KR20240007075A - 항체의 Fc 영역이 융합된 막구조화 단백질 및 바이러스리셉터를 포함하는 나노디스크 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항체의 Fc 영역이 융합된 막구조화 단백질 및 바이러스 리셉터를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노디스크에 관한 것이다. 본 발명의 나노디스크는 제작 수율이 우수하고, 우수한 약동학적인 성질을 가지며, 우수한 항바이러스 효능을 나타낸다.

Description

항체의 Fc 영역이 융합된 막구조화 단백질 및 바이러스 리셉터를 포함하는 나노디스크{Nanodisc containing membrane scaffold protein fused with Fc region of antibody and viral receptor}
본 발명은 항체의 Fc 영역이 융합된 막구조화 단백질 및 바이러스 리셉터를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노디스크 및 이의 항바이러스 용도에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스(Influenza virus)는 오르소믹소 계통(Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A형, B형, C형 등 3가지로 구분된다. 그 중 B형과 C형은 사람에서만 감염이 확인되고 있으며, A형은 사람, 말, 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있다. A형 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA)과 뉴라미니다제(Neuraminidase, NA)의 종류에 따라 구분되는데, 지금까지 144종류(HA 단백질 16종과 NA 단백질 9종)가 알려져있다. HA는 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며, NA는 바이러스가 세포 내로 침투할 수 있도록 한다.
지금까지 개발된 바이러스 감염증 치료제로는 아만타딘(amantadine) 또는 리만타딘(rimantadine)계열의 M2 이온채널 억제제(M2 ion channel inhibitor)와 오셀타미비르(oseltamivir, 상품명 타미플루) 또는 자나미비르(zanamivir, 상품명 리렌자) 계열의 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 억제제가 알려져 있으나, 이들 치료제는 그의 효과가 제한된다는 문제점이 있었다. 즉, 아만타딘 또는 리만타딘 계열의 유도체 화합물은 이에 대한 저항성 변종바이러스가 빠르게 생성되고, 일부 지역에서 검출된 H5N1 타입의 인플루엔자 바이러스는 아만타딘 또는 리만타딘 계열의 화합물에 대하여 내성을 나타내며, 인플루엔자 B 바이러스는 아만타딘 유도체에 민감하지 않다고 알려져 있다. 또한, 오셀타미비르 또는 자나미비르 계열의 유도체 화합물 역시 이에 대한 저항성 바이러스가 증가하고, 이러한 저항성 바이러스는 어린이에게서 빈번히 발생하고 있다고 알려져 있다.
한편, 2020년부터 현재 진행형인 코로나 바이러스에 의한 COVID-19 등 바이러스에 의한 질병의 유행이 근래 다수 발생하고 있다.
코로나바이러스는　코로나바이러스과(Coronaviridae)의　코로나바이러스아과(Coronavirinae)에 속하는　RNA 바이러스로,　사람과 동물의 호흡기와 소화기계 감염을 유발한다. 주로 점막전염, 비말전파로 쉽게 감염되며, 사람에게는 일반적으로 경미한　호흡기 감염을 일으키지만 치명적인 감염을 유발하기도 하며, 소와 돼지는 설사, 닭은 호흡기 질환이 발생하기도 한다. 코로나바이러스는 현대 문명에서 치명적인 감염병을 일으키는 대표적인 바이러스다.　2003년　4월에는　중화인민공화국발　중증급성호흡기증후군,　일명 사스가 유행해 사망률 9.6%를 기록하며 많은 사람이 사망했다.　2015년에는　중동호흡기증후군, 일명 메르스가　중동에서 전 세계로 퍼지면서 사망률 약 36%로써 사망자가 다수 발생하였다. 또한　2019년　12월부터 신종 코로나바이러스 감염증(코로나19, COVID-19)이 전 세계로 확진되면서 감염자가 늘어나고 있다.
바이러스성 질환 치료를 위해, 항체 치료제가 개발되고 있다. 그런데, 바이러스성 질환에 대한 항체 치료제는 돌연변이로 인한 내성 바이러스의 출현에 취약하다. 뿐만 아니라 항바이러스 항체 치료제의 경우 뛰어난 치료 효능을 보이지 못하는 경우가 일반적인데 이는 항체가 바이러스 단백질의 기능 저해 및 면역 세포에 의한 바이러스 사멸을 매개함으로써 항바이러스 활성을 나타내기 때문이다. 또한 항체 치료제는 자체가 숙주에 면역원성을 제공할 가능성이 있어, 내성 바이러스 발생할 가능성이 높아지기도 한다.
구체적으로, 코로나바이러스 치료제의 개발 과정에서 바이러스 특이적 중화 항체 치료제(렉키로나, 리젠코브 등)가 개발된 바 있다. 코로나바이러스에 대한 항체 치료제는 빠르게 개발되었으나 충분한 치료효과를 나타내지는 못하였다. 전세계적으로 수십종의 코로나바이러스 항체 치료제가 개발되었으나, 셀트리온의 렉키로나주를 포함하여 거의 모든 항체는 오미크론 변이에 효과적이지 못하여 공급이 중단되거나 긴급 승인이 취소되었다. 심지어 오미크론에 유일하게 효능이 있었던 GSK의 항체 치료제(소트로비맵)는 투여와 동시에 내성 바이러스가 발생이 보고되기도 하였다.
한편, 나노디스크(nanodisc)는 체내의 고밀도 지질단백질(high-density lipoproteins, HDL)의 주요성분인 아포리포단백질 A1 (apolipoprotein A1, Apo-A1)에서 유래한 단백질인 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP)이 인지질 이중막을 원반 형태로 감싸 형성된 구조를 말한다. 나노디스크는 다양한 세포막 단백질의 구조 연구에 주로 쓰인다. 또한, 다양한 생리기능성 물질을 내부에 탑재하여 이를 생체 내로 전달하는 이동체로서 역할을 수행하기도 한다. 나노디스크는 생체 내 유래 물질로서 체내에서 안정적이며 유해한 반응을 유발하지 않아 안전한 장점이 있다.
대한민국 등록특허 제10-2181991호에는 항바이러스 효능을 보이는 나노디스크가 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-2438720호에는 항바이러스 효능을 보이는 나노디스크가 기재되어 있다.
본 발명에서는 우수한 항바이러스 효능을 보이는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층(lipid bilayer); 상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 둘러싸는 막구조화 단백질(membrane scaffold protein, MSP); 및 상기 지질 이중층과 소수성 결합되는 '바이러스 리셉터 (virus receptor)'를 포함하는 나노디스크(nanodisc)에 있어서, 상기 막구조화 단백질에 Fc 절편 (Fc fragment)이 융합되어, Fc 절편이 상기 나노디스크의 측면 외부로 돌출된 나노디스크를 제공한다.
