LT3083B

LT3083B - Novel fungal strains and use thereof in antibiotic production

Info

Publication number: LT3083B
Application number: LTIP328A
Authority: LT
Inventors: Jagroop S Dahiya
Original assignee: Novopharm Ltd
Priority date: 1992-02-10
Filing date: 1993-02-04
Publication date: 1994-11-25
Also published as: CA2062023A1; MX9300694A; ZA93879B; US5362638A; TW239137B; KR930018021A; LTIP328A

Description

Lovastatinas yra /IS- [Ια(R*), 3α,7β,8β (2S*, 4S*), 8 a β] /-2-metilbutaninės rūgšties 1,2,3,7,8,Sa-heksahidro3, 7--dimetil-8-[ 2- (tetrahidro-4-hidroksi-6~okso-2Hpiran-2-il)-etil] -I-naftalenilo esteris, o jo struktūra gali būti pavaizduota šia chemine formule:

Lovastatino tipo antibiotikai yra metabolitai, kurių sintezei reikia kelių fermentų grupių. Jų gamyba antibiotikus' gaminančių mikroorganizmų molekulinio klonavimo būdu reikalauja tiems fermentams atitinkamų genų išskyrimo, analizės ir, galbūt, modifikacijos.

. i)

Bandymai išskirti tokius genus iš grybelinių rūšių kol kas davė klonus, turinčius arba atskirus grupės genus arba tik nepilnas genų grupes (žr. Malpartida' and Hopvrood, Molecular Cloning of the Whole Biosynthetic Pathvay of a Streptomyses Antibiotic and ’its Expression in a Heterologous Host, Nature {1934, 309 pp 462-464)..

Lovastatino .gavimas fermentacijos būdu, ' naudojant Monascus ruber grybelinės rūšies .kamienus aprašomas .^,T ?...... ;..·ι·· .' · v > ,·'/ -/7./7

Kanados patente Nr. 1129794 , /

Lovastatino gavimas terreus fermentacijos būdu, .inės rūšies aprašomas kitame Kanados patente Nr. 1161380.

naudojant kamienus,

Tačiau, abiejų procesų methi.^;/;-ioyąstąt.inės::,.'yiaL' gaunamas kartu su cheminių išskirti.

dideliais junginių,

Naudojant kiekiais kitų, labai panašių iš kurių lovastatiną reikia

Monascus ruber, lovastatinas gaunamas kartu su monakolinu J. Naudojant Aspergillus 10 ’ terreus, jis gaunamas kartu su dihidrolovastatinu ir hidroksi^rūgštimi. Hidroksi-rūgštis gali būti lengvai laktonizuojama į lovastatiną, tačiau nuo jo reikia atskirti dihidrolovastatiną.

Šio išradimo tikslas, yra pateikti genetiškai sukurtus .mutantinus- grybelinius kamienus, kuriuos galima būtų panaudoti lovastatino gamyboje fermentacijos būdu, ir pateikti lovastatino gavimą fermentacijos būdu, pašalinant aukščiau minėtus trūkumus.

· .

^; t·;. .,/'· ' ·· ·,· -.v. . 7.7.7 ¢-..- ·.<·. ,7; 7//· /^!; y

Pagal vieną iš šio išradimo, krypčių yra gaunami Aspergillus geno atitinkamų, rūšių nauji mutantiniai grybeliniai kamienai, galinantys išreikšti ir išskirti lovastatiną. „ Tie kamienai turi funkcionaliniame sąryšyje lovastatiną gaminančių fermentų'^-grupės genus, išvestus iš lovastatiną gaminančio Aspergillus terreus kamienų DNR. Jie yra gaminami DNR protoplasto transformacijos procese iš lovastatiną duodančio

Aspergillus terreus kamieno, . taip pat turinčio atitinkamą atrinkimo žymę, su kita, lovastatino neduodančia Aspergillus rūšimi, parinkta iš A,oryzaĄ, , A..fumigatus, 'A.niger, A.nidulans ir A.f1avus. Transformantų atranka, vykdoma pagal atrinkimo^ žymę; lovastatiną duodantys transformantai yra identifikųojaroi įr/išskiriami,o po to/sųbklonuojami.

'20

. ..../y/-. /S/'/,...../.,. Pagal//kitą išradimo kryptį yfa pateikiamas lovastat ino gavimo būdas. Jis apima maitinimo terpės fermentavimą su Aspergillus mikroorganizmo transformantu, turinčių iš Aspergillus terreus / Išvestų genų, užkodavimą lovastatiną gaminančių fermentų/ grupei bei taip gaunamo .· ' .R.'··· ^: \·, lovastatino išskyrimą. Pagal, šį išradimą yra gaunamas lovastątinas su žymiai //mažesniais kiekiais teršalų iš dihidrolovastatino ir hidroksirūgšties darinių, negu naudojant Aspergillus terreus.

