MD3442602T2 - Eliberarea vectorului virus-adenoasociat de micro-distrofină pentru tratarea distrofiei musculare - Google Patents

Eliberarea vectorului virus-adenoasociat de micro-distrofină pentru tratarea distrofiei musculare

Info

Publication number
MD3442602T2
MD3442602T2 MDE20190237T MDE20190237T MD3442602T2 MD 3442602 T2 MD3442602 T2 MD 3442602T2 MD E20190237 T MDE20190237 T MD E20190237T MD E20190237 T MDE20190237 T MD E20190237T MD 3442602 T2 MD3442602 T2 MD 3442602T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
muscle
mir
dystrophin
aav
micro
Prior art date
Application number
MDE20190237T
Other languages
English (en)
Inventor
Louise Rodino-Klapac
Jerry R Mendell
Kristin N Heller
Original Assignee
Res Inst Nationwide Childrens Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Res Inst Nationwide Childrens Hospital filed Critical Res Inst Nationwide Childrens Hospital
Publication of MD3442602T2 publication Critical patent/MD3442602T2/ro

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1719—Muscle proteins, e.g. myosin or actin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4707—Muscular dystrophy
    • C07K14/4708—Duchenne dystrophy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • C12N15/8645—Adeno-associated virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Invenţia se referă la vectori AAV recombinanţi care cuprind o genă miniaturizată a micro-distrofinei umane şi la metode de utilizare a vectorilor recombinanţi pentru a reduce sau preveni fibroza la subiecţii care suferă de distrofie musculară.

Description

DOMENIUL INVENŢIEI
Invenţia furnizează vectori de terapie genetică, cum ar fi vectori de virus adeno-asociat (AAV), care exprimă o genă de micro-distrofină umană miniaturizată, cum ar fi pentru utilizarea în metode de reducere şi prevenire a fibrozei la subiecţii care suferă de distrofie musculară.
STADIUL TEHNICII
Importanţa masei musculare şi a forţei pentru activităţile zilnice, cum ar fi locomoţia şi respiraţia şi pentru metabolismul întregului corp este fără echivoc. Deficitele funcţiei musculare produc distrofii musculare (MD) care se caracterizează prin slăbiciune şi pierdere musculară şi au un impact grav asupra calităţii vieţii. Cele mai bine caracterizate MD rezultă din mutaţii ale genelor care codifică membrii complexului proteic asociat cu distrofină (DAPC). Aceste MD rezultă din fragilitatea membranei asociată cu pierderea legăturii citoscheletului sarcolem de către DAPC. Distrofia musculară Duchenne (DMD) este una dintre cele mai devastatoare boli musculare care afectează 1 din 5000 de bărbaţi nou-născuţi.
Această aplicaţie include două abordări translaţionale pentru a dezvolta tratamentul pentru DMD. Infiltrarea fibrotică este profundă în DMD şi este un impediment semnificativ pentru orice potenţială terapie. De asemenea, este important de luat în considerare că numai înlocuirea genelor este împiedicată de severitatea fibrozei, deja prezentă la copiii foarte mici cu DMD. De altfel, biopsiile musculare la vârsta obişnuită a diagnosticului, între 4-5 ani, arată niveluri foarte semnificative de fibroză.
DMD este cauzată de mutaţii ale genei DMD care duc la reduceri ale ARNm şi absenţa distrofinei, o proteină sarcolemală de 427 kD asociată cu complexul proteic asociat distrofinei (DAPC) (Hoffman şi colab., Cell 51(6):919-28, 1987). DAPC este compus din mai multe proteine la sarcolema musculară care formează o legătură structurală între matricea extracelulară (ECM) şi citoschelet prin distrofină, o proteină care leagă actina şi alfa-distroglican, o proteină care leagă laminina. Aceste legături structurale acţionează pentru a stabiliza membrana celulelor musculare în timpul contracţiei şi pentru a proteja împotriva leziunilor induse de contracţie. Odată cu pierderea distrofinei, fragilitatea membranei are ca rezultat rupturi sarcolemale şi un aflux de calciu, declanşând proteazele activate de calciu şi necroza fibrelor segmentare (Straub şi colab., Curr Opin. Neurol. 10(2): 168-75, 1997). Acest ciclu necontrolat de degenerare şi regenerare musculară epuizează în cele din urmă populaţia de celule stem musculare (Sacco et al., Cell, 2010. 143(7): p. 1059-71; Wallace şi colab., Annu Rev Physiol, 2009. 71: p. 37-57), ducând la slăbiciune musculară progresivă, inflamaţie endomisială şi cicatrici fibrotice.
Fără stabilizarea membranei de la distrofină sau o micro-distrofină, DMD va manifesta cicluri necontrolate de leziuni şi reparaţii tisulare şi, în cele din urmă, va înlocui fibrele musculare pierdute cu ţesut cicatricial fibrotic prin proliferarea ţesutului conjunctiv. Fibroza este caracterizată prin depozitele excesive de proteine ale matricei ECM, inclusiv colagen şi elastina. Proteinele ECM sunt produse în principal din citokine, cum ar fi TGFβ, care este eliberată de fibroblastele activate care răspund la stres şi inflamaţie. Deşi principala caracteristică patologică a DMD este degenerarea miofibrelor şi necroza, fibroza ca o consecinţă patologică are repercusiuni egale. Supraproducţia de ţesut fibrotic restricţionează regenerarea musculară şi contribuie la slăbiciune musculară progresivă la pacientul cu DMD. Într-un studiu, prezenţa fibrozei pe biopsiile iniţiale ale muşchilor DMD a fost puternic corelată cu un rezultat motor slab la o urmărire de 10 ani (Desguerre şi colab., J Neuropathol Exp Neurol, 2009. 68(7): p. 762-7). Aceste rezultate indică fibroza ca un contributor major la disfuncţia musculară DMD şi evidenţiază nevoia de a dezvolta terapii care să reducă ţesutul fibrotic. Majoritatea terapiilor anti-fibrotice care au fost testate la şoarecii mdx acţionează pentru a bloca semnalizarea citokinelor fibrotice prin inhibarea căii TGFβ. MicroARN-urile (miARN-urile) sunt ARN-uri monocatenar de ~ 22 de nucleotide care mediază silenţierea genică la nivel post-transcripţional prin împerecherea cu bazele din 3' UTR al ARNm, inhibând translaţia sau promovând degradarea ARNm. O secvenţă de însămânţare de 7 pb la capătul 5' al miARN-ului ţinteşte miARN; recunoaşterea suplimentară este oferită de restul secvenţei vizate, precum şi de structura sa secundară. MiRNA joacă un rol important în patologia bolilor musculare şi prezintă profiluri de expresie care sunt dependente în mod unic de tipul de distrofie musculară în cauză (Eisenberg şi colab. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(43): p. 17016-21). Un număr tot mai mare de dovezi sugerează că miARN-urile sunt implicate în procesul fibrotic în multe organe, inclusiv inimă, ficat, rinichi şi plămâni (Jiang şi colab., Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(43): p. 17016-21). Recent, s-a demonstrat că reglarea în jos a miR-29 contribuie la fibroza cardiacă (Cacchiarelli şi colab., Cell Metab, 2010. 12(4): p. 341-51) şi expresia redusă a miR-29 a fost legată genetic cu muşchii pacienţilor umani cu DMD (Eisenberg şi colab. Proc Natl Acad Sci USA, 2007. 104(43): p. 17016-2). Familia miR-29 este formată din trei membri ai familiei exprimaţi din două clustere bicistronice de miARN. MiR-29a este coexprimat cu miR-29b (miR-29b-1); miR-29c este coexprimat cu o a doua copie a miR-29b (miR-29b-2). Familia miR-29 împărtăşeşte o secvenţă de seminţe conservată, iar miR-29a şi miR-29b diferă fiecare cu o singură bază de miR-29c. În plus, electroporarea plasmidei miR-29 (un grup de miR-29a şi miR-29b-1) în muşchiul mdx de şoarece a redus nivelurile de expresie ale componentelor ECM, colagenului şi elastinei şi a scăzut puternic depunerea de colagen în secţiunile musculare în decurs de 25 de zile după tratament (Cacchiarelli şi colab., Cell Metab, 2010. 12(4): p. 341-51).
Virusul adeno-asociat (AAV) este un parvovirus cu deficit de replicare, al cărui genom ADN monocatenar are o lungime de aproximativ 4,7 kb, incluzând 145 de repetiţii terminale inversate de nucleotide (ITR). Există mai multe serotipuri de AAV. Se cunosc secvenţele de nucleotide ale genomilor serotipurilor AAV. De exemplu, secvenţa de nucleotide a genomului AAV serotip 2 (AAV2) este prezentată în Srivastava şi colab., J Virol, 45: 555-564 (1983)) corectat de Ruffing şi colab., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994)). Ca alte exemple, genomul complet al AAV-1 este furnizat în GenBank Număr de Acces NC_002077; genomul complet al AAV-3 este furnizat în GenBank Număr de Acces NC_1829; genomul complet al AAV-4 este furnizat în GenBank Număr de Acces NC_001829; genomul AAV-5 este furnizat în GenBank Număr de Acces AF085716; genomul complet al AAV-6 este furnizat în GenBank Număr de Acces NC_00 1862; cel puţin porţiuni din genomurile AAV-7 şi AAV-8 sunt furnizate în GenBank Număr de Acces AX753246 şi, respectiv, AX753249 (vezi, de asemenea, Brevetele US Nr. 7.282.199 şi 7.790.449 referitoare la AAV-8); genomul AAV-9 este prezentat în Gao şi colab., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)); genomul AAV-10 este prezentat în Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006); iar genomul AAV-11 este prezentat în Virology, 330(2): 375-383 (2004). Serotipul AAVrh74 este descris în Rodino-Klapac şi colab. J. Trans. Med. 5: 45 (2007). Secvenţele-cis care direcţionează replicarea ADN-ului viral (rep), încapsidarea/ambalarea şi integrarea cromozomilor celulei gazdă sunt conţinute în ITR-uri. Trei promotori AAV (numiţi p5, p19 şi p40 pentru locaţiile lor relative pe hartă) conduc expresia celor două cadre de citire deschise interne AAV care codifică genele rep şi cap. Cei doi promotori rep (p5 şi p19), cuplaţi cu splitarea diferenţială a singurului intron AAV (de ex., la nucleotidele AAV2 2107 şi 2227), au ca rezultat producerea a patru proteine rep (rep 78, rep 68, rep 52 şi rep 40) din gena rep. Proteinele rep posedă proprietăţi enzimatice multiple care sunt în cele din urmă responsabile pentru replicarea genomului viral. Gena cap este exprimată de la promotorul p40 şi codifică cele trei proteine capside VP1, VP2 şi VP3. Splitarea alternativă şi situsurile de pornire a translaţiei fără consens sunt responsabile pentru producerea celor trei proteine capside înrudite. Un singur situs de poliadenilare consens este localizat la poziţia hartă 95 a genomului AAV. Ciclul de viaţă şi genetica AAV sunt revizuite în Muzyczka, Subiecte curente în microbiologie şi imunologie, 158: 97-129 (1992)).
AAV posedă caracteristici unice care îl fac atractiv ca vector pentru furnizarea de ADN străin către celule, de exemplu, în terapia genică. Infecţia cu AAV a celulelor din cultură este necitopatică, iar infecţia naturală a oamenilor şi a altor animale este silenţioasă şi asimptomatică. Mai mult, AAV infectează multe celule de mamifere, permiţând posibilitatea de a ţinti mai multe ţesuturi diferite in vivo. Mai mult, AAV transcrie celulele cu diviziune lentă şi care nu se divizează şi poate persista în esenţă pe toată durata de viaţă a acestor celule ca epizom nuclear activ transcripţional (element extracromozomial). Genomul proviral AAV este infecţios ca ADN clonat în plasmide, ceea ce face fezabilă construcţia genomilor recombinanţi. Mai mult, deoarece semnalele care direcţionează replicarea AAV, încapsidarea şi integrarea genomului sunt conţinute în ITR-urile genomului AAV, o parte sau toate cele interne de aproximativ 4,3 kb ale genomului (codifică replicarea şi proteinele structurale ale capsidei, rep-cap) pot fi înlocuite cu ADN străin, cum ar fi o casetă genică care conţine un ADN de interes şi un promotor de poliadenilare. Pot fi furnizate proteinele rep şi cap în trans. O altă caracteristică semnificativă a AAV este că este un virus extrem de stabil şi consistent. Rezistă cu uşurinţă condiţiilor folosite pentru a inactiva adenovirusul (56°C până la 65°C timp de câteva ore), făcând conservarea la rece a AAV mai puţin critică. AAV poate fi chiar liofilizat. În cele din urmă, celulele infectate cu AAV nu sunt rezistente la suprainfecţie.
Studii multiple au demonstrat expresia proteinei recombinate mediată de AAV pe termen lung (> 1,5 ani) în muşchi. Vezi, Clark şi colab., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler şi colab., Proc Nat. Acad Sc. SUA, 93: 14082-14087 (1996); şi Xiao şi colab., J Virol, 70: 8098-8108 (1996)). Vezi, de asemenea, Chao şi colab., Mol Ther, 2:619-623 (2000) şi Chao şi colab., Mol Ther, 4:217-222 (2001). Mai mult, deoarece muşchiul este foarte vascularizat, transcrierea AAV recombinantă a dus la apariţia produselor transgene în circulaţia sistemică după injectarea intramusculară, aşa cum este descris în Herzog şi colab., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997)) şi Murphy şi colab., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921-13926 (1997)). În plus, Lewis şi colab., J Virol, 76: 8769-8775 (2002)) au demonstrat că miofibrele scheletice posedă factorii celulari necesari pentru glicozilarea, plierea şi secreţia corectă a anticorpilor, ceea ce indică faptul că muşchiul este capabil de exprimare stabilă a terapiei proteice secretate.
Îmbunătăţirea funcţională la pacienţii care suferă de DMD şi alte distrofii musculare necesită atât restaurarea genelor, cât şi reducerea fibrozei. Există o nevoie de metode de reducere a fibrozei care pot fi asociate cu metode de restaurare a genelor pentru tratamente mai eficiente ale DMD şi ale altor distrofii musculare. miR29 este un potenţial regulator al genelor şi un candidat ideal pentru reducerea fibrozei musculare.
REZUMATUL INVENŢIEI
Într-un aspect, invenţia furnizează un vector AAVrh74 recombinant care cuprinde un element de control specific muscular legat în mod operabil la secvenţa de nucleotide din SECV ID NR.: 7.
Într-un aspect, invenţia furnizează o compoziţie care cuprinde vectorul AAVrh74 recombinant al invenţiei şi un purtător acceptabil farmaceutic.
Într-un aspect, invenţia furnizează vectorul AAVrh74 recombinant al invenţiei sau compoziţia conform invenţiei pentru utilizare în tratamentul distrofiei musculare.
Într-un aspect, invenţia furnizează vectorul AAVrh74 recombinant al invenţiei sau compoziţia conform invenţiei pentru utilizare în reducerea sau prevenirea fibrozei la un subiect care suferă de distrofie musculară.
Într-un aspect, invenţia furnizează vectorul AAVrh74 recombinant al invenţiei sau compoziţia conform invenţiei pentru utilizare în creşterea forţei musculare sau a masei musculare la un subiect care suferă de distrofie musculară.
În unele variante de realizare, subiectul suferă de distrofie musculară Duchenne.
Într-un aspect, invenţia furnizează o metodă in vitro de producere a unei proteine micro-distrofină funcţională care cuprinde infectarea unei celule gazdă cu un vector AAVrh74 recombinant al invenţiei şi exprimarea unei proteine micro-distrofină funcţională în celula gazdă.
Terapiile şi abordările combinate pentru reducerea şi prevenirea fibrozei folosind vectori de terapie genetică pot furniza miR-29 pentru a suprima fibroza împreună cu micro-distrofină pentru a aborda defectul genetic observat în DMD. După cum se arată în exemplele 5-7, tratamentul combinat a dus la o reducere mai mare a fibrozei, mărime musculară crescută şi forţă musculară crescută.
De exemplu, elementul de control specific muşchilor este elementul genei actinei scheletice umane, elementul genei actinei cardiace, factorul de legare a intensificatorului specific miocitelor MEF, creatinkinaza musculară (MCK), tMCK (MCK trunchiat), lanţul greu al miozinei (MHC), C5-12 (promotorul sintetic), elementul C5-12 (promotorul sintetic), elementul accelerator al creatinkinazei murine, elementul accelerator al creatinkinazei murine, elementul genei troponină C scheletică contracţii-scurte, elementul genei troponină C cardiacă contracţii-scurte, elementul genei troponinei I cu contracţie lentă, factorii nucleari inducibili de hipozia, elementul inductibil de steroizi sau elementul de răspuns la glucocorticoid (GRE).
De exemplu, oricare dintre vectorii rAAV ai invenţiei sunt legaţi operaţional la elementul de control specific al muşchilor care cuprinde secvenţa de nucleotide amplificatoare MCK din SECV ID NR.: 10 şi/sau secvenţa promotor MCK din SECV ID NR.: 11.
Invenţia prevede, de asemenea, compoziţii farmaceutice (sau uneori denumite aici pur şi simplu "compoziţii") care conţin oricare dintre vectorii rAAV ai invenţiei.
