KR20240060001A - 황산 콘드로이친 함량이 증대된 해삼 추출물의 제조 방법 - Google Patents

황산 콘드로이친 함량이 증대된 해삼 추출물의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 해삼 추출물의 제조 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 황산 콘드로이친, 조단백질 및 총 다당체 함량이 증대된 해삼 추출물의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 본 발명에 따른 제조 방법은 해삼 수용액에 단백질 분해효소를 첨가하여 가수분해하여 가수분해물을 제조하는 단계; 상기 가수분해물에 미생물을 첨가하여 발효시키는 단계; 및 상기 발효물을 여과하여 해삼 추출물을 제조하는 단계를 포함한다.

Description

황산 콘드로이친 함량이 증대된 해삼 추출물의 제조 방법{METHOD FOR PREPARING HOLOTHUROIDEA EXTRACT WITH INCREASED CHONDROITIN SULFATE CONTENT}
본 발명은 해삼 추출물의 제조 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 황산 콘드로이친 함량이 증대된 해삼 추출물의 제조 방법에 관한 것이다.
해삼(Holothuroidea)은 극피동물 해삼강에 속하는 동물을 총칭하는 단어로써 몸은 길쭉한 원통형 모양이고 등에는 작은 돌기가 난 형태이다. 체벽의 근육에 석회질의 골편들이 퍼져있으며 몸 전체가 점액성 물질로 덮여져 있다. 전 세계의 바다에 분포하고 있으며, 세계적으로 약 900여 종이 알려져 있고 저서성 생물로써 바닷속의 암석, 진흙, 모래 등에 살며 해수 내의 현탁물이나 퇴적물을 먹고 산다. 크게 청삼, 흑삼, 홍삼으로 구별하기도 하는데 이는 해삼의 체색에 따른 분류법으로 외양성 암초에서 발견되는 해삼은 홍조류를 주로 섭취하여 적색, 갈적색을 띠고, 내만에서 발견되는 해삼은 바닥 흙의 유기물을 섭취하여 청록색이나 흑색을 띠고 있다.
해삼을 식품으로 섭취하는 나라는 극히 적은 편으로 한국, 중국, 일본, 동남아 및 지중해 연안의 일부 국가이다. 우리나라의 경우 예로부터 '바다에서 나는 삼'이라는 뜻의 해삼으로 불려왔고, 한의학에서 한약재로도 사용되기도 했다. 해삼은 90%가량이 수분으로 구성되어 있으며, 단백질과 무기질이 3% 내외이고 지방은 0.2%로 거의 없는 편이다. 해삼은 주요 효능 성분으로 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan), 사포닌, 뮤신, 다당류 등이 언급된다.
글리코사미노글리칸은 뮤코다당류들의 통칭으로, 길고 가지가 없는 이당류 반복으로 된 구조이다. 글리코사미노글리칸은 뮤코다당류로서 길고 가지가 없는 이당류 반복의 성분 중 하나가 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucoseamine)이나 N-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)인 아미노당이며, 황산을 가진 당 분자를 보유한 것을 통칭한다. 대부분 단백질에 글리코사미노글리칸 분자가 결합 된 프로테오글리칸(Proteoglycan) 형태로 존재하며, 이는 생물체들의 세포외기질, 관절 등의 중요한 성분이다.
글리코사미노글리칸은 이당류의 종류 및 기능에 따라 6가지로 크게 나뉘는데 그중 하나가 관절 및 연골 건강에 도움을 줄 수 있다고 알려진 황산 콘드로이친이다. 몸을 지탱하는 뼈와 뼈를 연결하는 관절 및 연골은 체내 칼슘, 단백질 등이 부족하거나 관절에서 염증이 발생함으로써 골다공증, 골관절염 등 다양한 질환이 발생할 수 있으며, 기능이 유지되지 않으면 신체적으로 큰 불편을 초래한다.
