KR20090113477A - 항고혈압활성 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는발효물 - Google Patents
항고혈압활성 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는발효물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물성 프로바이오틱 유산균 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 전통 가자미식해에서 분리, 동정된 항고혈압활성이 있는 균주로서 한국미생물보존센터(KCCM) 특허기탁된 균주(Lactobacillus plantarum NUC-LG42 KCCM 10940P)이다. 본 발명에 의하면 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42는 산생성능, 내산성 및 내담즙산능이 우수하며, 항고혈압활성의 생리활성을 가지므로 요구르트용 스타터 또는 기능성 프로바이오틱 유산균으로 이용이 가능하다.
락토바실러스 플란타룸, Lactobacillus plantarum, 항고혈압
Description
본 발명은 식물성 프로바이오틱 유산균 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 전통 가자미식해에서 분리, 동정된 항고혈압활성이 있는 균주로서 한국미생물보존센터(KCCM) 특허기탁된 균주(Lactobacillus plantarum NUC-LG42 KCCM 10940P)이다.
본 발명에 의하면 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42는 산생성능, 내산성 및 내담즙산능이 우수하며, 항고혈압활성의 생리활성을 가지므로 요구르트용 스타터 또는 기능성 프로바이오틱 유산균으로 이용이 가능하다.
고혈압은 만성 순환기계 질환 중 발생빈도가 가장 높은 질환으로 비교적 증상이 없는 편이지만 뇌졸중, 심부전, 관상동맥질환 등 치명적인 합병증을 유발할 수 있기 때문에 보다 적극적인 환자 관리와 치료가 요구되는 질환이다. 세계보건기구(World Health Organization)의 World Health Statistic 2007에 따르면 2030년까지 예측되는 사망원인에서 허혈성 심장질환, 뇌혈관질환이 암 다음으로 높게 나타 났을 뿐만 아니라, 한국 통계청(Korea National statistical)에서 제시한 2005년 기준 사망원인에서도 순환기계통 질환이 두 번째 사망원인으로 나타나 고혈압의 치료 및 예방이 전 세계적인 과제로 떠오르고 있다. 특히, 원인불명으로 알려져 있는 본태성 고혈압이 전체 고혈압의 80%에 해당하고 고혈압 치료에는 꾸준한 약물치료가 요구되기 때문에 의료비 부담뿐만 아니라 약물부작용을 줄이고자 항고혈압 효과가 있는 천연물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
고혈압을 개선하기 위한 목적으로 enalapril, captopril, ramipril, risinopril 등의 ACE 저해제가 개발되어 상용되고 있으나 이러한 약제의 사용으로 인한 부작용으로 미각이상, 백혈구 감소, 혈관부종, 간기능 이상 및 마른기침 등이 보고되었다. 따라서 천연물질로부터 항고혈압효과를 가지는 물질 탐색에 대한 요구가 계속되었으며, 대두 및 참치의 단백질 가수분해물, 차의 카테킨류, 키토산, 배에서 추출한 펙틴, 새우의 단백질 가수분해물, 약(yak) 밀크 카제인 등에서 분리된 ACE 저해제는 몇 가지 예라 하겠다.
최근 각국의 전통 발효식품에는 다양한 기능성이 있다는 학계의 결과가 발표되면서 국내외적으로 많은 관심을 불러일으키고 있으며, 세계적인 건강기능식품시장에 내세울만한 우리나라의 전통식품으로는 김치, 된장, 고추장, 청국장 등이 있다. 특히 우리 고유의 발효식품은 풍부한 유산균을 내포하고 있어 생활습관병(고혈압, 비만, 당뇨 등)의 예방, 항암 효과, 소화, 강장 효과 및 뇌기능의 활성화 등의 과학적 우수성이 지속적으로 밝혀지고 있다.
