KR20240078928A - 침샘 오가노이드 안정화 및 침샘조직 재생 유도 조성물 - Google Patents

침샘 오가노이드 안정화 및 침샘조직 재생 유도 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 침샘 오가노이드 안정화 및 침샘조직 재생 유도 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 신규 화합물은, 침샘 오가노이드에서, 침샘 특이 마커인 α-SMA, Cytokeratin-14, E-cadherin 및 Aquaporin-5의 발현을 증가시켜, 침샘 오가노이드를 증식시키고 안정화 시키는 것을 확인하였다. 또한, 쇼그렌 증후군 동물모델에, 본 발명의 신규 화합물을 처리하면, 쇼그렌 증후군 동물모델로부터 분리된 침샘 조직에서도, 오가노이드 마커의 발현을 증가시켜, 침샘 조직의 재생을 유도하는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 신규한 화합물은, 침샘 오가노이드를 이용한 쇼그렌 증후군의 치료 방법 및 치료제 스크리닝 분야에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

침샘 오가노이드 안정화 및 침샘조직 재생 유도 조성물{Composition for stabilizing salivary gland organoids and inducing regeneration of salivary gland tissue}
본 발명은 침샘 오가노이드 안정화 및 침샘조직 재생 유도 조성물에 관한 것이다.
쇼그렌 증후군은 눈물샘(lacrimal gland)과 침샘(salivary gland)에 영향을 미치는 다양성 만성 염증(system chronic inflammatory) 질병이다. 쇼그렌 증후군은 미국에 4,000,000명의 환자를 포함하여 전세계 인구의 1-3%에 달하는 가장 널리 분포하는 자가면역질환이다. 쇼그렌 증후군을 가지고 있는 환자의 90% 이상이 여성이며, 이 질병은 다양한 다른 자가 면역현상과 동반되어 나타날 수도 있다. 쇼그렌 증후군의 생리학적인 원인에 대해서는 정확히 이해되지 않고 있지만 두 개의 구별되는 현상이 일어나는 것으로 보고 있다. 자가 반응성 림프세포의 활성이 유도되는 시작단계와 눈물샘과 침샘에 병원성의 림프세포가 침투하여 누적하게 됨으로써 각각 눈물의 양과 침의 양을 감소시키는 효과가 나타나는 두 가지 구별되는 시기가 있다.
즉, 증상의 진행단계에 따라 1차성 쇼그렌 증후군과 2차성 쇼그렌 증후군으로 구별되는데, 1차성 쇼그렌 증후군은 주로 안구, 구강, 피부 건조증이 나타나며, 눈의 건조감의 느낌이 있고 이물질이 들어있는 듯한 느낌이 들며 더 진행되면 눈이 따갑고 눈물이 나오지 않으며 충혈되거나 피로감이 있다. 그러나, 이러한 상태를 그대로 두면 각막과 결막 손상으로 이어지며 입은 침 분비 부족으로 치석이 많이 생기고 충치와 치주염도 자주 발생하게 된다. 또한, 피부의 땀샘과 피지선의 분비도 감소하여 피부가 마르는 것도 특징 중 하나이다.
2차성 쇼그렌 증후군은 류마티스 관절염, 루푸스, 전신성 경화증, 피부근염이 동반되기도 하는데, 병이 진행되면서 호흡기, 위장, 취장 등 소화기 내분비계 손상과 신장, 심장 등의 신경계에 손상이 온다. 또한 쇼그렌 증후군 환자의 약 5% 정도에서는 림프종이 발생하는 것으로 알려져 있고, 쇼그렌 증후군 환자는 일반인에 비해 약 2.7배정도 사망률이 높은 것으로 알려져 있다.
쇼그렌증후군을 연구하기 위한 여러 동물 모델이 존재하는데, 동물 모델의 문제점은 사람의 쇼그렌증후군과 병인을 공유하는 모델인가 하는 점이다. 또한 제대로 쇼그렌증후군 환자의 상태를 반영하는가 하는 점이다. 동물실험의 비용뿐 아니라 동물 사육 시설의 제한으로 이러한 모델을 널리 이용하기는 어려운 상태이다. 이에, 쇼그렌증후군 환자의 상태를 제대로 반영하는 모델은 전무한 실정이다.
한편, 오가노이드는 줄기세포나 장기세포에서 분리한 세포를 배양하거나 재조합하여 만든 미니장기로서, 각 해당 기관과 매우 유사한 구조와 기능을 가지는 것을 기반으로 하여 실제 조직과 최대한 가깝게 분화가 가능하다는 특징이 있다.
