CN116396955A - 一种制备高免疫原性的天然dsDNA抗原的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备高免疫原性的天然dsDNA抗原的制备方法。本发明所提供的从生物组织中分离纯化天然dsDNA抗原的方法，先经过裂解消化及酚氯仿抽提制备得到粗dsDNA抗原，之后再依次经过CM阳离子交换层析及葡聚糖‑琼脂糖复合凝胶过滤介质200分子筛层析进一步去除杂质，所制备得到的dsDNA抗原，得率高、免疫原性强，灵敏度及特异性好，更适用于化学发光法等对诊断原料质量要求高的诊断方法。

Description

一种制备高免疫原性的天然dsDNA抗原的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备高免疫原性的天然dsDNA抗原的制备方法。
背景技术
自身免疫性疾病是指机体对自身抗体发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，由Donath与Landsteiner首先提出，其特征为高滴度的自身抗体和致敏性淋巴细胞的出现，包含数十种疾病。常见的自身免疫疾病通常分为三大类：第一大类是以关节疼痛为主要表现的，比如类风湿关节炎和强直性脊柱炎；第二类以系统性红斑狼疮、干燥综合征为代表的结缔组织病；第三类以血管受累为主要表现的系统性血管炎。目前，对于自身免疫的发病机制尚不完全清楚，一般认为是遗传易感个体在环境因素如感染、紫外线、肿瘤及药物等多种因素共同作用下导致自身免疫应答出现异常，产生针对自身抗原的病理性免疫应答反应而引起器官或系统损伤。
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种比较常见的系统性自身免疫病，主要侵犯结缔组织并影响多个器官系统，易发生于中青年女性，临床表现多样，具有以抗核抗体为主的多种自身抗体和广泛的小动脉病变及多系统的受累，肾衰竭、脑损害和心力衰竭是导致SLE患者死亡的常见原因。抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)，又称抗核酸抗原抗体，是一组对细胞核内的DNA、RNA、蛋白或这些物质的分子复合物产生的自身抗体。ANA无种属差异性和器官差异性，大多数属于IgG类抗体，仅少部分属于IgM和IgA。抗核抗体针对的靶抗原如细胞内的核酸及核蛋白成分等在细胞生理活动中起重要作用，因此，对ANA的特异性检测对疾病的明确诊断具有重要的参考价值。目前已发现具有不同临床意义的ANA达二十多种，形成了初具体系的抗核抗体谱(antinuclear antibodies，ANAs)，对系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、混合性结蹄组织病(mixedconnective tissue disease，MCTD)、干燥综合征(Sjogren syndrome，SS)、系统性硬化症(systemic sclerosis，SSc)、多肌炎/皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis)和原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis，PBC)等疾病的诊断、鉴别诊断及衡量疗效、判断预后都具有重要的临床价值。
抗双链DNA抗体是抗DNA抗体中的一种，Arana于1967年在SLE患者血清中发现，因能与天然DNA结合的自身抗体，故被称为天然DNA抗体或dsDNA抗体。抗dsDNA抗体主要出现于SLE患者的血清中，且抗体的滴度与SLE的活动性存在相关性，在SLE患者血循环中，大分子的DNA浓度显著高于正常人，DNA还可与多种器官的微血管结构包括肾小球基底膜上的硫酸乙酰肝素(heparansulfate)结合，抗dsDNA抗体可与这些循环中的和器官原位的DNA分子反应，形成抗原抗体复合物，激活炎症系统如补体活化途径，导致组织损伤。因此，抗双链DNA抗体是系统性红斑狼疮(SLE)的血清学标志物。