발효식품에 관여하는 유산균은 고부가가치를 창출할 수 있는 자원으로써 새 롭게 인식되고 있으며, 인간의 웰빙 및 건강과 밀접한 관계를 가지고 있으나, 우리나라에서 유산균의 중요성 및 기능성에 대한 관심은 선진국에 비하여 상당히 늦은 편이며, 일본에서 기술제휴로 1971년에 제품이 처음 판매됨으로써 유산균에 대한 중요성이 국민에게 인식되기 시작하였고, 유산균에 대한 연구도 가속화되기 시작했다. 그러나 대부분의 유산균에 대한 연구는 외국에서 유래한 유제품 기원의 유산균에서 시작되었고, 우리의 전통발효식품 유산균인, 김치, 청국장, 된장 등에 함유된 토착 유산균에 대한 연구는 그렇게 깊이 연구되지 않았다.
한편, 항고혈압능 유산균과 관련하여 한국 특허공개번호 2003-0061740 (홍국 또는 홍국추출물을 함유한 기능성 유산균 음료의 제조방법)에는 홍국 분말 또는 홍국 추출물을 포함하는 유산균 배지를 이용하여 직접 유산균을 접종하여 발효시킴으로써 또는 유산균 발효액에 첨가하는 액당에 혼합함으로써 제조되는 기능성 유산균 음료에 관한 발명으로, 홍국이 갖는 유효성분에 의한 항고지혈증 및 항고혈압 기능을 영양가치가 높고 칼로리가 낮은 장 활성이 우수한 유산균 음료에 적용하여, 복용이 간편하고 성인병 예방 및 개선 효과가 우수한 기능성 유산균 음료를 제조하는 것과 홍국의 유효성분인 모나콜린-K의 안정성을 향상시키기 위하여 로즈마리 추출물, 알파루틴, 라이코펜 등의 항산화물질을 첨가하는 것을 특징으로 한 기능성 유산균 음료가 알려져 있다.
그러나, 이는 홍국 추출물을 배지로 사용함에 특징이 있는 것이다.
본 발명은 프로바이오틱 유산균으로 섭취 시 혈압강하 효과를 기대할 수 있는 식물성 유산균주 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P(한국미생물보존센터, 특허기탁일자2008.04.04), 이를 이용한 배양물, 및 발효 제품을 제공함을 목적으로 한다.
본 발명에서는 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P 균주의 동결건조분말(109CFU/g)을 이용하여 사람의 본태성 고혈압 모델로 활용되는 spontaneously hypertension rat (SHR)에 유전적으로 혈압이 상승하는 기간을 포함하는 생후 6주부터 12주까지에 유산균 투여에 의한 생체내 실험(in vivo)에서 혈압 저하효과를 확인하였고, 간독성도 없는 것을 확인하여 기능성 프로바이오틱 유산균임을 확인하였다.
또한 우유 및 두유 요구르트 제조시에 산생산능이 우수하여 8시간에 요구르트의 커드를 형성하므로 요구르트제조용 스타터로서도 사용이 가능함을 확인하였다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P는 그 속이 락토바실러스로서 유산균에 속하므로 락토바실러스가 사용되는 다양한 발효제품에 발효균주로서 사용이 가능하다. 브로바이오틱 균으로서 생균으로 섭취하여도 무방하다. 또한, 동물사료첨가제로 사용할 수도 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P는 내산성능과 내담즙산능이 우수하고 혈압을 낮추는 항고혈압 활성이 뛰어나고, 간독성이 없으므로 인체에 유용한 프로바이오틱 생균제로 제공할 수 있고, 발효유나 유산균 발효식품에도 활용이 가능하며, 동물사료첨가제로도 이용될 수 있어 산업적으로 매우 유용한 균이다.
본 발명은 혈압강하 기능을 가지는 프로바이오틱 유산균 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P에 관한 내용이다.
이하 실시예와 실험예를 통하여 본 균주의 특성과 기능을 보다 상세히 설명하고자 한다. 단, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지는 않는다.