Invenţia prevede, de asemenea, particule virale care cuprind oricare dintre vectorii AAV recombinanţi ai invenţiei.
De exemplu, oricare dintre rAAV conform invenţiei poate fi administrat subiecţilor care suferă de distrofie musculară pentru a reduce fibroza, şi în special reduce fibroza în muşchiul scheletic sau în muşchiul cardiac al subiectului. Aceste metode pot cuprinde în plus etapa de administrare a unui rAAV care exprimă micro-distrofină.
"Fibroza" se referă la depunerea excesivă sau nereglementată a componentelor matricei extracelulare (ECM) şi procesele de reparare anormale în ţesuturi la leziuni, inclusiv muşchiul scheletic, muşchiul cardiac, ficat, plămân, rinichi şi pancreas. Componentele ECM care sunt depuse includ fibronectină şi colagen, de exemplu, colagen 1, colagen 2 sau colagen 3.
De exemplu, oricare dintre rAAV conform invenţiei poate fi administrat subiecţilor care suferă de distrofie musculară pentru a preveni fibroza, de exemplu, administrat înainte de a se observa fibroza la subiect. rAAV conform invenţiei sunt administrate subiectului care suferă de distrofie musculară pentru a preveni o nouă fibroză la aceşti subiecţi. Aceste metode pot cuprinde în plus etapa de administrare a unui rAAV care exprimă micro-distrofină.
Termenii "terapie combinată" şi "tratament combinat" se referă la administrarea unui vector rAAV care exprimă miR-29 şi a unui vector rAAV care exprimă micro-distrofină.
Subiectul poate suferi de distrofie musculară, cum ar fi DMD, distrofie musculară Becker sau orice altă distrofie musculară asociată distrofinei. În plus, subiectul poate suferi de distrofinopatie.
Invenţia furnizează vectori AAV recombinanţi cuprinzând o secvenţă de nucleotide care codifică o proteină micro-distrofină. Invenţia furnizează un rAAV care cuprinde a) un element de control specific al muşchilor legat operabil la secvenţa de nucleotide a SECV ID NR.: 7 sau b) secvenţa de nucleotide a SECV ID NR.: 9.
Un exemplu de microdistrofină care exprimă rAAV conform invenţiei este pAAV.mck.micro-distrofină care cuprinde secvenţa de nucleotide din SECV ID NR.: 9 şi este prezentată în Figurile 10 şi 11. Acest vector rAAV cuprinde promotorul MCK, o secvenţă de intron himerică, secvenţa de codificare a genei micro-distrofină, poliA, catena principală a plasmidei de rezistenţă la ampicilină şi pGEX cu originea şi replicarea pBR322. Vectorii AAV recombinanţi ai invenţiei sunt AAVrh.74.
Sunt descrişi vectori rAAV care exprimă micro-distrofină care cuprinzând o secvenţă de nucleotide care are cel puţin 65%, cel puţin 70%, cel puţin 75%, cel puţin 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, cel puţin 89%, cel puţin 89%, în mod mult mai obişnuit, cel puţin 89%, 89% 91%, 92%, 93%, sau 94% şi chiar mai obişnuit, cel puţin 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% identitate de secvenţă cu SECV ID NR.: 7 şi codifică o proteină micro-distrofină funcţională.
Invenţia furnizează vectori rAAV care exprimă micro-distrofină cuprinzând o secvenţă de nucleotide care hibridizează în condiţii stringente la secvenţa de acid nucleic din SECV ID NR.: 7 sau complimente ale acesteia şi codifică o proteină micro-distrofină funcţională.
Termenul "stringent" este utilizat pentru a se referi la condiţii care sunt înţelese în mod obişnuit în domeniu ca fiind stricte. Severitatea hibridizării este determinată în principal de temperatură, tăria ionică şi concentraţia agenţilor de denaturare cum ar fi formamida. Exemple de condiţii stricte pentru hibridizare şi spălare sunt clorură de sodiu 0,015 M, citrat de sodiu 0,0015 M la 65-68°C sau clorură de sodiu 0,015 M, citrat de sodiu 0,0015 M şi formamidă 50% la 42°C. Vezi, Sambrook şi colab., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Ed. a doua, Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). Condiţii mai stricte (cum ar fi temperatură mai mare, putere ionică mai mică, formamidă mai mare sau alt agent de denaturare) pot fi, de asemenea, utilizate, cu toate acestea, rata de hibridizare va fi afectată. În cazurile în care este vorba despre hibridizarea deoxioligonucleotidelor, condiţiile de hibridizare stringente exemplificative suplimentare includ spălarea în 6x SSC 0,05% pirofosfat de sodiu la 37°C (pentru oligo-baze 14), 48°C (pentru oligo-17 baze), 55°C (pentru oligo-bază 20-203°C), (pentru oligo-bază 20-203°C).
Alţi agenţi pot fi incluşi în tampoanele de hibridizare şi spălare în scopul reducerii hibridizării nespecifice şi/sau de fond. Exemple sunt albumină serică bovină 0,1%, polivinil-pirolidonă 0,1%, pirofosfat de sodiu 0,1%, dodecilsulfat de sodiu 0,1%, NaDodSO4, (SDS), ficoll, soluţia Denhardt, ADN-ul spermatozoizilor de somon sonicat (sau alţi ADN de tip sulfat neadecvaţi), deşi pot fi utilizaţi, de asemenea, alţi agenţi sulfataţi necomplementari. Concentraţia şi tipurile acestor aditivi pot fi modificate fără a afecta substanţial stringenţa condiţiilor de hibridizare. Experimentele de hibridizare sunt de obicei efectuate la pH 6,8-7,4, cu toate acestea, în condiţii tipice de putere ionică, rata de hibridizare este aproape independentă de pH. Vezi Anderson şi colab., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Cap. 4, IRL Press Limited (Oxford, Englşi). Condiţiile de hibridizare pot fi ajustate de către un specialist în domeniu pentru a se adapta acestor variabile şi a permite ADN-urilor de diferite secvenţe să formeze hibrizi.
Într-un alt aspect, vectorii rAAV care exprimă micro-distrofină cuprind secvenţa de codificare a genei micro-distrofinei legată operaţional la un element de control specific muscular. De exemplu, elementul de control specific muşchilor este elementul genei actină scheletică umană, elementul genei actină cardiacă, factorul de legare a amplificatorului specific miocitelor MEF, creatinkinaza musculară (MCK), tMCK (MCK trunchiat), lanţul greu al miozinei (MHC), C5-12 (promotorul sintetic), elementul de amplificare rapidă a creatinkinazei murine, elementul genei fast-twitch troponina C scheletică, elementul genei slow-twitch troponina C cardiacă, factorii nucleari inducibili de hipozia, elementul inductibil de steroizi sau elementul de răspuns la glucocorticoid (GRE).
În plus, invenţia furnizează vectori rAAV care exprimă micro-distrofină cuprinzând un element de control specific muşchilor care cuprinde secvenţa de nucleotide din SECV ID NR.: 10 sau SECV ID NR.: 11.
Invenţia prevede, de asemenea, compoziţii farmaceutice (sau uneori denumite aici pur şi simplu "compoziţii") care conţin oricare dintre vectorii rAAV ai invenţiei.
Invenţia prevede, de asemenea, particule virale care cuprind oricare dintre vectorii AAV recombinanţi ai invenţiei.
Invenţia furnizează, de asemenea, metode in vitro de producere a unei proteine funcţionale micro-distrofină cuprinzând infectarea unei celule gazdă cu un vector AAV recombinant care exprimă micro-distrofină conform invenţiei şi care exprimă o proteină micro-distrofină funcţională în celula gazdă.
Reducerea fibrozei la un subiect care are nevoie poate cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic din orice vector rAAV conform invenţiei care exprimă micro-distrofină. De exemplu, oricare dintre rAAV conform invenţiei este administrat subiecţilor care suferă de distrofie musculară sau distrofinopatie pentru a reduce fibroza, şi în special reduce fibroza în muşchiul scheletic sau în muşchiul cardiac al subiectului.
Prevenirea fibrozei la un subiect care are nevoie de aceasta poate cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic din orice vector AAV recombinant al invenţiei care exprimă micro-distrofină. De exemplu, oricare dintre rAAV conform invenţiei este administrat subiecţilor care suferă de distrofie musculară sau distrofinopatie pentru a preveni fibroza, de exemplu, rAAV conform invenţiei care exprimă micro-distrofină sunt administrate înainte ca fibroza să fie observată la subiect. În plus, rAAV conform invenţiei care exprimă micro-distrofină sunt administrate unui subiect cu risc de a dezvolta fibroză, cum ar fi cei care suferă sau sunt diagnosticaţi cu distrofinopatie sau distrofie musculară, de exemplu, DMD sau distrofie musculară Becker. rAAV conform invenţiei sunt administrate subiectului care suferă de distrofinopatie sau distrofinopatie distrofie musculară pentru a preveni o nouă fibroză la aceşti subiecţi.
Termenii "terapie combinată" şi "tratament combinat" se referă la administrarea unui vector rAAV care exprimă miR-29 şi a unui vector rAAV care exprimă micro-distrofină.
Când se administrează un vector rAAV care exprimă miR-29 şi un vector rAAV care exprimă proteina micro-distrofină, aceşti vectori rAAV pot fi administraţi concomitent sau administraţi consecutiv cu vectorul rAAV care exprimă miR29 administrat imediat înainte ca rAAV care exprimă proteina micro-distrofină să fie administrat consecutiv, sau vectorul rAAV care exprimă miR29 este administrat consecutiv, administrat imediat după rAAV care exprimă proteina micro-distrofină. Alternativ, vectorul AAV care exprimă proteina micro-distrofină poate fi administrat în aproximativ 1-5 ore sau 5-12 ore sau 12 până la 15 ore sau cu 15 până la 24 ore după administrarea rAAV care exprimă miR-29 sau vectorul AAV care exprimă proteina micro-distrofină poate fi administrat în aproximativ 1-5 ore sau 5-12 ore sau 12 la 15 ore sau cu 15 până la 24 ore înainte de administrarea rAAV care exprimă miR-29. Alternativ, vectorul AAV care exprimă proteina micro-distrofină poate fi administrat în aproximativ 1 sau 6 sau 12 sau 24 de ore după administrarea rAAV care exprimă miR-29 sau vectorul AAV care exprimă proteina micro-distrofină poate fi administrat în aproximativ 1 sau 6 sau 12 sau 24 de ore înainte de administrarea miR-A29.
Oricare dintre vectorii AAV ai invenţiei poate fi administrat pacienţilor diagnosticaţi cu distrofinopatie sau distrofie musculară, cum ar fi DMD sau distrofia musculară Becker, înainte ca fibroza să fie observată la subiect sau înainte ca forţa musculară să fi fost redusă la subiect sau înainte ca masa musculară să fi fost redusă la subiect.
Oricare dintre rAAV conform invenţiei poate fi administrat unui subiect care suferă de distrofinopatie sau distrofie musculară, cum ar fi DMD sau distrofia musculară Becker, care a dezvoltat deja fibroză, pentru a preveni o nouă fibroză la aceşti subiecţi. Invenţia prevede, de asemenea, administrarea oricăruia dintre rAAV conform invenţiei la pacientul care suferă de distrofie musculară care are deja o forţă musculară redusă sau are o masă musculară redusă pentru a proteja muşchiul de leziuni ulterioare.
Vectorul rAAV poate fi, de exemplu, administrat prin injecţie intramusculară sau injecţie intravenoasă.
Vectorul sau compoziţia rAAV poate fi administrat sistemic. De exemplu, vectorul sau compoziţia rAAV este administrarea parentală prin injecţie, perfuzie sau implantare.
Într-o altă variantă de realizare, invenţia furnizează o compoziţie cuprinzând vectorii rAAV care exprimă micro-distrofină sau care cuprind atât un vector rAAV care exprimă miR-29, cât şi şi vectorul rAAV care exprimă microdistrofină pentru reducerea fibrozei la un subiect care are nevoie. În plus, invenţia prezintă compoziţii care cuprind vectorii rAAV care exprimă microdistrofină sau care cuprind atât un vector rAAV care exprimă miR-29, cât şi vectorul rAAV care exprimă microdistrofină pentru prevenirea fibrozei la un pacient care suferă de distrofinopatie sau distrofie musculară, cum ar fi DMD sau distrofia musculară Becker.
Invenţia prezintă, de asemenea, compoziţii care cuprind vectori rAAV care exprimă proteina micro-distrofină sau cuprinzând atât un vector rAAV care exprimă miR-29, cât şi vectorul rAAV care exprimă proteina micro-distrofină pentru creşterea forţei musculare şi/sau a masei musculare la un subiect care suferă de distrofinopatie sau distrofie musculară, cum ar fi DMD sau distrofia musculară Becker.
Într-o altă variantă de realizare, invenţia furnizează compoziţii cuprinzând vectorii rAAV care exprimă proteina micro-distrofină sau cuprinzând atât un vector rAAV care exprimă miR-29 cât şi vectorul rAAV care exprimă proteina micro-distrofină pentru tratamentul distrofinopatiei sau distrofiei musculare, cum ar fi DMD sau distrofia musculară Becker.
Compoziţiile conform invenţiei sunt formulate pentru injectare intramusculară sau injectare intravenoasă. Compoziţia conform invenţiei este, de asemenea, formulată pentru administrare sistemică, cum ar fi administrarea parentală prin injecţie, perfuzie sau implantare. În plus, oricare dintre compoziţii este formulată pentru administrare la un subiect care suferă de distrofinopatie sau distrofie musculară, cum ar fi DMD, distrofie musculară Becker sau orice altă distrofie musculară asociată cu distrofina.
Invenţia descrie, de asemenea, administrarea oricăruia dintre rAAV conform invenţiei la pacientul care suferă de distrofie musculară care are deja o forţă musculară redusă sau are o masă musculară redusă pentru a proteja muşchiul de leziuni ulterioare.
În oricare dintre utilizările invenţiei, medicamentul este formulat pentru injectare intramusculară. În plus, oricare dintre medicamente poate fi preparat pentru administrare la un subiect care suferă de distrofie musculară cum ar fi DMD sau orice altă distrofie musculară asociată cu distrofină.
În plus, oricare dintre medicamentele invenţiei poate fi o terapie combinată în care vectorii rAAV care exprimă miR-29 şi vectorii rAAV care exprimă micro-distrofină sunt administraţi concomitent sau administraţi consecutiv cu vectorul rAAV care exprimă miR29 administrat imediat înainte de rAAV care exprimă micro-distrofină sau administraţi consecutiv cu vectorul rAVV care exprimă miR29 administrat imediat după rAAV care exprimă micro-distrofină. Alternativ, medicamentul cuprinde administrarea vectorului AAV care exprimă micro-distrofină administrată în aproximativ 1-5 ore după administrarea rAAV care exprimă miR-29 sau medicamentul cuprinde vectorul AAV care exprimă micro-distrofină administrat în aproximativ 1-5 ore înainte de administrarea rAAV care exprimă miR-29.
SCURTĂ DESCRIERE A FIGURILOR
Figura 1 prezintă o schemă a vectorului rAAV scAAVCrh.74.CMV.miR29c şi secvenţa de nucleotide a miR-29c într-o catena principală miR-30 naturală şi secvenţa de nucleotide a structurii de ac de păr presupuse.
Figura 2A-CD ilustrează faptul că injectarea de miR-29c în muşchi reduce colagenul în muşchi şi restabileşte expresia miR-29c.
Figura 3A-3C demonstrează că injectarea de miR-29c îmbunătăţeşte forţa musculară absolută (panoul A) şi forţa musculară specifică (panoul B), dar nu protejează împotriva leziunilor induse de contracţie (panoul C).
Figura 4A-4C afişează numărul de micro-distrofină de expresie a fibrelor musculare pentru a măsura eficacitatea eliberării transgenelor.
Figura 5A-5C demonstrează că co-livrarea miR-29c cu micro-distrofină reduce expresia colagenului (panoul A) şi expresia distrofinei indusă de fibroză.
Figura 6A-6D ilustrează faptul că injecţia intramusculară de miR-29c/micro-distrofină inhibă matricea extracelulară (ECM) în şoareci mdx/utrn+/- aşa cum s-a măsurat prin colagen 1 alfa (panoul A), colagen 3 alfa (panoul B), fibronectină (panoul C) şi TGF-β (panoul D).
Figura 7A-7C demonstrează injectarea intramusculară a forţei absolute crescute de miR-29c (panoul A), forţa specifică normalizată (panoul B) şi protecţie suplimentară împotriva leziunilor induse de contracţie (panoul C) în muşchi.
Figura 8 ilustrează faptul că combinaţia miR-29c/µ-dys creşte dimensiunea muşchilor la şoarecii trataţi la vârsta de 3 luni. Sunt indicate secţiuni de muşchi gastrocnemius mdx/utrn+/- tratate şi netratate coloraţi cu picrosirius roşu pentru colorarea colagenului. Zonele fibrotice sunt roz, iar muşchiul intact este în verde. La nivel macroscopic, combinaţia miR-29c/µ-dys scade fibroza şi creşte aria secţiunii transversale totale.
