LU504853B1 - Probenträger zum Verwenden in einem rotationsbasierten Verfahren zur Vervielfältigung von DNA und/oder Bestimmung von Nukleinsäuren - Google Patents

Probenträger zum Verwenden in einem rotationsbasierten Verfahren zur Vervielfältigung von DNA und/oder Bestimmung von Nukleinsäuren Download PDF

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Niklas Virks
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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Probenträger (1) zum Verwenden in einem rotationsbasierten Verfahren zur Vervielfältigung von DNA und/oder Bestimmung von Nukleinsäuren, mit einem Grundkörper (2) und wenigstens einer in dem Grundkörper (3) ausgebildeten Amplifikationskammer (3). Der Probenträger ist dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationskammer (3) eine Dicke (d) von kleiner als 1mm, insbesondere in einem Bereich zwischen 10m und 0,9mm, vorzugsweise zwischen 10m und 0,5mm, aufweist.

Description

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LU504853
Probenträger zum Verwenden in einem rotationsbasierten Verfahren zur Vervielfältigung von
DNA und/oder Bestimmung von Nukleinsäuren
Die Erfindung betrifft einen Probenträger zum Verwenden in einem rotationsbasierten Verfahren zur
Vervielfältigung von DNA und/oder Bestimmung von Nukleinsäuren. Darüber hinaus betrifft die
Erfindung ein System mit einem solchen Probenträger und ein Verfahren zum Betreiben einer
Rotationsvorrichtung. Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung eine solchen Probenträgers zur Vervielfältigung von DNA und/oder Bestimmung von Nukleinsäuren.
Rotationsbasierte Verfahren werden beispielsweise im medizinischen Bereich angewendet. Meist kommen sie zum Einsatz, um Nukleinsäuren, wie beispielsweise DNA (Desoxyribonukleinsäure) oder
RNA (Ribonukleinsäure) zu bestimmen. Darüber hinaus werden die Verfahren zum Vervielfältigen von
DNA eingesetzt.
Zum Vervielfältigen von DNA wird üblicherweise die sogenannte Polymerase-Kettenreaktion (PCR) angewendet. Die PCR ist die Standardmethode zur spezifischen Vervielfältigung von DNA und ist für viele moderne biologische und biomedizinische in-vitro Prozesse unerlässlich. Besonders die Echtzeit-
PCR, bei der die fortschreitende Vervielfältigung der Ziel-DNA kontinuierlich durch fluoreszierende
Sonden ausgelesen wird, ist weit verbreitet, und kann zum Beispiel genutzt werden für die spezifische
Identifikation von infektiösen Pathogen aus Patientenproben. Die Miniaturisierung der PCR-Methode durch mikrofluidische Techniken bietet im Vergleich zu konventioneller, makroskopischer PCR einige
Vorteile im Hinblick auf Kosten, Schnelligkeit, Transportfähigkeit und möglicher Komplettintegration und Automatisierung mehrerer aufeinanderfolgender Prozesse.
Essenziell für die PCR-Methode ist das thermische Zyklieren, bei dem zyklisch die
Flüssigkeitstemperatur in der Amplifikationskammer mit den relevanten biologischen Komponenten an die für die biologischen Prozesse nötige Temperaturen angepasst wird. Die Geschwindigkeit, mit der diese Temperaturveränderung durchgeführt werden kann, hat einen direkten Einfluss auf die
Gesamteffektivität der PCR und auf die Dauer des Gesamtzyklus, wobei schnellere PCRs immer wichtiger werden, zum Beispiel für die Point-of-Care Diagnostik.
Darum gibt es eine Vielzahl von Techniken, die spezifisch darauf ausgerichtet sind die
Temperaturveränderung zu beschleunigen. Beispiele hier sind unter anderem die shunting- microfluidic PCR, bei der die Flüssigkeit zwischen verschiedenen Heizzonen hin und her bewegt wird,
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LU504853 die continous-flow PCR Technik, bei der die Flüssigkeit durch verschiedene Temperaturzonen fließt und Methoden die nicht auf Kontaktheizung basieren, wie, z.B. das Erhitzen durch Laser oder
Mikrowellenstrahlung. Am weitesten verbreitet und für den kommerziellen Einsatz dominierend, ist immer noch die Temperaturregelung durch Kontaktheizung/-kühlung. Für die Schnelligkeit der
Temperaturveränderung hierbei entscheidend ist das Volumen der Flüssigkeit, welches direkt proportional zur Dicke der Kammer ist, im Verhältnis zu dessen Auflagefläche mit der Kontaktheizung.
Dabei kann für dünnere Kammern die Temperatur der PCR-Flüssigkeit schneller zwischen den relevanten Temperaturen angepasst werden als für Kammern mit einer größeren Dicke. Dies macht es erstrebenswert, PCR in sehr dünnen Kammern auszuführen.
Je kleiner die Größenskalen werden, desto größer sind jedoch die relativen Effekte von
Oberflachenspannung und Benetzung. Mit abnehmender Kammergröße wird es deshalb zunehmend schwieriger Luftblasen aus einem Auslesebereich der Amplifikationskammer zu entfernen. Luftblasen können auf verschiedene Weisen entstehen, beispielsweise durch das wiederholte, zyklische
Aufheizen auf Temperaturen nahe dem Siedepunkt von Wasser, kann es zur Entgasung von im
Reaktionsvolumen gelösten Gasen kommen oder das Auflösen von Lyophyilisaten kann Blasen erzeugen oder begünstigen. Blasen sind aber ein bekannter störender Faktor für die optische Auslese der Vervielfältigung von DNA und/oder der Detektion im Mikroliterbereich. Darüber hinaus lassen sich flache Amplifikationskammern nur schwer blasenfrei befüllen. Dazu müssen spezielle Geometrien — eingesetzt werden, die den Herstellungsvorgang des Probenträgers verkomplizieren. Die bei sehr dünnen Kammern mit kleinem Flüssigkeitsvolumen entstehende Blasenbildung kann einen erheblichen Einfluss auf die korrekte Signaldetektion haben, insbesondere wenn sich Blasen im direkten Auslesepfad der optischen Auslesevorrichtung befinden.
Die Aufgabe der Erfindung besteht daher darin, einen Probenträger bereitzustellen, mittels der die
Zeitdauer des PCR-Vorgangs reduziert wird.
Die Aufgabe wird gelöst durch einen Probenträger zum Verwenden in einem rotationsbasierten
Verfahren zur Vervielfältigung von DNA und/oder Bestimmung von Nukleinsäuren, mit einem
Grundkörper und wenigstens einer in dem Grundkörper ausgebildeten Amplifikationskammer, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationskammer eine Dicke von kleiner als 1 mm (Millimeter), insbesondere in einem Bereich zwischen 10um (Mikrometer) und 0,9 mm, vorzugsweise zwischen 10um und 0,5mm, aufweist.
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Darüber hinaus besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, ein Verfahren bereitzustellen, mittels dem die Zeitdauer des PCR-Vorgangs reduziert wird.
Die Aufgabe wird gelôst durch ein Verfahren zum Betreiben einer Rotationsvorrichtung mit einem
Trägerhalter, der wenigstens einen erfindungsgemäBen Probentrager trägt, wobei die
Rotationsvorrichtung in einem Auslesebetrieb oder einem Entlüftungsbetrieb betrieben wird, wobei die Drehzahl der Rotationsvorrichtung im Auslesebetrieb geringer ist als im Entlüftungsbetrieb.
Der erfindungsgemäße Probenträger weist den Vorteil auf, dass die Effektivität des PCR-Gesamtzyklus erhöht wird, weil die Zeitdauer des PCR-Gesamtzyklus reduziert wird. Dies ist möglich, weil aufgrund der gewählten Dicke der Amplifikationskammer die Temperaturveränderung der in der
Amplifikationskammer befindlichen Flüssigkeit schnell erfolgt. Mit anderen Worten, die in der
Amplifikationskammer befindliche Flüssigkeit kann sehr schnell auf die Zieltemperatur aufgeheizt oder abgekühlt werden. Dies ergibt sich, weil dünne Amplifikationskammern in kleinen absoluten räumlichen Temperaturunterschieden und/oder kleinen Temperaturgradienten innerhalb der
Flüssigkeit resultieren. Die resultierende gleichmäßigere Temperaturverteilung erlaubt homogene
Reaktionsbedingungen in der Amplifikationskammer, was für die Verkürzung der Zeitdauer des PCR-
Gesamtzyklus förderlich ist.
Der erfindungsgemäße Probenträger ermöglicht somit, dass die Zeitdauer des oben beschriebenen
PCR-Vorgangs reduziert wird. Gleichzeitig kann bei Drehen des Probenträgers durch die
Rotationsvorrichtung die Amplifikationskammer durch die optische Auslesevorrichtung gut ausgelesen werden, ohne dass Gasblasen, insbesondere Luftblasen, den Auslesevorgang beeinträchtigen. Dies wird nachfolgend näher erläutert.
