KR900007646B1 - 초과산화물 디스무타제 유도체의 제조방법 - Google Patents

초과산화물 디스무타제 유도체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

초과산화물 디스무타제 유도체의 제조방법
제1도는 합성 실시예 3에서 기술된 SOD와 Bu-SMA(부분적으로 반(hadf) 부틸-에스테르화된 스티렌-말레산 무수물 공중합체)와의 반응에 있어서 SOD내의 TNBS-적정가능한 아미노 그룹 함유량의 감소%와 반응 시간과의 관계를 나타낸다.
제2도는 합성 실시예 1과 합성 실시예 2에서 각각 수득한 SOD 유도체와 출발물질 SOD의 UV 스펙트럼이다.
제3도는 시험 실시예 5에서 수득한 반응 혼합물의 Bu-SMA 농도와 수득된 SOD 유도체의 TNBS-적정가능한 아미노 그룹 함유량과의 관계 및 상기의 Bu-SMA 농도와 상기의 SOD 유도체의 SOD 활성과의 관계를 나타낸다.
제4도(a)은 인간의 적혈구 SOD의 IR 스펙트럼이다.
제4도(b)는 소의 적혈구 SOD의 IR 스펙트럼이다.
제5도, 제6도 및 제7도는 합성 실시예 7-1, 7-2, 및 7-3에서 각각 수득한 SOD 유도체의 IR 스펙트럼이다.
제8도는51Cr로 표지된 후 합성 실시예 1에서 수득한 SOD 유도체의 등전 포커스(isoelectric focusing)의 pH 및 방사성의 견지에서 본 결과를 나타낸다.
제9도는51Cr로 표지된 후 합성 실시예 2에서 수득한 SOD 유도체의 등전 포커스의, pH 및 방사성의 견지에서 본 결과를 나타낸다.
제10도는 합성 실시예 2에서 수득한 SOD 유도체와 출발물질 SOD의 소 혈청 알부민-세파로즈 컬럼 친화성 크로마토그라피의 결과를 나타낸다.
제11도는 합성 실시예 2에서 수득한 SOD 유도체와 출발물질 SOD의 각종 프로테아제종에 대한 저항성을 비교한 것이다.
제12도는 래트에게 정맥투여된 합성 실시예 2에서 수득한 SOD 유도체와 출발물질 SOD의 혈장 농도의 시간에 따른 변화를 나타낸다.
제13도는 미리 0.2ml의 HEPES 완충액(pH 6.0)을 좌측 대퇴근(산성 부위)에, 0.2ml의 생리 식염수를 우측 대퇴근(대조 부위)에 근육내 투여하여 처리한 마우스에게 정맥투여된 Bu-SMA 및 SOD 유도체의 대퇴 조직내 누적의 시간에 따른 변화를 나타낸다.
제14도는 강제 침수에 의해 래트내에 유발된 급성 위점막성 병변에 대하여 항궤양활성에 대한 SOD 유도체의 시험에서 나타난 바와 같이 침수 기간과 궤양지수(mm/조직)사이의 관계를 나타낸다.
제15도(a)은 래트의 유발된 부종이 있는 대뇌의 우반구(손상된 부위), 대뇌의 좌반구(손상되지 않은 부위 또는 대조부위), 및 현장내의 SOD 유도체의 누적을 나타낸다.
제15도(b)는 상기의 동일한 래트의 손상된 부위, 손상되지 않은 부위, 및 혈장내의 Bu-SMA의 누적을 나타낸다.
제16도는 SOD 유도체를 적용한 파라큐트(paraquat)-처리된 마우스 및 SOD 유도체를 적용하지 않은 파라큐트-처리된 마우스(대조 그룹)에게 파라큐트를 투여한 후, 혈장 GOT 수준과 시간과의 관계를 나타낸다.
본 발명은 초과산화를 디스무타제 유도체, 이의 제조방법 및 의약적 용도에 관한 것이다.
초과산화물 디스무타제(superoxide dismutase 이후, SOD로 약칭한다)는 현재 동물, 식물 및 미생물과 같은 생뭍체내에 널리 존재하며 생물체에게 해로운 초과산화물을 분해하는 효소로 알려져 있다. 최근에, 분리된 SOD를 소염제로서 사용하고자 하는 시도
가 있었다 [참조 : Farumashia, 17,411(1981) ; Current Therapeutic Research, 16,706(1974)]. 또한, 제어하기 어려운 방사선-유발성 대장염의 치료와 위궤양의 예방 또는 -치료에서 SOD를 이용하는 연구가 수행되어 왔다. [참조 : Jikken Igaku(Experimental Medicine),4(12),39,(1986)].
이후에 기술할 시험 실시예의 결과로부터 명백한 바와 같이, 인체형 SOD는 실질적으로 소염활성이 부족하며, 항궤양활성이 매우 약하다.
정맥투여되는 SOD의 혈장 반감기는 단지 약 4 내지 6분이며; SOD는 신속히 대사되어 배뇨된다. SOD의 현장 반감기를 연장시키기 위해, 피쿨(Ficol1), 폴리에틸렌 글리콜 또는 래트 알부민으로 변형시킴으로써 SOD를 거대분자로 전환시키려는 시도가 있었다. 그러나, 피콜-또는 폴리에틸렌 글리콜-변형된 SOD에서 SOD의 효소활성은 현저하게 감소되었으며, 래트 알부민-변형된 SOD는 항원성이 있다. 이눌린-변형된 SOD는 변형되지 않은 SOD에 비하여 SOD 활성이 감소되지만, 혈장내에서의 반감기는 훨씬 길어지는 것으로 보고되었다.[참조 Japanese Kokai Tokkyo Koho No. 58-3282]. 그러나, 이러한 변형된 SOD 종은 상기의 이유 또는 분자크기의 증가로 인한 조직 침투성의 감소에 있어서 실제로 사용하기에는 문제점이 있다.
본 발명의 목적은 SOD의 분자 크기가 증가되지 않고, 혈장 반감기가 SOD에 비하여 훨씬 더 연장되면서 SOD의 효소활성이 실질적으로 지속되는 신규한 초과산화물 디스무타제 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 소영활성, 허혈성 손상-예방활성 및 뇌부종-예방활성과 같은 약리학적 활성이 있는 신규하고 안전한 초과산화를 디스무타제 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기한 초과산화를 디스무타제 유도체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 소염제, 허혈성 손상 예방제 및 뇌부종 치료제와 같은 상기한 초과산화물 디스무타제의 의약적 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 이러한 목적 뿐만 아니라 기타의 목적과 잇점은 하기의 상세한 설명으로부터 당해분야의 전문가에게 명백해질 것이다.
본 발명은 하기 일반식(I)의 초과산화를 디스무타제 유도체를 제공한다.
[SOD][Z]X(Ⅰ)
상기식에서,[SOD]는 각각 상응하는 아미노그룹 또는 그룹들 대신에 수소원자 1개를 제거함으로써 아미노 그룹으로부터 유도되는 그룹 1 내지 6개를 갖는 초과산화물 디스무타제 잔기이며, [Z]는 하기 구성단위(a),(b) 및 (c)로 이루어지며 중량평균 분자량이 800 내지 20,000인 l가 공중합체 잔기이며, (a) 하기의 그룹(1),(2),(3) 및 (4)중에서 선택된 그룹
Figure kpo00002
[상기식에서, R1,R3및 R5는 각각 수소원자 또는 메틸 그룹이며, R5는 수소원자, 염소원자, 브롬원자 또는 메틸 그룹이고, R4는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 5의 알킬 그룹이며, R6는 메틸 그룹 또는 에틸 그룹이다]
(b) 하기 일반식(5)의 그룹
Figure kpo00003
상기식에서, R7은 수소원자, 또는 1 내지 4개의 탄소원자를 함유하는 알카놀, 알킬 그룹이 1 내지 4개의 탄소원자를 함유하는 에틸렌 글리콜 모노알킬 에테르 또는 이의 히드록실 그룹을 제거하여 생성되는 것으로 알킬 그룹이 각각 1 내지 4개의 탄소원자를 함유하는 글리세롤 디알킬 에테르의 잔기이다]
(c) 하기 구조식(6)의 그룹
Figure kpo00004
상기식에서, 카보닐 탄소원자는 [SOD]의 아미노 그룹의 질소원자에 의해 [SOD]에 결합된다.]
x는 수소원자 l개를 제거함으로써 아미노 그룹으로 부터 각각 유도되는 [SOD]의 그룹의 수에 상응하는1 내지 6의 정수이다.
