KR20230149155A - 에틸알코올 생성능이 개선된 증류주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 nibrfgc000500297 균주 및 이를 이용한 고품질의 증류주 제조 방법 - Google Patents

에틸알코올 생성능이 개선된 증류주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 nibrfgc000500297 균주 및 이를 이용한 고품질의 증류주 제조 방법 Download PDF

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조호철
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장영진
강재신
박길우
안초롱
문준웅
박천석
강길란
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Abstract

본 발명은 에틸알코올 생성능이 개선된 증류주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP)을 제공한다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP)은 발효한 1일차 밑술의 에틸알코올 함량이 5.1%(v/v)로 초기 발효력이 우수하여 잡균에 의한 오염에서 안전하고, 술덧의 최종 에틸알코올 함량이 18.9%(v/v)로 알코올 생성능이 우수한 특징이 있다.
또한, 본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP)은 1-propanol, 1-butanol, iso-amyl alcohol 등 알코올취, 용매취를 나타내는 퓨젤오일 성분을 저감시켜 깨끗한 맛과 동시에 산뜻한 향취를 지닌 증류주를 제조할 수 있으므로, 관능성이 개선된 고품질 증류주의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

에틸알코올 생성능이 개선된 증류주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000500297 균주 및 이를 이용한 고품질의 증류주 제조 방법{SACCHAROMYCES CEREVISIAE STRAIN FOR PRODUCING DISTILLED SPIRITS WITH HIGH ETHYL ALCOHOL PRODUCTION CAPACITY AND HIGH-QUALITY DISTILLED SPIRITS PRODUCTION METHOD USING SAME}
본 발명은 고농도의 에틸알코올 생성능을 갖고, 퓨젤오일 함량이 저감되어 알코올취 및 용매취가 개선된 증류주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000500297 균주 및 이를 이용한 고품질의 증류주 제조 방법에 관한 것이다.
곡류, 과실류, 서류 등을 발효시킨 술덧을 증류장치를 이용하여 증류하게 되면 알코올 도수가 높고, 오래 보관하더라도 변질되지 않는 증류주를 만들 수 있다. 우리나라는 13세기 원나라로부터 고리가 전파되면서 곡류를 발효시킨 술덧을 증류하여 소주를 빚기 시작하였는데, 독특한 향기와 고유의 맛으로 선조들로부터 사랑을 받으며 오늘날까지 이어져 내려오고 있다. 최근 들어 한국 고유의 증류주에 관심이 증가하고 있으며, 성장을 거듭하는 증류주 시장에서 소비자 기대치를 충족하기 위해서는 고품질 증류주 제품의 개발이 필요하며, 이를 통해 경쟁력을 확보하고, 소비자 신뢰도를 높일 수 있다. 또한, 증류주의 품질 향상과 경쟁력을 담보하기 위해 우수한 양조 미생물의 확보가 매우 중요하다.
양조 과정에서 효모가 만들어낸 술덧은 고급 향기성분 및 알코올 수율에 매우 큰 영향을 미치며 증류한 최종 제품의 품질에도 지대한 영향을 준다. 그러나, 우리 전통주의 주조에 활용할 수 있는 효모는 매우 제한적이다. 실제로 효모 제품의 국내시장 규모는 연 230억이나, 대부분 수입에 의존하는 실정이며, 이로 인해 국산 주류의 전통성이 담보되지 못할 뿐 아니라, 외화 낭비도 심각한 실정이다.
특히, 곡류를 발효한 소주와 같은 증류주에 사용되는 양조효모의 종류 및 사용량은 매우 제한적이며, 이로 인해 실제 많은 양조장에서는 수입 제빵효모를 사용하고 있는 등 고품질 증류주 생산에 많은 제약이 따르는 실정이다. 또한, 국내산 양조효모의 경우에도 대부분 동일한 업체의 효모를 이용하는 결과로 지역마다의 차별성이 없어지고, 주질이 획일화되는 결과를 초래하게 되었다. 따라서, 우수한 풍미를 갖는 증류주 양조를 위해서는 다양한 효모 균주의 개발이 필요한 실정이다.
이러한 국내 현실을 반영하여 다양한 풍미를 나타내는 자생 효모 균주를 개발하고자, 본 발명자들은 전국의 꽃, 열매, 누룩, 토양 등에서 야생 효모 1,700여 균주를 순수 분리·배양하여 보존 중이며, 이중 배양이 쉽고 알코올 발효 능력이 있어 양조에 활용이 가능한 88개 균주를 대상으로 양조 품질과 적합성을 평가하였다. 그 결과, 고농도의 에틸알코올 생성능을 갖는 증류주 제조에 적합한 우수한 양조효모의 특성을 규명하여 본 발명을 완성하게 되었다.
(0001) 특허등록 제10-1715040호, 효모 사카로마이세스 세레비지애 HDSY-03를 이용하여 제조된, 에스테르 성분이 강화된 증류주 (0002) 특허공개 JP 제2020-103222호, 인돌 생산 효모를 이용하는 증류주 제조 방법 및 인돌 고생산 효모와 그 육종 방법 (0003) 특허공개 제10-2021-0056007호, 맛과 향이 우수한 증류주의 제조방법
따라서, 본 발명의 주된 목적은 고농도의 에틸알코올 생산능력을 가진 증류주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP)을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP)을 이용하여 퓨젤오일 함량이 저감되고 알코올취 및 용매취가 개선된 고품질 증류주의 제조방법과 이에 따라 제조된 고품질의 증류주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 에틸알코올 생성능이 개선된 증류주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP)을 제공한다.