본 발명의 나노디스크에 있어서, 상기 인지질은 바람직하게 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민(phophatidylethalolamine), 포스파티딜글리세롤(phophatidylglycerol) 및 포스파티딜이노시톨(phophatidylinositol) 중 선택되는 하나 이상인 것이 좋다.
본 발명의 나노디스크에 있어서, 상기 인지질은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민(phophatidylethalolamine), 포스파티딜글리세롤(phophatidylglycerol) 및 포스파티딜이노시톨(phophatidylinositol) 중 선택되는 하나 이상일 수 있는데, 바람직하게는 POPC(l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPS(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine), 및 POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것이 좋다.
본 발명의 나노디스크에 있어서, 상기 막구조화 단백질(membrane scaffold protein)은 헬릭스(helix) 구조를 갖는 양친매성 단백질일 수 있으며, 아포리포단백질(apolipoprotein) 또는 아포리포단백질의 '헬릭스(helix) 구조 및 양친매성 특성'이 유지된 아포리포단백질의 절편일 수 있다.
또한, 본 발명은 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층(lipid bilayer); 상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 둘러싸는 막구조화 단백질(membrane scaffold protein, MSP); 및 상기 지질 이중층과 소수성 결합되는 '바이러스 리셉터 (virus receptor)'를 포함하는 나노디스크(nanodisc)에 있어서, 상기 막구조화 단백질에 Fc 절편 (Fc fragment)이 융합되어, Fc 절편이 상기 나노디스크의 측면 외부로 돌출된 나노디스크를 함유하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 인지질은 바람직하게 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민(phophatidylethalolamine), 포스파티딜글리세롤(phophatidylglycerol) 및 포스파티딜이노시톨(phophatidylinositol) 중 선택되는 하나 이상인 것이 좋다.
본 발명의 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 인지질은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민(phophatidylethalolamine), 포스파티딜글리세롤(phophatidylglycerol) 및 포스파티딜이노시톨(phophatidylinositol) 중 선택되는 하나 이상일 수 있는데, 바람직하게는 POPC(l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPS(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine), 및 POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것이 좋다.
본 발명의 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 막구조화 단백질(membrane scaffold protein)은 헬릭스(helix) 구조를 갖는 양친매성 단백질일 수 있으며, 아포리포단백질(apolipoprotein) 또는 아포리포단백질의 '헬릭스(helix) 구조 및 양친매성 특성'이 유지된 아포리포단백질의 절편일 수 있다.
본 발명의 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 바이러스는 코로나바이러스 과(Coronaviridae), 버니아바이러스 과(Bunyaviridae), 필로바이러스 과(Filoviridae), 플라비바이러스 과(Flaviviridae), 헤파드나바이러스 과(Hepadnaviridae), 헤르페스바이러스 과(Herpesviridae), 오스소믹소바이러스 과(Orthomyxoviridae), 폭스바이러스 과(Poxviridae), 랍도바이러스 과(Rhabdoviridae), 레트로바이러스 과(Retroviridae) 및 토가바이러스 과(Togaviridae)로 중 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 나노디스크는 항체의 Fc 영역이 융합된 막구조화 단백질 및 바이러스 리셉터를 포함하는 것을 특징으로 하는데, 일반적인 막구조화 단백질을 포함하는 나노디스크 대비 제작 수율이 높으며, 우수한 약동력학적 성질을 나타내고, 우수한 항바이러스 효능을 나타낸다.
도 1은 본 발명 나노디스크(immunodisc)의 제작 과정을 개략적으로 보여준다.
도 2는 항체의 Fc 영역이 융합된 막구조화 단백질(MSP-Fc)이 온전하게 생산된 것인지 확인하기 위해, Fc 영역이 융합된 막구조화 단백질(MSP-Fc)을 생산한 후, 전기영동을 통해 분자량을 확인한 결과를 보여준다.
도 3은 본 발명 나노디스크(immunodisc)가 온전하게 제작된 것인지 확인하기 위해, 본 발명 나노디스크(immunodisc)를 제작한 후, 동적빛산란(DLS)으로 입자크기를 측정한 결과(도 3의 A), 다각도 광산란(SEC-MALS) 검출기로 분자량을 측정한 결과(도 3의 B)를 보여준다.
도 4는 E.coli 발현 MSP를 포함하는 나노디스크(ND), 대형 나노디스크(P2N2-ND); 인간 유래 세포(HEK293) 발현 MSP를 포함하는 나노디스크(hMSP-ND), 대형 나노디스크(hMSP2N2-ND); 인간 유래 세포(HEK293) 발현 MSP-Fc를 포함하는 나노디스크(면역디스크, immunodisc), 대형 나노디스크(P2N2-immunodisc);의 차이를 개략적으로 보여준다.
도 5는 본 발명 나노디스크(immunodisc)의 우수한 제작 수율을 확인하기 위해, 본 발명 나노디스크(immunodisc, P2N2-immunodisc)를 제작한 후, 컬럼(Superose 6, Supedex 200)을 사용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 실시(도 5의 A, B)하고, 정제 수율을 일반 나노디스크와 비교한 결과(도 5의 C)를 보여준다.
도 6은 다당류 또는 당지질 기반 바이러스 수용체(T3, T6, GD1a, 6slst, 3slst)를 포함하는 대형 나노디스크(P2N2-immunodisc-T3, T6, GD1a, 6slst, 3slst의 정제를 위해 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 실시한 결과를 보여준다.
도 7은 다당류 또는 당지질 기반 바이러스 수용체(T3, T6, GD1a, 6slst, 3slst)를 포함하는 대형 나노디스크(P2N2-immunodisc-T3, T6, GD1a, 6slst, 3slst)의 제작 수율을 확인하기 위하, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 실시(도 7의 A)하며, 정제 수율을 일반 나노디스크와 비교한 결과(도 7의 B)를 보여준다.
도 8은 바이러스 수용체로서 안지오텐신 전환효소 2(ACE2)를 포함하는 본 발명 나노디스크(ACE2-immunodisc)의 제작과정 (도 8의 A), 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용한 정제과정 (도 8의 B), 나노디스크가 온전하게 제작된 것인지 확인하기 위해 SDS-PAGE 분석(도 8의 C), 동적빛산란(DLS) 측정(도 8의 D)한 결과를 보여준다.
도 9는 바이러스 수용체로서 안지오텐신 전환효소 2(ACE2)를 포함하는 본 발명 나노디스크(ACE2-immunodisc)의 우수한 제작 수율을 확인하기 위해, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 실시하며, 일반 나노디스크의 경우와 비교한 결과를 보여준다.
