KR20240066518A - Ace 억제 활성을 갖는 신규한 락티플란티바실러스 플란타럼 k79 균주, 이를 이용한 우유 발효물의 제조방법, 이에 따른 우유 발효물 및 이를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 식품 조성물 - Google Patents
Ace 억제 활성을 갖는 신규한 락티플란티바실러스 플란타럼 k79 균주, 이를 이용한 우유 발효물의 제조방법, 이에 따른 우유 발효물 및 이를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 식품 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
ACE 억제 활성을 갖는 신규한 락티플란티바실러스 플란타럼 K79 균주, 이를 이용한 우유 발효물의 제조방법, 이에 따른 우유 발효물 및 이를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) K79 균주(수탁번호 KACC 81222BP) 균주는 ACE 억제 활성이 뛰어나고, 베타-갈락토시다제 활성이 우수하여 우유 발효 속도가 빠르므로 발효유를 제조하는데 적합하다.
또한, 상기 균주를 이용한 우유 발효물은 ACE 억제 활성이 매우 높아 항고혈압용 식품 또는 식품 소재로 매우 유용하다.
본 발명의 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) K79 균주(수탁번호 KACC 81222BP) 균주는 ACE 억제 활성이 뛰어나고, 베타-갈락토시다제 활성이 우수하여 우유 발효 속도가 빠르므로 발효유를 제조하는데 적합하다.
또한, 상기 균주를 이용한 우유 발효물은 ACE 억제 활성이 매우 높아 항고혈압용 식품 또는 식품 소재로 매우 유용하다.
Description
본 발명은 ACE 억제 활성을 갖는 신규한 락티플란티바실러스 플란타럼 K79 균주, 이를 이용한 우유 발효물의 제조방법, 이에 따른 우유 발효물 및 이를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
고혈압은 전 세계적으로 성인의 15~20%가 겪고 있는 만성 순환기계 질환 중 발생빈도가 가장 높은 질환으로 비교적 증상이 없는 편이지만, 높은 혈압으로 인해 정상적인 기능을 유지하던 기관들이 서서히 그 기능을 상실하여 뇌졸중, 심부전, 관상동맥질환 등 치명적인 합병증을 유발할 수 있기 때문에 보다 적극적이고 꾸준한 환자 관리와 치료가 요구되는 질환이다. 세계건강보건기구 (WHO)에서는 최고 혈압이 160 mmHg 이상이고 최저 혈압이 95 mmHg 이상인 경우를 고혈압으로 규정하고 있으며, 고혈압 질환의 종류로는 크게 원인이 불분명한 본태성 고혈압과 원인 질병에 의한 속발성 고혈압으로 구분되는데 이 중 90% 이상이 본태성 고혈압에 속하는 것으로 알려져 있으며, 전 세계적으로 약 6억명 이상의 사람들이 고혈압을 앓고 있으며, 이 고혈압 때문에 매년 3백만 명이 사망하고 있어 전 세계적인 과제로 떠오르고 있다.
생체 중에 존재하고 있는 불활성화 안지오텐신 I (Angiotensin I)은 안지오텐신 I 전환 효소 (Angiotensin I converting Enzyme, ACE)에 의하여 C-말단 His-Leu가 떨어져 나감으로써 혈관벽 수축 작용을 가지는 안지오텐신 II (Angiotensin II)로 전환되어 혈관을 수축하고, 신장에서 알도스테론의 분비를 증가시켜 체액량을 증가시킴으로써 혈압을 상승시키는 작용을 한다. 따라서 ACE의 활성을 억제시킴으로써 혈압상승의 원인이 되는 안지오텐신 II 생성 저하를 통해 혈압을 억제할 수 있다.
고혈압을 개선하기 위한 목적으로 에넬라프릴(enelapril)이나 라미프릴(Ramipril) 등의 ACE 저해제가 개발되어 상용되고 있으나 이러한 약제의 사용으로 인한 부작용으로 미각이상, 백혈구 감소, 혈관부종, 간기능 이상 등이 발견되었다.
따라서 천연물질로부터 항고혈압 효과를 가지는 연구에 대한 요구가 계속되었으며, 대두 단백질 가수분해물, 키토산, 밀크 카제인 등에서 분리된 ACE 저해제는 식품의약품안전처에 개별인정 기능성 식품으로 인정받았다.
종래 화학 합성 방법 등을 통하여 제조되었던 고혈압 제제들이 부작용 등의 문제가 발생됨에 따라, 최근 세계 각국에서는 천연 물질로부터 항고혈압 효과를 갖는 물질을 얻기 위한 노력이 지속되고 있다. 또한, 각국에서는 의약품은 물론이고, 효소와 건강보조제와 같은 식품 소재 등 다양한 용도에 활용될 수 있는 새로운 물질을 탐색하기 위하여 대량 배양이 용이한 균주에 대한 연구도 활발하게 진행하고 있다.
이에, 본 발명자들은 ACE 억제 활성 및 우유 발효 속도가 우수한 유산균에 대하여 연구한 결과, 김치로부터 분리한 균주가 항생제 내성, 내담즙성, 항균 활성 및 장부착능 뿐만 아니라 우수한 우유 발효물 형성 능력을 가지면서, 상기 균주를 이용한 우유 발효물이 높은 ACE 억제 활성을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 안지오텐신 전환 효소(Angiotensin converting enzyme, ACE) 억제 활성 및 우유 발효 활성을 갖는 락티플란티바실러스 플란타럼 K79 균주를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 ACE 억제 활성이 있는 우유 발효물의 제조방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 우유 발효물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 우유 발효물을 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 안지오텐신 전환 효소(Angiotensin converting enzyme, ACE) 억제 활성 및 우유 발효 활성을 갖는 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) K79 균주(수탁번호 KACC 81222BP)에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 젠타마이신(Gentamycin), 카나마이신(Kanamycin), 암피실린(Ampicillin), 테트라사이클린(Tetracycline), 클린다마이신(clindamycin), 에리트로마이신(Erythromycin) 및 클로람페니콜(Chloramphenicol) 중에서 선택된 1종 이상의 항생제 내성; 담즙 내성; pH 내성; 대장균, 살모넬라 타이피머리움(Salmonella Typhimurium), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 및 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성; 및 장 부착능;을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 유해 효소인 β-Glucuronidase를 생성하지 않으며, 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 활성이 우수한 것일 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명은 탈지유에 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) K79 균주(수탁번호 KACC 81222BP)를 접종한 후 발효시키는 단계;를 포함하는 ACE 억제 활성이 있는 우유 발효물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 탈지유는 10 내지 15 중량% 농도일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 상기 탈지유에 0.01 내지 0.07 중량%로 접종하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 발효는 30 내지 46 ℃에서 10 내지 25시간 동안 발효시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 우유 발효물은 pH 4.0 내지 5.0이고, 80 내지 90%의 ACE 억제 활성을 나타내는 것일 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 우유 발효물에 관한 것이다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명은 상기 우유 발효물을 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantafum) K79 균주(수탁번호 KACC 81222BP) 균주는 ACE 억제 활성이 뛰어나고, 베타-갈락토시다제 활성이 우수하여 우유 발효 속도가 빠르므로 발효유를 제조하는데 적합하다.
또한, 상기 균주를 이용한 우유 발효물은 ACE 억제 활성이 매우 높아 항고혈압용 식품 또는 식품 소재로 매우 유용하다.
도 1은 균주별 ACE 억제 활성(IC50)을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 락티플란티바실러스 플란타럼 K79 균주의 계통도이다.
