CN112195236A - Hdac2在制备评估急性肝衰竭肝脏炎症进展的标志物中的用途 - Google Patents

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王鲁文
李汛
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Abstract

本发明提供了一种用于评估急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的标志物，包括组蛋白去乙酰化酶2。本发明还提供了一种组蛋白去乙酰化酶2在制备用于评估急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的标志物中的用途。其通过测定组蛋白去乙酰化酶2活性的高低评估急性肝衰竭患者的肝组织炎症程度，可靠性高，为临床上评估急性肝衰竭患者肝脏炎症进展提供了新的理论依据。

Description

HDAC2在制备评估急性肝衰竭肝脏炎症进展的标志物中的 用途
技术领域
本发明专利属于生物工程领域，涉及组蛋白去乙酰化酶2，具体而言是组蛋白去乙酰化酶2在制备用于评估急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的标志物中的用途。
背景技术
急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是多种因素引起肝脏合成、解毒与代谢功能严重障碍的临床危急重症。其病理表现为肝细胞大量坏死，同时伴有存活肝细胞严重的变性。ALF影响到所有器官系统，需要利用大量的资源，并且有30％的死亡率。目前针对ALF的内科治疗仅限于病因治疗和对症治疗，而针对其发病机制尚缺乏有效的治疗手段。目前缺乏早期诊断ALF的有效指标，诊断出ALF时，患者肝脏的病变已非常严重。
在真核细胞中，基因组DNA被高度保守的组蛋白H2A，H2B，H3和H4包裹成核小体，形成了染色质的基本单位。染色质组织在控制基因表达中起关键作用。表观遗传修饰可以调节遗传性或可逆基因表达而无需改变DNA序列，还可以修饰染色质结构及其可及性。组蛋白的乙酰化是基因表达表观遗传调控的重要机制。组蛋白乙酰化通过降低DNA对组蛋白的亲和力并从接头DNA释放组蛋白尾巴来打开浓缩的染色质结构，从而使转录因子，辅因子和RNA聚合酶II复合体能够进入DNA。组蛋白的乙酰化调节由组蛋白乙酰化酶(histoneacetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)共同完成。正常生理情况下，HAT和HDAC蛋白结构与酶活性保持高度平衡，称为“乙酰化动态平衡”，对于维持细胞内稳态平衡有重要作用：HATs使组蛋白的富含赖氨酸的氨基末端尾巴中的赖氨酸乙酰化，从而导致电荷中和以及更松弛，开放和转录活跃的染色质结构；相反，HDACs通过去除组蛋白N-末端赖氨酸残基侧链ε-氨基的乙酰基，使组蛋白恢复其基础状态来抵消HAT的作用，同时在大多数情况下会抑制基因表达。
HDACs共18个成员包括两大家族，可分为四类。第Ⅰ类包括HDAC1、2、3和8，与酵母转录因子Rpd3同系。第Ⅱ类包括HDAC4、5、6、7、9和10，与酵母Hda1同系。第Ⅲ类包括SIRT1-SIRT7，是酵母sirt2蛋白的同系物。而HDAC11由于同时具有Rpd3及Hda1的保守结构，因此被定义为第Ⅳ类。第Ⅰ类HDACs中，HDAC1和HDAC2由于缺乏核输出信号，只存在于细胞核内。而HDAC3虽然具有核输入信号和核输出信号，但目前只在细胞核内发现其存在。第Ⅱ类与第Ⅳ类HDACs只在特定的组织中表达，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ类HDACs是Zn+离子依赖的去乙酰化酶，而第Ⅲ类HDACs发挥其活性需要NAD+参与。
因此，寻求早期诊断ALF的指标，对于及时干预ALF的发生发展至关重要。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，提供一种用于评估急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的标志物，包括组蛋白去乙酰化酶2。
本发明提供了一种用于评估急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的标志物，其测量的组蛋白去乙酰化酶2的表达量与急性肝衰竭患者的肝组织炎症程度正相关。
本发明还提供了一种组蛋白去乙酰化酶2在制备用于评估急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的标志物中的用途。