目前检测dsDNA抗体的方法有放射性免疫分析、间接免疫荧光法、胶体金法、免疫印迹法和酶联免疫吸附法。因存在放射污染等危险因素，放射免疫分析日趋淘汰。间接免疫荧光法的结果判读受人为主观因素影响较大，且需专业设备荧光显微镜等，难以大规模推广。胶体金法仅能定性检测，灵敏度较差，易受干扰，不足以满足临床诊断需要。免疫印迹法因转印过程中有可能出现抗原丢失或者变性，条带不显色或不清晰，导致结果不易观察，且易出现漏检或假阳，无法满足诊断要求。酶联免疫吸附法优势在于可以定量检测，但是由于难以获得稳定且具有高免疫反应性的dsDNA抗原，因而针对抗dsDNA抗体的检测往往存在的检测特异性差、灵敏度和准确性相对较低的缺陷，检测灵敏度和准确性无法得到保障。
因此，如何获得纯度及免疫反应性高的双链DNA抗原对于提高化学发光法等对诊断质量要求高的检测方法的灵敏度和准确性具有重要意义。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种制备高免疫原性的天然dsDNA抗原的方法，采用该方法制备得到的抗原在纯度、活性、特异性及稳定性上均能满足诊断原料的需求，且免疫原性远高于市售同类产品。
本发明通过以下技术方案来实现上述技术目的：一种制备高免疫原性的天然dsDNA抗原的方法，包括以下步骤：
向组织样本中加入裂解液、蛋白酶K和RNA酶A，均浆后置于45～60℃水浴锅中水浴消化，离心取上清；
向上清中按照样本：饱和酚：氯仿：异丙醇体积比50:(25～40):(32～40):(1～2)的比例加入抽提试剂抽提，取上层水相，乙醇沉淀后溶解即得粗dsDNA抗原；
将粗dsDNA抗原依次经过CM阳离子交换层析、葡聚糖-琼脂糖复合凝胶过滤介质200分子筛层析纯化后，即得。
本发明所提供的从生物组织中分离纯化天然dsDNA抗原的方法，先经过裂解消化及酚氯仿抽提制备得到粗dsDNA抗原，之后再依次经过CM层析及葡聚糖-琼脂糖复合凝胶过滤介质200分子筛层析进一步去除杂质，所制备得到的dsDNA抗原，得率高、免疫原性强，灵敏度及特异性好，批间差异小，更适用于化学发光法等对诊断原料质量要求高的诊断方法。
作为一种优选的实施方式，CM阳离子交换层析装填层析柱时所用的缓冲液为10～50mM Hepes，0.5～5mM EDTA，0.05～0.5M NaCl，pH 5.0～10.0。
作为一种优选的实施方式，CM阳离子交换层析所用的层析柱为CM-6FF，葡聚糖-琼脂糖复合凝胶过滤介质200分子筛层析为Prepack-GL26/600Finedex 200。
作为一种优选的实施方式，葡聚糖-琼脂糖复合凝胶过滤介质200分子筛层析装填层析柱时所用的缓冲液为5～50mM Tris-HCl，0.5～5mM EDTA，pH 4.5～9.0。
作为一种优选的实施方式，裂解液为：5～50mM Tris-HCl，0.5～5％ SDS，0.1～1.0％ Triton，0.1～1.0M NaCl。
其中，组织样本包括但不限于小牛胸腺组织、蛙鱼精、Hela细胞。
作为一种优选的实施方式，当组织样本含有结缔组织时，还需要经过前处理去除结缔组织。具体步骤为：匀浆过滤、裂解消化、氯仿抽提、CM阳离子交换层析及葡聚糖-琼脂糖复合凝胶过滤介质200分子筛层析。
作为一种优选的实施方式，前处理方法为：加入均浆缓冲液，纱布过滤；其中均浆缓冲液为：10～100mM Tris-HCl，0～0.1M NaCl，pH 5.0～8.5。
本发明的另一目的在于保护上述方法制备得到的dsDNA在制备用于系统性红斑狼疮自身免疫性疾病的临床辅助诊断试剂盒中的应用。本发明所制备的dsDNA抗原适用于ELISA、化学发光法、免疫比浊等检测，包括但不限于系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的临床辅助诊断。
附图说明
图1为本发明对比例1中DEAE层析图谱；
图2为本发明对比例1中制备得到的抗原纯化前后和sigma抗原对不同血清的检测结果比较；
图3为实施例1和2中制备得到的dsDNA抗原和市售产品的SDS-PAGE检测结果；
图4为实施例1和2中制备得到的dsDNA抗原和市售产品的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图5为实施例1和2中制备得到的dsDNA抗原和市售产品在不同包被浓度下ELISA检测滴度结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