Im Sinne der Erfindung wird als „Dicke“ die Erstreckung der Amplifikationskammer in einer Richtung verstanden, die parallel zur Rotationsachse ist und/oder normal zum Grundkörper steht. Die „Dicke“ kann einer „mittleren Dicke“ der Amplifikationskammer entsprechen.
Die mittlere Dicke ist dabei der Quotient zwischen, insbesondere beheiztem, Flüssigkeitsvolumen innerhalb der Amplifikationskammer geteilt durch die beheizte Grundfläche oder die beheizten
Grundflächen der Amplifikationskammer. Die wenigstens eine beheizte Grundfläche entspricht der
Grundfläche der Amplifikationsammer, welche im PCR Betrieb mit Flüssigkeit benetzt ist. Durch die beheizte Grundfläche kann, insbesondere der wesentliche Anteil, der Wärme in die
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Amplifikationskammer eingetragen oder aus der Amplifikationskammer ausgetragen werden. Die beheizte Grundfläche der Amplifikationskammer kann wenigstens einem Teil einer Bodenflache der
Amplifikationskammer entsprechen.
Als ,Auslesebetrieb” wird ein Betrieb der Rotationsvorrichtung verstanden, bei dem ein Auslesen der wenigstens einen Amplifikationskammer erfolgt. Als „Auslesen“ wird ein Vorgang verstanden, bei dem unter Verwendung der optischen Auslesevorrichtung erfasst wird, ob Nukleinsäuren in der
Amplifikationskammer vorhanden ist. Eine Datenverarbeitungsvorrichtung der Rotationsvorrichtung kann auf Basis der ausgelesenen Daten bestimmen, ob Nukleinsäure in der Amplifikationskammer vorhanden ist. Alternativ oder zusätzlich kann die Datenverarbeitungsvorrichtung auf Basis der im
Rahmen des Auslesevorgangs ermittelten Daten die Vervielfältigung der in der Amplifikationskammer befindlichen DNA bestimmen.
Die elektrische oder elektronische Datenverarbeitungsvorrichtung kann wenigstens einen Prozessor aufweisen oder ein Prozessor sein. Die Datenverarbeitungsvorrichtung kann Bestandteil einer
Leiterplatte sein. Darüber hinaus kann die Datenverarbeitungsvorrichtung in einem Innenraum der
Rotationsvorrichtung angeordnet sein oder außerhalb von dem Innenraum der Rotationsvorrichtung angeordnet sein.
Im Entlüftungsbetrieb wird der Probentrager mit wenigstens einer vorgegebenen Drehzahl gedreht.
Dabei erfolgt im Entlüftungsbetrieb kein Auslesen der Amplifikationskammer durch die
Auslesevorrichtung. Die Drehzahl im Entlüftungsbetrieb ist größer als im Auslesebetrieb. Alternativ kann die Drehzahl im Entlüftungsbetrieb gleich der Drehzahl im Auslesebetrieb sein. Dabei ist dem
Entlüftungsbetrieb die Drehzahl des Trägerhalters so groß, dass Gasblasen aus der
Amplifikationskammer verdrängt werden.
Eine Rotationsvorrichtung kann in einem Rotationsbetrieb betrieben werden. Im Rotationsbetrieb wird der Probenträger mit wenigstens einer vorgegebenen Drehzahl gedreht. Dabei erfolgt im
Rotationsbetrieb kein Auslesen der Amplifikationskammer durch die Auslesevorrichtung. Im
Rotationsbetrieb erfolgt die Prozessierung der zugegebenen Probe, insbesondere biologischen Probe durch die in dem Probenträger befindlichen Reagenzien. Dabei kann die Drehzahl im Rotationsbetrieb größer sein als die Drehzahl im Auslesebetrieb. Dies ist notwendig, weil zum Prozessieren der Probe eine Mindestdrehzahl notwendig ist und die Geschwindigkeit des Detektors die maximale Drehzahl während der Auslese limitiert. Es ist jedoch nicht ausgeschlossen, dass im Rotationsbetrieb die
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Drehzahl der Drehzahl im Auslesebetrieb entspricht oder kleiner als die Drehzahl im Auslesebetrieb ist.
Von besonderem Vorteil ist auch eine Rotationsvorrichtung mit wenigstens einem 5 erfindungsgemalen Probenträger und einer Rotationsvorrichtung, die einen drehbaren Tragerhalter aufweist, der den Probenträger hält. Die Rotationsvorrichtung weist den Vorteil auf, dass durch
Drehen des Probentragers die störenden Gasblasen aus der Amplifikationskammer entfernt werden können. Dies ist möglich, weil durch die durch die Rotation auf die Luftblasen erzeugten Kräfte bewirken, dass die Gasblasen nicht mehr im optischen Pfad der Auslesevorrichtung angeordnet sind.
Genauer gesagt ermöglichen die Rotationskräfte eine konstante Entfernung von Gasblasen aus dem
Ausleseabschnitt der Amplifikationskammer. Insbesondere wird die Verdrängung der Gasblasen realisiert durch eine hôhere Drehzahl des Trägerhalters im Entlüftungsbetrieb als im Auslesebetrieb, durch welche die Flüssigkeit in der Amplifikationskammer radial nach außen gedrückt wird und damit die leichteren Gasblasen radial nach innen verdrängt. Mit „radial innen“ oder „radial außen“ wird die
Radialrichtung bezogen auf die Rotationsachse des Probenträgers und/oder des Trägerhalters gemeint.
Der erfindungsgemäße Probenträger ermöglicht eine zuverlässige real-time PCR für dünne
Amplifikationskammern, insbesondere für Amplifikationskammern mit einer Dicke im Bereich 10pm und 0,5mm. Infolge der dünnen Ausbildung der Amplifikationskammer ist eine schnelle Anpassung der in der Amplifikationskammer befindlichen Flüssigkeit an eine Zieltemperatur möglich. Dies ermöglicht ein schnelles thermisches Zyklieren und somit schnelle, real-time PCR.
Die Bestimmung von Nukleinsäuren kann eine Detektion von Nukleinsäuren und/oder eine
Quantifizierung von Nukleinsäuren umfassen. Dabei kann die Nukleinsäure in der gesamten
Amplifikationskammer bestimmt werden, sofern die optische Auslesevorrichtung die gesamte
Amplifikationskammer ausliest. Alternativ kann ein Ausleseabschnitt der Amplifikationskammer ausgelesen werden, wobei der Restabschnitt der Amplifikationskammer nicht ausgelesen wird.
Bei einer Ausführung kann eine Auslesevorrichtung zum Auslesen der Amplifikationskammer, vorhanden sein. Dabei kann der Teil der Amplifikationskammer ausgelesen werden, die mit Flüssigkeit gefüllt ist. Die Auslesevorrichtung kann zum Bestimmen von Nukleinsäuren, insbesondere von DNA und/oder RNA, geeignet sein. Die Auslesevorrichtung kann eingerichtet sein, die
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Amplifikationskammer optisch zu erfassen. So kann die Auslesevorrichtung ein Objektiv und wenigstens ein optisches Element, wie beispielsweise wenigstens einem Umlenkspiegel und/oder optische Filter, aufweisen. Dabei kann die Auslesevorrichtung ein Fluoreszenzdetektor sein. In diesem
Fall ist die Auslesevorrichtung dazu konfiguriert, von der Amplifikationskammer ausgehende
Fluoreszenzsignale zu erfassen und/oder zu verarbeiten. Dazu können mittels der Auslesevorrichtung in der Amplifikationskammer befindliche fluoreszierende Sonden ausgelesen und daraus ein
Rückschluss auf die Vervielfältigung der in der Amplifikationskammer befindlichen DNA getätigt werden.
Die wenigstens eine Amplifikationskammer des Probenträgers kann Abschnitte mit unterschiedlichen
Dicken aufweisen. Dabei kann die die wenigstens eine Amplifikationskammer zwei Abschnitte mit unterschiedlichen Dicken aufweist, wobei der tiefere der beiden Abschnitte auslesbar ist. Eine derartig ausgebildete Amplifikationskammer weist den Vorteil auf, dass ein gutes Auslesen sichergestellt ist.
So kann die Auslesevorrichtung nicht die gesamte Amplifikationskammer auslesen, sondern nur einen
Ausleseabschnitt der Amplifikationskammer auslesen. Vorzugsweise wird, insbesondere nur, ein
Ausleseabschnitt der Amplifikationskammer ausgelesen, wobei der Ausleseabschnitt tiefer ist als ein
Restabschnitt der Amplifikationskammer. Eine tiefere Kammer erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass mehr Zielmaterial, wie DNA und/oder RNA, in dem Ausleseabschnitt der Amplifikationskammer angeordnet sind. Bei einer höheren Zielmaterialmenge im Ausleseabschnitt kann auch ein stärkeres
Signal durch die Auslesevorrichtung empfangen werden.