도 3은 본 발명의 K79 균주의 내담즙성을 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명의 K79 균주의 pH 내성을 나타내는 도이다.
도 5는 본 발명의 K79 균주의 장부착능을 나타내는 도이다.
도 6은 본 발명의 K79 균주의 최적배양조건 확립을 위한 반응표면분석법(RSM)에서, 독립변수(X1, X2, X3, X4)가 종속변수(Y1, Y2)에 미치는 영향을 3차원 그래프로 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 K79 균주를 이용한 우유 발효물의 제조 과정에서, 발효 종료 후 각각의 공정 단계가 우유 발효물의 ACE 억제 활성에 미치는 영향을 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명의 락티플란티바실러스 플란타럼 K79 균주의 계통도이다.
도 3은 본 발명의 K79 균주의 내담즙성을 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명의 K79 균주의 pH 내성을 나타내는 도이다.
도 5는 본 발명의 K79 균주의 장부착능을 나타내는 도이다.
도 6은 본 발명의 K79 균주의 최적배양조건 확립을 위한 반응표면분석법(RSM)에서, 독립변수(X1, X2, X3, X4)가 종속변수(Y1, Y2)에 미치는 영향을 3차원 그래프로 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 K79 균주를 이용한 우유 발효물의 제조 과정에서, 발효 종료 후 각각의 공정 단계가 우유 발효물의 ACE 억제 활성에 미치는 영향을 나타내는 도이다.
본 발명의 신규 미생물은 김치에서 분리되었으며, 후술하는 실시예의 방법에 따라 스크리닝 및 동정하였다. 미생물의 동정은 그의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 기초로 하여 이루어졌다. 김치에서 분리한 신규의 유산균이 ACE 억제 활성이 있고, 베타-갈락토시다제 활성이 우수하여 발효시간이 빠르기 때문에 발효유 제조에 적합함을 알아내고, 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은, 안지오텐신 전환 효소(Angiotensin converting enzyme, ACE) 억제 활성이 있고, 우유 발효 속도가 빠른 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) K79 균주(수탁번호 KACC 81222BP)에 관한 것이다.
본 발명자들은 김치로부터 분리한 균주들을 변형 MRS배지에서 배양한 다음, 각 균락을 순수분리하고 노란색으로 변한 균락을 잠정적 유산균으로 선발하였다. 선발된 균주는 변형 MRS 배지에 도말한 후, 호기 배양하여 순수분리 하였다. 순수 분리된 균주를 동정한 결과, 균주는 그람양성 간균이며, 산소유무와 상관없이 잘 생장하고 카탈라아제와 운동성에 대해서는 음성으로 밝혀졌다. 또한, 15 ℃와 45 ℃에서 생장하지 않았으며, 글루코오스(glucose)로부터 가스와 알긴산으로부터 암모니아를 생성하지 않아 락토바실러스(Lactobacillus)에 속하는 것으로 확인하였다.
한편, 종명을 확인하기 위하여 49종의 당 발효 시험을 실시한 결과, Gentiobiose 등 25종의 당을 이용하였고, ATB 동정시스템에 입력하여 조사한 결과와 16S rRNA 유전자 염기서열(Gene Sequence)을 이용하여 얻어진 결과가 일치되어 락티플란티바실러스 플란타럼으로 판명되었다(도 2).
따라서, 본 발명은 김치에서 분리한 탈지유 응고 균주들 중 탈지유 발효 속도와 ACE 억제 활성이 우수한 균주를 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) K79로 명명하였다.
하기 실시예를 통해 김치로부터 분리한 본 발명의 락티플란티바실러스 플란타럼 K79 균주는 미생물 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석 결과, 서열번호 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 상기 핵산서열은 NCBI GenBank(http://www.ncbi.nin.gov)에서 제공하는 블라스트 서치 프로그램(blast search program)을 통해 상동성(homology)을 확인해 본 결과, Lactiplantibacillus plantarum NRRL B-14768 균주와 99% 동일하고, 100% 상동성을 갖는 균주가 없는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열을 갖는 본 발명의 락티플란티바실러스 플란타럼 K79 균주를 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 2022년 8월 29일자로 기탁하였다(수탁번호 KACC 81222BP).
본 발명의 K79 균주는 우유, 특히 탈지유에 접종하여 발효시키는 경우 ACE 억제 활성이 우수한 우유 발효물을 제조할 수 있게 하므로, 발효유의 제조에 매우 유용하다.
또한, 본 발명의 K79 균주는 하기 일 실시예에서, 항생제 내성시험을 통해 생장 여부를 관찰하여 최저억제농도(MIC)값을 측정한 결과, 카나마이신(Kanamycin), 암피실린(Ampicillin), 테트라사이클린(Tetracycline), 클린다마이신(clindamycin), 에리트로마이신(Erythromycin) 및 클로람페니콜(Chloramphenicol) 중에서 선택된 1종 이상의 항생제에 대해 내성을 가지고 있었으며, 타계열의 항생제에 비해 카나마이신에 대해 내성이 높은 반면 클린다마이신 및 에리트로마이신에 대해서는 감수성이 높은 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명의 K79 균주는 하기 일 실시예에서 효소 활성 시험 결과, 이당류인 유당을 포도당과 갈락토스로 분해하는 베타-갈락토시다제의 활성이 매우 높게 나타났다. 한편, 벤조피렌(Benzopyrene)을 발암성 물질로 전환시키는 발암효소인 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)의 경우에는 효소활성이 없는 것으로 나타나 안전성을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 K79 균주는 하기 일 실시예에서, 담즙 내성을 MRS배지에서의 유산균 성장을 시험함으로써 측정하였는바(도 3), log 값이 1.0 증가하는데 소요되는 시간이 담즙을 첨가하지 않을 때는 약 5시간, 담즙을 첨가할 때는 약 5.5시간 소요됨에 따라 약간 억제를 받기는 하나 담즙에 대한 내성이 있는 것으로 나타났다.
하기 일 실시예에서, K79 균주의 항균 활성은 대장균(Escherichia coli)에 대해 50% 이상의 억제력, 구체적으로는 51.75%의 억제력을 보였고, 살모넬라 타이피머리움(Salmonella Typhimurium)과 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 대해 30% 이상의 억제력, 구체적으로는 각각 37.71%와 33.33%의 억제력을 보였으며, 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 20% 이상의 억제력, 구체적으로는 20.65%의 억제력을 나타내었다.
또한, pH 내성을 시험한 결과, 대조구 pH인 6.4에 비해 강산인 pH 2에서조차도 거의 영향이 없음에 따라 내산성이 있음을 보인다.
또한, 본 발명의 K79 균주는 우수한 장 부착능을 가지는 것을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 K79 균주는 발효유 제조에 적합한 젖산균임을 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 탈지유에 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) K79 균주(수탁번호 KACC 81222BP)를 접종한 후 발효시키는 단계;를 포함하는 ACE 억제 활성이 있는 우유 발효물의 제조방법에 관한 것이다.
일 구체예에서, 상기 탈지유는 10 내지 15 중량%, 바람직하게는 11 내지 14 중량%, 더욱 바람직하게는 12 내지 14 중량%, 더욱 바람직하게는 13 내지 14 중량% 농도일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 균주는 상기 탈지유에 0.02 내지 0.20 중량%, 바람직하게는 0.03 내지 0.15 중량%, 더욱 바람직하게는 0.04 내지 0.10 중량%, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 0.06 중량%로 접종하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 발효는 30 내지 46 ℃, 바람직하게는 30 내지 40 ℃, 더욱 바람직하게는 30 내지 35 ℃, 더욱 바람직하게는 31 내지 35 ℃, 더욱 바람직하게는 32 내지 35 ℃에서 10 내지 25시간, 바람직하게는 15 내지 25 시간, 더욱 바람직하게는 18 내지 25 시간, 더욱 바람직하게는 19 내지 23 시간 동안 발효시키는 것일 수 있다. 본 발명의 우유 발효물의 제조방법에 따르면, 상대적으로 저온 및 단시간에 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상의 ACE 억제 활성을 갖는 우유 발효물을 얻을 수 있다.