双链DNA是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成的双螺旋结构；DNA的外侧由脱氧核糖和磷酸交替连接构成的基本骨架，内侧是碱基通过氢键连接形成的碱基对，碱基之间的配对遵循碱基互补配对原则(A-T、C-G)。在正常细胞内，碱基对间的氢键被打开，需要解旋酶的作用。DNA中G和C形成的碱基对的比例越高，结构越稳定，完全解旋成单链所需的温度越高。
对于dsDNA抗原制备，动物DNA中的碱基比例较接近于人体自身DNA中的碱基比例，小牛胸腺细胞核含量比重大，DNA含量较高，而且脱氧核糖核酸酶的活性较低，因此，小牛胸腺生物组织便于提取，原料价格低，可适用于大规模生产，本发明所提供的方法尤其适用于该组织材料的大规模提取生产。
实施例1
本实施例提供一种从小牛胸腺中提取天然dsDNA抗原的方法，动物组织经匀浆、裂解、酚氯仿抽提后以dsDNA溶解缓冲液溶解离心后沉淀，经CM阳离子柱结合去杂，最终分子筛层析纯化后获得20.4mg的dsDNA抗原。详细步骤如下：
(1)新鲜小牛胸腺经去除结缔组织等杂质后称取25.0g，按质量体积比1:1.5加入37.5mL均浆缓冲液后以均浆机多次均浆(每次5s，暂停5s)至无块状组织，加入过滤纱布袋(50目)中挤压过滤以除去多余组织等。其中均浆缓冲液为：50mM Tris-HCl，30mM NaCl，pH7.5。
(2)将过滤后的样本加至50mL离心管中，配平后5000rpm下离心20min，小心弃去离心上清，收集离心沉淀，称量沉淀重量。
(3)在沉淀中按质量体积比1:1.5加入组织裂解液，之后再加入终浓度为100μg/mL的蛋白酶K，终浓度为100μg/mL的RNA酶A，以手持匀浆机打散，混匀样本后置于60℃水浴锅中水浴1.5h，期间间隔15min搅拌一次。水浴后样本加至50mL离心管中，配平后5000rpm下离心20min，小心取离心后上清。其中，裂解液为：10mM Tris-HCl，1％ SDS，0.5％ Triton，NaCl 0.5M。
(4)称量所取上清体积，按体积比50:37.5:36:1.5依次加入样本：Tris饱和酚：氯仿：异丙醇，颠倒混匀后分装至50mL高速离心管中，配平后以22000rpm 4℃下离心15min，离心后可见样本分三层，上层为清澈透明水相，中间为乳白色的蛋白质层，下层为淡黄色，小心移取上层水相至量筒中，称量体积。
(5)量筒中加入2.5倍体积的95％乙醇，混匀后分装至50mL高速离心管中，配平后以22000rpm 4℃离心15min，离心后小心弃去上清，每管中加入20mL 75％乙醇后吹打沉淀，再次以22000rpm 4℃离心15min，重复本次操作，收集离心后沉淀，加入适当体积dsDNA溶解缓冲液后缓慢摇晃、溶解。所述dsDNA溶解缓冲液为：20mM HEPES，1mM EDTA，PH＝8.0。
(6)溶解后样本经0.45μm滤器过滤后上样于CM-6FF阳离子交换柱(武汉汇研生物科技有限公司)。上样中待吸光度A260上升至0.01开始收集样本上样流出液，样本上样完毕后继续以层析起始缓冲液清洗，待吸光度下降至0.01后停止收集，即为上样流出液，体积约为25mL。其中，装填层析柱过程中所用的缓冲液为20mM HEPES，1mM EDTA，0.15M NaCl，pH＝8.0。
(7)将流出液分批经Prepack-GL 26/600Finedex 200(江苏千纯生物科技有限公司)分子筛层析进行进一步纯化，收集洗脱液5mL/管。其中分子筛缓冲液为：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH＝7.5。对经过分子筛层析的样本进行蛋白电泳及核酸琼脂糖电泳检测。
本实施例以25g新鲜小牛胸腺为原料，经匀浆、裂解、抽提及层析获得纯化后的dsDNA抗原，经紫外吸光检测仪测得A260为408.0，按照20对应于1mg dsDNA抗原计算得率，共获得20.4mg的dsDNA抗原。
本实施例1所制备的dsDNA抗原经稳定性实验检测，即取多个小样置于37摄氏度环境中72小时后经ELISA检测，结果与稳定前比较差异无统计学意义；依照实施例1方法多次制备dsDNA抗原，批间差异变异系数CV小于15％。
实施例2
本实施例提供一种从蛙鱼精生物组织中提取天然dsDNA抗原的方法，所用的生物组织为蛙鱼精，因蛙鱼精无结缔组织，因此无均浆等样本前处理。具体步骤如下：
