KR870010191A - 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA)의 신규 유도체 및 이것의 제조방법 - Google Patents

조직형 플라스미노겐 활성제(tPA)의 신규 유도체 및 이것의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음

Description

조직형 플라스미노겐 활성제(tPA)의 신규 유도체 및 이것의 제조방법
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제 1도 a는 생물학적으로 결여된 tPA이서 특징적으로 폴드(fold)된 아미노산사슬 및 NH2말단에서 개시하는 특징적 영역을 나타낸다.
제 1 도 b는 완전한 tPA를 나타낸다.
제 2도는 뮤테인(mutein)의 누클레오타이드 서열 및 tPA의 45~179아미노산이 부재하는 아미노산 서열을 나타낸다.
제 3도는 플라스미드 pePa 137의 제관 분열지점을 나타낸다.

Claims (33)

  1. 천연tPA의 아미노산 서열에 상응하는 것을 가지나 천연 tPA분자의 표피 생장 요소같은 영역 (EGF영역)을 형성하는 아미노산은 적어도 부분적으로 없고 연결부위 고리 Ⅰ 또는 Ⅱ의 최소하나이며, 촉매부위 및 섬유소지가 존재하는, 조직형 플라스미노겐 활성제 (tPA 유도체).
  2. 제 1항에 있어서, 고리 Ⅰ 영역의 제 1이황화결합에 이르는 아미노산 다음의 EGF 영역이 부재하는 tPA유도체.
  3. 제 2항에 있어서, 고리 Ⅱ영역의 제 1이황화결합에 이르는 고리 Ⅰ 영역의 총 아미노산이 부재하는 tPA유도체.
  4. 상기항의 어느 한 항에 있어서, 아미노산 44~72의 하나로 개시하고 아미노산 87~179의 하나로 끝나는 완전한 tPA분자로부터 서열 단면이 부재하는 tPA유도체.
  5. 제 4항에 있어서, 부재 서열단편이 아미노산 113~179의 하나로 끝나는 tPA유도체.
  6. 제 4항에 있어서, 아미노산 45~179가 없는 tPA아미노산 서열을 갖는 tPA유도체.
  7. 제 6항에 있어서, 아미노산 50~175가 없는 tPA 아미노산 서열을 갖는 tPA유도체.
  8. 제 7항에 있어서, 아미노산 50~87이 없는 tPA아미노산 서열을 갖는 tPA유도체.
  9. 완전한 tPA분자와 비교하여 적당한 제한 엔도누클레아제(endonuclease)의 사용으로 유도체로부터 결여된 아미노산 서열을 암호화한 단편이 tPA-cDNA로부터 제거되고, 원하는 tPA유도체를 암호화한 단편이 결합되며, 얻은 tPA유도체 cDNA가 적당한 벡터(vector)를 거쳐 프로카리온트(prokaryont)내로 도입되고 그 속에서 발현되는, 제 1항에 따르는 tPA 유도체의 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서, 제한 엔노누클레아제가 tPA-cDNA서열의 염기쌍 315~726부위만을 절단하는데 사용되는 방법.
  11. 제 9항 또는 제10항에 있어서, 제한 엔도누클레아제로서, Dde Ⅰ 단독으로 또는 Mnl Ⅰ 또는 Dra Ⅲ 및 Mae Ⅲ 또는 Pnu 4H. 또는 Rsa Ⅰ만으로 함께 사용되는 방법.
  12. 제 9항 내지 제11항의 어느 한 항에 있어서, 벡터로서, pBR322, pKK223~3, pACYC177, pRSF1010, 소의유두종 비루스 또는 pKCR이 사용되는 방법.
  13. tPA-DNA가 적당한 벡터내로 도입되고, 얻은 벡터는 tPA-DNA분자로부터 제거될 염기 서열의 양측에 연결된 염기서열의 상보적 염기 서열을 갖는 올리고누클레오타이드로 교잡되며, 교정 뮤타지네시스(mutagenesis)가 실행되고, 이 돌연변이 벡터가 적당한 세포내로 도입되고 확대되며 올리고누클레오타이드로 교잡된 확대된 벡터는 회복되어 적당한 프로카티온트내로 도입되고 발현되는 제 1항에 따르는tPA유도체의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 올리고누클레오타이드가 18~26누클레오타이드로 사용되는 방법.
  15. tPA-mRNA이 tPA를 생성하는 세포로부터 분리되고, 크기에 따라 분류되며, 원하는 tPA유도체에 상응하는 크기와 단편이 cDHA내로 전사되고 클론(clone)되며, tPA-cDNA와 비교하여 tPA유도체를 암호화한 cDNA로부터 부재하는 tPA-암호화 cDNA부위와 교잡하는 올리고누클레오타이드와 더이상 교잡하지 않는 클론이 선택되고 tPA유도체 DNA가 이것으로부터 회복되며 적당한 벡터를 거쳐 프로카리온 트 세포내로 도입되고 발현되는, 제 1항에 따르는 tPA유도체의 제조 방법.
  16. tPA가 프로테아제로 아미노산 44 및 72 사이, 87 및 179 사이에서 절단되고 형성된 말단부분이 다시 연결되는, 제 1항에 따르는 tPA유도체의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 섬유소지 및 고리영역 Ⅰ 사이의 거리를 최적으로 하는 방법.
  18. 제 9항 내지 제17항의 어느 한 항에 있어서, 확대 및/또는 발현이 lac Ⅰq플라스미드를 포함하는 대장군 균주에서 실행되는 방법.
  19. 제 9항 내지 제17항의 어느 한 항에 있어서 발현이 쥐 LTK 세포에서 실행되는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 대장균 DSM 3698이 사용되는 방법
  21. 제20항에 있어서, 플라스미드 pePa 137을 포함하는 대장균 DSM 3698이 배양되는 방법.
  22. 제 9항 내지 제17항의 어느 한 항에 있어서, 확대 및 또는 발현이 슈도모나스 푸티다(Pseudomonag.putida) DSM 2106에서 실행되는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 플라스미드 pePa 143 및 임의의 pePa 119를 포함하는 슈도모나스 푸티다 DSM 2106이 배양되는 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 제 9항 내지 제23항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 tPA유도체.
  25. 플라스미드 pePa 137
  26. 플라스미드 pePa 143
  27. 플라스미드 pePa 144
  28. 플라스미드 pREM 7685
  29. 플라스미드 pREM 7732
  30. 천연 tPA의 아미노산 서열에 상응하는 것을 갖으나 천연 tPA의 표찌 생장 요소같은 영역 (EGF 영역)을 형성하는 아미노산 및 적어도 고러 Ⅰ 영역의 제 1 이황화결합에 이르는 아미노산 서열이 부재하는 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA)를 포함하고 응괴를 용해하는 시약.
  31. 제30항에 있어서, 아미노산 45~170이 없는 tPA의 아미노산 서열을 갖는 tPA 유도체를 포함하는 시약.
  32. 제30항에 있어서, 아미노산 50~175가 없는 tPA의 아미노산 서열을 갖는 tPA유도체를 포함하는 시약.
  33. 제30항에 있어서, 아미노산 50~87가 없는 tPA의 아미노산 서열을 갖는 tPA 유도체를 포함하는 시약.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
KR870003827A 1986-04-21 1987-04-21 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA)의 신규 유도체 및 이것의 제조방법 KR870010191A (ko)

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