이후, 상기의 초과산화물 디스무타제 유도체는 SOD 유도체라고 한다.
또한 본 발명은 SOD를 pH 7 내지 11의 알칼리성 수용액 중에서 하기의 구성단위로 이루어지며 중량평균 분자량이 800 내지 20,000인 공중합체와 반응시킴을 특징으로 하여 SOD 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.
(a) 하기의 그룹 (1),(2),(3) 및 (4)중에서 선택된 그룹
Figure kpo00005
[상기식에서, R1,R2,R3,R4,R5밋 R6는 상기에서 정의한 바와 같다]
(b) 하기 일반식(5)의 그룹
Figure kpo00006
상기식에서, R7은 상기에서 정의한 바와 같다]
(C') 하기 구조식(7)의 그룹
Figure kpo00007
이후, 상기의 공중합체는 간단히 공중합체라고 한다. 또한, 본 발명은 활성성분으로서 SOD 유도체를 함유하는 약제학적 조성물과 약제를 제공한다.
본 발명에 따라 SOD 유도체를 제조하는 방법은 하기에 상세하게 기술한다.
SOD와 공중합체와의 반응을 일반적으로 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 아세트산나트륨, 인산나트륨 등과 같은 염의 수용액에 SOD를 용해시킨 다음, 이렇게 하여 수득한 용액에 분말 또는 디메틸 설폭사이드 등과같은 유기용매중의 용액 형태로 가하여 수행한다. 반응도중에 용액의 pH를 7 내지 11로 유지해야 할 필요가 있다. pH가 7이하이면 공중합체의 용해도가 낮아져서 반응이 진행되지 않는다. pH가 11이상이면 SOD의 효소활성이 상실되어 본 발명에 따른 SOD 유도체를 수득할 수 없다. 반응온도는 바람직하게는 약 3 내지 50℃, 더욱 바람직하게는 3 내지 40℃의 범위 내에서 선택된다. 반응시간은 반응온도와 공중합체의 부가형태에 따라 선택되지만, 일반적으로 10분 내지 3시간이다. 공중합체는 SOD 몰당 약 0.5 내지 30몰의 양으로 사용한다. 각각의 SOD 분자에 결합된 공중합체 분자의 수는 상기한 범위내에서 공중합체의 양을 변화시켜 조정할 수 있다.
이렇게 하여 수득한 반응 혼합물은 SOD 유도체, 미반응 SOD, 공중합체 등을 함유한다. 이러한 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 겔 여과한다. 필요한 경우, 이렇게 하여 수득한 SOD 유도체-함유 유출물 또는 용출액을 소수성 크로마토그래피한 다음, 한외여과하여 농축시킨다. 이어서 동결 건조시켜 SOD 유도체를 고체형태로 수득한다.
상기의 반응에서, SOD의 아미노 그룹이 공중합체의 말레산 무수물 환과 반응함으로써 SOD 유도체가 생성된다. 예를들면, 인체형 Cu,Zn-SOD는 분자당 22개의 아미노 그룹(인간의 적혈구 SOD 또는 효모에 의해 생성된 유전적으로 조작된 인체형 SOD의 경우) 또는 분자당 24개의 아미노 그룹(대장균에 의해 생성된 유전적으로 조작된 인체형 SOD의 경우)을 함유한다. 상기의 반응에서, 아미노 그룹중의 일부가 공중합체의 말레산 무수물 환 1개와 반응함으로써 1 내지 6분자의 공중합체가 각각의 SOD 분자에 결합된 SOD 유도체를 생성한다.
일반적으로 출발물질 공중합체의 분자는 각각 평균 0.5 내지 2개의 말레산 무수물 환을 함유한다. 말레산 무수물 환 중의 하나가 SOD의 아미노 그룹과 반응하면, 잔여 말레산 무수물 환은 SOD의 다른 아미노 그룹과 거의 반응하지 않고 물과 반응하여 가수분해된 결과, 말레산-유도된 그룹(8)을 생성하는 경향이 있다.
Figure kpo00008
따라서, 상기에서 언급한 SOD 유도체의 구성단위(b)는 R7이 수소원자인 그룹을 포함한다. 부분적으로 반-에스테르화된 공중합체를 출발물질로 사용하는 경우, 상기의 구성단위(b)는 상기한 말레산-유도된 그룹이 반-에스테르화된 그룹일 뿐만 아니라 상기한 말레산-유도된 그룹중의 일부를 포함하기도 한다. 공중합체 분자 1개가 다수의 SOD 분자와 반응하여 궁중합체의 다수의 말레산 무수물 환 각각이 반응하여 각각의 SOD 분자의 아미노 그룹에 결합되는 부산물을 생성할 가능성이 있다. 이러한 소량의 부산물로 오염되더라도 본 발명에 따른 SOD 유도체는 특별한 어려움 없이 본 발명에 따라 의약적 용도로 사용할 수 있다. 그러나, 의약적 활성성분으로 사용되는 화합물이 일정한 단일 화학 구조를 갖는 것이 바람직하다는 현재의 상황에서 볼 때, SOD 유도체가 상기의 부산물을 상당히 많이 함유할 경우, SOD 유도체를 겔 여과하거나 부산물을 제거하는 다른 처리를 수행하여 정제된 생성물을 의약적 활성성분으로서 사용하는 것이 바람직하다. 상기의 반응으로 수득한 SOD 유도체는 SOD 분자 1개당 공중합체 분자의 수에 있어서 달라지는 SOD-공중합체 커플링 생성물의 혼합물이다. 따라서, 본 발명에 따라 제공되는 SOD 유도체를 나타내는 상기의 일반식에서 x는 각각의 SOD 분자와 커플링한 공중합체 분자의 평균수를 의미한다. 각각의 SOD 분자와 커플링한 공중합체 분자의 수가 일정한 SOD 유도체가 활성성분 화합물로서 바람직한 경우, 상기의 방법으로 수득한 SOD 유도체를 겔 여과하거나 다른 적절한 처리를 수행하여 SOD 유도체를 수득할 수 있다. 상기의 반응과 후속의 처리단계에서, SOD 유도체의 카복실 그룹은 알칼리 금속염 또는 암모늄 염을 생성할 수 있다. 본 발명에 따른 SOD 유도체는 또한 카복실 그룹을 함유하는 이러한 SOD 유도체를 염 형태로 포함한다.
SOD 유도체의 효소활성은 SOD 분자당 공중합체 분자의 수가 증가함에 따라 점차적으로 감소하는 경향이 있다. SOD 분자당 7 또는 그 이상의 공중합체 분자를 함유하는 SOD 유도체는 효소 활성이 너무 낮으므로, 의약적 활성성분 화합물로서 사용하기에는 적합하지 않다. 1 내지 4개의 공중합체 분자가 각각의 SOD 분자와 커플링한 SOD 유도체는 높은 수준의 효소활성을 유지하고 혈액순환에 있어서 연장된 반감기와 같은 기타의 유리한 특징이 있으므로 바람직하다. SOD와 각각 커플령한 2개의 공중합체 분자를 가진 SOD 유도체가 특히 바람직하다.
출발물질 SOD는 이의 공급원, 즉 동물(인간, 소, 등), 식물 및 미생물과 같은 생물체로부터 추출하여 수득하거나, 공지의 방법 또는 유전조작 기술을 이용하여 수득한다. SOD의 화학적 구조(배위금속, 분자량, 아미노산 서열 등에 관하여)는 상당히 밝혀져 있다. 현재, SOD는 세가지 그룹, 즉 Fe-SOD, Mn-SOD 및 Cu,Zn-SOD로 분류되며, 종(species)과 아세포 구간에 따라 분자량이 30,000 내지 80,000이다. 또한, 세가지 종류의 SOD의 아미노산 서열은 각각 다르다.
