JPH02209897A - シクロスポリン結合タンパク、及び生理活性シクロスポリン分析法の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、流体サンプル中のシクロスポリン及びその薬
理活性類似体、誘導体及び代謝物質の分析に関する。

［従来の技術］ シクロスポリンは、真菌性起源（Ｔ、１ｎｆｌａｔｕａ
＋Ｇ　ａｍｓ）の、中性で高度に疎水性の環状ウンデカ
ペプチド類中の一群に対する一般名である。シクロスポ
リンは固形臓器移植のレシピエンドに対して免疫抑制薬
として広く用いられてむり、同種の骨髄移植後に於ける
移植組織−被移植体反応を妨げるのに有効である。一般
的には、アン、インターン、メト、（Ａｎｎ、　Ｉ　ｎ
ｔｅｒｎ、Ｍｅｄ、）（：ｌ−ヘアＤ、　Ｊ　。

（ＣｏｈｅｎＤ、Ｊ　、）等、１０１：６６７（１９８
４））を参照せよ。

シクロスポリンは又、自己免疫疾患、例えばタイプ１糖
尿病くメリツス）ｍｅｔ　１ｉｔｕｓ（アラサン、Ｒ０
（Ａｓｓａｎ、Ｒ，）等、ランセット、６７（１９８５
年１月１２日り、乾酊（エリス、Ｃ，Ｎ、　（Ｅ　ｌ１
ｉｓ、　Ｃ６Ｎ、）等、Ｊ、アメリ、メト、アソーシ、
（Ｊ、Ａｍｅｒ。

Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、）、　２５６　：３１１０（１９
８６））及び春季角結膜炎（ベンエズラ、Ｄ、（Ｂｅｎ
　Ｅｚｒａ、Ｄ、）等トランスプラント・ブロン、　（
Ｔ　ｒａｎｓｐｌａｎＬ　　Ｐ　ｒｏｃ、　）、２０：
６４４（１９８６））に対する可能な治療薬として研究
され続けている。

免疫抑制シクロスポリン及びその代謝物は、Ｔ−リンパ
球ヘルパーとエフェクター細胞の増殖を妨げることが知
られている。そしてシクロスポリンＡ、即ち親シクロス
ポリン（ＣｓＡ）は、刺激を受けたＴ細胞によりリンホ
カインの生成を選択的に抑制する。それでも、シクロス
ポリンの作用機構ははっきりしていない。一般的には、
ドラッグ。

Ｒ，Ｊ、（Ｄｒｕｇｇｅ、　Ｒ，Ｊ、）等のトランスプ
ラント・ブロン、２０：３０１（１９８８））を参照せ
よ。

調節生化学物質はその作用機構の初段階とじて巨大分子
受容体、即ち典型的にはタンパク質又はグリコプロティ
ンと相互作用するという事実から、シクロスポリンに対
するそのような受容体が探し求められてきた。受容体の
候補として幾つかが同定されているが、推定されたこれ
らの受容体のどれが（もし存在すれば）、シクロスポリ
ンの作用機構に直接関係するのか未だ判明していない。

ＣｓＡに対する可能性ある受容体としては、（１）シク
ロフィリン、即ちリンパ球、肝細胞、甲状腺細胞及びそ
の他の細胞タイプの可溶性細胞質フラクションから単離
した１７．６２８ダルトン（ｄａｌ、）のタンパク質（
ハンドシュマツカー、　Ｒ，Ｅ、　（Ｈａｎｄｓｈｕｍ
ａｃｈｅｒ。

Ｒ，Ｅ、）等、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２２
６　：５４４（１９８４）；バーディング、　Ｍ、　Ｎ
、　（Ｈａｒｄｉｎｇ、　Ｍ。

Ｎ、）等、Ｊ、バイオ口、ケム、（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｆｆｉ、）。

２６１：８５４７（１９８６）；ハンドシュマツカーＲ
、Ｅ　、　（Ｈａｎｄｓｈｕｍａｃｈｅｒ、　Ｒ、Ｅ　
、　）等、米国特許第４゜７２２．９９９号、１９８８
年２月；バーディング。

Ｍ、　Ｎ、（Ｈａｒｄｉｎｇ、Ｍ、　Ｎ、）等、アドバ
、インフラム。

リサ、　（Ａｄｖ、　Ｉ　１ｆｌａ＊ｍ、　Ｒｅｓ、　
）、１２：２８３（１９８８）；アガーウオール、Ｒ，
Ｐ、（Ａｇａｒ＊ａｌ、　Ｒ，Ｐ、）等、トランスプラ
ンテーション（Ｔ　ｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）。

４２：６２７（１９８６））；（２）カルモデユリン、
即ちＣａ”−要求酵素（Ｃａｘ”　−ｒｅｑｕｉｒｉｎ
ｇｅｎｚｙｍｅｓ）の効果を伝達する１６．６８０ダル
トンの細胞内タンパク質（−射的には、ヘス、　Ａ、　
Ｄ。

（Ｈｅｓｓ、Ａ、Ｄ、）等、トランスプラント・プロワ
。

（１８：２１９（１９８６）を参照せよ。）；及び（３
）Ｔ及びＢリンパ球表面上のプロラクチン受容体（ラッ
セル、Ｄ、Ａ、（Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｄ、Ａ、）等、イム
ノル（Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　）、１３４：３０２７（１
９８５））が含まれる。

シクロスポリンＡ１即ち最初に単離されるシクロスポリ
ンは全合成されている。それは約１２０２ダルトンの分
子量を有する。８位のＤ−アラニン（これはｒＲＪ配置
を有する。）を除いて全てのアミノ酸は「Ｓ」配置の中
性Ｌ−アミノ酸である。１１３．４．６．９．１０及び
１１位のアミノ酸はＮ−メチル化されている。アミノ酸
のうち１０個は既知の脂肪族アミノ酸であるが、１位の
アミノ酸（これはＬ−９アミノ酸とも呼ばれる。）はβ
−ヒドロキシアミノ酸である。−射的には、ウエンガ−
＊　Ｒ、（Ｗｅｎｇｅｒ、　Ｒ、）　：イン（Ｉｎ）：
ホワイトＤＪＧ出版（Ｗｈｉｔｅ　　Ｄ　Ｊ　Ｇ　（ｅ
ｄ））　ニジクロスボリンＡに関する国際全議会　（ケ
ンブリッジ、英国、１９８１年９Ｌエルスヴイアニユー
ヨーク（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）、
１９８２．ｐｐ、１９〜３４）を参照せよ。Ａ−Ｚのシ
クロスポリンは、今や既知であり（コベル、Ｃ，Ｆ、（
Ｋｏｂｅｌ、Ｃ，Ｆ、）２３７（１９８２））、広範な
種類の類似体及び誘導体が合成されている（ローインク
ーラー、Ｊ。

（ＲｏｓｅｎＬｈａｌｅｒ、　Ｊ　、　）等、ＰＣＴ出
願公開ＷＯ３６１０２０８０，１９８６年４月ＩＯ日）
。

シクロスポリンは肝臓中で、主に脱メチル化、ヒドロキ
シル化及び分子内環化を経る広範な代謝を受ける。モー
ラ−、Ｇ　、　（Ｍ　ａｕｒｅｒ、　Ｇ　）＋　）ラン
スプラント・プロワ、、１７：１９（１９８５）。今日
迄に特性決定（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ）された代謝
物の全てが、分子の環状構造を保持しており、親ＣｓＡ
のように代謝物は標的組織に広範に結合している。

ライラフエル、　Ｂ　、　（Ｒｙ４ｆｅｌ、　Ｂ、　）
等、トランスプラント・ブロン、、２０：５７５（１９
８８）。ＣｓＡの代謝物のうち成る２１個のものは現在
知られており、Ｍ１〜Ｍ、１と命名されている。Ｍ　１
、Ｍ　１＠及びＭ　ｌ　７はＣｓＡの主要な代謝物であ
る。

臓器の拒絶反応を抑制するに必要な治療薬濃度以上の濃
度で、ＣＬＩＡ及びその代謝物のうちの成る物が存在す
る時は、これらは患者に好ましくない臨床的副作用をも
たらす。腎機能不全は一般に、シクロスポリンＡで免疫
抑制された患者に起こるが（カーノ、Ｂ、Ｄ、（Ｋａｈ
ａｎ、Ｂ、Ｄ、）等、トランスプラント・ブロン、、１
７：１（１９８５））、ＣｓＡ代謝物も腎毒性の可能性
があるかどうかについては議論の余地が残る（反対意見
としては、ライラフエル等の前記の論文を参照せよ。）
。副作用として時に、上腹部の痛み、短期感覚異常、軽
度の多毛症、歯肉過形成、及び感染症を、惹き起こす。

ペン・エズラ、Ｄ、（Ｂｅｎ、Ｅｚｒａ、Ｄ、）等、前
記の論文。このように、移植にシクロスポリンを臨床的
に使用することは複雑である。即ち、投与量が少ないと
十分な免疫抑制が行なわれず、又過剰に投与すると腎毒
性、肝細胞毒性、及び敗血症をもたらすので、この間の
狭い範囲が治療薬として適した投与量となる。ライッフ
ェル、Ｂ０等、アーキ。

トキシコール、（Ａｒｃｈ、Ｔｏｘｉｃｏｌ、）５３　
：ｌ　Ｏ７（１９８３）、マイヤース、Ｂ、Ｄ、（Ｍｙ
ｅｒｓ、Ｂ、Ｄ、）等、Ｎ、イング、Ｊ、メト、（Ｎ、
Ｅｌ］（、Ｊ　、Ｍｅｄ、）、３１１：６９９（１９８
４）。この様に、移植患者の血漿中のＣｓＡ１度を絶え
ず長期間モニターせねばならない。そうする為には、Ｃ
ｓＡとその類似体、誘導体及び代謝物とを区別出来るだ
けでなく、（免疫抑制剤又は毒物として）薬理活性を示
す代謝物と薬理不活性なものとを区別出来る分析法を用
いなければならない。

現在、ＣｓＡとその代謝物は高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）、３Ｈ又は１２′Ｉをトレーサーとして
用いた放射免疫定量法（Ｒ’ｌＡ）、及び蛍光偏光免疫
定量法（ＦＰＩＡ）により定量されている。ＨＰＬＣを
用いた固相抽出法により、患者のサンプルからＣａＡと
その代謝物の全てが分離・同定されている。クリスチャ
ンズ、　Ｕ、　（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ。