본 발명자들은 증류주 제조에 사용되는 수입산 효모 또는 국내산 송천효모를 대체할 수 있는 고품질의 효모 균주를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP)이 시중에서 판매되는 상용 효모보다 고농도의 에틸알코올 생산능력을 가지며, 초기 발효력이 뛰어나 안전 양조에 유용하고, 감압, 상압 등 다양한 증류 방식에 적합한 특성이 있으며, 고품질의 증류주 생산에 유용함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 고농도의 에틸알코올 생산능력을 가진 증류주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297은 국립생물자원관에서 분리·배양한 야생효모 1,700여 균주 중 배양이 쉽고, 알코올 발효 능력이 있어 양조에 활용이 가능한 88개 균주를 대상으로 효모의 크기와 모양, 유기산 생성력, 발효도, 당 이용성 확인, 포자 생성(Sporulation), 발효 안정성 등의 연구와, 발효 실험을 통해 양조용으로 활용 가능성이 큰 33종을 1차 선발한 후, 2차 시험양조를 통해 발효가 완료된 술덧의 최종 에틸알코올 도수가 15.5%(v/v) 이상이며 발효 술덧의 향기가 뛰어난 효모 5종을 2차 선발하고, 최종적으로 에틸알코올 생성력, 발효의 안정성, 발효 비율, 증류 비율, 향기 성분 분석 및 관능평가를 통해 도출된 고품질의 증류주 제조용 효모이다. 상기 균주는 2022년 2월 17일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000500297 균주로 기탁하여 수탁번호 KACC 83060BP를 부여받았다. 본 발명에서 "사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000500297 균주", "NIBRFGC000500297 균주" 및 "500297 균주"는 동일한 의미로 서로 혼용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "증류주"는 양조 과정을 통해 얻은 술덧을 추가로 증류하여 제조되는 알코올 농도가 높은 술을 의미한다. 증류주는 원료로 쌀이나 보리 등의 곡류, 사과, 체리, 서양배 등의 과일, 또는 사탕수수, 용설란, 감자류 등을 발효시켜 제조한 술덧을 증류해 알코올 농도를 높인 것으로, 대표적인 예로는 소주, 보드카, 럼, 데낄라, 진, 아쿠아 비트, 코른, 위스키, 브랜디, 칼바도스, 키르슈 등이 잘 알려져 있다.
본 발명에서 상기 균주로 발효한 1일차 밑술의 에틸알코올 함량은 5.1%(v/v)이고, 상기 균주로 발효한 술덧의 최종 에틸알코올 함량은 18.9%(v/v)인 것을 특징으로 한다. 도 1을 참조하면, 밑술 발효 1일차에 에틸알코올 함량은 5.1%(v/v)이었고, 2일차에 10.2%(v/v)이었으며, 4일차에 14.9%(v/v)로 측정되었다. 밑술 및 본담금 초기 알코올 생성력이 좋은 효모를 사용한 전통주 제조의 경우, 본담금 직후부터 술덧의 알코올 함량이 높은데, 알코올 도수가 높아짐에 따라 알코올 내성이 약한 오염균들이 저해되는 요인으로 작용한다. 따라서 밑술 및 본담금 초기 발효 진행 속도가 빠르다는 것은 높은 알코올 생성으로 다른 미생물 오염을 줄여서 안전한 발효에 유용하고 양조공정 관리에 효율적이다. 또한, 증류주용 양조효모의 제조에서 술덧의 알코올 함량이 높아지면 증류 과정에서 얻어지는 증류주 용량을 더 늘릴 수 있어 높은 수율을 가진다.
발효 진행 속도와 술덧의 최종 에틸알코올 함량에 대한 실험 결과를 통해 검토해 본 바, 본 발명의 NIBRFGC000500297 균주는 발효한 1일차 밑술의 에틸알코올 함량이 5.1%(v/v)이고, 본담금 10일 경과 시점의 에틸알코올 함량이 18.9%(v/v)로, 낮은 pH, 높은 에틸알코올 술덧에서 잘 증식하고 발효 초기부터 말기까지 지속해서 강한 에틸알코올 생성능(표 2 및 표 3 참조)을 보유하고 있으므로, 고품질의 증류주 제조에 특화된 균주이다.
본 발명에서, NIBRFGC000500297 균주는 94.1%의 발효 비율을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 효모가 전분을 에틸알코올로 얼마나 전환하는지를 간접적으로 판단할 수 있는 발효 비율(%)을 하기 [식 1]에 따라 비교 분석하였다.
[식 1]
실험 결과, NIBRFGC000500297 효모를 사용한 제조예 4가 94.1%로 가장 높았고, 송천효모를 사용한 비교예 1, NIBRFGC000500289 효모를 사용한 제조예 5 및 NIBRFGC000500310 효모를 사용한 제조예 1이 각각 90.2%, 89.7%, 88.7%의 순으로 분석되었는 바, 본 발명의 NIBRFGC000500297 균주가 전분 원료를 에틸알코올로 가장 효율적으로 전환하는 증류주 양조 적성이 가장 우수한 균주임을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000500297 균주는 송천효모 대비 퓨젤오일 생성을 저감시켜 증류주의 알코올취 및 용매취를 개선시키는 것을 특징으로 한다. 상기 퓨젤오일의 예로는 1-프로판올(1-propanol), 1-부탄올(1-butanol) 및 이소 아밀 알코올(iso amyl alcohol) 일 수 있다.