Dabei kann mittels der Auslesevorrichtung das Zielmaterial, insbesondere die Nukleinsäure, direkt bestimmt werden. Alternativ ist es möglich, ein anderes Material zu bestimmen, aus dem dann das
Zielmaterial, insbesondere die Nukleinsäure, bestimmt werden kann. So kann ein bei einer Reaktion entstehendes Beiprodukt bestimmt und daraus die Menge an Nukleinsdure in der
Amplifikationskammer bestimmt werden. Bei einer fluoreszierenden Messmethodik fluoresziert das
Beiprodukt und kann durch die optische Auslesevorrichtung bestimmt werden.
Der Ausleseabschnitt kann bezogen auf die Rotationsachse des Probenträgers radial zwischen — wenigstens zwei Restabschnitten der Amplifkationskammer angeordnet sein. Dies bedeutet, dass es einen ersten Restabschnitt geben kann, der radial näher zur Rotrationsachse angeordnet ist als der
Ausleseabschnitt. Darüber hinaus kann ein zweiter Restabschnitt existieren, der radial von der
Rotationsachse weiter angeordnet ist als der Ausleseabschnitt. Das Auslesen im tieferen
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Ausleseabschnitt bietet den Vorteil, dass mehr Material ausgelesen werden kann im Vergleich zu einem Auslesen im Restabschnitt. Dadurch verbessert sich das Signal zu Rauschverhältnis.
Dabei kann der Ausleseabschnitt der wenigstens einen Amplifikationskammer eine Dicke von wenigstens 1mm aufweisen. Insbesondere kann der Ausleseabschnitt eine Dicke in einem Bereich zwischen 1 mm bis 2mm aufweisen. Der Restabschnitt der Amplifikationskammer kann eine Dicke von kleiner als 1mm aufweisen. Insbesondere kann die Amplifikationskammer mit einer Dicke in einem Bereich zwischen 10pm und 0,9 mm, vorzugsweise zwischen 10pm und 0,5mm aufweisen.
Insbesondere kann der Probenträger eine Amplifikationskammer mit einem Ausleseabschnitt aufweisen, der eine mittlere Dicke von kleiner als 1mm aufweist. In einer derartigen Ausführung kann die Dicke in radialer und/oder azimuthaler Richtung variieren.
Ein weiterer Vorteil einer Amplifikationskammer mit unterschiedlich tiefen Abschnitten besteht darin, dass durch den tiefen Amplifikationskammerabschnitt, also den Amplifikationskammerabschnitt mit einer Dicke von wenigstens 1 mm, Flüssigkeit aus der Amplifikationskammer gepumpt werden kann.
Der flache Amplifikationskammerabschnitt, also der Amplifikationskammerabschnitt mit einer Dicke von kleiner als 1 mm, hat einen hohen Widerstand, der einem schnellen und reproduzierbaren pumpen von Flüssigkeit aus der Amplifikationskammer entgegenwirkt.
Der Ausleseabschnitt kann wenigstens 10% der Amplifikationskammer, insbesondere einen Bereich zwischen 10-50% der Amplifikationskammer, aufweisen. Dabei beinhaltet der Ausleseabschnitt den
Teil der Amplifikationskammer, die mit Flüssigkeit befüllt ist. Insbesondere beinhaltet der
Ausleseabschnitt eine Bodenflache der Amplifikationskammer, die mit Flüssigkeit benetzt ist.
Dagegen kann ein Abschnitt der Amplifikationskammer nicht ausgelesen werden, der keine Flüssigkeit enthält.
Ein derart ausgebildeter Ausleseabschnitt ermôglicht ein gutes Auslesen des Ausleseabschnitts und das Erkennen von in dem Ausleseabschnitt befindlichen Zielmaterials, insbesondere Fluorophors.
Gleichzeitig ist der Ausleseabschnitt nicht zu groß, sodass eine Temperaturänderung der in der
Amplifikationskammer befindlichen Flüssigkeit schnell erfolgen kann. Durch die Rotation des
Probenträgers ergibt sich eine thermische Konvektion die die Wärme schnell gleichmäßig in der
Amplifikationskammer verteilt. Daher hat der tiefere Ausleseabschnitt keinen stark nachteiligen Effekt
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Bei einer besonderen Ausführung kann die mittlere Dicke, also der Quotient des Flüssigkeitsvolumens der in der Amplifikationskammer befindlichen Flüssigkeit geteilt durch eine mit der Flüssigkeit benetzte Grundfläche, insbesondere Bodenflache, der Amplifikationskammer kleiner als 1 mm sein.
Die mit Flüssigkeit benetzte Grundfläche der Amplifikationskammer kann der gesamten Grundfläche der Amplifikationskammer, insbesondere der gesamten Bodenflache der Amplifikationskammer, entsprechen, durch die Wärme in die Amplifikationskammer eingebracht oder aus der
Amplifikationskammer ausgebracht wird. Alternativ kann die mit Flüssigkeit benetzte Grundfläche der
Amplifikationskammer kleiner sein als die gesamte Grundfläche des Probenträgers, insbesondere die gesamte Bodenfläche der Amplifikationskammer, durch die Wärme in die Amplifikationskammer eingebracht oder aus der Amplifikationskammer ausgebracht wird.
Es sind Ausführungen möglich, bei denen die Flüssigkeit nicht die gesamte Bodenflache der
Amplifikationskammer benetzt. In diesen Ausführungen unterscheidet sich die mit Flüssigkeit benetzte Bodenflache der Amplifikationskammer von der Auflageflache des Probentragers über den
Wärme in die Amplifikationskammer eingebracht oder aus der Amplifikationskammer ausgebracht wird.
Dabei kann sich die Amplifikationskammer, insbesondere Hauptamplifikationskammer, in radialer
Richtung in einem Bereich zwischen 1mm und 10mm, insbesondere 5mm, erstrecken und/oder kann sich in azimuthaler Richtung in einem Bereich zwischen 1mm und 6mm, insbesondere 4mm, erstrecken. Eine derart ausgebildete Amplifikationskammer weist ein ausreichend großes Volumen auf, sodass mit hoher Wahrscheinlichkeit eine hohe Zielmaterialmenge in der Amplifikationskammer angeordnet ist. Gleichzeitig ist die Amplifikationskammer nicht zu groß, sodass eine
Temperaturänderung der in der Amplifikationskammer befindlichen Flüssigkeit schnell erfolgen kann.
Eine Voramplifikationskammer kann von der Hauptamplifikationskammer unterschiedliche ausgebildet sein. Insbesondere kann sich die Voramplifikationskammer in radialer Richtung 20 mm und/oder in azimuthaler Richtung 20 mm erstrecken.
Die Amplifikationskammer kann eine Hauptamplifikationskammer oder eine
Voramplifikationskammer sein. Dabei kann der Probentrager eine oder mehrere
Hauptamplifikationskammern aufweisen. Außerdem kann der Probenträger eine oder mehrere
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Voramplifikationskammern aufweisen. Der Probenträger kann auch wenigstens eine
Hauptamplifikationskammer und wenigstens eine Voramplifikationskammer aufweisen. Dabei kann die in den Probentrager eingebrachte Probe, insbesondere biologische Probe, zuerst in der
Voramplifikationskammer = prozessiert werden, bevor eine Prozessierung in der
Hauptamplifikationskammer erfolgt.
Durch Vorsehen von wenigstens einer Voramplifikationskammer kann die Menge an Zielmaterial, wie beispielsweise Nukleinsäure, das in die Hauptamplifikationskammer gelangt um einen Faktor 100 oder mehr erhöht werden. Dadurch kann sichergestellt werden, dass genug Zielmaterial in der
Hauptamplifikationskammer vorhanden ist, damit das Zielmaterial von der Auslesevorrichtung ermittelt wird. Somit wird das Problem vermieden, dass in der Hauptamplifikationskammer kein
Zielmaterial vorhanden ist. Dieses Problem stellt sich, weil die Hauptamplifikationskammer flach ist.
Darüber hinaus hat das Vorsehen wenigstens einer Voramplifikationskammer den Vorteil, dass eine hohe Robustheit gegenüber Inhibitoren erreicht wird. In einer PCR-Voramplifikation mit 5-20 Zyklen werden typischerweise nicht vergleichbare Mengen an DNA Kopien im Vergleich zu einer 1-Schritt PCR mit 30-50 Zyklen hergestellt. Dadurch sind Biomoleküle, wie beispielsweise Primer oder Polymerase, meist nicht limitiert und Anforderungen an deren Prozessivität und Aktivität in Reaktionsumgebungen sind weniger kritisch. Ferner sind typische Inhibitionsmechanismen einer realtime PCR, bei welcher eine Fluoreszenzgeneration gestört wird, für die Voramplifikation nicht gegeben. Die Störungen spielen erst ab der zweiten Amplifikation in der Hauptamplifikationskammer eine Rolle, wobei dort dann aber ein Verdünnungsfaktor von typischerweise 5-40 vorliegt.
Ein Probenträger kann derart ausgebildet sein, dass bei eine Voramplifikation der Nukleinsäure in der
Voramplifikationskammer durchgeführt wird, bevor die Nukleinsäure in der
Hauptamplifikationskammer amplifiziert wird. Die Voramplifikation und Hauptamplifikation erfolgen, nachdem der Probenträger in die Rotationsvorrichtung eingesetzt wird. Insbesondere erfolgen die
Voramplifikation und Hauptamplifikation aufgrund der Rotation des Probenträgers durch den
Trägerhalter.