Ｕ、）等、クリニ、ケミ、（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ、）、
３４：３４（１９８８）；レシスマイヤー、　Ｇ　、　
Ｌ　、　（Ｌ　ｅｎｓｆｌＩｙｅｒ。

Ｇ、　Ｌ、）等、トランスプラント・ブロン、、　２０
　：（３１４（１９８８）；チャールズ、　Ｂ　、　Ｇ
、　（Ｃｈａｒｌｅｓ＋　Ｂ　。

Ｇ、）等、セラビ、ドラ’ｙグ、モニター（Ｔ　ｈｅｒ
ａｐ、　Ｄ　ｒｕｇ。

Ｍｏｎ１ｔｏｒ）、　１０　：９７　（１９８８）。そ
の様な方法は、病院の研究員にとっては時間がかかり過
ぎ、定量するには高価であり、更にデータがとれるのが
一般的に遅過ぎるのみならず、ＣｓＡとその代謝物の全
てを分離・評価するには限界があり、更に又、生理活性
なものと不活性なものとを区別する事が出来ない。ＨＰ
ＬＣは、未代謝ＣｓＡの測定には最も適していると考え
られる。フェルダーＲ，Ａ、　（Ｆ　ｅｌｄｅｒ、　Ｒ
，Ａ、）等、クリニ、ケミ、（３２：１３７８（１９８
６）。） ＲＩＡの方法は、患者サンプル中のシクロスポリンとそ
の代謝物を定量するのに使われている。

種々のＲＩＡ法の全てが基本段階として、ラベルした（
３Ｈ，１１５Ｉ、又は蛍光分子）シクロスポリンとその
シクロスポリン分析体との間の、それらの化合物に特有
の抗体上の結合サイトをめぐる競争反応を含む。その競
争反応の結果、抗体に結合し且つラベルされたシクロス
ポリンは、未ラベルのシクロスポリンアナライト（ａｍ
ａｌｙｔｅ）によりサンプル中の量が減少する。−船釣
には、マホニーＷ、　Ｃ、（Ｍ　ａｈｏｎｙ、　Ｗ、　
Ｃ，１米国特許第４，７２７゜０３５号（１９８８年、
２月２３日）：ローインクーラー、Ｊ、ＰＣＴ出願公開
ＷＯ３６／１２０８０（１９８６年、４月１０日）を参
照せよ。多クローン抗体を使用するＲＩＡに於いては、
粗化合物と、その代謝物のうち必要な免疫決定因子（こ
れは、７〜３２％の交叉反応性と見積もられた。フエル
ダー、Ｒ，Ａ、（Ｆｅｌｄｅｒ、Ｒ，Ａ、）等、前記論
文。）を保有するもののみの合計が計算される。後者の
うちの成るものだけが、免疫抑制薬又は毒物として薬理
活性である。更に、”Ｊ−ＣｇＡをトレーサーとして用
いたＲＩＡ値は、’Ｈ−ＣｓＡを用いた値と食い違った
結果を与える。この理由は未だ分っていない。フェルダ
ー、Ｒ，Ａ、等、前記論文。

単クローン抗体を用いるシクロスポリン及び代謝物のＲ
ＩＡ法も又、知られている。ケスニオ−（Ｑ　ｕｅｓｎ
ｉａｕｘ）は、２つのタイプの単クローン抗体（Ｍａｂ
）を開発した。即ち、１つはＣｓＡに特異的に、もう１
つはＣｓＡとその代謝物の両方に非特異的に結合するＭ
Ａｂである（ケスニオ−１■１等、クリニ、ケミ、、３
３：３２（１９８７乃。多クローン抗体と２つのＭＡｂ
合成体を使用し、且つ放射線ラベル体−（ＲＩＡ）と蛍
光ラベル体（ＦＰＩΔ）を用いた免疫定量法と、ＨＰＬ
Ｃ法とを比較すると、ｔＡ若しくはＦＰＩΔの何れも、
多クローン抗体と非特異的ＭＡｂによりＣｓＡとその代
謝物の成る物を測定出来るが、一方、特異的ＭＡｂとＨ
ＰＬＣによりＣｓＡの粗化合物を測定できる。ギボンズ
、　Ｓ　、　（Ｇ　１ｂｂｏｎｓ、　Ｓ　、　）等、ト
ランスプラント・ブロン、２０：３３９（１９８８）。

その他としては、ＣｓＡに対してＲＩＡは非常に不明確
であり、更に、肝臓移植患者の肝機能劣化を示す如く全
Ｃｓ濃度をＨＰＬＣの測定値よりも過大に見積もる、と
いうことが判っている。ブライデン、Ｇ、Ｔ。

（Ｂ　１ｙｄｅｎ、　Ｇ、　Ｔ、）、クリニ、ファーマ
、セラヒ。

（ＣＩｉｎ、　Ｐ　ｈａｒｍ、　Ｔ　ｈｅｒａｐ、）、
３７：１８２（１９８５）；ホルト、Ｄ、Ｗ、（Ｈｏｌ
ｔ、Ｄ、Ｗ、）等、クリニ、ケミ、。

３４：１０９１（１９８８）。

このように、ＣｓＡ及びＣｓＡ代謝物に対する分析方法
の違い、更に種々の試験による交叉反応性スペク゛トル
の違いが、生物学上どの程度重要であるか不明確であり
、それ故、ＣｓＡを投与した後に発生する可能性のある
治療薬とは逆の副作用を予見し且つ回避するために、ど
ちらの方法及びマトリックスが治療薬のモニタリングに
最適であるかを決定するための多大な相関研究が求めら
れている。

このように、シクロスポリン、その類似体、誘導体、及
び代謝物に対して、迅速で、単純で、且つ費用がかから
ず、流体サンプル中のこれらの分子の濃度が正確に定量
され且つ再現性を有し、更に又、薬理活性化学種と非活
性化学種との区別が出来る定量分析法が強く求められて
いる。

［発明が解決しようとする課Ｂ］ 本発明者等は、流体サンプル中及び血液細胞中に於ける
シクロスポリンとその類縁体の機能活性度に対する新し
い分析法を見い出した。この方法は、結合剤として水溶
性の細胞質巨大分子シクロスポリン結合タンパクを用い
る競争的なタンパク結合分析法を含む。従って本発明は
、シクロスポリン及び薬理活性代謝物に対し特異的な水
溶性巨大分子結合タンパクを提供することを目的とする
。

又本発明は、前述の水溶性結合タンパクを用いた、シク
ロスポリン及び薬理活性代謝物に対する、水溶液を基本
とした競争的タンパク結合分析法を提供することを目的
とする。

更に本発明は、前述の可溶性結合タンパクを用いた、シ
クロスポリン及び薬理活性代謝物に対する、固体状態の
競争的タンパク結合分析法を提供することを目的とする
。

更に、又本発明は、放射性原子、酵素、蛍光分子、又は
化学発光分子でラベルされ、本発明の競争的タンパク結
合分析法に使用するのに適したシクロスポリンを提供す
ることを目的とする。

本発明を以下に記述した好ましい態様から、及び特許請
求の範囲から更に明らかにする。

［課題を解決するための手段］ 「受容体」という用語は、成る配位子を認識出来且つ選
択的にそれと結合し得る巨大分子に関して言い、配位子
と結合した後に、この巨大分子は成る化学的又は物理的
シグナルを発生することが出来、このシグナルにより連
鎖現象を始めて生物学的反応を導くということは一般的
に認められている。ブレーヒャ−，Ｍ、（Ｂｌｅｃｈｅ
ｒ、Ｍ、）等、「受容体と人間の疾患」（ウィリアムズ
＆ウィルキンズ（Ｗｉ１１ｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）
、バルチモア、１９８１年、第１章）。

それ放水発明に於いては、競争的タンパク結合分析法に
使用される水溶性結合タンパクは、天然の受容体の特性
、即ちシクロスポリン薬剤及びその類似体、誘導体、及
び代謝物の薬理作用の最初の段階（即ち、薬剤のタンパ
ク質巨大分子への特異的可逆的結合）を行なう、という
特性を備えるということは重要である。

本発明に従って行なう分析法に使用するのに適した水溶
性特異的結合タンパクは、哺乳類細胞、例えば人間の末
梢血のリンパ球、単核細胞、又は白血病細胞、ウシの胸
腺グランド、人間若しくは子牛の脾臓細胞、人間若しく
は動物の胸腺様又はリンパ腫細胞系、人間若しくは動物
の肝臓又は肝癌細胞の抽出物から、又は、人間若しくは
動物の赤血球から調製される。シクロスポリン結合タン
パクは多種の系統発生学、例えば節足動物、トレマトー
ダ、軟体動物、菌類、海綿動物及びイーストに存在する
。好ましくは、人間の又は確立された細胞系の白血球で
ある。最も好ましくは、正常な人間又は癌患者の単核白
血球である。

細胞質とは、細胞のうち非粒状非膜部であると生物学的
には定義される。可溶性細胞質（即ち、サイトンル）と
は、細胞抽出物を高い９−力で、即ち２０．０００９以
上で少なくとも１５分間遠沈した後の上澄液フラクショ
ンであると、操作上は定義される。本発明を行なうのに
適したシクロスポリン結合タンパクは、この上澄液中に
存する。

次に述べる当業者に周知の細胞分裂法及びサイトツル巨
大分子単離法は、本発明の実施の上で適する。一般に、
単離した白血球又は赤血球を次の方法のうちの何れかで
分裂させる。即ち、（１）低張溶液中、低温で凍結−解
凍、次いでガラス／ガラス又はテフロン／ガラス均質化
チューブ中捻やかに均質化；（２）低温で短時間の音波
処理；（３）低温で低張細胞溶解、次いで細胞溶解物の
狭いオリフィス（例えば、２６ゲージ皮下注射針）への
強制的反復通過；又は（４）低張溶液中での直接均質化
。

本明細書中、最も好ましい方法は、白血球のペレットを
低張塩溶液中、低温で凍結させ、次いで急速解凍して細
胞を溶解させ、そしてテフロン／ガラス均質化器中でそ
の溶解物を穏やかに均質化する。