(1)在25.0g蛙鱼精生物组织中加入100mL组织裂解液，之后再加入终浓度为100μg/mL的蛋白酶K，终浓度为100μg/mL的RNA酶A，以手持匀浆机打散，混匀样本后置于60℃水浴锅中水浴1.5h，期间间隔15min搅拌一次。水浴后样本加至50mL离心管中，配平后5000rpm下离心20min，小心取离心后上清。其中，裂解液为：20mM Tris-HCl，5％ SDS，0.5％Triton，NaCl 0.5M。
(2)称量所取上清体积，按体积比50:37.5:36:1.5依次加入样本：Tris饱和酚：氯仿：异丙醇，颠倒混匀后分装至50mL高速离心管中，配平后以22000rpm 4℃下离心15min，离心后可见样本分三层，上层为清澈透明水相，中间为乳白色的蛋白质层，下层为淡黄色，小心移取上层水相至量筒中，称量体积。
(3)量筒中加入2.5倍体积的95％乙醇，混匀后分装至50mL高速离心管中，配平后以22000rpm 4℃离心15min，离心后小心弃去上清，每管中加入20mL 75％乙醇后吹打沉淀，再次以22000rpm 4℃离心15min，重复本次操作，收集离心后沉淀，加入适当体积dsDNA溶解缓冲液后缓慢摇晃、溶解。所述dsDNA溶解缓冲液为：10mM HEPES，1mM EDTA，PH＝7.5。
(4)溶解后样本经0.45μm滤器过滤后上样于CM-6FF阳离子交换柱(武汉汇研生物科技有限公司)。上样中待A260吸光度上升至0.01开始收集样本上样流出液，样本上样完毕后继续以层析起始缓冲液清洗，待吸光度下降至0.01后停止收集，即为上样流出液，体积约为25mL。其中，装填层析柱过程中所用的缓冲液为20mM HEPES，1mM EDTA，0.15M NaCl，pH＝8.0。
(5)将流出液分批经Prepack-GL 26/600Finedex 200(江苏千纯生物科技有限公司)分子筛层析进行进一步纯化，收集洗脱液5mL/管。其中分子筛缓冲液为：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH＝7.5。
本实施例以25g新鲜蛙鱼精为原料，经裂解、抽提及层析获得纯化后的dsDNA抗原，经紫外吸光检测仪测得A260为232.00，按照20对应于1mg dsDNA抗原计算得率，共获得11.6mg的dsDNA抗原。
对比例1
本对比例提供一种从小牛胸腺中提取天然dsDNA抗原的方法，其为改进实验中的其中一种提取方法，具体步骤如下：
(1)新鲜小牛胸腺经去除结缔组织等杂质后25.0g，按质量体积比1:5加入PBS缓冲液后以均浆机多次均浆(每次5s，暂停5s)至无块状组织，加入过滤纱布袋(50目)中挤压过滤以除去多余组织等。其中PBS缓冲液为：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4，PH 7.4。
(2)将过滤后的样本加至50mL离心管中，配平后5000rpm下离心20min，小心弃去离心上清，收集离心沉淀，称量沉淀重量。
(3)在沉淀中按质量体积比1:5加入组织裂解液，之后再加入终浓度为100μg/mL的蛋白酶K，终浓度为100μg/mL的RNA酶A，以手持匀浆机打散，混匀样本后置于55℃水浴锅中水浴2h，期间间隔15min搅拌一次。水浴后样本加至50mL离心管中，配平后5000rpm下离心20min，小心取离心后上清。其中，裂解液为：10mM Tris-HCl，1％ SDS，0.5％ Triton，NaCl0.5M。
(4)称量所取上清体积，按体积比50:25:24:1依次加入样本：Tris饱和酚：氯仿：异丙醇，颠倒混匀后分装至50mL高速离心管中，配平后以18000rpm4℃下离心15min，离心后可见样本分三层，上层为清澈透明水相，中间为乳白色的蛋白质层，下层为淡黄色，小心移取上层水相至量筒中，称量体积。
(5)量筒中加入2.5倍体积的95％乙醇，混匀后分装至50mL高速离心管中，配平后以18000rpm 4℃离心15min，离心后小心弃去上清，每管中加入20mL 75％乙醇后吹打沉淀，再次以18000rpm 4℃离心15min，重复本次操作，收集离心后沉淀，加入适当体积TE缓冲液后缓慢摇晃、溶解，获得纯化前的dsDNA抗原。所述TE缓冲液为：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH＝7.5。