알코올 도수가 높은 증류주에서는 기본적으로 에틸알코올 함량이 높기 때문에 높은 퓨젤오일 함량은 알코올취 및 용매취가 더욱 강하게 느껴져 거부감을 일으키며, 오히려 퓨젤오일 함량이 낮은 경우가 경쾌하고 부드러운 느낌을 준다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 NIBRFGC000500297 균주로 발효한 술덧을 감압 또는 상압 증류한 증류주의 퓨젤오일 생성량은 송천효모 대비 저감된 것을 확인하였는데, 구체적으로 본 발명의 감압 증류주는 퓨젤오일인 1-propanol, 1-butanol 및 iso amyl alcohol의 함량이 시판 중인 송천효모로 제조한 증류주에 비해 각각 29%, 37%, 19% 낮았고, 상압 증류주에서도 1-propanol, 1-butanol 및 iso amyl alcohol의 함량이 송천효모로 제조한 증류주에 비해 각각 41%, 25%, 32% 낮은 것을 확인하였으며, 이로 인해 본 발명의 증류주가 월등히 부드럽고 경쾌한 향기와 관능적인 풍미가 우수한 특징을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 정제수에 입국 및 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP)을 첨가하고 4일 내지 5일 동안 발효하여 밑술을 제조하는 단계; 상기 밑술에 팽화미, 정제효소제 및 정제수를 첨가하고 6일 내지 15일 동안 발효하여 담금하는 단계; 상기 제조된 숙성술덧을 상압 또는 감압 증류하여 원주를 수득하는 단계; 및 상기 수득된 원주를 냉각 및 여과하는 단계;를 포함하는 증류주 제조 방법을 제공한다.
상기 전분질 원료인 팽화미 원료 중량의 5% 내지 35%에 해당하는 입국을 밑술 제조단계에 사용할 수 있으며, 급수되는 정제수는 전분질 원료 대비 120% 내지 200%의 중량으로 투입할 수 있다. 또한, 정제효소제는 전분 원료 대비 0.02% 내지 0.06% 중량으로 사용할 수 있으며, 효모는 1㎖ 당 8×107 내지 8×108 cfu의 균수로 배양하여 입국 100 중량부 대비 1.0㎖ 내지 9.3㎖의 부피로 사용할 수 있고, 바람직하게는 1㎖ 당 2×108 cfu의 균수로 배양하여 입국 100 중량부(g) 대비 2.5㎖의 부피로 사용할 수 있다. 밑술 제조 단계에서의 발효는 4일 내지 5일 동안 진행하는 것이 바람직하고, 본담금의 발효는 6일 내지 15일, 보다 바람직하게는 7일 내지 11일, 가장 바람직하게는 8일 내지 10일 정도 진행하는 것이 좋은데, 담금 단계에서 에틸알코올 도수의 변화가 없는 경우 발효과정을 종료할 수 있다.
본 발명의 증류주 제조 방법에서, 상기 원주를 수득하는 단계의 상압 증류는 상압단식증류기(Pot still)를 이용하여 증류 원액의 에틸알코올 도수가 30%(v/v) 내지 60%(v/v)가 되도록 상압 증류하여 원주를 수득하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 원주를 수득하는 단계의 감압 증류는 감압단식증류기(vacuum still)를 이용하여 증류 원액의 에틸알코올 도수가 30%(v/v) 내지 60%(v/v)가 되도록 감압 증류하여 원주를 수득하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 증류주 제조 방법에 따라 제조되고, 알코올취 및 용매취가 개선된 고품질의 증류주를 제공한다. 본 발명의 증류주는 에틸알코올 함량이 높고, 발효과정에서 생성되는 알코올취, 용매취가 개선되어 깨끗한 맛과 산뜻한 향취를 갖는 것을 특징으로 하는데, 구체적으로 본 발명의 증류주는 1-프로판올(1-propanol), 1-부탄올(1-butanol) 및 이소 아밀 알코올(iso amyl alcohol)로 구성된 퓨젤오일 함량이 송천효모 대비 저감되어 알코올취 및 용매취가 개선된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 고품질의 증류주 제조 방법과 고품질의 증류주는 상술한 본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP)에 의해 제조되는 것이기 때문에, 이들 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 고품질의 증류주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP)을 제공한다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP)은 발효한 1일차 밑술의 에틸알코올 함량이 5.1%(v/v)로 초기 발효력이 우수하여 잡균에 의한 오염에서 안전하고, 술덧의 최종 에틸알코올 함량이 18.9%(v/v)로 알코올 생성능이 우수한 특징이 있다.
또한, 본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP)은 1-propanol, 1-butanol, iso-amyl alcohol 등 알코올취, 용매취를 나타내는 퓨젤오일 성분을 저감시켜 깨끗한 맛과 동시에 산뜻한 향취를 지닌 증류주를 제조할 수 있으므로, 관능성이 개선된 고품질 증류주의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 6종 효모를 이용하여 제조된 증류주 술덧의 발효 경과에 따른 에틸알코올 함량을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000500297 균주를 YPD 배지에서 배양하고, 배양 형태를 촬영한 사진이다.
도 3은 사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000500297 균주를 YPD 배지에서 배양하고, 광학현미경(왼쪽, 1,000배)과 주사전자현미경(오른쪽)으로 촬영한 사진이다.