그로 인해 최근 관절 건강을 위한 건강기능성식품 등의 소비가 증대되고 있으며, 이와 관련된 기능성 원료의 발굴도 이어지고 있다. 건강기능성 개별인정형 원료로 등록된 황산 콘드로이친은 소 연골에서 유래된 제품이며, 최근에는 소 연골 황산 콘드로이친 제품의 체내 흡수율이 낮다고 언급되며 비교적 분자량이 낮은 상어 연골 유래 제품도 다수 판매되고 있다.
그러나 국내 연안에는 상어 대형종이 드물며 잡기가 어렵고, 일부가 멸종 위기종 또는 보호종으로 등록되어 있어 포획할 수 없는 경우가 많으므로 장기적으로 보았을 때, 직접 가공 원료로써도 부적합하고 상어 포획에 큰 금액이 소요된다고 하므로 기능성 원료로의 활용도는 다방면으로 불리한 점이 있다고 판단된다. 현재 국내에서 판매되는 상어 연골 유래 황산 콘드로이친 제품은 수입한 상어 연골 분말을 투입한, 단순 가공품이다.
한국등록특허 제10-0343781호는 가오리로부터 콘드로이틴 황산을 추출 및 정제하는 방법을 개시한다. 또한, 한국등록특허 제10-0167831호는 해삼 추출물을 단백질 분해 효소로 처리하여 콘드로이틴 황산을 추출하는 방법을 개시한다.
본 발명은 해삼에 효소가수분해 및 발효 처리를 통해 황산 콘드로이친 함량이 증대된 해삼 추출물의 제조 방법을 제공하고자 한다.
상기한 과제는, 해삼 수용액에 해삼 건조 중량 대비 3~7 중량%의 단백질 분해효소를 첨가하여 2~5시간 동안 55~70℃의 온도에서 가수분해하여 가수분해물을 제조하는 단계; 상기 가수분해물에 해삼 건조 중량 대비 0.1~1.5 중량%의 미생물을 첨가하여 발효시키는 단계; 및 상기 발효물을 여과하여 해삼 추출물을 제조하는 단계를 포함하는, 해삼 추출물의 제조 방법에 의해 달성된다.
바람직하게는, 상기 해삼 수용액은 세절 및 세척한 해삼을 80~90℃의 정제수에 넣고 1~2시간 가열하여 자숙 해삼을 제조하는 단계; 상기 자숙 해삼을 세절하고 정제수와 혼합하여 1~5 %(w/w) 농도의 수용액을 제조하는 단계; 및 상기 수용액을 15,000~20,000 rpm으로 5~15분간 교반하고, 100℃로 30분~1시간 동안 가열하여 해삼 수용액을 제조하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 단백질 분해효소는 알칼레이즈일 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 미생물은 락티카제이바실러스 파라카세이(Lacticaseibacillus paracasei)일 수 있다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 해삼 추출물은 해삼 열수 추출물과 대비하여 황산 콘드로이친 함량이 증가하고, 조단백질 및 총다당체 함량도 증가한다.
