KR20240057482A - 바질 발효물을 포함하는 신경염증 질환 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

바질 발효물을 포함하는 신경염증 질환 치료 또는 예방용 조성물 Download PDF

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KR20240057482A
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Abstract

본 발명은 바질 발효액 또는 바질 발효물의 추출물을 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바질 발효액 또는 바질 발효물의 추출물은 소교세포에 세포독성을 나타내지 않으면서, NO 생성을 억제하고 염증성 사이토카인의 분비를 억제하여 소교세포에서 신경염증을 효과적으로 제어하는 효과가 있으므로, 신경염증성 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

바질 발효물을 포함하는 신경염증 질환 치료 또는 예방용 조성물{Composition for preventing or treating neuroinflammatory disease comprising fermented basil}
본 발명은 바질 발효물을 포함하는 신경염증 질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
중추신경계는 신경세포와 신경교세포로 이루어져 있다. 신경교세포는 전체 뇌세포의 약 90%를 차지하며, 부피로는 뇌 전체의 약 50%를 차지하고 있다. 신경교세포는 다시 성상세포(astrocytes), 소교세포(microglia) 및 희소 돌기아교세포(oligodendrocytes)의 세 종류로 분류할 수 있다. 이중 소교세포는 뇌에 존재하며 정상일 때 면역 세포로 작용하며 CNS 발달에 기여할 뿐만 아니라 세포 사멸, 신경 세포 생존 및 조직 항상성을 유지하기 위한 시냅스 생성을 지원한다. lipopolysaccharide(LPS), amyloid-β(Aβ), α-synuclein와 같은 다양한 자극이 소교세포의 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 소교세포가 활성화되면 IL-6, IL-1β, TNFα를 포함한 전염증 인자를 분비하고 NO와 ROS 생성을 증가시켜 뉴런을 손상시킬 수 있다.
상기 소교세포는 분화된 대식세포(specialized macrophage)의 일종으로, 조직 잔해 및 죽은 세포들을 삼키는 식세포로서 작용할 뿐 아니라 뇌의 생체방어활동에 중요한 역할을 한다. 또한, 소교세포는 만성뇌질환에 있어서 다양한 신경 독소 및 전염증 매개체를 분비함으로써 신경염증 질환을 증가시켜 신경세포사 및 탈수초의 원인이 된다. 뇌손상 또는 신경성염증 자극에 대한 반응으로, 소교세포는 산화질소(nitric oxide, NO), 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS), 전염증성 사이토카인, 프로스타글란딘 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 등을 생산함으로써 신경염증 질환에 관여한다.
이러한 염증세포로서의 소교세포의 역할이 항상 유익한 것은 아니며, 조절되지 않은 소교세포의 활성화는 지속적으로 과도한 신경염증을 유발하여 퇴행성 신경질환을 포함하는 다양한 중추신경계 병리의 원인이 되고 있다. 신경염증은 신경계의 면역 반응의 일종으로, 알츠하이머, 파킨슨병, 다발성 경화증을 포함하는 많은 퇴행성 신경 질환과 매우 밀접하게 연관되어 있으며, 현재 퇴행성 신경 질환의 전형적 특징으로 생각되고 있다.
이에 따라 소교세포에 세포독성을 나타내지 않으면서, 염증성 사이토카인의 증가를 현저하게 억제하고, 소교세포에서 NO 생성을 억제하여 신경염증을 효과적으로 제어할 수 있는 물질의 개발이 필요하다.
대한민국공개특허 제10-2007-0042405호(2007년04월23일)
본 발명에서는 설탕으로 발효한 바질의 발효 상등액과 발효물의 추출물이 소교세포에 세포독성을 나타내지 않으면서, NO 생성을 억제하고 염증성 사이토카인의 분비를 억제하여 소교세포에서 신경염증을 효과적으로 제어할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 목적은 바질 발효액 또는 바질 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 바질 발효액 또는 바질 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.
이하 본 명세서에 대하여 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각에 대한 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기에 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 명세서에서 사용되는 「포함하는」과 같은 표현은, 해당 표현이 포함되는 문구 또는 문장에서 특별히 다르게 언급되지 않는 한, 다른 실시예를 포함할 가능성을 내포하는 개방형 용어(open-ended terms)로 이해되어야 한다.
본 발명의 설명 및 청구범위에서 사용된 용어나 단어는, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선을 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 바질 발효액 또는 바질 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 신경염증성 질환은 다발성 경화증, 신경모세포종, 뇌졸중, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 루게릭 병, 헌팅턴 병, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증, 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 용어 "바질"은 학명은 Ocimum basilicum이다. 상기 바질은 바질의 전초 또는 지상부 또는 지하부일 수 있다. 상기 지상부는 줄기, 잎, 꽃 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 지하부는 뿌리일 수 있다. 상기 바질은 바질의 지상부로 구체적으로 바질의 잎을 사용할 수 있다.
상기 바질은 자연적으로 생장하였거나 또는 인위적으로 재배된 것일 수 있다. 실내에서 종자를 발아시켜 재배한 것일 수 있고, 또는 일반적으로 판매되는 바질일 수 있다.
상기 바질 발효액 또는 바질 발효물은 생바질 중량 대비 15 내지 25 중량%의 설탕으로 발효하여 얻은 것일 수 있으며, 구체적으로 생바질 중량 대비 20 중량%의 설탕으로 발효하여 얻은 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "생바질"은 건조된 바질에 대응하는 의미로 건조되지 않은 바질을 의미한다.
상기 바질 발효액은 발효된 바질의 상등액일 수 있으며, 생바질 중량 대비 15 내지 25 중량%의 설탕, 구체적으로 20 중량%의 설탕으로 발효된 바질의 상등액일 수 있다.
