BR112015028115B1

BR112015028115B1 - Métodos e composições para o tratamento de câncer

Info

Publication number: BR112015028115B1
Application number: BR112015028115-0A
Authority: BR
Inventors: Laura SOUCEK; Marie-Eve BEAULIEU
Original assignee: Fundació Privada Institut D'investigació Oncològica De Vall Hebron
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2014-05-07
Publication date: 2023-11-21
Also published as: PT2994533T; EP2994533B1; JP6790148B2; BR112015028115A2; IL273090B; WO2014180889A1; EP3338789A1; EA201690159A1; EP2801370A1; HUE045615T2; KR102324116B1; SI2994533T1; EP3545966A1; EP2994533A1; EA202090683A3; US11339205B2; RS59276B1; EA035463B1; SG11201509131VA; SG10201709101VA

Abstract

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER. A invenção refere-se a um mutante negativo dominante de Myc, chamado de Omomyc, para o uso na medicina e para o uso na prevenção e / ou tratamento de câncer. A invenção também se refere a uma proteína de fusão que compreende o Omomyc e a sua composição farmacêutica e o seu uso na medicina e, em particular, para o tratamento de câncer.

Description

Campo da Invenção

[0001] A invenção relaciona-se com a área do câncer e, com maior particularidade, aos métodos e composições para o tratamento de câncer utilizando-se o polipeptídeo Omomyc e às composições que compreendem Omomyc e um ou mais fármacos anticancerígenos e ao seu uso para o tratamento de câncer.

Antecedentes da Invenção

[0002] O medicamento ideal contra o câncer deve visar uma função não-redundante continuamente necessária para a manutenção tumor, mas dispensáveis para a manutenção e funcionamento de quaisquer tecidos normais. Por essa razão, a lógica mais comum consiste em visar produtos de genes que são especificamente mutagenizados em câncer, com base no fato de que estas moléculas mutantes seriam os prováveis "motivadores" do câncer e, possivelmente, menos cruciais para os tecidos normais. Por estas razões, muita atenção centrou-se na catalogação de lesões recorrentes em tipos específicos de câncer. Infelizmente, existem vários problemas com esta abordagem. Primeiro, a maioria dos cânceres humanos sólidos passam por episódios de instabilidade genômica e exibem um ruído mutacional que pode obscurecer as mutações "impulsionadoras" e suas vias efetoras concomitantes. Segundo, os cânceres são o resultado final de um processo que envolve transições através de vários gargalos evolutivos. Cada gargalo pode requerer um tipo específico de mutação cuja função é depois disso dispensável ata manutenção tumoral e, conseqüentemente, não um bom direcionamento terapêutico depois desse ponto na evolução do tumor.

[0003] A Myc é uma proteína zipper de leucina hélice-volta-hélice básica (b-HLH-LZ) envolvida no controle do crescimento e câncer, que opera em uma rede com as proteínas Max, Mad e Mnt relacionadas estruturalmente. Os dímeros Myc/Max ativam a transcrição do gene e a proliferação celular ou induzem apoptose. Os complexos Mad/Max e Mnt/Max atuam como repressores e causam a parada de crescimento celular e diferenciação. Todos os dímeros reconhecem o mesmo local de consenso de DNA, a caixa CACGTG E.

[0004] A Myc é estreitamente regulada em células normais, onde os seus níveis são mais altos na proliferação e mais baixos na não proliferação. A atividade da Myc aberrantemente alta e / ou desregulada está causalmente implicada na maioria dos cânceres e muitas vezes associada com tumores agressivos, pouco diferenciados e angiogênicos. A desregularão de expressão da Myc é devida à superexpressão através de amplificações de genes, perda de controle transcricional, degradação diminuída ou estabilização aumentada. Isto resulta na proliferação aberrante, no aumento da sobrevida, alterações no metabolismo, angiogênese e inflamação, os quais representam todos eles as mais importantes características do câncer. Vários estudos fundamentaram o papel crucial da Myc no governo dos aspectos intracelulares e extracelulares da tumorigênese sugerindo que tal direcionamento da sua função será terapeuticamente valioso.

[0005] Sabe-se que a sub-regulação da Myc por meio de um inibidor de bromodomínio BET resulta na regressão de vários tipos de tumores (Delmore, J. E., et a., 2011, Cell, 146: 904-917). Muito embora esta abordagem apresente bom potencial, ela apresenta algumas limitações, tais como toxicidade e vários efeitos (off-target) colaterais.

[0006] Muitas moléculas pequenas que interrompem a interação Myc / Max apresentaram baixa especificidade in cellulo (Prochownik, E. V. and Vogt, P. K., 2010, Genes Cancer 1, 650-659).

[0007] Não obstante, um inibidor de Myc, ainda tem de se tornar clinicamente disponível e a sua concepção apresenta várias ressalvas: primeira, a Myc é compreendida por um fator de transcrição nuclear, que é conseqüentemente mais difícil de alcançar do que as moléculas de membrana ou citoplásmicas; segunda, a Myc não é dotada de “local ativo” que pudesse ser direcionado; terceira, a família da Myc compreende 3 diferentes proteínas, c-, N e L- Myc, que em determinadas condições são funcionalmente redundantes, de modo tal que todas requerem inibição simultânea. Além disso, tem havido a preocupação de que a inibição da Myc induzirá efeitos secundários graves pela inibição da proliferação de tecidos normais. Por todas estas razões, a preparação de um medicamento inibidor da Myc constitui um desafio.

[0008] O Omomyc é um mutante dominante negativo da Myc que compreende o domínio b-HLH-LZ da Myc e abrigando quatro substituições de aminoácidos no fecho de leucina da Myc (Soucek, L. et al., 1998, Oncogene 17, 24632472; Soucek, L. et al. (2002), Cancer Res 62: 3507-3510). As substituições de aminoácidos E61T, E68I, R74Q, e R75N conferem à proteína especificidade de dimerização alterada, que mantém a capacidade de se ligar ao seu parceiro natural Max e de formar homodímeros e heterodímeros com Myc tipo c, N- e L-comuns.

[0009] Por causa destas propriedades, o Omomyc é capaz é capaz de impedir funções de transativação de genes dependentes de Myc-tanto in vitro quanto in vivo pela negação da capacidade da Myc se ligar ao seu local de ligação de reconhecimento de DNA, a caixa E (Savino, M. et al. ,2011, PLoS One 6, e22284; Soucek, L. et al. (2004), Cell Death Differ 11, 1038 1045). Ao mesmo tempo, o Omomyc potencializa fortemente a apoptose induzida pela Myc-de uma maneira dependente do nível de expressão da Myc e desse modo fortalece a atividade de transrepressão da Myc. Deste modo, o Omomyc impede a ligação da Myc às caixas E promotoras e a transativação dos genes alvo ao mesmo tempo que retém a ligação dependente de Miz-1 aos promotores e transrepressão. Na presença do Omomyc, o interactome Myc é canalizado para a repressão e a sua atividade muda de um pró-oncogênico para um supressor de tumor-.

[00010] Camundongos TRE-Omomyc;CMVrtTA, em que a expressão de Omomyc é controlada por um elemento promotor responsivo à tetraciclina e o transativador rtTA amplamente expresso é conduzido por um promotor de CMV, exibe alta expressão de Omomyc na maior parte dos tecidos em seguida à administração de doxiciclina (Soucek et al., 2008, Nature, 455: 679-683). Estes camundongos foram cruzados com o bem estabelecido modelo de murideo LSL- KrasG12D de tumorigênese pulmonar. Apenas 3 dias de expressão de Omomyc foram suficientes para causar encolhimento drástico dos tumores e uma semana tornou os animais essencialmente isentos de tumores. Sob um aspecto importante, conquanto outros tecidos divisórios, tais como pele, testículo e intestino, exibissem taxas de proliferação significativamente diminuídas durante o tratamento, e exibissem um determinado grau de atrofia, os camundongos não exibiram sinais óbvios de sofrimento ou doença. Além disso, os efeitos colaterais da inibição de Myc resultante da expressão de Omomyc são completamente reversíveis e desaparecem com a interrupção do tratamento.

[00011] Até a presente data, apesar do fato de que a expressão de Omomyc demonstrou ser uma estratégia eficaz pela inibição da Myc in vivo, ela foi aplicada somente utilizando-se uma abordagem de terapia de genes. Com efeito, o Omomyc é um peptídeo considerado demasiadamente volumoso e impróprio para entrega ao compartimento celular desejado (Montagne M. et al., PLoS One. 2012;7:e32172. doi: 10.1371/journal.pone.0032172), Savino M. et al., PLoS One. 2011; 6:e22284. doi: 10.1371/journal.pone.0022284) and Genes Dev., 2011, 25: 895-7. doi: 10.1101/gad.2053311.)

[00012] Além disso, prevê-se que o Omomyc exibe fraca capacidade de atravessar barreiras fisiológicas por causa das suas propriedades físico-químicas intrínsecas (por exemplo, hidrofobicidade, como previsto usando-se Kyte & Doolittle hydropathy plot, Kyte J., Doolittle R.F. (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132). Além disso, apesar da presença de vários resíduos de arginina dentro da região básica do Omomyc, os algoritmos mais recentes que predizem a capacidade de penetração espontânea das células pelos peptídeos não predizem que o Omomyc possua essa propriedade (Gautam et al. Journal of Translational Medicine 2013, 11:74).

[00013] Por essa razão, seria vantajosa a provisão de abordagens terapêuticas para o tratamento de câncer com base nos domínios de b-HLH-LZ capazes de transdução através da membrana celular de células eucarióticas e inibição da transativação de genes dependente de Myc.

Sumário Breve da Invenção

[0014] De acordo com um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou uma variante funcionalmente equivalente do mesmo para o us ona medicina, bem como para o us ona prevenção e / ou tratamento de câncer.

[0015] De acordo com outro aspecto a invenção refere-se a uma proteína de fusão que compreende: (i) o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou uma variante funcionalmente equivalente do mesmo; e (ii) uma sequência de peptídeo de penetração de célula e / ou um sinal de localização nuclear.

[0016] De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende a proteína de fusão de acordo com a invenção bem como ao uso da proteína de fusão na medicina e, em particular, para o tratamento de câncer.

[0017] De acordo com outro aspecto, a invenção relaciona-se com uma composição que compreende em conjunto ou separadamente: (i) um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, uma variante funcionalmente equivalente do mesmo ou uma proteína de fusão de acordo com a invenção e (ii) um agente antitumoral.

[0018] De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende a composição da invenção, da mesma forma que o uso da composição da invenção na medicina e, em particular, para o tratamento de câncer.

Descrição Breve dos Desenhos

[0019] Figura 1. (A) Imagiologia de fluorescência de células A549 incubadas durante 2h com Omomyc-FITC sob 37°C mostra que o Omomyc-FITC fica localizado no núcleo e citoplasma (B) Coloração Hoescht dos núcleos. (C) Contraste de fase.

[0020] Figura 2. Células incubadas com 10 uM de seja Omomyc ou Max* foram contadas e marcadas com anexina V e PI. (A) Número total de células de PBS, A549 tratado por Omomyc ou Max. (B) Percentagem de células mortas marcadas com PI. (C) Percentagem de células vivas (não marcadas). (D) Percentagem de células positivas para anexina V.

[0021] Figura 3. (A) Espectros de dicroísmo circular (CD) registrados a 20°C para proteínas c-Myc*, Max* e Omomyc purificadas (32 μM) mostrando que Omomyc é dotado de uma estrutura dobrada mais semelhante àquela de Max* do que Myc*. (mdeg, miligraus) (B) Desnaturação térmica estudada por meio de dicroismo circular sob 1°C/min. para proteínas c-Myc*, Max* e Omomyc purificadas, mostrando que Omomyc é dotado de uma estrutura dobrada termicamente mais estável do que aquela de Max*. (°m, miligraus sob o comprimento de onda especificado de 222 nm).

[0022] Figura 4. Quantificação de fluorescência a partir de imagens de microscopia confocal de células A549 fixas com 4% PFA depois de 2 horas de incubação sob 37°C com Omomyc ou Max* sob diferentes concentrações de peptídeos (5, 10 e 25 μM) (30-80 células contadas por imagem). AU, unidades arbitrárias.

[0023] Figura 5. Quantificação de fluorescência a partir de imagens de microscopia confocal de células A549 vivas depois de 20 minutos de incubação sob 37°C com Omomyc ou Max* (20 μM). AU, unidades arbitrárias.

[0024] Figura 6. Coloração violeta cristal de células A549 e H1650 de células de adenocarcinoma do pulmão tratadas com 25 μM de peptídeo Omomyc ou Max* durante os períodos de tempo indicados.

[0025] Figura 7. Quantificação da inibição da proliferação por marcação de violeta cristal de células A549 e H1650 de adenocarcinoma de pulmão tratadas com 25 μM de peptídeos Omomyc ou Max* pelos períodos de tempo indicados.

[0026] Figura 8. Resposta à dose de células A549 ao Omomyc e Max* por meio de quantificação por marcação de violeta cristal.

[0027] Figura 9. Quantificação da proliferação de células de glioma U87 tratadas com 25 μM de peptídeos Omomyc ou Max*.

[0028] Figura 10. (A) Pulmões de animais não tratados (esquerda) e tratados (direita) 10 minutos depois da administração do peptídeo fluorescente Omomyc (dose única de 37,5 mg/kg). (B) Cérebros de animais não tratados (esquerda) e tratados (à direita) 10 minutos depois da administração intranasal do peptídeo fluorescente Omomyc (dose única de 37,5 mg/kg).