(6)将溶解后的样本经0.45μm滤器过滤后上样于DEAE阴离子层析柱(购自武汉汇研生物科技有限公司)进行纯化，装填层析柱过程中所用的缓冲液为20mM Tris-HCl，1mMEDTA，0.15M NaCl，pH 8.0，洗脱过程中，使用的洗脱缓冲液1为20mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.5M NaCl，pH 8.0，洗脱缓冲液2为20mM Tris-HCl，1mM EDTA，4M NaCl，pH 8.0。上样后以洗脱缓冲液1洗脱可见有明显的洗脱峰，收集洗脱缓冲液1，收集完毕后继续以洗脱缓冲液2洗脱，后续洗脱峰不明显，DEAE层析图谱如图1所示。由图1可知，目的产物出现在洗脱峰1中，所得样本得率低，体积扩大明显，浓度低。
采用了酶联免疫法(ELISA)验证，检测不同包被抗原浓度(0.50、2.00ug/ml)下天然dsDNA抗原与sigma公司抗原对含有人源性抗双链DNA抗体的质控品1、质控品2、质控品3的反应滴度，结果如表2和图1所示。
表1对比例1中制备得到的抗原纯化前后和sigma抗原对不同质控品的检测结果比较
Figure BDA0004068737140000101
由表1和图2可知，进一步经过阴离子层析进行纯化处理后，纯化处理后的dsDNA抗原对三种筛选阳性血清(质控品1、质控品2、质控品3)检测结果差异较大，纯化后的抗原对质控品1、质控品3滴度高于纯化前的抗原，但质控品2在不同包被浓度下没有随抗原包被浓度的递增而变化，说明该方法制备得到的dsDNA抗原不能满足诊断原料的需求。
检测分析
(1)纯度分析
同时采用实施例1、2制备得到的纯化的天然dsDNA和购自sigma公司纯化的dsDNA抗原(Product No：D4522)进行纯度的平行对比。实验方法为聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，考马斯蓝染色)，核酸琼脂糖凝胶电泳(EB替代物Golden view)，之后采用BioRad的ChemiDocMP成像仪扫描后对电泳胶结果进行光密度分析(Densitometry Analysis)。
SDS-PAGE检测结果如图3所示，可见sigma公司纯化的dsDNA抗原及本申请实施例中制备得到的抗原均未见有蛋白条带，说明均无明显蛋白残留。琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示，实施例中纯化的dsDNA抗原较sigma公司的产品条带位置一致，条带单一且无明显拖尾降解，说明本发明所制备得到的dsDNA完整度与市售产品相当。
(2)灵敏度及特异性的验证
同时采用实施例1、2中制备得到的纯化的天然dsDNA和购自sigma公司纯化的dsDNA抗原(Product No：D4522)进行灵敏度及特异性的平行对比。实验方法为酶联免疫法(ELISA)，检测不同包被抗原浓度(0.25、0.50、1.00、2.00μg/m)下，对含有相应抗体的质控品反应滴度变化并绘制标准曲线。结果如表2和图5所示，滴度对比中可以看出在各个包被浓度下实施例1、2检测结果均远高于对照抗原。
表2不同包被浓度下各dsDNA抗原ELISA检测滴度结果
Figure BDA0004068737140000111
采用实施例1、2中制备得到的抗原对214例SLE样本进行检测，检测结果如下表3，检测结果灵敏度高，均在92％以上。
表3 214例样本dsDNA抗原血清灵敏度检测结果
Figure BDA0004068737140000112
Figure BDA0004068737140000121
采用实施例1、2中制备得到的抗原对401例样本(124例体检健康样本+277例相关疾病样本)进行检测，检测结果如表4所示，均具有较高的临床特异性，特异度可达到88.03％。
表4 401例样本的dsDNA抗原血清特异性检测结果
Figure BDA0004068737140000122
本发明所提取纯化的天然dsDNA抗原已经通过了公司内部一系列高规格的质量检测，证明其在产量、纯度、活性、特异性以及稳定性上均有大幅度的提高，下游客户的试验检测结果也呈现良好的反馈，均证明了本发明提供方法制备得到的天然dsDNA抗原免疫活性更高、效价更高。
