KR930000164B1

KR930000164B1 - 프리마이신 성분 및 항생물질 복합체의 분리방법

Info

Publication number: KR930000164B1
Application number: KR1019860700058A
Authority: KR
Inventors: 스질라기 임르스 닥터; 기율라 데카니; 프란크 유디트 닥터.; 호르바쓰 가보르 닥터.; 가보르 닥터.쿨르짜르
Original assignee: 치노인 교기스져 에스 베게스제티 테르메케크 기야라 알티.; 기율라 스주크,타마스 스주츠
Priority date: 1984-05-31
Filing date: 1985-05-31
Publication date: 1993-01-11
Also published as: EP0182851A1; ATE92498T1; CA1274508A; FI80046B; FI860426A; KR860700121A; DE3587499T2; DK46086A; FI860426A0; DK46086D0; US4873348A; WO1985005621A1; IL75357A; EP0182851B1; DE3587499D1; US5093359A; FI80046C; IL75357A0

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

프리마이신 성분 및 항생물질 복합체의 분리방법

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 프리마이신 혼합물을 분리하여 얻은 프리마이신의 여러성분들 그리고 이들 성분들을 항생물질 복합체로부터 분리해내는 공정에 관한 것이다. 아울러 본 발명은 이들 성분들을 함유하면서 상승작용을 가지는 약학성분 및 그 제조방법을 포함한다.

[공지기술]

프리마이신 항생물질 복합체는 스트렙토마이세테종에 속하는 터모폴리스포라 갈러리엔시스 균종을 배양시켜 얻을 수 있는데, 발효에 의한 제조방법이 항가리특허 명세서 제153,593호에 기술되어 있다.

프리마이신은 마크로라이드 타입의 항생물질로서 그 특성은 기존문헌(J. Chem. Soc., Perkin I. Page 816, 1974)에 단일 구조식 ; [5-(18-(α-D-아라비노푸라노실옥시)-2-부틸-3,7,11,15,19,21,23,25,27-노나하이드록시-4,16,32,34-테트라메틸-1-옥소-옥사사이클로헥사트리콘타-16,32-디엔-35-일)-4-하이드록시헥실]-쿠아니디늄 설페이트로 기술되어 있다.

프리마이신은 널리 사용될 수 있는 매우 효과적인 항생물질로서 첫째 그람양성 박테리아들에 대해 효과적일 뿐만 아니라, 다중 내성 인체 병원종에도 효과적이다. 이 물질에 대한 내성은 아직 발견되지 않았다.

앞의 실험에서, 발효로 얻은 피리마이신이 균질물질이 아니라는 사실을 밝혔다. 최근 개발된 크로마토그라피에 의해 프리마이신 혼합물질을 좀더 정밀한 검사에 사용할 수 있다.

[발명의 상세한 설명]

발효로 얻은 프리마이신은 3가지 주성분과 6가지 부성분으로 이루어져 있는데 이들 성분들의 정성적이고 소량 제조 분리에 본 발명이 적합하다는 사실이 밝혀졌다. 특히 더군다나 성분들이 상호의 작용을 증진시키는 즉, 상승작용을 갖는다는 사실이 밝혀졌다.

본 발명에서는 티모폴리스포라 갈러리엔시스 균종에서 얻은 항생물질 복합체의 여러 성분들을 분리해내는 노력을 기울였다. 여러 크로마토그라피법을 검사해본 바에 의하면 박층 크로마토그라피와 칼럼 크로마토그라피가 전술한 목적에 가장 효율적인 것으로 나타났다.

박층 크로마토그라피(TLC)사용시에 실리카겔 흡착매층을 입힌 상업적 크로마토 착색판을 사용한 연후 적당한 용매군으로 고성능 박층 크로마토 착색판을 사용하여 매우 높은 분해능으로 성분들을 분리하였다.

본 발명의 바람직한 실제 공정에서, 터모폴리스포라 갈러리엔시스 균종의 균사체에서 얻은 지방이 제거되고 조야한 약간 불순한 또는 순수한 생성물의 저장용액을 개발된 TLC크로마토 착색판 위로 진입시키고, 착색 하여 나타난 반점들을 검출하여 항생물질 복합체의 주성분 그리고/또는 부성분을 분리해낸다.

배양기에서 회수한 조야한 약간 불순한 또는 순수한 생성물의 저장 용액을 제조하기 위하여 탄소수 1-4개의 알코올 수용액 또는 에탄올 : 노말-부탄올 : 물이 바람직하게는 25 : 25 : 50의 부피비로 섞인 혼합액이 사용된다. 위의 혼합액을 사용하여 0.5-1%(W/V)의 용액을 제조하여 500-100㎍의 물질을 크로마토 착색판에 집입시킨다.

최초의 실험에서는 상업적인 실리카겔 크로마토 착색판 타입 규조토겔 60F₂₅₄(크기 : 20×20cm, 실리카겔층의 두께 : 0.2mm)을 사용하였다. 프리마이신 혼합물을 최상으로 분리하기 위하여 이 착색판에 대해 여러 혼합용매를 검사해보았다.

용출매가 할로겐화 탄화수소(s), 유기산(s), 알콜(s), 물 바람직하게는 알데히드(s)를 포함할때 최상의 분리가 이루어졌다.

다음의 용매들이 용출매로써 사용될 수 있다 : 할로겐화 지방족 탄화수소(예들들면 클로로포름, 디클로로메탄), 유기산, 바람직하게는 탄소수 1-4의 지방족 카르본산(예를들면, 개미산, 아세트산), 할로겐화 지방족 카르본산(예를들면, 모노클로로-, 디클로로- 그리고 트리클로로 아세트산, 트리플루오로아세트산), 방향족 카르본산(예를들면, 안식향산), 유기설폰산(예를들면, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산), 알코올, 바람직하게는 탄소수 1-10의 지방족 직쇄 또는 측쇄 알코올(예를들면, 메탄올, 에탄올, 노말-부탄올, 이소프로판올), 알데히드, 바람직하게는 탄소수 1-4의 지방족 알데히드(예를들면 36%이 포름알데히드) 또는 수용성 혼합물.