도 4는 YT 마이크로플레이트(MicroPlate)를 이용하여 NIBRFGC000500297 균주의 페노타입 마이크로어레이(phenotype microarray) 분석을 수행한 결과이다[위의 표는 산화(oxidation), 아래 표는 동화(assimilation) 분석 결과임].
도 5는 NIBRFGC000500297 균주의 유연관계를 분석한 계통도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 실험 재료 및 방법
1-1. 효모 균주
국립생물자원관에서 분리·배양하여 보존 중인 효모 88 균주를 대상으로 효모의 크기와 모양, 유기산 생성력, 발효도, 당 이용성 확인, 포자 생성(Sporulation), 발효 안정성 등의 평가와 시험양조를 통해 양조용으로 사용 가능한 33 균주를 1차 선발하였다. 이후, 2차 시험양조를 통해 발효가 완료된 술덧의 최종 에틸알코올 도수가 15.5%(v/v) 이상이며, 발효 술덧의 향기가 뛰어난 효모 5 균주를 선발하여 실험에 사용하였다.
2차 선발된 효모 5종 균주는 Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000500310(전남 구례군 채집, 산수유), Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000503472(경기도 남양주 채집), Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000503478(강원도 홍천군 채집), Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000500297(제주시 연동 채집, 지역누룩), Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000500289(충남 천안 채집, 지역누룩)의 5종 균주이다. 비교예로는 시판 중인 송천효모를 사용하였다.
효모 균주는 20% glycerol stock으로 -45℃에 보관하였고, YMA 평판배지에 도말하여 콜로니(colony)를 확인 후, YMB 액체배지에 배양하여 사용하였다. 배지는 Yeast Malt Broth(MB Cell), Yeast Malt Agar(MB Cell) 제품을 사용하였다.
1-2. 증류주 원료
증류주 제조에 사용한 전분 원료는 쌀을 고온, 진공, 팽창시켜 만든 팽화미(국내산, ㈜조은곡식)를 사용하였고, 발효제로는 입국(역가 60sp, ㈜조은곡식)과 정제효소제(역가 15,000sp, ㈜바이오랜드)를 사용하였다.
1-3. 증류주 제조
숙성술덧 담금 방법은 전분 원료인 팽화미 원료의 25%에 해당하는 입국을 사용하였으며, 급수량은 전분원료 대비 160%로 하였다.
정제효소제는 전분 원료 대비 0.04% 사용하였으며, 효모는 1㎖ 당 2×108 cfu의 배양액 40㎖를 넣어주었다. 에틸알코올 도수의 변화가 없으면 술덧의 발효를 정지시키고, 에틸알코올 등 품질분석을 바로 진행하였으며, 감압단식증류기(vacuum still) 또는 상압단식증류기(Pot still)를 사용하여 증류를 진행하였다.
감압증류는 14.5L의 숙성술덧을 증류기에 넣고, 본류 유출시간까지 30~40분, 그 후 60~70분 증류하여 본류 5L 내지 5.3L를 수득하였고, 본류의 알코올 도수는 41%(v/v) 내지 52%(v/v)이다.
상압증류는 5L의 숙성술덧을 증류기에 넣고 본류 유출시간까지 20분 내지 30분, 그 후 60분 내지 70분 증류하여 알코올 도수 41%(v/v) 내지 50%(v/v)인 본류 1.7L 내지 1.9L를 수득하였다
1-4. 성분 분석
[당도]
당도 측정은 알코올 도수 측정 후 남은 잔액을 이용하여 디지털 당도 측정기(Atago, Japan)를 통해 °Brix로 측정하였다.
[총산 및 아미노산도]
총산 및 아미노산도는 AOAC법을 참고하여 국세청 주류분석규정(국세청 기술 연구소, 2008)에 따라 CO2를 제거한 시료 상층액 10㎖를 전위차 측정기(Metrohm, 855 Robotic Titrosampler)를 사용하여 0.1N NaOH pH 8.2가 될 때까지 적정한 ㎖ 수를 산도로 하고, 여기에 중성 포르말린 용액 5㎖를 가하여 유리된 산을 0.1N NaOH pH 8.2이 될 때까지 적정한 ㎖수를 아미노산도로 하였다.
초산으로 환산한 값을 총산으로 하여 g/100㎖ 단위로 나타내었다.
(총산)
Total acid(as acetic acid) g/100㎖ = 적정 ㎖ 수 × 0.006 × 10
글리신으로 환산한 값을 아미노산도로 하여 g/100㎖ 단위로 나타내었다.
(아미노산도)
Amino acid(as grycine) g/100㎖ = 적정 ㎖ 수 × 0.0075 × 10
[불휘발분]
시료 25㎖(15℃)를 증발접시에 넣고, 물 중탕기에서 가열하여 충분히 증발시킨 후, 건조기를 이용하여 105~110℃에서 2시간 건조하였다. 건조 시료를 데시케이터에서 식힌 후(30분 방치) 무게를 달아 증발접시 무게를 제외하여 측정한 후, 측정값에 4배로 곱하여 불휘발분의 그램 수를 산출하였다.
[주요 향기성분]
Gas Chromatography/Flame Ionization Detector(GC/FID)(Agilent 7890, Agilent Technologies INC., Santa Clara, USA)를 이용하여 향기성분을 분석하였다.
