KR970005488B1

KR970005488B1 - 항생제 pb-6042류

Info

Publication number: KR970005488B1
Application number: KR1019890015059A
Authority: KR
Inventors: 다다시 요시다; 데루오 하또리; 고이찌 마쓰모또; 요시히로 데루이; 준이찌 쇼오지
Original assignee: 시오노 기세이야꾸 가부시끼가이샤; 요시또시 가즈오
Priority date: 1988-10-20
Filing date: 1989-10-19
Publication date: 1997-04-16
Also published as: EP0365329A2; ES2052020T3; KR900006517A; DE68901024D1; EP0365329A3; ATE73789T1; GR3004095T3; US5045458A; EP0365329B1

Abstract

내용없음.

Description

항생제 PB-6042류

제1도는 PB-6042류의 TLC 크로마토그래피를 나타낸다.

제2도는 PB-6042류의 HPLC 크로마토그래피를 나타낸다.

제3도는 PB-6042류의 IR 스펙트럼을 나타낸다.

오늘날 유용한 항생무질을 매우 다양하게 이용할 수 있지만 오직 루스토마이신을 포함하여 그중 몇가지만이 혐기성 세균에 대해 배타적으로 항세균활성을 나타낸다. 그러므로, 혐기성 세균에 대해 더 특이적이고 더 강력한 항세균 활성을 갖는 항생제가 꾸준히 요구되고 있다.

이러한 상황하에서, 본 발명은 신규 항생제 PB-6042A, PB-6042B, PB-6042C 및 B-6042D, 또는 그의 염, 상기 항생제를 생산하는 신규 균주 및 그의 제조방법을 제공한다.

항생제 PB-6042A, B, C 및 D(이하 전체를 PB-6042류로 언급함)는 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans) PB-6042로 명명된 신규 균주의 생성물이다. 그것은 산성화합물이며 혐기성 세균에 특이적이며 유사한 항세균 스펙트럼을 갖는 루스토마이신과 같은 공지의 항생제보다 더 높은 항세균 활성을 나타낸다.

본 발명의 화합물은 혐기성 세균에 대해 배타적으로 항생제 활성을 나타내기 때문에, 혐기성 엔테로 박테리아로 인한 클리티스(clitis)와 같은 감염성 질병의 치료에 이 화합물을 사용하는 것이 바람직한 것으로 이해된다. 또한, 본 발명의 화합물은 후술한대로 매우 독특한 화학구조를 가지므로 치료학적으로 유용한 또 다른 생리학적 활성, 예를들면 혈소판응집-억제활성, 항-종양활성등을 나타내는 것으로 기대된다.

본 발명에는 본 발명 화합물의 염, 특히 나트륨염과 같이 제약학상 허용 가능한 염이 포함된다.

본 발명의 화합물은 공지된 항생제에서는 발견되지 않은 독특한 화학구조를 갖는다. 본 발명의 화합물의 물리화학적 특성 및 화학구조를 이후에 상세히 기술하겠다.

물리화학적 특성

항생제 PB-6042A, B, C 및 D는 여과지 전기 영동 및 생물학적 자기묘사법에 의해 모두 산성물질인 것으로 밝혀졌다. 나트륨 염 형태의 PB-6042류의 다른 물리학적 특성을 하기에 기재한다.

색깔 : PB-6042류는 모두 무색 결정성 분말이다.

용해성 : PB-6042류는 모두 DMSO, 메탄올, 에탄올 및 에틸아세테이트에 용해되고, 클로로포름에는 약간 용해되며, 물, 에테르 및 석유 에테르에는 용해되지 않는다.

안정성 : PB-6042류는 모두 산성용매에서 불안정하다. 유리 화합물을 증발 건조시켜 방치하면, 즉시 자발적으로 중합화되어 불용성 중합체를 생성한다.

TLC : PB-6042A, B, C 및 D의 혼합물을 함유하는 용액을 머크 실리카켈 GF 플레이트에 스폿팅하고, 클로로포름/메탄올(9 : 1) [전개용매 A] 및 부틸아세테이트/메탄올(9 : 1)[전개용매 B]에서 전개한다. 얻어진 TLC 크로마토그람을 첨부된 제1도에 제시한다. 제1도에 제시된대로, 모든 화합물의 Rf값은 동일하며, 전개용매 A 및 B에서 각각 약0.21 및 0.39이다.