Figura 9A-F demonstrează că tratamentul cu miR-29c administrat concomitent cu micro-distrofină a crescut hipertrofia musculară şi hiperplazia, aşa cum se arată printr-o creştere a greutăţii totale a gastroc injectat în comparaţie fie cu unul injectat singur (panoul A), o creştere a creşterii dimensiunii medii a fibrei (panoul B), o creştere a ariei transversale a muşchiului (panoul D: neinjectat: 24.6 faţă de miR-29c: 26,3 faţă de micro-dys: 26,6 faţă de micro-dys/miR-29c: 33.1) şi o creştere a numărului de fibre musculare (panoul E), dar numărul de fibre musculare pe unitate de suprafaţă nu a fost afectată (panoul F). Panoul C compară mdx/utrn+/- martor cu miR-29c/µ-dys mdx/utrn+/- tratate, diametrul mediu a crescut de la 25,96 la 30,97 µm
Figura 10A-G demonstrează că tratamentul precoce al terapiei combinate AAV.miR-29c/micro-distrofină este mai eficient în reducerea fibrozei şi a expresiei ECM. Panoul A prezintă colorarea roşie cu picrosirius a AAV.miR-29c, AAV.micro-distrofină şi AAV.miR-29c/AAV.micro-distrofină de tip sălbatic, neinjectat la şoareci injectaţi la vârsta de 4-5 săptămâni, scoşi la douăsprezece săptămâni după injectare. Panoul B oferă cuantificarea colorării roşii picrosirius care arată că muşchiul co-tratat a avut o reducere de 51,1% a colagenului în comparaţie cu muşchiul GAS neinjectat. Panoul C demonstrează că qRT-PCR confirmă o creştere a nivelurilor transcriptului miR-29c în cohortele tratate. qRT-PCR semi-cantitativă arată o reducere semnificativă a nivelurilor de colagen I şi III (panourile d, e), fbn (panoul f) şi TGF-β1 (panoul g) în muşchiul tratat cu AAV.miR-29c/AAV.micro-distrofină în comparaţie cu membrul contralateral şi fiecare dintre terapiile unice pentru Error n=5, SEM bars, (scAAVrh.74.CMV.miR-29c), n=5 (scAAVrh.74.CMV.miR-29c/ssAAVrh.74.MCK.micro-distrofină), n=6 (ssAAVrh.74.MCK.micro-distrofină), n=9(md) soareci+/-). ANOVA într-o singură direcţie (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001)
Figura 11 demonstrează că terapia combinată timpurie restabileşte forţa şi protejează împotriva leziunilor induse de contracţie. Măsurarea forţei absolute (panoul A) şi a forţei specifice normalizate (panoul b) în urma contracţiei tetanice în toţi cei trei muşchi GAS injectaţi în tratament au fost semnificativ crescute în comparaţie cu muşchii mdx/utrn+/- netrataţi (panoul C). Muşchii au fost apoi evaluaţi pentru pierderea forţei în urma contracţiilor excentrice repetitive. Doar şoarecii trataţi cu miR-29c/micro-distrofină şi micro-distrofină împreună au arătat o protecţie împotriva pierderii forţei în comparaţie cu muschi mdx/utrn+\- netratat (albastru). Analiza bidirecţională a varianţei demonstrează semnificaţia în curbele de dezintegrare Bare de eroare, SEM pentru n=5 (rAAVrh.74.CMV.miR-29c), n=6 (rAAVrh.74.CMV.miR-29c/rAAVrh.74.MCK.micro-dystrophin), n=5 (rAAVrh.74.CMV.miR-29c), n=6 (rAAVrh.74.CMV.miR-29c/rAAVrh.74.MCK.micro-dystrophin), n=5 (rAAVrh.74.CMV.miR-29c), n=5 (rAAVrh.74.CMV.miR-29c), n=15 (şoareci mdx/utrn+/-). ANOVA într-o singură direcţie (*p<0,05,**p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001).
Figura 12 ilustrează tratamentul combinat miR-29c/micro-distrofină creşte dimensiunea muşchilor la şoarecii trataţi la vârsta de 1 lună. Muşchii GAS mdx/utrn+/- tratat şi netratat au fost secţionaţi şi coloraţi cu roşu picrosirius pentru a colora pentru colagen. Zonele fibrotice sunt roz, iar muşchiul intact este în verde. La nivel macroscopic, combinaţia miR-29c/micro-distrofină scade fibroza şi creşte aria secţiunii transversale totale.
Figura 13A - 13G demonstrează că tratamentul precoce (la 4-5 săptămâni) cu terapia combinată AAV.MCK.miR-29c/micro-distrofină este mai eficient în reducerea fibrozei şi a expresiei ECM. Panoul A furnizează colorarea cu roşu picrosirius la şoareci neinjectate şi injectaţi cu microdistrofină AAV.MCK.miR-29c/AAV.MCK. la vârsta de 4-5 săptămâni, extrase la douăsprezece săptămâni după injectare. Mărirea originală, Panoul B x20 oferă cuantificarea colorării roşii picrosirius demonstrând că muşchiul co-tratat a avut o reducere de 50,9% a colagenului în comparaţie cu muşchiul GAS netratat. Panoul C oferă qRT-PCR confirmând o creştere a nivelurilor transcriptului miR-29c în cohorta tratată. qRT-PCR semi-cantitativă arată o reducere semnificativă a nivelurilor de colagen 1A (Col1A; panoul D) şi colagen 3A (Col3A; panoul E), fibronectină (Fbn; panoul F) şi Tgfβ1 (panoul G) în musculatura contralaterală tratată cu AAV.MCK.miR-29c/AAV. (*p<0,05,****p<0,0001).
Figura 14A - 14G demonstrează că tratamentul tardiv (tratament la 12 săptămâni) cu terapia combinată AAV.MCK.miR-29c/micro-distrofină este eficientă în reducerea fibrozei şi a expresiei ECM. Panoul A oferă colorarea roşie cu picrosirius a AAV.MCK.miR-29c şi AAV.MCK.miR-29c/AAV.micro-distrofină netratate la douăsprezece săptămâni după injectare. Mărire originală, x20. Panoul B oferă cuantificarea colorării roşii picrosirius care demonstrează că muşchiul co-tratat a avut o reducere de 30,3% a colagenului în comparaţie cu muşchiul GAS netratat. Panoul C oferă qRT-PCR confirmând o creştere a nivelurilor de transcriere miR-29c în cohortele tratate. qRT-PCR semi-cantitativă a demonstrat o reducere semnificativă a nivelurilor de colagen 1A (Col1A; panoul D), colagen 3A (Col3A; panoul E), fibronectină (Fbn; panoul F) şi Tgfβ1 (panoul G) în AAV.miR-29c/AAV.micro-distrofină în comparaţie cu limbul contralateral tratat cu muşchiul tratat. ANOVA unidirecţională. Toate datele reprezintă media ± SEM. (** p<0,01, ****p<0,0001).
Figura 15A-15C demonstrează că terapia combinată timpurie (tratament la 4-5 săptămâni) a restabilit forţa şi a protejat împotriva leziunilor induse de contracţie. Măsurarea forţei absolute (panoul A) şi a forţei specifice normalizate (panoul B) în urma contracţiei tetanice MCK.miR-29c/muşchii GAS injectaţi cu micro-distrofină au fost semnificativ crescute în comparaţie cu muşchi netrataţi mdx/utrn+/-. (C) Muşchii au fost apoi evaluaţi pentru pierderea forţei în urma contracţiilor excentrice repetitive. Şoarecii trataţi concomitent cu miR-29c/micro-distrofină şi micro-distrofină singuri au arătat protecţie împotriva pierderii forţei în comparaţie cu muşchii netrataţi mdx/utrn+\- (roşu). ANOVA în două sensuri. Toate datele reprezintă media ± SEM (****p<0,0001).
Figura 16A - 16C demonstrează că terapia combinată tardivă a restabilit forţa şi a protejat împotriva leziunilor induse de contracţie. Măsurarea forţei absolute (panoul A) şi a forţei specifice normalizate (panoul B) în urma contracţiei tetanice rAAV.MCK.miR-29c şi rAAV care exprimă muşchii GAS injectaţi cu microdistrofină au fost semnificativ crescute în comparaţie cu muşchi mdx/utrn+/- netrataţi. În panoul C, muşchii au fost apoi evaluaţi pentru pierderea forţei în urma contracţiilor excentrice repetitive. Şoarecii co-trataţi cu rAAV.MCK.miR-29c/rAAV care exprimă micro-distrofină au arătat o protecţie împotriva pierderii forţei în comparaţie cu muşchii mdx/utrn+\- netrataţi (roşu). ANOVA cu două sensuri. Toate datele reprezintă media ± SEM (**p<0,01, ****p<0,0001).
Figura 17A-17D demonstrează că tratamentul combinat creşte hipertrofia musculară la 3 luni după injectare. Panoul A demonstrează că rAAV. MCK.miR-29c co-livrat cu rAAV care exprimă micro-distrofină nu a reuşit să crească greutatea totală a GAZ injectat. Panoul B demonstrează că rAAV.MCK.miR-29c/rAAV care exprimă tratamentul combinat cu micro-distrofină a indus o creştere a dimensiunii medii a fibrei. Comparând mdx/utrn+/- martori cu mdx/utrn+/- trataţi cu miR-29c/micro-distrofină diametrul mediu a crescut de la 28,96 la 36,03µm. Panoul C arată că co-livrarea a produs o schimbare către distribuţia dimensiunilor fibrelor de tip sălbatic. Panoul D a furnizat numărul de fibre musculare pe mm2 în tratamentul combinat miR-29c/micro-distrofină a fost semnificativ mai mic decât şoarecii netrataţi şi de tip sălbatic (***p<0,01, ****p<0,0001).
Figura 18A-18B furnizează secvenţa de acid nucleic (SECV ID NR.: 1 pAAV.CMV.Mir29C) a unui vector rAAV exemplificator care cuprinde catena de ghidare matură a miR-29c (nucleotidele 1257-1284) şi scheletul natural mi-30 (nucleotidele 1088-1375). Constructul mai cuprinde promotorul CMV (nucleotidele 120-526), doi introni EF1a la nucleotidele 927-1087 şi 1380-1854 şi un polA la nucleotidele 1896-2091.
Figura 19 furnizează o schemă a vectorului rAAV pAAV.MCK.micro-distrofină.
Figura 20A-D furnizează secvenţa de acid nucleic (SECV ID NR.: 9; pAAV.MCK.micro-distrofină) a unui exemplu de vector rAAV care exprimă micro-distrofină.
Figura 21A-D furnizează secvenţa de nucleotide a secvenţei de nucleotide de micro-distrofină umană (SECV ID NR.: 7)
Figura 22 furnizează secvenţa de nucleotide (SECV ID NR.: 12 pAAV.MCK.Mir29C) a unui vector rAAV exemplificator care cuprinde catena de ghidare matură a miR-29c (nucleotidele 1487-1512) şi scheletul natural mi-30 (nucleotidele 1088-1375). Constructul mai cuprinde amplificatorul MCK (nucleotidele 190-395), promotorul MCK (nucleotidele 396-753), doi introni EF1a la nucleotidele 1155-1315 şi 1609-2083 şi un polA la nucleotidele 2094-2148.
DESCRIERE DETALIATĂ
Biopsiile musculare efectuate la cea mai fragedă vârstă de diagnosticare a DMD relevă o proliferare proeminentă a ţesutului conjunctiv. Fibroza musculară este dăunătoare în mai multe moduri. Reduce tranzitul normal al nutrienţilor endomiziali prin barierele de ţesut conjunctiv, reduce fluxul sanguin şi privează muşchii de constituenţi nutriţionali derivaţi de la nivelul vascular şi contribuie funcţional la pierderea precoce a ambulaţiei prin contracturile membrelor. În timp, provocările de tratament se înmulţesc ca urmare a fibrozei marcate în muşchi. Acest lucru poate fi observat în biopsiile musculare comparând proliferarea ţesutului conjunctiv în momente succesive. Procesul continuă să se exacerbeze, ducând la pierderea deambulării şi la accelerarea scăpată de sub control, în special la pacienţii dependenţi de scaunul cu rotile.
Fără o abordare paralelă de reducere a fibrozei, este puţin probabil ca beneficiile omiterii exonilor, codon-stop citit direct sau terapiilor de înlocuire a genelor să poată fi vreodată atinse pe deplin. Chiar şi moleculele mici sau strategiile de înlocuire a proteinelor sunt susceptibile de a eşua fără o abordare de reducere a fibrozei musculare. Preparări anterioare la şoarecii mdx în vârstă cu fibroză existentă trataţi cu AAV.micro-distrofină au demonstrat că nu am putut realiza refacerea funcţională completă (Human molecular genetics 22, 4929-4937 (2013)). De asemenea, se ştie că progresia cardiomiopatiei DMD este însoţită de cicatrici şi fibroză în peretele ventricular. Livrarea micro-ARN este deosebit de inovatoare din cauza lipsei barierelor imune şi a uşurinţei relative de livrare. MicroARN-urile sunt mici (~200bp) şi, prin urmare, pot fi ambalate în AAV împreună cu o casetă terapeutică pentru a corecta sau a ocoli defectul genetic.
Aşa cum este utilizat aici, termenul "AAV" este o abreviere standard pentru virusul adeno-asociat. Virusul adeno-asociat este un parvovirus ADN monocatenar care creşte numai în celulele în care anumite funcţii sunt asigurate de un virus helper co-infectant. În prezent, există treisprezece serotipuri de AAV care au fost caracterizate. Informaţii generale şi recenzii despre AAV pot fi găsite în, de exemplu, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, voi. 1, p. 169-228, şi Berns, 1990, Virologie, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York). Cu toate acestea, este pe deplin de aşteptat ca aceleaşi principii să fie aplicabile serotipurilor AAV suplimentare, deoarece este bine cunoscut faptul că diferitele serotipuri sunt destul de strâns legate, atât structural, cât şi funcţional, chiar şi la nivel genetic. (Vezi, de exemplu, Blacklowe, 1988, pp. 165-174 din Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed..; şi Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)). De exemplu, toate serotipurile AAV prezintă aparent proprietăţi de replicare foarte asemănătoare mediate de genele rep omoloage; şi toate poartă trei proteine capside înrudite, cum ar fi cele exprimate în AAV2. Gradul de înrudire este sugerat în continuare de analiza heteroduplex care dezvăluie hibridizare încrucişată extinsă între serotipuri de-a lungul lungimii genomului; şi prezenţa unor segmente de auto-normalizare analoge la capetele care corespund „secvenţelor repetate terminale inversate» (ITR). Modelele similare de infectare sugerează, de asemenea, că funcţiile de replicare din fiecare serotip sunt sub control de reglementare similar.
Un "vector AAV" aşa cum este utilizat aici se referă la un vector care cuprinde una sau mai multe polinucleotide de interes (sau transgene) care sunt flancate de secvenţe repetate terminale AAV (ITR). Astfel de vectori AAV pot fi replicaţi şi împachetati în particule virale infecţioase atunci când sunt prezenţi într-o celulă gazdă care a fost transfectată cu un vector care codifică şi exprimă produsele genei rep şi cap.
Un "virion AAV" sau "particulă virală AAV" sau "particulă vector AAV" se referă la o particulă virală compusă din cel puţin o proteină a capsidei AAV şi un vector AAV polinucleotidic încapsidat. Dacă particula cuprinde o polinucleotidă heterologă (adică o polinucleotidă, alta decât un genom AAV de tip sălbatic, cum ar fi o transgenă care urmează să fie eliberată la o celulă de mamifer), este denumită în mod obişnuit „particulă vector AAV» sau pur şi simplu „vector AAV». Astfel, producţia de particule de vector AAV include în mod necesar producerea de vector AAV, deoarece un astfel de vector este conţinut într-o particulă de vector AAV.
AAV
Genomii AAV recombinanţi conform invenţiei cuprind molecula de acid nucleic conform invenţiei şi unul sau mai multe ITR-uri AAV care flanchează o moleculă de acid nucleic. ADN-ul AAV din genomul rAAV poate fi de la orice serotip AAV pentru care poate fi derivat un virus recombinant incluzând, dar fără a se limita la, serotipurile AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 şi AAV-13. Producţia de rAAV pseudotipizat este dezvăluită, de exemplu, în WO 01/83692. Alte tipuri de variante de rAAV, de exemplu rAAV cu mutaţii de capside, sunt de asemenea avute în vedere. Vezi, de exemplu, Marsic şi colab., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)). Aşa cum s-a notat în secţiunea Context de mai sus, secvenţele de nucleotide ale genomurilor diferitelor serotipuri de AAV sunt cunoscute în domeniu. Pentru a promova expresia specifică a muşchilor scheletici, pot fi utilizate AAV1, AAV6, AAV8 sau AAVrh.74.
Plasmidele ADN pot cuprinde genomi rAAV conform invenţiei. Plasmidele ADN sunt transferate la celule permise pentru infectare cu un virus auxiliar al AAV (de exemplu, adenovirus, adenovirus cu deleţie E1 sau virus herpes) pentru asamblarea genomului rAAV în particule virale infecţioase. Tehnicile de producere a particulelor rAAV, în care un genom AAV care urmează să fie împachetat, gene rep şi cap şi funcţii de virus auxiliar sunt furnizate unei celule, sunt standard în domeniu. Producerea rAAV necesită ca următoarele componente să fie prezente într-o singură celulă (notate aici ca o celulă de ambalare): un genom rAAV, gene rep şi cap AAV separate de (adică, nu în) genomul rAAV şi funcţiile virusului helper. Genele AAV rep şi cap pot fi de la orice serotip AAV pentru care virusul recombinant poate fi derivat şi poate fi dintr-un serotip AAV diferit de ITR-urile genomului rAAV, incluzând, dar fără a se limita la, serotipurile AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAVrh.74, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 şi AAV-13. Producţia de rAAV pseudotipizat este dezvăluită, de exemplu, în WO 01/83692.
