KR960011375B1

KR960011375B1 - 합성에 의한 하이게나민(Higenamine)의 제법과 이를 함유한 혈전증 및 내독소 쇼크 억제제

Info

Publication number: KR960011375B1
Application number: KR1019930006972A
Authority: KR
Inventors: 윤혜숙
Original assignee: 윤혜숙
Priority date: 1993-04-26
Filing date: 1993-04-26
Publication date: 1996-08-22

Abstract

내용 없음.

Description

합성에 의한 하이게나민(Higenamine)의 제법과 이를 함유한 혈전증 및 내독소 쇼크 억제제

본 발명은 하이게나민(Higenamine)의 합성법 및 그 용도, 즉 혈전증 및 내독소 쇼크 억제에 관한 것이다.

하이게나민은 이소퀴놀린(Isoquinoline)계 알카로이드(alkaroid)로서 중요한 전통약물의 하나인 부자(Aconite root)로부터 강심작용 성분으로서 분리되었으며, 세신(Asiasarum root) 및 아노나 스쿠아모사(Annona squamosa)로부터도 분리되었고, 넬룸보 누시페라(Nelumbo nucifera)의 베아로부터는 광학 이성체인 R-(+)-하이게나민이 분리되어서 보고된 바 있다.

하이게나민은 코수게(kosuge)와 요코타(Yokota)에 의하여 부자의 강심작용 성분물질로서 보고된 이래, 각종 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)실험을 통하여 그 작용기전에 관한 연구가 이루어졌으며, 아드레나린 β수용체에 비선택적으로 작용하므로 아데닐 사이클라제(adenyl cyclase) 활성도는 높여주며, C-AMP(adenosine monophosphate) 농도를 증가시키고, 칼슘이온(C²⁺)의 세포내 유입을 증가시키는 등의 작용에 의하여 심근 수축력 및 심박동수 증강작용, 심박출량 증가작용, 혈압강하, 전신저항 감소작용등을 나타내나 정맥주사시 그 작용시간은 5~8분으로 매우 짧은 것으로 보고되었고, 혈중농도 또한 급격히 저하되었으며, 또한 혈중 C-AMP농도를 증가시키고 혈소판응집억제작용을 가짐이 알려져 있다.

그러나 종래의 하이게나민의 합성법은 β-(3-4-디메톡시페닐)에틸아민(β-(3,4-Dimethoxyphenyl)ethylamine)과 4-메톡시페닐아세트산(4-methoxyphenylacetic acid)으로부터 N-3',4'-디멕톡시페닐에틸-4-메톡시페닐아세트아미드(N-(3',4'-dimethoxyphenylethyl)-4-methoxyphenylacetamide)를 얻어, 이에 POCl₃을 사용하여 반응시켜 1-(4'-메톡시벤질-6,7-디메톡시-3,4-디하이드로이소퀴놀린염산염(1-(4'-methoxybenzyl-6,7-dimethoxy-3,4-dihydroisoquinoline hydrochloride)(3)을 얻는 방법을 사용하여 이에 NaBH₄(sodium borohydride)반응으로 얻어진 생성물을 AcOH(acetic acid)와 BHr혼합액과 환류하여 하이게나민을 얻는 제법이 있었다.

그런데 이 3,4-디하이드로이소퀴놀린을 얻기 위해 POCl₃를 상요할 때에 고체와 액체와 뒤섞여진 상태로 반응을 진행하기 때문에 반응하는 동안 계속 기계적으로 교반하여 반응을 진행시켜야 하는 번거러움과, 수율과 순도도 바람직하지 못한 폐단과 단점이 있었다.

이에 본 발명은 POCl₃대신 PCl₅를 사용하여 용액상으로 반응토록하여 반응의 원활과 수율 및 순도의 증가를 기할 수 있는 방법으로 개선하였으며, 또한 이 하이게나민과 혈소판 혈장(PRP, platelet rich plasma)을 일정시간 배양할 때, 하이게나민에 의한 혈소판 응집억제작용이 증가함을 발견하였고, 혈전증 및 내독소 쇼크 모델에 이를 투여하여 치료할 수 있음을 처음으로 규명하여 강심작용외에 혈전등 및 내독소 쇼크억제작용을 발명한 것이다.