本发明还提供了组蛋白去乙酰化酶2在制备检测急性肝衰竭患者肝脏炎症的芯片或试剂盒中的用途。其测量的组蛋白去乙酰化酶2的表达量与急性肝衰竭患者的肝组织炎症程度正相关。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括组蛋白去乙酰化酶2。其测量的组蛋白去乙酰化酶2的表达量与急性肝衰竭患者的肝组织炎症程度正相关。
本发明还提供了一种组蛋白去乙酰化酶2在评估急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的非诊断非治疗方面的用途，例如，科学研究等。
本发明还提供了一种组蛋白去乙酰化酶2在制备急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的检测试剂中的应用，所述检测试剂以组蛋白去乙酰化酶2作为急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的标记物。
其中，组蛋白去乙酰化酶2简称HDAC2。
本发明的有益效果在于：
1、本发明通过测定HDAC2活性的高低评估急性肝衰竭患者的肝组织炎症程度，可靠性高，证明HDAC2可作为评估急性肝衰竭患者的肝组织炎症程度的标志物，其为临床上评估急性肝衰竭患者肝脏炎症进展提供了新的理论依据；
2、本发明提供了组蛋白去乙酰化酶2在评估急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的非诊断非治疗方面的多种用途。
附图说明
图1为60例不同病情程度的ALF患者(各个不同治疗阶段)血清中HDAC2活性与血清中炎症指标(CRP水平)的相关性分析；
图2为60例不同病情程度的ALF患者(各个不同治疗阶段)血清中HDAC2活性与血清中炎症指标(中性粒细胞百分比(Neu％))的相关性分析；
图3为60例不同病情程度的ALF患者(各个不同治疗阶段)血清中HDAC2活性与血清中炎症指标(IL-1β水平)的相关性分析；
图4为60例不同病情程度的ALF患者(各个不同治疗阶段)血清中HDAC2活性与血清中炎症指标(IL-18水平)的相关性分析；
图5不同炎症等级A0-A3(炎症程度自A0至A3逐步加深)肝脏中，HDAC2的表达量示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
分别测定60例不同病情程度的ALF患者(各个不同治疗阶段)血清中HDAC2活性、血清中CRP水平、血清中中性粒细胞百分比(Neu％)、血清中IL-1β水平、血清中IL-18水平。所有研究对象均取空腹肘静脉血5ml置于真空采血管中，将血液样本放置全自动生化分析仪中检测CRP与Neu％的含量。检测后的样本经3000r/min离心3min后分离血清。采用ELISA试剂盒检测血清IL-1β、IL-18、HDAC2水平。加样过程中分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl。给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟。弃去液体，甩干，每个孔中加入Detection Ab工作液100μl(在使用前15分钟内配制)，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μl/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。每孔加HRP Conjugate工作液(临用前15分钟内配制)100μl，加上覆膜，37℃温育30分钟。弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，大约350μl/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟。每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序，根据每孔OD值算出标准曲线与各个样本中IL-1β、IL-18的表达量。HDAC2对应的孔，直接读取OD值进行统计。结果如图1～4所示，其中，图1为60例不同病情程度的ALF患者(各个不同治疗阶段)血清中HDAC2活性与血清中炎症指标(CRP水平)的相关性分析；图2为60例不同病情程度的ALF患者(各个不同治疗阶段)血清中HDAC2活性与血清中炎症指标(中性粒细胞百分比(Neu％))的相关性分析；图3为60例不同病情程度的ALF患者(各个不同治疗阶段)血清中HDAC2活性与血清中炎症指标(IL-1β水平)的相关性分析；图4为60例不同病情程度的ALF患者(各个不同治疗阶段)血清中HDAC2活性与血清中炎症指标(IL-18水平)的相关性分析。结果显示，血清中HDAC2活性与血清中CRP水平呈正相关；血清中HDAC2活性与血清中中性粒细胞百分比(Neu％)呈正相关；血清中HDAC2活性与血清中IL-1β水平呈正相关；血清中HDAC2活性与血清中IL-18水平呈正相关。