ELISA的具体方法为：将抗原与固相载体联结，形成固相抗原后洗涤除去未结合的抗原及杂质，加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。再经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其它成分在洗涤过程中被洗去，加入HRP酶标抗体后，固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与受检抗体的量正相关，加入酶底物使酶呈色，通过酶标仪测定ELISA检测板中的吸光值，评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。本发明中ELISA检测中所用的包被缓冲液为pH 7.5的PBS缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4)。首先以包被缓冲液配制所需浓度样本，按100μL/孔加至96孔ELISA检测板，4℃下静置24h，其次弃去孔中液体，以PBST缓冲液洗涤3次后以含5％ BSA的封闭液加入200μL/孔，置于37℃封闭40min后弃去。加入稀释后血清100μL(一抗血清稀释比例为1:300)，混匀后，37±0.5℃温育5～20min后去上清，以PBST缓冲液洗涤3次后加入稀释后二抗血清100μL(二抗血清稀释比例为1：3000)，混匀，37±0.5℃温育5～20min后去上清，以PBST缓冲液洗涤3次，加入100μL发光底物至检测管中，混匀，酶标仪检测发光强度。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种制备高免疫原性的天然dsDNA抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
向组织样本中加入裂解液、蛋白酶K和RNA酶A，均浆后置于45~60℃水浴锅中水浴消化，离心取上清；
向上清中按照样本：饱和酚：氯仿：异丙醇体积比50:（25~40）:（32~40）:（1~2）的比例加入抽提试剂抽提，取上层水相，乙醇沉淀后溶解即得粗dsDNA 抗原；
将粗dsDNA抗原依次经过CM阳离子交换层析、葡聚糖-琼脂糖复合凝胶过滤介质200分子筛层析纯化后，即得。
2.根据权利要求1所述的制备高免疫原性的天然dsDNA抗原的方法，其特征在于，CM阳离子交换层析装填层析柱时所用的缓冲液为10~50mM HEPES，0.5~5mM EDTA ，0.05~0.5MNaCl，pH 5.0~10.0。
3.根据权利要求2所述的制备高免疫原性的天然dsDNA抗原的方法，其特征在于，CM阳离子交换层析所用的层析柱为CM-6FF，葡聚糖-琼脂糖复合凝胶过滤介质200分子筛层析为Prepack-GL 26/600 Finedex 200。
4.根据权利要求1所述的制备高免疫原性的天然dsDNA抗原的方法，其特征在于，葡聚糖-琼脂糖复合凝胶过滤介质200分子筛层析装填层析柱时所用的缓冲液为5~50mM Tris-HCl，0.5~5mM EDTA，pH 4.5~9.0。
5.根据权利要求1所述的制备高免疫原性的天然dsDNA抗原的方法，其特征在于，裂解液为：5~50mM Tris-HCl，0.5~5% SDS，0.1~1.0% Triton，0.1~1.0M NaCl。
6.根据权利要求1所述的制备高免疫原性的天然dsDNA抗原的方法，其特征在于，组织样本包括但不限于小牛胸腺组织、蛙鱼精、Hela细胞。
7.根据权利要求1所述的制备高免疫原性的天然dsDNA抗原的方法，其特征在于，当组织样本含有结缔组织时，还需要经过前处理去除结缔组织。
8.根据权利要求7所述的制备高免疫原性的天然dsDNA抗原的方法，其特征在于，前处理方法为：加入均浆缓冲液，纱布过滤；其中均浆缓冲液为：10~100mM Tris-HCl，0~0.1MNaCl，pH 5.0~8.5。
9.权利要求1~8任一项所述的方法制备得到的dsDNA在制备用于系统性红斑狼疮自身免疫性疾病的临床辅助诊断试剂盒中的应用。
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