본 발명의 우유 발효물의 제조방법에 있어서, 상기 탈지유 농도, 균주 첨가량, 발효 온도 및 발효 시간의 조건을 모두 만족하는 경우에 ACE 억제 활성이 높은 우유 발효물을 얻을 수 있다. 상기 조건 중 하나라도 상기 범위를 만족하지 못하는 경우에는 원하는 수준의 ACE 억제 활성을 갖는 우유 발효물을 얻지 못할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 우유 발효물은 pH 4.0 내지 5.0, 바람직하게는 pH 4.4 내지 4.8이고, 80 내지 90%, 바람직하게는 85 내지 90%의 ACE 억제 활성을 나타내는 것일 수 있다.
다음으로, 본 발명의 우유 발효물의 제조방법은 상기 우유 발효물을 균질, 살균 열처리하는 단계;를 추가하여 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 본 발명의 방법에 따라 제조된 우유 발효물에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명의 우유 발효물은 pH 4.0 내지 5.0이고, 80 내지 90%, 바람직하게는 85 내지 90%의 ACE 억제 활성을 나타내는 것일 수 있다. 본 발명의 우유 발효물은 100배 희석한 경우에도 40% 이상, 바람직하게는 50% 이상의 ACE 억제 활성을 나타낸다(표 18 참조).
본 발명의 또 다른 측면은, 본 발명의 우유 발효물을 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 우유 발효물은 광의로는 우유 발효물을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 우유 발효물 가공품, 예컨대, 우유 발효물의 균질화 분말, 우유 발효물 건조 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 우유 발효물로 실험을 진행하긴 하였으나, 우유 발효물 가공품과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상가능할 것이다.
한편, 본 명세서에서 용어 “유효성분으로 함유하는”이란 우유 발효물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 우유 발효물의 1일 투여량은, 0.001-10 g/㎏일 수 있다.
본 발명의 용어 "개선"이란, 본 발명의 우유 발효물을 포함하는 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서는 고혈압의 증상 호전시키는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 식품학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 분말, 과립, 정제, 캡슐 등으로 제제화하여 기능성 식품으로 이용할 수 있다. 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 식품 조성물은 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류 등일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 우유 발효물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 락츌로스 등; 올리고당; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 우유 발효물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 우유 발효물을 유효성분으로 포함하는 고혈압 예방 또는 개선용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 우유 발효물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 우유 발효물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 우유 발효물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "예방"이란, 상기 고혈압의 증상을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 것을 의미한다. 본 발명에 있어서는 고혈압의 발병 시기를 지연시키거나, 발병을 억제하는 것을 의비한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 고혈압의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 락티플란티바실러스 플란타럼 K79 균주 및 이를 이용한 우유 발효물에 대해 실시예를 들어 상세히 설명하기로 한다.
<실시예>
실시예 1: 유산균의 분리 및 발효능 균주 선발
1-1: 유산균의 분리 및 수집
각 50 가정에서 만든 김치 50종에서 균주를 채취하여 브로모크레졸 퍼플(Bromocresol purple)과 소듐아자이드(sodium azide)를 첨가한 변형 MRS배지(표 1)에 0.1 ml씩 평면도말법으로 접종한 후, 37 ℃에서 48시간 배양하였다. 그런 다음, 노란색 콜로니 중 각기 다른 모양의 콜로니를 선발하고, 순수분리를 위해 MRS 배지에 streaking하여 얻어진 콜로니를 TSA에 37 ℃에서 18시간 동안 배양하여 보관하였다. 이로부터 총 158종의 균주가 분리되었다.
| 성분 | 함량(g/L) |
| 프로페오스 펩톤 #3 | 10.0 |
| 쇠고기 추출물 | 10.0 |
| 효모 추출물 | 5.0 |
| 락토오스 | 20.0 |
| 트윈 80 | 1.0 |
| 암모늄 시트레이트 | 2.0 |
| 소디움 아세테이트 | 5.0 |
| 마그네슘 설페이트 | 0.1 |
| 망간 설페이트 | 0.05 |
| 디포타시움 포스페이트 | 2.0 |
| 소듐 아자이드 | 0.25 |
| 브롬크레졸 퍼플 | 0.04 |
| 아가 | 15.0 |
이후, 상기 158종의 균주를 탈지유(skim milk)에 접종하여 발효능을 측정하였다. 상기 탈지유는 서울우유협동조합에서 제조한 단백질 35.0%, 유지방 1.0%, 탄수화물(유당) 52.5%, 회분 및 기타 8.5%, 수분 3.0%인 제품을 사용하였다. 탈지유를 살균하기 위해 10 %(w/w)로 농도를 조정한 후 심부 온도 80 ℃에서 1분간 살균하고, 1 %(w/w) 유산균을 접종한 후 37 ℃에서 18시간 및 24시간 동안 배양한 후 우유 발효 능력 여부를 확인하였다. 그 결과, 김치 유래의 158종의 균주 중에서 98종의 균주에 의해서 우유가 발효물이 되는 것을 확인되었다. 즉, 상기 98종의 균주는 우유 발효 능력, 즉 우유 발효능이 있는 것으로 나타났다.
1-2: 균주 선발
상기 1-1의 98종의 균주를 이용한 우유 발효물(바이오컨버전 산물)에 대한 ACE 억제능 평가를 통해 상기 98 종의 균주 중에서 ACE 억제능이 있는 12개 균주를 1차 선발하였다(표 2). ACE 억제 활성 측정은 (1) 정통법인 Cushman과 Cheung(1971)의 방법, 및 (2) 킷트 법을 이용하여 2회 측정하였다.
상기 (1) 정통법을 위한 ACE 억제 활성 측정을 위해, 상기 우유 발효물을 6,000 rpm에서 10분간 원심분리한 상층액(whey fraction)을 이용하였다. 그리고, ACE 억제 활성을 Cushman과 Cheung(1971)의 방법에 준하여 실시하였다. 시험군으로서 NaCl을 0.3M 함유한 0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3)에 기질 Hip-His-Leu 2.5 mM을 용해시킨 용액 50 ㎕, ACE 50 ㎕, 및 각각의 whey fraction 50 ㎕를 혼합하여 이용하였고, 대조구는 whey fraction 대신 증류수 50 ㎕를 첨가한 것을 이용하였으며, 각 시료를 37 ℃에서 30분간 반응시키고 1N HCl 250㎕ 첨가로 반응을 중지시켰다. 다시 여기에 ethylacetate 1.5 ml를 가하여 15초간 교반한 후 3,000 rpm에서 5분간 원심분리시켜 상징액 1 ml을 취하였다. 이 상징액을 121 ℃에서 30분간 가열하여 완전히 건조시킨 뒤 증류수 3 ml을 가하여 용해시킨 다음 228 nm에서 흡광도를 측정하고 하기 계산식에 적용하여 ACE 저해율을 구하였다.