实施例2
采用免疫组化法检测肝组织中HDAC2的表达。将切好的组织(<5mm3)用生理盐水组织洗一下，立即投入4％多聚甲醛(PFA)中固定24h。料经固定后，水冲洗数小时以去除组织内固定液及结晶沉淀。将组织依次经70％、80％、90％各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95％、100％各2次，每次20min。用纯酒精、二甲苯等量混合液浸润材料1-2h，再换纯透明剂(二甲苯、苯、氯仿、正丁醇)。随后放入二甲苯和石蜡各半的混合液，再放入熔化的石蜡中浸润。浸蜡之后放入包埋盒用石蜡进行包埋。将将包埋小肠样本的蜡块切成3mm的切片。随后消除切片内源性过氧化物酶活性。将切片在正常山羊血清中孵育10分钟，在TLR4(1:200)抗体溶液中4℃冰箱孵育过夜。将切片用PBS冲洗后放于辣根过氧化物酶(horse radishperoxidase，HRP)偶联的兔IgG多克隆抗体中在37℃培养箱中孵育30分钟。样品用DBA和苏木精染色后，在普通光学显微镜下拍照。
将ALF患者分为A0、A1、A2、A3四种等级，肝脏A0-A3炎症分级标准是按照METAVIR评分系统判断。分别选取30例A0等级患者、30例A1等级患者、30例A2等级患者、30例A3等级患者，分别对选取的患者进行HDAC2表达量进行评级：由研究者及1名病理科医师釆用人工双盲法分别阅片评分。阳性着色呈棕色细颗粒状。凡细胞质或细胞核不着色为0分、浅棕色为1分、棕色为2分、深棕色为3分；在高倍镜下随机计数5个视野，计算阳性细胞所占百分比，阳性细胞占所有细胞的比例：1％-10％为0分，11％-25％为1分，26％-50％为2分,51％-75％为3分,76％-100％为4分。根据上述2项指标的两积分相乘分为4级：0分为阴性(-)、1-4分为弱阳性(+)、5-8分为中等阳性(++)、9-12分为强阳性(+++)。结果如图5、表1所示：
表1不同肝组织炎症活动度分级(A)与HDAC2表达评级情况
Figure BDA0002739774670000051
结果显示，随着炎症程度的加深，HDAC2的表达量逐渐升高。
经Mann-Whitney U检验显示，A0与Al比较、A0与A3比较、A0与A2比较、A1与A2比较、A1与A3比较、A2与A3比较，组间检验结果如表2所示。
表2组间检验结果
Figure BDA0002739774670000052
结果显示，组间差异有显著的统计学意义(P<0.01)。Spearman秩相关性分析显示HDAC2表达强度与肝组织炎症活动度分级(A)有显著的正相关性(rs＝0.798，P<0.01)。线性趋势检验显示HDAC2表达强度与肝组织炎症活动度分级(A)有显著的线性关系(χ2＝75.367，P<0.01)，HDAC2表达强度与肝组织炎症活动度分级(A)之间不仅存在相关关系且为线性关系。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.一种用于评估急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的标志物，其特征在于，包括组蛋白去乙酰化酶2。
2.一种用于评估急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的标志物，其特征在于，其测量的组蛋白去乙酰化酶2的表达量与急性肝衰竭患者的肝组织炎症程度正相关。
3.组蛋白去乙酰化酶2在制备用于评估急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的标志物中的用途。
4.组蛋白去乙酰化酶2在制备检测急性肝衰竭患者肝脏炎症的芯片或试剂盒中的用途。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括组蛋白去乙酰化酶2。
6.组蛋白去乙酰化酶2在制备急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的检测试剂中的用途，其特征在于，所述检测试剂以组蛋白去乙酰化酶2作为急性肝衰竭患者肝脏炎症进展的标记物。
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