도 10은 다당류 또는 당지질 기반 바이러스 수용체를 포함하는 본 발명의 나노디스크(immunodisc-GD1a, P2N2-immunodisc-T3, T6, GD1a, 6slst, 3slst)의 항바이러스 효능을 확인하기 위해, 인플루엔자 바이러스 중화 실험 (도 10의 A), 인플루엔자 바이러스 플라스 감소 실험 (도 10의 B), 다양한 인플루엔자 바이러스에 대한 중화 실험(도 10의 C)를 실시한 결과를 보여준다.
도 11은 바이러스 수용체로서 안지오텐신 전환효소 2(ACE2)를 포함하는 본 발명 나노디스크(ACE2-immunodisc)의 항바이러스 효능을 확인하기 위해, CPE inhibition assay를 진행하고, 일반 나노디스크와 비교한 결과를 보여준다. 한편, Vero E6 세포는 코로나바이러스의 감염 경로 중 Endocytic pathway infection, Calu-3 세포는 코로나바이러스의 감염 경로 중 Direct fusion infection 감염 경로를 확인할 수 있는 세포이다.
도 12는 본 발명 나노디스크(immunodisc)의 약동학적 성질을 평가하기 위해, 마우스에 scFv-Fc 형태의 항체 P2B-2FB 또는 immunodisc를 주입한 후, 각 장기별로 분포된 농도(도 12의 A), 혈청 반감기(도 12의 B)를 확인한 결과를 보여준다.
도 13은 바이러스 수용체로서 안지오텐신 전환효소 2(ACE2)를 포함하는 본 발명 나노디스크(ACE2-immunodisc)의 약동학적 성질을 평가하기 위해, 마우스에 sACE2-Fc 또는 ACE2-immunodisc를 주입한 후, 각 장기별로 분포된 농도(도 13의 A), 혈청 반감기(도 13의 B)를 확인한 결과를 보여준다.
본 발명은 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층(lipid bilayer); 상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 둘러싸는 막구조화 단백질(membrane scaffold protein, MSP); 및 상기 지질 이중층과 소수성 결합되는 '바이러스 리셉터 (virus receptor)'를 포함하는 나노디스크(nanodisc)에 있어서, 상기 막구조화 단백질에 Fc 절편 (Fc fragment)이 융합되어, Fc 절편이 상기 나노디스크의 측면 외부로 돌출된 나노디스크 및 이를 함유하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
나노디스크는 막구조화 단백질(MSP)이 '인지질로부터 형성된 지질 이중층'의 측면을 소수성 결합으로 둘러싸, 인지질의 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되며, 지질 이중층이 납작한 원반 형태를 띄는 구조를 말한다. 선행 연구에 의하면 나노디스크는 소수성 약물의 전달체로 많이 이용되고 있으며, 단백질의 구조와 기능의 연구에 활용되기도 한다.
본 발명자는 대한민국 등록특허 제10-2181991호, 제10-2438720호 등을 통해, 나노디스크가 세포막 모사체 역할을 하며, 바이러스의 외피를 천공하는 것을 확인하였고, 이러한 기작을 통해 나노디스크를 광범위한 바이러스에 대한 항바이러스제로 사용할 수 있음을 확인하였다.
바이러스 치료에는 주로 항체 치료제가 개발되고 있는데, 나노디스크는 바이러스 치료 항체 및 이와 유사한 기술과 대비하여, 더욱 우수한 항바이러스 효능, 내성 바이러스를 유발하지 않는 성질, 높은 안전성을 가진다.
본 발명에서는 상기와 같은 나노디스크의 항바이러스 효능을 개선하기 위해, 다양한 연구를 수행하던 중 항체의 Fc 영역이 융합된 막구조화 단백질(MSP)를 사용하여 본 발명의 나노디스크(면역디스크, immunodisc)를 제작하는 경우, 제작과정에서 수율이 높아지고, 항바이러스 활성이 우수해지며, 우수한 약동학적 성질을 보이는 것을 확인하고 본 발명을 완성한 것이다.
또한, 본 발명의 나노디스크는 항체의 Fc 영역을 포함하는데, 이에 바이러스와 본 발명의 나노디스크가 결합되는 경우, 대식세포(macrophage)가 바이러스를 인식할 수 있게 되고, 이를 통해 생체 내에서 우수한 항바이러스 효능을 발휘할 수도 있다.
한편, 본 발명에서 인지질은 예로서, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 및 포스파티딜이노시톨(phophatidylinositol)로 이루 어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.
상기 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)은 일 예로 DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLPC(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DPPC(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), C13PC, DDPC(1,2-Didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DSPC(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLOPC(1,2-Dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), EPC(Egg phosphatidylcholine), MSPC( 1-Myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), PMPC(1-Palmitoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), PSPC(1-Palmitoyl-2- stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SMPC(1-Stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 SPPC(1-Stearoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)일 수 있다.
또한, 상기 포스파티딜글리세롤은 일 예로 DMPG(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)], DPPG(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DSPG(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)), POPG(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DEPG(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DLPG(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DOPG(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]) 또는 DSPG(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)])일 수 있고, 상기 포스파티딜에탄올아민은, DMPE(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DPPE(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPE(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPE(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DEPE(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLPE(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 또는 POPE(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 상기 포스파티딜세린은, DOPS(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DLPS(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DMPS(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DPPS(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DSPS(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine) 또는 POPS(POPS), 상기 포스파티딜이노시톨(phophatidylinositol)은 포스파티딜이노시톨-4-인산(phosphatidylinositol-4-phosphate), 포스파티딜이노시톨-4,5-비스인산(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate), 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리스인산(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate)일 수 있다.
한편, 본 발명에서 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP)은 헬릭스(helix) 구조를 가지며, 양친매성 특징을 가지고 있는데, 지질 이중층의 측면을 둘러싸는 역할을 한다. 막구조화 단백질(membrane scaffold protein)의 예로는 아포리포단백질(apolipoprotein)이 있다. 아포리포단백질(apolipoprotein)은 혈장지방단백질에 특이적으로 존재하는 단백질로, 지방단백질의 구조를 안정시키고, 지방단백질대사에 관여하는 효소를 활성화하며, 세포표면에 존재하는 지방단백질 수용체에 대한 배위자로서 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 상기 아포리포단백질(apolipoprotein)은 일 예로서, 아포리포단백질 A1(ApoA-I), 아포리포단백질 A2(ApoA-2), 아포리포단백질 B(ApoB), 아포리포단백질 C(ApoC) 및 아포리포단백질 E(ApoE), MSP1(Membrane scaffold protein1), MSP1D1, MSP1D2, MSP1E1, MSP1E2, MSP1E3, MSP1E3D1, MSP2, MSP2N1, MSP2N2, MSP2N3, 등이 있다.