ACE 저해율(%) = 1 - (S - S.C) / (C - C.C) × 100
S: 시료의 흡광도
S.C : 시료 대조구의 흡광도
C: blank의 흡광도
C.C: blank의 대조구 흡광도
다음으로, (2) 킷트 법을 위한 ACE 억제 활성은 ACE Kit-WST(Dojindo molecular technologies, Inc. Japan)를 사용하여 실시하였다. 시료, 기질완충액, 효소 표준용액을 각 well에 넣고 60분간 배양한 다음 지시약 표준용액을 첨가하고 10분간 배양한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 방법으로 측정한 ACE 억제 활성을 아래 표 2에 나타내었다.
| 균주 | KIT 법 | Cushman과 Cheung(1971)의 방법 |
| Enterococcus faecalis B46(특허) | 84.1 | 88.3 |
| Lactobacillus zeae K354(특허) | 86.8 | 60.0 |
| K104 | 91.9 | 69.4 |
| K106 | 91.0 | 77.2 |
| K109 | 90.1 | 13.3 |
| K108 | 91.6 | 78.3 |
| K110 | 90.7 | 74.4 |
| K111 | 91.6 | 60.6 |
| K6 | 91.3 | 85.0 |
| K101 | 89.0 | 72.2 |
| K79 | 91.3 | 80.0 |
| K120 | 86.2 | 65.4 |
| K118 | 91.9 | 55.6 |
| K117 | 84.6 | 72.2 |
상기 12개의 균주 중에서, 2개의 특허등록 균주를 대조구로 하여 킷트법, 및 Cushman과 Cheung(1971)의 방법을 이용하여 4개의 균주를 선발하였고, 킷트법으로 IC50을 측정한 결과 K79 균주가 200배 희석(희석농도 0.005)하여도 ACE 억제능이 59.3%로서 가장 높았다(표 3, 도 1).
| 균주 | 시료 희석농도(희석배수) / ACE 저해율(%) | ||||
| 0.04(25배) | 0.02(50배) | 0.01(100배) | 0.005(200배) | 0.025(400배) | |
| K106 | 92.4 | 82.0 | 71.9 | 44.7 | 10.1 |
| K108 | 91.0 | 76.3 | 59.9 | 34.2 | 11.3 |
| K6 | 89.5 | 73.1 | 63.0 | 30.9 | 12.7 |
| K79 | 96.8 | 92.3 | 81.6 | 59.3 | 27.7 |
1-3: 선발 균주 동정
바이오컨버전 산물에 대한 ACE 억제능 평가에서 최종 선발된 유산균 균주 K79의 genus와 species를 결정하기 위하여 생화학적, 생리적 시험을 하였다(표 4). 선발된 균주는 gram 양성을 나타내었고 현미경으로 관찰 시 rod 형태였으며, 산소유무와 상관없이 잘 생장하였고, catalase와 운동성은 음성으로 나타났다. 또한, 상기 균주는 15℃에서 생장하지 않았고, 45℃에서도 생장하지 않았다. 그리고, 상기 균주는 glucose와 arginine으로부터 각각 gas와 암모니아를 생성하지 않았다.
또한, 상기 유산균의 분자생물학적 특징을 조사하기 위해 균주 배양액으로부터 염색체 DNA를 분리한 후, 상기 염색체 DNA는 미생물 동정을 위하여 16s rRNA gene의 전체 염기서열 분석을 수행하였다. DNA sequence분석에는 universal primer 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하였으며, solgent EF-Taq을 사용하여 PCR을 실시하였다. 증폭과정은 95℃, 15분을 한 후 95℃, 20초; 50℃, 40초; 72℃, 1분 30초를 30회 시행하였으며, 72℃, 5분으로 마무리 하였다. 서열 분석은 PCR product를 solgent PCR purification kit (SolGent, Korea)로 purify한 후 ABI 3730XL DNA sequencer (Applied Biosystems, USA)로 자동 분석하였다.
상기 균주 K79 균주는 락티플란티바실러스 플란타룸에 속하는 균주인 것으로 조사되었고(도 2), 상기 동정한 K79 균주의 염기서열(16s rRNA 서열)을 서열번호 1에 나타내었다.
상기 K79 균주를 GenBank에 등록된 다른 균주들과 염기서열을 비교한 결과 표준균주인 Lactiplantibacillus plantarum NRRL B-14768 균주와 99%의 상동성을 나타내었으며, 서열번호 1과 100% 상동성을 갖는 균주는 기존에 존재하지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명자들은 이들 균주들을 2022년 8월 29일자로 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC: Korean Agricultural Culture Collection)에 기탁하여 하기와 같은 수탁번호를 부여받았다.
락티플란티바실러스 서브틸리스 - 수탁번호 KACC 81222BP(일명 “K79”라고 명명함)
| 균주 | K79 |
| Gram strain | + |
| Cell morphology | rod |
| Spore formation | - |
| Motility | - |
| Aerobic growth | + |
| Anaerobic growth | + |
| Catalase | - |
| Growth at 15 ℃ | - |
| Growth at 45 ℃ | - |
| Gas from glucose | - |
| Ammonia from arginine | - |
1-4: ACE 억제능 선발 균주의 특성 조사
(가) 당 발효 시험
당 발효 시험은 API 50 CHL kit(BioMereux, France)를 이용하여 실시하였다(표 5). 당 발효 시험 결과, L. plantarum K79균주는 API 50 CHL 49종의 당 중 25종을 이용하였다.
| No. | Strains | K79 |
| 0 | Control | - |
| 1 | Glycerol | - |
| 2 | Erythritol | - |
| 3 | D-Arabinose | - |
| 4 | L-Arabinose | + |
| 5 | D-Ribosse | + |
| 6 | D-Xylose | + |
| 7 | L-Xylose | - |
| 8 | D-Adonitol | - |
| 9 | Methyl-β-D-Xylopyranoside | - |
| 10 | D-Galactose | + |
| 11 | D-Glucose | + |
| 12 | D-Fructose | + |
| 13 | D-Mannose | + |
| 14 | L-Sorbose | - |
| 15 | L-Rhamnose | - |
| 16 | Dulcitol | - |
| 17 | Inositol | - |
| 18 | D-Mannitol | + |
| 19 | D-Sorbitol | + |
| 20 | Methyl-aD-Mannopyranoside | + |
| 21 | Methyl-aD-Glucopyranoside | - |
| 22 | N-AcetylGlucosamine | + |
| 23 | Amygdalin | + |
| 24 | Arbutin | + |
| 25 | Esculin ferric citrate | - |
| 26 | Salicin | + |
| 27 | D-Celiobiose | + |
| 28 | D-Maltose | + |
| 29 | D-Lactose | + |
| 30 | D-Melibiose | + |
| 31 | D-Saccharose | + |
| 32 | D-Trehalose | + |
| 33 | Inulin | - |
| 34 | D-Melezitose | + |
| 35 | D-Raffinose | + |
| 36 | Amidon(starch) | - |
| 37 | Glycogen | - |
| 38 | Xylitol | - |
| 39 | Gentiobiose | + |
| 40 | D-Turanose | + |
| 41 | D-Lyxose | - |
| 42 | D-Tagatose | - |
| 43 | D-Fucose | - |
| 44 | L-Fucose | - |
| 45 | D-Arabitol | - |
| 46 | L-Arabitol | - |
| 47 | Potassium Gluconate | + |
| 48 | Potassium 2-KetoGluconate | - |
| 49 | Potassium 5-KetoGluconate | - |
(2) 항생제 내성
항생제 내성 시험은 tryptic soy broth(Difco)를 사용하여 2배 희석방법에 의해 생장여부를 관찰하여 최저억제농도(MIC) 값을 정하였다.