Als Hauptamplifikationskammer wird die Kammer verstanden, in der die DNA vervielfältigt wird und/oder bei der die Nukleinsäure, insbesondere DNA und/oder RNA, bestimmt wird. Die
Auslesevorrichtung ist derart ausgebildet und angeordnet, dass sie die Hauptamplifikationskammer ausliest.
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Bei einer besonderen Ausführung kann die Hauptamplifikationskammer wenigstens einen Abschnitt mit einer Dicke, insbesondere einer mittleren Dicke, von kleiner als 1mm aufweisen. Sofern die
Ausführung eine Voramplifikationskammer aufweist, kann die Voramplifikationskammer eine Dicke, insbesondere eine mittlere Dicke, von kleiner als 1 mm oder von wenigstens 1 mm aufweisen. Dabei ist es vorteilhaft, dass die Voramplifikationskammer eine Dicke von kleiner als 1 mm aufweist, damit der Amplifikationsvorgang schnell durchgeführt werden kann.
Bei einer Ausführung kann der Grundkörper scheibenförmig und/oder kreissegmentförmig ausgebildet sein und/oder eine mikrofluidische Kanal- und/oder Kammerstruktur kann im
Grundkörper vorhanden sein. Die Amplifikationskammer ist Bestandteil der mikrofluidischen Kanal- und/oder Kammerstruktur. Als „mikrofluidische Kanalstruktur“ wird eine Kanalstrukturen verstanden, deren Abmessungen in wenigstens einer Raumrichtung, insbesondere in Tiefenrichtung und/oder
Tangentialrichtung, in einem Bereich zwischen 30 bis 700 pm (Mikrometer) liegen können.
Der drehbare Trägerhalter der Rotationsvorrichtung kann derart ausgebildet sein, dass er einen oder mehrere Probenträger aufnimmt. Für den Fall, dass der Probenträger kreissegmentförmig ausgebildet ist, kann der drehbare Trägerhalter wenigstens zwei Probenträger aufnehmen. Die
Probenträger können gleichzeitig durch den Trägerhalter gedreht werden.
Der Probenträger kann derart ausgebildet und dazu konfiguriert sein, sodass wenigstens einer der nachfolgenden Verfahrensschritte unter Verwendung des Probenträgers realisiert werden kann. So kann der Probenträger eine Zugangsleitung aufweisen, in die die zu prozessierende Probe eingegeben wird. Darüber hinaus kann eine thermische und/oder chemische und/oder mechanische Lyse durchgeführt werden. Außerdem kann die Probe mit einem Voramplifikationspuffer gemischt werden. Das Gemisch kann mit einem ersten Lyophilisat, welches Enzyme für eine
Amplifikationsreaktion enthält, gemischt werden. Es kann eine Voramplifikation, z.B. als PCR in 50-500 pl mit 5-20 Zyklen durchgeführt werden. Ein Teil des Voramplifikats kann abgemessen und mit
Hauptamplifikationspuffer und Lyophilisat, welches Enzyme, wie z.B. Polymerase, für die
Hauptamplifikation enthält, gemischt werden. Das Gemisch aus Hauptamplifikationspuffer,
Lyophilisat und Voramplifikat kann in einer oder mehrere Hauptamplifikationskammern aufgeteilt werden.
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Der Probentrager kann ein Folienelement aufweisen, das an dem Grundkörper angebracht ist und/oder einen Boden der Amplifikationskammer bildet. Die Amplifikationskammer kann somit durch das Folienelement und Grundkdrperwande begrenzt sein. Insbesondere kann das
Folienelement, insbesondere direkt, an eine Grundkdrperseite angebracht sein und/oder derart an den Grundkörper angebracht sein, dass der Grundkörper versiegelt ist. Das Folienelement kann elastisch ausgeführt sein. Insbesondere kann das Folienelement ein kleineres Elastizitätsmodul aufweisen als der Grundkörper. Dabei kann die Folie eine Dicke in einem Bereich zwischen 30 um und 200 um, insbesondere 90 um, aufweisen. Das Folienelement kann auf dem Tragerhalter, insbesondere direkt aufliegen. Dabei kann ein Wärmeeintrag durch den Tragerhalter durch das Folienelement in die
Amplifikationskammer erfolgen, um die in der Amplifikationskammer befindliche Flüssigkeit zu erwärmen. Dabei kann ein nahezu ausschließlich konduktiver Wärmeeintrag vom Trägerhalter in das
Folienelement erfolgen. Vom Folienelement kann ein konvektiver Warmeeintrag in die
Amplifikationskammer erfolgen. Alternativ kann ein konvektiver Wärmeaustrag von der
Amplifikationskammer in das Folienelement erfolgen.
Bei einer Ausführung kann der Grundkörper einen Einlass zum Einlassen von Flüssigkeit in die
Amplifikationskammer aufweisen. Die Flüssigkeit kann die Nukleinsäure beinhalten. Dabei kann eine in der Amplifikationskammer befindliche Gasblase durch den Einlass aus der Amplifikationskammer ausgebracht werden, wenn die Rotationsvorrichtung in dem Rotationsbetrieb ist. Dies bedeutet, dass die Gasblase durch denselben Einlass aus der Amplifikationskammer ausbringbar durch den die
Flüssigkeit in die Amplifikationskammer eingebracht wurde. Somit müssen keine Gasblasenkammern in der Amplifikationskammer vorgesehen werden, wodurch sich die Ausbildung der
Amplifikationskammer vereinfacht.
Bei einer Ausführung können die Auslesevorrichtung und/oder der Probenträger derart ausgebildet sein, dass die Amplifikationskammer in einem Auslesebetrieb der Rotationsvorrichtung ausgelesen wird. Die Auslesevorrichtung und der drehbare Trägerhalter können sich bezüglich des Probentragers gegenüberliegen. Insbesondere kann die von dem Folienelement abgewandte Seite des
Probenträgers zur Auslesevorrichtung weisen.
Die Rotationsvorrichtung kann eine Vorrichtung zum Heizen oder Kühlen der Amplifikationskammer aufweist. Die Vorrichtung kann ein Peltierelement und/oder Widerstandsheizdraht sein und/oder derart angeordnet sein, dass sie den Trägerhalter aufwärmt oder abkuhlt. Die Vorrichtung wird genutzt, um die Temperatur der in der Amplifikationskammer befindlichen Temperatur einzustellen.
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Der Probenträger kann derart auf dem Trägerhalter angeordnet sein, dass die Temperaturänderung der Flüssigkeit, insbesondere ausschließlich, durch den Tragerhalter erfolgt. Insbesondere kann der
Probentrager, vorzugsweise direkt, auf dem Tragerhalter angeordnet sein, sodass die
Amplifikationskammer von dem Trägerhalter erhitzt oder gekühlt wird. Mit anderen Worten, der
Wärmeeintrag in die Amplifikationsvorrichtung erfolgt nur von einer Seite des Probentragers.
Dadurch ist ein einfacher Aufbau der Rotationsvorrichtung môglich, weil es nicht notwendig ist,
Vorrichtungen zum Heizen oder Kühlen an unterschiedlichen Stellen der Rotationsvorrichtung vorzusehen. Alternativ können mehrere Vorrichtungen zum Heizen oder Kühlen der in der
Amplifikationskammer vorhandenen Flüssigkeit vorgesehen sein.
Die Rotationsvorrichtung kann eine Unterdruckeinrichtung zum Anlegen eines Unterdrucks auf den
Probenträger, insbesondere das Folienelement, aufweisen. Als Unterdruck wird ein Druck verstanden, der geringer ist als der Atmosphärendruck. Durch Anlegen von einem Unterdruck wird das
Folienelement und dem der Grundkörper an dem Trägerhalter festgehalten. Dies bedeutet, dass bei angelegtem Unterdruck der Trägerhalter und der Probenträger nicht relativ zueinander bewegt werden können. Ein weiterer Vorteil im Anlegen des Unterdrucks besteht darin, dass das
Folienelement gestrafft wird. Die Straffung ist notwendig, weil das Folienelement ansonsten aufgrund der elastischen Ausbildung gewellt ist und dadurch das Volumen der Amplifikationskammer schwankt und/oder undefiniert ist, was ein Auslesen der Amplifikationskammer erschwert. Dabei besteht ein
Bedürfnis ein möglichst dünnes Folienelement zu verwenden, um einen möglichst schnelle
Temperaturänderung in der Amplifikationskammer zu bewirken. Dabei hängt die schnelle der
Temperaturänderung von der Dicke des Folienelements ab.
Bei einer besonderen Ausführung kann die Datenverarbeitungsvorrichtung und einen Drehantrieb zum Antreiben des Trägerhalters aufweisen. Die Datenverarbeitungsvorrichtung kann mit dem
Drehantrieb datentechnisch verbunden sein. Als datentechnische Verbindung wird elektrische
Verbindung verstanden, mittels der Daten zwischen Komponenten ausgetauscht werden können.