前述の方法の何れかによる細胞分裂の後、この分裂調製
物を当業者に周知の方法で分別し、サイトツルタンパク
質を単離する。好ましい方法では、細胞均質物をサクロ
ース溶液として調整する（０゜２５〜０．３２Ｍのサク
ロース最終濃度）。次いで真空中、４℃で３０〜９０分
間２０．０００〜４０．０００９で遠沈する。シクロス
ポリン受容体夕ンパク質は上澄液中に存在し、使用する
用意ができる迄凍結して（例えば、−７０℃で）これを
保存しても良い。その他の方法としては、細胞を等張緩
衝液（例えば、０．１５ＭＫＣ（，２０ａ＋ＭトリスＨ
ＣＱ緩衝液、ｐＨ７，２，５ｍＭ２−メルカプトエタノ
ール）中で短時間音波処理して分裂させる時に、サイト
ツルを真空中４℃で１００．０００９の遠沈で回収する
。シクロスポリン結合タンパクはこのサイトツル中に存
在し、使用する迄凍結する。

更にその他の有用な方法としては、この混合物を等張圧
に調節した後、細胞破片を５００〜１０００９で１０〜
２０分間予備遠沈して均質物から除去し、そして上澄液
をｉｏｏ、ｏｏｏ〜１５０．０００ｇで３０〜９０分間
、４℃、真空中遠沈してサイトツルを得る。受容体は上
澄液中に存在する。

細胞の分別法が何であれ、シクロスポリン結合タンパク
は、分裂細胞調製物の水溶性部分中に存在することは明
らかである。

前述のサイトツルはそのまま本発明の競争的タンパク結
合分析に用いられる。成るいは、サイトツルのシクロス
ポリン結合タンパクを、分析に使用する前に予め部分的
に精製し濃縮する。サイズのふるい分け法及び親和性ク
ロマトグラフィー法が、精製及び濃縮工程に好ましい。

そのような分別法は米国特許第４．７２２，９９９号（
ハンドシュマツカー、　ＲｏＥ、　（Ｈａｎｄｓｃｈｕ
ｍａｃｈｅｒ、　Ｒ，Ｅ、）等、（１９８８年２月）；
コレトスキイＡ　、　Ｊ　、　（Ｋ　ｏｌｅｔｓｋｙ。

Ａ、Ｊ、）等、Ｊ、イムツル、（Ｊ　、　Ｉ　ｍ＋ａｕ
ｎｏ１．）、　１３７　：１Ｏ５４（１９８６）：ハー
ディング、　Ｍ、Ｗ、　（Ｈａｒｄｉｎｇ。

Ｍ、　Ｗ、　）等、Ｊ、バイオ口、ケミ（Ｊ　、　Ｂ　
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）２６１：８５４７（１９８６
）；及びアガーウオール６）に開示されており、それら
を、可溶性細胞タンパク質分別法の範囲に於いて参照に
より導入する。薄膜分子量ふるい分けフィルターも又、
粗分別に使用しても良い。３．０００〜１５０，０００
の分子量を持つタンパク質の分別に適したモレキュラー
シーヴ（例えば、セファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ
）Ｇ−７５又はＧ−１００，ファーマシア・ファイン・
ケミカルズ社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　Ｆｉｎｅ　　Ｃ
ｈｅｌｉｉｃａｌｓ。

Ｉ　ｎｃ、　）、ビスカッタウェイ（Ｐ　１ｓｃａｔａ
ｖａｙ）、　Ｎ　Ｊ　、又はバイオ−ゲルＰ−１００，
パイオーラッド（Ｂｉ。

Ｒａｄ）、リッチモンド、ＣＡ）が、好ましい。本発明
の競争的タンパク結合分析法の目的のために、（１）タ
ンパク質が、この分析法（即ち、放射活性、蛍光偏光、
化学発光及びその類似）に対し統計的に意味を持つ範囲
でラベルしたシクロスポリンと結合する場合、（２）未
ラベルのシクロスポリン及び生物学的に活性な類似体、
誘導体及びその代謝物が、タンパク買上の特定の結合サ
イトをめぐってラベルしたシクロスポリンと競争する場
合、及び（３）ノイズに対するシクロスポリン比、即ち
ラベルしたシグナルの全ての結合の、この分子の非特異
的結合に対する比（これらの用語は、以下の「競争的タ
ンパク結合分析法の原理」に於いて定義されている。）
が少なくとも１．１．好ましくは少なくとも１．２であ
る場合、タンパク質の分別は好ましい。

本発明に適したラベルしたシクロスポリン本発明の競争
的タンパク結合分析法には、ラベルしたシクロスポリン
が必要である。３Ｈ，”’　！又はフルオレセインでラ
ベルしたシクロスポリンは、市販されている。［３Ｈ］
Ｃ５Ａ（ラベル位置：９５％［Ａｂｕ−’Ｈ１−シクロ
スポリン及び５％［Ｎ−メチル−３Ｈ］−サル（Ｓａｒ
））シクロスポリンは、サンドツーファーマシューティ
カルズ（ＳａｎｄｏｚＰ　ｈａｒｍａｃｅｕｔ　１ｃａ
ｌｓ、　）ハノーバー、Ｎ、Ｊ、）又はサンドラ・リミ
テッド（Ｓａｎｄｏｚ　　Ｌｔｄ、バーセル（Ｂａｓｅ
ｔ）。

スイス）より市販されている。［３Ｈ］・ジヒドロＣｓ
Ａ　ハ、’Ｈｒ（二ニー・イングランド・ニュークリア
６コーブ、（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｎｕｃｌｅ
ａｒ　　Ｃａｒｐ、）。

ボストン、　ＭＡ）を用いてウィルズバッハ（ｌｆｉｌ
ｚｂａｃｈ）の方法で、ＣｓＡ中のＭｅＢｕｔ２重結合
を触媒還元して調製される。［１ｆｉｌｌｌ］　　Ｃ８
Δは、イムノ・ニュークリア１コープ（Ｉ　ＩＩ＋ｍｕ
ｎｏ　　Ｎ　ｕｃｌｅａｒ　　Ｃｏｒｐ、　。

スイス、ステイルウォーター（Ｓ　ｔｉｌｌｗａｔｅｒ
）Ｍ　Ｎ　。

５５０８２）のインクスター試薬（ＩＮｃｓＴＡＲｋｉ
ｔ）の一部として市販されている。蛍光偏光検出法用の
Ｃ５Ａ−フルオレセイントレーサー（これはＴＤＸ装置
と共に使用するのに適している。）は、アボット・ラボ
ラトリーズ（Ａ　ｂｂｏｔｔ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ。

アボット・パーク、　Ｉ　１）より市販されている。

ＣｓＡは又、米国特許第４，４２７，０３５号（マホ＝
　−、Ｗ、　Ｃ，（Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｗ、　Ｃ，）等、
１９８８年２月２３日）記載の方法に従って、フルオレ
セインインチオシアネートとの反応により、フルオレセ
インでラベルすることが出来る。

１１１１１−ラベルしたヒスタミン−ＣｓＣは、クリニ
、ケミ、（つｙｔ　７．Ｐ、Ｙ、（Ｗｏｎｇ、Ｐ、Ｙ、
）等、３２：４９２（１９８６））記載の方法に従って
調製される。

標準として使用するＣｓＡ、ＣｓＢ、ＣｓＣ，及びＣｓ
Ｄ、そしてＣｓＡ代謝物は、サンドラ・ファーマシュー
ティカルズ（ハノーバー、Ｎ、Ｊ、）より市販されてい
る。

アルカリ性フォスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼ
の開裂により励起される水溶性１．２＝ジオキセタンの
様な化学発光ラベル体については、ブロンスタイン［Ｂ
　ｒｏｎｓｔｅｉｎ、　Ｉ　、　Ｙ　、等、Ｊ、バイオ
ルミネ、ケミルミネ、　（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌｕｍｉｎ
、　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ、　）２：１８６（１９８８
）］及びボイタ［Ｖｏｙｔａ、　Ｊ　、等。

クリニ、ケミ、、３４：１５７（１９８８）コにより記
載されている。そしてこれらは、クエスト・システム・
インク、　（Ｑ　ｕｅｓｔ　　Ｓ　ｙｇｔｍｓ、　Ｉ　
ｎｃ、ベツドフォード、ＭＡ０１７３０．キャット、　
（ｃａｔ、）　　ｎｏ、ＥＤ−０１０）より市販されて
いる。

競争的タンパク結合分析法の原理は、次の一連の反応に
基づく。

（式中、Ｓはあらゆる被分析物、Ｓ＊はＳのラベルした
類似体、Ｒは特異的な反応物（即ち、受容体タンパク質
又はグリコプロティン）、そしてＳ＊−ＲとＳ−Ｒはそ
れぞれ受容体に結合し、ラベルした、及び未ラベルのＳ
を表わす。−射的には、ブレヒ＋　＋、　Ｍ、　（Ｂ　
１ｅｃｈｅｒ、　Ｍ、　）等、前記論文を参照せよ。） 定常条件下、添加したラベル配位子のトレーサーｆｔの
Ｓ＊とその受容体との反応で、この２つの物質量に於い
て錯体、Ｓ”−Ｒを形成する。この錯体の単離は、受容
体の同定と定量の両方に役立つ。未ラベルのアナライト
、Ｓ％を加えてＳ−Ｒが形成され、競争的平衡が成立し
た時、単離したＳ−Ｒ錯体中にはより少ない量のラベル
体が存在する。この減少量は、存在する未ラベルのアナ
ライトの量に比例する。実際的には、標準曲線をつくる
為に、固定量の受容体タンパク質を０〜過過飽和度のＳ
存在下、固定したトレーサー量の８８にさらす。後者の
濃度は理想的には、特異的結合のＫａよりも数オーダー
大きいものである。そしてこのフラクション（ｆ非特異
的結合」）は、非特異的結合が配位子濃度の直線的関数
であると考えられるので、全ての配位子濃度に対し同じ
であると考えられる。定常状態に達した後、？−：ｉ錯
体を単離し定量する。最も競争的になった容器、即ち過
飽和濃度のＳを含む容器中のラベル体の量を全結合値よ
り差引くことにより、非特異的結合データを補正する。

標準又は基準目盛曲線は、 ［５（ｓｔｄ）　　ＮＳＢ／Ｂ（ｏ　５ｔｄ）　　ＮＳ
Ｂ］１００対ｌｏｇｃｓ］（式中、Ｂ　（ｓｔｄ）は標
準Ｓの各濃度に於ける９Ｓの結合体く即ち、夛［コ１）
のｍ、　Ｂ（ｏ　５ｔｄ）は標準Ｓの非存在下に於ける
＊Ｓ結合体量、そしてＮＳＢは標準Ｓの各濃度に於ける
非特異的結合を表わす。）についてプロットすることに
より得られる。