상기 바질 발효물은 바질 발효물의 에탄올 추출물일 수 있으며, 생바질 중량 대비 15 내지 25 중량%의 설탕, 구체적으로 20 중량%의 설탕으로 발효된 바질 발효물의 에탄올 추출물일 수 있다.
상기 용어 "바질 발효물"은 발효한 바질에서 상등액을 분리하고 남은 고체 성분에 해당하는 건더기 부분을 의미한다. 상기 바질 발효물은 바질 발효물의 에탄올 추출물일 수 있다.
상기 에탄올 추출물은 발효한 바질에서 상등액을 분리하고 남은 건더기 부분에 에탄올을 가하여 1 내지 4시간 동안 70~80℃에서 환류 추출하여 얻은 추출액을 여과한 후 감압농축하여 얻을 수 있다. 상기 에탄올은 50~90%(v/v)의 에탄올을 사용할 수 있다.
상기 바질 발효는 3 내지 28일 동안 진행될 수 있으며, 구체적으로 6 내지 14일 동안 진행될 수 있다.
상기 바질 발효액 또는 바질 발효물은 생바질 중량 대비 20 중량%의 설탕으로 3 내지 28일 동안 구체적으로 6 내지 14일 동안 발효하여 얻을 수 있다.
또한, 상기 바질 발효물은 생바질 중량 대비 20 중량%의 설탕으로 9일 동안 발효한 바질 발효물의 에탄올 추출물일 수 있다.
또한 본 발명에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
상기 약학 조성물은, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 바질 발효액 또는 바질 발효물의 추출물은 유효성분으로 1일 0.001 내지 500 mg/kg으로, 구체적으로 0.1 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 바질 발효액 또는 바질 발효물의 추출물을 0.001 내지 50% 중량 백분율로 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로, 본 발명은 바질 발효액 또는 바질 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "바질 발효액", "바질 발효물의 추출물", "신경염증성 질환"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 바질 발효액 또는 바질 발효물의 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 바질 발효액 또는 바질 발효물의 추출물 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용되는 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 유효성분은 원료 조성물 중 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
본 발명은 바질 발효액 또는 바질 발효물의 추출물을 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바질 발효액 또는 바질 발효물의 추출물은 소교세포에 세포독성을 나타내지 않으면서, NO 생성을 억제하고 염증성 사이토카인의 분비를 억제하여 소교세포에서 신경염증을 효과적으로 제어하는 효과가 있으므로, 신경염증성 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 제조된 바질 자연발효물의 에탄올 추출물과 실시예 2에서 제조된 바질 자연발효물의 에탄올 추출물(20%)을 처리한 후 소교세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다 (Ctrl: 무처리, LPS: 음성대조군, PC: 양성대조군 L-NMMA, 바질: 비교예 1의 건조 바질 잎의 에탄올 추출물, 15% 자연발효물의 추출물: 설탕 15%로 발효한 실시예 1의 바질 자연발효물의 에탄올 추출물, 20% 자연발효물의 추출물: 설탕 20%로 발효한 실시예 2의 바질 자연발효물의 에탄올 추출물).
도 2는 실시예 2에서 제조된 바질 자연발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다(Ctrl: 무처리, LPS: 음성대조군, PC: 양성대조군 L-NMMA, 바질: 비교예 1의 건조 바질 잎의 에탄올 추출물, 발효액: 설탕 20%로 발효한 실시예 2의 바질 자연 발효 상등액, 발효물의 추출물: 설탕 20%로 발효한 실시예 2의 바질 자연발효물의 에탄올 추출물).
도 3은 실시예 3에서 제조된 갈색 설탕과 LP로 발효된 바질의 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다(Ctrl: 무처리, LPS: 음성대조군, PC: 양성대조군 L-NMMA, 바질: 비교예 1의 건조 바질 잎의 에탄올 추출물, 발효액: 설탕 20%와 LP로 발효한 실시예 3의 바질 발효 상등액, 발효물의 추출물: 설탕 20%와 LP로 발효한 실시예 3의 바질 발효물의 에탄올 추출물).
도 4는 실시예 4에서 제조된 갈색 설탕과 LF로 발효된 바질의 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다(Ctrl: 무처리, LPS: 음성대조군, PC: 양성대조군 L-NMMA, 바질: 비교예 1의 건조 바질 잎의 에탄올 추출물, 발효액: 설탕 20%와 LF로 발효한 실시예 4의 바질 발효 상등액, 발효물의 추출물: 설탕 20%와 LF로 발효한 실시예 4의 바질 발효물의 에탄올 추출물).
도 5는 실시예 5에서 제조된 갈색 설탕과 PP로 발효된 바질의 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다(Ctrl: 무처리, LPS: 음성대조군, PC: 양성대조군 L-NMMA, 바질: 비교예 1의 건조 바질 잎의 에탄올 추출물, 발효액: 설탕 20%와 PP로 발효한 실시예 5의 바질 발효 상등액, 발효물의 추출물: 설탕 20%와 PP로 발효한 실시예 5의 바질 발효물의 에탄올 추출물).