Šio išradimo transformantu gamybos procese galima naudoti įprastas metodikas gauti protoplastus iš atrinkto_z lovastatino negaminančio, Aspergillus kamieno bei įprastas metodikas išgauti DNR iš lovastatiną gaminančio Aspergillus terreus kamieno. Šios metodikos yra gerai žinomos patyrusiems specialistams ir čia jų nereikia detaliai . aptarinėti. Protoplasto transformacijos metodika bei procedūros . taip pat yra žinomos ir standartinės. ·

Iš lovastatino negaminančių Aspergillus kamienų dažniausiai. pasirenkamas Aspergillus oryzae kamienas, tačiau tai nėra būtina sąlyga tam, kad šio išradimo panaudojimas būtų sėkmingas. Galima naudoti ir kitas Aspergillus rūšis, būtent A.niger, A.nidulans, A. fumigatus ir A.flavus. Pirmenybė A.oryzae rūšiai teikiama dėl jos inertiškumo, su ja lengva ir saugu dirbti laboratorijoje bei gaminant fermentacijos komerciniu mastu.

Kad po protoplasto transformacijos proceso būtų galima atskirti mikroorganizmų transformantus .. nuo netransformantų, rėkia, kad DNR iš A.terreus turėtų atrinkimo žymę. Patyręs darbuotojas turi didelį atrinkimo žymių pasirinkimą ir .konkretus parinkimas nėra lemiamas faktorius tam, kad išradimas veiktų sėkmingai. Galima naudoti atsparumo antibiotikams žymes, kaip antai,

.. · - 411.'ampicilinui, ripamficinui, streptomicinui ir 1.1. Gautą transformantų ir netransformantų mišinį galima kultūrinti terpėje su atitinkamu antiobiotiku taip/ kad išskyrimui išliktų tik tie transformantai, kurie turi atrinkimo žymę.

Patogumo dėlei atrinkimo žyme ypač dažnai pasirenkamas atsparumas cikloheksimiduį, Cikloheksimidas slopina proteino sintezę, todėl yra lengva aptikti., ar kultūros 'sultinyje yra cikloheksimidui atsparus kamienas arba transformantas.

Po transformantų atrankos pagal atrinkimo žymę,tiriama, kurie transformantai. gali išreikšti ir išskirti lovastatiną. Tik sąlyginai mažas skaičius iš visų transformantų, pagamintų protoplasto transformacijos būdu, turi šią savybę. Jie ‘ atpažįstami atskirai auginant standartinės kultūros sultinyje ir tiriant, pvz., chromatografijos (ASSC) pagalba, . ar gautoje terpėje yra lovasbatino. Tie, kurie davė teigiamą '-j·. 1/./ '1;./' / ·.,·.//’· / · j, ·' <ll'l1/1,'·- ‘·’Υΐ·Υ ’· 1 /1,:. · y- ,,. /· · »> · 1··1 b / ·'.·. ·· · 1i- - _; :

lovastatino buvimo rezultatą, yra subkultūrinami ir auginami, kad duotų lovastatiną gaminančių grybelinių mikroorganizmų Aspergillus geno ir, · pageidautina, Aspergillus oryzae rūšies transformantų kolonijas.

Dėl iliustracijos, išradimas yra toliau aprašomas eksperimentų ataskaitose, pateikiamose žemiau.

Fig. 1 grafiškai vaizduoja nesubrendusių grybelinių . ekstraktų, pagamintų pagal žemiau aprašytus Pavyzdžio 1 eksperimentus, čhromato-graf inę (ASS,C) analizę;

Fig. 2 - yra lovastatino mišinio, gauto ir išgryninto iš hidrido kamieno, ^-BMR spektras;

Fig. 3 - yra to· paties mi š in i o bendras spe kt ras;

3083Β

Fig. 4 - vaizduoja naujo transformanto' AoAt/NBJ-V morfologines charakteristikas;

PAVYZDYS 1

MEDŽIAGOS IR METODAI

GRYBELINĖ KULTŪRA - grybeliniai izoliatai Aspergilus terreus ir A.oryzae, naudojami šiame darbe, išskirti iš orchidėjų dirvožemio pavyzdžių, parinktų iš Agriculttfre ' Canada, Research Station, Beaverlodge, Alberta, Canada.