Dabei kann die Datenverarbeitungsvorrichtung den Drehantrieb derart steuern, dass die
Rotationsvorrichtung, insbesondere wahlweise, in einem Rotationsbetrieb oder einem Auslesebetrieb betrieben wird. Dazu kann ein entsprechender Steuerbefehl von der Datenverarbeitungsvorrichtung an den Drehantrieb übermittelt werden.
Im Entlüftungsbetrieb ist die Drehzahl des Trägerhalters ausreichend hoch, dass die auf die Gasblasen und die Flüssigkeit wirkenden Kräfte ausreichend hoch sind, dass die Gasblasen radial nach innen
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Die Drehzahl der Rotationsvorrichtung im Auslesebetrieb kann geringer sein als im
Entlüftungsbetrieb. Die Datenverarbeitungsvorrichtung kann veranlassen, dass der
Entlüftungsbetrieb vor einem Auslesebetrieb durchgeführt wird. Dies bietet den Vorteil, dass sichergestellt ist, dass ein Großteil oder alle Gasblasen aus der Amplifikationskammer entfernt sind, bevor die Auslesevorrichtung die Amplifikationskammer im Auslesebetrieb optisch ausliest.
Dabei kann die Datenverarbeitungsvorrichtung veranlassen, dass die Rotationsvorrichtung zum
Betriebsbeginn in dem Entlüftungsbetrieb betrieben wird und anschließend die Rotationsvorrichtung nur im Auslesebetrieb oder Rotationsbetrieb betrieben wird. Dadurch wird ausgenutzt, dass die meisten Gasblasen beim Einfüllen der Flüssigkeit in den Probenträger entstehen und während des
Rotationsbetriebs keine oder nahezu keine Gasblasen entstehen. Insbesondere werden im
Auslesebetrieb keine Gasblasen erzeugt, weil die Temperatur der Flüssigkeit in der
Amplifikationskammer im Auslesebetrieb geringer ist als im Rotationsbetrieb.
Die Datenverarbeitungsvorrichtung kann derart konfiguriert sein, dass die Rotationsvorrichtung wahlweise im Entlüftungsbetrieb oder im Rotationsbetrieb oder im Auslesebetrieb betrieben wird.
Die Drehzahl des Probenträgers im Auslesebetrieb kann zwischen 1Hz bis 20Hz, insbesondere 2Hz bis 5Hz, betragen. Dagegen kann die Drehzahl im Rotationsbetrieb zwischen 2Hz bis 120Hz betragen.
Dabei kann eine Auslesezeit zwischen 1 Sekunde bis 6 Sekunden betragen. Als Auslesezeit wird die
Zeit verstanden, in der die Amplifikationskammer ausgelesen wird. Insbesondere kann die Auslesezeit 1 bis 2 Sekunden betragen, wenn der Probentrager mit einer Drehzahl von 5Hz gedreht wird.
Alternativ kann die Auslesezeit 4 bis 6 Sekunden betragen, wenn der Probenträger mit einer Drehzahl von 2 Hz gedreht wird.
Im Entlüftungsbetrieb kann die Drehzahl zwischen 16 Hz und 120 Hz betragen. Dabei kann die
Rotationsvorrichtung im Entlüftungsbetrieb für eine Zeitdauer von höchstens 2 Minuten, insbesondere eine Zeitdauer zwischen 1 Minute bis 2 Minuten betrieben werden. Dabei kann der
Entlüftungsbetrieb nach Einschalten der Rotationsvorrichtung zuerst durchgeführt werden.
Insbesondere kann der Entlüftungsbetrieb für eine vorgegebene Zeitdauer durchgeführt werden.
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Nach dem Entlüftungsbetrieb kann die Rotationsvorrichtung für wenigstens einen Zyklus, insbesondere für alle Zyklen, im Auslesebetrieb oder im Rotationsbetrieb betrieben werden. Dabei kann die Drehzahl des Trägerhalters im Auslesebetrieb und/oder im Rotationsbetrieb kleiner sein als im Entlüftungsbetrieb.
Bei einer besonderen Ausführung kann die die Amplifikationskammer abwechselnd aufgeheizt und abgekühlt werden. Insbesondere kann die Temperatur der Flüssigkeit in der Amplifikationskammer zyklisch zwischen mindestens zwei Temperaturen gewechselt wird. Dabei umfasst eine Zyklus die
Vielzahl der Heiz- oder Kühlvorgänge, in denen die Flüssigkeit auf die unterschiedlichen Temperaturen gebracht wird. Es können mehrere Zyklen, die jeweils das Wechseln der Flüssigkeitstemperatur auf wenigstens zwei Temperaturen aufweisen, durchgeführt werden. Die Zyklen können eine vorgegebene Zeitdauer dauern und/oder können in vorgegebenen Zeitabständen wiederholt werden.
Die einzelnen Zyklen können sich in ihrer Zeitdauer und/oder der in den Zyklen zu realisierenden
Temperaturen voneinander unterscheiden.
Der Probenträger kann drehfest mit der Rotationsvorrichtung verbunden sein. Dabei kann ein
Wärmeeintrag in die Amplifikationskammer mittels der Vorrichtung zum Heizen oder Kühlen oder ein
Wärmeaustrag aus der Amplifikationskammer mittels der Vorrichtung zum Heizen oder Kühlen durch denselben Probenträgerabschnitt, insbesondere Folienelementabschnitt, erfolgen. Dadurch wird ein einfach aufgebauter Probenträger und/oder eine einfach aufgebaute Rotationsvorrichtung ermöglicht.
Von besonderem Vorteil ist, wenn ein erfindungsgemäßer Probenträger zur Vervielfältigung von DNA und/oder Bestimmung von Nukleinsäuren verwendet wird.
In den Figuren ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt, wobei gleiche oder gleichwirkende Elemente zumeist mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigt:
Fig. 1 eine Darstellung eines Grundkôrpers mit Amplifikationskammern eines erfindungsgemäßen
Probentragers.
Fig. 2 eine Explosionsdarstellung eines erfindungsgemalien Probentragers.
Fig. 3 eine Draufsicht auf einen drehbaren Tragerhalter einer Rotationsvorrichtung.
Fig. 4 eine Seitenansicht des Tragerhalters.
Fig. 5 eine Draufsicht des Tragerhalters auf dem der Grundkörper des erfindungsgemäBen
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Probenträgers angebracht ist.
Fig. 6 eine Draufsicht des Tragerhalters auf dem der erfindungsgemäße Probentrager angebracht ist.
Fig. 7 eine Seitenschnittansicht auf einen Abschnitt des Probentragers gemäß einer ersten
Ausführung mit einer Amplifikationskammer.
Fig. 8 eine Seitenschnittansicht auf einen Abschnitt des Probentragers gemäß einer zweiten
Ausführung mit einer Amplifikationskammer.
Fig.9 eine Seitenschnittansicht auf einen Abschnitt des Probentragers gemäß einer dritten
Ausführung mit einer Amplifikationskammer.
Fig. 10aeine Schnittansicht von oben auf einen Grundkôrperabschnitt zu einem Zustand, bei dem sich der Tragerhalter nicht dreht.
Fig. 10beine Schnittansicht von oben auf einen Grundkôrperabschnitt zu einem Zustand, bei dem sich der Tragerhalter dreht.
Fig. 11 eine schematische Darstellung der Rotationsvorrichtung.
Fig 1 zeigt eine vereinfachte Darstellung eines Grundkdrpers 2 eines in Figur 2 dargestellten
Probenträger 1, der in einem rotationsbasierten Verfahren zur Vervielfältigung von DNA und/oder
Bestimmung, insbesondere zur Detektion und/oder Quantifizierung, von Nukleinsäuren verwendet wird. Bei dem in Figur 1 dargestellten Grundträger 2 sind im Vergleich zu dem in Figur 2 gezeigten
Grundkörper 2 eine Vielzahl von in dem Grundkörper 2 ausgebildeten Kanälen und/oder Kammern weggelassen. So sind in Figur 1 lediglich mehrere Amplifikationskammern 3 beispielhaft dargestellt, die im Grundkörper 3 ausgebildet sind. Insbesondere sind zwei Voramplifikationskammern 3b und fünf Hauptamplifikationskammern 3a dargestellt. Es sind jedoch Probenträger 1 denkbar, die eine unterschiedliche Anzahl von Voramplifikationskammern 3b und Hauptamplifikationskammern 3a aufweisen. Der Grundkörper 2 ist scheibenfôrmig und kreissegmentfôrmig ausgebildet.
Die Amplifikationskammer 3, insbesondere die Hauptamplifikationskammer 3a weist eine Dicke d von kleiner als 1mm (Millimeter), insbesondere in einem Bereich zwischen 10um (Mikrometer) und 0,9 mm, vorzugsweise zwischen 10um und 0,5mm, auf. Die Hauptamplifikationskammern 3a und die
Voramplifikationskammern 3b sind fluidisch miteinander verbunden. Die Amplifikationskammern 3 sind Bestandteil einer in Figur 2 dargestellten mikrofluidischen Kanal- und Kammerstruktur.