도 1a는 해삼 열수 추출물에 알칼레이즈(Alc), 플레이버자임(Fla) 및 프로타멕스(Pro)로 각각 처리하여 제조한 해삼 추출물의 조 단백질 함량을 측정한 결과이고, 도 1b는 총 다당체 함량을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 2a는 해삼 열수 추출물에 알칼레이즈(Alc), 셀룰클라스트(Cel), 프로타멕스(Pro), 알칼레이즈+셀룰클라스트(A+C), 알카라아제+프로타멕스(A
+P)로 각각 처리하여 제조한 해삼 추출물의 조 단백질 함량을 측정한 결과이고, 도 2b는 총 다당체 함량을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 3a는 해삼 열수 추출물에 알칼레이즈(Alc) 단독, 알칼레이즈 처리 후 아스퍼질러스 카와이 발효(A-AK, 10: 발효 12시간, 24: 발효 24시간, 48: 발효 48시간), 알칼레이즈 처리 후 아스퍼질러스 오리자에 발효(A-AO), 알칼레이즈 처리 후 락티카제이바실러스 파라카세이 발효(A-ML), 알칼레이즈 처리 후 사카로마이세스 세레비지애 발효(A-SC)로 각각 제조한 해삼 추출물의 조 단백질 함량을 측정한 결과이고, 도 3b는 총 다당체 함량을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 4a는 해삼 열수 추출물에 알칼레이즈(Cu-A) 단독, 알칼레이즈 처리 후 아스퍼질러스 카와이 발효(CU-AK, 10: 발효 12시간, 24: 발효 24시간), 알칼레이즈 처리 후 락티카제이바실러스 파라카세이 발효(Cu-ML)로 제조한 해삼 추출물의 조 단백질 함량을 측정한 결과이고, 도 4b는 총 다당체 함량을 측정한 결과이고, 도 4c는 황산 콘드로이친 함량을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 5a는 알칼레이즈 처리 후 락티카제이바실러스 파라카세이로 24시간 발효시켜 제조한 해삼 추출물 동결 건조물의 조 단백질 함량을 측정한 결과이고, 도 5b는 총 다당체 함량을 측정한 결과이고, 도 5c는 황산 콘드로이친 함량을 측정한 결과를 도시한 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
본 발명은 황산 콘드로이친, 조단백질 및 총 다당체 함량이 증대된 해삼 추출물의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 제조 방법은 아래의 단계들을 포함한다:
해삼 수용액에 단백질 분해효소를 첨가하여 가수분해하여 가수분해물을 제조하는 단계(S11); 상기 가수분해물에 미생물을 첨가하여 발효시키는 단계(S12); 및 상기 발효물을 여과하여 해삼 추출물을 제조하는 단계(S13).
이하 각 단계를 상세히 설명한다.
먼저, 해삼 수용액을 제조하고, 단백질 분해효소를 이용하여 가수분해물을 제조한다(S11).
상기 해삼 수용액은 세절 및 세척한 해삼을 80~90℃의 정제수에 넣고 1~2시간 가열하여 자숙 해삼을 제조하는 단계; 상기 자숙 해삼을 세절하고 정제수와 혼합하여 1~5 %(w/w) 농도의 수용액을 제조하는 단계; 및 상기 수용액을 15,000~20,000 rpm으로 5~15분간 교반하고, 100℃로 30분~1시간 동안 가열하여 해삼 수용액을 제조하는 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다.
상기 해삼 수용액에 해삼 건조 중량 대비 3~7 중량%의 단백질 분해효소를 첨가하여 2~5시간 동안 55~70℃의 온도로 가수분해할 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 노보자임사(Novozyme)의 알칼레이즈(Alcalase), 플레이버자임(Flavourzyme) 및 프로타멕스(Protamex)로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에 따르면 상기 가수분해는, 알칼레이즈 처리 후 프로타멕스를 처리하는 복합처리를 할 수 있다. 바람직하게는, 상기 단백질 분해효소는 알칼레이즈일 수 있다. 가수분해가 완료되면, 상기 가수분해물을 가열하여 실활시킬 수 있다. 실활 온도는 공지의 온도에 따른다.
다음으로, 상기 가수분해물에 미생물을 첨가하여 발효시킨다(S12). 상기 미생물은 해삼 건조 중량 대비 0.1~1.5 중량%로 첨가될 수 있고, 10~24시간 동안, 바람직하게는 12시간 동안 발효시킨다. 상기 미생물은 아스퍼질러스 카와이(Aspergillus kawachii), 아스퍼질러스 오리자애(Aspergillus oryzae), 락토바실러스 파라카세이(Aspergillus oryzae) 또는 사카로마이에스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다. 바람직하게는 상기 미생물은 락토바실러스 파라카세이이다.