CIKLOHĖKSIMIDUI ATSPARIŲ MUTANTŲ PARINKIMAS

Paauginus abu Aspergil.li izoliatus Czapek doks terpėje,· turinčioje cikloheksimido- (kone. '0,1-5 mM), 6 dienas

28±2°C temperatūroje, kiekvieno izoliato. A.terreus ir A.oryzae sporos (10⁸) buvo pateiktos ant 10 mM cikloheksimido Czapek doks terpės. (50 ml) ir inkubuojamos 30 min., centrifuguojamos po 10,000 g 10 min., o po to vėl buvo suspenduojamos steriliame distiliuotame . vandenyje. Sporos buvo tris kartus plaunamos maišant· ir vėl nusodinamos centrifugavimo būdu. Po to sporos buvo suspenduojamos steriliame 1% Triton Χ-100 tirpale ir hemocitometru buvo nustatomi jų skaičiai mėginiuose. Atitinkamas skiedinys pateikiamas į 10 mM cikloheksimido atrankos terpę ir po 10 dienų inkubacijos 28±2°C temperatūroje buvo išskirti atsparūs mutantai. Izoliatai buv.o tiriami, ar .jie gali gaminti lovastatiną. Cikloheksimidui atsparus lovastatinas, gaminantis A. terreus izoliatą, buvo. atrenkamas tolimesniems transpormacijos tyrinėjimams. .

^;

PROTOPLĄSTO IR DNR RUOŠIMAS

Aspergillus oryzae ir cikloheksimidui atsparus, lovastatiną gaminančio A.terreus (čia žymimas JAG-4703) . izoliatas buvo atskirai /kultūrinami 50 ml Czapek doks ; sultinyje . Kultūros inkubuoj amos<58 vai . 28±2°C temperatūroje besisukančiame plaktuve (New Brunswick Scientific/Ine.) prie 200 aps/min., po to surenkamos/ir plaunamos steriliu distiliuotu vandeniu, /pakartotinai 'centrifuguoj ant.

Abiejų rūšių kultūrų protoplastai buvo gauti naudojant Noyozimą/ 234 (Novo-Nordišk, Novo Alle, DK 2880, /agsvaerd, Denmar k ), kad per 12 — 14 vai. /ardymo / būtų / pašalintos / // ląsteių / / sienelės .· /Dažniausiai / buvo

-7 naudojamas : metodas, aprašytas Dickinson >and Isenberg, J.Gen. Microbiol. 128, p. 651-654(1982). Kiekvienos rūšies protoplastų mėginiai / regeneravo gyvybingas vienaląsteiines sporas su sienelėmis /28°C temperatūroje po 24 vai.regeneracinėje terpėje (R), turinčioje 0,1 g agaro7 (Difco) /5 g sorbozės ir / 0,35 g EDTA 50 ml distiliuoto vandens kiekyje. Sudygusios sporos turėjo visas savo motininių /kultūrų charakteristikas.

Visas DNR buvo išskirtas iŠ / Aspergillus terreus protoplastų pagal metodiką aprašytą /Schlięf/ and

Wensink,/ . Practical Methods in Molecular Biology ,33,

21-29 /(1981). /Protoplastai suspenduojami tirpale iš 10 mg/ml SDS, 0,1 M NaCl ir 0,1 M tri-HCl, pH 9,0 .Buvo pridedamas toks pat kiekisfenolio, prisotinto tris-HCl buferiu . Mišinys centrif uguo j amas 10 min. po 12,000 , g Eppėndoff Centrifugė vamzdyje (Brinkman Instruments, Canada Ltd., Rexdale, Ontario). Viršutinė fazė, /purinti

DNR, buvo pašalinta, sumaišyta su 95% etanolu, laikoma -20°C temperatūroje 60 min., po to 10 min. centrifuguojama kaip ir anksčiau. Gumulas buvo vėl suspenduojamas buferyje, pH 7,0 ir inkubuojamas su ⁷ ''

BNaze (Sigma, St. Lpuis, :K>, U.S.A.), apdorota feno!iu, o DNR nusodinama iš vandeningo sluoksnio. Išskirta DNR gryninama adsorbuojant ir plaunant ant DEAE-celiuliozės •///.•.••((ępĖ-5.27.7'-Wha_ltjnan), prieš tai išmirkius 10 mM tris-HCl buferyje, pH 7,5 ir 0,3 M NaCl, ir laikoma pastėro pipetėje. DNR skiedžiama su 10 m tris-HCl buferiui, pH. 7,5, turinčiu 1,5 M NaCl. Tas tirpalas atskiestas iki 0,2 M NaCl ir DNR nusodinama dviem etanolo kiekiais. DNR grynumas nustatomas iš 200-300 nm spektru, apskaičiuojant A_2€0/A₂₈₀ absorbcijos proporciją. Tiktai DNR su proporcijomis tarp 1,50 ir 2,00 buvo panaudojamos transformacijose. Šeši pavyzdžiai, kiekvienas turintis '0,1 mg išskirtos DNR, inkubuojami regeneracinėje terpėje, siekiant įsitikinti, ar nėra gyvybingų protoplastų - nė vienas iš jų nedavė jokios kolonijos.