분석시료를 20mL 바이알(vial)에 캡(cap)을 닫아 밀봉한 후, 헤드스페이스 샘플러(headspace sampler)(7697Am Agilent Technologies INC.. Santaclara, USA)에 넣고, 오븐(oven) 70℃, 루프(loop)(3㎖) 80℃, 라인(line) 90℃로 유지하여 GC/FID 장치에 주입하여 분석하였다. Column은 Agilent HP-FFAP(30m x 320㎛ x 0.25㎛)를 사용하였고, 캐리어 가스(Carrier gas)는 N2, 오븐(Oven) 온도는 40℃에서 4분간 유지 후 5℃/min의 속도로 100℃까지 상승시켰으며, 이후 6℃/min으로 200℃까지 상승 후 4분 유지하고, 10℃/min으로 220℃까지 상승시켰다. 스플릿 비율(Split ratio)은 10:1, 유량(Flow rate)은 0.8㎖/min의 조건으로 분석하였다.
실시예 2. 술덧의 제조
상기 실시예 1-1에서 2차 선발 과정을 통해 선정된 효모 균주 5 균주[Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000500310(전남 구례 채집, 산수유), Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000503472(경기도 남양주 채집), Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000503478(강원도 홍천군 채집), Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000500297(제주시 연동 채집, 지역누룩) 및 Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000500289(충남 천안 채집, 지역누룩)]의 발효 성능을 분석하기 위해 숙성술덧을 제조하였다. 비교예로는 시판 중인 송천 효모를 사용하였다.
먼저, 밑술은 입국을 사용하였으며, 전체원료 8,000g 대비 20%인 1,600g을 사용하였고, 급수는 입국 대비 160%인 2,560㎖를 사용하였으며, 1㎖ 당 2×108 cfu로 배양한 효모 40㎖를 첨가하고, 발효는 4일간 발효시켰다. 밑술 완료 후, 팽화미 6,400g과 물 12,670㎖, 정제효소제 3.2g을 첨가하였고, 담금발효 기간은 11일 정도 진행하여 최종 발효가 멈추는 단계까지 발효시킨 후, 100 mesh 주대를 이용하여 숙성술덧을 거르고, 기본 성분분석과 기기분석을 실시하였다. 양조 담금법은 하기 [표 1]에 정리하였다.
[표 1]
실시예 3. 발효 술덧의 발효 진행 속도 분석
3-1. 발효 진행 속도 분석
각 실험군별 발효 경과에 따른 에틸알코올 함량 분석을 수행하고, 분석 결과를 도 1에 정리하였다.
각 실험군별 17일간 발효시킨 후 알코올 도수를 측정한 결과를 정리한 [도 1]을 참조하면, 제조예 1(NIBRFGC000500310 균주) 17.8%(v/v), 제조예 2(NIBRFGC000503472 균주) 15.7%(v/v), 제조예 3(NIBRFGC000503478 균주) 16.3%(v/v), 제조예 4(NIBRFGC000500297 균주) 18.9%(v/v), 제조예 5(NIBRFGC000500289 균주) 18.0%(v/v) 및 비교예 1(송천효모) 18.1%(v/v)의 순으로 측정되었다.
효모의 종류를 달리한 5개 제조예와 비교예의 밑술 및 담금 기간 동안 에틸알코올의 생성 경과를 살펴보았다. 밑술 발효 구간에서는 제조예 1(NIBRFGC000500310 균주), 제조예 4(NIBRFGC000500297 균주), 제조예 5(NIBRFGC000500289 균주)가 비교예인 송천효모에 비해 초기 발효 속도가 빠른 것으로 분석되었다.
발효 1일째에는 NIBRFGC000500297 및 NIBRFGC000500289 균주를 사용한 제조예의 발효가 빨랐고, 발효 4일이 경과한 후에는 NIBRFGC000500297, NIBRFGC000500289 및 NIBRFGC000500310 균주를 사용한 제조예의 에틸알코올 생성량이 각각 14.9 %(v/v), 14.2 %(v/v) 및 14.2 %(v/v)의 순으로 높았다.
초기 알코올 생성력이 좋은 효모의 경우, 높은 알코올 함량을 가지게 되고, 알코올 도수가 높아짐에 따라 알코올 내성이 약한 오염균들의 저해되는 요인으로 작용한다. 따라서 초기 발효 진행 속도가 빠르다는 것은 높은 알코올 생성으로 다른 미생물 오염을 줄여서 안전한 발효에 유용하고 양조공정 관리에 효율적이다. 밑술 발효 4일까지의 에틸알코올 생성량을 하기 [표 2]에 정리하였다.
[표 2]
발효 5일째 본담금 하였고, 술덧이 희석되어 알코올 도수는 2.5%(v/v) 내지 3.0%(v/v)로 낮아졌다. 이후 발효를 계속 진행하였고 더 이상 에틸알코올 함량 변화가 없어 본담금 12일 후 발효를 중단하였다. 발효 결과, NIBRFGC000503472 균주 및 NIBRFGC000503478 균주는 최종 알코올 농도가 각각 15.7%(v/v) 및 16.3%(v/v)로 알코올 생성이 가장 저조한 것으로 확인되었다. 또한, 급격한 거품발생과 함께 끓어 넘침 현상이 발생하였는데, 병행복발효 방식으로 담금 횟수를 증가시키는 방식을 적용하는 술덧의 발효공법에서 덧술 첨가에 따라 초기 발효가 저해되는 NIBRFGC000503472 및 NIBRFGC000503478 효모 균주는 증류주 양조용 효모로는 부적합한 것으로 확인할 수 있었다.