최근 재생의학이나 세포 치료제로써 오가노이드의 연구가 활발하게 진행되고 있다. 실질적인 약물 대사반응 등의 시도는 동물실험에서 주로 이루어지고 있으나, 인간과 동물의 유전자 구조가 100% 같지 않기 때문에 동물에게 아무런 반응이 없는 물질도 인간에게 치명적일 수 있으며, 동물의 권리 침해에 대한 문제가 있다. 또한, 2차원으로 배양된 세포는 불멸화(immortalized)된 세포로서 약물 대사 정도에 있어 실제 장기와 차이가 있는바 정확한 실험이 어렵다는 문제가 있다. 또한, 약물대사를 평가하는 데 있어 가장 우수한 방법은 사람의 장기세포를 직접 이용하는 것이나 조직을 구하는데 한계가 있으며 체외 증식이 어려워 많은 양을 얻는데 어려움이 있다.
이에 본 발명은, 침샘 오가노이드에, 신규 화합물을 처리하면, 침샘 오가노이드의 안정화 및 재생을 유도하는 것을 확인하여, 쇼그렌 증후군 모델에 이용가능한 오가노이드의 경제적인 제작 방법에 이용할 수 있는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 침샘 오가노이드(salivary glands organoid)의 배양용 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
본 발명의 다른 목적은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome)의, 침샘(salivary glands) 조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 마우스 유래의 침샘 조직을 배양하여, 침샘 오가노이드(salivary glands organoid)를 제작하는 단계; 및
상기 침샘 오가노이드에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 처리하는 단계;를 포함하는, 침샘 오가노이드의 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 쇼그렌 증후군 동물모델에, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계;
상기 화합물이 투여된 동물모델에서, 침샘 조직을 수득하는 단계; 및
상기 침샘 조직을 배양하여 침샘 오가노이드(salivary glands organoid)를 제작하는 단계;를 포함하는 침샘 조직의 재생 유도 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 침샘 오가노이드(salivary glands organoid)의 배양용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
또한, 본 발명은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome)의, 침샘(salivary glands) 조직 재생용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 마우스 유래의 침샘 조직을 배양하여, 침샘 오가노이드(salivary glands organoid)를 제작하는 단계; 및
상기 침샘 오가노이드에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 처리하는 단계;를 포함하는, 침샘 오가노이드의 배양 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 쇼그렌 증후군 동물모델에, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계;
상기 화합물이 투여된 동물모델에서, 침샘 조직을 수득하는 단계; 및
상기 침샘 조직을 배양하여 침샘 오가노이드(salivary glands organoid)를 제작하는 단계;를 포함하는 침샘 조직의 재생 유도 방법을 제공한다.
본 발명의 신규 화합물은, 침샘 오가노이드에서, 침샘 특이 마커인 α-SMA, Cytokeratin-14, E-cadherin 및 Aquaporin-5의 발현을 증가시켜, 침샘 오가노이드를 증식시키고 안정화 시키는 것을 확인하였다. 또한, 쇼그렌 증후군 동물모델에, 본 발명의 신규 화합물을 처리하면, 쇼그렌 증후군 동물모델로부터 분리된 침샘 조직에서도, 오가노이드 마커의 발현을 증가시켜, 침샘 조직의 재생을 유도하는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 신규한 화합물은, 침샘 오가노이드를 이용한 쇼그렌 증후군의 치료 방법 및 치료제 스크리닝 분야에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 신규 화합물의 처리에 따른, 침샘 오가노이드 증식 촉진효과를 확인한 것이다.
도 2는 본 발명의 신규 화합물의 처리에 따른, 침샘 오가노이드의 마커인 α-SMA 및 Cytokeratin-14의 발현을 공초점 현미경으로 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 신규 화합물의 처리에 따른, 침샘 오가노이드의 마커인 E-cadherin 및 Aquaporin-5의 발현을 공초점 현미경으로 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 신규 화합물의 침샘 재생 유도를 확인하기위한, 쇼그렌 증후군 동물모델의 실험 과정을 도식화한 것이다.