HPLC : PB-6042류의 혼합물을 하기 조건하에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시킨다.

컬럼 : 누클레오실 5C₁₈(No.3), 4.6×250mm

용리액 : 40% 아세토니트릴/50mM PBS, ph=7.5(50mM Na₂SO₄)

유속 : 1ml/분

OD : 254nm

챠트속도 : 0.5cm/분

제2도는 PB-6042류가 상기 조건하에서 서로 분리되었음을 나타낸다.

융점, 원소분석 및 2차이온 질량스펙트럼(SI-MS) : PB-6042A

융점 : 113∼115℃

원소분석 :

실측치 C;61.50, H;7.36, Na;7.47

계산치 C₁₅H₂₁O₄Na(288)

C;62.50, H;7.29, Na;7.47

계산치 C₁₅H₂₁O₄Na.1/4H₂O

C;61.53, H;7.35, Na;7.86

SI-MS(m/z); 311(M+Na)

PB-6042B

융점 : 85∼88℃

원소분석 :

실측치 C;63.99, H;7.51, Na;6.91

계산치 C₁₇H₂₃O₄Na(314)

C;64.96, H;7.32, Na;7.32

계산치 C₁₇H₂₃O₄Na.1/4H₂O

C;64.05, H;7.37, Na;7.22

SI-MS(m/z); 337(M+Na)

PB-6042C

융점 : 125∼128℃

원소분석 :

실측치 C;63.90, H;8.16, Na;6.75

계산치 C₁₇H₂₅O₄Na(316)

C;64.55, H;7.91, Na;7.27

계산치 C₁₇H₂₅O₄Na.1/4H₂O

C;63.65, H;7.80, Na;7.17

SI-MS(m/z); 339(M+Na)

PB-6042D

융점 : 103∼106℃

원소분석 :

실측치 C;65.56, H;8.07, Na;6.11

계산치 C₁₉H₂₇O₄Na(342)

C;66.66, H;7.89, Na;6.72

계산치 C₁₉H₂₇O₄Na.1/4H₂O

C;65.80, H;7.80, Na;6.63

SI-MS(m/z); 365(M+Na)

UV스펙스럼 : PB-6042A, B, C 및 D는 UV스펙트럼에서 동일한 파장에서 최대흡수(λmax)를 나타내며, 또한 동일한 흡광 계수(ε)를 갖는다. 다른 용매에서 통상적인 최대흡수 λmax(ε)는 하기와 같다 :

λmax(ε)=248nm(18777), 298nm(9616), 용매 : 메탄올

λmax(ε)=248nm, 298nm, 용매 : 묽은 NaOH/메탄올

λmax(ε)=215nm(7640), 285nm(12239), 용매 : 묽은 HCl/메탄올

산성조건하에서 블루 쉬프트가 관찰된다.

IR스펙트럼(KBr) : 제3도는 서로 매우 유사한 PB-6042A, B, C 및 D의 IR스펙트럼임을 나타낸다.

원편광이색성(CD) : 메탄올중 220∼320nm에서 PB-6042류 각각의 CD는 0이다. 이것은 PB-6042류중 어느것도 광학 활성을 갖지 않는다는 사실을 시사해준다.

상기 물리화학적 특성으로부터, 항생제 PB-6042A, B, C 및 D는 매우 유사한 구조를 가지며, 그의 발색단은 매우 동일하다고 결론지을 수 있다.

구조적 측면

[1] PB-6042A

CDCl₃-CD₃OD(15 : 1)중에서 및 DMSO-d₆중에서의 PB-6042A나트륨염의¹H및¹³C NMR 스펙트럼은 5개의 4차 탄소뿐만 아니라 알킬기 및 엑소-메릴렌기가 존재함을 증명해준다. IR스펙트럼은 불포화락톤(1735cm^-1) 및 공역 불포화케톤(1670, 1630cm^-1)이 존재함을 시사해주는 반면에, 페이퍼전기영동 및 생물학적 자기묘사법에 따르면 PB-6042A가 산성 물질임에도 불구하고 카르복실기가 존재하지 않음을 나타낸다. PB-6042A는 화합물의 불포화 정도가 그 분자식으로 볼때 5로 추정되며, 발색단 주변의 엑소-메틸렌탄소, 5개의 사차탄소 및 알킬메틸렌탄소의 시그날은 모두¹³C-NMR스펙트럼에서 매우 넓다는 사실로 비추어보아 하기 제시한 호변이성을 유도하는 구조를 가질 것으로 믿어진다.