구체적으로, MRS 액체배지에 선발균주를 접종하고 37℃에서 18시간 배양한 후 0.1% peptone용액에 적정농도로 희석하였다. 각 항생제가 각 농도 별로 포함된 tryptic soy 액체배지에 105~106 CFU/mL수준으로 접종하고 37℃에서 48시간 배양한 후 육안으로 관찰하여 생장 여부를 결정하였다. 항생제 내성 측정은 2배 희석방법을 사용하였으며, 억제된 가장 낮은 농도를 MIC(Minimal inhibitory concentration) 값으로 결정하여 하기 표 6에 나타내었다. 항생제는 Sigma (USA)로부터 구매하였고, 젠타마이신(Gentamycin), 카나마이신(Kanamycin), 암피실린(Ampicillin), 테트라사이클린(Tetracycline), 클린다마이신(clindamycin), 에리트로마이신(Erythromycin) 및 클로람페니콜(Chloramphenicol)을 시험에 사용하였다.
| 항생제 | MIC (㎍/mL) | 컷오프 값 |
| 젠타마이신 | 8 | 16 |
| 카나마이신 | 64 | 64 |
| 암피실린 | 1 | 2 |
| 테트라사이클린 | 16 | 32 |
| 클린다마이신 | 0.25 | 2 |
| 에리트로마이신 | 0.25 | 1 |
| 클로람페니콜 | 8 | 8 |
상기 표 6을 살펴보면, 본 발명의 K79 균주는 상대적으로 클린다마이신 및 에리트로마이신에 대해 감수성이 높고, 카나마이신에 대해서는 내성이 높은 것을 확인할 수 있다.
(3) 효소 활성
K79 유산균의 효소활성을 API ZYM kit를 사용하여 실시하였다.
구체적으로, MRS 액체배지에서 37℃, 18시간 동안 배양한 선발균주를 생리식염수로 희석하여 105~106 CFU/mL수준의 시료를 조제한 후, API ZYM kit (API bioMerieux, Lyon, France)를 이용하여 37℃에서 5시간 배양한 다음 효소반응 시켰다. 효소활성은 표준색상표를 비교하여 0~5의 수치로 표시하였으며, 대조구 이외의 alkaline phosphatase, eterase(C4), esterase lipase(C8), lipase(C14), leucine arylamidase, valine arylamidase, cystine arylamidase, trypsin, chymotrypsin, acid phosphatase, naphthol-AS-BI-phosphohydrolase, α-galactosidase, β-galactosidase, β-glucuronidase, α-glucosidase, β-glucosidase, N-acetyl-β-glucosaminidase, α-mannosidase, β-fucosidase 효소의 활성을 측정하여 하기 표 7에 나타내었다.
| 효소 | K79 |
| Alkaline phosphatase | 0 |
| Esterase(C4) | 0 |
| Esterase Lipase(C8) | 0 |
| Lipase(C14) | 0 |
| Leucine arylamidase | 4 |
| Valine arylamidase | 3 |
| Cystinearylamidase | 2 |
| Trypsin | 0 |
| α-chymotrypsin | 0 |
| Acid phosphatase | 1 |
| Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase | 2 |
| α-galactosidase | 0 |
| β-galactosidase | 5 |
| β-glucuronidase | 0 |
| α-glucosidase | 1 |
| β-glucosidase | 3 |
| N-acetyl-β-glucosaminidase | 3 |
| α-mannosidase | 0 |
| α-fucosidase | 0 |
상기 표 7을 살펴보면, 본 발명의 L. plantarum K79는 이당류인 유당을 포도당과 갈락토스로 분해하는 베타-갈락토시다제의 활성이 5로서 매우 높았다. 특히, Benzopyrene을 발암성 물질로 전환시키는 발암효소인 β-glucuronidase의 경우에는 효소활성이 없는 것으로 나타나 안전성을 확인하였다.
(4) 담즙 내성 시험
담즙 내성은 길리랜드와 월커의 방법(Gilliland & Walker, J. Dairy Sci., 73, 905, 1990)에 따라 측정하였다.
구체적으로, Gilliland와 Walker (1990)의 방법에 따라 MRS 액체배지에서 37℃, 18시간 배양된 선발균주 균주를 0.05% cysteine이 함유된 MRS 액체배지에 0.3% oxgall을 첨가한 배지와 대조구로서 oxgall을 첨가하지 않은 배지에 각각 1% 접종하였다. 37℃의 incubator에서 7시간까지 혐기배양하면서 시간 별로 BCP plate count agar 평판에서 부어 굳힌 후 37℃에서 48시간 혐기배양하여 계수하여, 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 K79 균주는 배지에 담즙을 첨가하고 7시간 배양한 경우 후 약 0.5 log 값이 감소함에 따라 약간 억제를 받기는 하였지만, 담즙에 대한 내성이 있는 것으로 나타났다.
(5) pH 내성 시험
pH 내성은 클라크 등의 방법(Clark et al., Cultured Dairy Products J., 28(4), 11, 1993)에 따라 측정하였다.
구체적으로 클라크 등(1993)의 방법에 따라 37% HCl을 증류수에 섞어 pH 2, 3, 4 용액과 대조구로서 pH 6.4 용액을 제조하였고, 제조된 pH 용액 10 mL에 0.05% cysteine이 함유된 MRS 액체배지에서 37℃, 24시간 배양된 선발균주(약 109 CFU/mL)를 1 mL씩 섞은 후 37℃에서 혐기 배양하면서 0, 1, 2, 3시간 후의 생균수를 BCP plate count agar 평판에서 부어 굳힌 후 37℃에서 48시간 혐기 배양한 다음 계수하여, 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 K79 균주는 대조구 pH인 6.4에 비해 강산인 pH 2에서조차도 거의 영향이 없음에 따라 내산성이 있음을 보였다.
(6) 항균 활성 시험
항균 활성은 길리랜드와 스펙(Gilliland & Speck, J. Food Prot., 40(12), 820, 1977)에 따라 측정하였다.
구체적으로, 길리랜드와 스펙(1977)의 방법에 따라 항균력 측정에 사용한 지시균인 Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes 및 Staphylococcus aureus는 한국식품연구원으로부터 분양 받았으며, 지시균의 증식배지로서 Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, Staphyloccous aureus는 nutriunt 액체배지에서 호기적으로 37℃, 24시간 배양하였다. 혼합배양 및 대조군에 사용된 배지는 MRS 액체배지로서 유산균과 지시균을 각각 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 선택배지로서 Escherichia coli는 EMB agar, Salmonella Typhimurium 은 Bismuth sulfite agar, Listeria monocytogenes는 Supplement(X123)가 함유된 Listeria Isolation Agar, Staphyloccous aureus는 Baird parker agar를 사용하여 37℃에서 6시간 배양하였다. 유산균에 의한 지시균의 억제율은 다음의 식으로 구하여, 하기 표 8에 나타내었다. 참고로, K79 균의 초기 수는 1.64±0.16×106 CFU/㎖이었다.