도 5는 본 발명의 신규 화합물의 처리에 따른, 쇼그렌 증후군 동물모델 유래의 침샘 조직 증식 촉진을 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 신규 화합물의 처리에 따른, 쇼그렌 증후군 동물모델 유래 침샘 조직에서 오가노이드 마커 E-cadherin 및 Aquaporin-5의 발현을 공초점 현미경으로 확인한 도이다(A: 공초점 현미경 결과, B: E-cadherin 발현 정량화, C: Aquaporin-5 발현 정량화).
도 7은 본 발명의 신규 화합물의 처리에 따른, 쇼그렌 증후군 동물모델 유래 침샘 조직에서 오가노이드 마커 α-SMA 및 Cytokeratin-14의 발현을 공초점 현미경으로 확인한 도이다(A: 공초점 현미경 결과, B: α-SMA 발현 정량화, C: Cytokeratin-14 발현 정량화).
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.
따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 침샘 오가노이드(salivary glands organoid)의 배양용 조성물을 제공한다.
상기 용어 "약제학적으로 허용가능한 염" 은, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 및 이와 유사한 것 없이 인간 및 하급 동물의 조직과 접촉에 사용되는 것이며 합리적인 장점/단점 비에 비례하는 이들 염을 의미한다. 예를 들어, S. M. Berge et al.는, J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19에 상세하게 약제학적으로 허용가능한 염을 설명하고 있으며, 참조로서 여기 통합되어 있다. 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염은, 적당한 무기 및 유기산 및 염기로부터 유도된 것들을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한, 무독성 산부가염의 예들은, 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산과 같은 유기산으로 형성되거나, 또는 이온 교환과 같은 당해 기술분야에서 사용된 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노기의 염이다. 다른 약제학적으로 허용가능한 염은, 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠술포네이트, 벤조에이트, 비설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 시트레이트, 시클로 펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄술포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히드로요오다이드, 2-히드록시-에탄술포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올리에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔술포네이트, 운데카노에이트, 발레르에이트 염, 및 이와 유사한 것을 포함한다.
적당한 염기로부터 유도된 염은, 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄 및 N+(C1-4알킬)4 염을 포함한다. 대표적 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 소듐, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘, 및 이와 유사한 것을 포함한다. 게다가 약제학적으로 허용가능한 염은, 적당할 때, 무독성 암모늄, 4기 암모늄, 및 할라이드, 히드록시드, 카복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급알킬 술포네이트 및 아릴 술포네이트와 같은 상대이온을 사용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다.
본 발명에서 용어 "오가노이드(organoid)"란 조직에서나 혹은 배아줄기세포에서 유래된 세포를 이용하여 이를 3D 형태로 배양을 하여 마치 인공장기와 같은 형태로 만들 수 있는 것을 의미한다. 오가노이드는 장기의 'organ'과 같은 의미를 가진 접미어로 '장기와 유사한 것'이라는 말을 지니고 있다. 오가노이드는 3차원 배양방법을 통하여 세포와 세포의 기능이 좀 더 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 기능을 지닌다. 오가노이드는 줄기세포연구와 3D 세포배양 등이 개발되고, 다양한 조직으로 분화시킬 수 있는 생장 및 분화 인자의 최적화 연구와 함께 주목을 받고 있다.
본 발명에서 용어 “배양(culture)”이란, 생물체나 생물체의 일부(기관, 조직, 세포 등)를 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 뜻한다. 배양시 외적 조건으로 온도, 습도, 빛, 기체상의 조성(이산화탄소나 산소의 분압)등이 중요하며, 그 밖에 배양되는 생물체에 가장 중요한 영향을 주는 것이 배지이다. 배지는 배양기라고도 하며, 배양 대상의 직접적인 환경인 동시에 생존이나 증식에 필요한 각종 영양소를 제공한다.
또한, 본 발명에서 용어, “배지(culture media)"는 인 비트로에서 세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양조건을 선택할 수 있다. 세포의 배양에 사용되는 기본배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 기본 배지에는 예를들어, DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, (Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않으며, 본 발명에서는 오가노이드의 증식을 위하여, EGF를 포함한 각질 세포-혈청 무 함유 배지(Keratinocyte-Serum Free Media with EGF), 소 뇌하수체 추출물(bovine pituitary extract) 및 염화칼슘(Calcium chloride)이 포함된 오가노이드 분화배지에, 본 발명의 신규 화합물을 추가로 첨가한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은, 침샘 오가노이드의 증식을 촉진시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은, 오가노이드 마커의 발현을 증가시키는 것일 수 있으며, 상기 오가노이드 마커는 α-SMA, Cytokeratin-14, E-cadherin 및 Aquaporin-5로 이루어진 군에서 선택된 마커인 것일 수 있다.