シクロスポリンの標準溶液 本発明の分析法に使用するシクロスポリン標準溶液は、
次の様にして調製される。シクロスポリンのストック溶
液（ｓｔｏｃｋ　　５ｏｌｕｔｉｏｎ）（典型的には、
１０〜２０μｖ／ｍｅであるが、他の濃度であっても良
い。）を水と完全に混ざる極性溶媒中でｉ！２する。ス
トック溶液を薬剤が含まれない純血液、純血漿、又は純
血清で１０倍に稀釈して検ｆ１１標準を作る。薬剤を含
まない純血液（ｗｈｏｌｅ　　ｆｌｏｏｄ）、純血漿、
又は純血清で更に稀釈して０〜２０００ｎｙ／ｍＱの一
連のシクロスポリン稀釈標準を作る。

検量標準溶液に残存する溶媒濃度は、結合反応に影響を
与えない限り、決定的なものではない。高濃度のシクロ
スポリン標準検量溶液（例えば、２０００μ９／Ｉのは
、４℃で貯蔵しておくことが出来るが、調製してから２
４時間以内に使用せねばならない。アルコールは好まし
い溶媒で、Ｃ１〜Ｃ８の一級、二級又は三級アルカノー
ルから選択される。アセトニトリルも又、シクロスポリ
ンのストック溶液に適した溶媒である。

分析前に於ける、流体サンプルからのシクロスポリン抽
出 患者サンプル中のシクロスポリンとその類似体、誘導体
、及び代謝物、対照サンプル及び、薬剤を含まない純血
液、純血清又は純血漿で調製された標準は、分析に適し
た形態で供されねばならない。

好ましい方法に於いては、シクロスポリン含有流体サン
プルのアリコートを、約２０体積のメタノールで抽出し
、遠沈により沈降タンパク質を沈澱させる。界面活性剤
溶液で純血液のアリコートを抽出することも適する。例
えば、０．０３％（ｖ／ｖ）トウウィーン（Ｔ　ｗｅｅ
ｎ）　２０ポリオキシエチレン（２０ソルビタンモノラ
ウレート）含有の２０１１Ｉｌｌトリス緩衝液（ｐＨ８
，５，５〜１０体積）は適した抽出剤である（フエルダ
ー、　Ｒ，Ａ、、前述の論文）。シクロスポリン及び代
謝物は又、ベーカーＩＯ抽出システム（Ｓ　Ｐ　Ｅ、　
Ｊ　、Ｔ、　Ｂａｋｅｒ、　　フィリップスバーブ、Ｎ
Ｊ）及び小型のシアノディスポーザブル抽出カラム（３
ｉｆｆ容量、４０ｎｍ直径）を使用するイーの方法（Ｙ
ｅｅ、　Ｇ、Ｃ，等、クリニ、ケミ、、２８：２２６９
（１９８２））により血清含有サンプルから抽出するこ
とが出来る。純血液に適したその他の方法としては、純
血液サンプルを、２体積のメタノールと１体積の水で抽
出し、沈降タンパク質を遠沈により除去し、シクロスポ
リン含有上澄液を、チャールズの方法（Ｃｈａｒｌｅｓ
、　　Ｂ、Ｇ、等。

セラピ、ドラッグ、モニター（Ｔ　ｈｅｒａｐ、　　Ｄ
　ｒｕｇＭｏｎｉｔｏｒ）、　　１０　：９７　（１９
８８））に従って、セブーＪ’ｅｙりＣ＋ｓ（Ｓ　ｅｐ
−Ｐ　ａｋ　　Ｃ１８）サンプル：Ａ製カートリッジ（
ウォーターズ・クロマトグラフィｍ−デイビジョン（Ｗ
ａｔｅｒｓ　　ＣｈｒｏｉａｔｏｇｒａｐｈｙＤ　１ｖ
ｉｓｉｏｎ　　ミルフォード、ＭＡ）に通して濾過する
。

分析方法 １、結合ステップ シクロスポリン、類似体及び／又は代謝物含有アルコー
ル抽出物のアリコート（これらのアリコートの体積はラ
ベル体に依るが、３Ｈ−又は１１５■−ラベルを使用す
る時は典型的には０−１０００μｇである。）を分析チ
ューブに加え、穏やかに不活性ガスを流しつつ、僅かに
加熱した温度（典型的には４０℃でＮｔガス）で溶媒を
留去する。

その後、サイトツル結合タンパク調製物を適当に稀釈し
たもののアリコートを試験管に入れ、タンパク質に定常
的に結合するように穏やかにかき回す。ラベルしたシク
ロスポリンのアリコートを試験管に加え、混合する。次
いでこの試験管を、定常状態の結合１こ達するような適
当な時間（これは、０（対照）〜１６時間、典型的には
１．５時間）、僅かに加温した温度（典型的には、３７
℃）で保温する。非特異的結合体チューブは、結合タン
パクアリコートと同体積の緩衝液に、シクロスポリンを
含まない抽出物を添加することにより調製される。

２、分離ステップ 蛍光偏光分析法以外で、タンパク結合したフルオレセイ
ンラベルされたシクロスポリンと未結合のフルオレセイ
ンラベルされたシクロスポリンとを、これらが共に溶液
中に存するときに区別出来るあらゆる検出法を用いる場
合（以下を参照。）、タンパク質に結合し且つラベルさ
れたシクロスポリンを遊離し且つラベルされたシクロス
ポリンから分離することは必要である。

この目的のために使用し得る分離法としては以下のもの
が挙げられる。

ＪｍＡ：結合反応混合物の内容物を水冷緩衝液く好まし
くは約ｐＨ７，４）で稀釈し、内容物をファ・ソトマン
ＧＦ／Ｂフィルター（ファツトマン・ヘ一バー（Ｗｈａ
ｔＩＩｌａｎ　　Ｐ　ａｐｅｒ）、　　メイドストーン
（Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ）、英国）のようなガラスファイ
バーフィルターを通して濾過し−、次いで水冷緩衝液で
洗浄した。薄膜には、タンパク質に結合し且つラベルさ
れたシクロスポリンが保持される。

ム汰旦：非特異的結合サイトをブロックするためにキャ
リヤーであるウシの皿清アルブミン又はγ−グロブリン
溶液で予備洗浄した微孔性フィルター（ｆｌｌ、ｔば、
ニトロセルロース０．２２μ肩フイルター（ミリポア・
コープ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　　Ｃｏｒｐ、。

ペッドフォード（Ｂ　ｅｄｆｏｒｄ）、　Ｍ　Ａ　））
を使って濾過する以外は、この方法は方法へと同じであ
る。

方法Ｃ：氷冷緩衝液で結合反応混合物を稀釈した後、キ
ャリヤータンパク質（アルブミン又はγ−グロブリン）
で塗装された木炭粒子の懸濁液をチューブに加え、この
混合物をかき回し、次いで冷温上遠沈し、木炭粒子を沈
澱させる。上澄液には、タンパク質に結合し且つラベル
されたシクロスポリンを含む。

方法Ｄ：結合反応混合物を水冷緩衝液で稀釈した後、ポ
リエチレングリコール粒子（Ｍ、Ｗ、　　１５゜０００
〜２０．０００）の懸濁液、例えば３０幻／ｆｆ１２Ｍ
濁液１．Ｍと、キャリヤータンパク質の溶液、好ましく
は血清アルブミン又はγ−グロブリン１．ＯＨを合わせ
たものを加え、生成した懸濁液を混合する。沈澱物を遠
沈で集め、上澄み液を廃棄する。このペレットには、タ
ンパク質に結合しラベルされたシクロスポリンが含まれ
る。

１５　Ｌ　Ｅ　：結合混合物を水冷緩衝液で稀釈した後
、キャリヤーアルブミン又はγ−グロブリンをチューブ
に加え、トリクロロ酢酸を最終濃度約５〜１０％になる
迄アイスバス温度で加え、全てのタンパク質を沈澱させ
る。この沈澱物を遠沈し、上澄液を廃棄する。ペレット
にはタンパク質に結合しラベルされたシクロスポリンが
含まれる。

万広ｖ：モレキュラーシーヴマトリクス、例えばＬＨ−
２０セフアデクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、　７フー７シア
・ファイン・ケミカルズ（Ｐ　ｈａｒｍａｃ　ｉａ　　
Ｆ　ｉ　ｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）、　　ビスカッタウ
ェイ（Ｐ　ｉｓｃａｔａｗａｙ。

ＮＪ）のミニカラムを用いて、結合混合物中の未結合化
学種からタンパク質結合ラベル化シクロスポリンを単離
する。小体積量（例えば、０．５ｚυのリン酸塩緩衝生
理食塩水（好ましくは約ｐＨ７４）でこのカラムを洗浄
すれば、廃棄体積（ｖｏｉｄｖｏｌｕＩＩｌｅ）中にタ
ンパク質結合ラベル化シクロスポリンが留出している。

セファデクスＬＨ−２０は弱練水性のマトリクスであり
、遊離したラベル化／クロスポリンは、このようなマト
リクス中で遅く留出する。

受容体に結合した放射性シクロスポリンの定量方法人及
びＢに於いて３Ｈがトレーサーである時、フィルターを
液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）バイア
ル内に設置し、シンチレーシヲンシステム（例えば、ｐ
ｃｓｓ、アメルサーム（Ａ　ｍｅｒｓｈａｍ’）、アー
リントン、ハイツ、Ｉ１）を継なぐ水性−有機性溶媒層
のアリコートを加える。

このバイアルをかき回し、放射活性量を液体シンチレー
ションスペクトロメトリー（ＬＳＳ）で定ｍする。方法
Ｃを用いる場合は、上澄液のアリコートをＬＳＣバイア
ルに加え、例えばｐｃｓｓで稀釈し、かき回し、次いで
ＬＳＳで計数する。方法り及びＥを使用する場合、ペレ
ットをｐｃｓｓ中で再懸濁し、成るいはＮａＯＨで溶解
し°これをＰＣ８Ｓで稀釈し、次いでＬＳＣバイアルに
加え、ＬＳＳで計数する。方法Ｆを用いる場合は、廃棄
体積のアリコートをｐｃｓｓで稀釈し、ＬＳＣバイアル
に加え、次いでＬＳＳで計数する。