프리마이신 항생물질 복합체의 성분을 분리하는 데에는 다음의 용매군들이 가장 효율적인 것으로 나타났다 :

Ⅰ. 노말-부탄올, 빙초산과 물이 60 : 10 : 30의 비율로 섞인 혼합액의 상층,

Ⅱ. 노말-부탄올, 메탄올, 빙초산과 물이 75 : 2 : 8 : 15의 비율로 섞인 혼합액,

Ⅲ. 클로로포름, 메탄올, 빙초산과 물이 45 : 30 : 15 : 20의 비율로 섞인 혼합액,

Ⅳ. 클로로포름, 메탄올, 개미산과 물이 50 : 35 : 14 : 1의 비율로 섞인 혼합액,

Ⅴ. 클로로포름, 메탄올, 개미산, 물, 포름알데히드와 노말-부탄올이 130 : 53 : 6 : 9 : 3 : 3의 비율로 섞인 혼합액,

Ⅵ. 클로로포름, 메탄올, 개미산, 물, 포름알데히드와 노말-부탄올이 160 : 53 : 6 : 9 : 3 : 3의 비율로 섞인 혼합액,

Ⅶ. 클로로포름, 메탄올, 물, 포름알데히드와 노말-부탄올이 125 : 53 : 9 : 3 : 3의 비율로 섞인 혼합액에 모노클로로아세트산이 무게비로 15% 녹아있는 용액,

Ⅷ. 용매군 Ⅲ, 클로로포름과 메탄올이 15 : 2 : 1로 섞여있는 혼합액,

혼합용매 Ⅰ과 Ⅱ는 더 높은 효능을 갖는 것에 반하여 혼합용매 Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ 그리고 Ⅷ은 더욱 선택적이고, 특히 착색시간이 더 짧아져 공업적인 연속 검사에 바람직하다. 용매군 Ⅳ, Ⅴ와 Ⅵ은 개미산 메틸의 형성때문에 화학적으로 준 안정성을 지닌 반면 용매 Ⅲ은 물리적으로 준 안정성을 갖는다. 등은 곡선에 의하면 용매군 Ⅳ는 제조로부터 16-24시간 이내에 사용될 수 있고 용매군 Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ과 Ⅷ은 성분들을 각각에 더한 후 즉시 쓰일 수 있는 반면에 용매군 Ⅲ은 1∼2%의 메탄올이 첨가되면 1주일 동안 보존될 수 있다. 용매군 Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ과 Ⅷ이 바람직하다. 용출매 Ⅳ에서는 항생물질 복합체의 여러 성분들의 R_f값이 매우 비슷하기 때문에 적당한 분리를 얻으려면 착색을 2회 행하여야 하는데 반해서, 용매군 Ⅴ, Ⅵ 또는 Ⅶ을 사용할때에는 단 한번의 착색으로도 적당하게 분리할 수 있다. 가장 바람직한 용매군은 Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ 그리고 Ⅷ이다. 용매 Ⅴ는 박층 크로마토그라피의 표준 크로마토 착색판에 사용될 수 있고, 용출매 Ⅵ은 HPTLC판에 사용될 수 있다. 용매군 Ⅶ은 침투 착색판에 적당하며, 혼합용매 Ⅷ은 바람직하게는 로바-칼럼에 사용된다.

박층 크로마토그라피에 의해 분리된 프리마이신 혼합물의 성분들은 화학적 방법 그리고/또는 바이오오토그라피를 사용하여 검출할 수 있다.

화학적 검출에는 기존 문헌에 기술된 황산산성 바닐린, 클로로 톨루이딘, 인몰리브덴산, 벤지딘, 변법 사까구찌시약 그리고/또는 황산화에탄올 그리고/또는 열처리가 가장 효과적이며, 특유한 성질과 색에 민감한 반응을 제공한다. 반점의 위치는 바람직하게는 착색판을 적당한 시약에 침투시켜서 찾아낼 수 있으며, 건조시킨 후 어떤 경우에는 Shimadzu비중계를 사용하여 크로마토그람을 증발시킬 수 있다.

바이오오토그라피 착색법은 다음과 같이 행한다 :

박층 크로마토그라피 착색과 화학적 검출이 끝난 후 착색판을 반점의 옆에서 수직하게 따로 잘라낸다. 우선 배지판을 마련하여 이에 바칠루스 섭틸리스 ATCC 6633을 접종시킨다. 반점을 반대편에 표시하고 잘라진 띠를 배지판에 압착시키거나 또는 띠를 수직하게 2조각으로 잘라 1조각을 배지판에 압착시킨다. 다음 이 배지판을 37℃에서 20-24시간 동안 배양시킨다. 항온조로부터 들어올려보면 박테리아가 번식하지 못한 반점이 잘 관찰된다. 온전한 띠가 사용되었을 경우엔 띠의 반대편에 표시된 것에 의거하여서, 2조각으로 잘랐을 경우엔 다른 한 조각에 의거하여 박테리아 증식이 억제된 반점을 확인할 수 있다.

이상의 처치를 설명하기 위해서 용매군 Ⅳ로 2회 착색시켜 얻은 박층크로마토착색판을 그림 1에 도시하였다. 여러가지 배양기에서 배양시킨 프리마이신 견본을 착색시켜 얻은 여러 반점들(반점 1-4)로부터 프리마이신이 혼합물이라는 사실을 알 수 있다. 복합체의 분리된 주성분 A₁,B₁과 C₁그리고 바이오오토그람이 또한 그림에 나타나 있다.

프리마이신 혼합물을 용매군 Ⅴ로 1회 착색하면 괄호안의 R_f값에 의해 특성지워지는 다음의 성분들이 분리된다. A₁(0.29), A₂(0.31), A₃(0.33), C₁(0.35), C₂(0.37), C₃(0.39), B₁(0.54), B₂(0.56), B₃(0.58). 확인되지 않은 다른 부성분들도 추적될 수 있으며, 이 크로마토그람은 그림 2에 도시하였다. HPTLC착색판을 사용하면 분리효율을 증진시킬 수 있다. 적당하게 분리시키기 위해서 용해군 Ⅵ을 용출매로 사용한다.

사용하기가 어렵과 값비싼 HPTLC착색판 대신으로 적당한 금속염을 침투시킨 규조토겔 60F₂₅₄착색판을 사용하면 비슷한 정도로 훌륭하게 분리시킬 수 있다. 침투는 착색판을 수용성 그리고/또는 유기용매, 예를들면 금속염의 아세토니트릴 용액에 침투시켜서 이루어지는데 20% 수용액을 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 질산은과 같은 은염, 인산철(Ⅱ)과 같은 철염등이 금속염으로써 사용될 수 있다. 침투층의 표면 습기를 건조 제거한 후 착색판을 광선이 배제된 상태에서 1시간 동안 120℃에서 활성화시킨다. 크로마토그람을 착색하는데에 있어 용매군 Ⅴ와 Ⅵ도 매우 유용하지만 용매군 Ⅶ을 사용할 경우에 분리가 가장 잘 일어난다. 이 용매군에서 분리 효율이 매우 증진되는 것은 각 성분들이 Rf값 차이가 증가하는데에 기인한다.

프리마이신은 3가지 주성분들(A₁, B₁, C₁)과 더 많은 부성분들로 이루어졌음이 밝혀졌다.

각각의 성분들은 용해도 상태에 따라 함께 결정을 이룬다. 발효조건(자양기, 배양시간과 온도, 환기정도 등)이 변화함에 따라 항생물질 복합체의 1/100의 조성까지 영향받을 수 있다.

박층 크로마토그라피 용출의 장점은 프리마이신 혼합물을 칼럼 크로마토그라피 방법으로 예비 분리 처치하여 개선되었다. 분배 그리고 흡착칼럼 크로마토그라피가 검사되었다.

본 발명에서는 고체담체(세파덱스 LH-20)와 역류(Droplet Counter Current 크로마토그라피, 앞으로 DCCC라 명칭한다)를 사용하여 분배칼럼 크로마토그라피 분리를 행했다.