상기에서 일 예로 언급한 ApoA-I은 주로 주변조직으로부터 콜레스테롤을 제거하여 간 또는 다른 리포단백질로 운반하는 직접적인 역할을 수행하는 고밀도 리포단백질(HDL)의 구성요소인 것으로 알려져 있다. Apo-A1은 분자량 28kDa의 243개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩타이드로 구성된다. 11개의 아미노산 혹은 22개의 아미노산으로 이루어진 8개의 반복 단위 도메인을 가지며, HDL을 이루는 2차 구조의 알파-헬릭스의 비율이 60 내지 75%인 단백질이다. 또한, ApoE는 ApoA1과 마찬가지로 콜레스테롤의 운반에 관여하는 것으로 알려져 있는데, 33kDa의 299개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩타이드로 구성된 단백질이다.
또한, 본 발명에서 상기 막구조화 단백질로, 아포리포단백질의 헬릭스 구조 및 양친매성 특성'이 유지된 아포리포단백질의 절편을 사용할 수도 있다. 즉, 상기 아포리포단백질(apolipoprotein)의 '헬릭스 구조 및 양친매성 특성'을 소실하지 않는 범위 내에서, 아포리포단백질 전체가 아닌 그 일부(절편)를 사용할 수도 있는 것이다.
한편, 본 발명에서 '바이러스 리셉터(virus receptor)'란, 바이러스 표면 항원과 결합할 수 있는 수용체로써, 상기 표면 항원에 대한 항체, 상기 표면 항원이 결합할 수 있는 다른 세포막 결합 단백질, 상기 표면 항원이 결합할 수 있는 화합물 등이 될 수 있다. 즉, '바이러스 리셉터(virus receptor)'는 나노디스크의 바이러스와의 부착능을 더욱 향상시켜 항바이러스 효능을 향상시켜주는 역할을 한다.
본 발명에서 '바이러스 리셉터(virus receptor)'는 바람직하게 안지오텐진 전환효소 2 또는 '시알산(sialic acid)이 말단에 결합된 화합물'인 것이 좋다.
SARS-CoV와 SARS-CoV-2를 포함한 여러 코로나바이러스는 인체 세포로 침투하기 위해서 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)를 수용체로 이용하는 것으로 알려져 있다. 안지오텐진 전환효소 2를 포함하는 경우 SARS-CoV와 SARS-CoV-2 등을 포함한 코로나바이러스가 본 발명의 나노디스크를 세포막으로 인식하게되는 비율이 올라가고, 이를 통해, 코로나바이러스에 대한 항바이러스 효능을 향상시킬 수 있다.
인플루엔자 바이러스는 인체 세포로 침투하기 위해서 시알산(sialic acid)이 포함된 당분 분자를 수용체로 이용하는 것으로 알려져 있다. '시알산(sialic acid)이 말단에 결합된 화합물'을 포함하는 경우 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 효능을 향상시킬 수 있다.
상기 '시알산(sialic acid)이 말단에 결합된 화합물'은 화합물 말단에 시알산(sialic acid)을 포함하여 바이러스와의 부착능이 있는 화합물 또는 시알산(sialic acid) 복합체를 말하는데, 일예로, 시알릴락토오스(sialyllactose), 강글리오시드(ganglioside) 등이 있으며, 이를 기반으로 한 합성 수용체일 수도 있다. 상기 합성 수용체의 일 예로는 T3(Tetra-(2,3)sialyllactose-(ethylenglycol)3-maleimido-(ethylenglycol)3-stearyo), T6(Tetra-(2,6)sialyllactose-(ethylenglycol)3-maleimido-(ethylenglycol)3-stearyo), 3slst(α(2,3)sialyllactose-(ethylenglycol)3-stearoyl), 6slst(α(2,6)sialyllactose-(ethylenglycol)3-stearoyl) 등이 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물은 바이러스의 종류에 상관없이 항바이러스 효능을 보일 수 있다. 따라서, 본 발명에서 '바이러스 감염증'은 코로나바이러스 과 (Coronaviridae), 버니아바이러스 과 (Bunyaviridae), 필로바이러스 과 (Filoviridae), 플라비바이러스 과 (Flaviviridae), 헤파드나바이러스 과 (Hepadnaviridae), 헤르페스바이러스 과 (Herpesviridae), 오스소믹소바이러스 과 (Orthomyxoviridae), 폭스바이러스 과 (Poxviridae), 랍도바이러스 과 (Rhabdoviridae), 레트로바이러스 과 (Retroviridae) 및 토가바이러스 과 (Togaviridae) 중 선택되는 어느 하나 이상에 의해 유발되는 것일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 유효성분인 상기 조성물 외에 약학으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 척추강 내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 흉골 내 투여, 종양 내 투여, 비내 투여, 뇌내 투여, 두개골 내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량(약학 유효량)을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명에서 약학 유효량은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명에서 예방은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 발명에서 치료는 질환 상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 내복약, 주사제 등 다양하게 제조될 수 있고, 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니고, 이와 등가 사상의 변형까지 포함한다.
[실시예 1: 본 발명의 나노디스크(면역디스크) 제작]
본 실시예에서는 항체의 Fc 영역이 융합된 막구조화 단백질(MSP-Fc)을 포함하는 본 발명의 나노디스크(면역디스크, Immunodisc; 이하 '면역디스크' 기재)를 제작하였다.
먼저, HEK293 세포에서 MSP-Fc 단백질을 발현 및 정제한 후, 인지질과 혼합함으로써 본 발명의 면역디스크를 제조할 수 있었다. (도 1).
1-1. 항체의 Fc 영역이 융합된 막구조화 단백질(MSP-Fc) 생산 및 정제
MSP-Fc 융합단백질 생산을 위해 MSP1E3D1를 코딩하는 서열과 항체의 Fc 영역을 코딩하는 서열(서열번호 2)로 구성된 플라스미드를 제조하였다.
HEK293 수용성 부유세포를 37℃, 120 rpm, 8% CO2의 조건하에서 배양하여, 1.1x106 cells/mL 180 mL 배양액을 준비하였다. 이후, 상기 제조한 플라스미드 250 μg과 PEI 750 μg를 배양 배지 20 mL에 혼합한 후, 상기 준비한 부유세포에 Transfection 하였다. 37℃, 120 rpm, 8% CO2 조건의 인큐베이터에서 세포를 96시간 배양한 후, 8000 g에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하고 상층액만 얻어냈다. Protein G resin에 상층액을 전부 흘려준 다음, Elution buffer(0.1 M Glycine, pH 2.8)를 흘려주어 Resin으로부터 단백질을 정제한 후, Neutralization buffer(1 M Tris, pH 9.0)를 처리하여 단백질의 pH를 pH 7.4로 조절해 안정화시켜 주었다.