１！！１１がトレーサーである場合、方法Ａ及びＢにお
けるフィルター、方法Ｃに於ける上澄液、又は方法り及
びＥに於けるペレット、又は方法Ｆに於ける廃棄体積を
ガラスチューブ内に設置し、放射活性をガンマカウンタ
ーで定量する。

蛍光偏光による競争的タンパク結合分析法３Ｈラベルし
たＣｓＡ及びフルオレセインラベルしたＣｓＡを用いた
置換実験により、両分子はサイトツルシクロスポリン結
合タンパク上のＣｓＡ結合サイトをめぐって競争するこ
とが示された。

競争的タンパク結合化学種中に於いて受容体と結合した
シクロスポリン量を決定するための蛍光偏光分析測定法
は、この観察に基づく。

蛍光偏光分析法の原理については、ロビンズ等の論文［
Ｒｏｂｂｉｎｓ、　　Ｂ、　Ａ、、　　Ｊ　、クリニ、
ラボ。

ｌｔ’）、　（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　　Ｌａｂ、　　Ａｎ
ａｌ、　）、　　２：６２（１９８８月、及びアボット
研究書のＴＤＸ教授マニュアル（Ａ　ｂｂｏｔ　　Ｌ　
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　　Ｔ　Ｄ　ＸＩ　ｎ５ｔｒｕ
ｃｔｉｏｎ　　Ｍａｎｕａｌ）に記載されている。この
分析法を簡潔に述べると、平面偏光ビームを用いてフル
オロフォア（ｆＩｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）　（例えば、フ
ルオレセイン）を励起し、発生する偏光蛍光シグナルを
測定する。この分析法に於いては、溶液中の分子はその
分子サイズに反比例した速度でランダムに動き、回転す
るという原理に基づ（。小さな分子（例えば、Ｃ５Ａ−
フルオレセイン）は自由にそして速く回転するが、大き
な分子（例えば、タンパク質に結合したＣ５Ａ−フルオ
レセイン）は自由に、成るいはほぼ自由に回転すること
はない。

本発明の蛍光偏光結合タンパクに基づく分析法に於いて
、Ｃ５Ａ−フルオレセインは自由に回転するので偏光蛍
光シグナルを発生することは無いが、シクロスポリンに
結合したＣ５Ａ−フルオレセインは自由に回転出来ない
ので偏光蛍光シグナルを発生する。即ち、分子サイズの
増大化と共に偏光は増加する。

このようにこの分析システムは、アナライト（本明細書
中に於いてはシクロスポリン、その誘導体、類似体、又
は代謝物）、蛍光ラベルした薬剤（例えば、Ｃ５Ａ−フ
ルオレセイン）、及び水溶性シクロスポリン結合タンパ
クを有する最初のサンプルの保温を伴う標準競争的タン
パク結合分析法を含む。

偏光蛍光シグナルの強度は逆比例的にアナライト濃度に
関係する。グツドライカー、　Ｗ、Ｂ、（Ｄａｄｌｉｋ
ｅｒ、　Ｗ、　　Ｂ、　）等、メソッズーｘンジモル（
Ｍｅｔｂｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ）、　　４８：３８
０（１９７８）。

それ故、もし患者のサンプルが低濃度のシクロスポリン
アナライトを含有するならば、競争的結合反応が定常状
態に達した後には、反応混合物中には高濃度の結合した
トレーサー（例えば、Ｃ５Ａ−フルオレセイン）が存在
し、高い偏光を示す。逆に、もし患者のサンプル中に高
濃度のシクロスポリンアナライトが存在するならば、競
争的結合反応が定常状態に達した後には、反応混合物中
には低濃度の結合したトレーサーが存在し、低い偏光を
示す。ラベルした分子が受容体に結合した時に偏光蛍光
の最大変化を生じる小さな分子の測定に、この方法は最
も有用である。

本発明の競争的タンパク結合分析法の目的のために、タ
ンパク質に結合したシクロスポリンアナライトと未結合
のシクロスポリンアナライトは単一の反応混合物中で区
別される（即ち、これら２つの成分を分離せずに区別さ
れる）ということは、蛍光偏光法に於いて重要である。

アボット（Ａ　ｂｂｏｔｔ）研究所では、多くの治療剤
の分析に蛍光偏光システムを、そのＴＤＸシステムに於
いて、応用している。シクロスポリンの免疫定量法用の
このＴＤＸシステムは、自動化されたＴＤＸ装置に加え
て、緩衝液−界面活性剤溶液、タンパク質安定剤含有の
抗ＣｓＡ抗体溶液、及び界面活性剤とタンパク質安定剤
を含有するＣｓＡフルオレセイン溶液を、別々のバイア
ル中に入れた代謝物試薬パックを含む。

本発明のサイトツル水溶性シクロスポリン結合タンパク
及びタンパク安定剤を入れたバイアルを、ＴＤＸシステ
ムの抗体バイアルと置き換えることにより、シクロスポ
リン及びその類似体に対する本発明の競争的タンパク結
合分析法にこのＴＤＸを適用することが出来る。

シクロスポリン標準、対照、及び患者サンプルをアボッ
トＴＤＸ装置の各カートリッジに別々に入れる。代謝物
試薬パックを装置に設置する。その後、自動化された一
連の各ステップに於いて、標準、対照、及び患者サンプ
ルが、水溶性結合タンパク及びＣｓＡフルオレセインと
混合され、結合の定常状態に達する迄、予備セットされ
た温度で選択された時間、この混合物を保温する。この
混合物をガラスのキュベツトに移し、蛍光偏光シグナル
を測定する。上述した様に、このシグナル強度はアナラ
イト濃度に逆比例に関係する。

患者サンプルの蛍光シグナルをＢ／Ｂｏ比に変換し、一
連のシクロスポリン標準を蛍光偏光により分析して得ら
れる標準曲線（この曲線に於いて、縦座標は、 ［Ｂ　（ｓｔｄ）／　Ｂ　（ｏ　５ｔｄ）］１００対ｆ
２ｏｇ［ｃｓ］であり、Ｂ　（＋、ｔｄ）は結合した標
準Ｃ５Ａ−フルオレセイン対の蛍光偏光であり、Ｂ（ｏ
ｓｔｄ）は対照サンプルの蛍光偏光であり、［Ｃｓ］は
各Ｂ／Ｂｏ比に於けるＣｓＡの濃度である。）上の各Ｂ
　／　Ｂ　ｏ比における各点を読む（上述のシクロスポ
リン標準溶液を参照せよ。） 上述の分離法Ａ及びＢに於いて、フィルターを一枚のフ
ァツトマン（Ｗｈａｔｍａｎ）吸取紙上に置く。

次いで、３−（２″−スピロアダマンタン）−４メトキ
シ−４−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２
−ジオキセタン、２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ、　　ク
エスドシステムズ、インク０．ベツドフォード、ＭＡ）
のＭ　ｇ　Ｃ（！を含有アルカリ緩衝溶液（５００〜１
，０００μ９）に、このフィルターを浸す。このフィル
ターを一枚のミラー・ボレスター・フィルム（Ｍｙｌａ
ｒｐｏｌｅｓｔｅｒ　　ｆｉｌｍ）に移し、次いでタイ
プ６１２ポラロイドフイルム（Ｐ　ｏｌａｒｏｉｄｆｉ
ｌｍ）のようなインスタントフィルムを入れた魚箱に移
す。このフィルムを適当な時間露光した後、例えば黒色
及び白色のＲＢＰデンシトメーター（ＲＢ　Ｐ　　Ｄ　
ｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ、　　トビアス・アソーシ。

イン先　（Ｔ　ｏｂｉａｓ　　Ａ　５ｓｏｃ、　　Ｉ　
ｎｃ、　）、　　アイビーランド（Ｉ　ｖｙｌａｎｄ）
、　　Ｐ　Ａ　）を用いて暗像をデジタル化する。

分離法Ｅに於いては、ペレット！ｖ濁液をｐＨ７゜４の
緩衝液で洗浄し、次いでＭｇＣＣｔ含有アルカリ性緩衝
液（ｐＨ７〜１０）で１度洗浄する。次いで、最大の蛍
光を発する迄、典型的には３００Ｃで１５〜３０分間、
Ｍ　ｇ　ＣＱ　＊含有アルカリ性緩衝液（ｐＨ７〜１０
）中でこのベレットをＡＭＰＰＤと反応させる。その後
、各チューブからの蛍光をルミノメータ−で、例えばタ
ーナ−２０Ｅルミノメータ−（Ｔ　ｕｒｎｅｒ　　２０
　Ｅ　　Ｌ　ｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）又はパーりホール
リド拳クリニルマット・ルミネセシス拳アナライザー（
Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　　Ｃ１ｉＣ１１ｎｉｌｕ　　Ｌｕｍ
１ｎｅｓｃｅｎｃｅＡ　ｎａｌｙｚｅｒ）で読む。

分離法Ｃ及びＦに於いては、上澄液又は廃棄体積物それ
ぞれを、Ｍ　ｇ　Ｃ（２ｔの存在下アルカリ性ｐＨ（ｐ
Ｈ７〜１０）でＡＭＰＰＤと反応させる。最大蛍光に達
した後（典型的には３０℃で１５〜３０分）、蛍光をル
ミノメータ−で測定する。

シクロスポリンがα−又はβ−ガラクトシダーゼに共役
（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）　Ｉ、ている場合、３−（２゜
スピロアダマンクン）−４−（３’−ｏ−ガラクトピラ
ノシド）フェニル−１，２−ジオキセタンが基質である
。

競争的タンパク結合分析データのプレゼンテーション 標準又は基準目盛曲線は、既知のシクロスポリン標準溶
液に対し、 ［Ｂ（ｓｔｄ）−ＮＳ　Ｂ／Ｂ（ｏ　５ｔｄ）−ＮＳ　
Ｉ３］１００％　対　ｆｆｏｇ［ｃｓＡコ （式中各記号は前記と同義。） をプロットすることによりっ（られる。

その後、対照及び未知検体の放射活性値、蛍光偏光値又
は化学発光値を、当業者に既知の標準計算により ［Ｂ（未知）／　Ｂ　（ｏ）コ１００ （式中、Ｂ（未知）はタンパク結合シクロスポリンの定
量値、Ｂ　（ｏ）はそれに対し適当な対照値を示す。） に変換する。次いで、計算比を標準又は基準目盛曲線に
照らし合わせ、未知サンプル中のシクロスポリン又はシ
クロスポリン類似の生理活性を持つ化合物の濃度を決定
する。