이 방법에서도 박층 크로마토그라피에서와 같은 용매군 즉, 유기산 그리고/또는 염소화 탄화수소 그리고/또는 탄소수 1-4의 알칸올 그리고/또는 물등이 사용될 수 있다. 용매군 Ⅰ(고정상)이 바람직한데, 여기서 고체 담체(세파덱스 LH-20)을 2일 동안 불리고 크로마토그라피 컬럼에 채워 노말-부탄올, 빙초산 그리고 물이 30 : 10 : 60의 비율로 섞인 혼합액의 아래상(이동상)으로 세척한다. 프리마이신을 이동상과 고정상이 20 : 1로 섞인 혼합액에 녹이고, 여과 유리에 여과시킨 후 칼럼에 통과시킨다. 낮은 이동상을 용출매로 이용하는데에 있어 연동 펌프와 수집기를 사용한다. 분류물의 성분과 순서를 박층 크로마토그라피로 조절하고 206nm의 자외선에서 크로마토그람을 살폅아 분리상태를 점검한다.

같은 성분의 분류물을 회합하고 진공증류하여 수율을 결정한다. 칼럼을 통과시킨 양의 90∼95%가 회수된다.

주로 주성분 A₁, B₁과 C₁을 포함하는 용출물을 크로마토그라피로 더 순도를 높인다.

성분 A₁은 용매군 Ⅰ로 크로마토그라피되었고, 성분 B₁은 벤젠, 노말-부탄올, 메탄올, 빙초산 그리고 물을 포함한 용매로부터 얻어냈음에 반해, 성분 C₁은 클로로포름, 메탄올, 빙초산 그리고 물로 이루어진 용매군을 사용한 DCCC 방법으로 분리해냈다.

프리마이신 혼합물의 성분들은 부드러운 압력하에서 적당한 실리카겔을 충전시킨 칼럼 크로마토그라피로 가장 바람직하게 분리될 수 있다. 다음의 칼럼들이 검사되었다 : 실리카겔이 채워진 실리카겔 칼럼 ; 사용채비 완료된 로바-칼럼 (Merck), 적당한 금속염이 침투된 실리카겔이 채워진 칼럼(박층 크로마토착색판과 유사).

로바-칼럼이 사용될 경우나 또는 이 칼럼이 없을 경우엔 단순한 실리카겔 대신 침투된 실리카겔로 채워진 칼럼을 사용할 경우 분리효율이 크게 증진되었다. 로바-칼럼과 침투된 겔로 채워진 칼럼의 두 경우 모두, 약간의 과도압력(1.1-5.0기압)을 걸어주면 유효했다.

침투에 있어서, 실리카겔을 적당한 금속염과 혼합하는데 바람직하게는 유기용매로 제조한 금속염 용액에 현탁시키고, 용매를 임의로 제거하면 침투된 실리카겔은 칼럼의 충전에 사용할 수 있게 된다. 칼럼을 유기용매, 바람직하게는 할로겐화 지방족 탄화수소(예를들면 클로로포름)에 현탁시킨 침투 실리카겔로 충전시키고, 약간의 과도 압력(1.1-2.5기압)을 가해 빽빽히 채운다. 은염이 금속염으로 사용될 경우엔 은염의 환원을 방지하기 위해 칼럼을 광선으로부터 차단시키는 것이 요구된다.

분리할 프리마이신 혼합물이나 1차 분리한 성분들을 칼럼의 윗 부분에 진입시키고 용출매인 혼합용매로 녹여 약간의 압력을 가해 흡착시킨다.

분리할 혼합물은 공업적 프리마이신 설페이트 또는 항가리 특히 명세서 제 254/ 84호 따라 프리마이신 설페이트로부터 제조한 바람직하게는 프리마이신 아세테이트나 프리마이신 모노클로로아세테이트등의 다른 프리마이신 염일 수 있다.

용매로서는 용매군 Ⅴ,Ⅵ,Ⅶ 그리고 Ⅷ이 사용될 수 있다. 로바 칼럼 용출에는 혼합용매 Ⅴ, Ⅵ 또는 Ⅷ등이 가장 좋고, 금속 염으로 침투된 실리카겔이 채워진 칼럼 용출에는 혼합용매 Ⅶ이 가장 바람직하다.

같은 부피의 분류물을 일정 흘림 속도로 수집하여 박층 크로마토그라피로 조절한다. 동일 한 Rf값을 가진 물질을 포함하는 분류물들을 합하여 용매 침전법으로 각각의 성분을 회수한다.

칼럼 크로마토그라피로 분리한 결과 다음의 성분들이 개별 분리되었다 :

A₁키노프리신(Rf=0.29)

A₂=미도프리신

A₃=메티프리신

C₁=옥시프리신

C₂=옥시미프리신

C₃=옥시메티프리신

B₁=하이드로프리신

B₂=하이미프리신

B₃=하이메티프리신

분리된 성분들을 검사하여 다음의 결과를 얻었다 :

1. A₁=키노프리신(Rf=0.29)

고속원자 충격 질량분광법(FAB-MS)로 측정한 분자량은 1078이다(그림 3). 박층 크로마토그라피와 FAB-MS로 분석한 결과 분리된 성분 A₁은 화학적으로 균일한 것으로 밝혀졌다. 분자량에 기초하여 IR 그리고¹H와¹³C NMR 일차원과 이차원 스펙트라로부터 결정된 구조를 구조식 Ⅰ로 나타내었다.

2. A₂=미도프리신(R_f=0.31)과 A₃=메티프리신(R_f=0.33)분자량(FAB-HS) : 1092와 1106. 분자량에 기초하여 화학적방법 그리고¹H와¹³C NMR 일차원과 이차원의 분광학 방법으로 분석하였다. 성분 A₂와 A₃는 성분 A₁의 동족체로서 A₂의 측쇄는 메틸렌기만큼 A₃의 측쇄는 에틸렌기만큼 A₁의 측쇄보다 길다는 사실이 밝혀졌다.

3. C₁=옥시프리신(R_f=0.35)

분자량 : 946(FAB-HS)

전술한 분석법으로 밝혀낸 화합물 C₁의 구조를 다음구조식 Ⅱ로 나타내었다.

성분 C₁과 A₁의 차이는 당부분 대신에 하이드록시기가 18위치의 탄소에 결합되었다는 점이다.

4. C₂=옥시미프리신(R_f=0.37)과 C₃=옥시메티프리신(R_f=0.39)

분자량(FAB-MS) : 960과 974.

전술한 분석법으로부터 성분 C₂의 측쇄는 메틸렌기만큼 C₃의 측쇄는 에틸렌기만큼 C₁의 측쇄보다 길다는 사실이 밝혀졌다.

5. B₁=하이드로프리신(R_f=0.54)

분자량(FAB-MS) : 930

전술한 분석법으로 밝혀진 화합물의 구조를 구조식 Ⅲ으로 나타내었다.

상기식을 보면, 당부분 대신에 수소원자가 18위치의 탄소원자에 결합되어 있다.

6. B₂=하이미프리신(R_f=0.56)과 B₃=하이메티프리신(R_f=0.58)

분자량(FAB-MS) : 944와 960

전술한 분석법으로부터 성분 B₂의 측쇄는 메틸렌기만큼 그리고 B₃의 측쇄는 에틸렌기만큼 B₁의 측쇄보다 길다는 사실이 밝혀졌다.