발효가 완료되면, 상기 발효물을 여과하여 해삼 추출물을 제조한다(S13). 여과된 해삼 추출물은 동결 건조하여 분말 형태로 음료, 일반 식품, 건강기능식품 등에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 해삼 추출물은 황산 콘드로이친, 조단백질 및 총 다당체 함량이 해삼의 열수 추출물과 대비하여 현저히 증가한다.
이하에서 실시예 및 실험예를 들어서 본 발명을 상세하게 설명하지만, 이들 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다.
제조예 1: 해삼 열수 추출물 제조
해삼은 체내에 흙, 모래 등을 품고 있는 경우가 많으므로 30℃ 미만 온도의 정제수에 넣고 3회 세절하여 일부 불순물을 제거하였다. 해삼을 80℃ 이상 온도의 정제수에 넣고 1시간 이상 가열하여 해삼을 자숙시키고 이를 재차 세절하였다. 자숙한 해삼을 3%의 수용액으로 제조한 뒤 18,000 rpm에서 10분 내외로 균질하고 이를 100℃에서 30분 이상 가열 살균하여 해당 수용액을 효소가수분해 및 발효하는데 사용하였다.
실시예 1: 단일 가수분해효소를 이용한 해삼 추출물 제조공정 개발
해삼 추출물의 글리코사미노글리칸 추출 및 이의 함량 증대 추출 공법을 개발하기 위해 단일 효소를 적용하고 분석을 통해 적합한 효소를 추적하였다. 가수분해효소의 활성을 최대화하기 위해 효소 별 활성 조건에 맞춰 pH를 조절하고 적정 온도에서 반응을 진행한 후, 고온에서 실활하여 반응을 정지시키고 이의 여과액을 추출물로 활용하였다. 해당 추출물을 이용하여 분석을 진행한 후, 실험 내용을 바탕으로 단일 효소 가수분해 공정을 확립하였다.
단일 효소를 활용한 실험은 효소를 적용하지 않은 동일 시료 조건의 대조구와 노보자임(Novozyme) 사의 단백질 분해효소인 알칼레이즈, 프로타멕스, 플레이버자임 총 3종을 적용하여 진행하였다.
효소 기질 pH 온도 ℃
Alcalase 단백질 6.5 ~ 8.5 55 ~ 70
Flavourzyme 5.0 ~ 7.0 50
Protamex 5.5 ~ 7.5 35 ~ 60
시료명 효소 효소농도 시료농도 처리시간
0 CON 대조구 / 효소X - 5% -
1 Alc Alcalase 기질대비
5%		 3시간
2 Fla Flavouzyme
3 Pro Protamex
1-1) 해삼 가수분해 추출물의 황산 콘드로이친 함량 측정
상기 제조된 열수 추출물을 단일 효소의 최적 pH로 조정한 후 효소를 5%씩 첨가하였다. 효소의 첨가비는 해삼의 중량을 기준으로 첨가하였다. 효소를 첨가한 시료는 각각의 최적 온도와 100~150rpm으로 설정된 진탕기에서 반응시켰고, 3시간 경과 후 100℃에서 30분간 살균하여 시료를 취했다. 취한 시료는 현대마이크로(대한민국) 사의 No. 100 여과지(Thickness: 0.16mm, 5um)로 1차 여과 후, 2,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 분석을 진행하였다.
가시광선 분광광도계(UV/Vis Spectrophotometer)를 활용하여 총다당체를 측정하였고, 단백질 증류 정량기(Kjeldahl Distillation System)을 활용하여 조단백질을 측정하였으며, 한국기능식품연구원에 의뢰하여 황산 콘드로이친 함량을 측정하였다.
1-2) 해삼 가수분해 추출물의 총다당체 함량 측정
상기 제조된 가수분해 추출물 시료 200uL에 5% Phenol 용액 1mL, 진한 황산 5mL을 혼합하여 20분 동안 반응시킨 후 490nm에서 측정하였다. 만노즈(Mannose)를 표준용액으로 사용하여, 시료 중 만노즈 함량으로 결과를 나타냈다.