(식중 R은 (CH₂)₈CH₃이다.)

증폭(broadening)은 호변이성으로 인한 화학적 쉬프트교환에 기여한다. 상기 제시된 공명구조는 음이온 형태를 안정시키며, PB-6042류의 산성특성에 기여한다.

PB-6042A는 H₂/PtO₂로 환원시켜 엑소-메틸렌기를 메틸기로 전환시키고 (참고예 1 참조), 생성물을 UV분광학으로 분석하여 λmax가 메탄올중에서 230 및 265이고, 물은 NaOH/메탄올중에서 230 및 263이며, 물은 HCl/메탄올중에서 204 및 269임을 밝혔다. 환원된 생성물은 항세균활성 및 산성특성을 유지한다.

얻어진 발색단의¹³C 시그날은 또한 24℃, CLCl₃-CD₃OD(15 : 1)에서 증폭을 나타낸다. 24℃, DMSO-d₆에서는 세호변이성체에 해당하는 시그날이 관찰된다. 고온에서 호변이성체의 시그날은 합체된다. 하기에 제시된 공명구조 역시 산성특성에 기여한다.

(식중 R은 (CH₂)₈CH₃이다.)

그런후 환원 생성물을 통상적인 방법으로 메틸화시키고 (참고예 2), 생성된 화합물을¹³C-NMR 스펙트럼으로 분석하는데, 넓은 시그날은 전혀 발견되지 않는다. 긴 범위 C-H쉬프트 상관분광학(Long-range C-H shift correlation spectroscopy)을 사용하여 4차 탄소의 지정을 조사하여 메틸화 생성물이 하기 구조를 가진다는 사실을 밝혔다 :

그러므로, PB-6042A는 하기 구조를 갖는 것으로 여겨진다.

[2] PB-6042B, C 및 D

PB-6042B, C 및 D의 구조는 상기에서 구조가 결정된 PB-6042A의 NMR스펙트럼과 비교하여 결정한다. PB-6042류의¹H 및¹³C NMR 자료를 표1 및 2에 제시한다.

PB-6042류의 구조

주 : a, b, c; 동일한 첨자를 갖는 두 수치자료는 각 화합물에서 서로 대신할 수 있다.

상기 자료에 기초하여, PB-6042A, B, C 및 D는 공통의 기본 구조를 가지며 측쇄구조에 있어서만 서로 다르다.

PB-6042B중 측쇄의 정확한 구조는¹H-NMR디커플링(decoupling) 방법에 의해 결정한다. 디커플링 방법으로 δ값 2.82, 1.62, 2.10, 5.37(2회 출현) 및 2.01순으로 상관관계가 있음이 밝혀졌다. 불포화 결합뒤의 측쇄의 팁구조는¹H-NMR,¹³C-NMR 및 질량 스펙트럼의 적분 분석으로 결정한다. 결과는 PB-6042B구조를 하기 일반식(Ⅱ)에 제시된대로 결정해준다.

PB-6042C의¹H-NMR스펙트럼은 1.2∼1.4(m)에서의 적분강도가 PB-6042A의 것보다 4/3배 더 크다는 점을 제외하고는 PB-6042A의¹H-NMR스펙트럼과 유사하다. 또한,¹³C-NMR은 PB-6042C가 PB-6042A와 비교하여 추가로 두 CH₂(t)를 갖는다고 나타낸다. 그러므로, PB-6042C의 구조는 하기 일반식(Ⅲ)의 구조를 갖는 것으로 결정되었다. 질량 스펙트럼은 이 사실을 확인시켜준다.

끝으로 PB-6042D의 구조에 있어서, 불포화 결합의 정확한 위치는, 불포화 결합주변에 위치한 두 CH₂의 δ값이 약 2.01의 δ값내에 해당하기 때문에 NMR에 의해 결정될 수 없다. 그러나, 불포화 결합의 정확한 위치는 불포화 결합의 산화절단으로 및 생성된 포화 지방산을 분석하여 결정한다.