억제율 (%) = (대조군의 균수 CFU/mL-혼합배양 후의 균수 CFU/mL)/대조군의 균수 CFU/mL
| 식중독균 | 생장 | ||||
| 식중독균 | K79 균주 | 억제율(%) | |||
| CFU/ml | pH | CFU/ml | pH | ||
| 대장균 | 1.14±0.32×107 | 6.25 | 5.50±1.27×106 | 4.96 | 51.75 |
| 살모넬라 타이피머리윰 | 4.72±0.4×105 | 6.25 | 2.94±0.01×105 | 4.83 | 37.71 |
| 리스테리아 모노사이토제네스 | 8.4±0.85×106 | 6.23 | 5.60±0.14×106 | 4.89 | 33.33 |
| 스타필로코쿠스 오레우스 | 4.6±1.13×106 | 6.24 | 3.65±0.64×106 | 4.91 | 20.65 |
상기 표 8에 나타낸 바와 같이, L. plantarum K79가 대장균(Escherichia coli)에 대해 51.75%의 억제력을 보였고, 살모넬라 타이피머리움(Salmonella Typhimurium)과 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 대해 각각 37.71%와 33.33%의 억제력을 보였다. 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 20.65%로 가장 낮은 억제력을 보였다.
(7) 장부착능 시험
장부착능은 김 등의 방법(Korean J. Food Sci.Anim. Resour, 38, 554, 2018)에 따라 측정하였다.
구체적으로, 실험에 사용한 HT-29 세포는 한국세포주은행(seoul, Korea)을 통하여 구입하였고, Kim 등(2008)의 방법에 따라 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA)과 1% penicillin-streptomycin (P/S; Gibco, USA)이 첨가된 RPMI 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2/95% air가 공급되는 조건의 항온기(incubator)에서 배양하였다. HT-29 세포를 배양하기 위하여 세포를 12 well plate의 각 well에 106 cells/well로 분주하고 2일에 한번씩 배지를 교체해 주며 실험 전날, 95%까지 세포가 찼을 때 serum free medium으로 교체하여 cell이 더 이상 차는 것을 막아주었다. 균주의 장내 정착능을 실험하기 위해 2차 계대배양한 균주 1 mL를 취해 12,000rpm에서 3분간 원심분리하고 serum free medium을 이용해 두 번 세척하였다. 세척한 균주를 RPMI 배지로 희석하여 O.D. 600nm이 0.5가 나오도록 맞춘 후 0.1% peptone 용액으로 희석한 다음 BCP plate count agar에 pouring 하여 초기 균수를 측정하였다. O.D. 값을 맞춘 균체 100mL를 well에 분주 한 후 37℃, 5% CO2에서 2시간 배양한 뒤 PBS를 이용해 붙지 않은 균을 5번 세척해 준다. Trypsin-EDTA 1mL를 첨가하여 cell-bacteria를 떼어낸 후 0.1% peptone용액으로 희석한 다음 BCP plate count agar에 pouring하여 균수를 측정하여, 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 K79 균주는 대조구인 락토바실러스 람노서스 LGG에 비해 장 부착능에서 유의적인 차이를 보였다.
실시예 2: K79 균주를 이용한 우유 발효물의 최적 발효 조건
2-1: 반응표면분석법(RSM)을 이용한 배양조건의 최적화
(1) 재료 및 방법
공시 재료
멸균된 MRS broth에 균주 1%를 접종하여 37℃, 18시간 동안 배양한 후, 6000 rpm, 15분간 원심분리하여 cell paste 형태로 회수하였다. 동결보호제로서 증류수를 첨가하여 10% skim milk를 제조한 후 110℃, 5분간 2회 간헐 멸균하여 사용하였다. 회수된 cell paste 15 g에 멸균된 10% skim milk 50 mL을 첨가하여 잘 섞고, -70℃ deep freezer에 3시간 동결한 후 동결건조기에서 24시간 동안 동결 건조시켜 powder 형태로 제조하였다. 이때의 제조된 stater에 들어있는 K79 생균수는 3.5×109 CFU/g이었다.
시험방법
(가) 조건설정
조건설정은 배양조건을 최적화하기 위하여 독립변수(Xi)로 skim milk 농도(X1), starter첨가량(X2), 배양온도(X3), 배양시간(X4)을 설정하고 5단계로 부호화하여 27개 구간으로 설계하여 배양조건을 실시하였다. 종속변수(Yn)로는 ACE 억제율(Y1), pH(Y2)을 설정하였다. 통계처리는 MINITAB statistical software (Version 13, Minitab Inc., USA)를 사용하였다.
(나) 배양조건의 최적화를 위한 반응표면실험법
배양조건의 최적화를 위한 반응표면실험법은 중심합성계획(Central composite design, Box and Wilson, 1951)을 적용하였다. 독립변수로는 예비실험과 마찬가지로 탈지유 농도(X1), 발효온도(X2), 발효시간(X3), 스타터 첨가량(X4)을 설정하였다. 독립변수의 중심값과 범위는 예비실험을 바탕으로 설정되었으며, -2, -1, 0, 1, 2의 5가지 수준으로 부호화하였고(표 9), 이에 따른 실험조건은 표 10과 같다. 종속변수로는 ACE 억제율(Y1), pH(Y2)을 설정하였다. 통계분석 결과를 바탕으로 반응표면 모델식을 구하고 반응표면 그래프(Response surface plots)는 Maple software (Version 7, Waterloo Maple Inc., Canada)를 이용하여 3차원으로 나타내었다.
| 독립변수 | 부호 | 수준 | ||||
| -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | ||
| 탈지유 농도(%) | X1 | 6 | 8 | 10 | 12 | 14 |
| 발효 온도(℃) | X2 | 32 | 34.5 | 37 | 39.5 | 42 |
| 발효 시간(h) | X3 | 8 | 12 | 16 | 20 | 24 |
| 스타터 첨가량(%) | X4 | 0.02 | 0.065 | 0.11 | 0.155 | 0.2 |
| Run Order | 탈지유 농도(%) | 발효 온도(℃) | 발효 시간(h) | 스타터 첨가량(%) |
| 1 | 8 | 34.5 | 12 | 0.065 |
| 2 | 12 | 34.5 | 12 | 0.065 |
| 3 | 8 | 39.5 | 12 | 0.065 |
| 4 | 12 | 39.5 | 12 | 0.065 |
| 5 | 8 | 34.5 | 20 | 0.065 |
| 6 | 12 | 34.5 | 20 | 0.065 |
| 7 | 8 | 39.5 | 20 | 0.065 |
| 8 | 12 | 39.5 | 20 | 0.065 |
| 9 | 8 | 34.5 | 12 | 0.155 |
| 10 | 12 | 34.5 | 12 | 0.155 |
| 11 | 8 | 39.5 | 12 | 0.155 |
| 12 | 12 | 39.5 | 12 | 0.155 |
| 13 | 8 | 34.5 | 20 | 0.155 |
| 14 | 12 | 34.5 | 20 | 0.155 |
| 15 | 8 | 39.5 | 20 | 0.155 |
| 16 | 12 | 39.5 | 20 | 0.155 |
| 17 | 6 | 37 | 16 | 0.11 |
| 18 | 14 | 37 | 16 | 0.11 |
| 19 | 10 | 32 | 16 | 0.11 |
| 20 | 10 | 42 | 16 | 0.11 |
| 21 | 10 | 37 | 8 | 0.11 |
| 22 | 10 | 37 | 24 | 0.11 |
| 23 | 10 | 37 | 16 | 0.02 |
| 24 | 10 | 37 | 16 | 0.2 |
| 25 | 10 | 37 | 16 | 0.11 |
| 26 | 10 | 37 | 16 | 0.11 |
| 27 | 10 | 37 | 16 | 0.11 |
(다) pH 측정
pH는 pH 미터기를 사용하여 측정하였다.
(라) 유산균수 측정
유산균수는 발효액 1 mL를 십진희석법으로 희석하여 평판배양법으로 BCP 한천배지에 1 mL씩 분주하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 노란색 콜로니를 계수하여 시료 1 g 당 CFU (colony forming unit)로 표시하였다.