이후, 얻어낸 단백질을 SDS-PAGE 젤에 전기영동한 결과, 측정된 분자량이 예상(58 kDa)과 동일한 것을 확인할 수 있었다(도 2).
1-2. 면역디스크의 제작 및 확인
인지질로서，POPC(l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)를 클로로포름에 녹여 25 mg/ml 농도가 되도록 POPC 용액을 준비하였다. 총 지질의 농도가 10 mM, 부피가 1 mL가 될수 있도록 POPC 용액 304 μL를 유리 튜브에 옮겼다. 이후, 질소가스와 진공을 이용해 용매를 제거하고, ND 완충액(40 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaC, pH 7.4) 1 mL을 혼합하여 수화시킨 후, 55℃에서 30분간 초음파 처리하여 POPC 지질 필름을 얻어냈다.
MSP-Fc:지질의 몰 비율이 1:120이 되도록 MSP-Fc와 PCPC 지질 필름을 혼합하였다. 전체 혼합액과 동일한 양의 바이오비드(bio-beads)를 실온에서 5시간 동안 처리한 후, 바이오비드를 제거하고, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 면역디스크(Immunodisc)를 정제하였다.
상기 제조된 면역디스크가 온전하게 제조된 것인지 확인하기 위해, 동적빛산란(DLS)으로 입자크기를 측정한 결과, Immunodisc의 크기는 14.2 nm로 기존의 나노디스크(ND, 11.6 nm)에 비해 약 2.5 nm 증가한 결과를 나타내며 온전하게 제작된 것을 확인할 수 있었다 (도 3의 A).
또한, 크기가 같은 리포솜과 나노디스크 형태를 구분하기 위해 다각도 광산란(SEC-MALS) 검출기를 통하여 기존의 ND와 Immunodisc의 분자량을 측정하였다. 일반 ND는 이론적 수치인 255 kDa와 1.7% 오차를 보였고, 본 발명의 면역디스크(Immunodisc)는 이론적 수치인 330 kDa와 3.2% 오차를 보이며 각각 259.6 kDa, 317.3 kDa으로 나타나며, 나노디스크 형태가 잘 구축되었음을 확인할 수 있었다 (도 3의 B).
1-3. 대형 면역디스크 제작
나노디스크의 크기를 키우면 내부에 약물을 더 많이 탑재할 수 있거나, 항바이러스 활성이 더 강해진다는 장점이 있다. 본 실시예에서는 MSP를 2번 반복해서 디스크의 크기를 2배로 만들 수 있는 막구조화 단백질(MSP2N2)을 코딩하는 서열과 항체의 Fc 영역을 코딩하는 서열(서열번호 4)을 사용하여 Fc 영역이 융합된 대형 막구조화 단백질(MSP2N2-Fc)을 상기 실시예 1-1의 방법으로 생산한 후, 상기 실시예 1-2의 방법으로 나노디스크를 제작하여 대형 면역디스크(P2N2-Immunodisc)를 제작하였다 (도 4).
1-4. 일반 면역디스크(Immunodisc) 및 대형 면역디스크(P2N2-Immunodisc)의 제작 수율 확인
본 실시예에서는 본 발명 면역디스크의 제작 수율을 확인하고자 했다. 이를 위해, 상기 실시예 1-2 및 1-3에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 면역디스크를 정제할 때, 나타나는 결과를 비교 분석하였다. 한편, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 컬럼은 Superose 6, Supedex 200을 사용하였고, 대조군으로는 동물세포(HEK293 수용성 부유세포)에서 생산한 항체의 Fc 부위가 없는 막구조화 단백질(hMSP, hMSP2N2)을 사용하는 경우로 설정하여 비교하였다 (도 5).
도 5의 A 및 B를 보면, 일반 MSP를 사용한 경우에는 대부분이 elution volume 약 9 mL 내외에서 용출되며, aggregation 형태로 제작된 것을 확인할 수 있다. 반면, Fc가 융합된 면역디스크는 대부분이 elution volume 약 14 mL 내외에서 용출되며 Monomer 형태로 제작된 것을 확인할 수 있다. 상기와 같은 결과는 항체의 Fc 영역이 융합된 막구조화 단백질(MSP-Fc)의 Fc영역이 나노디스크의 제작 수율을 증대시켰음을 의미한다.
도 5의 C는 상기 도 5의 A 및 B의 결과를 토대로 제작 수율을 계산하여 비교한 결과로, 일반 MSP 대비 MSP-Fc를 사용하여 제작한 경우, 제작 수율이 약 2.5배 증가한 것을 확인할 수 있다. 또한, P2N2-ND의 생산 수율은 약 5%였으며, P2N2-Immunodisc의 생산 수율은 약 15%으로 제작 수율이 약 3배 가량 증가한 것을 확인할 수 있다.
1-5. 바이러스 수용체로서 시알산(sialic acid)이 말단에 결합된 합성 수용체를 포함하는 면역디스크 제작
본 실시예에서는 면역디스크에 바이러스 수용체(virus receptor)를 탑재시켜, 항바이러스 효능이 더욱 향상된 면역디스크를 제작하고자 했다. 이를 위해, 인플루엔자 바이러스의 감염 수용체로 이용되는 시알산(sialic acid)을 포함하는 다당류 또는 당지질 중 하나인 강글리오사이드(Ganglioside, GD1a)와 시알릭락토오스(sialyllactose) 기반의 합성 수용체(T3, Tetra-(2,3)sialyllactose-(ethylenglycol)3-maleimido-(ethylenglycol)3-stearyo; T6, Tetra-(2,6)sialyllactose-(ethylenglycol)3-maleimido-(ethylenglycol)3-stearyo; 3slst, α(2,3)sialyllactose-(ethylenglycol)3-stearoyl; 6slst, α(2,6)sialyllactose-(ethylenglycol)3-stearoyl;)를 사용하여 면역디스크를 제작하였다.
유리 튜브에 25 mg/mL의 POPC 213 μL를 옮긴 후, 5 mg/mL의 GD1a 1102 μL, 10 mg/mL의 3slst 333.3 μL, 10 mg/mL의 6slst 333.3 μL, 10 mg/mL의 T3(Tetra-2,3-sialyllactose-stearic acid) 1363.63 μL, 10 mg/mL의 T6(Tetra-2,6-sialyllactose-stearic acid) 1363.63 μL를 각각 첨가하고 혼합하여 수용체-지질 혼합액을 얻어냈다. 수용체-지질 혼합액에 질소가스와 진공을 이용해 용매를 제거하여, POPC: 수용체의 몰비율이 7:3이 되는 수용체-지질 필름을 얻어낸 후, ND 완충액(40 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaC, pH 7.4) 1 mL로 수용체-지질 필름을 수화시키고, 55℃에서 30분간 초음파 처리하였다.