PB-6042B 및 D의 측쇄중 불포화결합은 불포화결합 주변의 메틸렌 탄소의 δ값이 PB-6042C 및 D 모두에서 하기 공지 화합물의 시스-형의 것에 해당하는 값인 약 27이므로 시스-형으로 결정된다.

상기 연구에 기초하여, PB-6042류의 구조는 하기와 같이 결정된다.

(식중 R은

또한, PB-6042류의 각 화합물은 하기와 같다.

일반식 (Ⅰ)의 항생제 PB-6042A :

일반식 (Ⅱ)의 항생제 PB-6042B :

일반식 (Ⅲ)의 항생제 PB-6042C :

일반식 (Ⅳ)의 항생제 PB-6042D :

PB-6042류의 제조

항생제 PB-6042A, B, C 및 D는 인테로박터 아글로메란스 PB-6042를 배양하여 제조한다. 항생제는 당분야에 공지된 각종 단리 및 정제방법을 사용하여 회수할 수 있다.

인테로박터 아글로데란스를 일본국 고베시 기따꾸에 위치한 강에서 얻은 물시료로부터 단리한다. 균주를 언급하기 편리하도록 인테로박터 아글로메란스 PB-6042를 PB-6042로 약칭한다. PB-6042는 부다페스트 조약하에, 일본국 이바라끼껭쓰꾸바시 히가시 1-1-3에 위치한 일본국 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업기술 연구소에 FERM BP-2549의 수탁번호로 기탁되었다(기탁일 : 1988. 8. 6).

PB-6042의 특징

1. G+C 몰% : 53.0(HPLC로 결정)

2. 형태학적 특성

PB-6042는 28℃, 육즙을 함유하는 사면 한천에서 24시간동안 성장시키고, 하기 특성을 관찰한다.

균주는 그람-음성이고, 크기 0.5∼0.7(u)×2∼5(u)의 직선간균이다. 그것은 3∼5의 페리트리코우스 편모를 가지며, 하기 육즙 브로쓰에서 활발한 운동성을 나타낸다.

3. 배양특성

i) 육즙 한천 플레이트(28℃, 3일)

대부분의 클로니는 반투명한 연회갈색의 둥근 형태이다. 클로니는 전체적으로 매끄러운 가장자리 및 반짝이는 표면을 갖는다. 클로니의 윗면은 약간 블록하게 편평하다. 몇몇 클로니는 다른 특성이 반투명한 클로니와 동일하지만 백색이고 약간 불투명한 색깔을 낸다.

즉 후술된 세포형태, 그람균주 및 생리학적 특성에 있어서는 클로니간의 어떤 차이도 발견되지 않는다. 그러나, 클로니간 운동성에 있어서는 약간의 차이가 있다. 따라서, 반고체한천 배지의 천자배양에 있어 대부분의 반투명한 클로니는 고르게 성장하여 튜브전체에 균일한 혼탁도를 형성하므로 활발한 운동성을 나타내는 반면에 약간의 불투명한 클로니는 오직 천자선 주변에서만 성장하므로 운동성이 없음을 나타내준다. 운동성에 있어서 이러한 차이로 소수 클로니는 다수 클로니의 변종으로 밝혀졌다. 기체 발생 및 가용성 색소의 생산은 양쪽 클로니 모두에게 관찰되지 않는다.

ii) 육즙 브로쓰(28℃, 2∼11일)

PB-6042는 균일한 혼탁도를 형성하면서 성장하고, 연황색침사를 형성한다. 표면에 박편의 회갈색 얇은 균막이 발견되며, 튜브벽에서는 동일한 색깔의 얇고 깨지기 쉬운 고리가 발견된다. 기체발생 및 가용성 색소의 생산은 관찰되지 않는다.

iii) 육즙 한천 사면(28℃, 2일)

사면 상층 표면의 클로니는 반투명하고 약간 연한 적황색이고 다소 축축하다. 한천 도포시 미소돌기식 성장이 관찰된다. 그것은 편평한 윗면을 가지며 가장자리가 전체적으로 파상이다. 한편, 사면의 하층 표면의 클로니는 확산식 성장으로 보이며, 표면에 연황색 돌출부위가 관찰된다. 기체발생 및 가용성 색소의 생산은 관찰되지 않는다.