(2) 시험결과
(가) 모두 27개의 구간에서 실험이 행해졌으며, 각각의 구간에 따른 종속변수(Y1, Y2)를 표 11에 나타내었다. 이때 ACE 억제율(Y1)은 조건별 발효원액에서 100배 희석하여 나타낸 값이다. 탈지유 농도(X1)는 13.49%, 발효 온도(X2)는 33.4℃, 발효 시간(X3)은 21.5013시간, 스타터 첨가량(X4)은 0.0578% 일 때 최적 ACE 억제능과 pH를 보이는 것으로 나타났으며 예상되는 ACE 억제능은 86.69%, pH는 4.6 이었다.
| Run Order | 독립변수 | 반응값 | ||||
| X1 | X2 | X3 | X4 | Y1 | Y2 | |
| 1 | -1 | -1 | -1 | -1 | 64.5 | 5.94 |
| 2 | 1 | -1 | -1 | -1 | 78.1 | 5.93 |
| 3 | -1 | 1 | -1 | -1 | 73.5 | 5.40 |
| 4 | 1 | 1 | -1 | -1 | 83.4 | 5.46 |
| 5 | -1 | -1 | 1 | -1 | 80.1 | 4.85 |
| 6 | 1 | -1 | 1 | -1 | 86.5 | 5.07 |
| 7 | -1 | 1 | 1 | -1 | 75.2 | 4.73 |
| 8 | 1 | 1 | 1 | -1 | 87.7 | 4.86 |
| 9 | -1 | -1 | -1 | 1 | 72.1 | 5.67 |
| 10 | 1 | -1 | -1 | 1 | 77.3 | 5.81 |
| 11 | -1 | 1 | -1 | 1 | 68.5 | 5.25 |
| 12 | 1 | 1 | -1 | 1 | 81.5 | 5.41 |
| 13 | -1 | -1 | 1 | 1 | 79.6 | 4.48 |
| 14 | 1 | -1 | 1 | 1 | 89.4 | 4.63 |
| 15 | -1 | 1 | 1 | 1 | 79.1 | 4.71 |
| 16 | 1 | 1 | 1 | 1 | 85.6 | 4.86 |
| 17 | -2 | 0 | 0 | 0 | 78.4 | 4.84 |
| 18 | 2 | 0 | 0 | 0 | 82.9 | 5.08 |
| 19 | 0 | -2 | 0 | 0 | 86.1 | 4.43 |
| 20 | 0 | 2 | 0 | 0 | 73.6 | 5.04 |
| 21 | 0 | 0 | -2 | 0 | 39.7 | 6.39 |
| 22 | 0 | 0 | 2 | 0 | 89.5 | 4.40 |
| 23 | 0 | 0 | 0 | -2 | 85.2 | 5.05 |
| 24 | 0 | 0 | 0 | 2 | 87.4 | 4.97 |
| 25 | 0 | 0 | 0 | 0 | 84.1 | 5.15 |
| 26 | 0 | 0 | 0 | 0 | 85.6 | 5.14 |
| 27 | 0 | 0 | 0 | 0 | 87.3 | 5.15 |
(나) 배양조건을 최적화하기 위하여 4가지 독립변수들의 조합에 대한 종속변수의 반응 값을 하기 표 12에 나타내었다. 그 결과 Y1은 X1과 X3가 일차항에서 유의수준(p-value) 0.05보다 낮게 나와 통계적으로 유의성을 나타내었으며 종속변수에 대한 영향이 큰 것으로 나타난 반면, 교차항은 X3X3를 제외하고 통계적으로 유의성이 없는 것으로 나타났다. Y2는 X3만이 일차항에서 유의수준(p-value)이 0.05보다 낮게 나와 통계적으로 유의성이 나타났고, 종속변수에 대한 영향이 큰 것으로 나타났으며, 교차항은 X2X3 만이 통계적으로 유의성이 있는 것으로 나타났다.
| 구분 | Y1 | Y2 | ||
| Coefficient | p-value | Coefficient | p-value | |
| intercept | 85.6667 | 0.000 | 5.14667 | 0.000 |
| X1 | 3.5792 | 0.026 | 0.06167 | 0.200 |
| X2 | -0.7542 | 0.601 | -0.02000 | 0.668 |
| X3 | 6.8292 | 0.000 | -0.44417 | 0.000 |
| X4 | 0.3542 | 0.805 | -0.06583 | 0.173 |
| X1X1 | -1.0823 | 0.482 | -0.01896 | 0.701 |
| X2X2 | -1.2823 | 0.407 | -0.07521 | 0.145 |
| X3X3 | -5.0948 | 0.005 | 0.08979 | 0.087 |
| X4X4 | 0.3302 | 0.828 | -0.00646 | 0.896 |
| X1X2 | 0.4313 | 0.806 | 0.00000 | 1.000 |
| X1X3 | -0.4062 | 0.817 | 0.01875 | 0.742 |
| X1X4 | -0.4937 | 0.779 | 0.01250 | 0.826 |
| X2X3 | -1.4313 | 0.422 | 0.12250 | 0.048 |
| X2X4 | -0.8938 | 0.613 | 0.06125 | 0.293 |
| X3X4 | 0.2687 | 0.879 | -0.01500 | 0.792 |
(다) 상기에서 얻어진 결과를 바탕으로 구한 반응식은 표 13과 같다. 실험 결과 얻어진 data를 Minitab software를 이용하여 반응표면 분석한 결과를 바탕으로 적합한 2차 다항식의 모델을 구하였다. 각각의 독립변수에 대한 각각의 식은 아래 모델식과 같고, 종속변수인 Y1과 Y2의 결정계수(R2)는 각각 0.791과 0.905로 나타났으며, 두 경우 모두 p-value= 0.000으로 나타났다.
| 반응값 | 2차 다항식 모델 | R2 | p-value |
| Y1 | Y1=85.6667 + 3.5792X1 - 0.7542X2 + 6.8292X3 + 0.3542X4 + 0.4313X1X2 - 0.4062X1X3 - 0.4937X1X4 - 1.4313X2X3 - 0.8938X2X4 + 0.2687X3X4 - 1.0823X1 2 - 1.2823X2 2 - 5.0948X3 2 + 0.3302X4 2 | 0.791 | 0.000 |
| Y2 | Y2=5.14667 + 0.06167X1 - 0.02000X2 - 0.44417X3 - 0.06583X4 + 0.0000X1X2 + 0.01875X1X3 + 0.01250X1X4 + 0.12250X2X3 + 0.06125X2X4 - 0.01500X3X4 - 0.01896X1 2 - 0.07521X2 2 + 0.08979X3 2 - 0.00646X4 2 | 0.905 | 0.000 |
(라) ACE 억제 활성에 대한 ANOVA (Analysis of varience) 결과를 하기 표 14에 나타내었다. 하기 표 14에서, Linear는 유의수준이 0.003으로써 매우 유의성이 높게 나타났고, Regression과 Square는 각각 0.024와 0.043으로 유의성이 있었다. 반면, 2-way interations는 0.971로 0.05% 수준에서 유의성이 없는 것으로 나타났다.