Fig. 2 zeigt eine Explosionsdarstellung eines erfindungsgemäßen Probenträgers 1. Die Kanal- und
Kammerstruktur 8, die in dem Grundkörper 2 ausgebildet ist, weist eine Vielzahl von Kanälen und
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Kammern auf, die untereinander fluidisch verbunden sind. Im in Figur 2 dargestellten Zustand ist eine
Seite der Kanal- und Kammerstruktur 8 offen ausgeführt.
Der Probentrager 1 weist ein Folienelement 6 auf, mittels dem die offene Seite der Kanal- und
Kammerstruktur 4 verdeckt wird. Das Folienelement 6 fungiert als Boden für die im Grundkörper 2 offen ausgebildeten Kanäle und Kammern, wenn der Probenträger 1 auf dem in Fig. 3 dargestellten
Trägerhalter 10 angeordnet ist. Dabei wird das Folienelement 6 auf eine Grundkôrperseite direkt angebracht. So wird das Folienelement 6 auf den Grundkörper 2 heifsgesiegelt. Wie nachfolgend näher ausgeführt ist, wird über das Folienelement 6 Wärme in die Kanal- und Kammerstruktur 4 eingebracht oder aus dieser abgeführt.
Der Grundkörper 2 weist an seiner Sehnenseite einen vom Grundkörper 2 in radialer Richtung vorstehenden Zugangsabschnitt 17 einer in Figur 5 dargestellten Zugangsleitung 32 auf, die mit der
Kanal- und Kammerstruktur 4 fluidisch verbunden ist. Eine Probe, insbesondere biologische Probe kann in die Zugangsleitung eingebracht und von dort in einzelnen Kammern des Probenträgers prozessiert werden. Der Zugangsabschnitt 17 ist reversibel mittels einer Kapsel 31 verschlieBbar, um die Einbringung der Probe und ein nachfolgendes WiederverschlieBen zu ermöglichen. Der
Zugangsabschnitt 17 und die Zugangsleitung 32 sind derart ausgebildet, dass ein in den Figuren nicht dargestellter Tupfer, an dem sich die zu prozessierende Probe befindet, in die Zugangsleitung eingebracht werden kann.
Der Probenträger 1 enthält in einem Anfangszustand, d.h. in einem Zustand, in dem noch keine Probe in den Zugang 10 eingebracht ist, mehrere vorgelagerte Flüssigreagenzien in diversen Kammern.
Darüber hinaus sind Primer in den Voramplifikationskammern 3b vorgelagert. Weitere Primer und
Sonden, die in der Form von Poly- oder Oligonukleotiden vorliegen, sind den
Hauptamplifikationskammern 3a vorgelagert. Die Primerpaare in den Voramplifikationskammern 3b sind, je nach konkretem Ziel des Analyseverfahrens und/oder des spezifischen Ablaufs, identisch oder unterschiedlich. So sind die Primer in den Hauptampflikationskammern 3a zu den Primern in den
Voramplifikationskammern 3b paarweise identisch oder beispielswiese für eine im Stand der Technik bekannte ,nested PCR" (,verschachtelte” oder ,geschachtelte” PCR) vorgesehen und somit unterschiedlich ausgeführt.
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In weiteren Kammern sind Lyophilisate vorgelagert, die beispielsweise Enzyme, Polymerase, dNTPs {desoxyNukleosidTriPhosphate), Salze und/oder weitere vorgelagerte Reagenzien {z. B. PCR-Additive,
Nuklease Inhibitoren, Co-Faktoren der beteiligten Enzyme etc.) enthalten. In der Zugangsieitung kann eine Lyse und Mittel zur Prozesskontroile, z.B. Sporen, Pilze, Phagen oder künstlich hergestellte
Targets enthalten sein. Eine mit der Zugangsleitung in Verbindung stehende Lysekammer enthält ein
Lysepellet sowie einen Magneten und ein Mahimedium. Bei letzterem handelt es sich z.B. um Glas- und/oder Zirkoniapartikel.
Der Probenkôper 1 weist außerdem einen Abdeckkèôrper 18 auf, der an dessen Rand an die von dem
Folienelement 6 abgewandte Seite des Grundkôrpers 1 angebracht wird. Der Abdeckkôrper 18 liegt mit Ausnahme des Randes nicht direkt an dem Grundkôrper 2 an, sondern es befindet sich eine
Luftschicht zwischen dem Abdeckkôrper 18 und dem Grundkörper 2. Dies ist in den Figuren 7 bis 9 ersichtlich. Dabei kann der Abdeckkôrper 18 mittels Rasthakens in korrespondierende Aussparrungen 19 des Grundkôrpers 2 an diesem fixiert werden. Der Abdeckkôrper 18 weist ein Auslesefenster 20 auf. Das Auslesefenster 20 ist transparent und derart angeordnet, dass der Inhalt der
Hauptamplifikationskammern 3a durch das Auslesefenster 20 ausgelesen werden kann. Darüber hinaus weist der Abdeckkôrper 18 eine Ausnehmung 21 auf, die zum Aufnehmen der an dem
Grundkôrper 2 angebrachten Zugangsleitung dient.
Der Grundkörper 2 weist mehrere Durchbrüche 22 auf, die zur eindeutigen Ausrichtung und
Positionierung des Probenträgers auf einem in Figur 3 dargestellten Trägerhalter 10 der
Rotationsvorrichtung 9 dienen. In diese Durchbrüche 22 greifen zur Positionierung und Fixierung in einer Drehebene, die parallel zur Oberfläche des Trägerhalters 10 liegt, Positionsstifte 23 des
Trägerhalters 10 ein.
Fig. 3 zeigt eine Draufsicht auf einen drehbaren Trägerhalter 10 und Fig. 4 zeigt eine Seitenansicht des
Trägerhalters 10. Der Trägerhalter 10 ist kreisférmig ausgebildet und dient zur Drehung des
Probenträgers 1 um eine Rotationsachse R. Die Rotationsachse R steht senkrecht auf den scheibenfôrmig ausgebildeten Grundkörper 2. Der Trägerhalter 10 ist derart ausgebildet, dass er zwei in Figur 1 und 2 dargestellte Grundkörper 2 tragen kann.
Der Tragerhalter 10 weist mehrere Heizabschnitte 30 auf. Dabei ist eine Vorrichtung 12 zum Heizen oder Kühlen des Probentragers 1 entlang der Rotationsachse R gesehen unterhalb des Heizabschnitts 30 angeordnet, was in den Figuren 6 und 7 gezeigt ist. Die Vorrichtungen 12 können jeweils ein
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Peltierelement oder Widerstandsheizplatten sein. Die Heizabschnitte 30 sind versetzt zueinander angeordnet und kônnen als Platten ausgeführt sein, die die Vorrichtung 12 bedecken. Darüber hinaus weist der Trägerhalter 10 einen Trägerboden 32 auf. Die Heizabschnitte 30 und Vorrichtungen 12 sind in Aussparrungen des Trägerbodens 32 angeordnet.
Darüber hinaus weist der Trägerhalter 10 eine Dichtung 24 auf, die eine oder mehrere der
Heizabschnitte 30 vollständig umschließt. In den Dichtungen 24 sind jeweils mehrere nicht dargestellte Bohrungen vorhanden, die entlang der Dichtung 24 versetzt zueinander angeordnet sind.
Zum Fixieren des Probenträgers 1 auf dem Trägerhalter 10 kann mittels einer in Figur 10 dargestellten
Unterdruckeinrichtung 13 ein Unterdruck an die Bohrungen angelegt werden. Im fixierten Zustand liegt der Probentrager 1, insbesondere das Folienelement 6, an den Dichtungen 24 an.
Fig. 5 zeigt eine Draufsicht des Trägerhalters 10 auf dem der Grundkörper 2 des erfindungsgemalien
Probenträgers 1 angebracht ist. Dabei ist ein Tupfer mit der zu prozessierenden Probe in der
Zugangsleitung 32 angeordnet. Der Grundkörper 2 liegt auf dem Trägerhalter 10 auf und ist drehfest mit dem Trägerhalter 10 verbunden. Wie aus Figur 5 ersichtlich ist, bedeckt der Grundkörper 2 nur die Hälfte des Trägerhalters 10. Ein weiterer in den Figuren nicht dargestellter anderer Grundkôrper 2 kann auf den verbleibenden Abschnitt des Trägerhalters 10 angeordnet werden. Bei der in Figur 5 dargestellten Ausführung ist der Probentrager 1 ohne Abdeckkôrper 18 dargestellt. Dagegen ist in
Figur 6 der Probenträger 1 mit Abdeckkôrper 18 dargestellt.