본 발명에서 하이게나민의 합성방법에 대하여 약술하면, β-(3,4-디메톡시페닐)에틸아민과 4-메톡시페닐아세트산을 반응시켜 N-(3′,4′-디메톡시페닐에틸)-4-메톡시페닐아세트아미드를 얻고, 여기에 PCl₅를 작용시켜 1-(4′-메톡시벤질)-6,7-디메톡시-3,4-디하이드로이소퀴놀린 염산염을 합성하고, 위의 물질를 NaBH₄로 환원하여 1-(4'-메톡시벤질)-6,7-디메톡시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린염산염(1-4'-methoxybenzyl)-6,7-dime-thoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolinehydrochloride)을 얻은 뒤, 아세트산과 HBr 혼합물로서 탈메틸화시켜 하이게나민을 얻는 것으로 반응식을 도시하면 아래와 같다.

상기 구조식에서 Me는 메틸기이고, AcOH는 초산(acetic acid)이다.

실시예 1

먼저 본 발명에서 사용되는 실험기기 및 시약등을 설명드리면, 실험기기중 핵자기공명측정기(NMR)는 바리안(Varian) FT-80A, 자외선 분광광도계(IR)은 페르킨-엘머(Perkin-Elmer)283, 원심분리기는 솔바(Sorvall) RT-6000, 혈소판 측정기(Whole blood platelet analyzer)는 텍사스 인터내셔날 실험실(Texas International Lab.) PLT-4, 혈소판 응집측정기(Whole blood platele aggregometer)는 크로노-로그(Chrono-Log)500VS를 사용하였으며, 시약은 알드리치 케미칼(주)(Aldrich Chem. CO.,), 시그마케미칼(주)(Sigma Chem. Co.,) 및 크로노-로구(주)(Chrono-Log Corp)로부터 구입하여 사용하였다.

우선 β-(3′,4′-디메톡시페닐)에틸아민 (9.1g, 0.05몰)을 80㎖의 톨루엔(toluene)에 녹이고 4-메톡시페닐아세트산(8.3g, 0.05몰)을 가산 후 반응액을 약 72시간 환류시키면서 가열하였다.

이때 딘-스타트 트랩(Dean-Stark trap)을 연결하여 생성되는 H₂O를 제거하여 반응을 촉진시켰다. 반응액을 냉각시킨 후 감압하에서 용매를 제거하고 얻어진 고체는 CH₂Cl₂에녹였다.

CH₂Cl₂용액은 d-HCl 및 H₂O로 씻어주고 무수의 Na₂CO₄로 제습한 후 감압하에서 용매를 제거하고, 얻어진 물질은 에탄올(EtoH)로 재결정하여 N-(3′,4′-디메톡시페닐에틸)-4-메톡시페닐아세트아미드(13.2g, 수율 80%)를 얻을 수 있었다. (m.p. 122~123℃) 상기 구조식(2)의 물질.

그런 후 PCl₅2.7g(0.013몰)을 CHCl₃10㎖에 녹이고, CaCl₂튜브로 습기유입을 방지한 반응용기냉에서 위에서 합성한 아미드(2) 3.17g(0.01몰)을 CHCl₃15㎖에 녹인 용액을 아이스 배스(ice bath)로 냉각시킨면서 서서히 가해주고 약 16시간 실온에서 저어주어 반응을 완결시켰다. 에테르(Ether) 약 30㎖를 반응액에 혼탁하여 질때까지 가하고 냉장고에 하루밤 방치한 후, 여과하여 반응생성물을 얻었다. 여액에 다시 약 20㎖의 에테르를 가하고 냉장고에 방치한 후, 여과하여 얻은 반응생성물은 앞에서 얻은 물질과 합하여 에탄올로 재결정하여 1-(4′-메톡시벤질)-6,7-디메톡시-3,4-디하이드로이소퀴놀린연산염(3.11g, 수율 93%)을 얻을 수 있었다.(m.p. 146~150℃) 상기 구조식(3)의 물질

이 3,4-디하이드로이소퀴놀린염산염(3) 3.1g(0.01몰)을 에탄올 30㎖에 녹이고 냉각시키면서 NaBH₄(sodium borohydride)(0.8g)의 에탄올 용액 30㎖를 서서히 가하여 반응시키고 상법에 의하여 처리한 후 CHCl₃로 추출하였다.

c-ECl수방울을 가하여 용매를 증류한 후 iPrOH로 재결정하여 1-(4′-메톡시벤질)-6,7-디메톡시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린염산염(3.3g, 수율 93%)을 얻을 수 있었다. (m.p. 188~190℃) 상기 구조식(4)의 물질.