참고사항은 특히 문현에 상세히 기술되어 있다[참조: Yoshihiko Oyanagi,"Superoxide and Medicine", pages 74-90, Kyoritsu Shuppan (1981,5,25) ; Journal of Biological Chemistry, 246,2875-2880(1971) ; ibid, 250,6107-6112(1975) ; Proceedings of the National Academy of Sciences,70,3725-3729(1973) ; 및 Archives of Biochemistry and Biophysics,179,243-256(1977)]. 출발물질로서 가장 바람직한 SOD는 인체형 Cu. Zn-SOD이다. 이것은 분자량이 33,000이며 분자내에 22 또는 24개의 아미노 그룹을 함유한다. 인체형 SOD는 예를들면, 인간의 혈액을 차례로 열처리, 이온교환 및 겔 여과하거나 유전조작 기술을 이용하여 수득할 수 있다.
출발물질 공중합체는 상기에서 언급한 구성단위(a)에 상응하는 단량체와 말레산 무수물과의 공중합체를 부분적으로 가수분해[부분적인 가수분해는 소수(분자당 평균 0.5 내지 2개)의 말레산 무수물 환이 남고, 그외의 말레산 무수물 환은 가수분해될 정도로 수행된다]하거나, 이러한 공중합체를 알코올과 부분적으로 반-에스테르화[부분적인 반-에스테르화는 소수(분자당 평균 0.5 내지 2개)의 말레산 무수물 환이 남고, 그외의 말레산 무수물 환은 반-에스테르화될 정도로 수행된다]시켜 수득할 수 있다. 상기의 방법으로 수득할 수 있는 공중합체의 예는 부분적으로 가수분해된 스티렌-, P-클로로스티렌-, P-브로모스티렌-, 또는 α-메틸스티렌-말레산 무수물 공중합체; 부분적으로 반-에스테르화된 스티렌-, P-클로로스티렌-,P-브로모스티렌- 또는 α-메틸스티렌-말레산 무수물 공중합체(메틸 에스테르, 에틸 에스테르, 프로필에스테르, n-부틸 에스테르, 메톡시에틸 에스테르, 에톡시에틸 에스테르, 프로폭시에틸 에스테르, 2-부톡시에틸 에스테르, 1,3-디메톡시-2-프로필 에스테르, 2,3-디메톡시-1-프로필 에스테르, 1,3-디에톡시 -2-프로필 에스테르, 2-에톡시 -3-메톡시 -1-프로필 에스테르, l,3-디프로폭시 -2-프로필 에스테르, 1,3-디부톡시-2-프로필 에스테르, 등) ; 부분적으로 가수분해된 에틸렌-, 프로필렌-,α-부틸렌-, 이소부틸렌-,1-펜텐-,2-메틸-1-부텐, 1-헥센- 또는 1-헵텐-말레산 무수물 공중합체 ; 부분적으로 반-에스테르화된-에틸렌-, 프로필렌-, α-부틸렌-, 이소부틸렌-,1-펜텐-,2-메틸-1-부텐,1-헥센-또는 1-헥텐-말레산 무수물 공중합체 (예로 든 상기와 동일한 에스테르); 부분적으로 가수분해된 비닐 아세테이트-말레산 무수물 공중합체; 부분적으로 반-에스테르화된 비닐 아세테이트-말레산 무수물 공중합체; 부분적으로 가수분해된 메틸(메트)아크릴레이트-말레산 무수물 공중합체; 부분적으로 반-에스테르화된 메틸(메트)아크릴레이트-말레산 무수물 공중합체; 부분적으로 가수분해된 에필(메트)아크릴레이트-말레산 무수물 공중합체; 부분적으로 반-에스테르화된 에틸(메트)아크릴레이트-말레산 무수물 공중합체; 등이다.
이러한 모든 공중합체는 소수성 그룹과 친수성 그룹을 모두 가지고 있으며, 그 결과, 소수성이 충분한 동시에 극성 카복실 그룹을 가진다. 따라서, 이러한 공중합체를 함유하는 SOD 유도체는 반대로 혈청 단백질 및 생체막(biomembrane)과 결합하며, 그 결과. 기관에로의 전이가 향상될 뿐만 아니라 혈액순환에서의 반감기가 연장된다. 특히, 구성단위(a)로서 스티렌-유도된 그룹을 갖는 SOD 유도체와 구성단위(b)로서 반-에스테르회된 그룹을 갖는 SOD 유도체는 소수성이 비교적 높으므로 이러한 효과를 나타내는데 바람직하다.
공중합체 내에서, 구성단위(b) 및 (c)에 대한 구성단위(a)의 몰비, 즉[(a)/[(b)+(c)]]는 실질적으로 약1 내지 1.3의 범위내가 바람직하다. 상기의 비는 일반적으로 1이다. 상기의 몰비가 1미만인 공중합체는 구성단위(a)에 상응하는 단량체와 말레산 무수물과의 공중합으로는 거의 수득할 수 없다. 구성단위(b)가 반-에스테르화된 경우, 비가 1.3 이상인 공중합체는 염수용액에서의 용해도가 이러한 수용액에서 SOD와 반응하기에 양호하지 않으므로 바람직하지 않다.
상기에서 언급한 공중합체는 모두 당해분야에 공지되어 있다. 이들의 중량 평균 분자량은 일반적으로 800내지 20,000의 범위내이다. 이러한 공중합체로부터 수득된 SOD 유도체가 감염 부위로 전이되는 견지에서 공중합체는 중량 평균 분자량이 3,000 이하인 것이 바람직하다. 공중합체의 분자량 분포에 있어서 특별한 제한은 없다. 따라서, 상기에서 언급한 구성단위(a)에 상응하는 단량체와 말레산 무수물과의 라디칼 공중합으로 수득한 공중합체(중량 평균 분자량/수평균 분자량의 비가 약 2.0 또는 그 이상인 공중합체)는 분별증류하지 않고 부분적으로 가수분해하거나 부분적으로 반-에스테르화한 후 원료로서 사용하거나, 분별증류하여 분자량 분포가 좁은 물질을 수득한 다음, 부분적으로 가수분해하거나 부분적으로 반-에스테르화하여 원료로서 사용할 수 있다.
하기의 시험실시예는 본 발명에 따른 SOD 유도체의 약리학적 특징을 상세하게 설명한다.
시험실시예 1
pH가 국소적으로 저하된 조직에서의 SOD 유도체의 특정한 누적
체중이 약 20g인 마우스를 사용하여, 0.15M-HEPES 완충액(pH 6.0) 0.2ml 및 생리 식염수 0.2ml를 좌측 및 우측 대퇴부 근육에 각각 근육내 주사한다. 이어서 합성 실시예2에서 기술한 과정으로 제조한125I 표지된 SOD 유도체(14nmol) 또는 합성 실시예 2에서 사용하는 Bu-SMA에 상응하는3H 표지된 Bu-SMA(0.22μmol)를 즉시 정맥내 투여한 다음, 우측 및 좌측 대퇴부 근육에 누적된 방사능의 양을 표시된 간격으로 측정한다. 결과는 제13도에 도시하였다. 좌측 대퇴부 근육(산성 부위)에서의 방사능은 우측 대퇴부 근육(대조 부위)에서보다 현저하게 높으며, 이러한 점은 SOD와 Bu-SMA의 커플링으로 인하여 합성 실시예 2에 따른 SOD 유도체가 선택적으로 산성 조직내로 흡수되는 것(염증 부위의 pH가 낮아진다)을 나타낸다.