도 6은 9일차 설탕(20%), 설탕(20%)과 LP, 설탕(20%)과 LF, 또는 설탕(20%)과 PP로 발효된 바질의 상등액과 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다(Ctrl: 무처리, LPS: 음성대조군, PC: 양성대조군 L-NMMA, 자연발효액: 실시예 2의 바질 자연 발효 상등액, LP 발효액: 설탕 20%와 LP로 발효한 실시예 3의 바질 발효 상등액, LF 발효액: 설탕 20%와 LF로 발효한 실시예 4의 바질 발효 상등액, PP 발효액: 설탕 20%와 PP로 발효한 실시예 5의 바질 발효 상등액, 자연 발효물의 추출물: 설탕 20%로 발효한 실시예 2의 바질 자연발효물의 에탄올 추출물, LP 발효물의 추출물: 설탕 20%와 LP로 발효한 실시예 3의 바질 발효물의 에탄올 추출물, LF 발효물의 추출물: 설탕 20%와 LF로 발효한 실시예 4의 바질 발효물의 에탄올 추출물, PP 발효물의 추출물: 설탕 20%와 PP로 발효한 실시예 5의 바질 발효물의 에탄올 추출물).
도 7은 실시예 1에서 제조된 바질 자연발효물의 에탄올 추출물과 실시예 2에서 제조된 바질 자연발효물의 에탄올 추출물(20%)을 처리한 후 아질산염의 생성을 평가한 것이다.
도 8은 실시예 2에서 제조된 바질 자연발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 아질산염의 생성을 평가한 것이다.
도 9는 설탕을 이용한 실시예 2의 바질 자연발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 발효 일자별 NO 생성 억제 효과를 비교한 것이다.
도 10은 실시예 3에서 제조된 갈색 설탕과 LP 발효된 바질의 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 아질산염의 생성을 평가한 것이다.
도 11은 설탕(20%)과 LP 유산균을 이용한 실시예 3의 바질 발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 발효 일자별 NO 생성 억제 효과를 비교한 것이다.
도 12는 실시예 4에서 제조된 갈색 설탕과 LF 발효된 바질의 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 아질산염의 생성을 평가한 것이다.
도 13은 설탕(20%)과 LF 유산균을 이용한 실시예 4의 바질 발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 발효 일자별 NO 생성 억제 효과를 비교한 것이다.
도 14는 실시예 5에서 제조된 갈색 설탕과 PP 발효된 바질의 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 아질산염의 생성을 평가한 것이다.
도 15는 설탕(20%)과 PP 유산균을 이용한 실시예 5의 바질 발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 발효 일자별 NO 생성 억제 효과를 비교한 것이다.
도 16은 9일차 설탕(20%), 설탕(20%)과 LP, 설탕(20%)과 LF, 또는 설탕(20%)과 PP로 발효된 바질의 상등액과 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 아질산염의 생성을 평가한 것이다.
도 17은 실시예 2에서 제조된 바질 자연발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 TNF-α분비량을 평가한 것이다.
도 18은 실시예 2에서 제조된 바질 자연발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 IL-16 분비량을 평가한 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1~5 제조
재료
발효를 위한 주재료인 바질은 농업회사법인 ㈜넥스트온의 Indoor farm에서 친환경으로 재배된 바질(Ocimum basilicum)을, 당류(糖類)로는 갈색설탕(제일제당)을 사용하였다. 바질 발효에 사용된 부위는 바질의 잎이며, 발효용기는 유리용기(Bormioli Rocco, 500mL)를 열탕소독하여 clean bench 안에서 충분히 식힌 후 사용하였다. 발효는 디지털배양기(코아테크코리아, HQ-DI 156)를 이용하였다.
발효를 위해 하기 실시예에 사용된 균주는 세계김치연구소(KCKM; Korean Collection for Kimchi Microorganisms) 김치미생물자원은행에서 분양받아 사용하였다.
사용된 유산균 균주는 Lactiplantibacillus plantarum (KCKM 0531, 이하 "LP" 균주라 함), Limosilactobacillus fermentum (KCKM 0729, 이하 "LF" 균주라 함), Pediococcus pentosaceus (KCKM 0941, 이하 "PP" 균주라 함) 3종을 사용하였다.
실시예 1. 설탕(15중량%)을 이용한 바질 자연발효 상등액과 발효물의 에탄올 추출물의 제조(자연 발효)
발효용기에 생바질 150g, 갈색설탕 22.5g(생바질 중량 대비 15 중량%)을 계량하여 넣은 후, 뚜껑을 닫고 밀봉하여 30℃로 설정된 배양기에서 28일 동안 발효를 진행하였다. 발효 기간 중 3일차, 6일차, 9일차, 14일차, 21일차, 28일차에 발효된 바질 건더기 부분과 바질 상등액을 각각 분리하여 채취하였다.
생바질 중량 대비 설탕 15 중량%로 자연 발효된 바질의 상등액을 자연 발효액으로 사용하였다. 또한 발효된 바질의 건더기 부분에 10배수의 70% 에탄올을 가하여 1시간 동안 70~80℃에서 환류추출하였다. 추출액을 여과한 후 여과액을 감압농축하여 바질 발효물의 에탄올 추출물을 수득하였다.
실시예 2. 설탕(20중량%)을 이용한 바질 자연발효 상등액과 발효물의 에탄올 추출물의 제조(자연 발효)
발효용기에 생바질 150g, 갈색설탕 30g(생바질 중량 대비 20 중량%)을 계량하여 넣은 후, 뚜껑을 닫고 밀봉하여 30℃로 설정된 배양기에서 28일 동안 발효를 진행하였다. 발효 기간 중 3일차, 6일차, 9일차, 14일차, 21일차, 28일차에 발효된 바질 건더기 부분과 바질 상등액을 각각 분리하여 채취하였다.
생바질 중량 대비 설탕 20 중량%로 자연 발효된 바질의 상등액을 자연 발효액으로 사용하였다. 또한 발효된 바질의 건더기 부분에 10배수의 70% 에탄올을 가하여 1시간 동안 70~80℃에서 환류추출하였다. 추출액을 여과한 후 여과액을 감압농축하여 바질 발효물의 에탄올 추출물을 수득하였다.