통상의 물리 상수값들(융점, 원소분석자료, 광학적 활성도, UV와 IR스펙트라 등등)은 각 화합물들의 특성이 되지 않았다. 예를들면, 단일 성분의 융점은 160-170℃인데 혼합물의 융점은 167-168℃이었다. 원소분석자료도 각 성분들의 특성이 되지 않았는데 이는 각 성분들이 유사한 구조의 고분자들이어서 원소분석자료의 차이들이 측정 오차내에 있기 때문이다. 프리마이신 혼합물의 대부분이 성분 A₁, B₁와 C₁를 포함하기 때문에 이들을 주성분이라 일컫는다. 소량으로 존재하는 다른 성분들은 부성분이라 부른다.

프리마이신 성분들은 출발 프리마이신 혼합물에 따라 황산염 또는 아세트산염이나 모노클로로아세트산염 등의 다른 염의 형태로 분리된다.

분리된 프리마이신 성분의 황산염은 여러 유기산이나 무기산에 의해 다른 염으로 전환될 수 있으며, 이는 헝가리 특허명세서 제2571/84호에 기술되어 있다.

프리마이신 혼합물과 3가지 주성분(A₁,B₁과 C₁)의 항미생물 활성도 스펙트라를 도표 0(27페이지)에 나타내었다. 인체 병원 다중 내성 균종에 대해 측정한 MIC값들 (㎍/ml)도 함께 나타내었다. 다른 값들이 나온다는 사실로부터 3가지 주성분들이 다른 방법으로 항세균 활성도를 발휘한다고, 즉 세균의 다른 위치들을 장해한다고 유추할 수 있다.

놀랍게도 성분들은 서로의 작용을 강화시킨다는 즉, 상승작용을 가지고 있다는 사실을 알아내었다. 상승작용과 주성분들의 다르다고 가정한 장해 위치에 기초하여 다음의 유리한 효과들이 성분들의 조성물을 사용하여 얻어졌다 :

1. 병원균의 다른 위치에서 대사활동을 동시에 장해함으로써 멸균시키는 ″살균효과″를 더 안전하게 얻을 수 있으며, 이 효과는 세균 증식을 단지 억제하기만 하는 세균 효과보다 훨씬 더 바람직하다.

2. 대사활동의 다른 경로를 동시에 장해하기 때문에 활성 조합성분에 대한 내성이 발현되지 않거나 발현되더라도 그 속도가 느리다.

3. 사용하는 성분들의 양이 매우 줄어든다. 이에 따라 덜 활성인 성분을 투여하게 되어 해로운 부작용이 감소하거나 완전히 사라진다. 이 효과는 치료학적인 견지에서 매우 유리하다. 덜 활성인 성분을 사용하면 비용이 절감되어 경제적인 견지에서도 바람직하다.

본 발명의 상승작용 조성물에는 프리마이신과 그 유도체, 특히 염들의 주성분들 (A₁,B₁, C₁)과 다른 부성분들이 사용될 수 있다. 조성물은 2가지 또는 3가지 더 많은 여러 성분들을 포함할 수 있다. 2가지 성분을 사용할 경우엔 성분들의 무게비를 5 : 95에서 25 : 75의 범위로 하고 3성분을 사용할 경우엔 4 : 3 : 3에서 7 : 1 : 2의 범위로 하여 사용한다. 본 발명의 바람직한 상승작용 조성들이 다음의 실시예에 나와 있으며, 또한 여러 미생물 균종에서 측정한 MIC값들과 상가 그리고 상승효과의 정도가 기술되어 있다. ″상가적 효과″라는 용어는 성분들의 효과가 합해진다는 의미 즉, 한성분 MIC값의 절반과 또한 성분 MIC값의 절반을 더하면 두 활성 성분 조성물의 MIC값이 얻어진다는 의미로 사용된다. 성분들의 바람직한 상호작용에 의해 항균활성도가 상가 효과보다 더 클때 상승작용이 나타나고, 이렇게 생긴 효과를 상승작용 효과라고 한다.

MIC값은 디프코-육즙 배양기에서 측정하였다. 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 감정하고 5×10⁵/ml의 아포를 접종하였다. 실시예 13-25에서 197가지의 경우가 더욱 활성인 성분을 함유한 조성물이 상승작용 활성도를 가지고 있다는 것을 나타내어 같은 효과를 얻기 위해선 활성성분의 원래 양에서 소량만이 투여되어야 한다.

본 발명의 프리마이신 성분들은 임의로 다른 약학적 활성성분들과 함께 한 성분만 또는 다른 성분과 섞어서 투여할 수 있다. 이들은 단독으로 투여할 수도 있지만 일반적으로 투여 경로와 표준 약학실습에 기초하여 선택된 약학적 담체와 함께 투여한다. 활성성분은 캡슐제, 정제, 당의정제, 좌제등의 고형제제로, 연고제, 겔제등의 반고형 제제로, 주사제, 현탁제, 시럽제 등과 같은 액형제등으로 투여할 수 있다. 바람직한 제형은 겔제, 좌제, 수술용 살포분제, 주사제, 현탁제 그리고 앰플산제와 앰플액제의 조성물 등이다.

본 발명의 성분들은 경구적, 비경구적, 직장용 또는 국소적(예를들면 연고제)으로 투여할 수 있다. 이들은 통상적인 약학적 담체(예를들면 탄산마그네슘, 스테아린산마그네슘, 전분, 활석말, 물 등등)나 또는 사이클로 덱스트린 등과 같은 신규 담체, 그리고 임의의 부형제, 이화제, 유화제 등을 함유한다.

경구 투여에 적합한 제형은 예를들면 정제, 당의정제 또는 캡슐제이다. 본 발명의 더 활성인 성분을 포함하는 상승작용 조성물은 또한 수의 치료에 즉, 사료에 섞은 액형제제로도 사용할 수 있다. 비경구적 투여에 적합한 제형으로 수용성 유액제, 액제 또는 현탁제 등이 사용될 수 있다. 살포분제, 연고제, 수용성 또는 유성 유액제 또는 이들을 유액제나 현탁제나 흡입약이 침투된 붕대등이 국소적 투여에 사용될 수 있다.

본 발명을 다음의 비제한 실시예에서 설명한다.

[실시예 1]

규조토겔 위에서 박층 크로마토그라피로 2회 착색하여 프리마이신을 분리

노말-부탄올, 에탄올 그리고 물 또는 메탄올의 1 : 1 : 2비율 혼합액으로 프리마이신 복합체 0.5% 용액을 마련한다. 용액중 10㎕(50㎍의 활성성분)를 규조토겔 착색판(Merck에서 생산한 DC-Plastikfolie, 규조토겔 60F₂₅₄또는 DC-Alufolie규조토겔 60, 층두께 : 0.2mm)위에 적가한다. 용매군 Ⅳ를 용출매로 사용하고 16cm의 거리에서 크로마토그람을 착색한다. 착색을 되풀이한다. 색깔 반응으로 반점들을 가시화하고 590nm에서 비중계법으로 평가한다. 생물학적 활성도는 바이오오토그라피 검사로 조사한다.