시험실시예 2
허혈성 손상 억제효과와 소염효과
방법
수컷 SD 래트(체중 약 200g)를 밤새 단식시킨 다음, 각각 6마리씩 그룹을 지어 스트레스 게이지에 넣는다. 스트레스를 가하기 위해 동물의 검상 수준까지 22℃의 물속에 침수시킨다. 이러한 방식으로 스트레스를 가하면 래트의 위점막의 혈류를 감소시키고 궤양에 이르는 급성 염증을 야기하는 국부 빈혈을 유발한다. 스트레스를 가한지 2,4 및 6시간 후, 상자를 물에서 꺼내어 래트를 회생시킨다. 이어서, 위를 절제한다. 분리된 위에 10% 포르말린을 주입하여 고정시킨다. 고정시킨 다음, 선형의 궤양의 길이를 합하고, 그 합계를 궤양지수로 나타낸다.
강제로 침수시키기 전에 시험 화합물을 즉시 투여한다. 대조 그룹의 래트에게 생리 식염수를 0.5ml 투여하는 반면, 시험 그룹의 래트에게 SOD 또는 합성 실시예 2에서 제조한 SOD 유도체(lmg/래트)의 식염 용액을 0.5ml 투여하며, 이는 모두 정맥내 경로로 투여한다.
결과
제14도는 침수기간에 대하여 플로트한 궤양 지수(mm/조직)를 나타낸다. 제14도에서, 원은 대조 그룹의 데이터를 나타내며, 삼각형은 SOD 유도체 그룹의 데이터를 나타낸다. 부수적으로, SOD 그룹에 대한 결과는 대조 그룹의 결과와 실제로 동일하므로 생략한다.
SOD 그룹은 항궤양 효과의 징후를 보이지 않는 반면에 SOD 유도체 그룹에서는 궤양화의 억제가 뚜렷하게 나타남을 제14도로부터 알 수 있다.
따라서, SOD 유도체는 조직에서 국부적인 pH의 저하로 인해 수반되는 질병에 대하여 우수한 허혈성 손상 예방-소염제임이 명백하다.
시험 실시예 3
뇌부종 예방효과
래트(체중 약 200g)의 대뇌 우반구를 액체 질소로 30초 동안 처리하여 뚜렷한 일측성 뇌부종을 야기시킨다. 동일한 래트에게 시험 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 3H-표지된 Bu-SMA를 0.2μmol 정맥내 투여하는 경우, 방사능은 pH가 국부적으로 감소되는 손상된 부위에 특정적으로 누적된다[제15도(2)]. 동일한 부종성 래트에게 시험 실시예 1에서 사용한 것과 동일한125I-표지된 SOD유도체를 27nmol 정맥내 투여하는 경우, 방사능은 손상된 부위에 특정적으로 누적된다 [제15도(1)]. 따라서, 합성실시예 2에 따라 Bu-SMA에 커플링한 SOD유도체가 손상된 뇌조직에 상당히 누적되는 것이 명백하다. 이러한 SOD유도체의 누적은 뚜렷한 부종의 감소를 가져온다.
시험 실시예 4
산소중독 예방효과
마우스(체중 약 20g)에게 파라큐트를 200mg/kg 복막내 투여하여 간세포 손상(이것은 혈장 GOT의 뚜렷한 상승을 야기한다)을 일으키는 초과산화물 음이온 라디칼(O2-)의 형성을 유발한다. 이러한 파라큐트-처리된 마우스에게 상기와 동일한 SOD유도체를 20mg/kg 정맥내 투여하면 혈장 GOT수준 상승의 뚜렷한 억제를 야기한다(제16도). 변형되지 않은 SOD는 이러한 방지효과를 보이지 않으며, 따라서 헐장 GOT 수준은 대조그룹에서와 다르지 않다.
또한, 독물학적 연구는 SOD 유도체의 독성이 낮음을 나타낸다.
전술한 결과로부터 명백한 바와 같이, SOD유도체는 초과산하물 음이온 라디칼과 관련된 여러가지 질병에 효과적이며, 소염제, 허혈성 손상 길항질, 대뇌 항부종제, 항파라큐트 중독제와 소화성 궤양 및 위점막의 염증으로 인한 기타의 위장질환의 예방제로서 사용할 수 있다.
또한, SOD 유도체는 허혈성 심장질환의 치료제 또는 초과산화물 음이온 라디칼과 관련된, 항암제에 의해 야기된 부작용의 완화제로서 중요하다.
SOD 유도체의 투여량은 질병의 종류, 질병의 중증도, 환자의 내성, 및 기타의 요인에 따라 다르다. 그러나, 성인의 통상적인 1일 투여량은 단일 또는 분할 투여량으로서 0.1 내지 500mg이며, 바람직하게는 0.5내지 100mg이다. SOD 유도체는 각각의 투여경로에 적합한 각종 투여형태로 제공할 수 있다.
따라서, SOD 유도체는 기존의 약제학적 방법으로 제형화하여 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 활성성분으로서 SOD 유도체의 종 하나 이상을 함유하는 각종 약제학적 조성물을 포함한다. 이러한 약제학적 조성물은 약제학적 실시에서 통상적으로 사용되는 약제학적으로 무독한 담체, 비히클 및 기타의 보조물질을 사용하여 제조할 수 있다.
이러한 약제학적 조성물을 경구투여하고자 하는 경우, 바람직하게는 위장계통으로부터 흡수에 적합한 투여형태로 제공한다. 경구투여용 단위 투여 형태인 정제와 캡슐은 시럽, 아라비아 고무, 젤라틴, 소르비톨, 트라가칸트 고무, 폴리비닐 피롤리돈 등의 결합제, 락토오즈. 옥수수 전분, 인산칼슘, 소르비톨, 글리신 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜, 실리카 등의 윤활제, 감자 전분 등의 붕해제, 나트륨 라우틸 설페이트 등의 약제학적으로 무독산 습윤제를 함유할 수 있다. 정제는 공지의 방법으로 피복할 수 있다. 경구투여용 액체 제제는 수용성 또는 오일상 현탁액, 용액, 시럽, 엘릭시 등이거나, 물 또는 기타의 적합한 비히클로 일시적으로 제조제된 동결 건조제일 수 있다. 이러한 액체 제제는 소르비톨시럽, 메틸셀룰로오스, 글루코즈/슈크로즈 시럽, 젤라틴, 히드록시에틸셀룰로오즈, 카복시에틸셀룰로오즈, 알루미늠 스테아레이트 겔, 식유 경화유 및 유지 등의 현탁화제; 레시틴, 소르비탄 모노올레이트, 아라비아고무 등의 유화제 , 아몬드 오일(almond-oil), 분별증류된 코코넛 오일, 유성 에스테르, 프로필렌 글리콜, 에틸 알코올 등의 비수성 비히클; 메필 P-히드록시벤조에이트, 프로필 P-히드록시벤조에이트, 소르브산등의 방부제 등을 포함하는 통상적인 첨가제를 함유할 수 있다.
주사액을 제조하기 위해, SOD유도체를 생리 식염수, 주사용 글루코즈 용액 등의 적절한 용매에 용해시킨 다음, 통상적인 방법으로 SOD 유도체의 농도를 용매 2 내지 10ml당 2 내지 20mg으로 조정하여 피하, 근육내 또는 정맥내 투여용 주사액을 제조한다. 상기의 주사액을 제조하는데 있어서, 필요에 따라, pH 조절제, 완충제, 안정화제, 방부제, 가용화제 등을 수응액을 첨가할 수 있다.
상기에서 언급한 약제학적 조성물은 이의 형태와 기타의 인자에 따라 선택된 농도로, 일반적으로 약 0.01내지 50중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 20중량%의 농도로 SOD유도체를 함유할 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
참고 실시예 1
스티렌-말레산 무수물 공중합체의 합성
말레산 무수물(383g,3.9mole)을 큐멘 3.7ℓ에 가한 다음, 혼합물을 환류하에 교반한다. 큐멘 1.7ℓ중의 디큐밀 퍼옥사이드 16.3g(60mmole)과 스트렌 203g(1.95mole)의 용액을 약 40분에 걸쳐 상기 용액에 적가한다. 적가를 완결한 후, 1시간 동안 계속 가열, 교반한다. 이렇게하여 수득한 반응혼합물을 밤새 방치한 다음, 상등액을 제거하고, 반응용기에 점착되어 있는 점성 물질을 아세톤에 용해시켜 회수한다. 회수한 용액으로부터 아세톤을 감압하에 증류시켜 스티렌-말레산 무수물 공중합체(이후, 간단히 SMA라고 한다)를 353g 수득한다.