그런 뒤, 위의 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 염산염(4) 3.5g(0.01몰)을 초산(10㎖)과 47% HBr(7.5㎖)의 혼합액과 약 4시간 환류시키면서 가열하였다. 반응액을 냉각시킨 후 여과하여 결정을 얻었으며, iPrOH로 씻고 MeOH로 재결정하여 하이게나민(1), 브롬산염(2.9g, 수율82%)을 얻을 수 있었다. 상기 구조식(1)의 본 발명 생성물질.

위에서와 같은 방법으로 생성된 하이게나민은 1위치에 치환기가 있는 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린핵을 가지며, 강력한 혈소판 응집 억제작용을 가진 트리메토퀴놀(trimethoquinol)과 구조적으로 매우 유사하며, 또한 하이게나민은 상기한 바와 같이 혈소판 응집에 대해 억제작용을 가진다는 등에서 착안하여, 본 발명은 혈소판은 하이게나민과 배양할 때 응집에 관한 연구를 하였던바, 혈소판응집억제작용을 확인할 수 있었고, 따라서 혈전증 및 내독소 쇼크 억제작용을 함을 규명할 수 있었다.

즉, 하이게나민과 혈소판을 배양할 때 응집에 미치는 영향을 검색하기 위해, 흰쥐의 혈소판혈장을 하이게나민(0.5㎎/㎖)과 3~30분간 배양할 때 ADP(adenosine diphosphate)에 의한 혈소판 응집에는 영향이 없었으나, 배양시간이 길어짐에 따라 콜라겐(collagen)에 의하여 유도되는 혈소판 응집억제작용이 증가됨을 알게 되었다.

따라서, 이에 대해 상세히 설명하면 다음과 같다.

하이게나민의 혈소판응집억제작용, 항혈전 및 내독소 쇼크억제작용을 하기 실시예의 실험을 통해 알 수 있었다.

실시예 2

혈소판응집억제작용 검색

스프라구 달리(Sprague Dawley)계 옹성 흰쥐(체중, 200±20g)를 CHCl₃로 마취시킨 후 2.2% 트리소디움시트레이트(trisodium citrate)(1볼륨(volume))를 넣은 플라스틱 주사기를 이용하여 심장으로부터 혈액(9 볼륨)을 채취하고 200×g에서 10분간 원심분리하여 상층액 혈소판 혈장(PRP, Plaelet Rich Plasma)을 얻고 남은 층은 700×g에서 30분간 다시 원심분리하여 혈소판 제거 혈장(PPP, Platelet Poor Plasma)을 얻었다.

그후 혈소판측정계를 이용하여 PRP의 혈소판 수를 세고 생리식염수로 희석하여 혈소판수를 400~450×10⁶/㎖으로 맞추었다. 그리고, 혈소판 응집측정기를 이용하여 PRP(0.45㎖)를 0.05㎖ 하이게나민의 생리식염수용액(5㎎/㎖)과 일정시간 37℃에서 배양한 후 ADP 또는 콜라겐 용액을 넣고 1000rpm으로 교반하면서 37℃에서 배양을 계속하여 혼탁도의 변화로서 혈소판 응집정도를 판정하였으며, ADP 및 콜라겐의 최종 농도는 각각 2~3×10^-6g/㎖ 및 6~10×10^-6g/㎖로서 각 PRP가 최고응집을 일으키는 농도에서 실험하여 각 시료의 응집억제도를 %로서 구하였다.

그 결과는 아래 표 1과 같다.

(주) 하이게나민 0.5㎎/㎖(최종농도)에 의한 억제 %

마우스를 이용한 항혈전작용 검색

마우스에 콜라겐과 에피네프린(epinephrine)의 혼합용액을 정맥주사할 때 폐동맥내에 혈전이 형성되고, 이에 의하여 폐동맥이 폐쇄됨으로 1분이내에 대부분의 마우스가 마비되어 움직이지 못하게 되고, 동공이 커지며, 호흡이 곤란하게 되고, 경련이 뒤따르며 5분 이내에 약 70%의 마우스가 사망하고 나머지도 15분 이상 마비가 계속된다.