固体状態の競争的タンパク結合分析法 支持マトリクス（例えば、ミクロタイター板の凹部の底
面、又はプラスチックチューブの壁面）をシクロスポリ
ン結合タンパクで塗装し、非特異的結合サイトを短時間
、薬剤を含まない血清にさらしてプロットする。

ラベルしたＣｓＡを稀釈した、アルコール抽出物のアリ
コートを、塗装面と接触させ、穏やかに振とうしつつ保
温し、固体表面を冷ＰＢＳで洗浄し、次いで洗浄液を吸
引して廃棄する。

その後、シクロスポリン及び／又はその生理活性類似体
、誘導体及び代謝物が含有される患者の液体サンプル抽
出物のアリコートを、タンパク質で塗装した表面に接触
させ、０（対照）〜１６（アナライト）時間のうちの適
当な時間、穏やかに振とうしつつ保温する。保温液体を
吸引廃棄し、固体表面を冷ＰＢＳで穏やかに洗浄する。

タンパク質に結合した、ラベルしたＣｓＡを、上記液体
サンプルからのシクロスポリンの抽出のように、界面活
性剤又はアルコールで固体表面から抽出する。沈降タン
パク質を短時間の遠沈にかけて除去し、上澄液の放射活
性ｍを上述の様にして定量する。

（実施例） 当業者に本発明の詳細な説明するために、以下に実施例
を述べる。これらは説明するためにのみ記述されたもの
であり、特許請求の範囲に記載されていない部分につい
ては、これらが本発明の範囲を限定するものではない。

（実施例１） サイトンルシクロスボリン結合タンパクの単離約１００
酎の血漿−緩衝液塗装物を入れたロイツバツク（Ｌ　ｅ
ｕｋｏｐａｃｋ、血液銀行、小児病院国立医療センター
、ワシントン、Ｄ、Ｃ，より購入。）を３　：　５　（
ｖ／　ｖ）の割合でリン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７，
４）で３７℃にて稀釈した。稀釈した細胞をヒストバッ
ク＝　１０７７　（Ｈ１ｓｔｏｐａｑｕｅ＝　１０７７
、シグマ・ダイアグノスティックス（Ｓ　ｉｇｍａＤ　
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、　　セントルイス、ＭＯ）上
に３：８（ｖ／　ｖ）で積層し、２５℃で３０分間、４
００９で遠沈した。稀釈した血漿の上層を吸引廃棄し、
ハイパツク（Ｈｙｐａｑｕｅ）−血漿界面に存する白面
細胞層の単核白血球を注意深く吸い取りこれを保存した
。ボタン様の赤血球及び顆粒球を廃棄した。

白面細胞を一７０℃で凍結し、解凍して細胞を溶解した
。更に、テフロン製の乳棒を用いて５ストロ一ク／分の
速度で２分間、ガラスチューブ内を穏やかに均質化して
細胞分裂を行なった。この均質物をサクロースで０．３
２Ｍに調製し、次いで０〜４℃で４０分間、２０．　Ｏ
ＯＯｇで遠沈した。

シクロスポリンのサイトツル結合タンパクが含まれる上
澄液を、−７０’Ｃで使用する迄保存した。

ニシンコニン酸タンパク質分析試薬（ピアス（Ｐ　１ｅ
ｒｃｅ）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、　Ｉ
　１）を用いて定量したサイトツルのタンパク質ｉ１４
度は、２、１〜４．２ｏ／ｌ＋２ｔ？あツタ。

（実施例２ン ７０％ａｑ、　Ｅ　ｔｏ　Ｈ中にＣｓＡが１６０　ｔｔ
ｔｔ／ｉ（１の濃度で存するストック溶液０．１．１ｊ
ｆｆを、純血液、血漿又は血清９．９１１２に加えて、
１．６μｇ／肩ｅの標準を調製した。１．６μｇ／Ｒν
の標準溶液を純血液、血漿又は血清で倍々に薄めて、２
５．５０．１００．２００．４００．８００、及び１６
００ｎｇ／ｘＱの標準を調製した。対照として、薬剤を
含まない純血液、血漿又は血清を同様に倍々に稀釈した
。

２、標準、対照、又は患者サンプルの抽出ＣｓＡの純血
液、血清又は血漿標準、対照、及び患者サンプルのアリ
コート（５０μのをメタノール９５０μσに加え、キャ
ップしたチューブを３０秒間かき回して混合し、次いで
この混合物を５分間２００　（ｈで遠沈して沈降タンパ
クを除去した。シクロスポリンを含まない純血液を上述
の様にして抽出し、ゼロ標準として用いた。

３、分析操作 アリコート（ステップｌのエタノールｌ［５０μρ〜８
５０μ！：ｌ）をガラス製の試験管に加え、穏やかにＮ
ｔ気流を流しつつ４０’Ｃで溶媒を除去した。

乾燥サンプルに（実施例Ｉの）サイトツル結合タンパク
を加え、試験管の内容物をかき回して混合した。適当に
稀釈したトレーサー［”！］−ＣｓＡ又は［３Ｈ］−ジ
ヒドロＣｓＡのアリコートを各試験管に加え、これらの
溶液をかき回して混合した。

結合体混合物を３７℃で１２時間保温した。ＣｇＡを含
まない抽出物を受容体アリコートと同体積の緩衝液に加
えて、非特異的結合チューブ（ＮＳＢ）を調製した。

保温期間の後、チューブを水冷塔に漬け、トリスＨＣｌ
２緩衝液（ｐＨ７，４，４℃）３．０ｍ１２を稀釈剤と
して加えた。次いでチューブの内容物をファツトマンＧ
Ｆ／Ｂガラスフィルターに通して濾過し、このフィルタ
ーを１度水冷緩衝液６．０λＱで洗浄した。次いでこの
フィルターで真空マニホールドで吸引乾燥した。

３Ｈがトレサーのときは、各フィルターを別々のＬＳＣ
バイアルに設置し、ＰＣ８Ｓのアリコートを加えた。各
バイアルをかき回し、２時間放置し、ラジオ活性をＬＳ
Ｓで定量した。１″６■がトレサーのときは、各フィル
ターを別々のガラスチューブに設置し、ガンマカウンタ
ーで放射活性を定量した。統計的に意味を持つように計
測回数を選択した。

標準曲線は、ｎｙ／ｌＱ単位のＣｓＡ濃度に対して［Ｂ
（ｓｔｄ）　　Ｎ　Ｓ　Ｂ／　Ｂ（ｏ　５ｔｄ）　　Ｎ
　Ｓ　ＢＩ３００％をプロットすることにより作製した
。

第１図の曲線は、サイトツル受容体タンパク質と［３Ｈ
］−ジヒドロＣｓＡの固定濃度、及びＣｓＡの倍々に稀
釈した各濃度に於いて競争的タンパク結合分析法を用い
て作製した。この標準曲線は、シクロスポリンがｌ　Ｏ
ｎ９／　ｘＱ〜４００　ｎ９／　ｍｆ２の範囲に於いて
有用である。

第２図の曲線は、トレーサーとして１１５■を用い濃度
に対して結合体の放射活性をプロットした以外は第１図
と同様にして競争的タンパク結合分析法を行って作製し
た。純血液中１２　ｎ９／　ｘＱの濃度のＣｓＡ標準で
は、結合体は１２％であった。

純血液中２５　ｎ９／　ｚ（ｌの濃度のＣｓＡ標準では
、結合体は２％であった。第１図と第２図の著しい違い
は、［３Ｈ］−ジヒド０ＣｓＡに比し”’Ｉ　−ＣｓＡ
の方が、より大きな受容体サイトへの親和性を示し、そ
の結果より大きな感度を示すことである。

純血液中のシクロスポリン活性度濃度が約５ｎ９／ｘＱ
ｃｓｋという低い場合でも、１１Ｂｉトレーサーを用い
ればこの方法で定量することが出来る。

（実施例３） シクロスポリンの競争的タンパク結合分析法次の分析法
は、以下に述べる実施例２の変法を用いて行なった。

標準、対照、及び患者サンプルのＣｓＡメタノール抽出
体積は８００μＱであった。サイトツル結合タンパクの
体積は、１　：　５　（Ｖ／Ｖ）に稀釈した緩衝液（０
，６ｘ９／ｉｇ）２００μρであった。放射性配位子は
［’Ｈ３−ジヒドロＣ５Ａ（２５μｇ）であった。保温
時間は１２時間であった。水冷緩衝液２ＲＱを各反応チ
ューブに加えて反応を停止させ、これらのチューブをア
イスバスに５分間漬けた。ガラスフィルター法で、遊離
した配位子からタンパク質に結合した［３Ｈ］−ジヒド
ロＣｓΔを分離した。

フィルターをｐｃｓｓシンチラント（ｐｃｓｓｓｃｉｎ
ｔｉｌｌａｎｔ）　１０　ｍＱに入れ計測し、標準曲線
を前記の３Ｈトレーサーの場合と同様にして作製した。

第３図に示すように、ＣｓＡのｎｇ／ｘ（ｌのａｏｇに
対して％Ｂ／Ｂｏをプロットすると、標準的な（ｃｌａ
ｓｓｉｃａｌ）　Ｓ状の関係が得られた。これは、放射
免疫定量法で決定された患者のシクロスポリン濃度の範
囲内である（マホ＝　＋、　Ｗ、Ｃ，（Ｍａｈｏｎｅｙ
＋Ｗ、Ｃ，）、米国特許４，７２７，０３５号）。

（実施例４） 人間の単核白血球サイトツルタンパク質の分別パイオー
ラッズ・バイオ−ゲルＰ−１００（旧ｏ−Ｒａｄ’ｓ　
　Ｂｌｏ−Ｇｅ１　　Ｐ　　１００）分子ｍふるい分け
ゲル（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　　ｇｅｔ）（分別範囲は約
５．０００〜１００，０００ダル）を充填した１、ｘ２
ｃｆｆｉの１．Ｄ、カラムを、Ｏ，’４ｎＭＣａＣ１２
ｆｆｉ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、及び８０ｍＭＮａＣＱを
含有する５０ｍＭのトリスＨＣｌ２緩衝液で、２４時間
平衡にした。

このカラムを、１５，０００〜６６．０００ダルのファ
ーマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃ　ｉａ）分子量標準を用い
て標準化した（第４図）。

実施例１のサイトルのアリコート２ｚｅ（２，２＋ｙタ
ンパク質）をカラムに通し、前述のカラム緩衝液で分別
した。各フラクション（４ｍｇ）をｌ５ＣＯ（リンカー
ン、　Ｎｅｔ、）フラクション・コレクターで集めた。