SMA의 분별증류
상기의 방법으로 수득한 SMA 분획중의 120.0g을 아세톤 3ℓ에 용해시킨다. 약 1시간에 걸쳐 교반하면서 n-헥산 4.9ℓ를 상기 용액에 적가한다. 생성된 불투명한 아세톤-n-헥산 혼합물을 다른 용기로 옮긴다음, 이 혼합물에, n-헥산 9.74ℓ를 약 1.5시간에 걸쳐 교반하면서 적가한다. 용기벽에 점착되어 있는점성 물질은 아세톤으로 용해시켜 회수한다. 이렇게 회수한 용액으로부터 아세톤을 감압하에 증류시킨다. 잔사를 진공하에 70 내지 80℃의 온도에서 밤새 건조시킨다. 이렇게 하여 분별증류된 SMA 침전물을 49. 2g 수득한다.
수득된 SMA 분휙중의 400g을 아세톤 1ℓ에 용해시킨다. 표면이 실란-처리된 유리구슬(평균 입자크기: 0.lmm) 3.8kg을 상기 용액에 가한 다음, 아세톤을 증발시켜 표면에 SMA가 부착된 유리구슬을 수득한다.
컬럼 시스템 온도를 25℃로 유지하면서, 내부직경이 80mm이고 길이가 80cm인 컬럼에 상기의 SMA-부착 유리구슬과 아세톤 및 n-헥산의 혼합물(25℃에서의 부피비: 24: 76) 1.4ℓ를 채우고. 부피비가 상이한 두가지 아세톤-n-헥산 혼합물, 즉(i) 25℃에서 부피비가 24 : 76인 아세톤-n-헥산 혼합물 1.6ℓ와(11) 25℃에서의 부피비가 37: 63인 아세톤-n-헥산 혼합물 6.0ℓ를 칼럼 시스템의 상부로부터 차례로 컬럼 시스템에 적가 공급한 다음, 아세톤 3.0ℓ를 더 적가공급한다. 상기에서 언급한 37 : 63(부피비)의 아세톤-n-헥산 혼합물에 상응하는 용리분획을 수거한 다음, 비점이 낮은 분획은 감압하에서 증류시킨다. 잔사를 진공하에 70 내지 80℃의 온도에서 밤새 건조시킨다. 이렇게 하여 목적하는 SMA 분획을 31. 8g의 수율로 수득한다. 분별화된 SMA의 중량평균분자량(
Figure kpo00009
w)과 수평균분자량(
Figure kpo00010
n)을 겔 투과 크로마토그라피(이후, 간단히 GPC라고 한다 ; 테트라하이드로푸란 용리액, 폴리스티렌 표준물)로 측정한 결과,
Figure kpo00011
w은 1,340
이고
Figure kpo00012
n은 1,220이었다(
Figure kpo00013
w/
Figure kpo00014
n=1.10). 증기압 삼투압계를 사용하여 측정한
Figure kpo00015
n은 1,210이었다. 전위차계 적정으로 측정하여 수득한 분별화된 SMA중의 말레산 무수물의 양은 47. 3mole%이었다.
분별화된 SMA의 부분적인 반 부틸 에스테르화
자석 교반기가 장치된 약 40ml 앰플에 상기의 분별화된 SMA l0.0g, n-부틸 알코올 2.20g, 무수리듐아세테이트 0.10g 및 디옥산 20ml을 충진시킨 다음, 밀봉한다. 이 앰플의 내용물을 20시간 동안 교반하면서 90℃에서 가열한다. 소량의 반응 혼합물을 취한 다음, 내부 표준물로서 에틸 셀로솔브를 사용하여 기체 크로마토그라피로 미반응 n-부틸 알코올에 대하여 분석하고, 충진된 n-부틸 알코올의 전환을 기준으로 공중합체중의 말레산 무수물 환의 반 부틸 에세테르회도를 계산한 결과, 62%로 나타났다. 이어서 반응혼합물을 디옥산 20ml로 희석한 다음, 희석용액을 n-헥산 400ml에 적가하여 재침전시킨다. 침전물을 회수하고, 진공하에 약 60℃에서 밤새 건조시켜 목적하는 부분적으로 반 부틸-에스테르화된 스티렌-말레산 무수물 공중합체(Bu-SMA)를 11.5g 수득한다.
공중합체중의 잔여 말레산 무수물 환의 양은 적의선 분광계[FT-IR, KBr 디스크(disk) 법]에 의해 나타난 파수 1780cm-1및 700cm-1에서의 흡수도를 기준으로하여 측정한 결과, 30.3mole%로 나타났다(Bu-SMA 분자당 말레산 무수물 환의 수는 평균 1.8이다). GPC로 측정한
Figure kpo00016
w과
Figure kpo00017
n은 각각 1,530과 1,440이었다(Mw/Mn=1.06).
합성 실시예 1
0.1M 탄산수소나트륨 수용액(pH 8.0) 10ml에 인간의 적혈구 SOD(3,000units/mg)50mg(1.5 ×10-6mole)을 37℃에서 교반하면서 용해시킨다. 이 용액에 스티렌-말레산 무수물 공중합체 [개시제로서 디큐밀퍼옥사이드를 사용한 라디칼 중합반응의 생성물; 생성물중의 스티렌-말레산 무수물의 몰비=l : 1,
Figure kpo00018
w=1,280; 분자량 분포
Figure kpo00019
w/
Figure kpo00020
n=1.20이하]의 부분적 반 부틸 에스테르화에 의하여 고체 분말로 수득한 부분적인 반 부틸-에스테르화 스티렌-말레산 무수물 공중합체
[
Figure kpo00021
w=1,600 : 에스테르화도=60mole% : 말레산 무수물 환의 양=25mole%(분자당 말레산 무수물 환의수는 평균 1.6이다)]의 80mg(5mM : 이 농도는 반응혼합물중의 최종 Bu-SMA의 농도이다 : 이하 동일하게 적용된다)을 조금씩 가한 다음, 1시간 동안 반응을 진행시킨다.
인간의 적혈구 SOD의 아미노 그룹을 Bu-SMA의 반응시킨 다음, 나트륨 트리니트로 벤젠설포네이트(TNBS)를 사용하여 잔여 아이노그룹의 양을 측정한다. 본 실시예에서 사용하는 인간의 적혈구 SOD의 종은 분자당 22개의 아미노그룹을 함유하며 약 10 내지 11개의 아미노 그룹이 TNBS법에 의해 분석되었다. 인간의 적혈구 SOD의 아미노 그룹의 20mole%(적정가능한 아미노 그룹의 약 44mole%에 사용하는)가 상기의 반응조건하에서 Bu-SMA와 반응하는 것으로 확인되었다. 이 반응혼합물을 여과하고, 여액을 세파댁스 G-100(등륵상표, pharmacia Fine Chemicals 제품)로 채운 K 50/30컬럼(상표 : pharmacia Fine chemicals 제품, 스웨덴)에 주입하여 겔 여과한다. 20mM 탄산수소암모늄과 탄산암모늄의 혼합용액을 용리액으로 사용한다. 용리된 분휙은 280nm에서 측정하여, 흡수를 보이는 분휙을 수거하고, 한외여과막(Sartorius SM 145-39)을 사용하여 농축시킨 다음, 동결건조시켜 백색 분말을 52mg 수득한다. 수득된 분말의 UV 흡수 스팩트럼 [제2도의 SOD유도체(I)]과 출발물질 SOD 및 Bu-SMA의 UV흡수 스펙트럼은 인산 완충제를 사용하여 pH 7.4에서 측정한다. 스팩트럼은 제2도에 도시되어 있다. 동일한 방법으로 제조한51Cr-표지된 시료(반응생성물)의 5㎕을 앰폴린(Ampholine, pH 1.5-6.0 : 700nw : 에스테르화 12시간 : 분별화 : 1ml/분휙)상에서 등전 포커스(isoelectric focusing) 처리한 다음, pH와 방사능을 측정한다. 이렇게 하여 수득한 결과를 제8도에 도시한다. 수득된 분말의 등전점은 20이다. 로우리법(Lowrymethod)으로 측정한 수득된 백색 분말중의 단백질량은 80%이다. 이러한 결과를 근거로 하여 SOD 분자당 Bu-SMA 분자의 수가 결정된다.