O metodă de generare a unei celule de ambalare este de a crea o linie celulară care exprimă stabil toate componentele necesare pentru producerea de particule AAV. De exemplu, o plasmidă (sau mai multe plasmide) care cuprinde un genom rAAV lipsit de gene AAV rep şi cap, gene AAV rep şi cap separate de genomul rAAV şi un marker selectabil, cum ar fi o genă de rezistenţă la neomicina, sunt integrate în genomul unei celule. Genomii AAV au fost introduşi în plasmidele bacteriene prin proceduri precum coada GC (Samulski şi colab., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. SUA, 79:2077-2081), adăugarea de linkeri sintetici care conţin situsuri de clivare a endonucleazei de restricţie (Laughlin şi colab., 1983, Gene, 23:65-73) sau prin ligatura directă, la capătul contondent (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). Linia celulară de ambalare este apoi infectată cu un virus auxiliar, cum ar fi adenovirusul. Avantajele acestei metode sunt că celulele sunt selectabile şi sunt potrivite pentru producţia pe scară largă de rAAV. Alte exemple de metode adecvate folosesc adenovirus sau baculovirus mai degrabă decât plasmide pentru a introduce genomi rAAV şi/sau gene rep şi cap în celulele de ambalare.
Principiile generale ale producţiei de rAAV sunt revizuite în, de exemplu, Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; şi Muzyczka, 1992, Curr. Subiecte în microbiană. şi Immunol., 158:97-129). Diferite abordări sunt descrise în Ratschin şi colab., Mol. Celulă. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 81:6466 (1984); Tratschin şi colab., Mo1. Celulă. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin şi colab., J. Virol., 62:1963 (1988)); şi Lebkowski şi colab., 1988 Mol. Celulă. Biol., 7:349 (1988). Samulski şi colab. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); Brevetul U.S. Nr. 5.173.414; WO 95/13365 şi corespunzatoare brevetului US Nr. 5.658.776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin şi colab. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul şi colab. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark şi colab. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; Brevetul US Nr. 5.786.211; Brevetul US Nr. 5.871.982; şi Brevetul US Nr. 6.258.595.
Sunt descrise celule de ambalare care produc rAAV infecţios. Într-o variantă de realizare, celulele de ambalare pot fi celule canceroase transformate stabil, cum ar fi celulele HeLa, celulele 293 şi celulele PerC.6 (o linie 293 înrudită). Într-o altă formă de realizare, celulele de ambalare sunt celule care nu sunt celule canceroase transformate, cum ar fi celulele cu trecere joasă 293 (celule renale fetale umane transformate cu E1 de adenovirus), celule MRC-5 (fibroblaste fetale umane), celule WI-38 (fibroblaste fetale umane), celule Vero (celule de rinichi de maimuţă (celule pulmonare FRrL-2).
AAV recombinant (adică, particulele rAAV încapsidate infecţioase) ale invenţiei cuprind un genom rAAV. În variantele de realizare, genomilor ambelor rAAV le lipsesc ADN AAV rep şi cap, adică nu există ADN AAV rep sau cap între ITR-urile genomurilor. Exemple de rAAV care pot fi construite pentru a cuprinde moleculele de acid nucleic ale invenţiei sunt prezentate în Cererea de Brevet Internaţional Nr. PCT/US2012/047999 (WO 2013/016352).
rAAV poate fi purificat prin metode standard în domeniu, cum ar fi prin cromatografie pe coloană sau gradienţi de clorură de cesiu. Metodele de purificare a vectorilor rAAV din virusul helper sunt cunoscute în domeniu şi includ metode dezvăluite în, de exemplu, Clark şi colab., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp şi Clark, Metode Mol. Med., 69 427-443 (2002); Brevetul US Nr. 6.566.118 şi WO 98/09657.
Într-o altă variantă de realizare, invenţia are în vedere compoziţii care cuprind rAAV din prezenta invenţie. Compoziţiile invenţiei cuprind rAAV şi un purtător acceptabil farmaceutic. Compoziţiile pot cuprinde, de asemenea, alte ingrediente, cum ar fi diluanţi şi adjuvanţi. Purtătorii, diluanţii şi adjuvanţii acceptabili nu sunt toxici pentru primitori şi sunt de preferinţă inerţi la dozele şi concentraţiile folosite şi includ tampoane cum ar fi fosfat, citrat sau alţi acizi organici; antioxidanţi cum ar fi acidul ascorbic; polipeptide cu greutate moleculară mică; proteine, cum ar fi albumina serică, gelatina sau imunoglobulinele; polimeri hidrofili cum ar fi polivinilpirolidona; aminoacizi cum ar fi glicina, glutamina, asparagina, arginina sau lizina; monozaharide, dizaharide şi alţi carbohidraţi incluzând glucoză, manoză sau dextrine; agenţi de chelare cum ar fi EDTA; alcooli de zahăr, cum ar fi manitol sau sorbitol; contraioni care formează sare, cum ar fi sodiu; şi/sau agenţi tensioactivi neionici cum ar fi Tween, pluronics sau polietilen glicol (PEG).
Titrurile de rAAV care urmează să fie administrate în metodele descrise aici vor varia în funcţie, de exemplu, de rAAV particular, modul de administrare, scopul tratamentului, individul şi tipul(rile) de celule vizate şi pot fi determinate prin metode standard în domeniu. Titrurile de rAAV pot varia de la aproximativ 1 x 106, aproximativ 1×107, aproximativ 1×108, aproximativ 1×109, aproximativ 1×1010, aproximativ 1×1011, aproximativ 1×1012, aproximativ 1×1013 la aproximativ 1×1014 sau mai multe particule rezistente la DNază (DRP) per ml. Dozele pot fi exprimate şi în unităţi de genom viral (vg).
Sunt descrise metodele de transducere a unei celule ţintă cu rAAV, in vivo sau in vitro. Metodele in vivo cuprind etapa de administrare a unei doze eficiente, sau a dozelor multiple eficiente, dintr-o compoziţie care cuprinde un rAAV conform invenţiei unui animal (inclusiv o fiinţă umană) care are nevoie de acesta. Dacă doza este administrată înainte de dezvoltarea unei tulburări/boli, administrarea este profilactică. Dacă doza este administrată după dezvoltarea unei tulburări/boli, administrarea este terapeutică. În variantele de realizare ale invenţiei, o doză eficientă este o doză care atenuează (elimină sau reduce) cel puţin un simptom asociat cu tulburarea/starea de boală care este tratată, care încetineşte sau previne progresia către o tulburare/stare de boală, care încetineşte sau previne progresia unei tulburări/stare de boală, care diminuează amploarea bolii, care rezultă în remisia (parţială sau totală) a acelei boli, şi/sau care prelungeşte supravieţuirea. Un exemplu de boală avută în vedere pentru prevenire sau tratament cu metodele conform invenţiei este FSHD.
Terapiile combinate sunt de asemenea avute în vedere de invenţie. Combinaţia aşa cum este utilizată aici include atât tratament simultan, cât şi tratamente secvenţiale. Combinaţii de metode ale invenţiei cu tratamente medicale standard (de exemplu, corticosteroizi) sunt luate în considerare în mod specific, la fel ca şi combinaţiile cu terapii noi.
Administrarea unei doze eficiente de compoziţii poate fi pe căi standard în domeniu incluzând, dar fără a se limita la, intramusculară, parenterală, intravenoasă, orală, bucală, nazală, pulmonară, intracraniană, intraosoasă, intraoculară, rectală sau vaginală. Căile de administrare şi serotipul(urile) componentelor AAV ale rAAV (în special, ITR-urile AAV şi proteina capsidei) din invenţie pot fi alese şi/sau potrivite de către cei de specialitate în domeniu, ţinând cont de infecţia şi/sau starea de boală care este tratată şi celulele/ţesuturile ţintă care trebuie să exprime miR-29 şi miR-29.
Invenţia prevede administrarea locală şi administrarea sistemică a unei doze eficiente de rAAV şi compoziţii conform invenţiei incluzând terapia combinată conform invenţiei. De exemplu, administrarea sistemică este administrarea în sistemul circulator astfel încât întregul organism este afectat. Administrarea sistemică include administrarea enterală, cum ar fi absorbţia prin tractul gastrointestinal şi administrarea parentală prin injecţie, perfuzie sau implantare.
În particular, administrarea efectivă a rAAV din prezenta invenţie poate fi realizată prin utilizarea oricărei metode fizice care va transporta vectorul recombinant rAAV în ţesutul ţintă al unui animal. Administrarea conform invenţiei include, dar nu se limitează la, injectarea în muşchi, fluxul sanguin şi/sau direct în ficat. S-a demonstrat că simpla resuspendare a unui rAAV în soluţie salină tamponată cu fosfat este suficientă pentru a oferi un vehicul util pentru exprimarea ţesutului muscular şi nu există restricţii cunoscute asupra purtătorilor sau a altor componente care pot fi administrate concomitent cu rAAV (deşi compoziţiile care degradează ADN-ul ar trebui evitate în mod normal cu rAAV). Proteinele capsidelor unui rAAV pot fi modificate astfel încât rAAV să fie ţintit către un ţesut ţintă particular de interes, cum ar fi muşchiul. Vezi, de exemplu, WO 02/053703. Compoziţiile farmaceutice pot fi preparate sub formă de formulări injectabile sau ca formulări topice pentru a fi eliberate în muşchi prin transport transdermic. Numeroase formulări atât pentru injecţia intramusculară, cât şi pentru transportul transdermic au fost dezvoltate anterior şi pot fi utilizate în practica invenţiei. rAAV poate fi utilizat cu orice purtător acceptabil farmaceutic pentru uşurinţă în administrare şi manipulare.
Doza de rAAV care urmează să fie administrată în metodele dezvăluite aici va varia în funcţie, de exemplu, de rAAV particular, modul de administrare, scopul tratamentului, individul şi tipul(rile) de celule ţintă şi poate fi determinată prin metode standard în domeniu. Titrurile fiecărui rAAV administrat pot varia de la aproximativ 1x106, aproximativ 1x107, aproximativ 1x108, aproximativ 1x109, aproximativ 1x1010, aproximativ 1x1011, aproximativ 1x1012, aproximativ 1x1013, aproximativ 1x1014 sau aproximativ 1x1015 sau mai multe particule rezistente la DN10151 sau mai multe particule DNază rezistente pe ml. Dozele pot fi, de asemenea, exprimate în unităţi de genom viral (vg) (adică, 1×107 vg, 1×108 vg, 1×109 vg, 1×1010 vg, 1×1011 vg, 1×1012 vg, 1×1013 vg, 1×1014 vg, respectiv 1×1015). Dozele pot fi, de asemenea, exprimate în unităţi de genom viral (vg) per kilogram (kg) de greutate corporală (adică, 1×1010 vg/kg, 1×1011 vg/kg, 1×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, respectiv 1×1015 vg/kg). Metodele pentru titrarea AAV sunt descrise în Clark şi colab., Hum. Gene Ther., 10: 1031-1039 (1999).
în particular, administrarea efectivă a rAAV din prezenta invenţie poate fi realizată prin utilizarea oricărei metode fizice care va transporta vectorul recombinant rAAV în ţesutul ţintă al unui animal. Administrarea conform invenţiei include, dar nu se limitează la, injectarea în muşchi, în fluxul sanguin şi/sau direct în ficat. S-a demonstrat că simpla resuspendare a unui rAAV în soluţie salină tamponată cu fosfat este suficientă pentru a oferi un vehicul util pentru exprimarea ţesutului muscular şi nu există restricţii cunoscute asupra purtătorilor sau a altor componente care pot fi administrate concomitent cu rAAV (deşi compoziţiile care degradează ADN-ul ar trebui evitate în mod normal cu rAAV). Proteinele capsidelor unui rAAV pot fi modificate astfel încât rAAV să fie ţintit către un ţesut ţintă particular de interes, cum ar fi muşchiul. Vezi, de exemplu, WO 02/053703. Compoziţiile farmaceutice pot fi preparate sub formă de formulări injectabile sau ca formulări topice pentru a fi eliberate în muşchi prin transport transdermic. Numeroase formulări atât pentru injecţia intramusculară, cât şi pentru transportul transdermic au fost dezvoltate anterior şi pot fi utilizate în practica invenţiei. rAAV poate fi utilizat cu orice purtător acceptabil farmaceutic pentru uşurinţă în administrare şi manipulare.
În scopul injectării intramusculare, pot fi folosite soluţii într-un adjuvant cum ar fi uleiul de susan sau de arahide sau în propilenglicol apos, precum şi soluţii apoase sterile. Astfel de soluţii apoase pot fi tamponate, dacă se doreşte, iar diluantul lichid poate fi mai întâi izotonic cu soluţie salină sau glucoză. Soluţiile de rAAV ca acid liber (ADN conţine grupări fosfat acide) sau o sare acceptabilă farmacologic pot fi preparate în apă amestecată corespunzător cu un agent activ de suprafaţă cum ar fi hidroxpropilceluloza. O dispersie de rAAV poate fi, de asemenea, preparată în glicerol, polietilen glicoli lichizi şi amestecuri ale acestora şi în uleiuri. În condiţii obişnuite de depozitare şi utilizare, aceste preparate conţin un conservant pentru prevenirea creşterii microorganismelor. În acest sens, mediile apoase sterile folosite sunt toate uşor de obţinut prin tehnici standard binecunoscute specialiştilor în domeniu.
Purtătorii farmaceutici, diluanţii sau excipienţii adecvaţi pentru utilizare injectabilă includ soluţii sau dispersii apoase sterile şi pulberi sterile pentru prepararea extemporanee a soluţiilor sau dispersiilor injectabile sterile. În toate cazurile, forma trebuie să fie sterilă şi trebuie să fie fluidă în măsura în care există posibilitatea de a utiliza seringa. Trebuie să fie stabil în condiţiile de fabricaţie şi depozitare şi trebuie păstrat împotriva acţiunilor contaminante ale microorganismelor precum bacteriile şi ciupercile. Purtătorul poate fi un solvent sau un mediu de dispersie care conţine, de exemplu, apă, etanol, poliol (de exemplu, glicerol, propilen glicol, polietilen glicol lichid şi altele asemenea), amestecuri adecvate ale acestora şi uleiuri vegetale. Fluiditatea adecvată poate fi menţinută, de exemplu, prin utilizarea unei acoperiri cum ar fi lecitina, prin menţinerea dimensiunii necesare a particulelor în cazul unei dispersii şi prin utilizarea agenţilor tensioactivi. Prevenirea acţiunii microorganismelor poate fi realizată de diverşi agenţi antibacterieni şi antifungici, de exemplu, parabeni, clorbutanol, fenol, acid sorbic, timerosal şi altele asemenea. în multe cazuri, va fi de preferat să se includă agenţi izotonici, de exemplu, zaharuri sau clorură de sodiu. Absorbţia prelungită a compoziţiilor injectabile poate fi realizată prin utilizarea agenţilor care întârzie absorbţia, de exemplu, monostearat de aluminiu şi gelatină.
Soluţiile injectabile sterile sunt preparate prin încorporarea rAAV în cantitatea necesară în solventul adecvat cu diverse alte ingrediente enumerate mai sus, după cum este necesar, urmată de sterilizare pe filtru. În general, dispersiile sunt preparate prin încorporarea ingredientului activ sterilizat într-un vehicul steril care conţine mediul de dispersie bazic şi celelalte ingrediente necesare dintre cele enumerate mai sus. În cazul pulberilor sterile pentru prepararea soluţiilor injectabile sterile, metodele preferate de preparare sunt uscarea în vid şi tehnica de liofilizare care produc o pulbere a ingredientului activ plus orice ingredient suplimentar dorit din soluţia sterilă filtrată anterior a acestuia.
Transducţia cu rAAV poate fi de asemenea efectuată in vitro. Într-o variantă de realizare, celulele musculare ţintă dorite sunt îndepărtate de la subiect, transduse cu rAAV şi reintroduse în subiect. Alternativ, celulele musculare singeneice sau xenogeneice pot fi utilizate acolo unde acele celule nu vor genera un răspuns imun inadecvat la subiect.
Metodele adecvate pentru transducţia şi reintroducerea celulelor transduse într-un subiect sunt cunoscute în domeniu. Într-o variantă de realizare, celulele pot fi transduse in vitro prin combinarea rAAV cu celulele musculare, de ex., în medii adecvate şi screening pentru acele celule care adăpostesc ADN-ul de interes folosind tehnici convenţionale, cum ar fi Southern blot şi/sau PCR, sau prin utilizarea markerilor selectabili. Celulele transduse pot fi apoi formulate în compoziţii farmaceutice, iar compoziţia introdusă în subiect prin diferite tehnici, cum ar fi prin injectare intramusculară, intravenoasă, subcutanată şi intraperitoneală sau prin injectare în muşchiul neted şi cardiac, folosind de exemplu, un cateter.