/: 7/,. ·' ·'' ·^;’·< 7 ^:·· '*' ' i·¹ 7 ’ ' /--) ' ') · ·^:··' 7 - '' .'b... -· 7/7:¹ /./.·'··. 7 7-'··.

PROTOPLASTO - DNR INKUBACIJA

Apytikriai 5.2 χ 10⁴ A.oryzae protoplastų pagal hemocitometrinius paskaičiavimus ' inkubuojami su 10-100 ng A.terreus DNR 5 ml regeneracinėje terpėje, terpės sudėtis ir regeneracijos procesas aprašyti aukščiau. Siekiant · ištirti DNR galimą ' poveikį cheminei lovastatino išraiškai, 10-100 ng veršio krūtinės liaukų DNR (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., U.S.A.), DNR (Bethesda Research Laboratories, Gaitherberg, .MD, U.S.A.) ir homologiška A.oryzae DNR inkubuojami , su panašiais kiekiais A.oryzae protoplastų. Kai DNR buvo įjungta į inkubacjas,. protoplasta regeneracija sulėtėjo iki mažiau nei 10% ir panašūs kiekiai taip apdorotų protoplastų (IO⁵) neparodė jokio atsparumo cikloheksimidui.

'' -7(7./-7 ’

/)/7 8 . 7.,) J <

. LOVASTATINO GAMYBA IR BANDINYS 7.::-,/7.-/.)

Sporų, išaugintų inkubuojant A.oryzae protoplastus kartu su A.terreus DNR, suspensija įterpta po 1 ml i.

- lėkštelę į Czapek doks agaro terpę, turinčią 10 mM cikloheksimido. Po 48 vai. * inkubacijos 28±2?C temperatūroje kultūros išaugo iki 6-8 mm diametro. Kiekviena kultūra išaugo' atskirai iš vienos sporos šiomis sąlygomis. Kiekviena kultūra, išaugusi cikloheksimido terpėje, atskirai įterpta į Czapek doks terpės -sultinį (50 ml į 500 ml Erlenmeyer kolbą), .inkubuojama besisukančiame maišytuve (200 aps./min.) 28±2°C temperatūroje V- dienų. Kiekviena auginimo terpė tiriama lovastatino gamybai . pagal žemiau aprašytą . procedūrą ir chromatografinę (ASSC) analizę.

EKSTRAHAVIMAS

Fermentuotas sultinys (50 ml) parūgštintas 17 N HCl' iki pH 4,0, o po to f ryke-tonuotas etilacetatu (100 ‘ml., 3 x). Sujungtos etilacetato frakcijos džiovinamos vakuume 30°C temperatūroje, _rnuosėdos ištirpintos acetonitrile (5 ml) ir po to pateiktos chromatografinei (ASSC) analizei.

' . CHROMATOGRAFINĖ (ASSC) ANALIZĖ ,

Chromatografijos (ASSC) įrangą (Beckman Model 420), susidedančią įš Atex pompos (Model 110 A) ir injekcijos ventilio, parūpino Beckman Instruments, Toron.to, ~ Canada. LC-UV detektorius 237 nm bangai. Naudojamas hipersilo C-18 ODS kvarco kolonėlė (25. x 0, 46 cm) bei tirpinimo sistema iš acetonitrilo ir vandens (55. : 45), tėkmės greitis 1,0 ml/min. Pagaminto lovastatino kiekis _; lygįnama-s? ir apškaičiuojamas pagal sukurtą standartinę . Ibvaštatino kreivę.

879 /cikloheksimidui atsparūs izoliatai, įskaitant 4 _: /įovastėtiną gaminančius izoliatus, gauti iš 5,2x’ 10^{* 5}

A.oryzae protoplastų, inkubuotų su DNR iš cikloheksimįdūį ;'- atsparaus, lovąstatiną gaminančio A.terreus mutanto. Transformacijos * eksperimentai vykdomi šešis^- kartus.

Rezutatai pateikiami lentelėje 1.