MSP2N2-Fc:지질의 몰 비율이 1:300이 되도록 막구조화 단백질과 수화된 수용체-지질 필름을 혼합한 후, 전체 혼합액과 동일한 양의 바이오비드(bio-beads)를 실온에서 5시간동안 처리한 다음 바이오비드를 제거하고, 크기배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제하여 바이러스 수용체-Immunodisc를 얻어냈다. 그 결과, Elution volume 약 14~15 mL에서 Monomer 형태의 바이러스 수용체가 포함된 대형 면역디스크(P2N2-Immunodisc-T3, P2N2-Immunodisc-T6, P2N2-Immunodisc-GD1a, P2N2-Immunodisc-6slst, P2N2-Immunodisc-3slst)가 제작된 것을 확인할 수 있었다 (도 6).
한편, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 결과를 통해, 일반적인 막구조화 단백질(MSP)를 사용하여 제작한 나노디스크와 제작 수율을 비교한 결과, 시알산(sialic acid)이 말단에 결합된 합성 바이러스 수용체를 포함하는 경우에도 면역디스크가 제작 수율이 약 1.5배로 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 7).
1-6. 바이러스 수용체로서 안지오텐신 전환효소 2(ACE)를 포함하는 면역디스크 제작
본 실시예에서는 면역디스크에 코로나 바이러스의 감염 수용체로 이용되는 ACE2(안진오텐신 전환효소 2, 서열번호 5)를 탑재시켜, 항바이러스 효능이 더욱 향상된 면역디스크(ACE2-Immunodisc)를 제작하고자 했다.
지질로서，POPC(l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)와 DOPS(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)을 클로로포름에 용해시켜 각 25 mg/ml, 10 mg/ml 농도의 지질 용액을 준비하였다. 이후 나노디스크(ND) 완충액(40 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaC, pH 7.4)으로 녹였을 때 총 지질의 농도가 10 mM, 부피가 1 mL가 되며 동시에 POPC: DOPS가 8:2의 몰비율이 되도록 POPC 용액의 243 μL, DOPS 용액의 65 μL를 유리 튜브에 옮겼다. 이후 질소가스를 가하고, 진공 상태에서 최소 4시간 동안 방치하여 용매를 제거한 후, 리피드 필름을 수득하였다. 상기 수득한 리피드 필름에 상기 ND 완충액 1 mL를 혼합하여 상기 리피드 필름을 수화시키고, 초음파를 55℃에서 30분간 처리하여, 지질이 일정하게 분배된 지질 현탁액을 수득하였다.
ACE2(분자량 94.2 kDa):MSP-Fc(분자량 57 kDa):지질의 몰 비율이 0.5:1:120이 되도록 혼합하였다. 이후 전체 혼합액과 동일한 양의 바이오비드(bio-beads)로 실온에서 5시간 동안 1회, 4℃에서 16시간 동안 1회, 총 2회 처리하여, 자가조립과정을 통해 ACE2 포함된 면역디스크(ACE2-immunodisc)를 제조하였다 (도 8의 A).
제조된 ACE2가 포함된 면역디스크를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석한 결과, ACE2가 포함된 면역디스크는 Elution volume 13~14 mL에서 발견되었다 (도 8의 B). Elution volume 13~14 mL의 분획물을 얻어내어 SDS-PAGE 분석을 진행한 결과, ACE2와 면역디스크의 Band가 관찰되었다 (도 8의 C). 이를 통해 13~14 mL에 해당하는 Monomer 물질이 ACE2가 포함된 면역디스크임을 확인할 수 있었다. 또한, DLS 분석 결과, ACE2가 포함된 면역디스크의 직경(19.5 nm)은 ACE2가 포함되지 않은 면역디스크의 직경(14.2 nm)보다 5.3 nm 커진 것을 확인하여, ACE2-면역디스크가 성공적으로 형성되었다는 것을 확인할 수 있었다 (도 8의 D).
한편, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 일반적인 막구조화 단백질(MSP)를 사용하여 제작한 나노디스크와 제작 수율을 비교한 결과, 면역디스크는 ACE2를 포함하더라도 Monomer 형태(elution volume 13~14 mL)로 형성됐지만, 일반적인 나노디스크는 ACE2-나노디스크(elution volume 14 mL)일부와 ACE2가 포함되지 않은 나노디스크(elution volume 16 mL)로 나뉘어 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과는, 기존의 나노디스크는 ACE2를 포함하지 않는 경우가 발생하지만 면역디스크는 모두 ACE2가 포함된 디스크의 형태로 균일하게 형성되었다는 것을 의미한다. 이를 통해, Fc 부위를 포함하는 막구조화 단백질(Fc-MSP)를 사용하는 경우 ACE2 탑재 능력이 향상되어, 더욱 높은 수율로 나노디스크를 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다 (도 9).
[실시예 2: 면역디스크의 항바이러스 효능 평가]
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 면역디스크의 우수한 항바이러스 효능을 확인하고자 했다.
2-1. 시알산(sialic acid)이 말단에 결합된 합성 바이러스 수용체를 포함하는 면역디스크의 항바이러스 효능 확인
인플루엔자 바이러스에 대한 중화 효능 실험을 진행하여, 상기 실시예 1-5에서 제작한 시알산(sialic acid)이 말단에 결합된 합성 바이러스 수용체를 포함하는 면역디스크와 나노디스크의 항바이러스 효능을 비교하였다.
구체적으로, 96웰 검은색 플레이트의 각 웰에 MDCK 세포를 1×104 Cells씩 접종하여 24시간 동안 배양하였다. A/Sydney/5/97 H3N2 인플루엔자 바이러스의 최종 농도가 0.01 MOI, 면역디스크의 최종 농도가 2 μM이 되도록 혼합한 후, PBS로 2회 세척한 DCK 세포에 처리하였다. 24시간 후, MUNANA를 최종 100 μM이 되도록 처리하고 37℃에서 1시간 배양하였다. 이후, 분광광도계로 흥분 파장 355 nm, 방출 파장 460 nm의 형광을 측정하여 중화효능을 비교하였다 (도 10의 A).
도 10의 A를 보면, 면역디스크는 250 nM부터 100% 중화효능을 나타내고, 30 nM에서는 58%의 중화효능을 나타낸 것을 확인할 수 있다. 반면, 일반적인 나노디스크는 250 nM에서 50%의 중화효능을 보였고, 30 nM에서 30%의 중화효능을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 상기와 같은 결과는, 면역디스크가 일반적인 나노디스크 보다 향상된 항바이러스 효능을 가짐을 의미한다.
