KR900009069A

KR900009069A - 시클로스포린 결합단백질 및 생물학적 활성 시클로스포린에 대한 측정에의 이용

Info

Publication number: KR900009069A
Application number: KR1019890017795A
Authority: KR
Inventors: 제이 솔딘 스티븐
Original assignee: 원본 미기재; 칠드런스 내셔날 메디칼 센터 인코오퍼레이티드
Priority date: 1988-12-02
Filing date: 1989-12-02
Publication date: 1990-07-02
Also published as: AU630901B2; CA2004387C; JPH02209897A; CA2004387A1; EP0372862A2; AU4560789A; EP0372862A3

Abstract

내용 없음.

Description

시클로스포린 결합단백질 및 생물학적 활성 시클로스포린에 대한 측정에의 이용

본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음

제1도는 추적자로서 [³H]-디히드로 CsA 및 스토졸 결합단백질로서 인간의 단핵 백혈구의 추출물(단백질 420㎍)을 사용하는 본발명의 경쟁적 단백질 결합분석으로 부터 얻어진 정상곡선,

제2도는 추적자로서 [¹²⁵I]-CsA를 사용하는 것이외에는 제1도와 동일,

제3도는 시토졸 결합단백질 120㎍을 사용하는 것이외에는 제1도와 동일하다.