Ａ　２８０　ｎｍをモニターして、各サンプルのタンパ
ク質を分析した。４ｙｘ（ｌフラクションの１６個のプ
ールを凍結乾燥し、次いで、フラクション７を除いて、
脱イオン水２ＲＱで再構成（ｆｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ
）した。尚、フラクション７は溶解を促進させる為に水
１５ＭＱで再構成した。

各フラクションの結合分析を、次の様に行なった。［”
Ｈ］−ジヒドロシクロスポリン２５μＱを各フラクショ
ン（チューブＮＯ，１）０．５１１２に加えた。

同じ量のトレーサー及び未ラベルシクロスポリン６４　
ｎ９を、同一のサンブノ喧チューブＮＯ，２）に加えた
。この結合体混合物を１２時間、３７℃で保温後、結合
化及び遊離トレーサーを実施例２で記述した方法で分離
した。両方のサンプルについて、特異的結合を上述のよ
うにして計算した。

第５図（グラフＡ）のヒストグラムは、競争的未ラベル
シクロスポリンの非存在下（チューブＮＯ。

１）及び存在下（チューブＮｏ、２）に於けるタンパク
質に結合した放射活性［３Ｈ］−ジヒドロシクロスポリ
ン量を、各カラムフラクションの平均分子量の関数とし
てプロットしたものである。各カラムフラクションに於
けるチューブ１とチューブ２の差異（これは結合に対す
る競争を反映する。）を、各カラムフラクションの平均
分子量の関数とじて第６図にプロットする。平均分子量
的１０．２５０ダルの１種以上のタンパク質を含むサイ
トツルフラクションは、本発明の競争的たんばく結合分
析法に於いて最も活性であり、１７，０００ダル及び２
，６５０ダルのフラクションも又、可成りの競争的シク
ロスポリンＡ結合活性を示す。

（実施例５） の比較 ＣｓＡを投与した移植患者の１６個の血液サンプルを、
本発明の競争的タンパク結合分析法及びＨＰＬＣ法で２
重検査した。

結合分析法については、［’Ｈ］−ジヒドロシクロスポ
リンをトレーサーとして用いて実施例３の方法に従って
行なったが、保温時間は１．５時間とした。

ＨＰＬＣ分析法については、ギースブレヒト（Ｇ　１ｅ
ｓｂｒｅｃｈｔ、　　Ｅ　、　Ｅ　、等、セラビ、ドラ
ッグ、モニタリング（Ｔ　ｈｅｒａ　　Ｄ　ｒｕｇ　　
Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）、　　１９８８年出版）の方法
に従って行なった。簡潔に説明すると、内部標準ＣｓＤ
を含むアセトニトリル：メダノール（９：１）７５０μ
Ｑで純血液２５０μＱを抽出して、患者血液のタンパク
質を含まない濾過物を調製した。この混合物を遠沈した
後、上澄液をＣ１０及びシリカ・ボンド・エルート物を
（Ｓ　１ｌｉｃａ　　Ｂｏｎｄ　　Ｅ　ｌｕｇ）のカー
トリッジに通して不純物を除去した。溶出液を乾燥し、
アセトニトリル：水（１：１）で再構成した。次いでヘ
プタンで抽出して遅れて溶出されるピーク部分を除いた
。３μバツキングしたスペルコシル（Ｓ　ｕｐｅｌｃｏ
ｓｉｌ）ＣＩ８カラム（１０ｃｍＸ４．６ｍｍ）（スペ
ルコ、インク、　　（Ｓｕｐｅｌｃｏ、　　Ｏｎｃ、）
）を用いたウォーターズ・サイエンティフィック社（Ｗ
ａｔｅｒｓ　　Ｓ　ｃｉｅｎｔｉｒｉｃＣｏ、）製ＨＰ
　Ｌ　Ｃシステムで、ＨＰＬＣ分析した。

アセトニトリルニリン酸塩緩衝液（ｐＨ２，５，（７７
：２３））の移動層を流速０　、６　ｘ（２／　ｆｆ１
ｉｎ、で流した。

溶出フラクションの吸光度は２１４ｎｍで測定した。

ＣｓＡの回収は９２〜ＩＯ４％で、１５μ９／Ｌという
より低い感度であった。この方法では、５００μｙＣｓ
Ａ／Ｌまで直線的であった。ピークの高さ測定を、１５
０及び４００μｇ／ｆ、のＣｓＡ外部標準と比較した。

結果を第７図に示す。この図に於いて、ＣｓＡに対する
各ＨＰＬＣ分析結果（μ９／Ｌ単位）を、本発明の競争
的タンパク結合分析法（ＲＲＡ、μ９／１）により得ら
れた同じサンプルの結果に対してプロットする。ＨＰＬ
ＣはＲＲＡよりも実質的に低い値を与えるので、違う目
盛りが必要であった。例えば、ＨＰＬＣで約５００μ９
／Ｌと測定された患者のサンプルは、ＲＲＡでは１１０
０〜１６００μ９／Ｌであった。これは、ＲＲＡに於い
ては親Ｃ８Ａのみならず、代謝物も同様に測定されるこ
とを示す。これらの代謝物がサイトツル結合タンパクと
反応したという事実は、これらの分子は生理学的に活性
であることを示し、更に、本発明の結合分析法は全ての
薬理活性なシクロスポリン化学種を測定することが出来
る事を示す。

本発明の」二連の議論は、主に好ましい態様とその実施
例について述べたものである。特許請求の範囲に記載し
た本発明の本質及びその範囲から外れることなく、本発
明の変法及び改良法が可能であることは当業者には明ら
かである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、トレーサーとして［’Ｈ］−ジヒドロＣｓＡ
を用い、サイトツル結合タンパクとして人間の単核白血
球抽出物（４２０μ２タンパク質）を用いた本発明の競
争的タンパク結合分析法から得られる（％Ｂ／Ｂｏ対シ
クロ対重クロスポリン線である。この図に於いては、一
定量のサイトツル調製物で一定量の３Ｈジヒドロシクロ
スポリンを、倍々濃度の各シクロスポリン標準と混合し
３７℃で保温した。結合体のフラクションを遊離体フラ
クションからガラスフィルターを用いて分離した。 第２図は、トレーサーとして［１１８Ｉ］　　Ｃ８Ａを
用いた以外は第１図と同様の（ＣＰＭ”’１対シクロス
ポリン）競争的結合分析曲線である。純血液中１２　ｎ
９／　ｘＱのシクロスポリン標準は結合値１２％を有す
る。２５　ｎｇ／　ｚＱでは結合値は２％である。 結合の著しい相違は、受容体に対して親和性がより低い
ことである。このことは、より大きな分析感度を有する
ことを示す。結合体フラクションをガラスフィルターで
分離した。 第３図は、サイトツル結合タンパクを１２０μ？使った
以外は、第１図と同様の（％Ｂ　／　Ｂ　ｏ対シクロス
ポリン）標準曲線である。一定条件の３Ｈジヒドロシク
ロスポリンとサイトツル受容体を増大濃度のシクロスポ
リン標準と混合した。結合体フラクションをガラスフィ
ルターを使って分離した。 第４図は、横軸に分子量目盛りを備えたバイオ−ゲルＰ
−１００（Ｂｉｏ−Ｇｅｔ　　Ｐ−ＩＱＱ）モレキュラ
ーシーヴ力ラムの基準目盛（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）
を示す。 第５図は、パイオーゲルＰ−１００カラムから留出する
サイトツルタンパク質フラクシヲンを、本発明の競争的
タンパク結合定量法で定量した結果を示す。尚、図中、
白抜部分けチューブＮｏ、１（即ち、シクロスポリンを
含まないチューブ）、斜線部分けチューブＮｏ、２（即
ち、シクロスポリン６４ｎ９を加えたチューブ）に関す
るものである。 第６図は、第５図の各カラムフラクションのシクロスポ
リン結合活性度を示す。 第７図は、患者の血液のシクロスポリンに対するＨＰＬ
Ｃ分析結果と、本発明に従って行なわれた結合定量分析
結果の比較を示す。 第４図 特許出願人　チルドレンズ・ナショナル・メディカル・
センター・ インコーホレイテッド 代理人　弁理士　青　山　　葆　（ほか２名）／サ　子
　号 （Ｋｄ） ＨＰＬＣ （、ｕｇ／β］