[0029] Figura 11. Tratamento de adenocarcinoma de pulmão com PBS ou com Omomyc por meio de administração intranasal. (A) Taxa proliferativa de tumores. (B) Densidade celular.

[0030] Figura 12. Medição da % da área do tumor após o tratamento de adenocarcinoma de pulmão com PBS ou com Omomyc por meio de administração intranasal.

Descrição Detalhada da Invenção

[0031] Surpreendentemente, os autores da presente invenção descobriram que, o Omomyc é capaz de transduzir eficientemente através da membrana celular e translocar para o núcleo, em que ele exerce o seu efeito supressor de tumor. Por essa razão, o Omomyc é compreendido por um genuíno Domínio de Transdução de Proteínas (PTD). Conseqüentemente, pela primeira vez o Omomyc pode ser usado ele mesmo na forma de um fármaco anti-Myc sem a necessidade de se utilizarem seja veículos para a distribuição do polipeptídeo ao citoplasma da célula ou de se utilizarem abordagens de terapia de genes para a distribuição do ácido nucléico que codifica o Omomyc para a célula. Isto permite o uso do polipeptídeo do Omomyc para o tratamento de enfermidades associadas com a proliferação desregulada de células, tais como câncer. Surpreendentemente, os autores da presente invenção descobriram que o Omomyc é dotada de várias vantagens em comparação com o domínio bHLHZ do Max (Max*): • Omomyc mostra maior capacidade de penetração celular em comparação com o Max* em diferentes tipos de células e sob diferentes concentrações (Exemplo 6) • Omomyc é mais estável termicamente que o Max* e esta é uma clara vantagem para a concepção de medicamentos (Exemplo 5) • Omomyc é mais eficiente do que o Max* tanto na prevenção do crescimento de células (Exemplo 8) quanto no aumento da morte das células de câncer (Exemplo 4).

[0032] Além disso, o Omomyc é capaz de atravessar a barreira sangue-cérebro (Exemplo 9 e Figura 10B) e de exercer o seu efeito terapêutico in vivo (Exemplo 10).

Os métodos terapêuticos que utilizam o Omomyc

[0033] A presente invenção proporciona métodos para o tratamento de câncer com base no uso de um polipeptídeo que é dotado da sequência de SEQ ID NO: 1, que corresponde ao Omomyc, ou de uma variante funcionalmente equivalente do mesmo.

[0031] De acordo com um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou uma variante funcionalmente equivalente do mesmo para o uso na medicina.

[0032] De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou uma variante funcionalmente equivalente do mesmo para o uso na prevenção e / ou tratamento de câncer.

[0033] De acordo com outro aspecto, a invenção também se refere a um método para a prevenção e / ou tratamento de câncer que compreende administrar a um paciente com necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente efetiva do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou uma variante funcionalmente equivalente do mesmo.

[0034] De acordo com outro aspecto, a invenção também se refere ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou uma variante funcionalmente equivalente do mesmo para a preparação de um medicamento para a prevenção e / ou tratamento de câncer.

[0035] O polipeptídeo da sequência SEQ ID NO: 1 corresponde à sequência da proteína Omomyc. O termo “Omomyc” da forma que é utilizado neste contexto, refere-se a um polipeptídeo que consiste de uma versão mutagenizada do domínio bHLHZip da Myc portadora das mutações E61T, E68I, R74Q e R75N (em que a numeração das posições mutagenizadas é dada com relação à sequência da região de Myc correspondente aos aminoácidos 365-454 do polipeptídeo tal como definido sob o número de acesso NP_002458 na base de dados NCBI, versão de 27 de junho de 2012). A sequência de c-Myc proporcionada na base de dados NCBI sob o número de acesso NP_002458 está ilustrada em seguida, em que a região a partir do qual deriva Omomyc é mostrada sublinhada: 1 mdffrvvenq qppatmplnv sftnrnydld ydsvqpyfyc deeenfyqqq qqselqppap 61 sediwkkfel lptpplspsr rsglcspsyv avtpfslrgd ndggggsfst adqlemvtel 121 lggdmvnqsf icdpddetfi kniiiqdcmw sgfsaaaklv seklasyqaa rkdsgspnpa 181 rghsvcstss lylqdlsaaa secidpsvvf pyplndsssp kscasqdssa fspssdslls 241 stesspqgsp eplvlheetp pttssdseee qedeeeidvv svekrqapgk rsesgspsag 301 ghskpphspl vlkrchvsth qhnyaappst rkdypaakrv kldsvrvlrq isnnrkctsp 361 rssdteenvk rrthnvlerq rrnelkrsff alrdqipele nnekapkvvi Ikkatayils 421 vqaeeqklis eedllrkrre qlkhkleqlr nsca (SEQ ID NO:2)

[0040] O polinucleotídeo que codifica o Omomyc (SEQ ID NO: 3) e a correspondente sequência de polipeptídeo (SEQ ID NO: 1) está ilustrada em seguida, em que os tripletos sublinhados e em negrito fcorrespondem às posições que são mutagenizadas com relação ao Myc: 1ACC GAG GAG AAT GTC AAG AGG CGA ACA CAC AAC GTC TTG GAG CGC CAG 1Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln 49AGG AGG AAC GAG CTA AAA CGG AGC TTT TTT GCC CTG CGT GAC CAG ATC 17Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile 97CCG GAG TTG GAA AAC AAT GAA AAG GCC CCC AAG GTA GTT ATC CTT AAA 33Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys 145AAA GCC ACA GCA TAC ATC CTG TCC GTC CAA GCA GAG ACG CAA AAG CTC 49 Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu 193ATT TCT GAA ATC GAC TTG TTG CGG AAA CAA AAC GAA CAG TTG AAA CAC 65 Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His 241AAA CTT GAA CAG CTA CGG AAC TCT TGT GCG TAA 81Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala End

[0041] O Omomyc também contém o domínio M2 de um c-Myc, que é dotado da sequência RQRRNELKRSF (SEQ ID NO: 49) (vide Dang and Lee, Mol.Cell. Biol., 1988, 8:4048-4054) (duplo sublinhado anteriormente), e que corresponde a um sinal de localização nuclear.

[0042] O Omomyc é caracterizado pelo fato de que mostra capacidade de demerização aumentada com todas as três proteínas Myc oncogênicas (c-Myc, N-Myc e L-Myc). O Omomyc pode ser derivado a partir do domínio bHLHZip de qualquer proteína Myc conhecida na técnica, a partir do momento que sejam preservadas todas as mutações que resultam no efeito supressor de tumor. Deste modo, o Omomyc que pode ser usado na presente invenção pode ser derivado de qualquer espécie de mamífero, incluindo, sendo que não se fica limitado aos mesmos, animais domésticos e de criação (vacas, cavalos, porcos, sheep, ovelhas, cães, gatos ou roedores), primatas e seres humanos. De preferência, a proteína de Omomyc é derivada da proteína Myc de seres humanos (número de acesso NP_002458, versão de 27 de junho de 2012).

[0043] Da forma que é utilizado neste contexto, o termo “Myc” refere-se à família de fatores de transcrição que inclui c-Myc, N-Myc e L-Myc. A proteína Myc ativa a expressão de muitos genes através da ligação na sequência de consenso CACGTG (Sequências potenciadoras Box ou E-boxes e recrutando histona acetil-transferase ou HATs). Não obstante, a Myc também pode atuar como um repressor transcricional. Pela ligação do fator de transcrição Miz-1 e deslocando o coativador p300, ele inibe a expressão dos genes visados Miz-1. A Myc também tem uma função direta no controle da replicação de DNA.

[0044] A Myc b-HLH-LZ ou região Myc básica da hélice-laço-hélice básica domínio de fecho de leucina refere-se a uma região que determina a dimerização de Myc com a proteína Max e ligação aos genes alvo de Myc. Esta região corresponde aos aminoácidos 365-454 da Myc humana e é caracterizada por duas hélixes alfa conectadas por um laço (Nair, S. K., & Burley, S. K., 2003, Cell, 112: 193-205).

[0045] O termo “variante funcionalmente equivalente”, quando se refere ao Omomyc, refere-se a qualquer polipeptídeo que resulte da remoção, inserção ou adição de um ou mais aminoácidos com relação ao polipeptídeo de SEQ ID NO:1 ou que resulte da modificação química do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e que preserva substancialmente a atividade supressora de tumor do polipeptídeo Omomyc. A pessoa versada na técnica compreenderá que a preservação da atividade supressora de tumor do Omomyc requer que a variante possa dimerizar com Myc e inibir a sua atividade uma vez encontrada no núcleo, que é capaz de translocação através da membrana celular e que tem a capacidade de translocação através do envoltório nuclear.

[0046] Variantes funcionalmente equivalentes adequadas do Omomyc incluem polipeptídeos que consistem essencialmente do polipeptídeo da SEQ ID NO:1. Neste contexto, "que consiste essencialmente de" significa que a molécula especificada não conterá quaisquer sequências adicionais que possam alterar a atividade do Omomyc.

[0047] Variantes funcionais adequadas do peptídeo visado são aquelas que mostram um grau de identidade com relação ao peptídeo de SEQ ID NO:1 de aproximadamente maior que 25% de identidade da sequência de aminoácidos, tais como 25% 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. O grau de identidade entre dois polipeptídeos é determinado utilizando-se algoritmos de computador e métodos que são amplamente conhecidos das pessoas versadas na técnica. A identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada de preferência pela utilização do algoritmo BLASTP tal como descrito anteriormente [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 1990;215: 403-410]. De acordo com uma concretização preferida, a identidade da sequência é determinada através do comprimento pleno do polipeptídeo de SEQ ID NO:1 ou através do comprimento total da variante ou dos dois.

[0048] As variantes funcionalmente equivalentes do polipeptídeo Omomyc também podem incluir modificações pós-translacionais, tais como glicosilação, acetilação, isoprenilação, miristoilação, processamento proteolítico, e assim por diante.

[0049] De uma forma alternativa, variantes funcionais adequadas do peptídeo visado são aquelas em que uma ou mais posições dentro do polipeptídeo Omomyc contêm um aminoácido que constitui uma substituição conservadora do aminoácido presente na proteína de Omomyc mencionada anteriormente neste contexto. "As substituições conservadoras de aminoácidos" resultam da substituição de um aminoácido por outro que é dotado de propriedades estruturais e / ou químicas similares. Por exemplo, cada um dos seis grupos seguintes contém aminoácidos que são substituições conservadoras para um outro: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofan (W). A seleção dessas substituições conservadoras de aminoácidos está dentro do conhecimento daqueles normalmente versados na técnica e encontra-se descrita, por exemplo, por Dordo et al. et al., (J. Mol. Biol, 1999, 217;721-739) e Taylor et al., (J. Theor. Biol., 1986, 119:205-218).

[0050] Sera compreendido que as variantes funcionalmente equivalentes de Omomyc contêm mutações nas posições correspondentes às mutações E61T, E68I, R74Q e R75N encontradas no Omomyc derivado de c-Myc humano. A posição em que as ditas mutações têm de ocorrer na variante funcionalmente equivalente pode ser determinada por meio de um alinhamento múltiplo de sequências de diferentes sequências Myc e identificadas pelo alinhamento dessas posições correspondentes às posições 61, 68, 74 e 75 dentro da sequência de Omomyc derivada de c-Myc humano.

[0051] Um alinhamento múltiplo de sequências é compreendido por uma extensão de alinhamento em pares para incluir mais do que duas sequências de uma vez. Os métodos de múltiplo alinhamento alinham todas as sequências em um determinado conjunto de consultas. Um programa de alinhamento de várias sequências preferido (e de seus algoritmos) é compreendido por ClustalW, Clusal2W ou ClustalW XXL (vide Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res 22:4673-4680). Uma vez que as sequências de c-Myc provenientes de diferentes organismos e da variante são comparadas (alinhadas) da forma que se encontra descrita neste contexto, a pessoa versada na técnica poderá identificar facilmente as posições dentro de cada uma das sequências correspondentes às posições e introduz dentro da variante de Omomyc mutações correspondentes às mutações E61T, E68I, R74Q e R75N encontradas no Omomyc derivado de c-Myc humano.

[0052] Ensaios adequados para determiner se um polipeptídeo pode ser considerado como uma variante funcionalmente equivalente do Omomyc incluem, sem limitação: - Ensaios que medem a capacidade do polipeptídeo formar complexos diméricos com Max e Myc, tais como os ensaios baseados na expressão de um gene repórter, tal como descrito em Soucek et al. (Oncogene, 1998, 17: 2463 - 2472) da mesma forma que PLA (ensaio de ligação de proteínas) ou Co- imunoprecipitação. - Ensaios que medem a capacidade do polipeptídeo se ligar ao local de reconhecimento de Myc/Max dentro do DNA (o local CACGTG), tais como o ensaio de desvio de mobilidade eletroforética (EMSA) descrito em Soucek et al. (supra.) - Ensaios que medem a capacidade de reprimir a transativação induzida por Myc, tal como o ensaio baseado na expressão de um gene reporter sob o controle dos locais de ligação de DNA específicos para Myc/Max tais como descritos por Soucek et al. (supra). - Ensaios baseados na capacidade de o polipeptídeo inibir o crescimento de células expressoras do oncogene myc, tal como descrito por Soucek et al. (supra). - Ensaios que medem a capacidade de o polipeptídeo intensificar a apoptose induzida por myc, tais como os ensaios descritos por Soucek et al. (Oncogene, 1998: 17, 2463 - 2472). Além disso, pode ser usado qualquer ensaio comumente conhecido na técnica para avaliar apoptose em uma célula, tais como a coloração Hoechst, iodeto de propídio (PI) ou coloração por anexina V), azul tripano, progressão / fragmentação de DNA e TUNEL.