실험예
1) :
락토바실러스
플란타룸
NUC
-
LG42
KCCM
10940P의 분리 및 동정
전통 가자미식해(LG)로부터 유용 균주를 MRS (Difco, USA) 배지에 Minimum bactericidal concentration (MBC) Method로 분리 후 30℃에서 16~18시간 배양 하였다. MRS 고체 배지에 자란 집락을 분리하여 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 16~18시간 다시 배양하였다. 그리고 분리된 유산균은 20% glycerol 되게 배양액에 첨가하여 -70℃에 보관하였다.
그 결과 분리된 균의 생화학적 특성과 16s rDNA sequencing을 통하여 계통학적으로 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)으로 동정되었다.
도 1은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P의 광학현미경(× 800) 사진이다. 도 2는 API KIT를 이용하여 biochemical test, assimilation test 그리고 fermentation test를 행한 당이용 특성결과이다. 도 3은 16s rDNA 의 partial sequencing(약 1.5kbp) 결과이고, 도 4는 균주의 계통도(pyrogenic tree)를 나타낸 그림이다.
이하 실시예에서 구체적인 균주의 특성과 그 효능을 설명한다.
<
실시예
1> :
내산성
테스트
유산균의 내산성능을 조사하기 위하여 MRS 배지에서 48시간 배양하여 회수한 균체와 균체에 1% lactose, 0.1% soluble starch를 첨가하여 동결건조한 분말을 각각 인공위액(pH2.5)에 1:1의 비율로 혼합하여 37℃에서 4시간 동안 진탕하고, 1시간 간격으로 sampling하여 BCP배지에 도말한 후 37℃에서 48시간 배양 후 콜로니를 계측하였다.
도 5의 인공위액에서의 내산성능 결과에서 보는 바와 같이 동결건조분말에서는 균체의 변화가 거의 없어 내산성능이 우수한 결과를 나타내었다.
<
실시예
2> :
내담즙산능
테스트
인공담즙액에서의 생존특성을 조사하기 위해서 인공위액에 균체를 혼합하여 37℃에서 4시간 동안 진탕한 혼합액을 원심분리하여 상등액은 버리고 균체만 회수하여 인공담즙액과 균체를 동량으로 첨가하여 37℃에서 24시간 진탕배양 후 BCP배 지에 도말하여 37℃에서 48시간 배양 후 집락을 계측하였다. 도 6은 0.1% 담즙산용액에서 24시간 배양 후에도 사멸하지 않고, 107이상의 균수를 유지하므로 기존의 프로바이오틱 유산균들과 비교하였을 때 유사한 생육을 나타내었다.
<
실시예
3> : 고혈압 유발
rat
를 이용한 효능검증
1) 혈압저하 효능 검증
실험동물은 본태성 고혈압 쥐(SHR)로 실험 개시일 기준으로 생후 6~7주령, 평균체중 200 g에 달하는 수컷 42마리를 중앙실험동물에서 공급받았으며, 약 10일간의 예비 사육기간을 거친 뒤 4주간 사육하였다. 사육실의 환경은 온도 23± 2℃, 습도 55± 3%, 명암 주기 12시간으로 유지하였으며, 음용수와 고형 쥐 사료를 자유로이 공급하였다. 체중은 1주에 한 번 측정하였으며, 유산균 시료는 동결건조 분말을 균수가 109/ml가 되게 물에 현탁한 균액 1ml씩을 매일 같은 시간에 경구투여 하였다.
혈압측정 방법은 측정의 오차범위를 줄이기 위해 실험쥐를 혈압측정기의 플라스틱 고정 장치에 매일 30분씩 적응시켰으며, 혈압 측정 시 충분한 혈관 확장을 위해 test chamber를 약 30℃ 정도로 데워서 사용하였다. 혈압의 측정은 실험동물의 꼬리 동맥에서 ⅡTC NIBP Sensors를 이용하여 간접적으로 혈압수치를 데이터화하고 수축기, 이완기 혈압을 혈압측정기(Indirect Blood Pressure Analyzer, 3R229 12 channel rat system, Life Science, USA)로 일주일에 한 번 측정하였다.