iv) 육즙 젤라틴 전자배양(실온, 약 25℃, 3일)

액화가 관찰된다.

v) 리트머스 밀크(28℃, 2∼11일)

산 형성이 관찰된다. 단백질 응고 및 약간의 펩톤화가 관찰된다. 상승은 반투명 적자색이고, 하층은 붉은 크림색으로 두꺼운 응고체를 형성한다. 상기 응고체에서 발견되는 거품으로 PB-6042는 기체-생산력을 가짐을 알 수 있다. 얇은 회색 군막이 표면에 형성되며 얇은 회색고리 역시 튜브벽에서 관찰된다.

4. 생리학적 특성(28℃에서 배양)

1) 옥시다제 시험 : 음성

2) OF시험 : F형(발효형). 조건 혐기성 특성이 발견된다.

3) 카탈라제 시험 : 약간 양성

4) 질산염 환원 : 양성

상기 자료로부터 PB-6042는 그람-음성이며 직선 간균형이고 액체 배지에서 페리트리코우스 편모에 의해 활발한 운동성을 나타낸다는 점을 고려해볼때 PB-6042는 엔테로박테리아케아에(Enterobacteriaceae)에 속하는 것이라고 제안한다.

5) 탈질소화 : 음성

6) 시트레이트 이용 : 양성(심몬스 및 크리스챤센 배지)

7) 말로네이트 이용 : 양성

8) 에스쿨린의 가수분해 : 양성

9) ONPG시험 : 양성

10) H₂S의 생성 : 음성

11) 인돌 생성 : 양성

12) 우레아제 시험 : 음성

13) 보게스-프로스카우어 시험 : 양성

14) 메릴 레드 시험 : 음성

15) 아르기닌의 가수분해 : 양성

16) 라이신의 탈카르복실화 : 음성

17) 오르니틴의 탈카르복실화 : 음성

18) 데옥시리보누클레아제(DNase) 시험 : 음성

19) 트윈 80 에스테라제 시험 : 음성

20) 당으로부터의 산 및 기체생성 :

i) 아라비노스, 크실로스, 글루코스, 만니톨 및 멜리비오스로부터의 산 및 기체 생성;

ii) 프록토스, 만노스, 람노스, 이노사이트, 슈크로스 및 라피노스로부터 산은 생성하지만 기체는 생성하지 않음;

iii) 아도니톨, 둘시톨, 소르비톨, 말로스, 락토스 및 트레할로스로부터 산 및 기체 모두 생성하지 않음.

상기 특성을 이용하여 문헌 [Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology, vol. I, 1984]을 기준으로 PB-6042를 동정하여, PB-6042가 상기 제안한대로 엔테로박테리아케아에에 속한다고 결론지었다. 또한 PB-6042는 보게스-프로스카우어 시험에서 양성이고, 메틸레드시험, 데옥시리보누클레아제 시험 및 트윈 80에스테라제 시험에서 음성이며, 유일한 탄소원으로 시트레이트를 이용할 수 있다는 사실에 비추어보아 엔테로박테리아케아에중 엔테로박터 속으로 지정할 수 있다. 또한, PB-6042는 황색 클로니를 형성하고, 젤라틴 액화를 나타내며, 인돌을 생산하기 때문에 엔테로박터 속중에서도 엔테로박터 아글로메란스에 매우 가까울 것으로 여겨진다. PB-6042는 아타비노스 및 글루코스와 같은 당으로부터 산 및 기체를 생산하므로, PB-6042는 기체-생산 생물군에 속하는 것으로 밝혀진다. PB-6042가 보게스-프로스카우어반응에서 양성이며 인돌을 생산한다는 점에 비추어볼때, PB-6042를 생물군 G4로 지정할 수 있다.

형태 균주인 엔테로박터 아글로메란스 균주 ATCC 27155의 G+C몰%가 HPLC로 54.8%인 반면에, PB-6042의 G+C몰%는 상술한대로 50%인데, 이 값은 버기스 메뉴얼에 의해 한정된 53∼58%의 범위내에 있다.

상기 자료로부터, PB-6042는 엔테로박터 아글로메란스에 속하는 것이 확실하므로, 엔테로박터 PB-6042로 명명한다.