[0053] De acordo com uma concretização preferida, um polipeptídeo é considerado uma variante funcionalmente equivalente de Omomyc se ele demonstrar uma atividade em um ou mais dos ensaios que é compreendido por pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% do Omomyc nativo.

[0054] Além disso, variantes funcionalmente equivalentes de Omomyc também são capazes de transduzir células depois de a variante ser contactada com a dita célula. Será compreendido que variantes funcionalmente equivalentes do Omomyc contêm o domínio de transdução de proteínas encontrado no Omomyc bativo ou outro domínio de transdução de proteína funcional.

[0055] O termo “sequência de peptídeos de penetração de célula” é usado no presente relatório alternadamente com “CPP”, “domínio de transdução de proteínas” ou “PTD”. Ele refere-se a uma cadeia de peptídeos de comprimento variável que direciona o transporte de uma proteína no interior de uma célula. O processo de distribuição na célula comumente ocorre por meio de endocitose, mas o peptídeo também pode ser internalizado na célula por meio de translocação de membrana direta. Tipicamente, as CPP têm uma composição de aminoácidos que ou contém uma abundância relativamente alta de aminoácidos carregados positivamente tais como lisina ou arginina ou são dotadas de sequências que contêm um padrão alternativo de aminoácidos polares / carregados e de aminoácidos hidrofóbicos não polares. Exemplos das CPP que podem ser usadas na presente invenção incluem, sem limitação, a CPP encontrada na proteína Drosophila antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK. SEQ ID NO:4), a CPP encontrada no vírus herpes simplex 1 (HSV-1) proteína de ligação de DNA VP22 (DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE, SEQ ID NO:5), a CPP de Bac-7 (RRIRPRPPRLPRPRPRPLPFPRPG; SEQ ID NO: 6), as CPP da proteína HIV-1 TAT que consiste dos aminoácidos 49-57 (RKKRRQRRR, SEQ ID NO: 7), aminoácidos 48-60 (GRKKRRQRRRTPQ, SEQ ID NO: 8), aminoácidos 47-57 (YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO: 9); a CPP do peptídeo S413-PV (ALWKTLLKKVLKAPKKKRKV; SEQ ID NO: 10), a CPP de penetratina (RQIKWFQNRRMKWKK; SEQ ID NO: 11), a CPP de SynB1 (RGGRLSYSRRRFSTSTGR; SEQ ID NO: 12), a CPP de SynB3 (RRLSYSRRRF; SEQ ID NO:13), a CPP de PTD-4 (PIRRRKKLRRLK; SEQ ID NO: 14), a CPP de PTD-5 (RRQRRTSKLMKR; SEQ ID NO: 15), a CPP do FHV Coat-(35-49) (RRRRNRTRRNRRRVR; SEQ ID NO: 16), a CPP de BMV Gag-(7-25) (KMTRAQRRAAARRNRWTAR; SEQ ID NO: 17), a CPP de HTLV-II Rex-(4-16) (TRRQRTRRARRNR; SEQ ID NO:18), a CPP de D-Tat (GRKKRRQRRRPPQ; SEQ ID NO:19), a CPP R9-Tat (GRRRRRRRRRPPQ; SEQ ID NO: 20), a CPP de MAP (KLALKLALKLALALKLA; SEQ ID NO: 21), a CPP de SBP (MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV; SEQ ID NO: 22), a CPP de FBP (GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; SEQ ID NO: 23), a CPP de MPG (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya; SEQ ID NO: 24), a CPP de MPG(ENLS) (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya; SEQ ID NO: 25), a CPP de Pep-1 (ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cya; SEQ ID NO: 26), a CPP de Pep-2 (ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-cya; SEQ ID NO: 27), uma sequência de poliarginina que é dotada da estrutura RN (em que N está compreendido entre 4 e 17), a sequência de GRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 28), a sequência de RRRRRRLR (SEQ ID NO: 29), a sequência de RRQRRTS KLMKR (SEQ ID NO: 30); Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 31); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEQ ID NO: 32); RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 33), a sequência de YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 34); a sequência de RKKRRQRR (SEQ ID NO: 35); a sequência de YARAAARQARA (SEQ ID NO: 36); a sequência de THRLPRRRRRR (SEQ ID NO: 37); a sequência de GGRRARRRRRR (SEQ ID NO: 38).

[0056] Ensaios adequados para a determinação de se um polipeptídeo preserva a capacidade de translocação de membrana celular do Omomyc incluem, sem limitação, ensaios que medem a capacidade do polipeptídeo transduzir células na cultura, tais como o ensaio ilustrado no exemplo 3 da presente invenção. Este ensaio é baseado no contacto do polipeptídeo com células de cultura e detecção da presença do polipeptídeo em uma localização intracelular. De acordo com uma concretização preferida, a detecção do polipeptídeo da invenção é realizada por meio de microscopia de fluorescência.

[0057] De acordo com uma concretização preferida, um polipeptídeo é considerado como uma variante funcionalmente equivalente do Omomyc se ele for capaz de transduzir uma célula alvo pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% tão eficientemente quanto um Omomyc nativo.

[0058] Além disso, variantes funcionalmente equivalentes do Omomyc também são capazes de alcançar os núcleos das células transduzidas depois de a variante ser contactada com a dita célula. Será compreendido que variantes funcionalmente equivalentes do Omomyc contêm o NLS encontrado no Omomyc nativo ou outro NLS funcional.

[0059] O termo "sinal de localização nuclear", da forma que é utilizado neste contexto, refere- se a uma sequência de aminoácidos de cerca de 4-20 resíduos de aminoácidos de comprimento, que serve para direcionar uma proteína para o núcleo. Tipicamente, a sequência de localização nuclear é rica em aminoácidos básicos e sequências exemplificativas são amplamente conhecidas na técnica (Gorlich D. (1998) EMBO 5.17:2721-7). Em algumas concretizações, o NLS é selecionado a partir do grupo que consiste de o NLS de antígeno T grande de SV40 (PKKKRKV, SEQ ID NO: 39); o NLS de Nucleoplasmina (KRPAATKKAGQ AKKKK, SEQ ID NO: 40); o NLS de CBP80 (RRRHSDENDGGQPHKRRK, SEQ ID NO: 41); o NLS da proteína HIV-I Rev (RQARRNRRRWE, SEQ ID NO: 42); o HTLV-I Rex (MPKTRRRPRRSQRKRPPT, SEQ ID NO: 43); o NLS de hnRNP A (NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFKPRNQGGY, SEQ ID NO: 44); o NLS de rpL23a (VHSHKKKKIRTSPTFTTPKTLRLRRQPKYPRKSAPRRNKLDHY, SEQ ID NO: 45). De acordo com uma concretização da invenção, o sinal de localização nuclear compreende o motivo K (K/ R) X (K/ R) (SEQ ID NO: 46).

[0060] Ensaios adequados para a determinação de se um polipeptídeo é uma variante funcionalmente equivalente de Omomyc em termos de sua capacidade de translocação através da membrana celular incluem rotulação dupla de uma célula com um reagente específico para o polipeptídeo e com um corante que marca especificamente o núcleo da célula (tal como corante DAPI ou Hoechst). Esses ensaios estão ilustrados no Exemplo 6 da presente invenção. De acordo com uma concretização preferida, a detecção do polipeptídeo da invenção é realizada por meio de microscopia confocal ou por meio de microscopia de fluorescência.

[0061] De acordo com uma concretização preferida, um polipeptídeo é considerado como uma variante funcionalmente equivalente do Omomyc se ele for capaz de translocação para o núcleo das células tumorais visadas pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% tão eficientemente quanto o Omomyc nativo.

[0062] Variantes funcionalmente equivalentes adequadas incluem os polipeptídeos Omomyc*TAT e Omomyc*LZArg tais como definidos em seguida:

[0063] De acordo com a invenção, o polipeptídeo de Omomyc ou a sua variante funcionalmente equivalente são usados em um método para a prevenção ou tratamento de câncer em um paciente. Será compreendido que o método preventivo ou terapêutico de acordo com a invenção envolve o uso direto do polipeptídeo Omomyc ou da sua variante funcionalmente equivalente. Deste modo, os métodos preventivos ou terapêuticos de acordo com a invenção não envolvem a administração do ácido nucleico que codifica o Omomyc ou a variante funcionalmente equivalente do mesmo.

[0064] “Prevenção” é compreendida como a administração de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou uma variante funcionalmente equivalente do mesmo de acordo com o primeiro aspecto da invenção, ou de um medicamento que contém o mesmo em uma fase inicial ou precoce da doença, ou para impedir também o seu início.

[0065] O termo “tratamento” é usado para designar a administração de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou uma variante funcionalmente equivalente do mesmo de acordo com o primeiro aspecto da invenção, ou de um medicamento que o contém para controlar a progressão da enfermidade antes ou depois dos sinais clínicos terem aparecido. O controle da progressão da enfermidade é compreendido como os resultados clínicos benéficos ou desejados que incluem, sendo que não se fica limitado aos mesmos, a redução dos sintomas, redução da duração da enfermidade, estabilização das condições patológicas (especificamente evitar prejuizo adicional), retardamento da progressão da enfermidade, melhoramento da condição patológica e remissão (tanto parcial quanto completa). O controle da progressão da enfermidade também envolve um prolongamento da sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada se o tratamento não fosse aplicado.

[0066] O termo “câncer” refere-se a uma enfermidade caracterizada pela divisão de células descontrolada (ou por um aumento de sobrevivência ou resistência à apoptose), pela capacidade das ditas células invadirem outros tecidos vizinhos (invasão) ou pela disseminação para outras áreas do corpo onde as células não estão normalmente localizadas (metástase) através dos vasos linfáticos e sanguíneos. Na dependência de se os tumores podem ou não disseminar-se pela invasão e metástase, eles são classificados como sendo benignos ou malignos: os tumores benignos são tumores que não podem disseminar-se por invasão ou metástase, ou seja, eles apenas crescem localmente; enquanto que os tumores malignos são tumores que são capazes de disseminação por invasão ou metástase. Os métodos de acordo com a presente invenção são de utilidade para o tratamento de tumores locais e malignos. Da forma que é utilizado neste contexto, o termo câncer inclui, sendo que não se fica limitado aos mesmos, os seguintes tipos de câncer: câncer de mama; câncer do trato biliar; câncer da bexiga; câncer do cérebro incluindo glioblastomas e meduloblastomas; câncer cervical; coriocarcinoma; câncer de cólon; câncer do endométrio; câncer do esôfago; câncer gástrico; neoplasmas hematológicos incluindo leucemia linfocítica e mieloide aguda; leucemia linfoblástica / linfoma agudo das células T; leucemia das células capilares; leucemia mielógena crônica, mieloma múltiplo; leucemias associadas com AIDS e leucemia / linfoma das células T do adulto; neoplasmas intraepiteliais incluindo doença de Bowen e doença de Paget; câncer de fígado; câncer de pulmão; linfomas incluindo doença de Hodglun e linfomas linfocíticos; neuroblastomas; câncer oral incluindo carcinoma de células escamosas; câncer de ovário incluindo aqueles decorrentes de células epiteliais, células estromais, células germinativas e células mesenquimais; câncer pancreático; câncer de próstata; câncer retal; sarcomas incluindo leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, lipossarcoma, fibrossarcoma e osteossarcoma; câncer slun incluindo melanoma, carcinoma de células de Merkel, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células basais, e câncer de células escamosas; câncer testicular incluindo tumores germinais como seminoma, não-seminoma (teratomas, coriocarcinomas), tumores estromais, e tumores de células germinativas; câncer da tireóide incluindo adenocarcinoma e carcinoma medular da tireóide; e câncer renal incluindo adenocarcinoma e tumor de Wilms. Outros cânceres serão do conhecimento daquele normalmente versado na técnica. De acordo com uma concretização preferida, o câncer tratado é o câncer de pulmão, de preferência adenocarcinoma de pulmão, com maior preferência um orientado para o adenocarcinoma do pulmão KRas.

[0067] Os autores da presente invenção também observaram que o Omomyc ou a sua variante funcionalmente equivalente é capaz de diminuir a proliferação de células independentemente do fato de o câncer apresentar um aumento da expressão ou actividade da proteína Myc.

[0068] Da forma que é utilizado neste contexto, um "animal de experiência", inclui qualquer animal que seja portador de um câncer ou exiba um sintoma de câncer, ou que se encontra son o risco de contrair um câncer ou de exibir um sintoma de câncer. Os animais de experiência (pacientes) adequados incluem os animais de laboratório (tais como camundongo, rato, coelho, ou porquinho da índia (cobaia)), animais de fazenda, e animais domésticos ou animais de estimação (tais como um gato ou cachorro). Estão incluídos os primatas não humanos e, de preferência, pacientes humanos,.

[0069] A dosagem apropriada de Omomyc ou da sua variante funcionalmente equivalente a ser usado nos métodos de acordo com a invenção serão dependentes de diferentes fatores tais como o tipo de câncer a ser tratado, a gravidade e evolução da doença, se a composição é administrada para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e resposta ao peptídeo ou polipeptídeo, e o critério do médico assistente.