Transducţia celulelor cu rAAV conform invenţiei are ca rezultat expresia susţinută a micro-distrofinei. Sunt descrise metode de administrare/eliberare de rAAV care exprimă miR-29 şi/sau micro-distrofină la un animal, de preferinţă o fiinţă umană. Aceste metode includ transducerea ţesuturilor (incluzând, dar fără a se limita la, ţesuturi cum ar fi muşchi, organe cum ar fi ficatul şi creierul şi glande cum ar fi glandele salivare) cu unul sau mai multe rAAV ale prezentei invenţii. Transducţia poate fi efectuată cu casete de gene cuprinzând elemente de control specifice ţesutului. De exemplu, o variantă de realizare oferă metode de transducere a celulelor musculare şi a ţesuturilor musculare direcţionate de elementele de control specifice muşchilor, inclusiv, dar fără a se limita la, cele derivate din familiile de gene de actină şi miozină, cum ar fi din familia de gene myoD [vezi Weintraub şi colab., Science, 251: 761-766 (1991))], factorul de legare a amplificatorului specific miocitelor MEF-2 [Cserjesi şi Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991))], elemente de control derivate din gena actinei scheletice umane [Muscat şi colab., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987))], gena actinei cardiace, elementele secvenţei creatinkinazei musculare [Vezi Johnson şi colab., Mol Cell Biol, 9:3393-3399 (1989)] şi elementul de amplificare a creatinkinazei murine (mCK), elemente de control derivate din gena scheletică a troponinei C cu contracţie rapidă, gena troponinei C cardiace cu contracţie lentă şi gena troponinei I cu contracţie lentă: factori nucleari inducibili de hipoxie (Semenza şi colab., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991))), elemente şi promotori inductibili de steroizi, inclusiv elementul de răspuns la glucocorticoizi (GRE) (vezi Mader şi White, Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 90: 5603-5607 (1993)), şi alte elemente de control.
Ţesutul muscular este o ţintă atractivă pentru livrarea ADN-ului in vivo, deoarece nu este un organ vital şi este uşor de accesat. Este descrisă expresia susţinută a miARN-urilor din miofibrele transduse.
Prin „celulă musculară» sau „ţesut muscular» se înţelege o celulă sau un grup de celule derivate din muşchi de orice fel (de exemplu, muşchi scheletici şi muşchi netezi, de exemplu, din tractul digestiv, vezica urinară, vasele de sânge sau ţesutul cardiac). Astfel de celule musculare pot fi diferenţiate sau nediferenţiate, cum ar fi mioblaste, miocite, miotuburi, cardiomiocite şi cardiomioblaste.
Termenul „transducţie» este utilizat pentru a se referi la administrarea/livrarea catenei de ghidare miiR29 sau regiunea de codificare a micro-distrofinei la o celulă primitoare fie in vivo sau in vitro, printr-un rAAV cu deficit de replicare care are ca rezultat expresia unui miR29 sau micro-distrofină de către celula primitoare.
Astfel, sunt descrise metode de administrare a unei doze eficiente (sau doze, administrate în esenţă simultan sau doze date la intervale) de rAAV care codifică miR29 şi/sau micro-distrofină unui pacient care are nevoie de acestea.
EXEMPLE
Exemplul 1
Confirmarea modelelor de distrofie musculară Duchenne
Şoarecele mdx oferă un model animal convenabil, dar incomplet, pentru a studia patogeneza DMD. Acest model este o încrucişare a şoarecelui mdx cu un heterozigot al knockout genei utrofină (mdx:utrn+/-), care prezintă fibroză crescută şi recapitulează mai fidel patologia DMD umană. Şoarecii mdx au o mutaţie nonsens în exonul 23 al DMD care are ca rezultat un fenotip relativ uşor şi o durată de viaţă aproape normală. Până la vârsta de 3 săptămâni, diafragma şi muşchiul membrelor şoarecilor mdx dezvoltă semne de inflamaţie endomisial. Aceste simptome scad în muşchiul membrelor după ce şoarecii ajung la vârsta adultă, în timp ce inflamaţia din muşchiul diafragmei continuă să se agraveze progresiv. La şoarecii mdx lipsiţi de telomerază, distrofia musculară se agravează progresiv odată cu vârsta; Şoarecii mdx care nu au utrofină (DKO) au un fenotip mai caracteristic DMD uman cu slăbiciune musculară cu debut precoce, fibroză severă şi moarte prematură. Utrofina, un paralog autozomal al distrofinei, împărtăşeşte un grad ridicat de omologie de secvenţă care poate compensa lipsa distrofinei la şoarecele mdx în dublu KO (distrofină plus utrofină); se observă un fenotip sever cu moarte precoce. Moartea prematură a şoarecelui DKO exclude progresia inflamaţiei şi a fibrozei, dar şoarecele mdx:utrn+/- prezintă un model cu asemănări cu boala umană care prezintă un grad izbitor de fibroză şi o supravieţuire mai lungă decât DKO, oferind un model mai bun pentru studiile noastre translaţionale propuse. Un raport recent confirmă utilizarea şoarecelui mdx:utrn+/- ca model ideal pentru studiul fibrozei în contextul DMD. În studiul de faţă, creşterea fibrozei, măsurată prin colorarea roşie Sirius, a fost însoţită de niveluri crescute de transcriere de colagen şi niveluri scăzute de mir29c.
Exemplul 2
Livrarea miR29 către şoarecii DMD reduce fibroza
Studiile preliminare au demonstrat că există o creştere semnificativă a coloraţiei cu roşu Sirius pentru colagen şi o scădere a nivelurilor de miR-29c la pacienţii umani cu DMD şi şoareci mdx/utrn+/-. Livrarea genică a miR-29 folosind vectori AAV specifici muşchilor este potenţial sigură şi eficientă. Pentru a genera vectorul rAAV, denumit aici rAAVrh.74.CMV.miR29c, secvenţa miR29c cu 22 de nucleotide (catena ţintă SECV ID NR.: 3 şi catena ghid SECV ID NR.: 4) a fost clonată într-o reţea miR-30 condusă de un promotor CMV. Caseta de expresie (SECV ID NR.: 2) a fost clonată într-o plasmidă AAV auto-complementară şi ambalată utilizând AAVrh.74, un serotip cunoscut că se exprimă bine în muşchi. ADNc-ul miR-29c a fost sintetizat folosind un primer personalizat care conţine catena ţintă (sense) miR-29c, tulpină bucla miR-30 şi catena de ghidare (antisens) miR-29c în catena principală miR-30. Au fost modificate trei baze ale secvenţei miR-29c. Această secvenţă a fost apoi clonată într-o plasmidă AAV ITR auto-complementară condusă de promotorul CMV şi secvenţa poli A.
Aşa cum se arată în Figura 1, plasmida pAAV.CMV.miR29C conţine ADNc mir29c într-o catenă principală a buclei stem miR-30 flancată de secvenţe repetitive terminale inversate (ITR) AAV2. Această secvenţă a fost încapsidată în virioni AAVrh.74. În plus, câteva nucleotide cu secvenţa ţintă miR-29c au fost modificate pentru a imita împerecherea Watson-crick la acest site ca în shRNA-miR (luc). Conform designului ShRNA-luc, ac de păr ar trebui să fie perfect complementar pe toată lungimea sa. În plus, cu cât sunt mai multe modificări ale firului pasager, cu atât este mai probabilă eliminarea oricărui mecanism endogen care reglează procesarea miR-29 care ar putea recunoaşte miARN-ul prin tulpină. A 19a bază a catenei de ghidare a fost modificată într-o citozină pentru a imita nucleotida care precede situsul de clivaj în secvenţa naturală mi-29c şi baza corespunzătoare de pe cealaltă catenă a fost schimbată pentru a păstra împerecherea.
Vectorul terapiei genice scrAAVrh.74.CMV.miR29c (1×1011 vgs) a fost injectat în muşchiul cvadriceps al şoarecilor mdx/utrn în vârstă de 3 luni+/-. Muşchiul Quadriceps a fost analizat la 3 luni după injectare prin colorare cu roşu Sirius şi analizat cu software-ul NIH ImageJ aşa cum este descris în Nevo şi colab., (PloS One, 6: e18049 (2011). Nivelurile de MiR29c, colagen şi elastină au fost cuantificate prin RT-PCR. Livrarea miR-29c şoarecilor mdx/utrn+/- tineri creşte semnificativ nivelurile mir-29c şi o reducere semnificativă a colorării roşii Sirius în muşchiul cvadriceps al şoarecilor mdx/utrn+/- de 6 luni (3 luni după injectare). A existat o reducere a nivelurilor de colagen şi elastină în muşchii trataţi atunci când au fost evaluate prin RT-PCR.
Demonstrarea creşterii fibrozei şi a scăderii expresiei miR29 în şoarecii mdx/utrn+/- şi pacienţii cu deficit de distrofină validează modelul de şoarece ca fiind reprezentativ pentru boala umană. Rezultatele iniţiale folosind miR29 furnizat de AAV ca terapie anti-fibrotică sugerează că există un efect benefic semnificativ cu reducerea colorării roşii Sirius şi a nivelurilor de colagen şi elastină, care contribuie cheie la fibroză.
Exemplul 3
Injectarea de MiR-29c reduce colagenul şi restabileşte miR-29c
Pentru a determina dacă rAAVrh.74.CMV.MiR-29c ar putea reduce fibroza, şoarecii mdx/utrn+\- de 12 săptămâni au primit o injecţie intramusculară de rAAVrh.74.CMV.MiR-29c la 5×1011vgs la muşchiul gastrocnemius stâng (GAS). Şoarecii au fost analizaţi la 12 săptămâni după injectare. Coloraţia roşie cu picrosirius a evidenţiat o scădere semnificativă a colorării colagenului în muşchii GAS (Fig. 2a) în comparaţie cu muşchiul contralateral mdx/utrn +/- GAS netratat. Cuantificarea colorării roşii picrosirius arată că muşchiul tratat a avut o reducere de 18,3% a colagenului în comparaţie cu muşchiul netratat (tratat - 23,3% ± 1,3 faţă de netratat-29,5% ± 0,7) (Fig 2b). Pentru a confirma supraexprimarea miR-29c în muşchiul tratat, ARN-ul total a fost extras din muşchiul GAS de la WT de 24 de săptămâni, tratat cu miR-29c şi şoareci mdx/utrn+/- şi sunt supuşi unei analize cantitative cu transcripţie inversă -PCR (qRT-PCR) pentru expresia miR-29c. Rezultatele au arătat că miR-29c a fost semnificativ crescut în muşchiul GAS al şoarecilor trataţi, comparativ cu şoarecii netrataţi (Fig. 2d).
Exemplul 4
MiR-29c îmbunătăţeşte forţa musculară absolută şi specifică, dar nu protejează împotriva leziunilor induse de contracţie
Ştiind că fibroza poate afecta funcţia musculară, am vrut să testăm dacă reducerea fibrozei prin creşterea expresiei MiR-29c ar putea proteja muşchii mdx/utrn+/- de la leziunea indusă de contracţie şi creşte forţa generală. Proprietăţile funcţionale ale muşchiului gastrocnemian din mdx/utrn+/- au fost evaluaţi şoarecii trataţi cu rAAVrh.74.CMV.MiR-29c. La douăsprezece săptămâni după injectare, GAS a fost izolat pentru a fi efectuat măsurători in vivo de forţă.
Procedura GAS urmează protocolul enumerat în Hakim şi colab., (Methods Mol Biol. 709: 75-89, 2011) pentru analiza fiziologiei muşchilor abdominali transversali, dar adaptate pentru GAS. Pe scurt, şoarecii au fost anesteziaţi folosind amestec de ketamina/xilazină. Pielea membrelor posterioare a fost îndepărtată pentru a expune muşchiul GAZ şi tendonul lui Ahile. Tendonul distal a fost disecat şi un nod dublu pătrat a fost legat în jurul tendonului cu sutură 4-0 cât mai aproape de muşchi, un al doilea nod dublu pătrat este legat chiar lângă primul nod şi apoi tendonul este tăiat. Muşchiul expus a fost umezit în mod constant cu soluţie salină. Şoarecii au fost apoi transferaţi pe o platformă controlată termic şi menţinuţi la 37°. Genunchiul a fost fixat de platformă cu un ac prin tendonul rotulei, sutura tendonului de braţul nivelat al traductorului de forţă (Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada), iar piciorul a fost fixat cu bandă. Contracţiile musculare GAS au fost provocate prin stimularea nervului sciatic prin intermediul electrozilor bipolari de platină. Odată ce muşchiul a fost stabilizat, lungimea optimă a fost determinată prin întinderea progresivă a muşchiului până la atingerea forţei maxime de contracţie. După o perioadă de repaus de 3 minute, GAS-ul a fost stimulat la 50.100.150 şi 200 Hz, permiţând o perioadă de repaus de 1 minut între fiecare stimul pentru a determina forţa tetanică maximă. S-a măsurat lungimea muşchilor. După o pauză de 5 minute, a fost evaluată susceptibilitatea muşchiului GAS la deteriorarea indusă de contracţie. După 500 ms de stimulare, muşchiul a fost prelungit cu 10% din lungimea optimă. Aceasta a constat în stimularea muşchiului la 150 Hz timp de 700 ms. După stimulare, muşchiul a fost readus la lungimea optimă. Ciclul a fost repetat în fiecare minut pentru un total de 5 cicluri. Forţa specifică a fost calculată prin împărţirea forţei tetanice maxime la aria secţiunii transversale a muşchilor GAS. După contracţiile excentrice, şoarecii au fost apoi eutanasiaţi şi muşchiul GAS a fost disecat, cântărit şi îngheţat pentru analiză.
Fiecare GAS a fost supus unei serii de contracţii excentrice repetate. Prin compararea raportului de forţă al fiecărei contracţii faţă de prima contracţie a arătat că după a cincea contracţie muşchiul netratat a scăzut la 0,56± 0,05 faţă de tratat 0,50± 0,04 (p ≤ 0,0001). Grupul injectat a arătat o scădere uşoară a gradului de protecţie în comparaţie cu martorii WT, care a scăzut la 0,92 ± 0,02 (Fig. 3c). Aceste date arată că reducerea fibrozei prin creşterea expresiei miR-29c duce la creşterea atât a forţei absolute, cât şi a forţei specifice, dar nu protejează în mod semnificativ muşchiul de leziunile induse de contracţie.
Muşchiul GAS tratat cu rAAVrh.74.MiR-29c a prezentat o îmbunătăţire semnificativă a forţei absolute în comparaţie cu muşchiul GAS mdx/utrn+/- netratat (rAAV.miR-29c- 2277 ±161,7 faţă de mdx/utrn+/- 1722± 145,7-netratat; Fig. 3a), şi, de asemenea, forţa specifică normalizată în rAAVrh.74.miR-29c ameliorarea specifică a muşchilor GAS trataţi în comparaţie cu muşchiul GAS netratat (rAAV.miR-29c- 204,7 ± 11,7 faţă de mdx/utrn+/- 151,6 ± 14,5-netratat; Fig. 3b). Forţa a fost încă redusă semnificativ în comparaţie cu martorii de tip sălbatic (rAAV.miR-29c-204,7 ± 11,7 faţă de 312,0 ± 34,1-tip sălbatic).
Exemplul 5
Co-livrarea cu Micro-Distrofină reduce şi mai mult fibroza
Pentru a determina dacă abordarea terapiei genice combinate miR-29c/micro-distrofină ar fi mai benefică pentru reducerea fibrozei, şoarecii mdx/utrn+\- de 12 săptămâni au primit o injecţie intramusculară de rAAVrh.74.CMV.MiR-29c la 5×1011 vgs la muşchiul gastrocnemian stâng. Următorii vectori de terapie genică au fost administraţi prin injecţie intramusculară (IM) în muşchiul gastrocnemius stâng (GAS) la şoarecii mdx/utrn+/- în vârstă de 3 luni, un model de şoarece DMD: singur scAAVrh.74.CMV.miR-29c, administrat împreună cu rAAVrh.74.MCK.micro-distrofină şi rAAVrh.74.MCK.micro-distrofină singur.
Plasmida pAAV.MCK.micro-distrofină conţine caseta de expresie ADNc micro-distrofină umană flancată de secvenţe repetate terminale inversate (ITR) AAV2 aşa cum se arată în Fig. 10. Această secvenţă este cea care a fost încapsidată în virionii AAV rh.74. Plasmida pAAV.MCK.micro-distrofină a fost construită prin inserarea casetei de expresie MCK care conduce o secvenţă de ADNc de micro-distrofină umană optimizată cu codon în vectorul de clonare AAV aşa cum este descris în Rodino-Klapac şi colab. (Mol Ther. 2010 ian;18(1):109-17). O secvenţă de promotor/amplificator MCK a fost utilizată pentru a conduce expresia genei specifice muşchilor şi este compusă din amplificatorul de nucleu MCK de şoarece (206 bp) fuzionat cu promotorul de nucleu MCK de 351 bp (proximal). După promotorul de bază, exonul MCK de şoarece endogen de 53 bp (netradus) este prezent pentru iniţierea eficientă a transcripţiei, urmat de semnalele de îmbinare 16S/19S tardive SV40 (97 bp) şi un mic 5'UTR (61 bp). Intronul şi 5' UTR sunt derivate din plasmida pCMVp (Clontech). Caseta de micro-distrofină are un consens Kozak imediat în faţa startului ATG şi un mic semnal poliA sintetic de 53 bp pentru terminarea ARNm. Caseta de micro-distrofină umană conţine domeniile (R4-R23/Δ71-78). ADN-ul complementar a fost codon optimizat pentru uz uman şi sintetizat de GenScript (Piscataway, NJ).