본 발명의, “아쿠아포린(aquaporin)”은 물 통로 단백질로서 각막, 신장, 간, 피부 등에서 발견된다. 아쿠아포린(aquaporin)은 AQP0~12까지 아과(subfamily)가 다양하게 존재하는데, AQP5는 타액 분비에 주요 바이오마커(biomarker)이다. 특히, AQP5 넉아웃 마이스(AQP5 knockout mice)에서 타액 분비량이 60 % 이상 감소했다는 연구결과가 발표된 바 있다(The Journal of Biological Chemistry, 274: 20071-20074, 1999). 이에 본 발명의 오가노이드 증식 및 안정화를 확인하기 위하여, 상기의 AQP5를 이용하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 침샘 오가노이드는, 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome) 동물모델 유래인 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 침샘 오가노이드의 제조를 위해 사용할 수 있는 동물모델은, 실험용 마우스인 것이 바람직하며, 실험용 마우스의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 계통별 분류상 폐쇄군(Closed Colony)에 속하는 ICR 또는 DDY; 근교계(Inbred)에 속하는 BALB/cA, C57BL/6N, C3H/HeN, DBA/2N 또는 CBA/N; 교잡군(hybrid)에 속하는 BDF1(C57BL/6 x DBA/2), CDF1(CBA/N x DBA/2) 또는 B6C3F1(C57BL/6 x C3H/HeN); 돌연변이계(Mutant)에 속하는 BALB/c-nu 또는 C,B-17SCID 등 실험용 마우스로 사용되고 있는 것이라면 모두 이용할 수 있다. 바람직하게는 쇼그렌 증후군 자연발생 마우스인 NOD/ShiLtJ 마우스를 사용 할 수 있다.
본 발명의 쇼그렌 증후군은 타액분비이상 질환의 일종이며, 본 명세서에서, '타액분비이상(disorder of salivation)'이란 타액의 분비가 정상보다 적거나 지나치게 많은 증상을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 타액분비가 정상보다 적은 것을 의미하는 것이 바람직하다. 이러한 맥락에서, '타액분비이상증' 이란 타액분비이상 증상이 질환 수준을 나타내는 질병을 의미한다.
본 발명에서 용어, "타액선(침샘, salivary gland)"은 타액을 생성, 분비하는 기관으로 이하선(귀밑샘, parotid gland), 악하선(턱밑샘, submaxillary gland), 설하선(혀밑샘, sublingual gland)과 같은 주타액선(major salivary gland)과, 점액선(mucous gland)과 같이 구강점막(mucous membrane of oral cavity)에 존재하는 점액선(mucous gland)과 같이 구강점막의 여러 부위에 분포하는 소타액선(minor salivary gland)으로 분류된다.
본 발명의, '타액(saliva)'이란 침이라고도 하며, 입속의 침샘(타액선)에서 분비되는 무색의 점성의 소화액을 의미한다. 일반적인 경우, 정상인에서 24시간 동안 분비되는 침의 양은 약 1000 ~ 1500㎖이다. 보통, 자율신경에 의해 자극받지 않았을 경우 1 분당 0.001~0.2㎖를 생성하며, 자극을 받으면 분당 0.18~1.7㎖로 유출량이 증가하는데, 분당 평균 분비량이 1㎖ 정도이다. 약 99%가 수분이며, 다양한 무기물을 포함하고 있다.