실시예 3. 설탕(20%)과 LP 유산균을 이용한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 제조(LP 발효)
KCKM에서 분양받은 Lactiplantibacillus plantarum KCKM 0531은 MRS broth medium에 희석하여 MRS agar plate에 도말하고, 30℃에서 24시간 배양한 후 접종에 사용하였다. 발효용기에 생바질 150g, 갈색설탕 30g(생바질 중량 대비 20 중량%)을 계량하여 넣은 후, Agar plate에 생성된 Lactiplantibacillus plantarum KCKM 0531의 1mm 크기 single colony 두 개를 멸균한 증류수 1mL이 담긴 tube에 풀어서 발효용기에 접종하였다. 다시 1mL의 증류수를 tube에 넣어 헹궈준 후, 발효 용기에 주입하고, 뚜껑을 닫아 밀봉하여 30℃로 설정된 배양기에서 28일 동안 발효를 진행하였다. 발효 기간 중 3일차, 6일차, 9일차, 14일차, 21일차, 28일차에 발효된 바질 건더기 부분과 바질 상등액을 각각 분리하여 채취하였다.
설탕(20%)과 LP 유산균으로 발효된 바질의 상등액을 발효액으로 사용하였다. 또한 설탕(20%)과 LP 유산균으로 발효된 바질의 건더기 부분에 10배수의 70% 에탄올을 가하여 1시간동안 70~80℃에서 환류추출하였다. 추출액을 여과한 후 여과액을 감압농축하여 바질 발효물의 에탄올 추출물을 수득하였다.
실시예 4. 설탕(20%)과 LF 유산균을 이용한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 제조(LF 발효)
KCKM에서 분양받은 Limosilactobacillus fermentum KCKM 0729은 MRS broth medium에 희석하여 MRS agar plate에 도말하고, 30℃에서 24시간 배양한 후 접종에 사용하였다. 발효용기에 생바질 150g, 갈색설탕 30g(생바질 중량 대비 20 중량%)을 계량하여 넣은 후, Agar plate에 생성된 Limosilactobacillus fermentum KCKM 0729의 1mm 크기 single colony 두 개를 멸균한 증류수 1mL이 담긴 tube에 풀어서 발효용기에 접종하였다. 다시 1mL의 증류수를 tube에 넣어 헹궈준 후, 발효 용기에 주입하고, 뚜껑을 닫아 밀봉하여 30℃로 설정된 배양기에서 28일 동안 발효를 진행하였다. 발효 기간 중 3일차, 6일차, 9일차, 14일차, 21일차, 28일차에 발효된 바질 건더기 부분과 바질 상등액을 각각 분리하여 채취하였다.
설탕(20%)과 LF 유산균으로 발효된 바질의 상등액을 발효액으로 사용하였다. 또한 설탕(20%)과 LF 유산균으로 발효된 바질의 건더기 부분에 10배수의 70% 에탄올을 가하여 1시간동안 70~80℃에서 환류추출하였다. 추출액을 여과한 후 여과액을 감압농축하여 바질 발효물의 에탄올 추출물을 수득하였다.
실시예 5. 설탕(20%)과 PP 유산균을 이용한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 제조(PP 발효)
KCKM에서 분양받은 Pediococcus pentosaceus KCKM 0941은 MRS broth medium에 희석하여 MRS agar plate에 도말하고, 30℃에서 24시간 배양한 후 접종에 사용하였다. 발효용기에 생바질 150g, 갈색설탕 30g(생바질 중량 대비 20 중량%)을 계량하여 넣은 후, Agar plate에 생성된 Pediococcus pentosaceus KCKM 0941의 1mm 크기 single colony 두 개를 멸균한 증류수 1mL이 담긴 tube에 풀어서 발효용기에 접종하였다. 다시 1mL의 증류수를 tube에 넣어 헹궈준 후, 발효 용기에 주입하고, 뚜껑을 닫아 밀봉하여 30℃로 설정된 배양기에서 28일 동안 발효를 진행하였다. 발효 기간 중 3일차, 6일차, 9일차, 14일차, 21일차, 28일차에 발효된 바질 건더기 부분과 바질 상등액을 각각 분리하여 채취하였다.
설탕(20%)과 PP 유산균으로 발효된 바질의 상등액을 발효액으로 사용하였다. 또한 설탕(20%)과 PP 유산균으로 발효된 바질의 건더기 부분에 10배수의 70% 에탄올을 가하여 1시간동안 70~80℃에서 환류추출하였다. 추출액을 여과한 후 여과액을 감압농축하여 바질 발효물의 에탄올 추출물을 수득하였다.
비교예 1.
바질 생잎을 채취한 후 건조하였다. 건조된 바질에 10배수의 70% 에탄올을 가하여 1시간동안 70~80℃에서 환류추출하였다. 상기 추출액을 여과한 후 여과액을 감압농축하여 바질 에탄올 추출물을 수득하였다.
실험예 1. 이화학적 특성 검정
실시예 1 내지 5에서 제조된 바질 발효 상등액의 이화학적 특성을 분석하였다.
당도, 산도 및 pH 측정 특정 결과는 표 1과 같다.