| 반응값 | 소스 | DF | SS | MS | F-value | p-value |
| Y1 | Regression | 14 | 2152.78 | 153.770 | 3.24 | 0.024 |
| Liner | 4 | 1443.41 | 360.853 | 7.61 | 0.003 | |
| Square | 4 | 653.14 | 163.286 | 3.44 | 0.043 | |
| Interaction | 6 | 56.23 | 9.371 | 0.20 | 0.971 | |
| Residual error | 12 | 568.97 | 47.414 | - | - | |
| Lack of fit | 10 | 563.85 | 56.385 | 22.00 | 0.044 | |
| Pure error | 2 | 5.13 | 2.563 | - | - | |
| Total | 26 | 2721.76 | - | - | - |
또한, pH에 대한 ANOVA (Analysis of varience) 결과를 하기 표 15에 나타내었다. 하기 표 15에서, Regression과 Linear는 각각 유의수준이 0.000으로써 매우 유의성이 높게 나타났고, Square와 2-way interactions는 각각 0.122와 0.443으로 0.05% 수준에서 유의성이 없는 것으로 나타났다.
| 반응값 | 소스 | DF | SS | MS | F-value | p-value |
| Y2 | Regression | 14 | 5.70276 | 0.40734 | 8.20 | 0.000 |
| Liner | 4 | 4.93970 | 1.23493 | 24.89 | 0.000 | |
| Square | 4 | 0.45121 | 0.11280 | 2.27 | 0.122 | |
| Interaction | 6 | 0.31185 | 0.05198 | 1.05 | 0.443 | |
| Residual error | 12 | 0.59540 | 0.04962 | - | - | |
| Lack of fit | 10 | 0.59533 | 0.05953 | 1786.00 | 0.001 | |
| Pure error | 2 | 0.00007 | 0.00003 | - | - | |
| Total | 26 | 6.29816 | - | - | - |
(마) 반응표면분석 결과 나타난 최적 조건에서의 coded 값과 uncoded 값을 하기 표 16에 나타내었다. 최적 조건일 때의 code 값은 X1=13.49, X2=33.4, X3=21.5013 그리고 X4=0.0578로 나타났다. 즉 탈지유 농도(X1)는 13.49%, 발효 온도(X2)는 33.4℃, 발효 시간(X3)은 21.5013시간, 스타터 첨가량(X4)은 0.0578%일 때 최적 ACE 억제능과 pH를 보이는 것으로 나타났다. 이 때 예상되는 ACE 억제능은 86.69%, pH는 4.6 이었으며, 실험값은 ACE 억제능은 85.5%, pH는 4.58 이었다(표 17).
| 종속변수 | 독립변수 | Critical value (uncoded) |
예상값 | 실험값 | |
| Y1 (ACE 억제활성(%)) |
X1 | 10.0 | 90.0000 | Target | |
| X2 | 37.0 | ||||
| X3 | 17.8304 | ||||
| X4 | 0.200 | ||||
| Y2 (pH) |
X1 | 6.0000 | 4.6 | Target | |
| X2 | 32.0017 | ||||
| X3 | 14.1670 | ||||
| X4 | 0.200 | ||||
| Multiple response optimization |
Y1, Y2 | X1 | 13.4931 | - | - |
| X2 | 33.4057 | ||||
| X3 | 21.5013 | ||||
| X4 | 0.0578 | ||||
| 종속변수 | 예상값 | 실제값 |
| Y1 | 86.6916 | 85.5 |
| Y2 | 4.60 | 4.58 |
(바) 독립변수(X1, X2, X3, X4)가 종속변수(Y1, Y2)에 미치는 영향을 Maple software(Maple 7. Waterloo Maple Inc., Canada)를 이용하여 3차원 그래프로 나타내었다(도 6).
(사) 공정단계별 ACE 억제활성에 미치는 영향
상기 최적조건인 탈지유 13.5%를 90 ℃에서 5분 살균한 다음 K79 균주 0.0578%를 첨가하고, 33.4 ℃에서 21.5시간 배양한 배양액, 상기 배양액을 열처리(110℃에서 1분 살균)한 용액, 상기 용액을 분무건조한 분말, 및 분말을 13.5% 농도로 환원한 용액으로 구분하여 ACE 억제능을 분석한 결과를 하기 표 18, 도 7에 나타내었다.
| 공정단계 | 시료희석배수 | |||
| 20배 | 40배 | 80배 | 100배 | |
| 배양종료액(A) | 89.39 | 82.01 | 62.85 | 55.01 |
| 열처리 후(B) | 87.05 | 74.00 | 46.06 | 46.20 |
| 분무건조 분말(C) | 93.00 | 93.56 | 90.69 | 91.00 |
| 분말 환원액(D) | 86.37 | 74.58 | 50.25 | 44.38 |
상기 표 18 및 도 7을 살펴보면, 열처리 후 단계(B)에서는 열처리 전 단계(A)에 비해 ACE 억제능이 약간 감소하는 경향을 보인 반면, 열처리 후 단계(B)와 분무건조 후 동일한 농도로 환원하는 단계(D)는 ACE 억제능에서 거의 차이를 보이지 않았다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (11)
- 안지오텐신 전환 효소(Angiotensin converting enzyme, ACE) 억제 활성 및 우유 발효 활성을 갖는 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) K79 균주(수탁번호 KACC 81222BP).
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는 젠타마이신(Gentamycin), 카나마이신(Kanamycin), 암피실린(Ampicillin), 테트라사이클린(Tetracycline), 클린다마이신(clindamycin), 에리트로마이신(Erythromycin) 및 클로람페니콜(Chloramphenicol) 중에서 선택된 1종 이상의 항생제 내성; 담즙 내성; pH 내성; 대장균, 살모넬라 타이피머리움(Salmonella Typhimurium), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 및 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성; 및 장 부착능을 가지는 것을 특징으로 하는 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는 유해 효소인 β-Glucuronidase를 생성하지 않으며, 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 활성이 우수한 것을 특징으로 하는 균주. - 탈지유에 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) K79 균주(수탁번호 KACC 81222BP)를 접종한 후 발효시키는 단계;를 포함하는 ACE 억제 활성이 있는 우유 발효물의 제조방법.
- 제5항에 있어서,
상기 탈지유는 10 내지 15 중량% 농도인 것을 특징으로 하는 우유 발효물의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 균주는 상기 탈지유에 0.02 내지 0.2 중량%로 접종하는 것을 특징으로 하는 우유 발효물의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 발효는 30 내지 46℃에서 10 내지 25시간 동안 발효시키는 것을 특징으로 하는 우유 발효물의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 우유 발효물은 pH 4.0 내지 5.0이고, 80 내지 90%의 ACE 억제 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 우유 발효물의 제조방법. - 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 우유 발효물.
- 제10항의 우유 발효물을 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020220145426A KR20240066518A (ko) | 2022-11-03 | 2022-11-03 | Ace 억제 활성을 갖는 신규한 락티플란티바실러스 플란타럼 k79 균주, 이를 이용한 우유 발효물의 제조방법, 이에 따른 우유 발효물 및 이를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 식품 조성물 |
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| KR1020220145426A KR20240066518A (ko) | 2022-11-03 | 2022-11-03 | Ace 억제 활성을 갖는 신규한 락티플란티바실러스 플란타럼 k79 균주, 이를 이용한 우유 발효물의 제조방법, 이에 따른 우유 발효물 및 이를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 식품 조성물 |
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| KR20090113477A (ko) | 2008-04-28 | 2009-11-02 | 주식회사 엔유씨전자 | 항고혈압활성 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는발효물 |
| KR20150074518A (ko) | 2013-12-24 | 2015-07-02 | 대상에프앤에프 주식회사 | 식물성유산균 발효액을 포함하는 당뇨 및 고혈압 예방 및 치료용 조성물 |
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