또한, 본 발명의 침샘 오가노이드를 이용한, 치료, 약물 스크리닝, 면역 반응성 등의 약학적 또는 기능적인 평가에 적용 가능한 질환으로는 쇼그렌 증후군, 만성염증성질환, 방사선 치료 또는 이에 의한 타액선 장해, 중증설사, 전신성 수분감소, 당뇨병, 영양소 결핍, 노화, 신경계 질환, 항암제 투여의 부작용 및 항당뇨, 항우울 또는 항알레르기성 약물의 부작용으로 이루어진 군에서 선택된 질환인 것 일 수 있으며, 바람직하게는 쇼그렌 증후군이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome)의, 침샘(salivary glands) 조직 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은, 쇼그렌 증후군 마우스 유래 침샘 조직의, 증식을 촉진시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은, 쇼그렌 증후군 마우스 유래 침샘 조직의, 오가노이드 마커 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은, 마우스 유래의 침샘 조직을 배양하여, 침샘 오가노이드(salivary glands organoid)를 제작하는 단계; 및
상기 침샘 오가노이드에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 처리하는 단계;를 포함하는, 침샘 오가노이드의 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 방법은, 오가노이드의 증식을 촉진시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 방법은, 오가노이드 마커의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은, 쇼그렌 증후군 동물모델에, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계;
상기 화합물이 투여된 동물모델에서, 침샘 조직을 수득하는 단계; 및
상기 침샘 조직을 배양하여 침샘 오가노이드(salivary glands organoid)를 제작하는 단계;를 포함하는 침샘 조직의 재생 유도 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 침샘 조직의 재생 유도는, 침샘 오가노이드의 증식을 촉진시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 침샘 조직의 재생 유도는, 오가노이드 마커의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 신규 화합물의 침샘 오가노이드 증식 확인
본 발명의 신규 화합물(HGR4113, 화학식 1)이 침샘 오가노이드의 증식을 촉진하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 오가노이드 배양 배지는 EGF를 포함한 각질 세포-혈청 무 함유 배지(Keratinocyte-Serum Free Media with EGF), 소 뇌하수체 추출물(bovine pituitary extract)(Gibco#37010-022), 0.09 mM 염화칼슘(Calcium chloride)(Amresco#E506-1)를 이용하였다. 오가노이드 배양 방법은, 24주령의 NOD/shilti 마우스의 침샘 조직에서 세포를 분리하여, 적당량의 마트리겔 (matrigel)에 섞어 20-50 μl 정도를 24 well plate에 droplet 형태로 올려주었다. 15분 동안 incubator에 배양 후 고체가 되면 분화배지를 1ml 넣어 배양하였다. 그 후 배양 4일에, HGR4113을 5 μM 처리하였으며, 3일 마다 배지를 교환하여, HGR4113으로 재자극하여, 오가노이드를 제작하였다(HGR4113 군). 대조군으로는 동량의 PBS를 처리한 Vehicle 군을 이용하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, Vehicle 군과 비교하여, HGR4113 군에서는, 오가노이드의 형태가 유의적으로 증가한 것을 확인하여, 신규 화합물이 침샘 오가노이드의 증식을 촉진시키는 것을 확인하였다.
<실시예 2> 침샘 오가노이드에서 오가노이드 마커 발현 확인
본 발명의 신규 화합물 HGR4113이 침샘 오가노이드에서, 오가노이드를 안정화시키는지 확인하기 위하여, 오가노이드 마커의 발현을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1의 배양된 오가노이드를, 배양 11일 후 icy cold(cryo)한 후 공초점현미경을 이용하여, 오가노이드 마커인 α-SMA 및 Cytokeratin-14 (CK-14)의 발현을 확인하였다. 또한, 동일한 방법으로, E-cadherin과 Aquaporin-5 (AQP5)의 발현을 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, Vehicle군과 비교하여, HGR4113 군에서는, 침샘 오가노이드에서, 오가노이드 마커인 α-SMA 및 Cytokeratin-14의 형광 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인하였으며, 도 3에 나타낸 바와 같이, E-cadherin과 Aquaporin-5의 발현 또한 증가한 것을 확인하여, 신규 화합물인 HGR4113가 침샘 오가노이드를 안정화시키는 것을 확인하였다.
<실시예 3> 신규 화합물의 쇼그렌 증후군 동물모델 유래의 침샘 조직 재생 확인
본 발명의 신규 화합물 HGR4113이 쇼그렌 증후군 동물모델에서 침샘 조직의 재생을 유도하는지 확인하였다. 구체적으로, 쇼그렌 증후군자연발생 동물모델인 NOD/shilti(Non-obese diabetic) 마우스에 매일 50 mg/kg의 농도로 HGR4113을 경구 투여하였다(도 4). 대조군으로는, 동량의 PBS를 경구 투여한 Vehicle 군을 이용하였다. 그 후 20주차에 마우스를 인도적으로 희생하고, 마우스로부터 침샘조직을 수득하였다. 수득된 침샘 조직은, 상기 실시예 1과 동일한 마트리겔(Matrigel matrix)에 섞은 뒤, 분화 배지를 첨가하여 배양하였다. 배양 14일 후 배양된 침샘 조직을 확인하여, 침샘 조직의 재생 및 오가노이드 증식을 확인하였다. 각 군의 구성은 하기 표 1에 나타내었다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, Vehicle 군과 비교하여, HGR4113 군에서는, 오가노이드 형성이 증가한 것을 확인하여, 신규 화합물 HGR4113이 쇼그렌 증후군에서, 침샘 조직의 재생을 촉진시키는 것을 확인하였다.