　 20%
자연발효
(실시예2) 		LP발효
(실시예3) 		LF발효
(실시예4) 		PP발효
(실시예5)
3일차 당도 23.1 21.6 23 22.2
총산도 1.89 2.79 2.61 2.59
pH 6 3.5 4 4
6일차 당도 22 20.2 21 20.3
총산도 2.09 3.05 2.93 2.65
pH 5 3.5 4 4
9일차 당도 21.2 20.2 20.2 20.2
총산도 2.19 3.13 3.25 2.75
pH 5 3.5 4 4
14일차 당도 21.1 20.1 20.1 19.9
총산도 2.14 3.22 3.11 2.78
pH 5 3.5 4 4
21일차 당도 21.2 20.2 20.2 -
총산도 2.27 3.14 3.14 -
pH 5 3 3.5 -
28일차 당도 21.1 20.3 20 -
총산도 2.28 3.21 3.19 -
pH 5 3 3.5 -
3개월차 당도 21.9 - - 21.5
총산도 2.31 - - 2.95
pH 5 - - 3.5
실험예 2. 세포독성 평가
96 웰 플레이트에 BV-2 세포(소교세포)를 6 x 10⁴cell/well의 농도가 되도록 DMEM 배양액에 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간 이후에 실시예 1 내지 5의 시료를 50 μg/ml의 농도로 처리한 후, 24시간 동안 반응시켰다. 배양약을 제거한 후, 0.5 mg/ml 농도의 MTT 용액을 100 μl씩 각 웰에 넣고 최소 1시간 동안 37℃ 배양기에서 배양한 다음 용액을 제거하고 DMSO를 200 μl씩 분주하여 각 웰에 생성된 formazin을 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포 생존율 평가는 LPS를 처리하지 않은 음성 대조군(Ctrl), 양성대조군(PC)으로 L-NMMA를 사용하였다. 비교예 1로 바질 잎의 70% 에탄올 추출물을 사용하였다. 시료로는 본 발명의 실시예 1 내지 5에서 제조된 바질 발효 상등액(발효액) 및 발효물의 에탄올 추출물을 사용하였다.
1-1. 설탕(15%와 20%)을 이용한 바질 자연발효물의 에탄올 추출물의 세포독성 평가(자연 발효)
생바질 중량 대비 15 중량%의 갈색 설탕을 첨가하고 바질을 발효하여 얻은 실시예 1에서 제조한 바질 자연발효물의 에탄올 추출물과 생바질 중량 대비 20 중량%의 갈색 설탕을 첨가하고 바질을 발효하여 얻은 실시예 2에서 제조한 바질 자연발효물의 에탄올 추출물을 이용하여 세포 독성을 평가하였다. 상기 바질의 발효 시료는 7 일차 발효 바질을 이용하였다.
도 1은 실시예 1에서 제조된 바질 자연발효물의 에탄올 추출물과 실시예 2에서 제조된 바질 자연발효물의 에탄올 추출물(20%)을 처리한 후 소교세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다(Ctrl: 무처리, LPS: 음성대조군, PC: 양성대조군 L-NMMA, 바질: 비교예 1의 건조 바질 잎의 에탄올 추출물, 15% 자연발효물의 추출물: 설탕 15%로 발효한 실시예 1의 바질 자연발효물의 에탄올 추출물, 20% 자연발효물의 추출물: 설탕 20%로 발효한 실시예 2의 바질 자연발효물의 에탄올 추출물).
그 결과, 모든 시료 처리군에서 세포 독성이 없는 것을 확인하였다.
1-2. 설탕(20%)을 이용한 바질 자연발효 상등액과 바질 자연발효물의 에탄올 추출물의 세포독성 평가(자연 발효)
생바질 중량 대비 20 중량%의 갈색 설탕을 첨가하고 바질을 발효하여 얻은 실시예 2에서 제조한 바질 자연발효 상등액과 바질 자연발효물의 에탄올 추출물을 이용하여 세포 독성을 평가하였다.
도 2는 실시예 2에서 제조된 바질 자연발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다(Ctrl: 무처리, LPS: 음성대조군, PC: 양성대조군 L-NMMA, 바질: 비교예 1의 건조 바질 잎의 에탄올 추출물, 발효액: 설탕 20%로 발효한 실시예 2의 바질 자연 발효 상등액, 발효물의 추출물: 설탕 20%로 발효한 실시예 2의 바질 자연발효물의 에탄올 추출물).
그 결과, 모든 시료 처리군에서 세포 독성이 없는 것을 확인하였다.
1-3. 설탕(20%)과 LP 유산균을 이용한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 세포독성 평가(LP 발효)
생바질 중량 대비 20 중량%의 갈색 설탕과 LP(Lactiplantibacillus plantarum) 유산균으로 바질을 발효하여 얻은 실시예 3에서 제조한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 이용하여 세포 독성을 평가하였다.
도 3은 실시예 3에서 제조된 갈색 설탕과 LP로 발효된 바질의 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다(Ctrl: 무처리, LPS: 음성대조군, PC: 양성대조군 L-NMMA, 바질: 비교예 1의 건조 바질 잎의 에탄올 추출물, 발효액: 설탕 20%와 LP로 발효한 실시예 3의 바질 발효 상등액, 발효물의 추출물: 설탕 20%와 LP로 발효한 실시예 3의 바질 발효물의 에탄올 추출물).
그 결과, 모든 시료 처리군에서 세포 독성이 없는 것을 확인하였다. 6일차 발효물의 추출물에서 무처리 음성대조군에 비해서 더 높은 세포 생존율을 보이기도 하였다.
1-4. 설탕(20%)과 LF 유산균을 이용한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 세포독성 평가(LF 발효)
생바질 중량 대비 20 중량%의 갈색 설탕과 LF(Limosilactobacillus fermentum) 유산균으로 바질을 발효하여 얻은 실시예 4에서 제조한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 이용하여 세포 독성을 평가하였다.
도 4는 실시예 4에서 제조된 갈색 설탕과 LF로 발효된 바질의 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다(Ctrl: 무처리, LPS: 음성대조군, PC: 양성대조군 L-NMMA, 바질: 비교예 1의 건조 바질 잎의 에탄올 추출물, 발효액: 설탕 20%와 LF로 발효한 실시예 4의 바질 발효 상등액, 발효물의 추출물: 설탕 20%와 LF로 발효한 실시예 4의 바질 발효물의 에탄올 추출물).