바이오오토그라피 검사에 사용된 배양기의 조성은 다음과 같다 :

쇠고기엑스 3g

박토 펩톤 5g

염화 소다 5g

인산 소오다 10g

제1인산칼륨 1g

박토 배지 18g

증류수 1000ml까지

배양기를 121℃에서 배양하고 pH를 8.0으로 맞춘다. 온도 53℃의 배양기 130ml를 멸균 유리접시(18×25cm)에 채우고 바칠루스 섭틸리스 ATCC 6633아포 현탁액을 1 : 2,000의 비율로 첨가한다. 크로마토그람으로부터 5mm 넓이로 띠를 잘라내어 용매를 건조 제거하고 한천판위에 덧붙인 후 37℃에서 18-24시간 동안 배양한다.

[실시예 2]

규조토겔위에서 박층 크로마토그라피로 1회 착색하여 프리마이신 혼합물을 분리

혼합용매 Ⅴ가 용출매로 사용되고 착색을 1회 행하는 이외엔 실시예 1의 공정과 같이 행한다.

[실시예 3]

HPTLC 착색판에서 1회 착색하여 프리마이신 혼합물을 분리

실시예 1에서 제조한 0.5%, 용액중에서 4㎕(활성성분 20㎍)을 취하여 HP TLC(Merck) 착색판에 진입시키고 18cm의 거리에서 착색한다. 다음 단계들은 실시예 1에서와 같다.

[실시예 4]

침투 규조토겔 착색판에서 1회 착색하여 프리마이신 혼합물을 분리

혼합용매 Ⅶ을 착색에 사용하고 규조토겔 60F₂₅₄착색판을 사용전에 전술한 방법에 따라 금속염으로 침투시키는 외엔 실시예 1의 공정에서와 같이 행한다.

다음의 단계들은 실시예 1에서와 같이 행한다.

[실시예 5]

박층 크로마토그라피 착색판 위에서 프리마이신 혼합물을 분리

검사할 견본 1% 용액중에서 2ml를 취하여 PSC-Fertigplatten, 규조토겔 60F₂₅₄(Merck)착색판에 진입시킨다.

착색판을 용매군 Ⅳ로 더 많이 착색한다. 유리판의 오른쪽과 왼쪽에 있는 3-3cm의 띠를 예열시킨 사까구찌 시약에 담그면 반점들이 상온에서 선홍색으로 나타난다. 뚜렷한 부분을 오려내어 황산 산성 바닐린을 첨가해도 아무런 반응이 일어나지 않을때까지 10% 초산 산성 메탄올과 함께 현미여과기에 용출시킨다. 용출물을 진공 증류시킨 잔류물에 용매군 Ⅰ에 녹여 5배 부피의 증류수로 4회 추출한다.

항생물질의 성분들은 상층에 있고 ″층 중량품″은 아래 상에 있다. 윗상을 증발시켜 얻은 성분들은 실시예 1의 방법에 따라 계속 정제시킨다.

[실시예 6]

분배 칼럼 크로마토그라피에 의한 프리마이신 성분들 ″A″의 분리 사용된 용매군 :

고정상 : 용매군 Ⅰ

이동상 : 노말-부탄올, 빙초산과 물이 30 : 10 : 60의 비율로 섞인 혼합물의 아래상

칼럼의 제조 :

세파덱스 LH-20겔 720g을 용매군 Ⅰ3l중에서 1일 동안 불린다. 현탁액을 크로마토그라피 칼럼(58×1150mm)에 채우고, 정착시킨 후 이동상 1.5l로 세척한다.

크로마토그라피 공정 :

이동상 300ml와 고정상 15ml의 혼합물에 프리마이신 2g을 녹이고, 용매를 여과하고 칼럼에 진입시킨다. 용출은 이동상을 50-60방울/분의 흘림 속도로 흘려서 행한다.

일반적으로 17ml(=800방울)의 분류물이 수집되며, 300-400분류물이 얻어질때까지 용출을 행한다.

ㆍ만약 상이 바뀌면 세파덱스 LH-20 고정상 칼럼은 3-4회 사용될 수 있다. 겔은 다음과 같이 회수할 수 있다 : 아세톤에 현탁시켜 여과하고 증기상에서 아세톤으로 2시간동안 환류시킨 다음 건조시킨다. 다른 분류물이 있는 물질들은 박층크로마토그라피와 UV 분광기로 확인한다.

[성분들의 개별분리]

분석자료(UV와 TLC)에 의거하여 같은 물질을 함유하는 것으로 밝혀진 분류물들을 회합한다. 용매를 증발 제거한 잔류물을 메탄올과 벤젠이 2 : 1로 섞인 혼합액에 녹이고 다시 증발시킨다.

그리하여 성분 A들의 혼합물 743mg과 성분 A들과 C들을 함유하는 570mg의 혼합 분류물을 얻어진다. 성분 B들은 칼럼에 남아 있어서 용매군 Ⅰ로 녹이면 성분 B들이 480mg 얻어질 수 있다. 성분 A들을 전술한 조건에서 계속 크로마토그라피하면 순도 98% 이상으로 주성분 A₁이 얻어진다.

[실시예 7]

분배 칼럼 크로마토그라피를 사용한 프리마이신 성분 B들의 분리

실시예 6에서 기술된 바와 같이, 얻어진 성분 B들을 소위″B-선택적″용매군을 용출매로 사용하는 외엔 전술한 바와 같은 크로마토그라피법으로 정제한다. 그리하여 주성분 B₁이 96% 이상의 온도로 얻어질 수 있다.

ㆍ″B-선택적″용매군의 조성은 다음과 같다 :

고정상 : 노말-부탄올, 메탄올, 빙초산, 물이 1 : 41 : 10 : 5 : 43의 비율로 섞여있는 혼합액의 윗상

이동상 : 벤젠, 노말-부탄올, 메탄올, 빙초산과 물이 1 : 24 : 10 : 5 : 60의 비율로 섞여있는 혼합액의 아래상.

[실시예 8]

DCCC(Droplet Counter Current Chromatography)에 의한 프리마이신 성분들의 분리

실시예 6에서 얻은 혼합 분류물을 DCCC로 더 정제한다. 사용된 용매군은 다음과 같다 :

고정상 : 클로로포름, 메탄올, 빙초산과 물이 26 : 39 : 9 : 26의 비율로 섞인 혼합액이 아래상

이동상 : 동일한 혼합액의 위상.

용출 : 용매군을 2시간동안 교반하고, 16시간동안 직접 방치시키면 상분리가 일어난다. DCCC기구(내경=2.0mm, 관 300개)에 아래상(고정상)을 채운다. 검사할 물질 130mg을 위상(이동상) 12ml에 녹이고, 여과하여 용기까지 퍼낸다. 1.7-1.8기압하에서 15ml/hr의 흘림속도로 윗상을 흘려 용출시키면 3.7ml(=220방울)의 분류물이 수집된다. 그리하여 주성분 C₁이 90%의 순도로 얻어진다.