1-3) 해삼 가수분해 추출물의 조단백질 함량 측정
상기 제조된 가수분해 추출물 시료 1g에 분해촉진제로 황산칼륨 2g, 진한 황산 12mL을 넣고 킬달 분해장치에서 시료가 연한 미색에서 무색이 될 때까지 탄화하였다. 탄화물을 단백질 증류 정량기기를 활용하여 증류, 중화 및 적가하여 조단백질 함량을 측정하였다.
2-4) 결과
해삼 추출물에 3종의 상업용 단백질 효소를 적용하여 유효성분의 함량을 확인한 결과를 도 1에 나타냈다. 도 1a를 보면, 조단백질은 알칼레이즈, 프로타멕스는 증가하였으나, 플레이버자임은 대조구보다 감소하였다. 도 1b를 보면, 총다당체는 모두 증가하였으나, 알칼레이즈, 프로타멕스, 플레이버자임 순으로 감소하는 경향을 보였다. 황산 콘드로이친은 아미노기를 보유한 다당류이므로, 조단백질과 총다당체 모두 높은 경향의 효소가 적합하다는 판단하에 단일 효소로써 알칼레이즈가 가장 적합하다고 평가되었다.
실시예 2: 복합 가수분해효소를 이용한 해삼 추출물 제조공정 개발
상기 단일 가수분해효소 적용을 통해 알칼레이즈 단일 적용이 적합하다고 판단되었으나, 보다 효능 성분을 증진시키기 위해 조단백 함량이 알칼레이즈보다 높았던 프로타멕스와 다당류 분해에 사용되는 셀룰클라스트를 적용하여 적합한 복합처리 효소를 추적하였다. 상기 실험과 모든 조건은 동일하였으며 실험 또한 동일한 방법으로 진행하였다.
효소 기질 pH 온도 ℃
Alcalase 단백질 6.5 ~ 8.5 55 ~ 70
Cellulclast 4.5 ~ 6.0 50 ~ 60
Protamex 5.5 ~ 7.5 35 ~ 60
시료명 효소 효소농도 시료농도 처리시간
0 CON 대조구 / 효소X - 5% -
1 Alc Alcalase 기질대비
5%		 3시간
2 Cel Cellulclast
3 Pro Protamex
4 A+C Alcalase+Cellulclast 각 기질대비
2.5%
5 A+P Alcalase+Protamex
해삼 추출물에 1차 효소로 알칼레이즈를 적용하고 2차 효소로 셀룰클라스트, 프로타멕스를 적용하여 조단백질, 총다당체의 함량을 확인했다. 그 결과를 도 2에 나타냈다. 도 2a를 보면, 조단백질은 셀룰클라스트 복합, 프로타멕스 복합 모두 알칼레이즈 단일보다 증가하였으나, 크게 유의적이지 않았다. 도 2b를 보면, 총다당체는 프로타멕스 복합이 가장 낮았으며 알칼레이즈, 셀룰클라스트 복합 순으로 증가하는 경향을 보였으나, 이 또한 크게 유의적이지 않았다. 알칼레이즈와 셀룰클라스트 복합 처리에서 조단백질과 총다당체 모두 증대 효과가 보였으나, 그 양이 미미하여 유의적이지 않으므로 최종적으로 효소처리는 알칼레이즈 단독 처리를 수행하는 것이 적합하다고 평가되었으며, 이의 추가적인 발효 처리 시도가 필요하다고 판단되었다.