-r4 © P © © i—I a

o

P o

M a

©

N

5*i

M

O ©

© □

r-4 r-4

-r4

S-4 ©

a ©

o

M-J

K) c

Π3

C •Ή

©·
G	v
-P	•P
P	>0	JT	©
©	G	P	3
P	©	©
«	C	•P	>0
©	-P	rH	-P
>	e	0	©
O	©	N	44
0	Oi	►rl	©

O <V OI

Oi

G

Ή oi

P ©

a ©

©

4-1

C ©

•H >© •H ©

M >© •H «Γ

G

H

4-» (0 p

© ©

>

Oi «Γ c

_-=«4

4-» ©

4-1 ©

© >

O

IT>

rtn

OČ

C •o •H

O ©

•P ©

G ©

Oi ©

kO o m ·. vo ro rtn kO

M d

© ©

a ©

+J

-H

Ό

S •rl ©

44<D

-C

O i-4

-H

U

O

4-1

G ©

P

I ©

©

M

P ©

P a

SH .2

U

3*

4->

a o

4->

O • P a

3*

4-1 ©

G ©

0>

oi o 4-1 © © ’ι—I a

o

P o

p a

o a

©

-H »O •H ©

©

O

-r-t

-H

N □

.0-1

-H ©

ra a

o

-P o

fM

P ©

4->

G

Ή

P ©

a «

ω

O	o	o	o.	O
r-t	(—4	r-4	-(—4	r-t
54	X	X	X	X
•rrl· ''	r-t	r*	r-	tn
·., .(	'0 ··	. -.·	·	··
sr	(*>	m	04	iH

o	o	O	o	o
r-4	r-4	r-4	r-t	r-t
/x/·	X	X	X	X
v	CM	CM	o	kO
' *	.		» ··	<
r-	IT;	tn		04

H — l-t M

VI) 1.6xl0⁵ Χ.ΙχΙΟ⁵ 70 ii - <.Viena (iš transformuotų;, kultūrų, ( AO-ll, išlaikė ( savo ' / transformuotas .charakteristikas ' šešis mėnesius;. Fig. 1 iliustruoja ASSC analizę(ekstraktų, įgautų iš A.oryzae ';:0;;(0.;0r0cip:iento-;(-įr<0'donQro(' kultūrų ir ekstraktų apdirbtų su $ A ·terreus 0 DNR. Kaip transformuoti ^: (izoliatai gamina.

lovastatiną yra parodyta lentelėje,2.

LENTELĖ2 Aspergillus oryzae transformuotų izoliatų gamyba Czapek dbks sultinyje (pH 6.8)

Izoliatas	Lovastatino kiekis, (mg/J)
AO-I	15,36±1,78
AO-II	26, 89±3,76
. AO-III	13,46+4,56
AO-IV	9,67±0,75

Izoliatas Nr. AO-I subkultūrinamas penkis kartus ir davė transformantą AoAt -NBJ/5, kuris 1992 II 25 buvo patalpintas į American Type Culture Co-llection kaip gyvybnga, nekintama kultūra, nuorodos numeris ATCC 74135.

Lovastatinas yra gaunamas' kartu su hidroksi-rūgšlies analogu, kurį lengva paversti į lovastatiną, pvz., perplaunant toluole, kad būtų baigta laktonizacija ir tokiu būdu padidintas lovastatino kiekis. Šiuose eksperimentuose laktonizacija nebuvo vykdomą.

Lovastatino, pagaminto motininės kultūros A.terreus Czapek doks sultinyje, kiekis sudaro 166, 72±5,92 mg/1, o motininė A.oryzae kultūra lovastatino nepagamino.

Fig. 2 vaizduoja ASSC būdu iš hibrido kamieno išgryninto lovastatino( mišinio ^H-BMR spektrą.Lyginant su žinomu, standartiniu; lovastatino ,-speKtru, šis ’(('.'(^:-'^!0''--spėktxah patvirtina(produkto tapatybę..

¹² RA/.

Fig. 3 yra.^/^/./pątįes/prp'duktb. bendras spektras ir rodo, / kad gautas. lovastafcinąs/ yra 99% grynumo.

DNR koncentracijos nuo 5 iki 20 ng į terpės ml 5 · nepaveikė nei A.oryzag protoplastų regeneracinio pajėgumo, nei cikloheksimidui atsparių ir’ lovastatiną gaminančių izoliatų išgavimo iš inkubacijų su A.terreus

DNR.. Gauti duomenys rodo, kad tos koncentracijos nebuvo lovastatino gamybą .ribojantis faktorius. Panašiai, DNR iš veršio krūtinės liaukų, DNR bei homologiška A.oryzae DNR prie koncentracijų nuo 5 ng iki 5 ng į terpės 'ml nepaveikė A.oryzae protoplastų regeneracijos, lyginant

,. R· ; ·.'··/.././: .../ ·, R/R . .R ; R-. : ·.. .R-'R.R /A RR R;, ?. RRRA. .,R. RRą·RRRr / R'· ...R -RR R? R H ' ..... V, A..'· -R'R/'R / ' su neapdorotais kontroliniais pavyzdžiais. Tačiau DNR prie 10 ir 100 ng i, terpės ml sulėtino regeneraciją iki . atitinkamai maksimalių dydžių 26 % ir 1 %. Toks DNR apdorojimas nedavė lovastatino išraiškos.