[실시예 9]

금속염이 침투된 실리카겔 위에서 흡착 칼럼 크로마토그라피의 프리마이신 성분들의 분리

컬럼의 제조 :

질산은 40g과 아세토니트릴 500ml을 섞은 용액에 200g의 규조토겔 HF₂₅₄실리카겔을 현탁시키고 용매를 진공하 증발시킨다. 침투된 실리카겔 500ml의 클로로포름에 현탁시키고 크로마토그라피 칼럼에 채운다. 빽빽하게 침착할 수 있도록 충전상의 높이가 고정될때까지 약간의 각도압력(1.1-2.5기압)을 가한다. 광선에 의해 질산은 이 환원되는 것을 방지하기 위해 칼럼을 알루미늄 박으로 덮어둔다.

크로마토그라피 공정 :

프리마이신 400mg을 갓 제조된 용매군 12ml에 녹인다. 약간의 과도압력(1.1기압)을 가해 용액을 충전상에 흡착시킨다. 용출매(용매군 Ⅶ)30ml를 진입시켜 과도 압력 1.5-2.5 기압하에서 1.1ml/min의 흘림속도로 용출을 개시한다.

처치 :

분류물의 물질들을 박층 크로마토그라피로 확인한다. 각 분류물의 10㎕씩을 규조토겔 60F₂₅₄(Merck) 착색판의 출발지점으로 진입시키고 용매군 Ⅴ로 불포화된 용기내에서 16cm의 거리에서 착색시킨다. 반점들은 냉각공기로 건조시킨 후 클로로톨리딘시약 그리고/또는 황산 그리고/또는 열처리에 의한 착색으로 그 위치가 지정된다.

같은 물질을 포함하는 분류물들을 회합하여 프리마이신 성분을 에테르로 침전시킨다. 침전된 고체를 여과하고 약간의 아세토니트릴과 에테르로 세척한다. 잔류물을 노말-부탄올, 초산 그리고 물이 4 : 1 : 5의 비율로 섞인 혼합액의 성층에 녹이고 물 5ml로 3회 세척한다. 분리된 상층의 물질에서 용매를 진공증발시킨 잔류물을 에테르에서 분쇄하고 여과한 후 진공건조시킨다.

그리하여 135mg의 성분 A₁=키노프리신

30mg의 성분 A₂=미도프리신

40mg의 성분 A₃=메티프리신

20mg의 성분 C₁=옥시프리신

20mg의 성분 B₁=하이드로프리신

이 얻어진다.

주 : 광선을 배제시킨 칼럼에 있는 질산은의 대부분은 아세토니트릴로 세척함으로써 회수할 수 있으며, 다시 사용된다.

[실시예 10]

사용 채비된 로바-칼럼에서 흡착 칼럼 크로마토그라피를 사용한 프리마이신 성분들의 분리

사용된 칼럼 :

리크로프렙으로 채운 로바 C(Merck) 칼럼, 바람직하게는 2개 이상의 칼럼이 연결된다.

크로마토그라피 방법 :

용매군 Ⅷ이 용출매로서 사용되는 것 이외엔 실시예 9의 공정에 따른다. 프리마이신 3400mg을 용매군 Ⅷ 40ml에 녹이고 이 용액을 4개의 칼럼이 연속적으로 연결된 칼럼군의 위로 진입 시킨다.

처치 :

같은 물질을 포함하는 분류물들을 회합하고, 전체 분류물 부피의 10%에 해당하는 양의 노말-부탄올을 첨가하여 45℃를 넘지 않도록 하면서 진공증발시킨다. 고체 잔류물을 에테르에서 분쇄하고 여과시킨다.

그리하여 1100mg의 성분 A₁=키노프리신

110mg의 성분 A₂=미도프리신

80mg의 성분 A₃=메티프리신

110mg의 성분 C₁=옥시프리신

20mg의 성분 C₂=옥시미프리신

15mg의 성분 C₃=옥시메틴프리신

150mg의 성분 B₁=하이드로프리신

50mg의 성분 B₂=하이미프리신

40mg의 성분 B₃=하이메틴프리신

이 얻어진다.

[실시예 11]

프리마이신 성분들의 황산염으로의 제조

메탄올 5ml와 1N 황산 0.3ml가 회합된 분류물에 첨가된다는 사실이외엔 실시예 10의 공정을 따른다. 에테르 300ml를 첨가하면 침전이 완결된다.

그리하여 실시예 10의 프리마이신 성분들이 황산염의 형태로 얻어진다.

[실시예 12]

프리마이신 성분들의 황산염 이외 따른 염으로의 제조

항가리 특허 출원 제2571/84호의 공정에 따라 프리마이신 성분들의 황산염에 바륨염을 첨가하여 황산염 이외의 다른 염들을 제조한다.

그리하여 프리마이신 성분들의 황산염이외 다른 염들이 개미산염, 아세트산염, 모노클로로아세트산염, 수산염, 안식향산염, 토실산염, 과염소산염, 염화물등의 형태로 얻어진다.

프리마이신 복합체와 그 성분들의 항미생물 활성도를 여러 미생물 균종에 대해 검사하여 그 결과를 표 0에 나타내었다.

[표 0]

프리마이신 주 성분들의 항미생물 스펙트라

(접종 : 5×10⁵/ml, 37℃에서 24시간동안 배양)

[표 0/a]

인체 병원 미생물 균증에 대한 프리마이신 항생물질 복합체의 항미생물 스펙트라

[실시예 13]

상승작용 조성물 No. 1

n(성분들의 숫자)=2

성분들의 비율 : A₁: B₁=75 : 25

결과들은 표Ⅰ에 요약하였다.

도표의 설명 :

종란 Ⅰ : 성분 A₁의 MIC 값(㎍/ml)

종란 Ⅱ : 성분 B₁의 MIC 값

종란 Ⅲ : 성분 A₁과 B₁을 포함하는 조성물의 MIC 값

종란 Ⅳ : A₁의 MIC 값에 관련된 조성물중의 A₁의 양(%)

종란 Ⅴ : B₁의 MIC 값에 관련된 조성물중의 B₁의 양(%)

종란 Ⅵ : (Ⅳ＋Ⅴ)/n

종란 Ⅶ : 항미생물 활성도의 부가분(Ⅳ＋Ⅴ)

종란 Ⅷ : 항미생물 활성도의 상승작용분(100%-Ⅶ)

[표 Ⅰ]

[실시예 14]

상승작용 조성물 No. Ⅱ

n=2

성분들의 비율 : A₁: B₁=50 : 5

조성물의 항미생물 활성도를 표Ⅱ에 요약하였다.

[표 Ⅱ]

[실시예 15]

상승작용 조성물 No. Ⅲ

n=2

성분들의 비율 : A₁: B₁=25 : 75

항미생물 활성도의 실험결과를 표Ⅲ에 요약하였다(약자들은 표Ⅰ에서와 같다.).

[표 Ⅲ]

[실시예 16]

상승작용 조성물 No. Ⅳ

n=2

성분들의 비율 : A₁: C₁=75 : 25

조합의 항미생물 활성도에 대한 결과를 표Ⅳ에 요약하였다(성분 B₁대신 성분 C₁을 사용한 외엔 약자는 실시예 3에서와 같다.).