Fig. 7 zeigt eine Seitenschnittansicht auf eine Amplifikationskammer 3 gemäß einer ersten
Ausführung. Insbesondere zeigt Figur 7 eine Seitenschnittansicht eines Abschnitts eines
Grundkôrpers 2, in dem die Amplifikationskammer 3 angeordnet ist und eines Teils des Trägerhalters 10, insbesondere des Heizabschnitts 30 und der Vorrichtung 12. Die Amplifikationskammer 3 ist im vorliegenden Ausfuhrungsbeispiel die Hauptamplifikationskammer 3a. Dabei ist die
Hauptamplifikationskammer 3a im dargestellten Beispiel nur teilweise mit Flüssigkeit 33 gefüllt. Dabei ist in Figur 7 eine Grenzfläche 35 zwischen einem Luftabschnitt und einem Flüssigkeitsabschnitt in der
Amplifikationskammer 3 eingezeichnet. In einem nicht dargestellten Ausführungsbeispiel kann die
Amplifikationskammer 3 zusätzlich oder alternativ die Voramplifikationskammer 3b sein.
Aus Figur 7 ist ersichtlich, dass das Folienelement 6 auf dem Trägerhalter 10 aufliegt. Der Trägerhalter 10 weist die Vorrichtung 12 zum Heizen oder Kühlen des Probenträgers 1 auf, die unterhalb des
Heizabschnitts 30 angeordnet ist. Durch die Vorrichtung 12 kann die in der Amplifikationskammer 3
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Die Amplifikationskammer 3 weist eine Dicke d auf. Dabei wird die Amplifikationskammer 3 durch das
Folienelement 6 und durch Wände des Grundkôrpers 2 begrenzt. Die Rotationsvorrichtung 9 weist außerdem eine Auslesevorrichtung 11 auf, die entlang der Rotationsachse R oberhalb der
Amplifikationskammer 3 angeordnet ist. Die Auslesevorrichtung 11 kann die Amplifikationskammer 3 optisch auslesen und somit Nukleinsäuren, insbesondere DNA, in der Amplifikationskammer 3 bestimmen. Eine mit der Auslesevorrichtung 11 datentechnisch verbunden
Datenverarbeitungsvorrichtung 14 kann auf der Basis der empfangenen Daten bestimmen, wie sich die DNA in der Amplifikationskammer 3 vervielfältigt hat.
Der Trägerhalter 10 weist einen Temperatursensor 26 auf. Der Temperatursensor 26 misst die
Temperatur des Heizabschnitts 30. Da das Folienelement 6 dünn ist, weist die Temperatur der
Flüssigkeit innerhalb der Amplifikationskammer 3 nahezu die gleiche Temperatur auf wie der
Heizabschnitt 30.
In Figur 7 ist eine Grundfläche der Amplifikationskammer 29 eingezeichnet, mittels der Wärme von dem Folienelement 6 in die Amplifikationskammer 3 eingebracht wird. Die Grundfläche der
Amplifikationskammer 3 entspricht einer Bodenfläche der Amplifikationskammer 3. In Figur 7 benetzt die Flüssigkeit 33 nur einen Teil der Grundfläche der Amplifikationskammer 29, wobei der durch die
Flüssigkeit benetzte Teil der Grundfläche im folgenden als beheizte Grundfläche 34 bezeichnet wird.
Eine mittlere Dicke der Amplifikationskammer 3 entspricht dem Quotienten des Volumens der in der
Amplifikationskammer 3 befindlichen Flüssigkeit 33 geteilt durch die beheizte Grundfläche 34, also den Teil der Bodenflache der Amplifikationskammer 3, der mit Flüssigkeit 33 benetzt ist. Dabei ist vorteilhaft, dass die mittlere Dicke der Amplifikationskammer 3 kleiner als 1mm, insbesondere zwischen 10 um und 0,9 mm, ist.
Fig. 8 zeigt eine Seitenschnittansicht auf eine Amplifikationskammer 3 gemäß einer zweiten
Ausführung. Die zweite Ausführung unterscheidet sich von der in Figur 7 dargestellten Ausführung in der Ausbildung der Amplifikationskammer 3. Die in Figur 8 dargestellte Amplifikationskammer 3 weist zwei Abschnitte mit unterschiedlichen Dicken auf. So weist die Amplifikationskammer 3 einen
Ausleseabschnitt 4 auf, der von der Auslesevorrichtung 11 im Auslesebetrieb der
Rotationsvorrichtung 9 ausgelesen wird. Darüber hinaus weist die Amplifikationskammer 3 einen
Restabschnitt 5 auf, der von der Auslesevorrichtung 11 nicht ausgelesen wird. Der Ausleseabschnitt 4
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LU504853 ist dicker als der Restabschnitt 5. Dabei ist der Restabschnitt 5 in radialer Richtung gesehen näher zu einer in Figur 8 nicht dargestellten Rotationsachse angeordnet als der Ausleseabschnitt 4.
Der Ausleseabschnitt 5 kann dicker sein als der Restabschnitt 4 der Amplifikationskammer 3. Der
Ausleseabschnitt 5 kann eine Dicke von wenigstens 1 mm aufweisen. Um die Vorteile der Erfindung zu erhalten, sollte die mittlere Dicke des Ausleseabschnitts kleiner als 1mm, idealerweise zwischen pm und 0,9 mm, betragen. Der Ausleseabschnitt 5 ist am Rand der Amplifikationskammer 4 gezeichnet, kann sich aber in Ausführungen an einer beliebigen Stelle innerhalb der
Amplifikationskammer 3 befinden. 10
Fig. 9 zeigt eine Seitenschnittansicht auf einen Abschnitt des Probentragers gemäß einer dritten
Ausführung mit einer Amplifikationskammer 3. Die dritte Ausführung unterscheidet sich von der in
Figur 8 gezeigten zweiten Ausführung in der Ausbildung der Amplifikationskammer 3. So wird der
Restabschnitt 5 mittels einer Schräge 36 in den Ausleseabschnitt 4 überführt.
Fig. 10a zeigt eine Schnittansicht von oben auf einen Abschnitt des Grundkèrpers 2, in dem die
Amplifikationskammer 3 ausgebildet ist, zu einem Zustand, bei dem sich der Trägerhalter 10 nicht dreht. Der Tragerhalter 10 ist in Figur 10a nicht dargestellt. In dem dargestellten Zustand sind
Gasblasen 27 in der Amplifikationskammer 3 angeordnet. Darüber hinaus ist in der
Amplifikationskammer 3 Flüssigkeit angeordnet, wobei, die Amplifikationskammer 3 nur teilweise mit
Flüssigkeit befüllt. Insbesondere ist die Amplifikationskammer 3 zu 90% mit Flüssigkeit befüllt.
Fig. 10b zeigt eine Schnittansicht von oben auf den in Fig. 10a gezeigten Grundkôrperabschnitt zu einem Zustand, bei dem sich der nicht dargestellte Trägerhalter 10 dreht. Insbesondere wird die
Rotationsvorrichtung 9 in einem Entlüftungsbetrieb betrieben. In dem Entlüftungsbetrieb dreht sich der Tragerhalter 10 um die Rotationsachse R und wird der Tragerhalter 10 mit einer Drehzahl betrieben, bei der die auf die Flüssigkeit und die Gasblasen wirkenden Kräfte dazu führen, dass die
Gasblasen nach radial innen verdrängt werden. Die auf die Flüssigkeit und die Gasblasen
Kraftrichtung Z ist in Figur 10b eingezeichnet. Die Gasblasen können durch einen Einlass 28 aus der
Amplifikationsxammer 3 geführt werden. Der Einlass 28 dient außerdem zum Einbringen von
Flüssigkeit in die Amplifikationskammer 3.
Fig. 11 zeigt eine schematische Darstellung der Rotationsvorrichtung 9. Die Rotationsvorrichtung 9 weist einen Drehantrieb 16 zum Antreiben der Tragerhalter 10 auf. Der Drehantrieb 16 ist
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LU504853 triebtechnisch mit dem Trägerhalter 10 gekoppelt und/oder weist einen nicht dargestellten
Antriebsmotor auf. Der Probentrager 1 ist auf dem Tragerhalter 10 angeordnet. Die
Auslesevorrichtung 11 ist entlang der Rotationsachse R gesehen oberhalb vom Probenträger 1 angeordnet.
Die Rotationsvorrichtung 9 weist auBerdem die Datenverarbeitungsvorrichtung 14 auf. Die
Datenverarbeitungsvorrichtung 14 ist datentechnisch mit der Auslesevorrichtung 11, einer
Unterdruckvorrichtung 13 und dem Drehantrieb 16 verbunden. Die Datenverarbeitungsvorrichtung 14 kann Steuerbefehle an den Drehantrieb 16 übermitteln, damit die Rotationsvorrichtung 9 im
Rotationsbetrieb oder im Auslesebetrieb betrieben wird.
Die Unterdruckvorrichtung 13 kann eine Pumpe sein, die einen Unterdruck in den Bohrungen bewirkt, um den Probenträger 1 an dem Trägerhalter 10 fixieren. Die datentechnische Verbindung ist in Figur 11 gestrichelt dargestellt. Die Rotationsvorrichtung 9 weist ein Gehäuse 15 auf, das einen Innenraum umschließt. Die oben genannten Komponenten sind innerhalb des Gehäuses 15 angeordnet.