SHR은 생후 7주부터 혈압이 상승하여 13주령이 되면 수축기 혈압이 200 mmHg 이상을 유지하는 백서로 혈압 증가의 원인이 불분명하여 사람의 본태성 고혈압의 기전 연구에 많이 활용되어 왔다. 이런 특성을 이용하여 생후 7~8주령된 SHR에 4주 동안 유산균을 농도별로 투여한 결과, 수축기 혈압의 경우 대조군에서는 꾸준한 혈압 상승을 보였으나 유산균 투여군에서 농도별로 혈압 상승이 억제되는 것으로 나타났다(도 7). 특히 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P(‘42번’ 유산균)의 유산균 고농도(109CFU/ml) 투여군에서 혈압이 127 mmHg로 측정되어 대조군 175 mmHg에 비해 유의적인 혈압 감소가 나타났다.
도 7에서 기호의 의미는 아래와 같다. 본 실험에서 비교유산균 L. plantarum LG8도 가자미식해에서 분리된 다른 균주이고, L. plantarum NUC-LG42는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P를 나타낸다.
A : 유산균 무첨가 대조구,
B : 비교유산균 L. plantarum LG8(107CFU/ml)
C : 비교유산균 L. plantarum LG8(109CFU/ml)
D : L. plantarum NUC-LG42(107CFU/ml)
E : L. plantarum NUC-LG42(109CFU/ml)
2)
혈액중의
지질함량 분석
상기 1)에서 4주간의 유산균실험식이 급여 후 12시간 절식시키고 ether로 마취시킨 후 혈액을 채취하였다. Heparin 처리가 된 주사기로 복부 대동맥에서 혈액을 채취한 후 실온에서 30분간 방치하고 4℃, 3000 rpm에서 20분간 원심분리하여 혈장을 분리한 후 각 성분분석에 사용하였다.
분리한 혈청은 자동생화학분석기(KONELAB 20XT, Finland)를 이용하여 총 콜레스테롤(total cholesterol), HDL-cholesterol, 중성지방(triglyceride)을 측정하였다. 그 결과는 표 1(4주간 유산균을 섭취한 쥐의 혈중 콜레스테롤 함량)과 같다.
지질대사 장애에 의한 콜레스테롤 및 중성지질의 증가는 고혈압을 비롯한 당뇨병 및 열량 과잉 섭취, 간 질환, 흡연, 알콜 중독, 운동 부족 등에 의해 발병되고 심장순환기계 질환과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 혈청 중 총 콜레스테롤 농도와 중성지질 농도는 SHR 대조군에 비해 유산균 투여군에서 약간 감소하는 경향을 보였으나 유의적인 차는 아니었다(표 1). HDL 콜레스테롤 농도의 경우, SHR 대조군에 비해 유산균 투여군에서 약간씩 증가하는 경향을 보였으며, 특히 저농도의 42번 유산균을 투여한 실험군에서 HDL 콜레스테롤이 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있었다. 따라서 SHR에 42번 유산균을 섭취시킴으로서 총 콜레스테롤과 중성지질의 농도는 감소하고, HDL 콜레스테롤의 농도는 증가하는 것으로 나타났다.
| Groups | Total cholesterol (mg/dL) | Triglyceride (mg/dL) | HDL cholesterol (mg/dL) |
| 대조구 (유산균 무섭취) | 61.89±2.911) NS | 74.22±3.63NS | 36.23±5.56bc |
| 비교유산균 L. plantarum LG8(107CFU/ml) | 57.54±4.61 | 67.85±3.94 | 46.52±12.55abc |
| 비교유산균 L. plantarum LG8(109CFU/ml) | 59.51±3.22 | 69.23±4.38 | 48.76±3.15a |
| L. plantarum NUC-LG42 (107CFU/ml) | 58.72±4.96 | 70.30±5.27 | 49.78±1.44a |
| L. plantarum NUC-LG42 (109CFU/ml) | 58.50±1.95 | 67.32±3.37 | 47.19±12.41ab |
1)Values are expressed as mean± SD.