그 결과, LPS만을 처리한 군을 제외하고 모든 시료 처리군에서 세포 독성이 없는 것을 확인하였다. 3, 6일차 발효액과 발효물의 추출물에서 무처리 음성대조군에 비해서 더 높은 세포 생존율을 보였다.
1-5. 설탕(20%)과 PP 유산균을 이용한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 세포독성 평가(PP 발효)
생바질 중량 대비 20 중량%의 갈색 설탕과 PP(Pediococcus pentosaceus) 유산균으로 바질을 발효하여 얻은 실시예 5에서 제조한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 이용하여 세포 독성을 평가하였다.
도 5는 실시예 5에서 제조된 갈색 설탕과 PP로 발효된 바질의 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다(Ctrl: 무처리, LPS: 음성대조군, PC: 양성대조군 L-NMMA, 바질: 비교예 1의 건조 바질 잎의 에탄올 추출물, 발효액: 설탕 20%와 PP로 발효한 실시예 5의 바질 발효 상등액, 발효물의 추출물: 설탕 20%와 PP로 발효한 실시예 5의 바질 발효물의 에탄올 추출물).
그 결과, LPS만을 처리한 군을 제외하고 모든 시료 처리군에서 세포 독성이 없는 것을 확인하였다.
1-6. 설탕(20%), 설탕(20%)과 LP, LF, PP 유산균을 이용한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 세포독성 평가
다음으로, 설탕(20%), 설탕(20%)과 LP, 설탕(20%)과 LF, 설탕(20%)과 PP 유산균으로 바질을 발효한 후 발효 9일차 바질의 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 세포 독성을 비교하였다.
도 6은 9일차 설탕(20%), 설탕(20%)과 LP, 설탕(20%)과 LF, 또는 설탕(20%)과 PP로 발효된 바질의 상등액과 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다(Ctrl: 무처리, LPS: 음성대조군, PC: 양성대조군 L-NMMA, 자연발효액: 실시예 2의 바질 자연 발효 상등액, LP 발효액: 설탕 20%와 LP로 발효한 실시예 3의 바질 발효 상등액, LF 발효액: 설탕 20%와 LF로 발효한 실시예 4의 바질 발효 상등액, PP 발효액: 설탕 20%와 PP로 발효한 실시예 5의 바질 발효 상등액, 자연 발효물의 추출물: 설탕 20%로 발효한 실시예 2의 바질 자연발효물의 에탄올 추출물, LP 발효물의 추출물: 설탕 20%와 LP로 발효한 실시예 3의 바질 발효물의 에탄올 추출물, LF 발효물의 추출물: 설탕 20%와 LF로 발효한 실시예 4의 바질 발효물의 에탄올 추출물, PP 발효물의 추출물: 설탕 20%와 PP로 발효한 실시예 5의 바질 발효물의 에탄올 추출물). 구체적으로, 생바질 중량 대비 20 중량%의 갈색설탕으로 자연발효한 실시예 2, 갈색설탕과 LP로 발효한 실시예 3, 갈색설탕과 LF로 발효한 실시예 4, 갈색설탕과 PP로 발효한 실시예 5에서 제조된 바질의 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 세포 독성을 비교하였다.
그 결과, LPS만을 처리한 군을 제외하고 모든 시료 처리군에서 세포 독성이 없는 것을 확인하였다.
이와 같이, 설탕을 이용한 바질의 자연 발효 상등액, 설탕과 유산균을 이용한 바질의 발효 상등액과 이들의 에탄올 추출물 모두 소교세포에 세포독성이 없는 것을 확인하였다.
실험예 2. NO 생성 평가
96 웰 플레이트에 BV-2 세포(소교세포)를 6 x 10⁴cell/well의 농도가 되도록 DMEM 배양액에 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간 이후에 실시예 1 내지 5의 시료를 처리하고, 1시간 동안 반응시킨 후, 24시간 동안 100 ng/ml의 LPS로 자극하였다.
시료로는 실시예 1 내지 5에서 제조된 바질 발효 상등액(발효액) 및 발효물의 에탄올 추출물을 사용하였다. NO 생성량 변화를 확인하기 위하여 NO (Nitric oxide)의 가용성 산화 생성물인 아질산염(nitrite)의 생성을 배양 배지에서 측정하였다. NO 합성 억제제인 L-NMMA (NG-Monomethyl-L-arginine)를 양성대조군(PC)으로 사용하였다.
2-1. 설탕(15%와 20%)을 이용한 바질 자연발효물의 에탄올 추출물의 NO 생성 평가(자연 발효)
생바질 중량 대비 15 중량%의 갈색 설탕을 첨가하고 바질을 발효하여 얻은 실시예 1에서 제조한 바질 자연발효물의 에탄올 추출물과 생바질 중량 대비 20 중량%의 갈색 설탕을 첨가하고 바질을 발효하여 얻은 실시예 2에서 제조한 바질 자연발효물의 에탄올 추출물을 이용하여 아질산염의 생성을 측정하여 NO 생성을 평가하였다. 상기 바질의 발효 시료는 7 일차 발효 바질을 이용하였다.
도 7은 실시예 1에서 제조된 바질 자연발효물의 에탄올 추출물과 실시예 2에서 제조된 바질 자연발효물의 에탄올 추출물(20%)을 처리한 후 아질산염의 생성을 평가한 것이다.