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Bezugszeichenliste 1 Probenträger 2 Grundkörper 3 Amplifikationskammer 3a Hauptamplifikationskammer 3b Voramplifikationskammer 4 Ausleseabschnitt 5 Restabschnitt 6 Folienelement 8 Kanal- und Kammerstruktur 9 Rotationsvorrichtung 10 Trägerhalter 11 Auslesevorrichtung 12 Vorrichtung zum Heizen oder Kühlen 13 Unterdruckeinrichtung 14 Datenverarbeitungsvorrichtung 15 Gehäuse 16 Drehantrieb 17 Zugangsabschnitt 18 Abdeckkôrper 19 Aussparung 20 Auslesefenster 21 Ausnehmung 22 Durchbruch 23 Positionsstift 24 Dichtung 26 Temperatursensor 27 Gasblasen 28 Einlass 29 Probenträgerabschnitt 30 Heizabschnitt 31 Kapsel 32 Trägerboden 33 Flüssigkeit 34 Boden der Amplifikationskammer 35 Grenzflache 36 Schrage
R Rotationsachse
Z Kraftrichtung

Claims (25)

020A0001LU 03.08.2023 23 LU504853 Patentansprüche
1. Probenträger (1) zum Verwenden in einem rotationsbasierten Verfahren zur Vervielfältigung von DNA und/oder Bestimmung von Nukleinsäuren, mit einem Grundkörper (2) und wenigstens einer in dem Grundkörper (3) ausgebildeten Amplifikationskammer (3), dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationskammer (3) eine Dicke (d) von kleiner als 1 mm, insbesondere in einem Bereich zwischen 10um und 0,9mm, vorzugsweise zwischen 10 pm und 0,5 mm, aufweist.
2. Probenträger (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass a. die wenigstens eine Amplifikationskammer (3) Abschnitte mit unterschiedlichen Dicken aufweist oder dass b. die wenigstens eine Amplifikationskammer (3) zwei Abschnitte mit unterschiedlichen Dicken aufweist, wobei der tiefere der beiden Abschnitte durch eine Auslesevorrichtung (11) auslesbar ist.
3. Probentrager (1) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass a. ein Ausleseabschnitt (4) der wenigstens einen Amplifikationskammer (3) eine Dicke (d) von wenigstens 1 mm, insbesondere in einem Bereich zwischen 1 mm bis 2 mm, aufweist und/oder ein Restabschnitt der Amplifikationskammer (3) eine Dicke von kleiner als 1 mm, insbesondere in einem Bereich zwischen 10 um und 0,9 mm, vorzugsweise zwischen 10 um und 0,5 mm, aufweist und/oder dass b. die Dicke (d) eine mittlere Dicke der Amplifikationskammer (3) ist.
4, Probentrager (1) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Ausleseabschnitt (4) wenigstens 10% der Amplifikationskammer (3), insbesondere einen Bereich zwischen 10-50% der Amplifikationskammer (3), aufweist.
5. Probentrager nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Amplifikationskammer, insbesondere Hauptamplifikationskammer, in radialer Richtung in einem Bereich zwischen 1 mm und 10 mm, insbesondere 5 mm, erstreckt und/oder in azimuthaler Richtung in einem Bereich zwischen 1 mm und 6 mm, insbesondere 4 mm, erstreckt.
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6. Probenträger (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikationskammer (3) eine Hauptamplifikationskammer (3a) oder eine Voramplifikationskammer (3b) ist.
7. Probenträger (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass a. der Grundkörper (2) scheibenférmig und/oder kreissegmentformig ausgebildet ist und/oder dass b. eine mikrofluidische Kanal- und/oder Kammerstruktur im Grundkörper (2) vorhanden ist.
8. Probenträger (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenträger (1) ein Folienelement (6) aufweist, das an dem Grundkörper (2) angebracht ist und/oder einen Boden der Amplifikationskammer (3) bildet.
9. Probenträger nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Grundkôrper (2) einen Einlass (28) zum Einlassen von Flüssigkeit in die Amplifikationskammer (3) aufweist, wobei eine in der Amplifikationskammer (3) befindliche Gasblase (27) durch den Einlass (28) aus der Amplifikationskammer (3) ausbringbar ist.
10. Rotationsvorrichtung (9) mit wenigstens einem Probenträger (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und einem drehbaren Trägerhalter (10), der den Probenträger (1) hält.
11. Rotationsvorrichtung (9) nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Rotationsvorrichtung (9) eine Auslesevorrichtung (11) zum Auslesen der Amplifikationskammer (3), insbesondere des Ausleseabschnitts (4), aufweist.
12. Rotationsvorrichtung (9) nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Auslesevorrichtung (11) und/oder der Probenträger (1) derart ausgebildet ist, dass die Amplifikationskammer (3) in einem Auslesebetrieb der Rotationsvorrichtung (9) auslesbar ist.
13. Rotationsvorrichtung (9) nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Rotationsvorrichtung (9) eine Vorrichtung (12) zum Heizen oder Kühlen der Amplifikationskammer (3) aufweist.
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03.08.2023 25 LU504853
14. Rotationsvorrichtung (9) nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Rotationsvorrichtung (9) eine Unterdruckeinrichtung (13) zum Anlegen eines Unterdrucks auf den Probenträger (1), insbesondere das Folienelement (6), aufweist.
15. Rotationsvorrichtung (9) nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Rotationsvorrichtung (9) eine Datenverarbeitungsvorrichtung (14) aufweist, die mit der Auslesevorrichtung (11) und/oder einem Drehantrieb (16) für den Tragerhalter (10) datentechnisch verbunden ist.
16. Rotationsvorrichtung (9) nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Datenverarbeitungsvorrichtung (14) veranlasst, dass die Rotationsvorrichtung (9) in einem Auslesebetrieb oder einen Entlüftungsbetrieb betrieben wird, wobei die Drehzahl des Trägerhalters (10) im Auslesebetrieb geringer ist als im Entlüftungsbetrieb.
17. Rotationsvorrichtung (9) nach Anspruch 10 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Datenverarbeitungsvorrichtung (14) veranlasst, dass ein Entlüftungsbetrieb vor einem Auslesebetrieb durchgeführt wird.
18. Rotationsvorrichtung (9) nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Drehzahl des Trägerhalters (10) im Auslesebetrieb zwischen 1 Hz bis 6 Hz, insbesondere 2 Hz bis 5 Hz, beträgt und/oder dass b. die Drehzahl des Trägerhalters (10) im Entlüftungsbetrieb zwischen 16 Hz bis 120 Hz beträgt.
19. Rotationsvorrichtung (9) nach einem der Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auslesezeit zwischen 1 Sekunde bis 6 Sekunden beträgt.
20. Rotationsvorrichtung (9) nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenträger (1) drehfest mit dem Trägerhalter (10) verbunden ist, wobei ein Wärmeeintrag in die Amplifikationskammer (3) mittels der Vorrichtung (12) zum Heizen oder Kühlen oder ein Wärmeaustrag aus der Amplifikationskammer (3) mittels der Vorrichtung (12) zum Heizen oder Kühlen durch denselben Probenträgerabschnitt (29), insbesondere Folienelementabschnitt, erfolgt.
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03.08.2023 26 LU504853
21. Verfahren zum Betreiben einer Rotationsvorrichtung (9), insbesondere nach einem der Ansprüche 10 bis 20, mit einem Trägerhalter (10), der wenigstens einen Probenträger (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 9 trägt, wobei die Rotationsvorrichtung (9) in einem Auslesebetrieb oder einen Entlüftungsbetrieb betrieben wird, wobei die Drehzahl der Rotationsvorrichtung (9) im Auslesebetrieb geringer ist als im Entlüftungsbetrieb.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Rotationsbetrieb vor dem Auslesebetrieb durchgeführt wird.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet dass a. die Drehzahl des Probenträgers (1) im Auslesebetrieb zwischen 1 Hz bis 6 Hz beträgt und/oder dass b. die Drehzahl des Probenträgers (1) im Rotationsbetrieb zwischen 16 Hz bis 120 Hz beträgt.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Amplifikationskammer (3) abwechselnd aufgeheizt und abgekühlt wird und/oder dass b. die Temperatur der Amplifikationskammer (3) zyklisch zwischen wenigstens zwei Temperaturen gewechselt wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass eine Voramplifikation der Nukleinsäure in einer Voramplifikationskammer (3b) durchgeführt wird, bevor die Nukleinsäure in der Hauptamplifikationskammer (3a) amplifiziert wird.
25. Verwendung eines Probenträger (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Vervielfältigung von DNA und/oder Bestimmung von Nukleinsäuren.
LU504853A 2023-08-03 2023-08-03 Probenträger zum Verwenden in einem rotationsbasierten Verfahren zur Vervielfältigung von DNA und/oder Bestimmung von Nukleinsäuren LU504853B1 (de)

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