그러므로 마우스에 하이게나민을 경구투여한 후, 콜라겐과 에피네프린의 혼합용액을 정맥주사하였을 때 위와 같은 혈전증상이 경감되는가를 관찰하였다.

미리 약 3시간 절식시킨 마우스(ICR계, 체중 20±2g)에 에피네프린 혼합용액(900㎍콜라겐+90㎍ 에피네프린/10㎖ 생리식염수/㎏)을 꼬리정맥에 주사한 후 15분간 마비의 지속, 사망 또는 마비로부터의 회복 여부를 관찰하여 시료의항혈전 효과를 판정하였다.

그 결과 콜라겐과 에피네프린의 혼합용액만을 정맥주사하였을 때 5분 이내에 78.9%가 사망하였으며, 15분이내에 회복된 마우스는 없는 반면, 하이게나민 50㎎/㎏ 투여후 1시간 또는 2시간에 주사하였을 때, 주사 후 6분 이내에 23~25%가 회복되어 자유로이 움직였으며, 15분 이내에 41~43%가 회복되었고, 5분 이내에 사망률은 47~50%로서 혈전증상이 상당히 경감되었음을 알 수 있었다. 또 3시간에 주사하였을 때 주사후 6분 이내에 5.9%가 회복되어 자유로이 움직였으며, 15분 이내에 29.4%가 회복되었고, 5분 이내에 52.9%가 사망하여 대조군보다는 증상이 경감되었으나, 하이게나민의 혈전증상 억제효과가 투여후 1시간 또는 2시간 보다 낮음을 보였다.

이 결과를 표로 도시하면 다음과 같다.

(주) 대조군에게는 생리식염수를 혈전유도약물 투여 1시간전에 투여하고, 하이게나민은 혈전유도약물 투여전에 각각 다른 시간별로 투여되었다.

한편 하이게나민의 투여량을 변화하였던 바, 표(3)과 같은 결과를 얻었다.

(주) 하이게나민이나 아스피린(대조군에는 생리식염수)은 혈전유도약물 투여 1시간전에 투여되었다.

마우스를 이용한 내독소 쇼크억제작용

그람 음성균 외피의 지질성분인 리포폴리사카라이드(Lipo polysaccharide, LPS)는 혈전형성, 혈관폐쇄, 급격한 혈압강하 등을 동반하는 파종성 혈관내 응고(DIC, Disseminated Intravascular Coagulation) 및 이에 따르는 내독소 쇼크등을 유발하는 강력한 독소이다. 미리 약 3시간 절식시킨 마우스

하이게나민의 급성독성

1)경구투여시 : LD₅₀1g/㎏

2)복강내 투여시 : LD₅₀400㎎/㎏

3)정맥주사시 : LD₅₀=약 90㎎/㎏

본 발명은 제조방법에서 PCl₅를 사용하여 1-(4′-메톡시벤질)-6,7-디메톡시-3,4-디하이드로이소퀴놀린염산염 합성시에 반응을 균질한 상태로서 진행시킬 수 있어 높은 수율과 순도로 하이게나민을 얻을 수 있었고, 뿐만 아니라, 이 생성된 하이게나민은 혈소판 응집 억제작용을 가짐은 물론, 마우스의 혈전증 및 내독소 쇼크를 효과적으로 억제하는 등의 새로운 작용 효과를 가짐을 발명하였다.

따라서 이 하이게나민과 약학적으로 허용되는 첨가제등으로 되는 주사제, 액제, 정제, 환제를 제제화가 용이하며 혈전증 및 내독소 쇼크억제제로 제조될 수 있다.

Claims

하기 반응구조식(1)으로 표시되는 하이게나민(Higenamine)의 제조방법에 있어서, PCl₅를 CHCl₃에 녹이고 습기유입을 방지하는 반응용기내에서 냉각하면서 반응구조식(2)으로 표시되는

생산함을 특징으로 하는 하이게나민의 제조방법.

상기 구조식에서 Me는 메틸기이고, AcOH는 초산(acetic acid)이다.
제1항에 있어서, 생성된 하이게나민과 약학적으로 허용되는 첨가제로된 혈전증 및 내독소 쇼크억제제.