[표 Ⅳ]

[실시예 17]

상승작용 조성물 No. Ⅴ

n=2

성분들의 비율 : A₁: C₁=50 : 50

조성물의 항미생물 활성도에 대한 결과를 표Ⅴ에 요약하였다(성분 B₁대신에 성분 C₁이 사용된 외엔 약자들은 실시예 B에서와 같다.).

[표 Ⅴ]

[실시예 18]

상승작용 조성물 No. Ⅵ

n=2

성분들의 비율 : A₁: C₁=25 : 75

조성물의 항미생물 활성도에 대한 결과가 표Ⅵ에 요약되어 있다(B₁대신에 C₁이 사용된 외엔 약자는 실시예 13에서와 같다.).

[표 Ⅵ]

[실시예 19]

상승작용 조성물 No. Ⅶ

n=2

성분들의 비율 : C₁: B₁=75 : 25

조성물의 항미생물 활성도에 대한 결과가 표Ⅶ에 요약되었다(A₁대신에 C₁이 사용된 외엔 약자는 실시예 13에서와 같다.).

[표 Ⅶ]

[실시예 20]

상승작용 조성물 No. Ⅷ

n=2

성분들의 비율 : C₁: B₁=50 : 50

조성물의 항미생물 활성도에 대한 결과를 표 Ⅷ에 요약하였다(성분 A₁대신 성분 C₁이 사용된 외엔 약자는 실시예 13에서와 같다.).

[표 Ⅷ]

[실시예 21]

상승작용 조성물 No. Ⅸ

n=2

성분들의 비율 : C₁: B₁=25 : 75

조성물의 항미생물 활성도에 대한 결과를 표 Ⅸ에 요약하였다.(성분 A₁대신에 성분 C₁이 사용된 이외엔 약자는 실시예 13에서와 같다).

[표 Ⅸ]

[실시예 22]

상승작용 조성물 No. Ⅹ

n=3

성분들의 비율 : A₁: C₁: B₁=40 : 30 : 30

조성물의 항미생물 활성도에 대한 결과를 표 Ⅹ에 요약하였다.

표 Ⅹ의 약자는 다음과 같다 :

종란 Ⅰ : 성분 A₁의 MIC 값(㎍/ml)

종란 Ⅱ : 성분 C₁의 MIC 값(㎍/ml)

종란 Ⅲ : 성분 B₁의 MIC 값(㎍/ml)

종란 Ⅳ : 성분들 A₁＋B₁＋C₁을 함유하는 조성물의 MIC 값

종란 Ⅴ : A₁의 MIC 값에 관련된 조성물중 A₁의 양(%)

종란 Ⅵ : C₁의 MIC 값에 관련된 조성물중 C₁의 양(%)

종란 Ⅶ : B₁의 MIC 값에 관련된 조성물중 B₁의 양(%)

종란 Ⅷ : (Ⅴ＋Ⅵ＋Ⅶ)/n

종란 Ⅸ : 항미생물 활성도의 부가분(Ⅴ＋Ⅵ＋Ⅶ)

종란 Ⅹ : 항미생물 활성도의 상승작용분(100%-Ⅸ)

[표 Ⅹ]

[실시예 23]

상승작용 조성물 No. ⅩI

n=3

성분들의 비율 : A : C : B=50 : 25 : 25

조성물의 항미생물 활성도에 대한 결과를 표 ⅩI에 요약하였다.(표의 약자는 실시예 22에서와 같다).

[표 ⅩI]

[실시예 24]

상승작용 조성물 No. Ⅶ

n=3

성분들의 비율 : A : C : B=60 : 20 : 20

조성물의 항미생물 활성도에 대한 결과를 표 Ⅶ에 요약하였다.(표의 약자들은 실시예 22에서와 같다).

[표 ⅩII]

[실시예 25]

상승작용 조성물 No. Ⅷ

n=3

성분들의 비율 : A₁: C₁: B₁=70 : 10 : 20

조성물의 항미생물 활성도에 대한 결과를 표 Ⅷ에 요약하였다.(표의 약자는 실시예 22에서와 같다).

[표 ⅩIII]

다음의 실시예들은 프리마이신의 개개 성분들과 또는 상승작용 혼합물을 할성성분으로서 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 약학적 조성물은 공지의 방법으로 제조된다.

″활성성분″이라는 용어는 프리마이신의 분리된 개별성분들 또는 그 혼합물로서 이해한다.

[실시예 26]

[실시예 27]

[실시예 28]

[실시예 29]

[실시예 30]

[실시예 31]

[실시예 32]

성분들을 혼합하여 플라쉬에 채운다.

[실시예 33]

성분들을 혼합하여 병이나 단지에 채운다.

[실시예 34]

[실시예 35]

[실시예 36]

[실시예 37]

[실시예 38]

[실시예 39]

[실시예 40]

항미생물 붕대

프리마이신을 분리한 성분들이나 또는 그 혼합물의 용액을 바람직하게는 에탄올과 합하여 무명천과 같은 붕대에 포화시키고 붕대를 감아서 통상적인 방법으로 멸균시킨다. 제조된 멸균, 항미생물 붕대는 언제라도 사용가능하다.