본 발명의 항생체 PB-6042A, B, C 및 D는 엔테로박터 아글로메란스 PB-6042로부터 통상적인 방법으로 수득할 수 있다. 간단히, 엔테로박터 아글로메란스 PB-6042의 배양액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 실리카겔에서 크로마토그래피한 후, 항생제 PB-6042A, B, C 및 D를 역상 HPLC에 의해 각각 단리한다. 이렇게 수득된 항생제는 지용성이며 산성 화합물이다.

PB-6042류의 항세균 활성

PB-6042A, B, C 및 D는 혐기성 세균의 성장을 선택적으로 억제한다. 표 3은 각종 혐기성 세균에 대한 PB-6042류의 최소억제농도(MIC)를 요약한 것이다. 혐기성 세균에 대한 본 발명 PB-6042류의 MIC는 1.56∼12.5ug/ml의 범위이다.

표 4는 각종 호기성 세균에 대한 PB-6042A, B, C 및 D의 MIC를 요약한 것이다.

본 발명 PB-6042류의 항세균 활성의 한가지 중요한 국면은 PB-6042류가 그람-양성 및 그람-음성 혐기성 세균 모두에 항세균 활성에 나타내며, 오직 몇몇 그람-양성 호기성 세균에 대해서만 약한 활성을 나타낸다는 사실과 관련된 것이다. 이 특징은 임상적용에서 매우 유용하며 바람직하다.

PB-6042류를 바실루스 sp. ATCC 21206을 사용하는 흡수-억제 시험에 의해 항세균 기작에 대해 조사하여, 항세균 활성에 원형질막 형성의 억제가 관여한다는 사실을 밝혔다.

본 발명 항생제는 20∼40ug/ml의 농도에서 콜라겐으로 인한 혈소판 응집억제작용 및 종양세포에 대한 세포독성 활성을 갖는다는 점이 입증되었다.

하기 실시예 및 참고예는 단지 본 발명을 더 상세히 설명하기 위해 제공된 것으로서 본 발명의 범주가 단지 하기 실시예로 구성된 것이라고 여겨서는 안 된다.

[실시예]

항생제 PB-6042A, B, C 및 D의 제조

A. 발효

PB-6042(엔테로박터 아글로멘란스 균주)의 세포 현탁액을 50ℓ 쟈르 발효기내 1.0%글루코스, 0.5%효모추출액 및 0.7% CaCO₃를 함유하는 15ℓ의 배지(pH7.0)에 접종시킨다. 그런후 배지를, 32℃에서 2일동안 450∼600rpm에서 교반하고, 0.3∼1.0vvm으로 통기시키며, 내부 압력을 0.35kg/㎤으로 유지하면서 보온한다.

분석을 위해 클로스트리디움 디피실레 ATCC 17857을 사용한다.

B. 관리 및 정제

상기 A에 기술된대로 제조된 32.5ℓ의 배양 브로쓰에, 6kg의 NaCl 및 10ℓ의 에틸아세테이트를 가한다. 혼합물을 HCl을 사용하여 pH4.0으로 조정하고, 30분동안 교반한 후 웨스트페리아 세퍼레이트(Westfaria Separator) TA-1로 원심분리한다. 에틸 아세테이트 상을 분리하고, 2%NaHCO₃(pH8.6) 및 물 순으로 세척한후 용매를 증발시킨다. 24g의 생성 오일 잔류물을 50ml의 클로로포름/메탄올(7 : 3)에 용해시키고, 실리카겔(Silicagel 60, 3.6×40cm, 407ml)상에서 용리액으로 클로로포름/메탄올(9 : 1)을 사용하여 크로마토그래피한다. 용출 분획은 클로스트리디올 디피실레-플레이트 분석법을 사용하여 분석한다. 포지티브 분획을 합하고 용매를 증발시킨다. 잔류물을 석유 에테르와 혼합하여 생성물을 침점물로 수득한다. 생성물을 다시 에틸아세테이트/메탄올(8 : 2)에 다시 용해시키고, 실리카겔(Merck Silicagel 60, 3.6×40cm, 407ml)상에서 용리액으로 에틸아세테이트를 사용하여 크로마토그래피시킨다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 용매를 증발시킨다. 그런후, 잔류물에 석유 에테르를 흡수시켜 1.6g의 생성물을 침전물로 수득한다.