' ' ·'. / 'AR/ 7\R^;R'R- / 'R··· - ' '·'··' R; A. R.R- ···,. R'''RAR· '' //' R/ //R·; ^::^:./RA- / R 1. r'/ R '-' -RRRr.. AR

Regeneracinė terpė davė protoplastų kiekius, palyginamus su tais, kuriuos gavo Acha et ai J. Gen.

Microbiol., 45, 515^-523 (1966), naudojant sudėtingesnę mineralo terpę. Konidai ir šviežiai sudaiginti konidai davė geresnius gyvybingų protoplastų ir DNR derlius negu micelijos, , Pagal šią sistemą, protoplasto regeneracijos metu nebuvo pastebėta ląstelinių agregatų formavimosi, aprašyto Acha et' /1. (1966). Aiškus faktorių, atsakingų už atsparumą ckloheksimidui ir lovastatino išraišką, perėjimas iš A.terreus į A.oryzae rodo tarprūšinę DNR transformaciją. Kartu vykstanti atsparumo cikloheksimidui ir lovastatino gamybos transformacija buvo netikėtai patenkinama ir teikė vilčių, jog genai, susiję su šių charakteristikų išraiška, yra fiziškai artimi ir gali jungtis į grupes.

įNaujg -transformanto, AoAt-NBJ/5, morfologija yra R pavaizduota Fig.4 Ir gali būti apibūdinta tokiu būdui ·;^?Ο/3083Έ ' ' ' ' / ¹³ . ^/J'^:'.^; / AoAt; - NBJ/5 MORFOLOGIJA -7./-,..

Konidinės galvutės strypo formos* _; / šviesiai rudos'. ?Konidioforai // lygūs> / bespalviai;. // Pūslelės· / pusrutulio '/

- ///formos/?.:'?iki pusės / ari dviejų: trečdalių, padengtos ? fialidų, išsidėsčiusių·/-'·..i^viem / / sluoksniais. Konidai rutulio pavidalo arba elipsiniai, /jų kolonijos ant Czapek agaro auga lygiai ir labai greitai, spalva flokozinė arba švelniai einamo/ /rusvumo /dėl; konidų gamybos. Eksudatas oranžinis, atvirkščioj i pusė geltona iki rudumo.

Šie eksperimentai rodo, kad, iš principo, genetiškai apibrėžtos, vienos grybelinės ' rūšies . antibiotikus gaminančios charakteristikos gali. būti išreikštos kitoje rūšyje.

PAVYZDYS 2 - GAMINIMO BŪDAS

Grybelinė kultūra: lovastatino gamybai buvo naudojama transformuota Aspergillus oryzae (ATCC Nr. 74135) AoAt/NBJ-V kultūra.

' fermentavimas

Sėklų ruošimas: grybelinė kultūra (liofilizuotas buteliukas) aseptiškai perkelta' ant bulvių dekstrozės agaro nuožulnumos ir jai leista augti 4-5 dienas 25°C temperatūroje. Inkubacijos pabaigoje paruošta konidinė suspensija, pridedant '10 ml tritono Χ-100 (0,01 %) tirpalo, smarkiai plakant, konidinė suspensija perkelta ant sterilių ryžių (50 g), laikomų Erlenmeyer kolboje (250 ml talpos). Į kolbą papildomai įpilta 10 ml ? sterilaus vandens, /smarkiaiplakama ir inkubųojama 5-7

-/7 dienas ' 28°C /temperatūroje. Inkubacij os periodo pabaigoje įpilta sterilaus vandens (50 ml).

/ per sterilų muslino audeklą ir filtratas (1χ10^δ konįdų/ml) perpiltas į / sėklų.ęf (50 1 talpos)> turintį 30 1 sėklų terpės'. Naudotos sėklų terpės sudėtis buvo tokia:

·

D-gliukozė 20 g/1 Salyklo ekstraktas 20 g/1

Neopeptonas 3 g/1

Krano vanduo 11 pH 6,8--(su 10% - NaOH). , Terpė .sterilizuojama 121°C temperatūroje 30 min. (103 kPa). Sėkloms leista augti 17-20 valandų 28°C temperatūroje (vėdinimo greitis 0.310 0.5 vv/min.) su 80-100 % suskaidytu deguonimi (200 aps./min.).