또한, 인플루엔자 바이러스에 대한 플라크 감소 분석을 진행하여, 시알산(sialic acid)이 말단에 결합된 합성 바이러스 수용체를 포함하는 면역디스크와 나노디스크의 항바이러스 효능을 비교하였다.
구체적으로, 6웰 플레이트의 각 웰에 MDCK 세포를 1×106 Cells씩 접종하여 24시간 동안 배양하였다. MDCK 세포를 PBS로 2회 세척한 후, A/Sydney/7/97 H3N2 인플루엔자 바이러스를 100 PFU/mL 처리하였다. 각 웰에서 배양액을 제거하고, 나노디스크를 각 8.3, 25, 74, 222 또는 667 nM의 농도로 포함하는 아가로즈 용액(HEPES 25 mM, sodium bicarbonate 22 mM, DMEM, 1% 아가로스, pH 7.4) 1.5 ml을 세포에 처리한 후, 상온에 두어 고형화 시켰다. 이후 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 3일 동안 배양하고, 형성된 플라크의 개수를 측정하였다. 한편, 대조군으로는 Phosphate buffered saline (PBS)를 포함하는 아가로스 용액을 사용한 실험군을 사용하였다 (도 10의 B).
도 10의 B를 보면, 3slst를 포함하는 나노디스크와 면역디스크를 비교한 경우, 면역디스크는 222 nM에서 60%의 감염저해능을 나타내었다. 반면, 일반 나노디스크는 222 nM에서 40%의 감염저해능을 보임을 확인할 수 있었다. 또한, Ganglioside GD1a 수용체를 가진 나노디스크와 면역디스크를 비교한 경우, 면역디스크는 약 10배 이상 강한 항바이러스 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과는 면역디스크가 일반적인 나노디스크 보다 향상된 항바이러스 효능을 가짐을 의미한다.
또한, 면역디스크가 넓은 스펙트럼의 항바이러스 효능을 나타내는지 확인하기 위해 다양한 인플루엔자 바이러스에 대하여 중화효능 실험을 진행하였다.
구체적으로, 96웰 검은색 플레이트의 각 웰에 MDCK 세포를 1×104 Cells씩 접종하여 24시간 동안 배양하였다. A/X31 H3N2, A/Aquatic bird/Korea/w81/2005 H5N2, A/Sydney/5/97 H3N2, A/Puerto Rico/1934 H1N1, B/Shandong/7/97 인플루엔자 바이러스의 최종 농도가 0.005-0.01 MOI, 면역디스크의 최종 농도가 1 μM이 되도록 섞은 후, PBS로 2회 세척한 세포에 처리하였다. 24시간 후, MUNANA를 최종 100 μM이 되도록 처리하고 37도에서 1시간 배양하였다. 분광광도계로 흥분 파장 355 nm, 방출 파장 460 nm로 형광을 측정하여 중화효능을 비교하였다 (도 10의 C).
도 10의 C를 보면, 면역디스크가 서로 다른 종류의 외피를 가진 인플루엔자 바이러스에 모두 항바이러스 효능을 보임을 확인할 수 있었다. 한편, 바이러스 수용체로서 T3를 포함하는 면역디스크가 IC50 농도가 가장 낮으며, 가장 우수한 항바이러스 효능을 보였다.
2-2. ACE2(안진오텐신 전환효소 2)를 포함하는 면역디스크의 항바이러스 효능 확인
Authentic SARS-CoV-2 virus를 이용한 CPE inhibition assay를 진행하여, 상기 실시예 1-6에서 제작한 ACE2가 포함된 면역디스크와 나노디스크의 항바이러스 효능을 비교하였다.
구체적으로, Calu-3, Vero E6 세포를 2 X 105 cell/mL의 농도로 100 μL씩 96웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 분주하고 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 세포에서 배지를 걷어내고, 100 TCID50 (Tissue cell infectious dose)의 SARS-CoV-2 바이러스 50 μL와 다양한 농도로 희석된 항바이러스제 50 uL를 혼합해 주었다. 상기 혼합액 100 μL를 각 웰에 처리하여 37℃에서 1시간 동안 감염시킨 후, 상층액을 제거하고, 각 농도의 항바이러스제가 포함된 배지 100 μL를 각 웰에 분주하여 48~72시간 동안 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
세포의 상층액을 제거한 후, 4% 포름알데하이드를 각 웰당 100 μL씩 분주하고, 25℃에서 1시간 동안 반응시켜 고정을 진행한 후, 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액을 각 웰 당 100 μL씩 분주하여 25℃에서 1시간 동안 염색하였다. 크리스탈 바이올렛 용액을 제거하고, 각 웰당 100 μL의 메탄올을 처리하여 건조된 크리스탈 바이올렛을 용해시킨 후, 분광광도계를 이용해 570 nm의 파장 대의 흡수도를 측정하여 세포병변감소 효과를 측정하였다 (도 11).
도 11을 보면, ACE2포함 나노디스크보다 ACE2포함 면역디스크의 항바이러스 효능이 더 뛰어난 것을 확인할 수 있다. 한편, SARS-CoV-2는 세포를 감염할 때 크게 두가지 경로로 감염되는데, 첫번째는 Vero E6 세포와 같이 표면에 ACE2만 발현되는 경우의 감염 경로인, Endocytic pathway infection이 있다. 두번째로는 Calu-3 세포와 같이 ACE2와 TMPRSS2(서열번호 6)를 동시에 발현하고 있는 경우의 감염 경로인, Direct fusion infection이다.
[실시예 3: 면역디스크의 약동학적 성질 평가]
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 면역디스크의 약동학적 성질을 확인하고자 했다. 이를 위해, 마우스에 면역디스크를 주입한 후, 시간대 별로 체내 분포도를 확인하였다.
3-1. 면역디스크의 약동학적 성질 평가
scFv-Fc 형태의 항체 P2B-2FB(서열번호 7) 또는 면역디스크를 마우스 꼬리 정맥을 통해 주입한 후 12, 24, 48, 96, 168 시간이 경과할 때, 각 실험군 마우스로부터 혈액과 각각의 장기(Heart, Larynx, Trachea, Lung, Liver, Spleen, Kidney)를 채취한 후, 이를 분쇄하고 ELISA를 통해 체내에 주입된 항체 및 면역디스크의 농도를 확인하였다 (도 12).
도 12의 A는 각 장기별로 분포된 항체 또는 면역디스크의 농도를 나타내는데, 항체의 경우에는 다양한 장기에 넓게 분포된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 본 발명의 면역디스크는 간에 집중된 분포를 보였는데, 이는 면역디스크가 가진 단백질-지질 구조가 간세포가 인식하는 HDL와 비슷한 구조를 띄고 있어서 본 결과가 나온 것으로 추측된다.