Şoarecii au fost analizaţi la 12 şi 24 săptămâni după injectare. În primul rând, numărul de fibre musculare care exprimă micro-distrofină a fost utilizat pentru a evalua eficacitatea eliberării transgenelor şi pentru a ne asigura că avem niveluri similare de micro-distrofină exprimate în fiecare grup. Am descoperit că micro-distrofină nu a fost diferită între cohortele tratate cu micro-distrofină în monoterapie (71,85±2,25%) în comparaţie cu terapia combinată miR-29c/micro-distrofină (75,03±1,91%) (Fig. 4).
Muşchiul GAS a fost analizat la 12 luni după injectare pentru a evalua acumularea de colagen prin colorare cu roşu Sirius şi cuantificarea ulterioară cu ImageJ. Rezultatele suplimentare au inclus nivelurile de transcriere miR-29c şi de colagen, măsurătorile forţei în muşchiul GAS, măsurătorile diametrului fibrelor şi analiza Western blot pentru proteinele implicate în regenerarea musculară (MyoD, Myogenin). Cantitatea fibrozei a fost analizată prin colorarea cu roşu picrosirius, care a evidenţiat o scădere semnificativă a coloraţiei de colagen în muşchii GAS în toate grupurile tratate (Fig. 5a) în comparaţie cu muşchiul GAS mdx/utrn+/- contralateral sau micro-distrofină singură. Cuantificarea coloraţiei cu roşii picrosirius arată că muşchiul co-tratat a avut o reducere de 40,8% a colagenului în comparaţie cu muşchiul netratat (tratat - 17,47% ± 0,75 faţă de netratat-29,5% ± 0,7) (Fig. 5b). Pentru a confirma expresia miR-29c, qRT-PCR a fost efectuată pe muşchiul GAS şi toate grupurile de tratament au avut o creştere a miR-29c în comparaţie cu muşchiul netratat (Fig. 5c).
Analog ţesutului DMD, s-a observat o reducere semnificativă a nivelurilor de miR-29c în muşchiul mdx/utrn+/- care s-a corelat cu creşterea fibrozei măsurată prin colorare cu roşu picrosirius. După 3 luni de tratament doar cu scAAV.miR-29c, a existat o reducere semnificativă a fibrozei (tratată-23,5%±1,3 vs. netratată-27,8% ±0,6) în muşchiul GAS. Când a fost administrată împreună cu micro-distrofină, s-a observat o reducere suplimentară a colagenului (41%) prin colorare cu roşu picrosirius (tratament combinat: 17,47% ± 0,75 faţă de netratat: 29,5% ± 0,7) (p<0,0001) (Fig.5b). Pentru a confirma expresia miR-29c, qRT-PCR a fost efectuată pe muşchiul GAS şi toate grupurile de tratament au avut o creştere a miR-29c în comparaţie cu muşchiul netratat (Fig. 5b).
La 24 de săptămâni după injectare, rezultatele au fost similare cu cele observate la 12 săptămâni după injectare. A existat o reducere de 47% a colagenului prin colorarea cu roşu picrosirius în comparaţie cu muşchiul netratat (tratament combinat: 16,5±1,23 faţă de netratat: 31,07±0,93; p<0,0001) şi o creştere coincidentă a nivelului transcriptului miR-29c.
Pentru a valida în continuare reducerea colagenului observată prin colorarea cu roşie cu picrosirius, a fost efectuată qRT-PCR pe muşchi pentru a cuantifica nivelurile de transcriere ale Col1A, Col3A şi, de asemenea, o altă componentă ECM, fibronectina (Fbn). Analiza qRT-PCR a detectat o scădere a Col1A şi Col3A după fiecare tratament, totuşi numai cohorta tratată atât cu micro-distrofină, cât şi cu miR-29c a prezentat o reducere semnificativă (Fig. 6a şi 6b). Analiza a arătat că Fbn a fost redus semnificativ numai în cohorta co-tratată (Fig. 6c).
S-a demonstrat anterior că TGF-β1 este reglat în sus în muşchiul distrofic, jucând probabil un rol în iniţierea cascadei fibrotice. TGF-β1 este o citokină pro-fibrotică cunoscută care reglează în jos miR-29c şi este responsabilă pentru conversia mioblastelor în miofibroblaste cu o creştere a colagenului şi a fibrogenezei musculare. Analiza qRT-PCR arată că muşchiul tratat concomitent a avut niveluri semnificativ mai scăzute de TGF-β1 în comparaţie cu muşchiul neinjectat şi fie tratamentul unic (Fig. 6d). La 6 luni după injectare, muşchii trataţi concomitent a continuat să prezinte niveluri reduse de Col1A, Col3A, Fbn şi TGF-β1, în timp ce s-au observat doar scăderi uşoare ale nivelurilor de ARNm de Col1A în grupurile miR-29 şi micro-distrofină.
O creştere a forţei specifice şi absolute a fost observată în muşchiul tratat numai cu miR-29c în comparaţie cu membrul netratat, care atunci când este combinat cu micro-distrofină a condus la forţă absolută şi specifică care nu au fost semnificativ diferite de cele de tip sălbatic. De asemenea, am observat o creştere semnificativă a greutăţii gastro-intestinale la acei muşchi care au fost trataţi concomitent.
Rezultatele iniţiale folosind rAAV.miR-29c ca terapie anti-fibrotică sugerează că există un efect benefic cu reducerea nivelului de colagen, un contributor cheie în fibroză. În plus, atunci când este combinată cu micro-distrofină pentru a îmbunătăţi stabilitatea membranei, reglarea miR29 a normalizat forţa musculară.
Exemplul 6
Creştere suplimentară a forţei absolute şi protecţie suplimentară împotriva leziunilor induse de contracţie
Ştiind că muşchiul tratat cu miR-29 a avut o creştere modestă, dar semnificativă a forţei absolute şi specifice, a fost investigată terapia combinată a supraexprimării miR-29c şi impactul înlocuirii genei cu micro-distrofină asupra funcţiei musculare. La douăsprezece săptămâni după injectare, am izolat GAS pentru care am efectuat măsurători de forţă in vivo. Vectorul rAAVrh.74.MiR-29c descris mai sus în Exemplul 2 şi un rAAV
rAAVrh.74.MiR-29c şi rAAV co-tratate cu care exprimă muşchiul GAS tratat cu Micro-Dys au prezentat o îmbunătăţire semnificativă a forţei absolute în comparaţie cu muşchiul GAS mdx/utrn+/- netratat (cotratat- 3582,4 ±79,4 nM vs. mdx/utrn+/- netratat- 1722 ± 145,7 nM faţă de tip sălbatic- 3005 ± 167,3 nM) (Fig. 7) şi, de asemenea, forţa specifică normalizată în îmbunătăţirea specifică a muşchilor GAS tratat cu rAAVrh.74.miR-29c/micro-dys în comparaţie cu a muşchiului GAS netratat (co-tratat mice-264.6 ± 264.6 nM/mm2 faţă de mdx/utrn+/- netratat- 151,6 ± 14,5 nM/mm2 faţă de 312,0 ± 34,1 nM/mm2) (Fig 7). Atât forţa absolută, cât şi cea specifică nu au fost semnificativ diferite de martorii de tip sălbatic.
Fiecare GAS a fost supus unei serii de contracţii excentrice repetate. Prin compararea raportului de forţă al fiecărei contracţii faţă de prima contracţie a evidenţiat că după a cincea contracţie muşchiul netratat s-a deteriorat la 0,54± 0,06 faţă de 0,66± 0,04 co-tratat (p ≤ 0,0001), care poate să fi contribuit la micro-distrofină deoarece, de asemenea, micro-distrofină s-a redus la 0.066 ± 0,04. Grupul tratat a fost încă semnificativ mai mic decât cel de tip sălbatic care a scăzut la 0,92 ± 0,02 (Fig. 7c). Descoperiri similare au fost observate la 24 de săptămâni după injectare. Aceste date arată că reducerea fibrozei şi înlocuirea genelor conduce la creşterea forţei 5 absolute şi specifice şi protejează în mod semnificativ muşchiul de leziunile induse de contracţie.
Exemplul 7
Tratamentul combinat creşte hipertrofia musculară şi hiperplazia
MiR-29c co-livrat cu micro-distrofină a crescut greutatea totală de gastroc injectat în comparaţie cu oricare dintre cele injectate singure la vârsta de trei luni (Fig. 8, Fig. 9a). Pentru a investiga sursa creşterii masei musculare, se măsoară diametrele miofibrelor. Tratamentul combinat miR-29c/µ-dys a demonstrat o creştere a dimensiunii medii a fibrei. Comparând martorii mdx/utrn+/- cu miR-29c/µ-dys tratate mdx/utrn+/-, diametrul mediu a crescut de la 25,96 la 30,97 µm (Fig. 9b). Co-livrarea a produs o schimbare către distribuţia dimensiunii fibrelor de tip sălbatic (Fig. 9c). Deşi dimensiunea medie a fibrelor a fost crescută, nu explică creşterea de ~30% a greutăţii musculare brute. A fost de asemenea măsurată suprafaţa totală a secţiunii transversale a muşchiului. Muşchii gastroci din toate grupurile au fost scanaţi complet cu diapozitive şi a fost măsurată suprafaţa totală. Muşchii trataţi concomitent cu micro-dys/miR-29c au avut o creştere semnificativă a suprafeţei secţiunii transversale în comparaţie cu cei netrataţi şi fie cu oricare tratament singur (neinjectat: 24,6 faţă de miR-29c: 26,3 faţă de micro-dys: 26,6 faţă de micro-dys/miR-29c: 33.8,). (Fig. 8, fig. 9d).
S-a raportat că miR-29c joacă un rol în calea myoD/Pax7/myogenin şi s-a emis ipoteza că miR-29c poate avea un impact asupra regenerării şi activării celulelor satelit (celule stem musculare) pentru a se diferenţia în descendenţa miogenă. Pentru a testa acest lucru, a fost numărat numărul total de fibre musculare din imaginile scanate cu diapozitive complete. Un număr crescut de fibre musculare după tratamentul combinat miR-29c/µ-dys (Fig. 9e). În cele din urmă, având în vedere că diametrele fibrelor musculare la şoarecii mdx/utrn+/- sunt eterogene cu multe fibre mici şi unele fibre hipertrofice, s-a determinat dacă numărul de fibre pe unitate de suprafaţă (celule/mm2) a fost afectat de tratament. Tratamentul combinat miR-29c/µ-dys nu a fost diferit de cel de tip sălbatic (Fig. 9f).
Exemplul 8
Tratamentul precoce cu combinaţia previne fibroza
Având în vedere importanţa potenţială a miR-29c combinatorie şi micro-distrofina ca terapie profilactică pentru DMD, o cohortă de şoareci mdx/utrn+/- tineri au fost trataţi la vârsta de 4 săptămâni. Folosind aceeaşi paradigmă ca şi pentru alte grupuri descrise aici, următoarele tratamente au fost comparate pentru eficacitatea prevenirii fibrozei prin injectarea intramusculară de GAS: scAAVrh.74.CMV.miR-29c singur, terapie combinată ssAAVrh74.MCK.micro-dystrophin + scAAVrh.74.CMVmi, sau ssAAVrh74.MCK.micro-distrofină singură la aceeaşi doză. Şoarecii au fost supuşi necropsiei la 12 săptămâni după injectare. A fost observată o scădere semnificativă a colorării colagenului în muşchii GAS în toate grupurile tratate în comparaţie cu mdx/utrn+/- contralateral netratat (Fig. 10A). Cuantificarea coloraţiei cu roşu picrosirius a arătat că muşchiul co-tratat cu micro-distrofină/miR-29c a avut o reducere de 51% a colagenului în comparaţie cu muşchiul netratat (tratat - 11,32% ± 1,18 faţă de netratat - 23,15% ± 0,90) (p<0,000, 0,90) Reducerea Col3A, Fbn şi TGF-β1 în urma terapiei combinatorii (Fig. 10D şi E).
Exemplul 9
Terapia precoce combinată restabileşte forţa şi protejează împotriva leziunilor induse de contracţie mai bine decât tratamentul tardiv
Măsurarea forţei in vivo a fost efectuată pe GAS-ul şoarecilor trataţi devreme cu terapia combinată aşa cum este descris în Exemplul 8. În şoareci mdx/utrn+/- de 4 săptămâni, co-tratamentul folosind miR-29c/micro-distrofină a arătat o îmbunătăţire semnificativă a forţei absolute în comparaţie cu şoarecii mdx/utrn+/- netrataţi şi nu a existat nicio diferenţă faţă de tipul sălbatic (co-tratat: 2908 ± 129,5 mN faţă de netratat: 1639,4 ± 116,9 mN faţă de tipul sălbatic: 3369,73 ± 154,1 mN). Forţa specifică a fost, de asemenea, normalizată la niveluri de tip sălbatic în urma terapiei combinatorii (cotratată 338,9 ± 22,34 mN/mm2 faţă de 184,3 ± 13,42 mN/mm2 netratată faţă de WT 364,3 ± 7,79 mN/mm2) (Fig. 11A şi B şi 12).
În continuare, fiecare GAS a fost supus unei serii de contracţii excentrice repetate. Prin compararea raportului de forţă al fiecărei contracţii cu cea de-a cincea contracţie, muşchiul netratat s-a deteriorat la 0,53± 0,04 faţă de 0,82± 0,04 co-tratat (p ≤ 0,0001). Grupul de tratament combinatoriu a fost uşor mai mic decât cel sălbatic, dar nu semnificativ diferit, care a scăzut la 0,93 ± 0,01 (Fig. 11C). Aceste date arată că reducerea fibrozei şi înlocuirea genelor conduc la creşterea forţei absolute şi specifice şi protejează în mod semnificativ muşchiul de leziunile induse de contracţie.
Aceste experimente sugerează că înlocuirea genelor ar trebui începută în perioada de nou-născut. Eforturile se deplasează în mod clar în direcţia identificării DMD şi a altor distrofii musculare în perioada de nou-născut. Studiul de screening pentru nou-născuţi din Ohio ilustrează potenţialul de identificare a DMD la nou-născuţi folosind CK 7 Neurol. ca biomarker (>2000 U/L) cu confirmare ADN pe aceeaşi pată de sânge uscat (Mendell şi colab., Ann. Neurol. 71: 304-313, 2012). Această metodologie este acum extinsă şi în alte state din SUA (PPMD 16 mai 2016: Next Steps with Newborn Screening) şi în alte ţări, în special în Marea Britanie (Comitetul naţional de screening al Regatului Unit) şi China (Perkin Elmer™ lansează proiecţia în China).
miR-29 s-a dovedit, de asemenea, promiţător ca modalitate de tratament pentru fibroza cardiacă, pulmonară şi hepatică. Infarctul miocardic la şoareci şi oameni este asociat cu reglarea în jos a miR-29. Rooij şi colab., (Proc. Natl. Acad. Sci, USA 105:13027-13032, 2008) a demonstrat că expunerea fibroblastelor la un miR-29b mimetic a scăzut transcriptele de colagen, oferind o cale de transcriere clinică pentru fibroza cardiacă. Studiile ulterioare au arătat că într-un model de şoarece cu fibroză pulmonară indusă de bleomicină, atenuarea fibrozei ar putea fi realizată utilizând livrarea miR-29b.14 pe baza sistemului de transpozon Sleeping Beauty (SB). În prezent, un miR-29b mimetic se află într-un studiu clinic intradermic local de fază 1 privind tolerabilitatea şi siguranţa pe voluntari sănătoşi (miRagen Therapeutics™ MRG-201). Comparativ cu livrarea oligonucleotidelor miR-29 care ar necesita administrarea repetată legată de timpul de înjumătăţire al oligonucleotidelor, terapia genică AAV ar putea oferi o cale pentru transferul genei cu o singură livrare.
Exemplul 10
Tratament cu expresia specifică musculară a miR-29 şi fibroza redusă cu microdistrofină şi expresia ECM
Vectorii AAV care cuprind secvenţa miR29c şi un promotor specific muscular MCK au fost, de asemenea, generaţi şi testaţi ca terapie combinată cu vectori AAV care exprimă micro-distrofină. Pentru a genera vectorul rAAV, denumit aici rAAV.MCK.miR29c, secvenţa de 22 de nucleotide miR29c (catena ţintă SECV ID NR.: 3 şi catena ghid SECV ID NR.: 4) a fost clonată într-o schelă miR-30 condusă de un promotor MCK (SECV ID NR.: 11). Caseta de expresie (SECV ID NR.: 12) a fost clonată într-o plasmidă AAV monocatenară şi ambalată utilizând AAVrh74, un serotip cunoscut că se exprimă bine în muşchi. ADNc-ul miR-29c a fost sintetizat folosind un primer personalizat care conţine catena ţintă (sense) miR-29c, bucla miR-30 stem şi catena de ghidare (antisens) miR-29c în catena principală miR-30. Au fost modificate trei baze ale secvenţei miR-29c. Această secvenţă a fost apoi clonată într-un AAV ITR monocatenar care conţine plasmidă condusă de promotorul MCK şi secvenţa poliA.