Different superscripts in the same column indicate significant differences between groups at p<0.05 by Duncan's multiple comparison test.
3) 혈장 내
AST
및
ALT
활성
AST(Aspartate aminoTransferase)와 ALT(Alanine aminoTransferase)는 생체 내 아미노산을 형성하는 역할을 하는 효소로서 여러 장기세포에 존재하지만 그 중 간에 가장 많은 양이 존재하며, 약물이나 외부적 스트레스에 의해 간조직이 손상을 받으면 혈액 중 이들 효소들의 활성이 증가하게 된다. 따라서 혈중 AST와 ALT의 활성 측정은 간 기능을 살펴보는 하나의 지표가 된다. 혈장 중 AST, ALT의 활성을 측정한 결과는 표 2(혈장내의 AST 및 ALT 활성)과 같다. AST의 활성은 SHR 대조군과 유의적인 차이가 없었으나, AST의 경우, SHR 대조군에 비해 42번 유산균 저농도 투여군에서 약간 높게 나타났다(표 2). 42번 고농도 투여군의 경우 대조군과 유의적인 차이가 없는 것을 감안한다면 42번 저농도 투여군은 시료의 독성으로 인한 AST 활성의 증가가 아닌 혈압 측정에 따른 스트레스 등의 다른 원인에 의한 AST 활성의 증가가 나타난 것으로 생각된다. 따라서 유산균의 장기 투여에 따른 간독성 유발 문제는 그다지 높지 않을 것을 시사한다.
| Groups | AST (IU/L) | ALT (IU/L) |
| 대조구 (유산균 무섭취) | 108.78±24.681) abc | 56.27±6.86bc |
| 비교유산균 L. plantarum LG8(107CFU/ml) | 109.27±20.83abc | 57.11±11.06c |
| 비교유산균 L. plantarum LG8(109CFU/ml) | 91.95±2.88cd | 56.91±7.52bc |
| L. plantarum NUC-LG42 (107CFU/ml) | 94.74±11.58bcd | 66.50±9.59a |
| L. plantarum NUC-LG42 (109CFU/ml) | 110.06±32.92a | 60.73±15.09bc |
1)Values are expressed as mean±SD.
Different superscripts in the same column indicate significant differences between groups at p<0.05 by Duncan's multiple comparison test.
<
실시예
4>
락토바실러스
플란타룸
NUC
-
LG42
균주로 제조한 요구르트의 특성
락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 균주의 동결건조 분말(1010CFU/g)을 시판 우유(서울우유) 및 두유(두유로 굿모닝, 매일유업)에 0.8~1.0 중량%가 되게 첨가하여 42℃에서 8시간 발효한 요구르트의 사진은 도 8(락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 균주로 제조한 요구르트)과 같다.
유청의 분리가 일어나지 않고 부드러운 호상 요구르트의 물성을 나타내어 요구르트스타터로서도 적합하다고 판단되었다.
도 1은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P의 광학현미경(× 800) 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P의 특성 및 당이용능 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P의 16s rDNA 의 partial sequencing(약 1.5kbp) 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P의 계통도(pyrogenic tree)를 나타낸 그림이다.
도 5는 인공위액에서의 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P의 내산성능 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P의 내담즙산능 결과를 나타낸다.
도 7은 4주간 유산균 투여에 의한 혈압의 변화를 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 균주로 제조한 요구르트의 사진이다.
Claims (3)
- 락토바실러스 플란타룸 NUC-LG42 KCCM 10940P 균주.
- 청구항 1에 기재된 균주를 이용한 배양물.
- 청구항 1에 기재된 균주를 포함하는 발효 제품.
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