도 12의 B는 마우스 Serum의 항체 또는 면역디스크의 농도를 나타내는데, 항체와 본 발명의 면역디스크 모두 유사한 수준의 반감기가 나타는 것을 확인할 수 있다. 상기와 같은 결과는 면역디스크가 항체와 유사한 수준의 뛰어난 약동력학적 성질을 지님을 의미한다.
3-2. ACE2를 포함하는 면역디스크의 약동학적 성질 평가
sACE2-Fc(서열번호 8) 또는 ACE2를 포함하는 면역디스크 4.5 mg/kg를 마우스 꼬리 정맥을 통해 주입한 후 12, 24, 48, 96, 168 시간이 경과할 때, 각 실험군 마우스로부터 혈액과 각각의 장기(Heart, Larynx, Trachea, Lung, Liver, Spleen, Kidney)를 채취한 후, 이를 분쇄하고 ELISA를 통해 체내에 주입된 항체 및 면역디스크의 농도를 확인하였다 (도 13).
도 13의 A는 각 장기별로 분포된 sACE2-Fc 또는 ACE2를 포함하는 면역디스크의 농도를 나타내는데, sACE2-Fc와 ACE2를 포함하는 면역디스크는 serum에 대다수가 존재하였으며, Larynx(후두)와 Trachea(기관)을 포함하는 상기도로 가장 주요하게 이동하는 것을 확인할 수 있었다.
도 13의 B는 마우스 Serum의 sACE2-Fc 또는 ACE2를 포함하는 면역디스크의 농도를 나타내는데, ACE2를 포함하는 면역디스크의 체내 반감기는 166.1hr로 sACE2-Fc의 반감기(23.5hr)에 비해 더욱 낮은 반감기를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
특히, 문헌상으로 보고된 통상적인 단백질 기반 나노디스크의 반감기는 0.5~2시간정도에서 최대 60시간 정도(Ilia G. Denisov and Stephen G. Sligar, 2017; Lorena Simσn-Gracia, 2022; Hyun-Ji Park, 2018)로 96시간이 지난 이후에는 거의 나노디스크가 혈액내에서 관찰되지 않았는데 (Hyun-Ji Park, 2018), 본 발명의 ACE2 포함 면역디스크는 48시간 이후에도 초기 면역디스크 농도와 상당한 차이 없이 거의 동일한 농도가 유지되는 것을 확인할 수 있었고, 168시간 이후에도 serum내의 면역디스크 농도가 초기의 40%정도의 높은 농도를 유지하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
[인용문헌]
1. Denisov, Ilia G., and Stephen G. Sligar. "Nanodiscs in membrane biochemistry and biophysics." Chemical reviews 117.6 (2017): 4669-4713.
2. Simon-Gracia, Lorena, et al. "Paclitaxel-Loaded Cationic Fluid Lipid Nanodiscs and Liposomes with Brush-Conformation PEG Chains Penetrate Breast Tumors and Trigger Caspase-3 Activation." ACS Applied Materials & Interfaces (2022).
3. Park, Hyun-Ji, et al. "High-density lipoprotein-mimicking nanodiscs carrying peptide for enhanced therapeutic angiogenesis in diabetic hindlimb ischemia." Biomaterials 161 (2018): 69-80.

Claims (13)

  1. 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층(lipid bilayer);
    상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 둘러싸는 막구조화 단백질(membrane scaffold protein, MSP); 및
    상기 지질 이중층과 소수성 결합되는 '바이러스 리셉터 (virus receptor)'를 포함하는 나노디스크(nanodisc)에 있어서,
    상기 막구조화 단백질에 Fc 절편 (Fc fragment)이 융합되어, Fc 절편이 상기 나노디스크의 측면 외부로 돌출된 나노디스크를 함유하는 것을 특징으로 하는 나노디스크.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인지질은,
    포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민(phophatidylethalolamine), 포스파티딜글리세롤(phophatidylglycerol) 및 포스파티딜이노시톨(phophatidylinositol) 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 나노디스크.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 인지질은,
    POPC(l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPS(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine), 및 POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노디스크.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 막구조화 단백질(membrane scaffold protein)은,
    헬릭스(helix) 구조를 갖는 양친매성 단백질인 것을 특징으로 하는 나노디스크.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 막구조화 단백질(membrane scaffold protein)은,
    아포리포단백질(apolipoprotein) 또는 아포리포단백질의 '헬릭스(helix) 구조 및 양친매성 특성'이 유지된 아포리포단백질의 절편인 것을 특징으로 하는 나노디스크.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 '바이러스 리셉터 (virus receptor)'는,
    안지오텐진 전환효소 2 또는 '시알산(sialic acid)이 말단에 결합된 화합물'인 것을 특징으로 하는 나노디스크.
  7. 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층(lipid bilayer);
    상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 둘러싸는 막구조화 단백질(membrane scaffold protein, MSP); 및
    상기 지질 이중층과 소수성 결합되는 '바이러스 리셉터 (virus receptor)'를 포함하는 나노디스크(nanodisc)에 있어서,
    상기 막구조화 단백질에 Fc 절편 (Fc fragment)이 융합되어, Fc 절편이 상기 나노디스크의 측면 외부로 돌출된 나노디스크를 함유하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 인지질은,
    포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민(phophatidylethalolamine), 포스파티딜글리세롤(phophatidylglycerol) 및 포스파티딜이노시톨(phophatidylinositol) 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 인지질은,
    POPC(l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPS(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine), 및 POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 막구조화 단백질(membrane scaffold protein)은,
    헬릭스(helix) 구조를 갖는 양친매성 단백질인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 막구조화 단백질(membrane scaffold protein)은,
    아포리포단백질(apolipoprotein) 또는 아포리포단백질의 '헬릭스(helix) 구조 및 양친매성 특성'이 유지된 아포리포단백질의 절편인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 '바이러스 리셉터 (virus receptor)'는,
    안지오텐진 전환효소 2 또는 '시알산(sialic acid)이 말단에 결합된 화합물'인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제7항에 있어서,
    상기 바이러스는,
    코로나바이러스 과(Coronaviridae), 버니아바이러스 과(Bunyaviridae), 필로바이러스 과(Filoviridae), 플라비바이러스 과(Flaviviridae), 헤파드나바이러스 과(Hepadnaviridae), 헤르페스바이러스 과(Herpesviridae), 오스소믹소바이러스 과(Orthomyxoviridae), 폭스바이러스 과(Poxviridae), 랍도바이러스 과(Rhabdoviridae), 레트로바이러스 과(Retroviridae) 및 토가바이러스 과(Togaviridae)로 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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