[0070] A quantidade de polipeptídeo da SEQ ID NO:1, da sua variante funcionalmente equivalente é administrada adequadamente ao paciente de uma só vez ou durante uma série de tratamentos. Na dependência do tipo e gravidade da enfermidade, um nível de dosagem apropriado será de um modo geral cerca de 0,01 até 500 mg por kg de peso corpóreo do paciente, por dia, que pode ser administrado em uma única dose ou várias doses. De preferência, o nível de dosagem sera cerca de 0,1 até cerca de 250 mg/kg por dia; com maior preferência cerca de 0,5 até cerca de 100 mg/kg por dia. A suitable dosage level may be about 0.01 to 250 mg/kg por dia, cerca de 0,05 até 100 mg/kg por dia, ou cerca de 0,1 até 50 mg/kg por dia. Dentro desta faixa a dosagem pode ser 0,05 até 0,5, 0,5 até 5 ou 5 até 50 mg/kg por dia. Para administração oral, as composições são proporcionadas de preferência na forma de comprimidos que contêm 1,0 até 1000 miligramas do ingrediente ativo, com particularidade 1,0; 5,0; 10,0; 15,0; 20,0; 25,0; 50,0; 75,0; 100,0; 150,0; 200,0; 250,0; 300,0; 400,0; 500,0; 600,0; 750,0; 800,0; 900,0; e 1000,0 miligramas do ingrediente ativo para a ajustagem sintomática da dosagem ao paciente a ser tratado. Os compostos podem ser administrados em um regime de 1 até 4 vezes por dia, de preferência uma vez ou duas vezes por dia.

[0071] O polipeptídeo da SEQ ID NO:1, ou da sua variante funcionalmente equivalente pode ser administrado por meio de qualquer tipo de via adequada, tais como por via oral, via tópica, por meio de inalação ou via parentérica de forma que os excipientes farmaceuticamente aceitáveis necessários para a formulação da forma de dosagem desejada sejam incluídos. A via de administração preferida das ditas composições farmacêuticas é a via endovenosa. De acordo com outra concretização, a via de administração é a via intranasal.

[0072] De acordo com uma concretização, o Omomyc ou a sua variante funcionalmente equivalente é preparado com carreadores que protegerão o dito polipeptídeo em relação a uma rápida eliminação do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de administração microencapsulada. Polímeros biocompatíveis biodegradáveis tais como etileno, acetate de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático podem ser usados. Os processos para a preparação das ditas formulações será evidente para as pessoas versadas na técnica. Os materiais também podem ser obtidos xomercialmente na Alza Corporation e na Nova Pharmaceuticals, Inc.

[0073] Apesar do fato que Omomyc e as suas variantes funcionalmente equivalentes são capazes de translocação através das membranas biológicas, é possível formular o Omomyc ou qualquer de suas variantes funcionalmente equivalentes em nanopartículas. As nanopartículas podem contribuir para preserver a integridade do polipeptídeo nos fluidos biológicos até ele alcançar o órgão visado. Além disso, as nanopartículas também podem ser modificadas de maneira a incluirem porções que permitem o direcionamento da nanopartícula para um órgão de interesse. Desta maneira, o Omomyc ou a sua variante funcionalmente equivalente sera distribuída na proximidade do órgão visado, facilitando o acesso do Omomyc ao interior das células onde é requerida a sua atividade biológica.

[0074] Deste modo, de acordo com outra concretização, o Omomyc ou qualquer uma de suas variantes funcionalmente equivalentes são proporcionados formando parte de uma nanopartícula.

[0075] Da forma que é utilizado neste contexto, o termo "nanopartícula" refere-se a qualquer material que é dotado de dimensions na faixa de 1-1.000 nm. De acordo com algumas concretizações, as nanopartículas são dotadas de dimensions situadas na faixa de 2-200 nm, de preferência na faixa de 2-150 nm, e ainda com maior preferência na faixa de 2-100 nm. As nanopartículas que podem ser usadas na presente invenção incluem tais materiais em nano-escala como uma nanopartícula à base de lípidos, uma nanopartícula superparamagnética, uma nanoshell, um nanocristal semicondutor, um ponto quântico, uma nanopartícula baseada em polímero, uma nanopartícula baseada em silício, uma nanopartícula baseada em sílica, uma nanopartícula baseada em metal, um fulereno e um nanotubo.

[0076] A distribuição direcionada pode ser pode ser conseguida por meio da adição de ligantes sem comprometimento da capacidade das nanopartículas entregarem suas cargas de polipeptídeo. Considera-se que isto possibilitará a distribuição para células, tecidos e órgãos específicos. A especoficidade direcionada dos sistemas de distribuição baseados em ligantes é baseada na distribuição dos receptores de ligantes nos diferentes tipos de células. O ligante de direcionamento poderá ser associado de forma não covalente ou de forma covalente com a nanopartícula, e pode ser conjugado à nanopartícula por meio de uma variedade de métodos tais como discutos neste contexto.

[0077] Exemplos de proteínas ou peptídeos que podem ser usados para direcionar nanopartículas incluem transferina, lactoferrina, TGF-β, factor de crescimento do nervo, albumina, peptídeo HIV Tat, peptídeo RGD, e insulina, da mesma forma que outros.

[0078] Será compreendido que a formulação de Omomyc ou da sua variante funcionalmente equivalente em uma nanopartícula não se pretende ou não se destina apenas a facilitar o acesso do Omomyc tao interior da célula, mas a proteger o Omomyc da degradação e / ou para facilitar o direcionamento da nanopartícula para o órgão de interesse.

Conjugados de Omomyc e proteínas de fusão que compreendem Omomyc

[0079] A presente invenção também proporciona conjugados que incluem uma primeira região que compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou uma variante funcionalmente equivalente do mesmo e uma segunda região que compreende uma porção química que facilita absorção celular do polipeptídeo. Exemplos de porções para aumentarem a absorção celular incluem, sendo que não se fica limitado aos mesmos: um grupo hidrofóbico (por exemplo, um lipídeo ou ácido graxo), um domínio de transdução de proteína, e determinados quelatos de metais.

[0080] A presence de porções químicas adicionais na molécula do Omomyc resulta em conjugados que mostram capacidade aumentada para serem translocados através das membranas biológicas com relação ao Omomyc não modificado, resultando deste modo em um aumento da atividade supressora de tumor.

[0081] Deste modo, de acordo com outro aspecto, a invenção relaciona-se com um conjugate que compreende: (i) o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou uma variante funcionalmente equivalente do mesmo, e (ii) uma porção química que facilita a absorção celular do polipeptídeo.

[0082] O termo “conjugado”, da forma que é utilizado neste contexto, refere-se a dois ou mais compostos que são ligados de forma covalente um ao outro de modo que a função de cada composto é retida no conjugado.

[0083] De acordo com concretizações preferidas, os conjugados de acordo com a invenção compreendem pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 ou mais porções químicas que facilitam a absorção celular do polipeptídeo ou da sua variante funcionalmente equivalente.

[0084] De acordo com uma concretização, a porção química que facilita a absorção celular do polipeptídeo é compreendida por um a lipídeo ou um ácido graxo.

[0085] De uma maneira geral um ácido graxo é compreendido por uma molécula que compreende uma cadeia de carbono com uma porção ácida (por exemplo, ácido carboxílico) em uma extremidade da cadeia. A cadeia de carbono de um ácido graxo pode ser de qualquer comprimento, não obstante, prefere-se que esse comprimento da cadeia de carbono seja de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais átomos de carbono, e qualquer gama derivável na mesma. De acordo com determinadas concretizações, o comprimento da cadeia de carbono varia desde 4 até 18 átomos de carbono na parte de cadeia do ácido graxo. De acordo com determinadas concretizações a cadeia de carbono de ácido graxo pode compreender um número ímpar de átomos de carbono, não obstante, um número par de átomos de carbono na cadeia pode ser preferido de acordo com determinadas concretizações. Um ácido graxo que compreende apenas ligações simples na sua cadeia de carbono é chamado saturado, enquanto que um ácido graxo que compreende pelo menos uma ligação dupla na sua cadeia é chamado de insaturado. O ácido graxo pode ser ramificado, muito embora em concretizações preferíveis da presente invenção, ele seja não ramificado. Ácidos graxos específicos incluem, sendo que não se fica limitado aos mesmos, ácido linoléico, ácido oléico, ácido palmítico, ácido linolênico, ácido esteárico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido araquídico, ácido palmitoléico, ácido araquidônico.

[0086] De acordo com uma concretização preferida, a porção química que facilita a absorção celular do polipeptídeo é compreendida por uma célula de penetração da sequência de peptídeo, caso este em que, o conjugado é compreendido por uma proteína de fusão que compreende o Omomyc ou a sua variante funcionalmente equivalente e a célula de penetração da sequência de peptídeo.

[0087] O termo “proteína de fusão” refere-se a proteinas geradas por meio de tecnologia de genes que consiste de dois ou mais domínios funcionais derivados de diferentes proteínas. A proteína de fusão pode ser obtida por meios convencionais, por exemplo, por meio de expresdsão de genes da sequência de nucleotídeos que codifica a referida proteína de fusão em uma célula adequada. Será compreendido que o peptídeo de penetração cellular refere-se a um peptídeo de penetração celular que é diferente do peptídeo de penetração celular que forma parte do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou da sua variante funcionalmente equivalente.

[0088] Os termos “polipeptídeo da SEQ ID NO:1”, “variante funcionalmente equivalente do polipeptídeo da SEQ ID NO:1” e “peptídeo de penetração celular” foram descritos em detalhes no contexto dos usos médicos da invenção e são igualmente aplicáveis no contexto de uma proteína de fusão.

[0089] De acordo com uma concretização preferida, o referido peptídeo de penetração celular não é compreendido pelo peptídeo de penetração celular do Omomyc endógeno.

[0090] De acordo com uma concretização, a sequência do peptídeo de penetração celular é fundida no N-terminal do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou da sua variante funcionalmente equivalente. De acordo com outra concretização, o peptídeo de penetração celular é fundido no C- terminal do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou da sua variante funcionalmente equivalente.

[0091] De acordo com concretizações preferidas, as proteínas de fusão de acordo com a invenção compreendem, além do peptídeo de penetração da própria célula encontrado no polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou da sua variante funcionalmente equivalente, pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 ou mais peptídeos de penetração de células adicionais.

[0092] De acordo com utra concretização preferida, os conjugados ou a proteína de fusãos da invenção compreendem o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou a sua variante funcionalmente equivalente e compreende ainda um sinal de localização nuclear N-terminal ou C-terminal. O termo “sinal de localização nuclear (NLS)” foi descrito no contexto dos usos terapêuticos da invenção e é igualmente aplicável às proteínas de fusão da invenção. Será compreendido que o NLS adicional refere-se a um NLS que é diferente para o NLS endógeno encontrado no Omomyc ou na sua variante funcionalmente equivalente. O NLS adicional pode ser o mesmo ou diferente do NLS endógeno encontrado no Omomyc ou na sua variante funcionalmente equivalente.

[0093] De acordo com uma concretização, o NLS é um dos NLS que aparece endogenamente na sequência Myc, tal como o peptídeo M1 (PAAKRVKLD, SEQ ID NO: 50) ou o peptídeo M2 (RQRRNELKRSF, SEQ ID NO: 49) (vide Dang and Lee, supra.).

[0094] De acordo com concretizações preferidas, os conjugades ou proteínas de fusão de acordo com a invenção compreendem, adicionalmente ao NLS endógeno encontrado no polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou na sua variante funcionalmente equivalente, pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 ou NLS.

[0095] A pessoa versada na técnica compreenderá que pode ser desejável que a proteína de fusão compreenda ainda um ou mais peptídeos flexíveis que conectam o polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou a sua variante funcionalmente equivalente, a sequência de peptídeo de penetração de célula e / ou o NLS. Deste modo, de acordo com uma concretização particular o polipeptídeo da invenção é conectado diretamente à sequência de peptídeo de penetração de célula. De acordo com outra concretização particular, o polipeptídeo da invenção é conectado à sequência de peptídeo de penetração de célula através de um peptídeo flexível. De acordo com uma concretização particular o polipeptídeo da invenção é conectado diretamente à sequência de peptídeo de penetração de célula e ao NLS. De acordo com outra concretização particular, o polipeptídeo da invenção é conectado à sequência de peptídeos de penetração de célula através de um primeiro ligante de peptídeo flexível e ao NLS através de um segundo ligante de peptídeo flexível.

[0096] Da forma que é utilizado neste contexto, o termo "peptídeo flexível", "peptídeo espaçador" ou "peptídeo ligante" refere-se a um peptídeo que liga covalentemente duas proteínas ou porções, mas que não é parte de qualquer polipeptídeo, permitindo o movimento de um com relação ao outro, sem causar um efeito prejudicial substancial na função seja da proteína ou da porção. Deste modo, o ligante flexível não afeta a atividade supressora de tumor da sequência do Omomyc, a atividade de penetração de célula do peptídeo de penetração de célula ou a capacidade de localização nuclear do NLS.