상기의 데이터를 근거로 하여, 수득된 흰색분말은 평균적으로 각각의 SOD 분자와 결합(Bu-SMA의 무수 말레산 환과 SOD의 아미노 그룹의 반응으로)한
Figure kpo00022
의 몰비=1 :
1; 부틸 에스테르화도=60% ,
Figure kpo00023
w=1,600)분자를 5개 갖는 SOD 유도체로서 확인된다.
합성 실시예 2
0.lM 탄산수소나트륨(pH 8.0)l0ml에 인간의 적혈구 SOD(3,000 units/mg)50mg을 37℃에서 교반하면서 용해시킨다. 이 용액에 합성 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 Bu-SMA 30mg(1.9mM)을 조금씩 가한다음, Bu-SMA를 합성 실시예 1과 동일한 방법으로 상기의 인간 적혈구 SOD와 반응시킨다. 이어서 반응혼합물을 합성 실시예 1과 동일한 방법으로 처리하여 백색 분말을 45mg 수득한다. 상기의 합성 실시예 1과 동일한 방법으로 측정한 백색 분말의 UV 흡수 스펙트럼은 제2도[SOD 유도체(II)]에 도시되어 있다.
등전 포커스에 이어서 측정한 pH와 방사능의 결과는 제9도에 도시되어 있다. 수득한 분말의 등전점은 4.4이다. 잔여 아미노 그룹의 양을 TNBS 법으로 분석한 결과는 출발물질 SOD내의 아미노 그룹중의 약 9mole%(적정가능한 아미노 그룹의 약 20mole%에 상응하는)가 Bu-SMA와 반응한 것으로 확인되었다.
상기의 데이터를 근거로 하여, 수득한 백색 분말은 SOD 유도체가, 평균적으로 각각의 SOD분자에 결합한 Bu-SMA 분자를 2개를 갖는 것으르 확인되었다.
합성 실시예 3
0.lM 탄산수소나트륨 수용액(pH 8.0) 1ml에 인간의 적혈구 SOD(3,000 units/mg) 5mg(1.5×10-7mole)을 용해시킨다. 이 용액에 합성 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 Bu-SMA 4mg(2.5mM)을 가하고, 반응을 37℃에서 동일한 방법으로 진행시킨다. SOD내의 아미노 그룹의 양과 반응시간과의 관계는 제1도에 도시되어 있다.
아미노 그룹의 분석은 TN BS 법으로 수행한다. 사용된 인간의 적혈구 SOD는 분자당 22개의 아이노그룹을 함유하며, 이들중 약 10 내지 11개를 TNBS법으로 분석할 수 있다. 상기의 반응조건하에서, 적정가능한 아미노 그룹의 약 38mole%가 Bu-SMA와 1시간내에 반응하는 것으로 확인되었다.
각각의 SOD분자와 결합한 Bu-SMA 분자를 약 4개 갖는 SOD유도체를 수득할 수 있다. 반응 한지 2시간 후 동일한 양의 Bu-SMA를 반응 혼합물에 더 가한다. 이러한 경우, 아미노 그룹의 양은 제1도에서(---,---)로 도시한 바와 같이 더욱 감소한다. 이것은 반응에 첨가한 Bu-SMA의 양을 변화시킴으로써 SOD 분자에 결합한 Bu-SMA의 양을 조절할 수 있음을 명백히 나타낸다.
합성 실시예 4
0.lM 탄산수소나트륨 수용액(pH 8.0) 1ml에 인간의 적혈구 SOD(3,000 units/mg) l0mg(3.0×10-7mole)용해시킨다. 이 용액에 부분적으로 가수분해되거나 부분적으로 반-에스테르화된 스티렌-말레산 무수물 공중합체(표1)중의 하나를 최종농도(반응혼합물에서)가 2.5mM이 되도록 가한다.
반응은 37℃에서 1시간 동안 수행한다. 그후, SOD내에 남은 아미노 그룹의 양을 TNBS법으로 측정한다. 각각의 경우, 아미노 그룹의 손실은 적정가능한 아미노 그룹의 15 내지 25mole%에 이르는 것으로 확인되었다. 각각의 경우에 평균적으로 각각의 SOD분자에 결합한 스티렌-말레산 무수물 공중합체 분자를1.7 내지 2.8개 갖는 SOD 유도체가 수득된다.
[표 1]
Figure kpo00024
합성 실시예 5
합성 실시예 4에서 사용한 스테렌-말레산 무수물 공중합체 대신에 부분적으로 가수분해된 이소부텐-말레산 무수물 공중합체(
Figure kpo00025
w=2,500; 말레산 무수물 환의 양=3.0 환/분자)를 사용하는 것 이외에는 동일한 방법으로 합성 실시예 4의 반응과 분리과정을 수행한다. 각각의 SOD 분자에 결합한 이소부텐-말레산 무수물 공중합체 분자를 약 4개 갖는 SOD 유도체가 수득된다.
합성 실시예 6
합성 실시예 4에서 사용한 스티텐-말레산 무수물 공중합체 대신에 표2에 기재된 공중합체중의 하나를 사용한 것 이외에는 동일한 방법으로 합성 실시예 4의 반응과 분리과정을 수행한다. 따라서, 상응하는 SOD 유도체가 수득된다.
[표 2]
Figure kpo00026
(각각의 공중합체의 말레산 무수물 환의 양은 분자당 약 1.5환이다. )
합성 실시예 7
인간의 적혈구 SOD(sigma 제품)의 특정량(표3)을 0.lM 탄산수소나트륨 수용액(pH 8. 0)에 5mg/ml의 농도로 용해시킨다. 이 용액에 부분적으로 가수분해된 스티렌-말레산 무수물 공중합체(분자량=약 1,400; 말레산 무수물 환의 양=약 1.0환/분자), 부분적으로 가수분해된 p-브로모스티렌-말레산 무수물 공중합체(분자량=약 1,600 ; 말레산 무수물 환의 양=약 1 5환/분자), 부분적으로 가수분해된 α-메틸스티렌 말레산 무수물 공중합체(분자량=약 1,600 ; 말레산 무수물 환의 양=약 3.3환/분자), 또는 부분적으로 가수분해된 이소부틸렌-말레산 무수물 궁중합체(분자량=2,500 ; 말레산 무수물 환의 양=약 3 5환/분자)의 특정량을 가한 다음, 반응을 25℃에서 1시간 동안 진행시킨다.
그 뒤 반응 혼합물을 세파덱스 G-75 슈퍼파인 (등륵상표 pharmacia Fine chemicals 제품)으로 채운 k 26/40 컬럼(등록상표 pharmacia-Fine Chemicals 제조)에 주입시켜 겔여과 한다. 10mM 탄산수소암모늄 및 탄산암모늄 혼합용액을 용리액으로 사용한다. 용리된 분획은 280nm 및 254nm에서 측정되고, 미반응 공중합체 분획 이외의 흡수를 보이는 분획을 수거한 다음, 동결건조시켜 백색 분말형태로 SOD 유도체를 수득한다. 이렇게 하여 수득한 결과는 표3에 기재되어 있다. SOD내의 반응한 아이노그룹은 TNBS법으로 측정한다. 사용된 인간의 적혈구 SOD종은 분자당 22개의 아이노그룹을 함유하며 이들중 약 10 내지 11개는 TNBS법으로 적정할 수 있다.