비교예인 송천효모 균주의 경우 밑술 발효에서는 비교적 낮은 에틸알코올 함량을 나타냈으나, 본담금 이후에는 급속한 발효 진행 경과를 보이는바, 이러한 급속한 발효는 오히려 바람직하지 않은 발효 경과이다. 본담금 후 12일까지의 에틸알코올 생성량을 하기 [표 3]에 정리하였다.
[표 3]
[표 3]을 참조하면, NIBRFGC000500297 효모 균주를 사용한 제조예 4는 초기 발효가 가장 빠르게 진행되었고, 발효 17일째 최종 알코올 함량도 18.9%(v/v)로 가장 높게 분석되었다. NIBRFGC000500310 효모 균주를 사용한 제조예 1과 NIBRFGC000500289 효모 균주를 사용한 제조예 5는 초기 발효가 다소 느렸으나, 최종 알코올 함량는 각각 17.8%(v/v) 및 18.0%(v/v)로 비교적 높게 분석되었다.
본담금 초기 알코올 생성력이 좋은 효모의 경우, 본담금 직후부터 높은 알코올 함량을 가지게 되고, 알코올 도수가 높아짐에 따라 알코올 내성이 약한 오염균들의 저해되는 요인으로 작용한다. 따라서 본담금 초기 발효 진행 속도가 빠르다는 것은 높은 알코올 생성으로 다른 미생물 오염을 줄여서 안전한 발효에 유용하고 양조공정 관리에 효율적이다.
또한, 효모가 전분을 에틸알코올로 얼마나 전환하는지를 간접적으로 판단할 수 있는 발효 비율을 비교한 결과, NIBRFGC000500297 효모를 사용한 제조예 4가 94.1%로 가장 높았고, 송천효모를 사용한 비교예 1, NIBRFGC000500289 효모를 사용한 제조예 5 및 NIBRFGC000500310 효모를 사용한 제조예 1이 각각 90.2%, 89.7%, 88.7%를 기록하였으며, NIBRFGC000503478 효모를 사용한 제조예 3 및 NIBRFGC000503472 효모를 사용한 제조예 2는 각각 81.2% 및 78.2%로 낮게 측정되었다. 각 효모를 사용한 숙성술덧의 발효 비율을 [표 4]에 정리하였다.
[표 4]
증류주 양조효모의 발효 상태만을 고려할 때, 초기 발효력이 뛰어나고 발효가 안정적이면서 발효 속도가 빠르며, 높은 알코올 생성 능력을 갖춘 효모가 적합하다. 이는 발효 초기에 오염균에 대한 영향이 적어 안전한 양조가 가능하고, 높은 에틸알코올 생성력으로 증류주 제조 시 높은 수득률을 보이기 때문이다.
발효 진행 속도와 숙성술덧의 최종 에틸알코올 함량, 발효 비율을 검토해 본 결과, 증류주 제조에 적합한 양조용 효모로는 NIBRFGC000500297 균주가 적합한 것으로 분석되었다.
3-2. 일반 성분 분석
상기 실시예 3-1의 발효가 끝난 제조예 및 비교예의 숙성술덧에 대하여 일반성분을 분석하였고, 하기 [표 5]에 정리하였다.
[표 5]
실시예 4. 감압, 상압증류 후 성분 분석
4-1. 감압 및 상압 증류
발효가 끝난 제조예 1~5 및 비교예 1의 숙성술덧을 감압증류기 및 단식증류기로 증류한 결과, NIBRFGC000500297 균주로 제조한 숙성술덧의 감압 및 상압 증류주의 증류비율은 각각 93.4%, 93.7%로, 다른 제조예와 비교예에 비해 증류 효율이 높은 것으로 나타났다. 증류에 따른 에틸알코올 함량과 증류 비율을 하기 [표 6] 및 [표 7]에 정리하였다.
[표 6]
[표 7]
4-2. 감압 및 상압 증류주의 향기성분 분석
증류 원액의 에틸알코올 함량을 40%로 조정한 다음 실시예 1-4의 향기성분 분석 방법에 따라 분석한 결과를 하기 [표 8] 및 [표 9]에 정리하였다.
[표 8] 감압증류 향기성분
[표 9] 상압증류 향기성분
4-3. 증류주 주요 향기 성분분석
4-2의 향기성분 분석 결과 중 실시예 3에서 증류주 양조효모로 적합한 것으로 나타난 NIBRFGC000500297 균주와 비교예 1의 송천효모로 제조한 증류주의 퓨젤오일인 1-propanol, 1-butanol, iso amyl alcohol 등 알코올취 및 용매취를 나타내는 성분의 비교 분석 결과(감압, 상압증류)를 [표 10] 및 [표 11]에 정리하였다.
[표 10] 감압증류
[표 11] 상압증류
NIBRFGC000500297 균주로 발효한 술덧을 감압증류한 증류주에서 알코올취, 용매취를 나타내는 퓨젤오일인 1-propanol, 1-butanol 및 iso amyl alcohol의 함량은 시판 중인 송천효모로 제조한 비교예 1의 증류주에 비해 각각 29%, 37%, 19% 낮았고, 상압증류한 증류주에서도 퓨젤오일인 1-propanol, 1-butanol 및 iso amyl alcohol의 함량이 비교예 1에 비해 각각 41%, 25%, 32% 낮았다.