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）均質化した、分裂した、通常の若しくは変
   形した（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）細胞を遠沈し、水溶
   性タンパク質を生成し、 （ｂ）該水溶性タンパク質を分別し、 （ｃ）得られた水溶性タンパク質のフ ラクションのシクロスポリン結合活性 度を試験し、そして （ｄ）容認し得るシクロスポリン結合 活性度を有するフラクションを選択す る ステップを含む工程により調製されるシクロスポリン、
   その生理活性誘導体、類似体、及び代謝物に対する水溶
   性巨大分子結合タンパク。
2. （２）該細胞が人間又は動物の、末梢又は培養した、白
   血細胞又はその前駆体組織を含む請求項（１）記載の結
   合タンパク。
3. （３）該細胞が人間若しくは動物の赤血球又はその前駆
   体組織を含む請求項（１）記載の結合タンパク。
4. （４）該細胞が人間又は動物の、組織又は培養した網内
   細胞を含む請求項（１）記載の結合タンパク。
5. （５）該細胞が、人間又は動物の、組織又は培養した、
   肝臓、脾臓、骨髄、及び胸腺細胞を含む群より選択され
   る請求項（１）記載の結合タンパク。
6. （６）該細胞が、節足動物、トレマトーダ、軟体動物、
   菌類、海綿動物、イースト、及びバクテリア細胞を含む
   群から選択される請求項（１）記載の結合タンパク。
7. （７）該遠沈が、少なくとも２０，０００ｇの力で、少
   なくとも１５分間、２５℃以下の温度で行なわれる請求
   項（１）記載の結合タンパク。
8. （８）該水溶性タンパク質が、１つ以上の分子量を濾し
   分け（ｃｕｔ　ｏｆｆ）膜フィルタに該水溶性タンパク
   質を通してフィルターすることを含む方法により分別さ
   れる請求項（１）記載の結合タンパク。
9. （９）該水溶性タンパク質が、１つ以上のサイズふるい
   分け（ｓｉｚｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）ゲルカラムに該
   可溶性タンパク質を通してフィルターすることを含む方
   法により、約２，０００〜１５０，０００ダルトンの分
   別範囲で分別される請求項（１）記載の結合タンパク。
10. （１０）ラベルしたシクロスポリンＡが該結合タンパク
    上の結合サイトをめぐって未ラベルのシクロスポリンＡ
    と競争する競争的タンパク結合分析法を各フラクション
    に適用することを含む方法により、容認し得るシクロス
    ポリン結合活性度を有する試験されたタンパク質フラク
    ションが選択される請求項（１）記載の結合タンパク。
11. （１１）２，４００〜３，０００ダルトンの分子量を有
    する請求項（１）記載の結合タンパク。
12. （１２）８，０００〜１３，５００ダルトンの分子量を
    有する請求項（１）記載の結合タンパク。
13. （１３）１３，５００〜２５，０００ダルトンの分子量
    を有する請求項（１）記載の結合タンパク。
14. （１４）最初の流体サンプル中に含まれるシクロスポリ
    ン、その生理活性誘導体、類似体、及び代謝物に対する
    競争的タンパク結合定量分析法に於いて、該定量分析法
    が、 （ａ）最初の該流体サンプルのシクロスポリンを含む抽
    出物を調製し、 （ｂ）該抽出物のアリコートを蒸発乾固させ、（ｃ）乾
    固した該アリコートと請求項（１）記載の水溶性結合タ
    ンパクの水溶液を調製し、（ｄ）放射活性シクロスポリ
    ンＡを該水溶液に加え、加えて生成した溶液を定常状態
    の結合に達する迄保温し、 （ｅ）タンパク質に結合したラベルされたシクロスポリ
    ンＡを、未結合のラベルされたシクロスポリンＡから物
    理的に分離し、 （ｆ）タンパク質に特異的に結合したラベルされたシク
    ロスポリン量を定量し、 （ｇ）タンパク質に特異的に結合したラベルされたシク
    ロスポリンの、上記ステップ（ｆ）で得られた定量値を
    標準曲線に照らし合わせることにより最初の該流体サン
    プル中のシクロスポリン、その生理活性誘導体、類似体
    、及び代謝物の量を決定し、該標準曲線が、上述の（ａ
    ）〜（ｆ）の各ステップを含む競争的タンパク結合分析
    法により一連のシクロスポリン標準溶液を分析し、且つ ［Ｂ＿（＿ｓ＿ｔ＿ｄ＿）−ＮＳＢ／Ｂ＿（＿ｏ＿ｓ＿
    ｔ＿ｄ＿）−ＮＳＢ］１００対ｌｏｇ［Ｃｓ］（式中、
    Ｂ＿（＿ｓ＿ｔ＿ｄ＿）は結合タンパクに結合したシク
    ロスポリン量、Ｂ＿（＿ｏ＿ｓ＿ｔ＿ｄ＿）は対照、Ｎ
    ＳＢは各サンプルのシクロスポリンの非特異的結合、及
    び［Ｃｓ］は分析された標準シクロスポリンの濃度を表
    わす。） をプロットすることにより得られる ステップを含む競争的タンパク結合定量分析法。
15. （１５）炭素数１〜６の直鎖状又は分岐鎖状１級、２級
    、又は３級アルカノール類から成る群より選択されるア
    ルコールを用いて、最初の流体サンプルからシクロスポ
    リン、その類似体、誘導体及び代謝物を抽出することに
    より、該抽出物が調製される請求項（１４）記載の定量
    分析法。
16. （１６）該放射活性シクロスポリンＡが＾３Ｈでラベル
    されたシクロスポリンＡ又は＾１＾２＾５Ｉでラベルさ
    れたシクロスポリンＡである請求項（１４）記載の定量
    分析法。
17. （１７）定常状態の結合に、約２５℃〜約３７℃に於い
    て約０．５〜約１６時間で達する請求項（１４）記載の
    定量分析法。
18. （１８）タンパク質に結合したラベルされたシクロスポ
    リンＡと未結合のラベルされたシクロスポリンＡの物理
    的分離が、ガラスファイバーフィルター、ニトロセルロ
    ースフィルター及びポリマーフィルターから成る群より
    選択されるフィルターを使って濾過することを含む方法
    により、行なわれる請求項（１４）記載の定量分析方法
    。
19. （１９）タンパク質に結合しラベルされたシクロスポリ
    ンＡとタンパク質に未結合のラベルされたシクロスポリ
    ンＡの物理的分離が、粒子吸着を含む方法により行なわ
    れる請求項（１４）記載の定量分析方法。
20. （２０）該吸着剤が、タンパク質を塗装した木炭、及び
    デキストランを塗装した木炭から成る群より選択される
    請求項（１９）記載の定量分析方法。
21. （２１）タンパク質に結合したシクロスポリンＡとタン
    パク質に未結合のシクロスポリンＡの該物理的分離が、
    タンパク質沈澱を含む方法により行なわれる請求項（１
    ４）記載の定量分析方法。
22. （２２）タンパク質に結合したシクロスポリンＡとタン
    パク質に未結合のシクロスポリンＡの該物理的分離が、
    サイズふるい分けカラムを用いた濾過を含む方法により
    行なわれる請求項（１４）記載の定量分析方法。
23. （２３）最初の流体サンプル中に含まれるシクロスポリ
    ン、その生理活性誘導体、類似体、及び代謝物に対する
    競争的タンパク結合定量分析法に於いて、該定量分析法
    が、 （ａ）最初の該流体サンプルの抽出物（これには該シク
    ロスポリン類が含まれる。）を調製し、 （ｂ）該抽出物と請求項（１）記載の水溶性結合タンパ
    クの水溶液を調製し、 （ｃ）フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）でラ
    ベルされたシクロスポリンＡを該水溶液に加え、加えて
    生成した混合物を定常状態の結合に達する迄保温し、 （ｄ）保温した混合物の蛍光偏光シグナルを測定し、タ
    ンパク質に結合したフルオロフォアでラベルされたシク
    ロスポリンＡの量に該蛍光偏光シグナルを変換し、及び （ｅ）蛍光偏光標準曲線に照らし合わせることにより最
    初の該流体サンプル中のシクロスポリン、その生理活性
    誘導体、類似体、及び代謝物の濃度を決定し、該蛍光偏
    光標準曲線が、該蛍光偏光競争的タンパク結合分析法に
    より一連のシクロスポリン標準溶液を分析し、且つ ［Ｂ＿（＿ｓ＿ｔ＿ｄ＿）／Ｂ＿（＿ｏ＿ｓ＿ｔ＿ｄ＿
    ）］１００対ｌｏｇ［Ｃｓ］（式中、Ｂ＿（＿ｓ＿ｔ＿
    ｄ＿）、Ｂ＿（＿ｏ＿ｓ＿ｔ＿ｄ＿）、及び［Ｃｓ］は
    請求項（１４）と同義。） をプロットすることにより得られる ステップを含む競争的タンパク結合定量分析法。
24. （２４）該フルオロフォアが、フルオレセイン及びルシ
    フェリンから成る群より選択される請求項（２３）記載
    の定量分析法。
25. （２５）最初の流体サンプル中に含まれるシクロスポリ
    ン、その生理活性誘導体、類似体、及び代謝物に対する
    競争的タンパク結合定量分析法に於いて、該定量分析法
    が、 （ａ）最初の該流体サンプルの抽出物（これには該シク
    ロスポリン類が含まれる。）を調製し、 （ｂ）該抽出物のアリコートを蒸発乾固させ、（ｃ）乾
    固した該アリコートと請求項（１）記載の水溶性結合タ
    ンパクの水溶液を調製し、（ｄ）酵素に共役した（ｃｏ
    ｎｊｕｇａｔｅ）シクロスポリンＡを該水溶液に加え、
    加えて生成した溶液を定常状態の結合に達する迄保温し
    、 （ｅ）タンパク質に結合し、酵素に共役したシクロスポ
    リンＡを、タンパク質に未結合の、酵素に共役したシク
    ロスポリンＡから物理的に分離し、 （ｆ）タンパク質に特異的に結合し、酵素に共役したシ
    クロスポリンＡの量を定量し、及び （ｇ）タンパク質に結合し、酵素でラベルされたシクロ
    スポリンＡの上記ステップ（ｆ）で得られた定量値を標
    準曲線に照らし合わせることにより最初の該流体サンプ
    ル中のシクロスポリン、その生理活性誘導体、類似体、
    及び代謝物の量を決定し、該標準曲線が、上述の（ａ）
    〜（ｆ）の各ステップを含む競争的タンパク結合分析法
    により一連のシクロスポリン標準溶液を分析し、且つ ［Ｂ（＿ｓ＿ｔ＿ｄ＿）−ＮＳＢ／Ｂ＿（＿ｏ＿ｓ＿ｔ
    ＿ｄ＿）−ＮＳＢ］１００対ｌｏｇ［Ｃｓ］（式中、Ｂ
    ＿（＿ｓ＿ｔ＿ｄ＿），ＮＳＢ，Ｂ＿（＿ｏ＿ｓ＿ｔ＿
    ｄ＿），及び［Ｃｓ］は請求項（１４）と同義。） をプロットすることにより得られる ステップを含む競争的タンパク結合定量分析法。
26. （２６）ステップ（ｆ）及び（ｇ）に於ける定量が、化
    学発光法を用いて行なわれる請求項（２５）記載の定量
    分析法。
27. （２７）該酵素がアルカリ性フォスファターゼであり、
    化学発光基質が、該酵素により分解されて光エネルギー
    を生成し得る水溶性１，２−ジオキセタンである請求項
    （２６）記載の定量分析法。
28. （２８）該酵素がα−、又はβ−ガラクトシダーゼであ
    り、化学発光基質が、該酵素により分解されて光エネル
    ギーを生成し得る水溶性１，２−ジオキセタンである請
    求項（２６）記載の定量分析法。
29. （２９）分析が固体状態で行なわれる請求項（１４）〜
    （２８）の何れかに記載の結合分析法。
30. （３０）最初の流体サンプル中のシクロスポリン、その
    生理活性類似体、誘導体、及び代謝物に対する競争的タ
    ンパク結合分析法の試薬に於いて、該試薬が、 （ａ）請求項（１）記載の結合タンパクとタンパク質安
    定剤の混合物、 （ｂ）ラベルされたシクロスポリン、 （ｃ）シクロスポリン標準、及び （ｄ）緩衝液及び界面活性剤安定剤を含む混合物 を含む試薬。