Claims

복합용매군으로 박층 크로마토그래피, 칼럼 크로마토그래피 또는 박층 크로마토그래피와 칼럼 크로마토그래피를 1회 또는 2회 전개시키므로서, 프라마이신의 배양제조중에 얻어진 조(粗)생성물, 반생성물 또는 순수한 생성물의 성분들의 분리 및 필요하다면, 각각의 성분들의 개별분리에 해당하는 프리마이신 항생물질 복합체의 분리공정.
제1항에 있어서, 박층 크로마토그래피를 사용한 프리마이신 성분들의 분리를 포함하는 공정.
제1항에 있어서, 분리할 항생물질 복합체를 탄소수 1-4인 알코올들의 0.5-1.0% 혼합액, 물 또는 탄소수 1-4인 알코올들의 0.5-1.0% 혼합액과 물에 녹여, 실리카겔 바람직하게는 고체 담체로서의 금속염을 침투시킨 실리카겔을 함유하는 박층 또는 고압박층 크로마토플레이트 상에 전개시키는 과정을 포함하는 공정.
제1항에 있어서, 분배 또는 흡찰칼럼 크로마토그라피를 사용한 프리마이신 성분들의 분리를 포함하는 공정.
제1항에 있어서, 흡착 크로마토그래피 공정중에서, 사용준비완료된 로바형 컬럼 또는 금속염 바람직하게는 은염, 철염 또는 은염과 철염을 함침시킨 실리카겔이 충진된 크로마토그래피 칼럼을 사용하는 공정.
제1항에 있어서, 분배 크로마토그래피, 소적역류 크로마토그래피 또는 분배 크로마토그래피와 소적역류 크로마토그래피에서 고체담체, 바람직하게는 세파덱스 LH-20을 사용하는 공정.
제1항에 있어서, 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소들의 혼합물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 이소프로판올과 같은 알코올들, 개미산, 아세트산, 모노클로로아세트산 같은 유기산들 바람직하게는 포름알데히드 같은 알데히드 및 물을 용출매로서 사용하는 공정.
제7항에 있어서, 노말-부탄올, 빙초산과 물이 60 : 10 : 3의 비로 섞인 혼합액(용매군 Ⅰ) 상층을 용출매로서 사용하는 공정.
제7항에 있어서, 노말-부탄올, 메탄올, 빙초산과 물이 75 : 2 : 8 : 15의 비로 섞인 혼합액(용매군 Ⅱ)을 용출매로서 사용하는 공정.
제7항에 있어서, 클로로포름, 메탄올, 빙초산 및 물이 45 : 30 : 15 : 20의 비로 혼합된 혼합물(용매군 Ⅲ)의 하층을 용출매로서 사용하는 공정.
제7항에 있어서, 클로로포름, 메탄올, 개미산과 물이 50 : 35 : 14 : 1의 비율로 섞인 혼합액(용매군 Ⅳ)을 용출매로서 사용하는 공정.
제7항에 있어서, 클로로포름, 메탄올 개미산, 물, 포름알데히드와 노말-부탄올이 130 : 53 : 6 : 9 : 3 : 3의 비율로 섞인 혼합액(용매군 Ⅴ)을 용출매로서 사용하는 공정.
제7항에 있어서, 클로로포름, 메탄올, 개미산, 물, 포름알데히드와 노말-부탄올이 160 : 53 : 6 : 9 : 3 : 3의 비율로 섞인 혼합액(용매군 Ⅵ)을 용출매로서 사용하는 공정.
제7항에 있어서, 클로로포름, 메탄올, 물, 포름알데히드와 노말-부탄올이 125 : 53 : 9 : 3 : 3의 비율로 섞인 혼합액에 무게비 15%의 모노클로로아세트산이 녹아있는 용액(용매군 Ⅶ)을 용출매로서 사용하는 공정.
제7항에 있어서, 용매군 Ⅲ, 클로로포름, 메탄올이 15 : 2 : 1의 비율로 섞인 혼합액(용매군 Ⅷ)을 용출매로서 사용하는 공정.
제1항에 있어서, 1-5기압, 바람직하게는 초과압력하에서 칼럼 크로마토그래피를 수행하는 공정.
제1항에 있어서, 동일한 R_f값을 가지는 성분들을 함유하는 분류물들을 회합하여 바람직하게는 에테르 같은 용매로 침전시키거나 또는 증발시킴에 의해 프리마이신 성분들을 회수하는 공정.
제1항에 있어서, 복합용매군으로 박층 크로마토그래피 상에 전개된 0.29의 R_f값을 가지는 키노프리신(프리마이신 성분 A₁)을 회수하는 공정.
제1항에 있어서, 복합용매군으로 박층 크로마토그래피 상에 전개된 0.31의 R_f값을 가지는 미도프리신(프리마이신 성분 A₂)을 회수하는 공정.
제1항에 있어서, 복합용매군으로 박층 크로마토그래피 상에 전개된 0.33의 R_f값을 가지는 메티프리신(프리마이신 성분 A₃)을 회수하는 공정.
제1항에 있어서, 복합용매군으로 박층 크로마토그래피 상에 전개된 0.35의 R_f값을 가지는 옥시프리신(프리마이신 성분 C₁)을 회수하는 공정.
제1항에 있어서, 복합용매군으로 박층 크로마토그래피 상에 전개된 0.37의 R_f값을 가지는 옥시미프리신(프리마이신 성분 C₂)을 회수하는 공정.
제1항에 있어서, 복합용매군으로 박층 크로마토그래피 상에 전개된 0.39의 R_f값을 가지는 옥시메티프리신(프리마이신 성분 C₃)을 회수하는 공정.
제1항에 있어서, 복합용매군으로 박층 크로마토그래피 상에 전개된 0.54의 R_f값을 가지는 하이드로프리신(프리마이신 성분 B₁)을 회수하는 공정.
제1항에 있어서, 복합용매군으로 박층 크로마토그래피 상에 전개된 0.56의 R_f값을 가지는 하이미프리신(프리마이신 성분 B₂)을 회수하는 공정.
제1항에 있어서, 복합용매군으로 박층 크로마토그래피 상에 전개된 0.58의 R_f값을 가지는 하이메티프리신(프리마이신 성분 B₃)을 회수하는 공정.
제17항에 있어서, 프리마이신 성분들을 염의 형태, 바람직하게는 아세트산염, 모노클로로아세트산염, 황산염 또는 개미산 염의 형태로 회수하는 공정.
제1항이나 27항에 있어서, 프리마이신 성분들의 황산염에 황산이외의 유기산 또는 무기산의 바륨염들을 첨가하여 황산염 이외의 다른 염들을 형성함을 포함하는 공정.
제1항이나 17항에 있어서, 황산을 첨가하여 프리마이신 성분들의 비황산염 형태를 황산염들로 형성함을 포함하는 공정.
2가지 이상의 프리마이신 성분들, 즉 프리마이신의 주성분(A₁,B₁,C₁)을 단독으로, 또는 부성분, 염과 같은 그들의 유도체 또는 부성분과 유도체를 복합시킨 성분들을 다른 항미생물 활성성분과 혼합한 성분 0.001 내지 10%(중량%)의 여기에 99.999 내지 90%(중량%)의 약학적으로 사용가능한 담체, 부형제, 희석제, 담체와 부형제, 담체와 희석제, 부형제와 희석제 또는 담체와 부형제와 희석제를 첨가하여 약학적 조성물을 형성하는 항생물질 조성물의 제조방법.
제30항에 있어서, 활성성분이 2가지의 프리마이신 성분으로 이루어질 경우 프리마이신 성분들을 5 : 95-75 : 25의 무게비로 혼합하는 공정.
제30항에 있어서, 활성성분이 3가지의 프리마이신 성분으로 이루어질 경우 프리마이신 성분들을 4 : 3 : 3-7 : 2 : 1의 무게비로 혼합하는 공정.
제30항이나 제31항에 있어서, 성분 A₁과 C₁의 조성물을 활성성분으로 사용하는 공정.
제30항이나 제31항에 있어서, 성분 A₁과 B₁의 조성물을 활성성분으로 사용하는 공정.
제30항이나 제31항에 있어서, 성분 B₁과 C₁의 조성물을 활성성분으로 사용하는 공정.
제30항이나 제32항에 있어서, 성분 A₁. B₁. C₁의 조성물을 활성성분으로 사용하는 공정.
제30항에 있어서, 조성물을 살포분제, 에어로졸, 겔, 연고, 안약 또는 국소치료에 적합한 다른 제형등으로 제형화함을 포함하는 공정.
제30항에 있어서, 현탁제, 또는 주사액 또는 앰플분제와 앰플 액제의 조합한 주사용 조성물 제조를 포함하는 공정.
제30항에 있어서, 항미생물 붕대의 제조를 포함하는 공정.
한가지 이상의 프리마이신 성분과 임의의 다른 항미생물 물질들을 0.001-10% 정도로, 그리고 약학적으로 사용가능한 담체, 희석제, 부형제, 담체와 희석제, 담체와 부형제, 희석제와 부형제 또는 담체와 희석제와 부형제들을 99.999-90% 정도로 포함하는 항생물질 조성물을 제조하는 방법.