그 결과, 비교예 1의 바질 잎의 에탄올 추출물(미발효물)에 비해 실시예 2에서 제조된 20% 자연발효물의 에탄올 추출물의 처리시, 소교세포(BV-2)의 NO 생성이 크게 감소한 것을 확인하였으며, 20% 자연발효물의 에탄올 추출물은 양성대조군(PC)인 L-NMMA와 동등 수준의 NO 생성 억제효과를 나타냈다. 따라서 비교예 1의 바질 미발효물에 비해 실시예 2의 20% 자연발효물의 에탄올 추출물이 항신경염 효과가 우수한 것을 알 수 있었다.
또한, NO 생성 억제 효과를 IC50으로 나타내어 그 효과를 비교하였다. 그 결과 20% 자연 발효물의 에탄올 추출물(실시예 2)은 양성대조군과 동등 수준 이상의 NO 생성 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다(표 2).
Extract IC50 (μg/ml)
1 건조 바질 에탄올 추출물(비교예 1) 45.69
2 15% 자연 발효물의 에탄올 추출물(실시예 1) 82.39
3 20% 자연 발효물의 에탄올 추출물(실시예 2) 35.96
4 L-NMMA(양성대조군) 36.45
2-2. 설탕(20%)을 이용한 바질 자연발효 상등액과 바질 자연발효물의 에탄올 추출물의 NO 생성 평가(자연 발효)
생바질 중량 대비 20 중량%의 갈색 설탕을 첨가하고 바질을 발효하여 얻은 실시예 2에서 제조한 바질 자연발효 상등액과 바질 자연발효물의 에탄올 추출물을 이용하여 아질산염의 생성을 측정하여 NO 생성을 평가하였다.
도 8은 실시예 2에서 제조된 바질 자연발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 아질산염의 생성을 평가한 것이다. 그 결과, 실시예 2의 바질 자연발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리하였을 때, 비교예 1의 바질 잎의 에탄올 추출물(미발효물)에 비하여 NO 생성이 보다 감소한 것을 확인하였다. 발효액은 9일차, 발효물의 추출물은 6일차에서 NO 생성이 가장 많이 감소되었다. 따라서 실시예 2의 바질 발효액과 바질 발효물의 에탄올 추출물은 비교예 1의 바질 잎의 에탄올 추출물(미발효물)보다 우수한 항신경염 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
도 9는 설탕 20 중량%를 이용한 실시예 2의 바질 자연발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 발효 일자별 NO 생성 억제 효과를 비교한 것이다. 발효액은 발효가 진행될수록 NO 생성이 감소되어 9일차에 가장 많이 감소되었으며, 이후 NO 생성이 다시 높아지는 것을 확인할 수 있다. 발효물의 추출물은 6일차에 NO 생성이 가장 많이 감소되었다.
2-3. 설탕(20%)과 LP 유산균을 이용한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 NO 생성 평가(LP 발효)
생바질 중량 대비 20 중량%의 갈색 설탕과 LP(Lactiplantibacillus plantarum) 유산균으로 바질을 발효하여 얻은 실시예 3에서 제조한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 이용하여 아질산염의 생성을 측정하여 NO 생성을 평가하였다.
도 10은 실시예 3에서 제조된 갈색 설탕과 LP 발효된 바질의 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 아질산염의 생성을 평가한 것이다. 그 결과, 비교예 1의 바질 잎의 에탄올 추출물(미발효물)은 실시예 3의 바질 발효 상등액(LP 발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물보다 소교세포(BV-2)의 NO 생성 억제 효과가 다소 높은 수준을 나타냈다. 따라서, 비교예 1의 바질 잎의 에탄올 추출물(미발효물)은 실시예 3의 바질 LP 발효액과 발효물의 에탄올 추출물에 비해 항신경염 효과가 다소 높았다.
도 11은 설탕(20%)과 LP 유산균을 이용한 실시예 3의 바질 발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 발효 일자별 NO 생성 억제 효과를 비교한 것이다. 실시예 3의 바질 발효 상등액(발효액)은 발효가 진행될수록 NO 생성이 증가하다가 14일차에 이전 일차에 비해 소폭 감소하는 것을 확인할 수 있다. 실시예 3의 바질 발효물의 추출물은 9일차에 NO 생성이 가장 많이 감소되었다.
2-4. 설탕(20%)과 LF 유산균을 이용한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 NO 생성 평가(LF 발효)
생바질 중량 대비 20 중량%의 갈색 설탕과 LF(Limosilactobacillus fermentum) 유산균으로 바질을 발효하여 얻은 실시예 4에서 제조한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 이용하여 아질산염의 생성을 측정하여 NO 생성을 평가하였다.
도 12는 실시예 4에서 제조된 갈색 설탕과 LF 발효된 바질의 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 아질산염의 생성을 평가한 것이다. 그 결과, 3일차 LF 발효물의 추출물이 NO 생성 정도가 가장 낮았으며, 다른 LF 발효 상등액(발효액) 및 LF 발효물의 에탄올 추출물의 경우 비교예 1의 바질 잎의 에탄올 추출물(미발효물)에 비하여 NO 생성 정도가 비슷하거나 다소 높았다. 따라서 실시예 4의 LF 발효 바질은 3일차 발효물의 추출물을 제외하면 비교예 1의 바질 잎의 에탄올 추출물(미발효물)에 비해 항신경염 효과가 낮았다.
도 13은 설탕(20%)과 LF 유산균을 이용한 실시예 4의 바질 발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 발효 일자별 NO 생성 억제 효과를 비교한 것이다. 실시예 4의 바질 발효 상등액(발효액)은 발효가 진행될수록 NO 생성 변화가 없다가 14일차에 소폭 증가하였다. LF 발효물의 추출물은 9일차에 NO 생성이 가장 많이 감소되었다.