Plasmida pAAV.MCK.miR29C conţine cADN-ul mir29c într-o catenă principală a buclei stem miR-30 flancată de secvenţe repetitive terminale inversate (ITR) AAV2. Această secvenţă a fost încapsidată în virionii AAVrh74. În plus, câteva nucleotide cu secvenţa ţintă miR-29c au fost modificate pentru a imita împerecherea Watson-crick la acest situs ca în shRNA-miR (luc). Conform modelului ShRNA-luc, ac de păr ar trebui să fie perfect complementar pe toată lungimea sa. În plus, cu cât sunt mai multe modificări ale firului pasager, cu atât este mai probabilă eliminarea oricărui mecanism endogen care reglează procesarea miR-29 care ar putea recunoaşte miARN-ul prin tulpină. Cea de a 19a bază a catenei de ghidare a fost modificată într-o citozină pentru a imita nucleotida care precede situsul de clivaj în secvenţa naturală mi-29c şi baza corespunzătoare de pe cealaltă catenă a fost schimbată pentru a păstra împerecherea.
Tratamentul precoce al terapiei combinate AAV.MCK.miR-29c/micro-distrofină a fost mai eficient în reducerea fibrozei şi a expresiei ECM. Şoarecii mdx/utrn+\- 4-5 săptămâni au primit o injecţie intramusculară de rAAVrh.74.MCK.MiR-29c şi rAAVrh74.MCK.micro-distrofină la 5×1011 vgs la muşchiul gastrocnemius stâng aşa cum este descris în Exemplul 5. Muşchii au fost recoltaţi la douăsprezece săptămâni după injectare. Colorarea cu roşu Picrosirius a muşchilor recoltaţi de la şoareci neinjectaţi şi injectaţi cu terapie combinată de rAAV.MCK.miR-29c/rAAV.MCK.micro-distrofină a arătat că muşchiul tratat concomitent a avut o reducere de 50,9% a colagenului comparativ cu muşchiul GAS netratat (vezi Fig. 13b). qRT-PCR a confirmat o creştere a nivelurilor transcriptului miR-29c în cohorta tratată (Fig. 13c). qRT-PCR semi-cantitativă a arătat o reducere semnificativă a nivelurilor de colagen A1 şi colagen 3A (Fig. 13d, e), fibronectină (Fig. 13f) şi Tgfβ1 (Fig. 13g) în muşchiul tratat cu AAV.MCK.miR-29c/AAV.micro-distrofină, comparativ cu terapia de membru contralateral (*p<0,05,****p<0,0001). Tratamentul tardiv al terapiei combinate AAV.MCK.miR-29c/micro-distrofină este eficient în reducerea fibrozei şi a expresiei ECM. Şoarecii Mdx/utrn+\- cu vârsta de trei luni au primit o injecţie intramusculară de rAAVrh.74.MCK.MiR-29c şi rAAVrh.74.MCK.micro-distrofină la 5×1011 vgs la muşchiul gastrocnemius stâng aşa cum este descris în Exemplul 5. Muşchii au fost recoltaţi la douăsprezece săptămâni după injectare. Coloraţia roşie cu picrosirius a muşchilor trataţi cu AAV.MCK.miR-29c şi AAV.MCK.miR-29c/AAV.micro-distrofină a arătat că muşchiul concomitent a avut o reducere de 30,3% a colagenului comparativ cu muşchiul GAS netratat (vezi Fig. 14a şi 14b) qRT-PCR a confirmat creşterea nivelului qRT în transcriptul miR-29 în cohortele tratate (Fig. 14c). qRT-PCR semi-cantitativă arată o reducere semnificativă a nivelurilor de colagen 1A şi colagen 3A (Fig. 14d, e), fibronectină (Fig. 14f) şi Tgfβ1 (Fig. 14G) în AAV.miR-29c/AAV.micro-distrofină, comparativ cu membrul contralateral al muşchiului tratat cu microdistrofină. ANOVA unidirecţională. Toate datele reprezintă media ± SEM. (** p<0,01, ****p<0,0001).
Exemplul 11
Terapia precoce combinată restabileşte forţa şi protejează împotriva leziunilor induse de contracţie mai bine decât tratamentul tardiv
Măsurarea forţei in vivo a fost efectuată pe GAS-ul şoarecilor trataţi devreme cu expresia specifică muşchilor a miR-29 şi micro-distrofină. aşa cum este descris în exemplele 8 şi 9. În şoarecii mdx/utrn+/- cu vârsta de 4 săptămâni, co-tratamentul folosind rAAV.MCK.miR-29c/şi rAAV care exprimă micro-distrofină a arătat o îmbunătăţire semnificativă a forţei absolute în comparaţie cu şoarecii mdx/utrn+/- netratat şi nu a existat nicio diferenţă faţă de tipul sălbatic (Fig. 15a). Forţa specifică a fost, de asemenea, normalizată la niveluri de tip sălbatic în urma terapiei combinate (Fig. 15b).
Muşchii au fost apoi evaluaţi pentru pierderea forţei în urma contracţiilor excentrice repetitive, aşa cum este descris în exemplul 9. Şoarecii trataţi împreună cu rAAV.MCK.miR-29c/rAAV.MCK.micro-distrofină şi rAAV.MCK.micro-distrofină au arătat o protecţie împotriva pierderii forţei netratate în comparaţie cu muşchii mdx/utrn +\- netrataţi (Fig. 15c).
În şoarecii mdx/utrn+/- de 12 săptămâni, co-tratamentul folosind rAAV.MCK.miR-29c/şi rAAV care exprimă micro-distrofină a restabilit forţa şi a protejat împotriva leziunilor induse de contracţie. Măsurarea forţei absolute (Fig. 16a) şi a forţei specifice normalizate (Fig. 16b) în urma contracţiei tetanice rAAV.MCK.miR-29c şi rAAV care exprimă muşchii GAS injectaţi cu microdistrofină au fost semnificativ crescute în comparaţie cu muşchii mdx/utrn+/- netrataţi. Ulterior, muşchii au fost evaluaţi pentru pierderea forţei în urma contracţiilor excentrice repetitive, aşa cum este descris în Exemplul 9. Şoarecii trataţi împreună cu MCK.miR-29c/micro-distrofină au arătat o protecţie împotriva pierderii forţei în comparaţie cu muşchii mdx/utrn+\- netrataţi. (Fig. 16c). Aceste date arată că reducerea fibrozei şi înlocuirea genelor conduc la creşterea forţei absolute şi specifice şi protejează în mod semnificativ muşchiul de leziunile induse de contracţie.
Exemplul 12
Tratamentul precoce combinat creşte hipertrofia şi hiperplazia musculară
Livrarea concomitentă a rAAV.MCK.miR-29 cu rAAV care exprimă micro-distrofină nu a crescut greutatea totală de gastroc injectat în comparaţie cu oricare dintre cele injectate singur la trei luni după injectare (Fig. 17a). Au fost măsurate şi diametrele miofibrelor. Tratamentul combinat miR-29c/micro-distrofină a demonstrat o creştere a dimensiunii medii a fibrelor. Comparând martorii mdx/utrn+/- cu mdx/utrn+/- tratat cu miR-29c/micro-distrofină, diametrul mediu a crescut de la 28,96 la 36,03µm (Fig. 17b). Livrarea concomitentă a produs o schimbare către distribuţia dimensiunii fibrelor de tip sălbatic (Fig. 17c). Numărul de fibre musculare pe mm2 în tratamentul combinat miR-29c/micro-distrofină a fost semnificativ mai mic decât şoarecii netraţi şi de tip sălbatic (Fig. 17d; ***p<0,01, ****p<0,0001).
REFERINŢE
1. Hoffman, E.P., Brown, R.H., Jr. & Kunkel, L.M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 51, 919-928 (1987).
2. Straub, V. & Campbell, K.P. Muscular dystrophies and the dystrophin glycoprotein complex. Curr Opin Neurol 10, 168-175 (1997).
3. Sacco, A., şi colab.Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell 143, 1059-1071 (2010).
4. Wallace, G.Q. & McNally, E.M. Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies. Annu Rev Physiol 71, 37-57 (2009).
5. Zhou, L. & Lu, H. Targeting fibrosis in Duchenne muscular dystrophy. J Neuropathol Exp Neurol 69, 771-776 (2010).
6. Desguerre, I., şi colab., Endomysial fibrosis in Duchenne muscular dystrophy: a marker of poor outcome associated with macrophage alternative activation. J Neuropathol Exp Neurol 68, 762-773 (2009).
7. Kim, J., şi colab., microRNA-directed cleavage of ATHB 15 mRNA regulates vascular development in Arabidopsis inflorescence stems. Plant J 42, 84-94 (2005).
8. Ambros, V. MicroRNA pathways in flies and worms: growth, death, fat, stress, and timing. Cell 113, 673-676 (2003).
9. Eisenberg, I., şi colab., Distinctive patterns of microRNA expression in primary muscular disorders. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 17016-17021 (2007).
10. Jiang, X., Tsitsiou, E., Herrick, S.E. & Lindsay, M.A. MicroRNAs and the regulation of fibrosis. FEBS J 277, 2015-2021 (2010).
11. van Rooij, E., şi colab.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 13027-13032 (2008).
12. Cacchiarelli, D., şi colab.MicroRNAs involved in molecular circuitries relevant for the Duchenne muscular dystrophy pathogenesis are controlled by the dystrophin/nNOS pathway. Cell Metab 12, 341-351 (2010).
13. DiPrimio, N., McPhee, S.W. & Samulski, R.J. Adeno-associated virus for the treatment of muscle diseases: toward clinical trials. Curr Opin Mol Ther 12, 553-560 (2010).
14. Mendell, J.R., şi colab.Sustained alpha-sarcoglycan gene expression after gene transfer in limb-girdle muscular dystrophy, type 2D. Ann Neurol 68, 629-638 (2010).
15. Mendell, J.R., şi colab.Limb-girdle muscular dystrophy type 2D gene therapy restores alpha-sarcoglycan and associated proteins. Ann Neurol 66, 290-297 (2009).
16. Mendell, J.R., şi colab.A phase 1/2a follistatin gene therapy trial for becker muscular dystrophy. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 23, 192-201 (2015).
17. Carnwath, J.W. & Shotton, D.M. Muscular dystrophy in the mdx mouse: histopathology of the soleus and extensor digitorum longus muscles. J Neural Sci 80, 39-54 (1987).
18. Coulton, G.R., Morgan, J.E., Partridge, T.A. & Sloper, J.C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol 14, 53-70 (1988).
19. Cullen, M.J. & Jaros, E. Ultrastructure of the skeletal muscle in the X chromosome-linked dystrophic (mdx) mouse. Comparison with Duchenne muscular dystrophy. Acta Neuropathol 77, 69-81 (1988).
20. Dupont-Versteegden, E.E. & McCarter, R.J. Differential expression of muscular dystrophy in diaphragm versus hindlimb muscles of mdx mice. Muscle Nerve 15, 1105-1110 (1992).
21. Stedman, H.H., şi colab.The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy. Nature 352, 536-539 (1991).
22. Deconinck, A.E., şi colab.Utrophin-dystrophin-deficient mice as a model for Duchenne muscular dystrophy. Cell 90, 717-727 (1997).
23. Grady, R.M., şi colab.Skeletal and cardiac myopathies in mice lacking utrophin and dystrophin: a model for Duchenne muscular dystrophy. Cell 90, 729-738 (1997).
24. Love, D.R., şi colab.An autosomal transcript in skeletal muscle with homology to dystrophin. Nature 339, 55-58 (1989).
25. Tinsley, J.M., şi colab.Primary structure of dystrophin-related protein. Nature 360, 591-593 (1992).
26. Tinsley, J., şi colab.Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med 4, 1441-1444 (1998).
27. Squire, S., şi colab.Prevention of pathology in mdx mice by expression of utrophin: analysis using an inducible transgenic expression system. Hum Mol Genet 11, 3333-3344 (2002).
28. Rafael, J.A., Tinsley, J.M., Potter, A.C., Deconinck, A.E. & Davies, K.E. Skeletal muscle-specific expression of a utrophin transgene rescues utrophin-dystrophin deficient mice. Nat Genet 19, 79-82 (1998).
29. Zhou, L., şi colab.Haploinsufficiency of utrophin gene worsens skeletal muscle inflammation and fibrosis in mdx mice. J Neural Sci 264, 106-111 (2008).
30. Gutpell, K.M., Hrinivich, W.T. & Hoffman, L.M. Skeletal Muscle Fibrosis in the mdx/utrn+/- Mouse Validates Its Suitability as a Murine Model of Duchenne Muscular Dystrophy. PloS one 10, e0117306 (2015).
31. Rodino-Klapac, L.R., şi colab.Micro-dystrophin and follistatin co-delivery restores muscle function in aged DMD model. Human molecular genetics 22, 4929-4937 (2013).
32. Cushing, L., şi colab.MIR-29 is a Major Regulator of Genes Associated with Pulmonary Fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol (2010).
33. Roderburg, C., şi colab.Micro-RNA profiling reveals a role for miR-29 in human and murine liver fibrosis. Hepatology 53, 209-218 (2011).
34. Nevo, Y., şi colab.The Ras antagonist, farnesylthiosalicylic acid (FTS), decreases fibrosis and improves muscle strength in dy/dy mouse model of muscular dystrophy. PloS one 6, e18049 (2011).
35. Rodino-Klapac, L.R., şi colab.A translational approach for limb vascular delivery of the micro-dystrophin gene without high volume or high pressure for treatment of Duchenne muscular dystrophy. J Transl Med 5, 45 (2007).
36. Mulieri, L.A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E.M. & Alpert, N.R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circ Res 65, 1441-1449 (1989).
37. Rodino-Klapac, L.R., şi colab.Persistent expression of FLAG-tagged micro dystrophin in nonhuman primates following intramuscular and vascular delivery. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 18, 109-117 (2010).
38. Grose, W.E., şi colab.Homologous recombination mediates functional recovery of dysferlin deficiency following AAV5 gene transfer. PloS one 7, e39233 (2012).
39. Liu, M., şi colab.Adeno-associated virus-mediated microdystrophin expression protects young mdx muscle from contraction-induced injury. Mol Ther 11, 245-256 (2005).

Claims (10)

1. Vector AAVrh74 recombinant care cuprinde un element de control specific muscular legat în mod operabil la secvenţa de nucleotide din SECV ID NR.: 7.
2. Vectorul AAVrh74 recombinant conform revendicării 1, în care elementul de control specific muscular este derivat din creatin kinaza musculară (MCK).
3. Vectorul AAVrh74 recombinant conform revendicării 2, în care elementul de control specific muşchilor cuprinde secvenţa de nucleotide din SECV ID NR.: 10 sau SECV ID NR.: 11.
4. Compoziţie care cuprinde vectorul AAVrh74 recombinant conform oricăreia dintre revendicările 1-3 şi un purtător acceptabil farmaceutic.
5. Vectorul AAVrh74 recombinant conform oricăreia dintre revendicările 1-3 sau compoziţia conform revendicării 4 pentru utilizare în tratamentul distrofiei musculare.
6. Vectorul AAVrh74 recombinant conform oricăreia dintre revendicările 1-3 sau compoziţia conform revendicării 4 pentru utilizare în reducerea sau prevenirea fibrozei la un subiect care suferă de distrofie musculară.
7. Vectorul AAVrh74 recombinant conform oricăreia dintre revendicările 1-3 sau compoziţia conform revendicării 4 pentru utilizare în creşterea forţei musculare sau a masei musculare la un subiect care suferă de distrofie musculară.
8. Vectorul sau compoziţia AAVrh74 recombinant pentru utilizare conform oricăreia dintre revendicările 5-7, în care vectorul sau compoziţia AAVrh74 recombinant este administrat înainte ca fibroza să fie observată la subiect sau înainte ca forţa musculară să fie redusă la subiect sau înainte ca masa musculară să fie redusă la subiect.
9. Vector sau compoziţie AAVrh74 recombinant pentru utilizare conform oricăreia dintre revendicările 5-8, în care subiectul suferă de distrofie musculară Duchenne.
10. Metodă in vitro de producere a unei proteine micro-distrofină funcţională care cuprinde infectarea unei celule gazdă cu un vector AAVrh74 recombinant conform oricăreia dintre revendicările 1-3 şi exprimarea unei proteine micro-distrofină funcţională în celula gazdă.