Claims

(a) 균등화된, 파열된 , 정상 또는 형질전환된 세포를 원심분리하여 수용성 단백질을 제조하는 단계; (b) 상기 수용성 단백질을 분별하는 단계; (c) 그렇게 얻어진 단백질 분획을 시클로스포린 결합 활성에 대하여 시험하는 단계; 그리고 (d) 허용가능한 시클로스포린 결합 활성을 가지는 그런 단백질 분획을 선택하는 단계로 이루어지는 방법에 의하여 제조된, 시클로스포린 및 그의 생물학적-활성유도체, 유사체 및 대사산물에 대한 수용성 고분자 결합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 세포가 사람 또는 동물의 말초 또는 배양된 백혈구 또는 그의 조직 선구체를 포함하는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 세포가 사람 또는 동물의 적혈구 또는 그의 조직 선구체를 포함하는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 세포가 사람 또는 동물의 조직 또는 배양된 세망내피세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 세포가 사람 또는 동물의 조직 또는 배양된 간, 비장, 골수 및 흉선세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 세포가 절지동물, 흡충류, 연체동물, 진균류, 해면동물, 효모 및 박테리아 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 원심분리가 적어도 20,000xg에서 적어도 15분동안의 힘과 25℃이하의 온도를 사용하는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 수용성 단백질을 하나 또는 그 이상의 분자량 커트오프 막필터를 통하여 여과하는 것으로 이루어지는 방법에 의하여 상기 수용성 단백질의 분별되는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 가용성 단백질을 분별범위가 약 2,000과 150,000달톤 사이인 하나 또는 그 이상의 크기 배제 겔 컬럼을 통하여 여과하는 것으로 이루어지는 방법에 의하여 상기 수용성 단백질이 분별되는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
제1항에 있어서, 시험된 단백질 분획중에 허용가능한 시클로스포린 결합 활성을 가지는 것들이, 표시된 시클로스포린 A가 미표지 시클로스포린 A와 상기 결합 단백질상에서의 결합부위에 대하여 경합하는 경합 단백질 결합 측정을 각 분획에 적용시키는 것으로 이루어지는 방법에 의하여 선택되는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
제1항에 있어서, 2,400 내지 3,000달톤 범위의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
제1항에 있어서, 8,000 내지 13,500 달톤 범위의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
제1항에 있어서, 13,500 내지 25,000 달톤 범위의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
초기 유동샘플에 함유된 시클로스포린 및 그의 생물학적-활성유도체, 유사체 및 대사산물에 대한 정량경합 단백질 결합 측정법으로서, (a) 상기 시클로스포린을 함유하고 있는 상기 초기 유동 샘플의 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물의 알리 을 건조상태까지 증발시키는 단계; (c) 상기 건조된 알리 과 제1항의 수용성 결합 단백질의 수용액을 제조하는 단계; (d) 상기 수용액에 방사성 시클로스포린 A를 첨가하고 그 결과의 반응혼합물을 고정상태의 결합에 이를때까지 인큐베이션하는 단계; (e) 미결합 표지 시클로스포린 A로부터 단백질-결합 표지 시클로스포린 A를 물리적으로 분리하는 단계; (f) 단백질에 특이적으로 결합된 표지 시클로스포린 A의 양을 정량하는 단계; 그리고 (g) 상기 초기 유동샘플중의 시클로스포린 및 그의 생물학적-활성 유도체, 유사체 및 대사산물의 양을 상기 단계 (f)에서 얻어진 단백질에 특이적으로 결합된 표지 시클로스포린 A의 정량된 양을 상기 모든 단계 (a)-(f)의 경합 단백질 결합 측정에 의하여 일련의 시클로스포린 표준용액을 분석함으로써 제조된 표준곡선에 적용시켜서 측정하고, [B_(std)-NSB/B_{(0 std)}-NSB]100 대 log[Cs]를 도시하는 단계로 이루어지는 방법. [상기 식에서 B_(std)는 결합단백질에 결합된 시클로스포린의 양이고, B_{(0 std)}는 대조표준이며, NSB는 시클로스포린의 각 샘플의 비특이적 결합이고, [Cs]는 분석된 표준시클로스포린의 농도이다.]
제14항에 있어서, 상기 추출물이 초기 유동샘플로부터 시클로스포린, 유사체, 유도체 및 대사산물을 C₁내지 C₆직쇄 또는 분지쇄의 1차, 2차 또는 3차 알칸올을 이루어지는 군으로부터 선택된 알코올을 사용하여 추출함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 방사성 시클로스포린 A가³H-표지 시클로스포린 A 또는¹²⁵I-표지 시클로스포린 A인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 정상상태 결합이 약 0.5 내지 약 16시간 범위의 시간안에 및 약 25℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 도달되는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 단백질-결합 및 비결합 표지 시클로스포린 A의 물리적 분리가, 유리섬유 필터, 니트로 셀룰로스 필터 및 중합체 필터로 이루어지는 군으로부터 선택된 필터를 사용하여 여과하는 것으로 이루어지는 방법에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 단백질-결합 및 비결합 표지 시클로스포린 A의 물리적 분리가 입상 흡착으로 이루어지는 방법에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 흡착제가 단백질-피복된 숯 및 덱스트란-피복된 숯으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 단백질-결합 시클로스포린 A 및 비결합 시클로스포린 A의 물리적 분리가 단백질 침전으로 이루어지는 방법에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 단백질-결합 시클로스포린 및 비결합 시클로스포린 A의 물리적 분리가 크기배제컬럼을 사용하는 여과로 이루어지는 방법에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
초기 유동샘플에 함유된 시클로스포린 및 그의 생물학적-활성유도체, 유사체 및 대사산물에 대한 정량경합단백질 결합 측정법으로서, (a) 상기 시클로스포린을 함유하는 상깅 초기 유동샘플의 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물과 제1항의 수용성 결합 단백질의 수용액을 제조하는 단계; (c) 상기 수용액에 플루오로포아-표지 시클로스포린 A를 첨가하고, 그 결과의 혼합물을 정상상태 결합에 도달할 때까지 인큐베이션하는 단계; (d) 그렇게 인큐베이션된 혼합물의 형광편광신호를 측정하고, 상기 형광편광신호를 단백질-결합된, 플루오로포아-표지 시클로스포린 A의 양으로 전환시키는 단계; 그리고 (e) 상기 초기 유동샘플중의 시클로스포린 및 그의 생물학적-활성유도체, 유사체 및 대사산물의 농도를, 일련의 시클로스포린 표준용액을 상기 형광편광 경합 단백질 결합측정에 의하여 분석함으로써 얻어진 형광편광 표준 곡선에 의하여 측정하고, [B_(std)/B_{(0 std)}]100 대 log[Cs]를 도시하는 단계로 이루어지는 방법. (상기 식에서 용어 B_(std), B_{(0 std)}및 [Cs]는 제14항에서 정의된 바와 같다.)
제23항에 있어서, 상기 플루오로포아가 플루오레신 및 루시페린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
초기 유동샘플에 함유된 시클로스포린 및 그의 생물학적-활성유도체, 유사체 및 대사산물에 대한 정량경합 단백질 결합 측정법으로서, (a) 상기 시클로스포린을 함유하는 상기 초기 유동샘플의 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물의 알리 을 건고상태까지 증발시키는 단계; (c) 상기 건조된 알리 과 제1항의 수용성 결합단백질의 수용액을 제조하는 단계; (d) 상기 수용액에 효소-포합 시클로스포린 A를 첨가하고 그 결과의 반응 혼합물을 정상상태 결합에 도달할 때까지 인큐베이션하는 단계; (e) 단백질-결합 효소-포합 시클로스포린 A를 비결합 효소-포합 시클로스포린 A로부터 물리적으로 분리하는 단계; (f) 단백질에 특이적으로 결합된 효소-포합 시클로스포린 A의 양을 정량하는 단계; 그리고 (g) 상기 초기 유동샘플중의 시클로스포린 및 그의 생물학적-활성유도체, 유사체 및 대사산물의 양을, 일련의 시클로스포린 표준용액을 지금까지의 단계 (a)-(f)의 경합 단백질 결합 측정에 의하여 분석함으로써 제조된 표준 곡선에 상기 단계(f)에서 얻어진 단백질에 결합된 효소-표지 시클로스포린 A의 정량된 양을 적용시킴으로써 측정하고, [B_(std)-NSB/B_{(0 std)}-NSB]100 대 log[Cs]를 도시하는 단계로 이루어지는 방법. (상기 식에서 용어 B_(std), NSB, B_{(0 std)}및 [Cs]는 제14항에서 정의된 바와 같다.)
제25항에 있어서, 단계 (f)와 (g)의 정량단계가 화학발광방법을 사용하며 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제26항에 있어서, 상기 효소가 알칼리 포스파타제이고 화학 발광 기질이 상기 효소에 의하여 분해 가능하여 광에너지를 산출하는 수용성 1, 2-디옥세탄인 것을 특징으로 하는 방법.
제26항에 있어서, 상기 효소가 α- 또는 β-갈락토시다제이고 화학발광 기질이 상기 효소에 의해 분해가능하여 광에너지를 산출하는 수용성 1,2-디옥세탄인 것을 특징으로 하는 방법.
고체 상태에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 제14항 내지 29항중 어느 하나의 결합측정법.
(a) 제1항의 결합 단백질과 단백질 안정화제의 혼합물; (b) 표지된 시클로스포린; (c) 시클로스포린 표준; 및 (d) 완충액 및 계면활성제 안정화제를 포함하는 혼합물로 이루어지는, 초기 유동샘플중의 시클로스포린 및 그의 생물학적-활성유도체, 유사체 및 대사산물에 대한 정량 경합 단백질 결합 측정용 키트.

※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.