알코올 도수가 높은 증류주에서는 기본적으로 에틸알코올 함량이 높기 때문에 높은 퓨젤오일 함량은 알코올취 및 용매취가 더욱 강하게 느껴져 거부감을 일으키며 오히려 퓨젤오일 함량이 낮은 경우가 경쾌하고 부드러운 느낌을 준다.
감압 및 상압증류 모두 NIBRFGC000500297 균주가 비교예 1(송천효모)에 비해 월등히 부드럽고 경쾌한 향기와 관능 상의 풍미가 뛰어난 것으로 나타났다.
실시예 5. 관능 평가
5종 효모와 송천효모로 제조한 술덧을 감압 또는 상압 증류한 증류주에 대한 관능 평가는 국세청주류면허지원센터의 관능평가 전문 패널(n=10)이 참여하여 외관, 맛, 향기, 감촉 항목에 대하여 묘사분석으로 평가하였다. 외관과 감촉 항목은 최저점 1에서 최고점 3점으로, 맛과, 향기 항목은 최저점 1에서 최고점 6점으로 하여 평가점수의 평균값을 하기 [표 12] 및 [표 13]에 정리하였다.
[표 12] 감압증류
[표 13] 상압증류
여과 정도 등 외관을 평가하는 항목은 무색, 투명한 증류주의 특성상 모든 균주에서 동일한 점수를 얻었고, 감촉은 NIBRFGC000500310 균주, NIBRFGC000500297 균주 및 NIBRFGC000500289 균주로 제조한 증류주가 좋은 점수를 얻었고, 향기와 맛 항목에서 모두 좋은 평가를 받은 증류주는 NIBRFGC000500297 균주로 제조된 증류주이다. 감압 또는 상압증류에 따른 약간의 차이는 있으나 증류 방식이 같으면 동일한 경향을 보였다.
효모별로 제조한 제조예 1 내지 5의 증류주에 대한 항목별 평가 결과를 종합하면, NIBRFGC000500310 균주와 NIBRFGC000500297 균주, NIBRFGC000500298 균주가 발효 초기에 오염균에 대한 영향이 적고 안전한 양조가 가능하며, 높은 에틸알코올 생성력을 갖는다.
향기성분 분석 결과를 보면 NIBRFGC000500297 균주가 알코올취, 용매취를 나타내는 퓨젤오일인 1-propanol, 1-butanol 및 iso amyl alcohol의 함량이 낮은데, 전술한 바와 같이 알코올 도수가 높은 증류주에서는 기본적으로 에틸알코올 함량이 높기 때문에 높은 퓨젤오일 함량은 알코올취 및 용매취가 더욱 강하게 느껴져 거부감을 일으키며 오히려 퓨젤오일 함량이 낮은 경우가 경쾌하고 부드러운 느낌을 준다. 관능검사 결과에서도 NIBRFGC000500297 균주가 외관, 향, 맛, 감촉 등 모든 항목에서 가장 좋은 평가를 받았는데, 이는 향기성분 분석 결과와 일맥상통한다.
또한, 발효 비율, 증류 비율 등 분석 결과를 검토해 보면, NIBRFGC000500297 균주가 다른 제조예 및 비교예에 비해 우수한 것으로 나타났다.
상기 결과를 종합하면, NIBRFGC000500297 균주가 증류주 양조용 효모로 가장 우수한 것으로 평가된다.
실시예 6. NIBRFGC000500297 균주의 균학적 특성 분석
6-1. 배양 및 형태학적 특징
NIBRFGC000500297 균주가 평판배지에서 생장하는 양상을 YPD(Difco) 한천배지에 접종 후 25℃에서 7일간 정치배양 한 후 관찰하였다.
도 2를 참조하면, YPD 배지에서 배양된 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) NIBRFGC000500297 균주의 콜로니 색깔은 흰색이며 가장자리는 부드러운 양상을 보였다.
6-2. 세포 형태
평판배지에서 자란 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) NIBRFGC000500297 균주의 세포 형태는 광학현미경 1,000배와 주사전자현미경(Scanning Electron Microscopy)으로 관찰하였다.
광학현미경으로 관찰한 결과, 원형 또는 난형의 모세포에서 딸세포가 출아하는 전형적인 효모 세포의 모습을 보였다(도 3 왼쪽 그림 참조). 또한, 주사전자현미경 하에서도 원형 또는 난형의 세포에서 딸세포가 출아하고, 딸세포가 떨어져 나간 스카가 관찰되었다(도 3 오른쪽 그림 참조).
6-3. 생리적 특성
사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) NIBRFGC000500297 균주의 탄소원 이용 능력은 Biolog社의 YT MicroPlate를 이용한 페노타입 마이크로어레이 테크놀로지(phenotype microarray technology) 기법으로 확인하였다. 96 웰 마이크로플레이트(96 well microplate)에 담긴 개별 탄소원을 이용하여 자랄 때, 세포내 호흡의 결과로 무색의 테트라졸륨 바이올렛(tetrazolium violet) 시약이 보라색으로 바뀌는 양상 및 단일 탄소원에서 생장하는 양상을 측정하여 탄소원 이용 유무를 파악하였다.