실시예 3: 가수분해효소 및 발효를 이용한 해삼 추출물 제조공정 개발
상기 복합 가수분해효소 적용을 통해 알칼레이즈와 셀룰클라스트 복합처리가 좋다고 평가되었으나, 증가량이 미미하여 극적인 효과가 있는 것이 아니므로 시간 및 금액적인 부분을 고려하여 알칼레이즈 단일 적용으로 진행하고 추가적으로 균을 적용하여 적합한 균주를 추적하였다. 해삼 추출물에 1차 효소로 단백질 분해효소인 알칼레이즈를 적용하고 AK(Aspergillus luchuensis; kawachii), AO(Aspergillus oryzae), ML(Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans), SC(Saccharomyces cerevisiae) 4종의 균을 적용하여 10시간, 24시간, 48시간 발효하고 유효성분의 함량을 확인했다. 상기 실험과 모든 조건은 동일하였으며 실험 또한 동일한 방법으로 진행하였다.
No 시료명 효소 효소농도 시료농도 처리시간
0 CON 대조구 / 효소X - 5% -
1 Alc Alcalase 효소농도
기질대비
5%

균주
동량		 3시간
2 A-AK10 Alcalase ▶
Aspergillus luchuensis; kawachii		 효소3 ▶ 발효 12시간
3 A-AK24 효소3 ▶ 발효 24시간
4 A-AK48 효소3 ▶ 발효 48시간
5 A-AO10 Alcalase ▶
Aspergillus oryzae		 효소3 ▶ 발효 12시간
6 A-AO24 효소3 ▶ 발효 24시간
7 A-AO48 효소3 ▶ 발효 48시간
8 A-ML10 Alcalase ▶
Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans		 효소3 ▶ 발효 12시간
9 A-ML24 효소3 ▶ 발효 24시간
10 A-ML48 효소3 ▶ 발효 48시간
11 A-SC10 Alcalase ▶
Saccharomyces cerevisiae		 효소3 ▶ 발효 12시간
12 A-SC24 효소3 ▶ 발효 24시간
13 A-SC48 효소3 ▶ 발효 48시간
해삼 추출물에 1차 효소로 알칼레이즈를 적용하고 AK, AO, ML, SC 총 4종의 균주를 접종하여 10, 24, 48시간 발효한 후 조단백질, 총다당체의 함량을 확인했다. 그 결과를 도 3에 나타냈다. 도 3a를 보면, 조단백질은 알칼레이즈 단일은 증가하였으나, 발효 후 감소하였다. AK, ML의 경우 서서히 다시 증가하여 알칼레이즈와 비슷한 경향을 보였으며 AO, SC는 서서히 감소하다가 48시간에 증가하는 경향을 보였다. 도 3b를 보면, 총다당체는 발효 이후 알칼레이즈 단일 대비 대폭 증가하는 경향을 보였다. 최소 3배에서 최대 5배까지 증가하였는데, 그중 ML 처리구가 가장 높게 증가하였다. AO, SC의 경우 조단백질, 총다당체 모두 함량이 감소하는 경향을 보여 적용하지 않는 것이 좋다고 평가되었다. AK, ML의 경우 조단백질은 감소하다가 증가하는 경향을 보였으나, 총다당체가 대폭 증가하여 해당 균주를 적용하고 황산 콘드로이친 함량을 확인할 필요가 있다고 판단되었다.
실시예 4: 가수분해효소 및 발효를 이용한 해삼 추출물 제조공정 개발
상기 가수분해효소 및 발효 적용을 통해 알칼레이즈 처리 후 AK, ML 처리구에서 총다당체가 대폭 증가하였으므로 이를 재차 적용 후 목표 유효성분인 황산 콘드로이친의 함량을 확인하고 최종적으로 적합한 균주를 확립하고자 하였다.
해삼 추출물에 1차 효소로 알칼레이즈를 적용하고 AK, ML 2종의 균을 적용하여 24시간 발효하고 유효성분의 함량을 확인했다.