LOVASTATINO GAMYBA

Sėklos (30 1) buvo perpiltos į fermentavimo indą (darbinis tūris l.©00 1) su gaminimo terpe. ¹ Terpės sudėtis buvo tokia:

Laktozė	60 g/1
Ardamino pH	10 g/1
Sojos proteinas	2 g/1 ^Ί
KC1	2 g/1
KH₂PO₄	0,8 g/1
MnSO₄4H₂O	0,03 g/1
Betainas	0,6 g/1
P ^r2000 . ? ?::	//6:2/7^;ίηί///6/-.-?''
Krano vanduo ,	11

pH 6,8 (prieš sterilizavimą, sukoreguota .^u 105

NaOH/H₂S0₄),3 sterilizuoja 3. 121°C / tempelatūroje 'vieną '7-7:valandą/-:prie/'103-138?'-kPa®'·-;/¹¹';?

8083 B

Po inpkųliacįjosy kultūra auginama 7-8 dienas Č8°C temperatūroje su pH kontrole prie 6,0-6,2 (su 10 % H₂S0₄) .

y greitis//fouvp / palaikomas tarp 0,7-1,0 vv/min.

(suskaidytas deguonis 80-100 %).

ANTRAS GAMYBOS ETAPAS

Septynių dienų senumo fermentuotas sultinys (.50 1) steriliai perpiltas į sėklų fermentuotuvą (darbinis tūris 2,000 1), turintį 1,500 1 sėklų terpės (sudėtis aprašyta'» aukščiau) . Sėkloms leista augti 24 valandas 28°C temperatūroje (200 aps./min., suskaidytas deguonis

80-100 %) . Sultinys (200 1) buvo steriliai perkeltas į gamybos fermentuotuvą. (30,000 1 talpos su darbiniu tūriu 20,000 1) turintį '' 18,000 1 gamybinės terpės.

Kultūrai buvo leista toliau augti 7-9 dienas 28°C temperatūroje su pH kontrole prie 6,0-6,2. Po 60 valandų fermentacijos pH nebebuvo kontroliuojamas. Į fermentuojamą sultinį buvo 'pridėta maitinimo . terpės (greitis 10 1/val.) penkioms dienoms. Maitinamo terpės sudėtis buvo tokia: '

D-gliukozė Ardamino pH Sojos proteinas Krano vanduo

285,7 g/1 71,4 g/1 14,3 g/1 1 1 pH 6,8 (prieš sterili-zavimą) - sterilizuojama 121°C temperatūroje 30-45 min. Fermentavimo pabaigoje sultinys rūgštinamas iki pH 4,0 su- ION-RC1 ir centrifūguojamas, Grybelinis. briketas džiovinamas 55°C 7tempėiatūroje7/'ir^:?ekstfahuojamąš.4/':?//..;

~ EKSTRAHAVIMAS IR GRYNINIMAS ' '/ '·, L 7. ://7 7777 ’·.·’-v 7'^:-'( : :-/77-7/- -7 ----./ ^: 7' ^: _: - - · . .

Išdžiovintas grybelinis briketas (20 kg) homogenizuojamas šaltu etilo acetatu (10-15 min.), o . homogenizuota medžiaga virinama' su grįžtamu šaldytuvu 80°C-85°C temperatūroje 4-6 valandas, atvėsinta medžiaga filtruojama. Filtratas džiovinamas vakuume iki juodos dervingos medžiagos (2,5-3· kg). Juoda dervinga medžiaga sumaišyta su silikageliu (.2,5 kg) įr CH₂C1₂ (5 litrai) .

' CH₂C1₂ išgarintas vakuume, o dervingas medžiagos mišinys su silikageliu išpiltas į stiklinę silikagelio kolonėlę (100 cm ilgio x 22,5 cm diam.), apdorotą su EtOAc : heksanu , (1:2). Buvo * surinkti pavyzdžiai (2,000 ji,

2x) . Po^24 valandų eliuojančio tirpiklio mišinys buvo pakeistas į EtOAc : heksaną (1:1) ir leidžiamas dar 24 „valandas. Pavyzdžiai, turintys produkto, surinkti, išdžiovinti (280 g) ir kristalizuojami iš metanolio

KRISTALIŽAVIMAS

Geltonas išdžiovintas produktas (280 g) ištirpįnamas 2,8 litro metanolio ir virinamas 40-60 min. 60-65°C temperatūroje. Karštas metanolio mišinys filtruojamas, o filtratas inkubuojamas 4-6 vai. 4°C temperatūroje.

Baltos kristalinės adatėlės atskiriamos-nuo motininio tirpalo ir perplaunamos šaltu metanoliu. Kristalai išdžiovinami vakuume, pasveriami (19,0 g) ir laikomi eksihatoriuje 4°C temperatūroje.