생성물은 20ml의 클로로포름/메탄올(9 : 1)에 용해시키고, 실리카겔(Merck Silicagel 60, 3.6×40cm, 407ml)상에서 용리액으로 우선 클로로포름 및 그후에 클로로포름/메탄올(9 : 1)을 사용하여 크로마토그래피시킨다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 용매를 증발시킨다. 잔류물을 석유 에테르와 혼합하여 1.03g의 생성물을 침전물로 수득한다. 생성물은 제조 HPLC(Nucleosil 10C₁₈컬럼(2.0×25cm))하는데, 10mg의 생성물을 메탄올에 용해시켜 한번 주입하고 48%아세토니트릴/50mM PBS pH7.5, 50mM Na₂SO₄로 용출시키고, 260nm에서 기록하여, PB-6042A, PB-6042B, PB-6042C 및 PB-6042D를 각각 함유하는 900ml. 900ml, 1150ml 및 740ml의 분획을 수집한다. 이 분획을 각각 증발시키고, 에틸아세테이트로 추출하고, 물로 세척한 후, 황산나트륨에서 건조시키고 용매를 증발시킨다. 잔류물을 석유 에테르와 혼합하여, 115mg의 PB-6042A, 92mg의 PB-6042B, 74mg의 PB-6042C 및 24mg의 PB-6042D를 나트륨염 형태의 분말상으로 수득한다.

(참고예 1)

PB-6042A의 환원

50mg의 PB-6042A 나트륨염을 8ml의 메탄올에 용해시키고, 수소 대기하, 35mg의 PtO₂의 존재하에서 2시간동안 수소화시킨다. 촉매를 여과한후, 여액을 농축시키고, 제조 박막크로마토그래피(6실리카겔 플레이트(250u), 에틸아세테이트/메탄올(9 : 1)시킨다. Rf값 0.24위치의 겔을 클로로포름을 추출하고, 추출액을 증발시킨다. 그런 후 잔류물을 에틸아세테이트 및 물은 NaHCO₃용액에 분배시키고, 에틸아세테이트상을 물로 세척하고 황산나트륨에서 건조시킨후 증발시킨다. 잔류물에 석유 에테르를 가하여 침전시킴으로써 22mg의 목적 생성물을 수득한다.

(참고예 2)

환원 PB-6042A의 메틸화

60mg의 PB-6042A나트륨염을 8ml의 메탄올에 용해시키고, 수소대기하에서 30mg의 PtO₂로 35분동안 수소화시킨다. 반응 혼합물을 참고예 1에 기재된 방법에 따라 처리하고, 겔은 클로로포름/메탄올(1 : 1)로 추출한후, 추출액을 증발시킨다. 잔류물을 에틸아세테이트 및 물(pH₃)에서 분배시키고, 에틸아세테이트상을 물로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시킨후 증발시킨다. CH₂N₂를 가한후 혼합물을 얼음에서 10분동안 방치하고 증발시켜, 메틸화 생성물을 수득하고, 하기 조건하에서 HPLC로 분석한다.

컬럼 : 누클레오실 5C₁₈(No.3), 2×25cm

용리액 : 60% 아세토니트릴/20mM Na₂HSO₄, ph=7.0

유속 : 15.75ml/분

챠트속도 : 0.5cm/분

OD : 254nm

보유시간 : 22.3분

보유부피 : 350ml

폴링분획(Polled fractions, 320ml)을 증발시키고, 수득 잔류물을 80ml의 에틸아세테이트로 추출하고, 물로 세척한후 황산나트륨에서 건조시키고 증발시켜, 22mg의 메틸화생성물을 수득한다.

Claims

하기 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 그의 염.
제1항의 화합물을 생산함을 특징으로 하는 엔테로박터(Enterobacter)속에 속하는 미생물.
제2항에 있어서, 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans)인 미생물.
제3항에 있어서, 엔테로박터 아글로메란스 PB-6042인 미생물.
제2, 3 또는 4항의 미생물을 적당한 배양 배치에서 배양하고, 제1항의 화합물을 단리시킴을 특징으로 하는 제1항의 화합물의 제조방법.