[0097] O peptídeo flexível compreende pelo menos um aminoácido, pelo menos dois aminoácidos, pelo menos três aminoácidos, pelo menos quatro aminoácidos, pelo menos cinco aminoácidos, pelo menos seis aminoácidos, pelo menos sete aminoácidos, pelo menos oito aminoácidos, pelo menos nove aminoácidos, pelo menos 10 aminoácidos, pelo menos 12 aminoácidos, pelo menos 14 aminoácidos, pelo menos 16 aminoácidos, pelo menos 18 aminoácidos, pelo menos 20 aminoácidos, pelo menos 25 aminoácidos, pelo menos 30 aminoácidos, pelo menos 35 aminoácidos, pelo menos 40 aminoácidos, pelo menos 45 aminoácidos, pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 60 aminoácidos, pelo menos 70 aminoácidos, pelo menos 80 aminoácidos, pelo menos 90 aminoácidos, ou cerca de 100 aminoácidos. De acordo com algumas concretizações o peptídeo flexível permitirá o movimento de uma proteína com relação à outra a fim de aumentar a solubilidade da proteína e / ou melhorar a sua atividade. Regiões de ligação adequadas incluem uma região de poli-glicina, a sequência GPRRRR (SEQ ID NO: 51) de combinações de resíduos de glicina, prolina e alanina residues.

[0098] De acordo com algumas concretizações a proteína de fusão da invenção pode compreender uma porção química adiciobal que inclui, entre outros, grupos de fluorescência, biotina, polietileno glicol (PEG), análogos de aminoácidos, aminoácidos não naturais, grupos fosfato, grupoe glicosil, marcas de radioisótopos, e moléculas farmacêuticas. De acordo com outras concretizações, o polipeptídeo heterológo pode compreender um ou mais grupos quimicamente reativos incluindo, entre outros, cetona, aldeído, resíduos Cys e resíduos Lys.

[0099] De acordo com uma concretização particular, os conjugados ou proteínas de fusão da invenção compreendem um marcador ligado ao conjugado ou ao domínio C-terminal ou N-terminal da referida proteína de fusão ou sua variante. O dito marcador é compreendido de uma maneira geral por um peptídeo ou sequência de aminoácidos que pode ser usada no isolamento ou purificação da dita proteína de fusão. Deste modo, o ditto marcador é capaz de ligação a um ou ligantes, por exemplo, um ou mais ligantes de uma matriz de afinidade tais como um suporte de cromatografia ou glóbulos com alta afinidade. Um exemplo do dito marcador é compreendido por um marcador de histidina (marcador His-ou HT), tal como um marcador quer compreende 6 resíduos de histidina (His6 ou H6), que pode ligar-se a uma coluna de níquel (Ni2+) ou cobalto (Co2+) com alta afinidade. O marcador His é dotado da característica desejável que ele pode ligar os seus ligantes sob condições que são desnaturantes para a maior parte das proteínas e disruptivas para a maioria das interações proteína-proteína. Deste modo, el epode ser usado para remover a proteína isca marcada com H6 em seguida ao rompimento das interações proteína-proteína com as quais a isca participou.

[00100] Exemplos ilustrativos, não limitativos, adicionais dos marcadores de utilidade para o isolamento ou purificação da proteína de fusão incluem o marcador Arg, marcador FLAG-(DYKDDDDK; SEQ ID NO:52), marcador Strep (WSHPQFEK, SEQ ID NO:53), um epítope capaz de ser reconhecido por um anticorpo, tais como o marcador c-myc (reconhecido por um anticorpo anti-c-myc), marcador HA (YPYDVPDYA, SEQ ID NO:54), marcador V5 (GKPIPNPLLGLDST, SEQ ID NO:55), marcador SBP, marcador S, peptídeo de ligação de calmodulin, domínio de ligação de celulose, domínio de ligação de chitin, marcador de transferase S de glutationa, proteína de ligação de maltose, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, e assim por diante. (Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 60:523-525), uma sequência de aminoácidos tal como AHGHRP (SEQ ID NO:56) ou PIHDHDHPHLVIHSGMTCXXC (SEQ ID NO:57), β-galactosidase e outras assemelhadas.

[00101] O marcador pode ser usado, se desejado, para o isolamento ou purificação da referida proteína de fusão.

[00102] De acordo com outro aspecto, a invenção relaciona-se com o conjugate ou proteína de fusão de acordo com a invenção para o uso na medicina.

[00103] De acordo com outro aspecto, a invenção relaciona-se com o conjugado ou proteína de fusão de acordo com a invenção para o uso na prevenção e/ou tratamento de cancer.

[00104] De acordo com outro aspecto, a invenção relaciona-se com o uso do conjugado ou a proteína de fusão de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para a prevenção e / ou tratamento de câncer.

[00105] De acordo com outro aspecto, a invenção relaciona-se com um método de tratamento e / ou prevenção de câncer em um objeto de experiência que compreende a administração ao dito objeto de experiência do conjugado ou de uma proteína de fusão de acordo com a invenção.

[00106] De acordo com uma concretização preferida o câncer a ser preveido ou tratado é compreendido por câncer induzido por Myc. IDe acordo com outra concretização preferida, o câncer a ser prevenido ou tratado é um câncer associado com uma mutação no gene KRAS. De acordo com uma concretização, a mutação no gene KRAS é uma mutação na glcina na posição 12, na glicina na posição 13 ou na glutamina na posição 61. De acordo com uma concretização de maior preferência, a mutação é selecionada a partir do grupo que consiste da mutação G12S, da mutação G12V, da mutação G13D, da mutação G12C, da mutação G12R, da mutação G12F, da mutação G12I, da mutação G13C, da mutação G13R, ou da mutação Q61L.

[00107] Os termos “medicamento”, “prevenção”, “tratamento”, “câncer” e “câncer induzido por Myc-” foram definidos anteriormente e aplicam-se igualmente ao aspecto da invenção.

Composições Antitumor

[00108] A descoberta inesperada de que oThe unexpected finding that o polipeptídeo Omomyc é capaz de translocação através das membranas biológicas e de exercer a sua atividade supressora de tumores quando proporcionado como um polipeptídeo abre a possibilidade de se formular o Omomyc com outros fármacos antitumor. Deste modo, de acordo com outro aspecto, a presente invenção também proporciona compositions que contêm, em conjunto ou separadamente, um primeiro componente selecionado a partir do grupo que consiste de: (i) Omomyc, (ii) uma variante funcionalmente equivalente do mesmo, (iii) um conjugado ou proteína de fusão de acordo com a invenção e, como um segundo componente, um composto antitumor.

[00109] O primeiro componente das composições de acordo com a invenção inclui a polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, uma variante funcionalmente equivalente do mesmo ou uma proteína de fusão de acordo com a invenção. Polipeptídeos adequados, variantes funcionalmente equivalentes do polipeptídeo da SEQ ID NO:1 e proteínas de fusão foram descritos anteriormente no contexto dos métodos terapêuticos de acordo com a invenção e são igualmente aplicáveis às composições de acordo com a presente invenção.

[00110] Da forma que é utilizado neste contexto, “agente antitumoral” é compreendido como o dito composto biológico ou químico que trata tumores ou previne a formação dos mesmos. De acordo com uma concretização preferida o dito agente é selecionado a partir do grupo que consiste de um agente citotóxico, um agente antiangiogênico, um agente antimetastático e um agente antiproliferante.

[00111] Da forma que é utilizado neste contexto, na presente invenção, o termo “agente citotóxico” refere-se a um agente que é capaz de promover a morte celular e que tem capacidade para reduzir o crescimento, sustar o crescimento ou destruir células e, com particularidade, células que proliferam rapidamente e, ainda com maior particularidade, células tumorais. A morte celular pode ser causada por meio de qualquer mecanismo, tal como, por exemplo, apoptose, muito embora ela não esteja limitada a esta causa, por meio da inibição de metabolismo, a interferência com a organização do citoesqueleto ou a modificação química do DNA. O termo agente citotóxico compreende quaisquer agentes quimioterápicos incluindo pequenas moléculas orgânicas, peptídeos, oligonucleotídeos e outros assemelhados; toxinas; enzimas; citocinas; radioisótopos ou agentes de radioterapia.

[00112] “Agentes quimioterápicos” são compreendidos como compostos químicos tais como, sem limitação, antibióticos de antraciclina tais como doxorubicina e daunorubicina, taxanos tais como Taxol™ e docetaxel, vinca alcalóides tais como vincristina e vinblastina, 5-fluorouracil (5-FU), leucovorin, irinotecan, idarubicin, mitomicina C, oxaliplatin, raltitrexed, tamoxifen, cisplatin, carboplatin, metotrexato, actinomicina D, mitoxantrona, blenoxano ou mitramicina.

[00113] “Toxina” é compreendida como um agente tóxico que se conjuga com o polipeptídeo de acordo com o primeiro aspevto da invenção ou uma proteína de fusão de acordo com o segundo aspecto da invenção formando uma imunotoxina. A conjugação de determinadas toxinas com o dito polipeptídeo ou com a dita proteína de fusão reduz a toxicidade do primeiro, possibilitando o seu uso como agentes terapêuticos, porque de outro modo eles seriam demasiado tóxicos. A ligação entre a toxina e o polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou a proteína de fusão de acordo com o segundo aspecto da invenção é realizada quimicamente, conservando a sua atividade biológica. A sua separação de uma maneira geral ocorre nos lisossomas das células visadas de forma tal que a mencionada ligação química só é quebrada no ambiente celular ácido encerrado proporcionado pelos lisossomas. As toxinas de utilidade no contexto da presente invenção são toxinas de plantas, toxinas bacterianas, toxinas de fungos ou de origem animal e seus fragmentos, tais como, sem limitação, a cadeia A de ricina, saponina, a cadeia A de difteria, fragmentos de não ligação ativa da toxina da difteria, cadeia A de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, α-sarcina, proteínas A de Leurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e tricotecenos.

[00114] As “enzimas” estão compreendidas no contexto da presente invenção como como toxina ou enzimas de activação de fármacos, tais como, sem limitação, fosfatase alcalina que ativa etoposida e doxorrubicina; carboxipeptidase G2 que ativa mostardas de nitrogênio; beta-lactamase que ativa doxorubicina, paclitaxel e mitomicina.

[00115] As “Citoquinas” são compreendidas como peptídeos de diferentes dimensões e pesos moleculares que sintetizam as células do sistema imunológico para o propósito de regular a resposta imune, e elas podem ser hormônios, fatores de crescimento, fatores de necrose, e assemelhados. Elas podem ser de origem natural ou provenientes de culturas de células recombinantes e equivalentes biologicamente ativos de citoquinas de sequência natural. A sua conjugação com anticorpos dá origem às imunocitoquinas. As citoquinas de utilidade na presente invenção são, sem limitação, fator alfa de TNF, INF-gama, fator GM-GSF ou IL-2.

[00116] “Radioisótopos” é compreendido como isótopos radioativos tais como, sem limitação, 131I, 90Y, 177Lu, 188Re, 67Cu, 211At, 213Bi, 125I, 111In.

[00117] Agente angiogênico” é compreendido como uma substância química ou biológica que inibe ou reduz a formação de novos vasos sanguíneos, ou seja, angiogênese.

[00118] Os agentes antiangiogênicos que podem ser conjugados com o polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou com uma proteína de fusão de acordo com o segundo aspecto da invenção incluem, sem limitação, um agente antiangiogênico selecionado a partir do grupo de paclitaxel, 2-metoxiestradiol, prinomastat, batimastat, BAY 12-9566, carboxiamidotriazol, CC-1088, ácido acético dextrometorfan, ácido acético dimetilxantenona, endostatin, IM-862, marimastat, penicilamina, PTK787/ZK 222584, RPI.4610, lactato de esqualamina, SU5416, talidomida, combretastatin, tamoxifen, COL-3, neovastat, BMS-275291, SU6668, anticorpos anti-VEGF, Medi-522 (Vitaxin II), CAI, interleucina 12, IM862, amiloride, angiostatin, Kl-3 angiostatin, Kl-5 angiostatin, Captopril, DL-alpha-difluorometilornitina, DL-alfa- difluorometilornitina HCl, endostatin, fumagillin, herbimicina A, 4-Hidroxifenilretinamida, juglone, laminin, laminin hexapeptídeo, laminin pentapeptídeo, lavendustin A, medroxiprogesterona, minociclina, inibidor ribonuclease de placenta, suramin, trombospondin, anticorpos dirigidos contra fatores pró-angiogênicos (por exemplo, Avastin, Erbitux, Vectibix, Herceptin); inibidores de tirosina- quinase de baixo peso molecular de fatores de crescimento proangiogênicos (por exemplo, Tarceva, Nexavar, Sutent, Iressa); inibidores mTOR (por exemplo Torisel); interferon alfa, beta e gama, IL-12, inibidores de metaloproteinase (por exemplo, COL3, marimastat, batimastat); ZD6474, SUl1248, vitaxin; inibidores de PDGFR (por exemplo, Gleevec); NM3 e 2- ME2; ciclopeptídeos tais como cilengitida.

[00119] “Agente antimetastático” é compreendido como uma substância química ou biológica que inibe ou reduz a metástase, ou seja, a distância de propagação, fundamentalmente pelo fluxo linfático ou do sangue, das células causadoras de câncer, e the crescimento de novos tumoresnos locais de destino da dita metástase asis.