Šiame, išradime aprašytas būdas įgalina pasiekti pakankamai dideles lovastatino išeigas, sukeliančias naujojo Aspergillus oryzae transformanto ląstelių sienelių įriirią, ir tokiu būdu galima išvengti ląstelių ūžavimo stadijos, išskiriant lovastatiną. Tai žymiai supaprastina galimo ir gryninimo būdą. Kaip aprašyta anksčiau, lovastatiną pagal šį būdą * galima gauti ekstrahuojant tirpiliu be būtinybės suformuoti ' : ¹⁷ esterius, druskas ir t/t. gavimo metu., Ekstrahavimas tirpikliu yra žymiai paprastesnis ir ekonomiškesnis gavimo ir gryninimo būdas negu chromatografja.

Claims

IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

1. Lovastatino gavimo būdas, kurį' sudaro maitinimo terpės fermentavimas su ' transformuotu Aspergillus

5 - kamieno grybelinių mikroorganizmu, ^atrinktu iš rūšių

A. oryzae, A.niger, A.nidulans, A.'fumigatus· ir A. f lavųs

,...·.·.·..·»

- grupės, besiskiriantis tuo, kad šį kamieną transformuoja taip-, kad jis turėtų svetimos DNR užkodavimą fermentų grupei, galinčiai sintetinti

10 lovastatiną, su atrinkimo žyme, bei lovastatino išskyrimu iš maitinimo terpės.
2. Būdas pagal 1 punkją, besiskiriantis tuo, kad transformuotas mikroorganizmas turi svetimą

15 , DNR, išvestą iš. lovastatiną gaminančios Aspergillus terrėus rūšies.
3. Būdas pagal 2 punktą, bes tuo, kad minėtas Aspergillus A.oryzae kamienas. » i s k i r kamienas i a n t i s yra rūšies/
4. Būdas pagal bet kurį ankstesnį punktą,· besiskiriantis tuo, kad svetima DNR, įvesta į transformantą, turi cikloheksimidui atsparių genų, kaip

25 atrinkimo žymę.
5. Būdas pagal bėt kurį ankstesnį punktą, besiskiriantis tuo, kad transformantas yra AoAt - NBJ/5 taip, kaip čię aprašyta ir apibrėžta.

30 ..........
6. Būdas pagal bet kurį ankstesnį punktą, bes i s k,ir i ant i s tuo, kad apima papildomą hidroksirūgšties analogo laktonizacijos stadiją, p tas hidroksi-rūgšties analogas fermentacijos procese

35 pavirsta į lovastatiną.
7. Būdas pagal bet kurį ankstesni punktą, b e s i s k ir i a n. t i s tuo, kad lovąstatiną (išskiria ekstrahuojant tirpikliu. y 5 8. y Grybeliniai. transformantai, galintys y sudaryti .

fermentų, pajėgiančių sintetinti lovąstatiną,: grupę; yra Aspergilluš rūšies kamienai/ atrinkti iš A^oryzae,

A 1 n i ge r, Ą.n i du1ans, A.fumigatus ir A.flavus, b e si sk i r i a n t y s tuo, ‘kad turį svetimą DNR .su genų

10 užkodavimu fermentų grupei, sugebančiai sintetinti • 8 lovąstatiną.' _ y yį '

9. Grybeliniai transformantai pagal 8 punktą, b e s i sk į f i a n t y s tud, kad Aspėrgįliūs rūšis atrenkama

15 .8: iš A.oryzae, A.niger, A.ni du1ans ir A.fūmigalis.

10. Grybeliniai transformantai pagal 9 punktą,b e s i s' k ®i r H':a n t y 7 s y 8 tuo; kad : Aspergillus rūšis yra

A.oryzae 8®·®!.

20 ®:. i®: /λ®'·-.·: ®:®8y;y®8-®8^:-z://'/®:®:

811.'Grybeliniai transformantai'pagal 8 punktą, b e sisk i r i a n t y s . tuo, kad svetima- DNR yra gaunamą8 iš Asper gilius terreus ·. rūšies/: lovas tat iną išreiškiančio kamieno. yi ®,’ ‘188
8 1 Z2 . /Grybeliniai transfd ir. 11 punktus, b e s i s k i r i a n t y s / tuo, kad apima visą DNR iš minėto A.terreus kamieno į minėtą A.oryzae kamieno protopiasto transformacijos produktą.

30 : ®'8 ® - :^:--y'://: ®/'y ::/88®®3®®į/:®®/

131 8 Grybeliniai transformantai, pagal 8-12 punktus, be s i s k ir i a n t y s y tuo, kad yra AoAt NBJ/5, kaip aprašyta ir apibrėžta.

ki ekstraktas iš oryzae (šaltinis)

B: ekstraktas iš A.terreus (šaltinis)

C: standartinis lovastatinas D: ekstraktas iš trari^Qfe3ttfft61&.oryzae