<실시예 4> 신규 화합물의 쇼그렌 증후군 동물모델 유래 오가노이드의 마커 발현 확인.
본 발명의 신규 화합물 HGR4113이 쇼그렌 증후군에서, 침샘 조직의 재생유도를 확인하기 위하여, 상기 실시예 3에서 유래된 오가노이드에서, 오가노이드 마커의 발현을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로, 오가노이드를 공초점 현미경으로 관찰하여, 오가노이드 마커인 α-SMA 및 Cytokeratin-14의 발현과, E-cadherin과 Aquaporin-5의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, Vehicle군과 비교하여 HGR4113 군에서는, 오가노이드 마커인 E-cadherin과 Aquaporin-5의 형광 발현이 유의적으로 증가하였으며, α-SMA 및 Cytokeratin-14의 형광 발현 또한 유의적으로 증가한 것을 확인하여(도 7), 본 발명의 HGR4113이 쇼그렌 증후군에서 침샘 조직의 재생을 촉진시키는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 신규 화합물은, 침샘 오가노이드에서, 침샘 특이 마커인 α-SMA, Cytokeratin-14, E-cadherin 및 Aquaporin-5의 발현을 증가시켜, 침샘 오가노이드를 증식시키고 안정화 시키는 것을 확인하였다. 또한, 쇼그렌 증후군 동물모델에, 본 발명의 신규 화합물을 처리하면, 쇼그렌 증후군 동물모델로부터 분리된 침샘 조직에서도, 오가노이드 마커의 발현을 증가시켜, 침샘 조직의 재생을 유도하는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 신규한 화합물은, 침샘 오가노이드를 이용한 쇼그렌 증후군의 치료 방법 및 치료제 스크리닝 분야에 유용하게 이용할 수 있다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 침샘 오가노이드(salivary glands organoid)의 배양용 조성물
    [화학식 1]
    .
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은, 침샘 오가노이드의 증식을 촉진시키는 것인, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은, 오가노이드 마커의 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 오가노이드 마커는 α-SMA, Cytokeratin-14, E-cadherin 및 Aquaporin-5로 이루어진 군에서 선택된 마커인 것인, 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 침샘 오가노이드는, 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome) 동물모델 유래인 것인, 조성물.
  6. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome)의, 침샘(salivary glands) 조직 재생용 조성물
    [화학식 1]
    .
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 조성물은, 쇼그렌 증후군 마우스 유래 침샘 조직의, 증식을 촉진시키는 것인, 조성물.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 조성물은, 쇼그렌 증후군 마우스 유래 침샘 조직의, 오가노이드 마커 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 오가노이드 마커는 α-SMA, Cytokeratin-14, E-cadherin 및 Aquaporin-5로 이루어진 군에서 선택된 마커인 것인, 조성물.
  10. 마우스 유래의 침샘 조직을 배양하여, 침샘 오가노이드(salivary glands organoid)를 제작하는 단계; 및
    상기 침샘 오가노이드에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 처리하는 단계;를 포함하는, 침샘 오가노이드의 배양 방법
    [화학식 1]
    .
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 방법은, 오가노이드의 증식을 촉진시키는 것인, 방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 방법은, 오가노이드 마커의 발현을 증가시키는 것인, 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 오가노이드 마커는 α-SMA, Cytokeratin-14, E-cadherin 및 Aquaporin-5로 이루어진 군에서 선택된 마커인 것인, 방법.
  14. 쇼그렌 증후군 동물모델에, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계;
    상기 화합물이 투여된 동물모델에서, 침샘 조직을 수득하는 단계; 및
    상기 침샘 조직을 배양하여 침샘 오가노이드(salivary glands organoid)를 제작하는 단계;를 포함하는 침샘 조직의 재생 유도 방법
    [화학식 1]
    .
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 침샘 조직의 재생 유도는, 침샘 오가노이드의 증식을 촉진시키는 것인, 방법.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 침샘 조직의 재생 유도는, 오가노이드 마커의 발현을 증가시키는 것인, 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 오가노이드 마커는 α-SMA, Cytokeratin-14, E-cadherin 및 Aquaporin-5로 이루어진 군에서 선택된 마커인 것인, 방법.
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