[00120] “Agente antiproliferante” é compreendido como uma substância química ou biológica que é capaz de prevenir ou de inibir a formação ou crescimento de tumores. Os agentes antiproliferantes incluem, sendo que não se fica limitado aos mesmos (i) antimetabolitos tais como antimetabolitos de ácido fólico (aminopterina, denopterina, metotrexato, edatrexato, trimetrexato, nolatrexed, lometrexol, pemetrexed, raltitrexed, piritrexim, pteropterin, leucovorin, 10-propargil-5,8- dideazafolato (PDDF, CB3717)), abálogos de purina (cladribina, clofarabina, fludarabina, mercaptopurina, pentostatin, tioguanina) e análogos de pirimidina (capecitabina, citarabina ou ara-C, decitabina, fluorouracil, 5-fluorouracil, doxifluridine, floxuridina e gemcitabina) (ii) produtos naturais, tais como antibióticos antitumor e inibidores mitóticos tais como vinca alcalóides tais como vindesina, vincristina, vinblastina, vinorelbina; taxanas tais como paclitaxel (Taxol™), docetaxel (Taxotere™); colcicina (NSC 757), tiocolchicina (NSC 361792), derivados de colchicina (por exemplo, NSC 33410), e allocolchicina (NSC 406042); halichondrina B (NSC 609395); dolastatina 10 (NSC 376128); maitansina (NSC 153858); rizoxina (NSC 332598); epotilona A, epotilona B; discodermolida; estramustina; nocodazol; (iii) hormônios e seus antagonistas, tais como tamoxifen, toremifene, anastrozol, arzoxifene, lasofoxifene, raloxifene, nafoxidine, fulvestrant, aminoglutetimida, testolactona, atamestano, exemestano, fadrozol, formestano, letrozol, goserelin, leuprorelin ou leuprolida, buserelin, histrelin, megestrol e fluoximesterona; (iv) agentes biológicos, tais como vetores virais, interferon alfa e interleucinas; (v) compostos baseados em platina tais como carboplatina, cisplatina [cis-diaminodicloroplatina, (CDDP)], oxaliplatina, iproplatina, nedaplatina, tetranitrato de triplatina, tetraplatina, satraplatina (JM216), JM118 [dicloro cis amina (II)], JM149 [dicloro cis amina (ciclohexilamina) trans diidroxo platina (IV)], JM335 [trans amina dicloro diidroxo platina (IV)], transplatina, ZD0473, cis, trans, cis-Pt(NH3)(C6H11NH2)(OOCC3H7)2Cl, malanato-l,2-diaminociclo hexanoplatina (II), 5- sulfosalicilato-trans-(l,2- diaminociclo hexano)platina (II) (SSP), poli-[(trans-l,2-diaminociclo hexano) platin]- carboxiamilose (POLI-PLAT) e 4-hidroxi-sulfonilfenilacetato (trans- 1,2- diaminociclo hexano) platina (II) (SAP) e assemelhados e (vi) fármacos de alquilação de DNA, tais como mostardas de nitrogênio, nitrosouréias, derivados de etilenoimina, sulfonatos de alquila e triazenos, incluindo, sendo que não se fica limitado aos mesmos, ciclofosfamida (Cytoxan™), bussulfano, improssulfano, pipossulfano, pipobromano, melfalano (L-sarcolisin), clorambucil, mecloretamina ou mustina, uramustina ou mostarda de uracil, novembiquina, fenesterina, trofosfamida, ifosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), clorozotocina, fotemustina, nimustina, ranimnustina, semustina (metil- CCNU), estreptozocin, tiotepa, trietilenomelamina, trietilenotiofosforamina, procarbazina, altretamina, dacarbazina, mitozolomida e temozolomida.

Composições farmacêuticasO

[00121] A invenção também proporciona composições farmacêuticas que compreendem os conjugados e proteínas de fusão da invenção ou as composições de acordo com a invenção. Deste modo, de acordo com outro aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade farmaceuticamente ativa do conjugado ou proteína de fusão de acordo com a invenção e um carreador farmaceuticamente ativo (primeira composição farmacêutica da invenção). De acordo com outro aspecto, a invenção proporciona uma compa composição farmacêutica que compreende uma quantidade farmaceuticamente ativa da composição de acordo com a invenção e um carreador farmaceuticamente ativo (segunda composição farmacêutica de acordo com a invenção).

[00122] Da forma que é usada na presente invenção, a expressão “composição farmacêutica” refere-se a uma formulação que foi adaptada para administrar uma dose predeterminada de um ou de vários agentes terapêuticos de utilidade a uma célula, um grupo de células, um órgão, um tecido ou um animal em que a divisão de células é descontrolada, tal como câncer.

[00123] A primeira composição farmacêutica da invenção contém uma quantidade farmacêutica efetiva de um conjugado ou proteína de fusão de acordo com a invenção. Os conjugates e proteínas de fusão adequados para o uso nas composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção incluem qualquer uma das proteínas de fusão mencionadas anteriormente so b o parágrafo conjugados de Omomyc e proteínas de fusão da invenção.

[00124] A segunda composição farmacêutica da invenção contém uma quantidade farmaceuticamente efetiva de uma composição de acordo com a invenção e a carreador farmaceuticamente ativo. A segunda composição farmacêutica da invenção compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO:1, uma variante funcionalmente equivalente do mesmo ou uma proteína de fusão de acordo com a invenção. Variantes funcionalmente equivalentes adequadas do polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou proteínas de fusão adequadas para o uso na segunda composição farmacêutica de acordo com a invenção são tais como definidas anteriormente sob usos terapêuticos da invenção ou sob proteínas de fusão da invenção, respectivamente.

[00125] A expressão “Quantidade farmaceuticamente efetiva”, da forma que é utilizada neste contexto, é compreendida como uma quantidade capaz de proporcionar um efeito terapêutico, e que pode ser determinado pela pessoa versada na técnica por meios comumente utilizados. A quantidade do polipeptídeo Omomyc, da sua variante funcionalmente equivalente ou de uma proteína de fusão ou do composto antitumoral que pode ser combinado nas composições farmacêuticas de acordo com a invenção será variável na dependência do animal de experiência e da modalidade de administração. As pessoas versadas na técnica compreenderão que as dosagens também podem ser determinadas com a orientação de Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition (1996), Appendix II, pp. 1707-1711 e a partir de Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Edition (2001), Appendix II, pp. 475493.

[00126] A dosagem apropriada do princípio ou princípios ativos dentro da composição farmacêutica dependerá do tipo de câncer a ser tratado, da gravidade e 3volução da enfermidade, se a composição é administrada para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e da resposta ao peptídeo ou polipeptídeo, e o critério do médico assistente. A quantidade de polipeptídeo da SEQ ID NO:1, da sua variante funcionalmente equivalente, a proteína de fusão é adequadamente administrada ao paciente dee uma só vez ou durante uma série de tratamentos. Na dependêcia do tipo e da gravidade da enfermidade, um nível de dosagem apropriado será de uma maneira geral de cerca de 0,01 até 500 mg por kg de peso corpóreo do paciente por dia que pode ser administrada em uma única dose em ou várias doses. De preferência, o nível de dosagem será cerca de 0,1 até cerca de 250 mg/kg por dia; com maior preferência cerca de 0,5 até cerca de 100 mg/kg por dia. Um nível de dosagem adequado pode ser cerca de 0,01 até 250 mg/kg por dia, cerca de 0,05 até 100 mg/kg por dia, ou cerca de 0,1 até 50 mg/kg por dia. Dentro desta faixa a dosagem pode ser de 0,05 até 0,5: 0,5 até 5 ou 5 até 50 mg/kg por dia. Para administração oral, as composições são proporcionadas de preferência na forma de comprimidos que contêm de 1,0 até 1000 milligrams do ingrediente ativo, com particularidade 1,0; 5,0; 10,0; 15,0; 20,0; 25,0; 50,0; 75,0; 100,0; 150,0; 200,0; 250,0; 300,0; 400,0; 500,0; 600,0; 750,0; 800,0; 900,0; e 1000,0 miligramas do ingrediente ativo para o ajuste sintomático da dosagem ao paciente a ser tratado. Os compostos podem ser administrados em um regime de 1 até 4 vezes por dia, de preferência uma vez ou duas vezes por dia.

[00127] Mo caso da segunda composição farmacêutica de acordo com a invenção, que contpem um primeiro componente selecionado a partir do polipeptídeo da SEQ ID NO:1, a sua variante funcionalmente equivalente e uma proteína de fusão de acordo com a invenção e um segundo vcomponente que é compreendido por um agente antitumoral, a composição pode ser apresentada como uma única formulação (por exemplo, na forma de um comprimido ou de uma cápsula que compreende uma quantidade fixa de cada um dos componentes) ou pode, por outro lado, ser apresentada na forma de formulações separadas a serem posteriormente combinadas para administração conjunta, sucessiva, ou separada. As composições da invenção também incluem a formulação na forma de um kit-of-partes em que os componentes são formulados separadamente, mas são acondicionados no mesmo recipiente. As pessoas versadas na técnica apreciarão que a formulação dos diferentes components no caso da segunda composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser similar, em outras palavras, formulados de forma semelhante (em comprimidos ou pílulas), que permitem a sua administração pela mesma via. No caso onde os diferentes componentes da invenção são formulados separadamente, os dois componentes podem ser apresentados em um blister. Cada blister contém os fármacos que devem ser consumidos durante o dia. Se os fármacos tiverem de ser administrados va'rias vezes ao dia, os fármacos correspondents a cada administração podem ser colocados em diferentes seções do blister, de preferência registrando em cada seção do blister a hora do bia em que eles deverão ser administrados. De uma forma alternativa, os components da composição da invenção podem ser formulados diferentemente de modo que os diferentes componentes são administrados diferentemente. Deste modo, é possível que o primeiro componente seja formulado como um comprimido ou cápsula para a sua administração oral e o segundo componente é formulado para sua administração intravenosa ou vice versa. A proporção entre os components que são parte das composições usadas na segunda composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser ajustada pela pessoa versada na técnica na dependência do agente antitumor usado em cada caso particular, da mesma forma que da indicação desejada. Deste modo, a invenção prevê composições em que a relação entre as quantidades dos dois componentes pode variar desde 50:1 até 1:50, em particular desde 20:1 até 1:20, desde 1:10 até 10:1, ou desde 5:1 até 1:5.

[00128] A primeira e a segunda composições farmacêuticas da invenção também podem conter um ou vários compostos adicionais para a prevenção e / ou tratamento de patologias em que existe uma divisão de células descontrolada, tal como câncer. Os referidos compostos adicionais, tais como agentes antitumorais podem formar parte da composição farmacêutica como entidades independentes.

[00129] A primeira e a segunda composições farmacêuticas da invenção também contêm um ou vários excipientes farmaceuticamente aceitáveis. “Excipiente farmaceuticamente aceitável” é compreendido por uma substância terapeuticamente inativa dita para ser usada para incorporar o ingrediente ativo e que é aceitável para o paciente a partir de um ponto de vista farmacológico / toxicológico e para o químico farmacêutico que manufatura o mesmo sob um ponto de vista físico / químico com relação à composição, formulação, estabilidade, aceitação por parte do paciente e biodisponibilidade.

[00130] O número e a natureza dos excipientes farmaceuticamente aceitáveis depended a forma de dosagem desejada. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos pela pessoa versada na técnica (Faulí y Trillo C. (1993) “Tratado de Farmacia Galénica”, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid). As ditas composições podem ser preparadas por meio dos métodos convencionais que são conhecidos no estado da técnica (“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20th edition (2003) Genaro A.R., ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, US).

[00131] A primeira e a segunda composições farmacêuticas da invenção ou podem ser administradas por meio de qualquer tipo de via adequada, tais como por via oral, via tópica, por meio de inalação ou via parentérica de modo que os excipientes farmaceuticamente aceitáveis necessários para a formulação da forma de dosagem desejada sejam incluídos. A via de administração preferida para as ditas composições farmacêuticas é a via endovebosa.

[00132] “Via oral” é compreendida como a composição farmacêutica incluída no organismo depois da deglutição. De acordo com uma concretização particular, a composição farmacêutica da invenção pode estar emu ma forma de dosagem adequada para a sua administração por via oral, seja ela sólida ou líquida. As formas de dosagem adequadas para a sua administração por via oral podem ser comprimidos, cápsulas, xaropes ou soluções, e podem conter qualquer excipiente convencional conhecido na técnica, tais como ligantes, por exemplo, xarope, acácia, gelatina, sorbitol ou polivinilpirrolidona; agentes de enchimento, por exemplo, lactose, açúcar, corn amido, fosfato de cálcio, sorbitol ou glicina; lubrificantes para compressão, por exemplo, estearato de magnésio; agentes de desintegração, por exemplo, amido, polivinilpirrolidona, glicolato de amido de sódio ou celulose mifcro cristalina; ou agentes de umedecimento farmaceuticamente aceitáveis tais como lauril sulfato de sódio. As composições orais sólidas podem ser preparadas por meio de processos convencionais de mistura, enchimento ou compressão. Operações de mistura repetitivas podem ser usadas para distribuir completamente o ingrediente ativo nessas composições que utilizam grandes quantidades de agentes de enchimento. As ditas operações são convencionais na técnica. Os comprimidos podem ser preparados, por exemplo, por meio de granulação úmida ou seca, e opcionalmente revestindo-as de acordo com os processos conhecidos na prática farmacêutica convencional, com particularidade com um revestimento entérico.