[표 3]
Figure kpo00027
인간의 적혈구 SOD와 소의 적혈구 SOD의 IR흡수 스팩트럼(FT-IR, KBr디스크법)은 제4도(1) 및 제4도(2)에 각각 도시되어 있다. 표3에 기재된 SOD유도체 7-1,7-2 및 7-3의 IR흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr 디스크법)은 제5도, 제6도, 제7도에 각각 도시되어 있다.
제5도 내지 제7도에서는 인간의 적혈구 SOD의 흡수 스펙트럼 이외에도 공중합체로 인한 흡수도(각각화살표로 표시)를 각각 관찰할 수 있다. 따라서, 이러한 도면에 나타난 흡수 스펙트럼은 각각의 공중합체가 SOD에 결합됨을 나타낸다.
인간의 적혈구 SOD 대신에 소의 적혈구 SOD를 사용하여, 상기에서 언급한 것과 동일한 반응과 분리과정을 수행하여 각각 제5도 내지 제7도에 도시한 것과 유사한 IR흡수 스펙트럼을 갖는 상응하는 SOD유도체를 수득한다.
시험 실시예 5
인간의 적혈구 SOD(5mg/ml)와 각종 농도(0.14, 0.37, 0.75,1.5, 3,6및 12mM)의 Bu-SMA을, 37℃ 및 pH 8.0에서 1시간 동안 반응시킨다. 이러한 방법으로, SOD와 결합한 Bu-SMA의 양이 상이한 각종 SOD유도체를 제조한다. SOD유도체내의 결합한 Bu-SMA의 양과 효소활성 사이의 관계를 연구한다. 효소활성측정은 문헌에 기술된 방법으로 수행한다.[참조 Journal of Biological Chemstry 244,6049-6055(1965)].반응혼합물중의 Bu-SMA농도와 수득된 SOD유도체내의 잔여 아미노 그룹의 양(TNBS법으로 측정한)사이의 관계 및 상기의 Bu-SMA농도와 효소활성 사이의 관계는 제3도에 도시되어 있다. 제3도에 도시한 데이터는 Bu-SMA 농도가 6mM인 경우, 수득된 SOD유도체내의 TNBS-적정가능한 아미노 그룹의 약 50%(이것은 상기에 언급한 바와 같이 출발물질 SOD의 각각의 분자내에서 생기는 22개의 아미노 그룹중의 약10 내지 11개의 아미노 그룹이 TNBS와 반응하므로, 5개의 아미노 그룹은 이러한 경우의 반응에 참여하며, 17개의 잔여 아미노 그룹은 반응하지 않음을 의미한다)가 원래의 효소활성의 50% 유지되면서, 본래대로 남아있으며, 결합된 Bu-SMA의 양이 더 증가하는 경우, 효소활성은 원래의 50%보다 더 낮아진다. 따라서, 공중합체를 사용한 SOD의 심한 화학적 변형은 효소활성의 유지에 있어서 바람직하지 않지만, 각각의 SOD분자에 결합한 공중합체 분자의 수를 약 6개 또는 그 이하로 제한할 필요가 있다. 제3도에서 도시한 바와 같이, 2개의 Bu-SMA분자가 각각의 SOD분자에 결합한 SOD유도체는 SOD자체의 원래의 효소활성의 80%를 보유한다.
합성 실시예 2에서 수득한 SOD유도체와 출발물질 SOD를 프로테아제에 대한 감도에 대하여 비교한다. 반응은 pH 7.4 및 37℃에서 수행한다.
SOD유도체 및 SOD는 15단위/ml의 농도(5μg/ml)로 트립신, 키모트립신 또는 파파인 0.lmg/ml와 각각 반응한다. 이렇게하여 수득한 결과는 제11도에 도시되어 있다. 두가지 모두 파파인의 작용하에서 효소활성을 약간 상실하지만, 실질적으로 비활성화되지 않고 다른 프로테아제종에 대해 안정하다. 따라서, SOD를 공중합체로 변형시키는 것은 효소 SOD의 안정성을 변화시키지 않는 것으로 결론지을 수 있다.
시험 실시예 6
합성 실시예 2에서 수득한 SOD유도체와 출발물질 SOD를 각각 소혈청 알부민-세파로즈컬럼 친화성 크로마토그라피로 처리한다. 수득된 결과는 제10도에 도시되어 있다. 출발물질 SOD는 알부민에 결합되지 않고 컬럼을 완전히 통과한다.
SOD유도체의 경우, 95% 또는 그 이상이 알부민 컬럼에 결합한다. 컬럼을 0.1% 나트륨 도데실-설페이트(SDS)로 처리하면 SOD유도체의 상당한 부분이 용리되지만, 이러한 조건하에서 SOD유도체의 약 30%는여전히 컬럼에 결합되어 남는다. 이어서 구아니딘 하이드로클로라이드로 컬럼을 변성처리하여 SOD유도체를 완전히 용리시킨다. SOD농도가 0.5%인 경우, SDS로 처리하여 알부민 컬럼으로부터 SOD유도체를 거의 정량적으로 용리시킨다. 이러한 사실은 Bu-SMA가 SOD와 결합한 SOD유도체가 출발물질 SOD와는 달리, 알부민에 대한 친화성이 강하다는 것을 나타낸다.
따라서. 합성 실시예 2에서 수득한 SOD유도체 또는 출발물질 SOD를 래트에게 정맥투여하면, 혈장내의 SOD유도체 농도와 SOD농도가 변한다. 수득된 결과는 제12도에 도시되어 있다. 제12도로부터 명백한 바와같이, SOD유도체의 혈장농도는 매우 장기간(반감기=6시간)동안 높은 수준에서 유지되는 반면, 출발물질 SOD의 혈장 농도는 단시간(반감기=5분)내에 감소한다. 이것은 Bu-SMA의 존재로 인하여 혈장 알부민과 SOD유도체의 강한 결합에서 기인하는 것으로 예상된다.
또한, 합성 실시예 4,5 및 6에서 수득한 SOD유도체는 소 혈청 알부민-세파로즈 컬럼 친화성 크로마토그라피로 처리하여 상기와 동일한 방법으로 수행한다. 각각의 SOD유도체에 있어서, 90% 이상이 알부민 컬럼에 결합하므로 나트륨 도데실 설페이트(SDS)를 처리하여 용리시킨다. 이것은 각각의 SOD유도체가 알부민에 강하게 결합되어 있음을 나타낸다. 이러한 결합은 SOD와 커플링한 공중합체 내의 소수성 그룹과 카복실 그룹의 존재에서 기인하는 것으로 예상된다.
합성 실시예 2에서 사용한 인간의 적혈구 SOD 대신에 소의 적혈구 SOD를 사용하는 것을 제외하고 동일한 방법으로 합성 실시예 2의 반응과 분리과정을 반복한다. 따라서, 2개의 Bu-SMA분자가 각각의 소의 적혈구 SOD분자에 결합된 SOD유도체가 수득된다. 이러한 SOD유도체에 있어서, 또한 상기에서 언급한 시험결과와 동일한 결과가 수득된다. 따라서, 인간의 적혈구 SOD와 소의 적혈구 SOD사이에는 어떠한 상이점도 관찰되지 않는다.
시험 실시예 7
합성 실시예 2에서 수득한 SOD유도체를 래트 혈청과 혼합한 다음, 혼합물을 겔 여과한다(Sophacryl S-200 ; SD래트 혈청 0.2ml ; 시료 0.2mg). 혈청 단백질-결합(주로 알부민결합)형태로 SOD유도체의 용리가 관찰된다. 한편, 출발물질 SOD와 래트 혈청의 혼합물의 겔 여과를 상기와 동일한 방법으로 수행하는데 있어서, SOD는 혈청 단백질과 반응하지 않고 원래의 분자량, 즉 약 33,000에 상응하는 분획으로 용리된다.
또 다른 시험에서, 상기의 SOD유도체는 무알부민혈중 래트 혈청과 혼합하여 혼합물을 상기와 동일한 방법으로 겔 여과한다. SOD유도체의 상당부분이 비-알부민 분획에서 혈청 단백질에 결합한 형태로 용리된다. 따라서, 혈장 알부민 농도가 낮을 경우, SOD유도체는 혈청 단백질의 다른 종과 결합한 형태로 행동한다. 이것은 SOD유도체가 혈청 알부민 농도의 감소가 관찰되는 질병에 대해서 효과적일 수 있음을 나타낸다.