2-5. 설탕(20%)과 PP 유산균을 이용한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 NO 생성 평가(PP 발효)
생바질 중량 대비 20 중량%의 갈색 설탕과 PP(Pediococcus pentosaceus) 유산균으로 바질을 발효하여 얻은 실시예 5에서 제조한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 이용하여 아질산염의 생성을 측정하여 NO 생성을 평가하였다.
도 14는 실시예 5에서 제조된 갈색 설탕과 PP 발효된 바질의 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 아질산염의 생성을 평가한 것이다. 그 결과, 실시예 5의 발효 상등액(PP 발효액) 및 PP 발효물의 에탄올 추출물을 처리하였을 때, 발효액에서 발효가 진행될수록 NO 생성 정도가 감소되는 경향을 나타냈다. 그러나, 실시예 5의 발효 상등액(PP 발효액)과 발효물의 에탄올 추출물은 비교예 1의 바질 잎의 에탄올 추출물(미발효물)에 비해 항신경염 효과가 낮은 편이었다.
도 15는 설탕(20%)과 PP 유산균을 이용한 실시예 5의 바질 발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 발효 일자별 NO 생성 억제 효과를 비교한 것이다. 실시예 5의 바질 발효 상등액(발효액)은 발효가 진행될수록 NO 생성이 감소되는 경향을 나타냈다. PP 발효물의 추출물은 NO 생성 변화가 크지 않았다.
2-6. 설탕(20%), 설탕(20%)과 LP, LF, PP 유산균을 이용한 바질 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 NO 생성 평가
다음으로, 설탕(20%), 설탕(20%)과 LP, 설탕(20%)과 LF, 설탕(20%)과 PP 유산균으로 바질을 발효한 후 발효 9일차 바질의 발효 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물의 아질산염의 생성을 측정하여 NO 생성을 평가하였다.
도 16은 9일차 설탕(20%), 설탕(20%)과 LP, 설탕(20%)과 LF, 또는 설탕(20%)과 PP로 발효된 바질의 상등액과 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 아질산염의 생성을 평가한 것이다. 구체적으로, 생바질 중량 대비 20 중량%의 갈색설탕으로 자연발효한 실시예 2, 갈색설탕과 LP로 발효한 실시예 3, 갈색설탕과 LF로 발효한 실시예 4, 갈색설탕과 PP로 발효한 실시예 5에서 제조된 바질의 상등액과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 아질산염의 생성을 비교하였다.
그 결과, 9일차 발효한 바질의 경우, 실시예 2의 설탕을 이용한 바질의 자연 발효 상등액(발효액)과 자연 발효물의 에탄올 추출물에서 NO 생성 억제 효과가 가장 높았으며 양성대조군(PC)인 L-NMMA 보다도 높은 수준이었다. 실시예 3, 실시예 4, 실시예 5의 설탕과 LP, LF, PP 유산균을 이용한 바질의 발효 상등액과 발효물의 에탄올 추출물은 양성대조군(PC)인 L-NMMA에 비해 NO 생성 억제 효과가 낮았으며, 특히 LP 발효의 경우 NO 생성 억제효과는 거의 없었다.
실험예 3. 사이토카인 분비량 평가
24 웰 플레이트에 BV-2 세포(소교세포)를 1 x 105 cell/well의 농도가 되도록 DMEM 배양액에 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간 이후에 비교예 1의 건조 바질 잎의 에탄올 추출물(미발효물)과 실시예 2 내지 5의 바질 발효 상등액(발효액) 및 발효물의 에탄올 추출물을 50 μg/ml의 농도로 처리한 후, 24시간 동안 100 ng/ml의 LPS로 자극하였다. 세포 상층액을 수집하여 ELISA를 이용하여 TNF-α 및 IL-6 분비량을 평가하였다.
도 17은 실시예 2에서 제조된 바질 자연발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 IL-6 분비량을 평가한 것이다. 도 18은 실시예 2에서 제조된 바질 자연발효 상등액(발효액)과 바질 발효물의 에탄올 추출물을 처리한 후 소교세포의 TNF-α 분비량을 평가한 것이다. LPS 자극에 의해 소교세포에서 TNF-α 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인의 레벨이 증가하였다. 그러나, 9일차 발효된 실시예 2의 자연발효 발효물의 에탄올 추출물 처리에 의해 TNF-α 및 IL-6와 염증성 사이토카인의 생성이 감소하였다. 이를 통해 바질 발효 9일차의 실시예 2의 발효물의 에탄올 추출물은 LPS에 의해 자극을 받은 염증성 사이토카인의 생성을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (10)

  1. 바질 발효액 또는 바질 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신경염증성 질환은 다발성 경화증, 신경모세포종, 뇌졸중, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 루게릭 병, 헌팅턴 병, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증, 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 바질 발효액 또는 바질 발효물은 생바질 중량 대비 15 내지 25 중량%의 설탕으로 발효하여 얻은 것인, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 바질 발효액 또는 바질 발효물은 생바질 중량 대비 20 중량%의 설탕으로 발효하여 얻은 것인, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 바질 발효액은 발효된 바질의 상등액인 것인, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 바질 발효물은 바질 발효물의 에탄올 추출물인 것인, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 바질 발효는 3 내지 28일 동안 진행되는 것인, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 바질 발효액 또는 바질 발효물은 생바질 중량 대비 20 중량%의 설탕으로 6 내지 14일 동안 발효하여 얻은 것인, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 바질 발효물은 생바질 중량 대비 20 중량%의 설탕으로 9일 동안 발효한 바질 발효물의 에탄올 추출물인 것인, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 바질 발효액 또는 바질 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품조성물.
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