[00133] Por outro lado, “via tópica” é compreendida como uma administração por via não sistêmica, e inclui a aplicação de uma composição farmacêutica da invenção externalmente na epiderme, na cavidade oral e a instilação da dita composição nas orelhas, olhos e nariz, e em que ela não entra de forma significativa no fluxo sanguíneo. “Via sistêmica” é compreendida como a administração por meio de via oral, via intravenosa, via intraperitoneal e via intramuscular. A quantidade de anticorpo requerida para o efeito terapêutico ou profilático sera naturalmente variável de acordo com o anticorpo escolhido, a natureza e a gravidade da enfermidade que está sendo tratada, e do paciente.

[00134] “Inalação” é compreendida como a administração por via intranasal e por inalação oral. As formas de dosagem adequadas para a dita administração, tais como uma formulação em aerossol ou um inalador dosado por medidor pode ser preparada por meio de técnicas convencionais. De acordo com uma concretização a via de administração é compreendida pela via intranasal.

[00135] Da forma que é utilizado neste contexto, o termo “parentérico”, inclui a administração por meio de via intravenosa, via intraperitoneal, via intramuscular ou via subcutânea. Formas de dosagem de administração parentérica sucutânea, intramuscular e intravenosa são de uma maneira geral preferidas.

[00136] De acordo com uma concretização, a primeira e a segunda composições farmacêuticas da invenção podem ser adaptadas para a sua administração parentérica, tais como soluções estéreis, suspensões ou produtos liofilizados na forma de dosahem unitária apropriada. As composições farmacêuticas que são adequadas para o seu uso injetável incluem soluções estéreis (quando elas são solúveis em água), or dispersões e pós estéreis para o preparao extemporâneo de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para a sua administração por via intravenosa, alguns carreadores adequados incluem solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril, e deve ser fluida até ao ponto em que exista a capacidade fácil para ser injetada. Ela deve ser estável na preparação e condições de armazenamento, e deve ser protegida da ação de contaminação por microorganismos tais como bacterias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou um meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, um poliol farmaceuticamente aceitável, tal como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido e as suas misturas adequadas. Fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, por meio de utilização de um revestimento, tal como lecitina, por meio da manutenção da dimensão de partícula requerida no caso de dispersão e por meio de utilização de agentes tensioativos. A prevenção contra a ação dos microorganismos pode ser conseguida por meio de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, tiomersal, e outros assemelhados. Na maior parte dos casos, sera preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares; polialcoóis tais como manitol, sorbitol; ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser causada por meio da inclusão de um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[00137] As soluções estéreis injetáveis podem ser preparadas pela inclusão do composto ativo na quantidade requerida em um solvente adequado com um ou uma combinação dos ingredientes mencionados anteriormente, conforme necessário, seguidos por esterilização por meio dee filtração através de membranas estéreis. De uma maneira geral, as disperses são preparadas pela inclusão do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e o resto dos ingredientes reueridos a partir de entre aqueles anteriormente listados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções estéreis injetáveis, os processos de preparação preferidos são secagem a vácuo e liofilização que dão origem a um pó com o ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional a partir de uma solução estéril previamente filtrada do mesmo.

[00138] As composições farmacêuticas da invenção podem ser adequadamente administradas por meio de infusão de pulso, por exemplo, com doses decrescentes da composição. De preferência, a dose é administrada oir meio de injeções, com maior preferência injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é aguda ou crônica.

[00139] De acordo com uma concretização, a primeira ou a segunda composições farmacêuticas da invenção são preparadas com carreadores que protegerão o dito polipeptídeo contra uma rápida eliminação a partir do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de administração microencapsulada. Poderão ser usados polímeros biocompatíveis biodegradáveis, tais como vinilacetato de etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Os processos para a preparação das ditas formulações serão evidentes para as pessoas versadas na técnica. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente na Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc.

[00140] As composições de liberação controlada também incluem preparados de cristais anticorpos em suspensão em formulações adequadas que podem manter é compreendido por cristais em suspensão. Estes preparados, quando eles são injetados por via subcutânea ou intraperitoneal podem produzir um efeito de liberação sustentada. Outras composições também incluem anticorpos aprisionados em lipossomas. Os lipossomas que contêm esses anticorpos são preparados por meio de métodos conhecidos tais como Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949.

[00141] Apesar do fato de que o Omomyc e os conjugados e proteínas de fusão que contêm Omomyc são capazes de translocação através de membranas biológicas, a pessoa versada na técnica compreenderá que também poderá ser conveniente formular os conjugados ou proteínas de fusão que compreendem Omomyc em nanopartículas. As nanopartículas podem contribuir para preserver a integridade do polipeptídeo no fluido biológico até ele alcançar o órgão visado. Além disso, no caso das composições compreenderem um agente antitumor, a encapsulação da composição pode diminuir os efeitos secundários causados pelas porções antitumor que permitem o direcionamento da nanoparticule para um órhão de interesse.

[00142] Deste modo, de acordo com outra concretização, as composições farmacêuticas da invenção compreendem os conjugados, proteínas de fusão e composições de acordo com a invenção formando parte de uma nanopartícula.

[00143] Nanopartículas adequadas que podem ser usadas no contexto da presente invenção incluem tais materiais em nanoescala na forma de uma nanopartícula baseada em lipídeo, uma nanopartícula superparamagnética, uma nanoshell, um nanocristal semicondutor, um ponto quântico, uma nanopartícula baseada em polímero, uma nanopartícula baseada em silício, uma nanopartícula baseada em sílica, uma nanopartícula baseada em metal, a fulereno e um nanotubo.

[00144] A distribuição direcionada pode ser obtida por meio da adição de ligantes sem comprometer a capacidade das nanopartículas distribuírem as suas cargas de polipeptídeos. Considera-se que isto possibilitará a distribuição para células, tecidos e órgãos específicos. A especificidade de direcionamento dos sistemas de distribuição baseados em ligantes é baseada na distribuição dos receptores de ligantes nos diferentes tipos de células. O ligante de direcionamento pode ser, seja de forma não-covalente ou de forma covalente associado com uma nanopartícula, e pode ser conjugado às nanopartículas por meio de uma variedade de métodos tais como discutidos neste contexto.

[00145] Exemplos de proteínas ou peptídeos que podem ser usados para direcionar nanopartículas incluem transferina, lactoferrina, TGF-β, fator de crescimento do nervo, albumina, peptídeo HIV Tat, peptídeo RGD, e insulina, da mesma forma que outros.

[00146] A primeira e a segunda composições farmacêuticas da invenção poden ser formuladas com um carreador farmaceuticamente aceitável. De acordo com uma concretização preferida, o carreador n]ao permite a distribuição direta da proteína de fusão ou da composição para o citoplasma das células, ou seja, o carreador não é capaz de fundir com a membrana plasmática das células visadas. Da forma que é utilizado neste contexto, “carreador” significa qualquer substância que serve para melhorar a distribuição e a eficiência do princípio ativo dentro da composição farmacêutica. Exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de água, solução salina, solução salina tamponada por fosfato, dextrose, glicerol, etanol e assemelhados, bem como as suas combinações. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem comprender ainda quantidades quantidades mínimas de substâncias auxiliares tais como agentes de umedecimento ou emulsionamento, preservativos ou tampões, que aumentam a vida de prateleira ou eficácia da proteína de fusão ou das composições que formam parte das composições farmacêuticas. Exemplos de carreadores adequados são amaplamente conhecidos na literatura (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). Exemplos de carreadores sem limitação são uma série de sacáridas tais como lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, e maltitol; uma série de amido, tais como amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, e amido de batata; uma série de celulose, tais como celulose, metil celulose, carboximetil celulose de sódio, e hidroxil propilmetil celulose; e uma série de enchimentostais como gelatina e polivinilpirrolidona. Em alguns casos, um agente de desintegração tal como polivinilpirrolidona reticulado, ágar, ácido algínico, ou alginato de sódio poderão ser adicionados.

[00147] A primeira e a segunda composições farmacêuticas da invenção são adequadas para a administração em qualquer tipo de mamífero, de preferência um ser humano.

[00148] A invenção é detalhada em seguida por meio dos exemplos sequintes que são meramente ilustrativos e em hipótese nenhuma significam limitação para o escopo da invenção.

EXEMPLOS Materiais e Métodos Exemplo 1 Expressão da construção Omomyc em meio rico ou em meio M9 mínimo

[00149] Para a produção de Omomyc em meio rico, 1 L de meio 2YT contendo ampicilina com BL21-AI™ One Shot® Chemically competent Escherichia coli (Life technologies) transformado com a construção do Omomyc-pET- 3a foi inoculado, cultivado sob 37°C com agitação sob 250 rpm até OD600 alcançar 0,8. A expressão de proteína foi induzida com 10 ml de solução de Arabinose, incubação sob 37°C durante 12 h. De uma forma alternativa, para a produção de Omomyc em meio mínimo de M9, E. coli transformado com a construção de Omomyc-pET3a foi inoculado em 1L de meio mínimo de M9 que continha cloramfenicol e ampicilina com BL21-CodonPlus (Strategene) e cultivado sob 37°C com agitação sob 250 rpm até OD60o alcançar 0,8. A expressão de proteína foi induzida com 1 ml de solução IPTG 1000X. A cultura de células foi incubada com agitação sob 250 rpm sob 37°C durante 12 h.

[00150] A cultura bacteriana foi centrifugada sob 10.000 rpm, 4°C, 5 minutos em um rotor SLA-1500 utilizando-se garrafas de 250 ml. A cultura foi centrifugada sequencialmente para combinar o equivalente de 1L de cultura por garrafa.

[00151] A fim de verificar a expressão da proteína de sucesso, alíquota de 1 ml a partir das culturas foi coletada e sua OD600 foi medida. 800 μL da dita alíquota foram rodados sob 16.060 xg durante 1 min. e o sobrenadante foi descartado. A pílula foi colocada em suspensão em um volume de tampão IB Laemmli equivalente a (valor 0,1 x OD600 ) μL a fim de assegurar quantidades iguais de extrato de células lisadas em cada amostra e facilitar a comparação entre células antes e depois da expressão de proteínas. Então, as amostras foram misturadas por vortex, sonicadas durante 5 segundos sob potência máxima, congeladas em nitrogênio líquido e finalmente, submetidas a ebulição durante 2 minutos (repetido 3 vezes) antes de serem carregadas em uma desnaturação 16,5% gel de acrilamida SDS-PAGE. Electroforese foi seguida por coloração de azul Coomassie ou transferência Western. O tampão IB Laemmli foi otimizado para permitir a solubilização dos corpos de inclusão e para assegurar a migração adequada e separação de proteínapara visualizar a expressão do Omomyc.

Exemplo 2 Purificação do Omomyc b-HLH-LZ

[00152] Grânulos de células foram colocados em suspensão em 3 ml de tampão de lise por grama de grânulos em vórtice. 150 μL de solução Triton por grama de grânulo de cultura foi adicionado. A viscosidade da suspensão foi reduzida por meio de sonicação em gelo, sob potência de 15 durante 6 x 15 segundos utilizando-se um homogeneizador ultrassônico.

[00153] Então, o equivalente de 100 μL/g do grânulo de cultura de DNase I pancreático bovino foi adicionado seguido por uma incubação de 60 minutos sob 37°C com agitação sob 50 rpm.

[00154] As amostras foram centrifugadas 20 min. sob 12.000 Dg (13.000 rpm em um rotor SS34 em uma Sorvall RC 5B Plus, usar garrafas centrífugas de 35 ml), 4°C para sedimentar os corpos de inclusão da mesma forma que complexos de alto peso molecular tais como oaredes celulares, ribossomas e DNA genômico não degradado. Lipídeos, soluble proteínas, aminoácidos, açúcares e ácidos nucléicos constituem o sobrenadante que foi descartado depois da centrifugação.

[00155] Os corpos de inclusão sedimentados foram solubilizados com 15 ml de tampão Bull cracker parte A por meio de vórtice. Este tampão desnaturante, ácido e de força iônica elevada possibilita a completa solubilização daconstrução do Omomyc a partir dos corpos de inclusão e permite a eliminação de complexos de alto peso molecular e DNA residual por centrifugação.

[00156] A solução de corpos de inclusão 1:1 foi diluída com Bull cracker parte B. Depois disso, as amostras foram centrifugadas 30 min. sob 30.000xg (19,000 rpm em um rotor SS34 em uma Sorvall RC 5B Plus) sob 4°C.

[00157] O sobrenadante foi purificado por meio de cromatografia de permuta catiônica em 5 colunas de permuta catiônica de 5 ml (colunas HiTrap™ SP Sepharose HP provenientes da GE Healthcare ou equivalentes) montadas em série em um sistema FPLC. Primeiro, a coluna foi lavada com 2 volumes de coluna (CV) de tampão B de FPLC sob uma taxa de fluxo de 5 ml/min. Então, a coluna foi equilibrada com 5 CV (125 ml) de tampão A de FPLC de uma taxa de fluxo de 2,5 ml/min. O sobrenadante (equivalente a um máximo de 9 g de sedimento de cultura por carga) foi carregado sob 2,5 ml/min. Imediatamente após o carregamento do sobrenadante, a coluna foi lavada com 75 ml (3 CV) de tampão U8, sob uma taxa de fluxo de 2,5 ml/min. Lavada com 1 CV de tampão A. Então, 3 CV de Tampão B a 10% foi adicionado à coluna. Eluição do Omomyc foi realizada com um gradiente de Tampão B de 10-35% em 50 ml (0.5%/ml) sob 2,5 ml/min. em frações de 2.5 ml. Nestas condições o Omomyc foi eluído sob ~1.5 M NaCl (i.e. ~30% v/v do gradiente) com uma pureza de 90%.