시험 실시예 8
합성 실시예 2에 따라 제조한51Cr-표지된 SOD유도체, 합성 실시예 2에서 사용한 Bu-SMA에 상응하는3H-표지된 Bu-SMA, 및 SOD를 각각 200,000cpm/래트의 투여량으로 체중이 약 200g인 래트에게 정맥투여한 다음, 1시간 후에 여러가지 기관에서의 방사능 수준을 측정한다. 결과는 표4에 기재되어 있다. SOD유도체의 배뇨가 뚜렷하게 저하되고, SOD유도체의 혈장반감기가 연장되며, SOD유도체가 기관에서 고농도로 분포되는 것이 명백하다.
Figure kpo00028
상기의 여러가지 시험 실시예의 결과로 부터 SOD유도체의 효소활성이 SOD의 효소활성에 가까우며, SOD에 비하여 혈장 반감기가 뚜렷하게 연장되는 것이 명백하다. 또한, SOD유도체는 혈청 단백질과 역반응할수 있으므로, 이 성질은 감염기관 또는 부위로의 SOD이전을 달성하는데 매우 유효하다. pH가 염증 및 허혈성 손상 부위에서 낮아지며 양자화된 카복실 그룹 함유 화합물이 이러한 부위에 선택적으로 누적되는 것으로 인정된다.
SOD유도체가 카복실 그룹을 함유하므로, 이러한 카복실 그룹은 생체내에서 양자화되며, 따라서 염증 및 허혈성 손상부위에 효율적으로 누적되는 것으로 예상된다. 따라서, SOD유도체는 궤양 및 점막염증과 연관된 기타 질병과 허혈성 질병용 예방제 및 치료제로서 탁월한 효과를 나타낸다.
본 발명에 따른 SOD유도체의 전형적인 예인, 합성 실시예 2에서 수득한 SOD유도체를 활성 성분으로서 함유하는 투여형의 몇가지 예가 다음에 기재된다.
투여형- 실시예 1
장용 피복캡슐은 하기의 성분을 사용하여 통상적인 방법으로 제조한다 :
합성 실시예 2에서 수득한 SOD유도체 20mg
락토오즈 46mg
옥수수전분 16mg
결정성 셀룰로오즈 12mg
셀룰로오즈 글리콜레이트 5mg
소르비톨 10mg
합계 (캔슐당) 109mg
상기의 캡슐은 일반적으로 하루에 세번 매식후 캡슐 2알의 투여량으로 성인에게 투여한다.
투여형 실시예 2
장용 피복정제는 하기의 성분을 사용하여 통상적인 방법으로 제조한다 :
합성 실시예 2에서 수득한 SOD유도체 20mg
락토오즈 79mg
옥수수전분 45.5mg
마그네슘 스테아레이트 0.5mg
합계 (정제당) 145mg
상기의 정제는 일반적으로 하루에 세번 매식후 정제 2알의 투여량으로 성인에게 투여한다.
투여형 실시예 3
주사액은 하기의 방법으로 제조한다: 합성 실시예 2에서 수득한 SOD유도체 10mg을 생리식염수에 용해시키고, 부피는 5ml로 하여 용액은 살균한 미공성 필터(micropore filter)로 여과한다. 살균한 갈색 유리병(type l.3ml)에 여액을 넣고 밀봉한다.

Claims (7)

  1. 초과산화물 디스무타제를 pH가 7 내지 11인 알칼리성 수용액중에서, 다음 일반식(1),(2),(3) 및 (4)중에서 선택된 그룹인 구성단위(a), 다음 일반식(5)의 그룹인 구성단위(b) 및 다음 구조식(7)의 그룹인 구성단위(c')로 이루어지며 중량 평균 분자량이 800 내지 20,000인 공중합체와 반응시킴을 특징으로하여 일반식(I)의 초과산화물 디스무타재 유도체를 제조하는 방법.
    Figure kpo00029
    상기식에서, [SOD]는 각각 상응하는 아미노 그룹 또는 그룹들 대신에 수소원자 1개를 제거함으로써 아미노 그룹으로부터 유도되는 그룹 1 내지 6개를 갖는 초과산화물 디스무타제 잔기이며, [Z]는 하기 구성단위(a),(b) 및 (c)로 이루어지며 중량 평균 분자량이 800 내지 20,000인 1가 공중합체 잔기이며, (a) 그룹(1),(2),(3) 및 (4)중에서 선택된 그룹.
    Figure kpo00030
    (b) 하기 일반식(5)의 그룹
    Figure kpo00031
    (c) 하기 구조식(6)의 그룹
    Figure kpo00032
    [상기식에서, 카보닐 탄소원자는 [SOD]의 아미노 그룹의 질소원자에 의해 [SOD]에 결합된다.] X는 수소원자 1개를 제거함으로써 아미노 그룹으로부터 각각 유도되는 [SOD]의 그룹의 수에 상응하는 1 내지 6의 정수이며, R1,R3및 R5는 각각 수소원자 또는 메틸 그룹이며, R2는 수소원자, 염소원자, 브롬원자 또는 메틸 그룹이고, R4는 수소원자, 또는 탄소수 1 내지 5의 알킬 그룹이며, R6는 메틸 그룹 또는 에틸 그룹이고, R7은 수소원자, 또는 1 내지 4개의 탄소원자를 함유하는 알카놀, 알킬 그룹이 1 내지 4개의 탄소원자를 함유하는 에틸렌 글리콜 모노 알킬 에테르 또는 이의 히드록실 그룹을 제거하여 생성되는 것으로 알킬그룹이 각각 l 내지 4개의 탄소원자를 함유하는 글리세롤 디알킬에테르의 잔기이다.
  2. 제1항에 있어서, 초과산화물 디스무타제가 인체형 초과산화물 디스무타제 또는 소형 초과산화물 디스무타제인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 초과산화물 디스무타제가 인간의 적혈구 초과산화물 디스무타제 또는 소의 적혈구 초과산화물 디스무타제인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 공중합체가 부분적으로 가수분해된 스티렌-. p-콜로로스티렌-, p-브로모스티렌- 또는 α-메틸스티렌-말레산 무수물 공중합체 ; 부분적으로 반-에스테르화된 스티렌-, p-콜로로스티렌-, p-브로모스티렌- 또는 α-메틸스티렌-말레산 무수물 공중합체 ; 부분적으로 가수분해된 에틸렌-, 프로필렌-,α-부틸렌-, 이소부틸렌-,1-펜텐-,2-메틸-1-부텐-, 1-헥센- 또는 1-헵텐-말레산 무수물 공중합체 ; 부분적으로 반-에스테르화된 에틸렌-, 프로필렌-,α-부틸렌-, 이소부틸렌-,1-펜텐-,2-메틸-1-부텐-,1-헥센- 또는 1-헵텐-말레산 무수물 공중합체 ; 부분적으로 가수분해된 비닐 아세테이트-말레산 무수물 공중합체 ; 부분적으로 반-에스테르화된 비닐 아세테이트-말레산 무수물 공중합체 ; 부분적으로 가수분해된 메틸(메트) 아크릴레이트-말레산 무수물 공중합체 ; 부분적으로 반-에스테르화된 메틸(메트) 아크릴레이트-말레산 무수물 공중합체 ; 부분적으로 가수분해된 에틸(메트) 아크릴레이트-말레산 무수물 공중합체 ; 및 부분적으로 반-에스테르화된 에틸(메트) 아크릴레이트-말레산 무수물 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 공중합체가 초과산화물 디스무타제의 몰당 약 0.5 내지 30몰의 양으로 사용되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, pH 7 내지 11의 알카리성 수용액이 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 아세트산나트륨, 또는 인산나트륨의 수용액인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 반응이 약 3 내지 약 50℃의 온도 범위내에서 수행되는 방법.
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