MDE20190237T 2016-04-15 2017-04-14 Eliberarea vectorului virus-adenoasociat de micro-distrofină pentru tratarea distrofiei musculare MD3442602T2 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662323163P 2016-04-15 2016-04-15
US201762473253P 2017-03-17 2017-03-17
PCT/US2017/027636 WO2017181015A1 (en) 2016-04-15 2017-04-14 Adeno-associated virus vector delivery of micro-dystrophin to treat muscular dystrophy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3442602T2 true MD3442602T2 (ro) 2025-07-31

Family

ID=60041940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20190237T MD3442602T2 (ro) 2016-04-15 2017-04-14 Eliberarea vectorului virus-adenoasociat de micro-distrofină pentru tratarea distrofiei musculare

Country Status (28)

Country Link
US (6) US11298429B2 (ro)
EP (5) EP4541894A3 (ro)
JP (6) JP7078546B2 (ro)
KR (3) KR102649707B1 (ro)
CN (2) CN118895311A (ro)
AU (4) AU2017250791B2 (ro)
BR (1) BR112018071182A2 (ro)
CA (2) CA3020996A1 (ro)
CO (1) CO2018012084A2 (ro)
DK (1) DK3442602T3 (ro)
ES (3) ES2985822T3 (ro)
FI (1) FI3442602T3 (ro)
HR (1) HRP20250541T1 (ro)
HU (1) HUE071243T2 (ro)
IL (3) IL319636A (ro)
LT (1) LT3442602T (ro)
MA (2) MA44683B1 (ro)
MD (1) MD3442602T2 (ro)
MX (2) MX2018012604A (ro)
MY (2) MY209041A (ro)
NZ (2) NZ787316A (ro)
PL (1) PL3442602T3 (ro)
PT (1) PT3442602T (ro)
RS (1) RS66847B1 (ro)
SG (1) SG11201808941PA (ro)
SI (1) SI3442602T1 (ro)
WO (3) WO2017181011A1 (ro)
ZA (2) ZA201806746B (ro)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102877920B1 (ko) 2015-11-16 2025-10-30 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 티틴-기반 근증 및 다른 티틴성병증의 치료를 위한 물질 및 방법
MA45477A (fr) 2016-04-15 2019-02-20 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Administration à vecteurs de virus adéno-associé de microarn-29 et micro-dystrophine pour traiter la dystrophie musculaire
US11338045B2 (en) 2017-03-17 2022-05-24 Newcastle University Adeno-associated virus vector delivery of a fragment of micro-dystrophin to treat muscular dystrophy
CN110997923B (zh) * 2017-03-17 2024-01-02 全国儿童医院研究所 腺相关病毒载体递送肌肉特异性微肌营养不良蛋白以治疗肌营养不良症
EP3697915A4 (en) * 2017-10-18 2021-12-08 Research Institute at Nationwide Children's Hospital ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTOR ADMINISTRATION SPECIFIC TO MUSCLES TO TREAT MUSCLE DYSTROPHY
KR20240164969A (ko) * 2017-10-20 2024-11-21 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 Nt-3 유전자 치료를 위한 방법 및 물질
AU2019216257B2 (en) 2018-01-31 2025-11-20 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Gene therapy for limb-girdle muscular dystrophy type 2C
JP7304878B2 (ja) * 2018-03-16 2023-07-07 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル キャプシド改変による組織特異的遺伝子送達の増加
US20210244828A1 (en) * 2018-05-15 2021-08-12 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Miri26-5p for treating motor neuron diseases
JP7534961B2 (ja) * 2018-06-18 2024-08-15 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル ジストログリカノパチーおよびラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための組換えアデノ随伴ウイルス生成物および方法
CN120393053A (zh) * 2018-06-18 2025-08-01 全国儿童医院研究所 用于治疗肌营养不良的肌肉特异性微小肌营养不良蛋白的腺相关病毒载体递送
WO2020006458A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus products and methods for treating limb girdle muscular dystrophy 2a
EP3598978B1 (en) 2018-07-26 2024-05-29 EXOFIX S.r.l. Fibroadipogenic progenitor-derived exosomes for regeneration of dystrophic muscles
WO2020123645A1 (en) * 2018-12-12 2020-06-18 Solid Biosciences Inc. Combination therapy for treating muscular dystrophy
US12377170B2 (en) 2019-02-26 2025-08-05 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery of β-sarcoglycan and the treatment of muscular dystrophy
JP7635139B2 (ja) * 2019-03-25 2025-02-25 ジェネトン オーバーラップａａｖベクターを使用する大きいサイズのクアシジストロフィンの産生
EP4017871B1 (en) 2019-08-21 2024-01-17 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery of alpha-sarcoglycan and the treatment of muscular dystrophy
WO2021142447A1 (en) * 2020-01-10 2021-07-15 Solid Biosciences Inc. Viral vector for combination therapy
WO2021142435A1 (en) * 2020-01-10 2021-07-15 Solid Biosciences Inc. Combination therapy for treating muscular dystrophy
BR112022021635A2 (pt) 2020-04-29 2022-12-06 Bristol Myers Squibb Co Distrofinas miniaturizadas tendo domínios de fusão de espectrina e usos das mesmas
IL299094A (en) * 2020-06-15 2023-02-01 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Administration of an adeno-associated virus vector for muscular dystrophies
CN111733185A (zh) * 2020-06-30 2020-10-02 华南农业大学 通过Mdfi基因编辑来实现动物肉品质改良的方法和应用
EP3936616A1 (en) * 2020-07-10 2022-01-12 Charité - Universitätsmedizin Berlin Microrna-targeted therapy for cardiac repair
KR20240095165A (ko) 2021-08-11 2024-06-25 솔리드 바이오사이언시즈 인크. 근이영양증의 치료
EP4401794A4 (en) * 2021-09-16 2025-09-17 Univ Florida AAV particles with modified inverted terminal repeats for enhanced gene expression in muscle
JP2023059858A (ja) 2021-10-15 2023-04-27 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 自己相補的アデノ随伴ウイルスベクター及び筋ジストロフィーの治療におけるその使用
EP4215614A1 (en) 2022-01-24 2023-07-26 Dynacure Combination therapy for dystrophin-related diseases
CN115819546B (zh) * 2022-08-19 2025-12-05 成都金唯科生物科技有限公司 表达微缩抗肌营养不良蛋白基因的腺相关病毒载体及其应用
JP2025527658A (ja) 2022-08-24 2025-08-22 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド 組換えアデノ随伴ウイルス及びその使用
WO2025188755A1 (en) * 2024-03-04 2025-09-12 Kate Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus compositions for the treatment of duchenne muscular dystrophy

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
ES2216005T3 (es) 1993-11-09 2004-10-16 Targeted Genetics Corporation Produccion de titulos elevados de vectores de aav recombinantes.
EP0728214B1 (en) 1993-11-09 2004-07-28 Medical College Of Ohio Stable cell lines capable of expressing the adeno-associated virus replication gene
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
AU707866B2 (en) 1994-12-06 1999-07-22 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant AAV vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
CA2625279A1 (en) 1995-08-30 1997-03-06 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and aav
ES2317646T3 (es) 1995-09-08 2009-04-16 Genzyme Corporation Vectores aav mejorados para terapia genica.
US5795872A (en) 1995-09-19 1998-08-18 Pharmadigm, Inc. DNA construct for immunization
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
CN1233291A (zh) 1996-09-06 1999-10-27 宾西法尼亚大学托管会 重组腺伴随病毒定向基因治疗的方法
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
ES2399232T3 (es) 1997-09-05 2013-03-26 Genzyme Corporation Procedimientos para la generación de preparaciones de vectores de AAV recombinantes de títulos altos exentas de auxiliares
JPH11318467A (ja) 1998-05-08 1999-11-24 Japan Science & Technology Corp 短縮型ジストロフィン
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
AU2001255575B2 (en) 2000-04-28 2006-08-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
AU2001261063A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 Xiao Xiao Dna sequences encoding dystrophin minigenes and methods of use thereof
ATE373095T1 (de) 2000-07-14 2007-09-15 Univ Michigan Mutierte muskelspezifische enhancer
EP1366160B1 (en) 2000-10-06 2008-07-09 The Regents Of The University Of Michigan Mini-dystrophin nucleic acid and peptide sequences
AU2002248297A1 (en) 2001-01-05 2002-07-16 Children's Hospital, Inc. Aav2 vectors and methods
PT2359869T (pt) 2001-12-17 2019-04-16 Univ Pennsylvania Sequências do vírus adeno-associado (aav) do serotipo 8, vetores contendo as mesmas, e utilizações destas
EP2295604B1 (en) 2004-02-09 2015-04-08 Thomas Jefferson University Diagnosis and treatment of cancers with microRNA located in or near cancer-associated chromosomal features
US20080044393A1 (en) 2004-07-16 2008-02-21 White Robert L Retinal dystrophin transgene and methods of use thereof
US20100184209A1 (en) * 2006-02-17 2010-07-22 Dharmacon, Inc. Compositions and methods for inhibiting gene silencing by rna interference
US7892824B2 (en) * 2007-01-18 2011-02-22 University Of Missouri-Columbia Synthetic mini/micro-dystrophin genes to restore nNOS to the sarcolemma
NZ583024A (en) 2007-07-31 2012-04-27 Regents The Univeristy Of Texas System Board Of An agonist of miR-29a, miR-29b or miR-29c that prevents tissue fibrosis and uses thereof
US8236557B2 (en) 2008-05-28 2012-08-07 University Of Missouri-Columbia Hybrid-AAV vectors to deliver large gene expression cassette
WO2010071454A1 (en) 2008-12-17 2010-06-24 Auckland Uniservices Limited Adeno-associated viral vectors and uses thereof
EP3290055B1 (en) 2011-07-25 2024-08-28 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of dux4
WO2013075008A1 (en) * 2011-11-16 2013-05-23 University Of Florida Research Foundation Inc. Aav dual vector systems for gene therapy
WO2013078316A1 (en) 2011-11-23 2013-05-30 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides
WO2013102904A1 (en) * 2012-01-05 2013-07-11 Hadasit Medical Research Services & Development Ltd. Methods and compositions for gene delivery
DE102012007232B4 (de) 2012-04-07 2014-03-13 Susanne Weller Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen
US9624282B2 (en) 2012-11-26 2017-04-18 The Curators Of The University Of Missouri Microdystrophin peptides and methods for treating muscular dystrophy using the same
CA2909807C (en) * 2013-04-20 2023-08-08 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus delivery of exon 2-targeted u7snrna polynucleotide constructs
JP2015092462A (ja) 2013-09-30 2015-05-14 Tdk株式会社 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池
GB201400598D0 (en) * 2014-01-14 2014-03-05 Univ Glasgow Materials and methods for modulation of tendon healing
PL3097197T3 (pl) * 2014-01-21 2021-06-28 Vrije Universiteit Brussel Mięśniowo-specyficzne elementy regulatorowe kwasów nukleinowych oraz sposoby i ich zastosowanie
WO2015141521A1 (ja) 2014-03-21 2015-09-24 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及び記録媒体
WO2015157306A1 (en) 2014-04-09 2015-10-15 University Of Houston Therapeutic mirnas for treating heart and skeletal muscle diseases
WO2015161255A1 (en) * 2014-04-18 2015-10-22 Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Education, On Behalf Of The University Of Nevada, Reno Methods for enhancing or decreasing the levels of mir124 and mir29 in subjects with muscular dystrophy
EP2960336A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Genethon Efficient systemic treatment of dystrophic muscle pathologies
JP6986444B2 (ja) * 2014-08-09 2021-12-22 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル Ｄｍｄ遺伝子のエクソン５内の内部リボソーム進入部位を活性化するための方法及び材料
JP6197169B2 (ja) 2014-09-29 2017-09-20 東芝メモリ株式会社 半導体装置の製造方法
US10842886B2 (en) * 2014-10-10 2020-11-24 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Guided injections for AAV gene transfer to muscle
CN107250364A (zh) 2015-01-16 2017-10-13 华盛顿大学 新的微小肌养蛋白及相关使用方法
GB201507842D0 (en) 2015-05-07 2015-06-17 New Royal Holloway & Bedford Production of large-sized microdystrophins in an AAV-based vector configuration
JP7338970B2 (ja) 2015-09-17 2023-09-05 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル Ｇａｌｇｔ２遺伝子治療のための方法および物質
WO2017165859A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Modified viral capsid proteins
MA45477A (fr) 2016-04-15 2019-02-20 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Administration à vecteurs de virus adéno-associé de microarn-29 et micro-dystrophine pour traiter la dystrophie musculaire
FI3442600T3 (fi) 2016-04-15 2024-05-14 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Adeno-assosioidulla virusvektorilla b-sarkoglykaanin ja mikro-rna-29:n toimittaminen ja lihasdystrofian hoito
CA2971303A1 (en) 2016-06-21 2017-12-21 Bamboo Therapeutics, Inc. Optimized mini-dystrophin genes and expression cassettes and their use
CN120393053A (zh) 2018-06-18 2025-08-01 全国儿童医院研究所 用于治疗肌营养不良的肌肉特异性微小肌营养不良蛋白的腺相关病毒载体递送

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017181014A1 (en) 2017-10-19
KR20240042136A (ko) 2024-04-01
JP7153562B2 (ja) 2022-10-14
DK3442602T3 (da) 2025-05-19
EP3442561B1 (en) 2024-02-14
IL302200B2 (en) 2025-08-01
US11406717B2 (en) 2022-08-09
US20190055581A1 (en) 2019-02-21
CN109069672B (zh) 2024-06-21
IL319636A (en) 2025-05-01
MA44683A (fr) 2019-02-20
BR112018071182A2 (pt) 2019-04-09
MX2018012604A (es) 2019-07-04
EP4410979A2 (en) 2024-08-07
ES2985822T3 (es) 2024-11-07
EP3442601A4 (en) 2019-11-20
WO2017181015A1 (en) 2017-10-19
US20250161490A1 (en) 2025-05-22
JP2025118741A (ja) 2025-08-13
HUE071243T2 (hu) 2025-08-28
EP3442602A4 (en) 2019-11-27
EP3442602B1 (en) 2025-02-19
AU2017250790A1 (en) 2018-11-15
IL262194A (en) 2018-11-29
US11723986B2 (en) 2023-08-15
EP3442601A1 (en) 2019-02-20
JP2022020839A (ja) 2022-02-01
EP4541894A2 (en) 2025-04-23
JP2019513393A (ja) 2019-05-30
US20230001015A1 (en) 2023-01-05
PT3442602T (pt) 2025-05-07
JP7431789B2 (ja) 2024-02-15
EP3442601B1 (en) 2024-07-03
CO2018012084A2 (es) 2019-02-08
MA44683B1 (fr) 2025-07-31
WO2017181011A1 (en) 2017-10-19
EP3442602A1 (en) 2019-02-20
ES2977730T3 (es) 2024-08-29
CA3020996A1 (en) 2017-10-19
SG11201808941PA (en) 2018-11-29
US20230173101A1 (en) 2023-06-08
CA3020999A1 (en) 2017-10-19
FI3442602T3 (fi) 2025-05-16
KR20250061772A (ko) 2025-05-08
JP2019513389A (ja) 2019-05-30
HRP20250541T1 (hr) 2025-07-18
AU2025208472A1 (en) 2025-08-14
NZ747049A (en) 2025-10-31
MA45477A (fr) 2019-02-20
AU2023201093A1 (en) 2023-05-18
RS66847B1 (sr) 2025-06-30
EP3442561A4 (en) 2019-12-18
MY209041A (en) 2025-06-17
US20190060489A1 (en) 2019-02-28
IL302200A (en) 2023-06-01
IL302200B1 (en) 2025-04-01
LT3442602T (lt) 2025-06-10
IL262194B2 (en) 2023-09-01
EP4410979A3 (en) 2024-11-06
AU2023201093B2 (en) 2025-05-15
JP2019513779A (ja) 2019-05-30
ZA201806746B (en) 2023-12-20
NZ787316A (en) 2025-10-31
MY195438A (en) 2023-01-21
CN118895311A (zh) 2024-11-05
ES3026989T3 (en) 2025-06-12
JP2024023439A (ja) 2024-02-21
JP7189771B2 (ja) 2022-12-14
PL3442602T3 (pl) 2025-07-07
US20190117795A1 (en) 2019-04-25
IL262194B1 (en) 2023-05-01
AU2017250791A1 (en) 2018-10-25
KR102649707B1 (ko) 2024-03-22
EP4541894A3 (en) 2025-06-11
EP3442561A1 (en) 2019-02-20
US11298429B2 (en) 2022-04-12
CN109069672A (zh) 2018-12-21
MX2024005644A (es) 2024-05-24
JP7078546B2 (ja) 2022-05-31
KR20180133486A (ko) 2018-12-14
AU2017250791B2 (en) 2022-11-24
ZA201906608B (en) 2025-03-26
SI3442602T1 (sl) 2025-07-31
KR102801562B1 (ko) 2025-04-30
AU2017250790B2 (en) 2024-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7431789B2 (ja) 筋ジストロフィーを治療するためのマイクロジストロフィンのアデノ随伴ウイルスベクター送達
US20230302157A1 (en) Adeno-Associated Virus Vector Delivery of Muscle Specific Micro-Dystrophin to Treat Muscular Dystrophy
HK40114888A (en) Adeno-associated virus vector delivery of microrna-29 and micro-dystrophin to treat muscular dystrophy
HK40125796A (en) Adeno-associated virus vector delivery of micro-dystrophin to treat muscular dystrophy
HK40004135B (en) Adeno-associated virus vector delivery of micro-dystrophin to treat muscular dystrophy
HK40004135A (en) Adeno-associated virus vector delivery of micro-dystrophin to treat muscular dystrophy
HK40004133B (en) Adeno-associated virus vector delivery of microrna-29 and micro-dystrophin to treat muscular dystrophy
HK40004133A (en) Adeno-associated virus vector delivery of microrna-29 and micro-dystrophin to treat muscular dystrophy
HK40004134A (en) Adeno-associated virus vector delivery of microrna-29 to treat muscular dystrophy
HK40004134B (en) Adeno-associated virus vector delivery of microrna-29 to treat muscular dystrophy
EA042315B1 (ru) Доставка микродистрофина вектором на основе аденоассоциированного вируса для лечения мышечной дистрофии
BR122024002143A2 (pt) Vetor de aavrh7.4 recombinante, composição, uso dos mesmos e método para produzir uma proteína micro-distrofina funcional