[00158] As frações que continham a construção pura foram reunidas e dessalinizadas em 5 colunas consecutivas de HiTrap™ Desalting provenientes da GE Healthcare (ou o equivalente) equilibradas com tampão Desalting TFA, sob uma taxa de fluxo de 3,0 ml/min. As fracções reunidas foram injetadas (volume máximo de 7,5 ml por injeção) e a eluição foi seguida com detector de OD280. A proteína foi eluída dentro dos primeiros 15 ml depois da injeção. As frações seguintes que mostraram baixos valores de OD280 e alta condutividade foram descartados. Este método proporcionou a recuperação de 95% de 98-99%de proteína dessalinizada.

[00159] A proteína purificada pode concentrar-se através de centrifugação em filtros centrífugos Amicon®Ultra, Ultracel®-3K (Millipore™) ou equivalentes, ou por meio de liofilização. Para concentração utilizando-se o Amicon®Ultra, seguiram-se as indicações do fabricante. De uma forma alternativa, para liofilização, adicionou-se 50% v/v de acetonitrila às frações dessalinizadas, congelou-se em nitrogênio líquido e liofilizou-se. A proteína liofilizada espumosa obtida pode ser pesada e ressolubilizada para 100 μl/mg em 50 % v/v acetonitrila que continha 0,05 % v/v TFA, aliquotas de 1 a 10 mg por Eppendorf e liofilizou-se de novo. Rendimento em torno de 25 mg/L da cultura em meio rico e 15 mg/L de cultura em meio M9 mínimo.

Exemplo 3 O Omomyc transduz-se em células A549

[00160] Os autores da invenção visaram demonstrar que as células tratadas com Omomyc mostraram que, mesmo depois desse curto espaço de tempo, o Omomyc já atinge o núcleo.

[00161] A expressão e purificação do Omomyc foi realizada tal como se encontra ilustrada nos Exemplos 1 e 2.

[00162] Células A549 (ATCC) foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro bovino fetal a 10% sob 37 °C em uma atmosfera umedecida que continha CO2 a 5%. Para microscopia de fluorescência, 20.000 células A549 foram semeadas em lamelas de vidro de 12,7 mm (0,5 polegada) e cultivaram-se durante 16 horas. Meio recente suplementado com peptídeo Omomyc (35 μM) foi adicionado e incubado durante 2 horas sob 37°C. As células foram lavadas 3 vezes com PBS e fixadas em paraformaldeído a 3%, e observadas sob o microscópio.

[00163] A Figura 1 mostra que o Omomyc pode funcionar como um domínio de transdução de proteínas transduzindo-se através da membrana celular e translocando- se para o núcleo.

Exemplo 4 O Omomyc reduz o número de células A549 viáveis e induz a apoptose

[00164] A549 cells were incubated in 24- well plates over a period of 72 hours with 10 μM Max* or Omomyc. Max* was obtained as described in Montagne M. et al. (Montagne M. et al. 2012. PLoS One, 7(2):e32172). Cells were harvested and stained with Annexin V and PI according to the manufacturer protocol (Tali® Apoptosis Kit A10788, Life technologies) and the fluorescence quantified using Tali® image-based cytometer.

[00165] Neste estudo os autores da presente invenção mostram que o Omomyc é mais eficiente na redução do número de células A549 viáveis do que o domínio bHLHZ de Max (Figura 2 A e C). De forma consistente a percentagem das células mortas / apoptóticas é mais alta no tratamento com o peptídeo Omomyc do que com o peptídeo Max* (Figura 2B e D).

Exemplo 5 Omomyc é mais do que o dobro de c-Myc* e mais termicamente estável do que Max* e c-Myc* em solução.

[00166] Polipeptídeos termicamente estáveis são vantajosos nas circunstâncias quando o polipeptídeo tem de ser formulado como uma composição farmacêutica. Conseqüentemente, determinaram-se as estabilidades térmicas comparativas do Omomyc e do Max*.

[00167] O gene de Omomyc foi expresso da forma descrita no Exemplo 1 e purificado como no Exemplo 2 anteriormente. A purificação de Max* foi realizada da forma descrita em detalhes em Beaulieu M.E. et al., 2013 (Methods Mol Biol, 1012:7-20). Sucintamente, bactérias BL21-DE3-pLys foram transformadas com um vetor de expressão pET-3a que continha o inserto Max*, e cultivadas como descrito acima. A indução foi realizada com IPTG (0,6 mM) durante 4 horas, depois do que as células foram colhidas. Depois da lise com o tampão Lysis e centrifugação sob 30 000 x g, o extrato de proteína solubilizada foi purificado utilizando-se cromatografia de permuta catiônica e dessalinizado da forma descrita anteriormente. As proteínas purificadas e liofilizadas foram ressuspensas em 50 mM de KH2PO4, 50 mM de KCl, 5 mM de DTT (o pH foi ajustado utilizando-se 1N KOH ou 1N HCl).

[00168] Medições de dicroísmo circular foram realizadas da forma descrita em Beaulieu M.E. et al., 2012 (J Mol Recognit, 25(7):414-26), utilizando-se uma concentração de proteínas de 32 μM. Os expectros de CD foram registrados sob 20°C e a desnaturação térmica foi realizada sob 1°C/min. (Figura 3A e 3B), monitorando-se sob um comprimento de onda de 222 nm para medir o teor helicoidal (reflectindo o, estado estruturado dobrado) da proteína.

Exemplo 6 O Omomyc penetra os núcleos das células mais eficientemente do que o Max*

[00169] Sucintamente, os peptídeos Omomyc e Max* purificados foram rotulados com fluoresceina- maleimida (FITC) através de um resíduo de cisteína C- terminal. Depois de purificação e avaliação da presença de uma única etiqueta fluorescente por molécula de proteína por espectrometria de massa, diferentes concentrações de proteína (5 μM, 10 μM ou 25 μM) foram adicionadas às células A549 (adenocarcinoma de pulmão mutante K-Ras) cultivadas em RPMI que continha soro a 0,5% e incubadas durante 2 h sob 37°C antes de serem lavadas três vezes com PBS e fixadas em PFA a 4% durante 10 min., coradas com 1.5 μg/ml Hoechst durante 10 min. e montadas em lâminas de microscopia. As imagens de microscopia confocal mostraram que o Omomyc penetra nos núcleos das células A549 mais eficientemente do que o Max* sob concentrações de 5, 10 e 25 μM (dados não ilustrados). A intensidade de fluorescência nuclear foi quantificada utilizando-se ImageJ, com de 30 até 80 células contadas por imagem. Na Figura 4 está ilustrada a quantificação da penetração celular observada para o Omomyc e Max* em células A549 fixas.

[00170] A capacidade de penetração celular superior do Omomyc sobre o Max* foi confirmada sob uma concentração de 20 μM em células vivas (para evitar possíveis artefatos de fixação) depois de 20 minutos de incubação. Sucintamente, o Omomyc e o Max* marcados com FITC foram adicionados às células A549 cultivadas em RPMI que continha soro a 0,5% e incubadas durante 20 minutos sob 37°C antes de serem lavadas três vezes em PBS e montadas com meio de montagem contendo Hoechst. As imagens de microscopia confocal mostraram que o Omomyc penetra os núcleos de células A549 vivas mais eficientemente do que o Max* sob 2 0 μM (dados não ilustrados) . A intensidade de fluorescência nuclear foi quantificada utilizando-se ImageJ, com de 30 até 80 células contadas por imagem. A quantificação da penetração celular observada para o Omomyc e o Max* em células vivas A549 está ilustrada na Figura 5.

Exemplo 7 A entrada de Omomyc ocorre através de um processo dependente de ATP

[00171] O Max* mostrou penetrar as células através de um processo dependente de ATP, que pode ser bloqueado baixando a temperatura a 4°C. um mecanismo semelhante está envolvido na capacidade de penetração celular do Omomyc. As células A549 foram incubadas durante 2 horas com 2 0 μM de peptídeo marcado por FITC sob 4°C e fixadas com 4% PFA, antes de serem lavadas três vezes com PBS e montadas em lâminas de microscopia utilizando-se Hoechst-que continha meios de monatagem. As imagens de microscopia confocal mostraram que a entrada do Omomyc pode ser bloqueada abaixando-se a temperatura para 4°C .

Exemplo 8 O Omomyc reduz o número total de células mais eficientemente do que o Max*

[00172] Sucintamente, células de adenocarcinoma de pulmão A549 e H1650 foram incubadas com 25 μM de peptídeos de Omomyc ou Max* em RPMI que continha soro a 5% e fixadas durante o tempo indicado (2 dias ou 4 dias) com PFA a 4% seguido por coloração por violeta cristal (voleta cristal a 0,5% em metanol a 25% durante 10 minutos) e lavagem pelo menos três vezes com água. Tanto o Omomyc quanto o Max* impediram o crescimento das células, mas o Omomyc é mais eficiente em fazê-lo (Figura 6). As células coradas com violeta cristal foram dissolvidas em ácido acético a 10% e a solução resultante foi diluída 1:4 em H2Odd e quantificada pela medição de absorvência sob OD595. A quantificação da inibição da proliferação por violeta cristal mostrou que o Omomyc é claramente mais eficiente do que o Max* em reduzir a proliferação de células H1650 (células de adenocarcinoma de pulmão mutantes EGFR) quando usadas sob concentração de 25 μM durante 6 dias (Figura 7).

[00173] A fim de se calcular o IC50 do Omomyc e do Max, células A549 foram tratadas com a concentração de peptídeo indicada em meios de cultura que continham soro a 5% e coloridas com xioleta cristal da forma descrita anteriormente. A quantificação foi realizada da forma descrita anteriormente. A Figura 8 mostra a resposta de dose das células A549 ao Omomyc contra o Max* mostrando que o Omomyc é dotado de um IC50 mais baixo do que o Max* (ou seja, o Omomyc necessita de uma dose mais baixa em comparação com o Max* a fim de reduzir o número de células para metade). De uma forma específica, IC50 para o Omomyc é 1,2 μM e o IC50 para o Max* é 2,6 μM.

[00174] O efeito do Omomyc na proliferação de células foi ensaiado em células de glioma U87. As células de glioma U87 foram incubadas com peptídeos Omomyc ou Max* (concentração final 25 μM) em DMEM que continha soro a 5% durante 48 h. As células foram tripsinizadas e contadas utilizando-se o contador de células Tali (Life technologies Inc.). A Figura 9 mostra que o Omomyc reduz a proliferação das células de glioma U87 mais eficientemente do que o Max*.

Exemplo 9 O Omomyc atinge eficientemente o tecido do pulmão e cérebro depois de administração intranasal

[00175] Animais foram tratados com uma única dose de 37,5 mg/kg de Omomyc ou deixadis sem tratamento (tratados com PBS) por meio de administração intranasal. 10 minutos depois da administração intranasal o peptídeo fluorescente foi detectado. O pulmão dos animais tratados aparece fluorescente como uma consequência da localização do Omomyc (Figura 10A). Isto demonstra que o peptídeo Omomyc pode ser administrado aos animais por meio de instilação intranasal e atinge o pulmão eficientemente. O cérebro dos mesmos animais descritos na figura anterior também se apresenta fluorescente (Figura 10B). É evidente que o peptídeo Omomyc fluorescente pode passar a barreira sangue-cérebro (BBB) e alcançar o cérebro.

Exemplo 10 O peptídeo Omomyc é dotado de um efeito terapêutico in vivo

[00176] Administrado como um peptídeo de forma intranasal, o Omomyc reduz a proliferação em um modelo de adenocarcionama de pulmão de camundongo impulsionado por KRas. Os inventores usaram um modelo de tumorigênese de camundongo impulsionado por KRAS (o modelo LSLKRasG12D). Sucintamente, camundongos com 8 semanas de idade foram instilados com um vírus AdenoCre para induzir a expressão da proteína de mutante KRas-G12D especificamente nos pulmões. Quando os camundongos desenvolveram adenocarcinoma de pulmão (18 semanas depois da infecção), os animais foram tratados de forma intranasal com the peptídeo Omomyc (15 mg/kg em volume de 35 μl) diariamente durante 3 dias. O Omomyc reduziu a taxa proliferante de tumores (coloração Ki67; Figura 11A) e reduziu a densidade celular (Figura 11B).

[00177] O peptídeo Omomyc também reduz a carga tumoral in vivo depois de 1 semana de tratamento. Utilizando-se o mesmo modelo de camundongo e condições experimentais tais como descritas anteriormente, the animas foram tratados diariamente durante 1 semana com 15 mg/kg de peptídeo. O percentual da área de tumor foi medido utilizando-se ImageJ. A Figura 12 mostra que o Omomyc reduz a carga tumoral em um modelo de camundongo com adenocarcinoma de pulmão impulsionado por KRas.

Claims

1. Uso de um polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 1 ou um polipeptídeo que resulta da adição de uma metionina na extremidade N-terminal da SEQ ID NO: 1, o uso caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para prevenção e/ou tratamento de câncer, em que o uso não envolve a administração de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo consistindo na SEQ ID NO: 1 ou o polipeptídeo que resulta da adição de uma metionina na extremidade N- terminal da SEQ ID NO: 1 e em que o polipeptídeo deve ser administrado.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo deve ser administrado sem utilização de veículos para liberação do polipeptídeo no citoplasma ou na célula.