No 시료명 효소 효소농도 시료농도 처리시간
0 CU-C
(CON)		 대조구 / 효소X - 5% -
1 CU-A
(Alc) 		Alcalase 효소농도
기질대비
5%

균주
동량		 3시간
2 CU-AK10 Alcalase ▶ Aspergillus luchuensis; kawachii 효소3 ▶ 발효 12시간
3 CU-AK24 효소3 ▶ 발효 24시간
5 CU-ML10 Alcalase ▶ Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans 효소3 ▶ 발효 12시간
6 CU-ML24 효소3 ▶ 발효 24시간
상기 제조된 가수분해 발효 추출물 시료를 한국기능식품연구원에 황산 콘드로이친 제1법을 의뢰하여 측정하였다. 해삼 추출물에 1차 효소로 알칼레이즈를 적용하고 AK, ML 총 2종의 균주를 접종하여 24시간 발효한 후 조단백질, 총다당체, 황산 콘드로이친의 함량을 확인했다. 그 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4a를 보면, 조단백질은 선행 분석과 같이 알칼레이즈 단일은 증가하고 발효 후 감소하였으며, 총다당체도 AK는 증가하다가 감소, ML은 서서히 증가하는 경향을 보였다(도 4,b). 도 4c를 보면, 황산 콘드로이친은 대조구와 가수분해 처리구는 낮았다가, 발효 후 대폭 증가하였으며 총다당체와 비슷한 경향을 보였다.
최종적으로 알칼레이즈 처리 후 락티카제이바실러스 파라카세이 균주로 발효하는 것이 적합하다고 판단되었다. 황산 콘드로이친 함량으로 보면 12시간만 발효하는 것으로도 적합해 보이나, 총다당체 함량이 24시간이 보다 높고, 황산 콘드로이친은 총다당체의 경향과 비슷하므로 최종적으로 24시간 발효가 적합하다고 판단되었다.
실시예 5: 최종 해삼 추출물 분석
선행에 따라 알칼레이즈와 ML 24시간 발효로 추출물을 제조하고 주식회사 오페론(대한민국) 사의 진공동결건조기(FDT-8612)를 활용해 해삼 추출물 수용액의 동결건조를 진행하였다. 최종적으로 나온 해삼 추출물 동결건조물을 1% 농도로 희석하여 유효성분의 함량을 확인했다. 해삼 동결건조물의 조단백질, 총다당체, 황산 콘드로이친의 함량을 확인했다. 그 결과를 도 5에 나타냈다. 도 5를 보면, 조단백질 43368.8 mg/100g, 총다당체 50844.0 mg/L(ppm), 황산 콘드로이친 7.90%를 나타냈다. 조단백질과 황산 콘드로이친은 액상 추출물 대비 약 20배가량 증가하였으며, 총다당체는 약 10배가량 증가하였다. 황산 콘드로이친 단일 함량은 낮은 편이라고 평가할 수도 있으나, 단백질과의 혼합제제로서의 가능성이 있을 것으로 판단된다.

Claims (4)

  1. 해삼 수용액에 해삼 건조 중량 대비 3~7 중량%의 단백질 분해효소를 첨가하여 2~5시간 동안 55~70℃의 온도에서 가수분해하여 가수분해물을 제조하는 단계;
    상기 가수분해물에 해삼 건조 중량 대비 0.1~1.5 중량%의 미생물을 첨가하여 발효시키는 단계; 및
    상기 발효물을 여과하여 해삼 추출물을 제조하는 단계를 포함하는, 해삼 추출물의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 해삼 수용액은
    세절 및 세척한 해삼을 80~90℃의 정제수에 넣고 1~2시간 가열하여 자숙 해삼을 제조하는 단계; 상기 자숙 해삼을 세절하고 정제수와 혼합하여 1~5 %(w/w) 농도의 수용액을 제조하는 단계; 및
    상기 수용액을 15,000~20,000 rpm으로 5~15분간 교반하고, 100℃로 30분~1시간 동안 가열하여 해삼 수용액을 제조하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 해삼 추출물의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 알칼레이즈인 것을 특징으로 하는, 해삼 추출물의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 락티카제이바실러스 파라카세이(Lacticaseibacillus paracasei)인 것을 특징으로 하는, 해삼 추출물의 제조 방법.
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