실험 결과를 정리한 도 4를 참조하면, NIBRFGC000500297 균주는 산화시키는 기질로 Inulin, maltose, D-melibiose, D-Raffinose, Stachyose, Sucrose, Turanose, α-D-Glucose, D-Galactose 등의 탄소원을 이용할 수 있는 것으로 확인되었다. 반면, D-Trehalose는 안정적으로 산화시키지 못하는 것으로 나타났다. 동화(Assimilation)에 이용할 수 있는 탄소원은 Inulin, maltose, D-melibiose, D-Raffinose, Stachyose, Sucrose, D-Trehalose, Turanose, α-D-Glucose, D-Galactose 및 α-Methyl-D-Glucoside의 성분인 것으로 확인되었다. 또한, NIBRFGC000500297 균주는 Xylose 성분을 탄소원으로 하는 배지에서는 자라지 못하였으나, D-Xylose 성분과 함께 D-Melibiose 또는 D-Galactose 성분을 탄소원으로 함유하는 배지에서는 잘 생장하는 것으로 확인되었다.
6-4. 유전적 특징
사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) NIBRFGC000500297 균주의 유전적 특징을 파악하고자, 6개의 하우스키핑(housekeeping) 유전자 서열을 이용하여 SGD (Saccharomyces Genome Database, https://www.yeastgenome.org/)의 얼터너티브 레퍼런스 스트레인(alternative reference strain)들과 비교하여 멀티 로코스 시퀀스 타이핑(multi locus sequence typing)을 실시하였다.
구체적으로 NIBRFGC000500297 균주로부터 DNA를 추출하고, 잘 보존된 6종 마커 유전자를 증폭한 후 염기서열을 확보하였다. 6개 마커 유전자((ACC1, ADP1, GLN4, MET4, NUP116, RPN2)의 프라이머는 하기 [표 14]와 같다.
[표 14]
비교군으로는 효모 유전체 데이터베이스인 SGD(Saccharomyces Genome Database)에 등록된 얼터너티브 레퍼런스 스트레인(alternative reference strain)을 이용하였다. 계통수(Phylogenetic tree)는 Mega X 프로그램에서 설정된 기본값으로 네이버-조인닝(Neighbor-joining) 방법을 이용하여 작성하였다. 이때 유전적 거리는 타무라-네이(Tamura-Nei) 방법에 따라 계산하였다.
균주의 유연관계 분석 결과를 정리한 도 5를 참조하면, NIBRFGC000500297 균주는 일본에서 분리된 사케 균주인 Kyokai7 균주와 가장 유연관계가 가까운 것으로 나타났다.
상기와 같이 생리적, 유전적 특징 분석을 완료한 NIBRFGC000500297 균주는 2022년 02월 17일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000500297 균주로 기탁하여 수탁번호 KACC 83060BP를 부여받았다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
농업생명공학연구원 KACC83060 20220217

Claims (10)

  1. 에틸알코올 생성능이 개선된 증류주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주로 발효한 1일차 밑술의 에틸알코올 함량은 5.1%(v/v)이고, 상기 균주로 발효한 술덧의 최종 에틸알코올 함량은 18.9%(v/v)인 것을 특징으로 하는, 증류주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 94.1%의 발효 비율을 갖는 것을 특징으로 하는, 증류주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP).
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 송천효모 대비 퓨젤오일 생성을 저감시켜 증류주의 알코올취 및 용매취를 개선시키는 것을 특징으로 하는, 증류주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP).
  5. 제4항에 있어서,
    상기 퓨젤오일은 1-프로판올(1-propanol), 1-부탄올(1-butanol) 및 이소 아밀 알코올(iso amyl alcohol)인 것을 특징으로 하는, 증류주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP).
  6. 정제수에 입국 및 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000500297(기탁번호 KACC 83060BP)을 첨가하고 4일 내지 5일 동안 발효하여 밑술을 제조하는 단계;
    상기 밑술에 팽화미, 정제효소제 및 정제수를 첨가하고 6일 내지 15일 동안 발효하여 담금하는 단계;
    상기 제조된 숙성술덧을 상압 또는 감압 증류하여 원주를 수득하는 단계; 및
    상기 수득된 원주를 냉각 및 여과하는 단계;를 포함하는 증류주 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 원주를 수득하는 단계의 상압 증류는 상압단식증류기(Pot still)를 이용하여 증류 원액의 에틸알코올 도수가 30%(v/v) 내지 60%(v/v)가 되도록 상압 증류하여 원주를 수득하는 것을 특징으로 하는, 증류주 제조 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 원주를 수득하는 단계의 감압 증류는 감압단식증류기(vacuum still)를 이용하여 증류 원액의 에틸알코올 도수가 30%(v/v) 내지 60%(v/v)가 되도록 감압 증류하여 원주를 수득하는 것을 특징으로 하는, 증류주 제조 방법.
  9. 제6항의 증류주 제조 방법에 따라 제조되고, 알코올취 및 용매취가 개선된 고품질의 증류주.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 증류주는 1-프로판올(1-propanol), 1-부탄올(1-butanol) 및 이소 아밀 알코올(iso amyl alcohol)로 구성된 퓨젤오일 함량이 저감되어 알코올취 및 용매취가 개선된 것을 특징으로 하는, 증류주.
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KR101715040B1 (ko) 2015-10-21 2017-03-10 한국식품연구원 효모 사카로마이세스 세레비지애 hdsy-03를 이용하여 제조된, 에스테르 성분이 강화된 증류주
JP2020103222A (ja) 2018-12-28 2020-07-09 三和酒類株式会社 インドール生産酵母を用いる蒸留酒の製造方法およびインドール高生産酵母とその育種方法
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