KR20230144524A - 플랫폼 치료제로서 사용기 위한 칼슘-활성화 칼륨 채널,Kca3.1의 강력하고 선택적인 억제제 - Google Patents

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서우 텡 옹
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난양 테크놀러지컬 유니버시티
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Abstract

뇌졸중과 같은 KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화와 관련된 질환 상태를 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서 화학식 I의 화합물 뿐만 아니라 특정 구체적 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 유도체의 용도가 제공된다.

Description

플랫폼 치료제로서 사용기 위한 칼슘-활성화 칼륨 채널, Kca3.1의 강력하고 선택적인 억제제
본 발명은, KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화(altered activity)와 관련된 질환 상태(disease condition)를 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의, 화학식 I의 화합물 및 특정 구체적 화합물, 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물(solvate) 및 유도체에 관한 것이다.
본 명세서에서 이전에 공개된 문헌의 목록 또는 고찰은 반드시 해당 문헌이 기술 수준의 일부이거나 일반적인 일반 지식이라는 것을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
인간 게놈의 78개 칼륨 채널 유전자 중 하나인 KCa3.1(KCNN4)은 중간-전도성 칼슘-활성화 칼륨 채널을 코딩한다[참조: S. P. Alexander et al., Br. J. Pharmacol. 2017, 174 Suppl 1, S1-S16; G. A. Gutman et al., Pharmacol. Rev. 2005, 57, 473-508; L. K. Kaczmarek et al., Pharmacol. Rev. 2017, 69, 1-11; and A. D. Wei et al., Pharmacol. Rev. 2005, 57, 463-472]. 이 채널은 4개의 KCa3.1 서브유닛의 복합체이고, 각각이 칼슘 센서로서 기능하는 칼모둘린(CaM)에 부착되어 있다(도 1A). 복합체의 저온-EM 구조가 결정되었고, 억제제와 활성화제의 결합 부위가 돌연변이유발에 의해 결정되었다(도 1B). Ca2+-활성화된 K+ 채널 KCa3.1은 면역 세포(림프구, 미세아교세포, 마크로파지, 비만 세포), 적혈구, 혈소판, 폐 및 위장관 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 근섬유아세포 및 일부 암에서 칼슘 진입 및 칼슘 신호전달을 유지하기 위한 양이온 상쇄제로서 기능한다. 이들 세포에서, 외부 신호는 관련 세포 표면 수용체를 활성화하여 세포내 Ca2+을 증가시키고, 이는 KCa3.1 채널을 개방한다(도 2).
약리학적 및 유전학적 연구에 의해, KCa3.1이 치료 표적인 것이 검증되었다. KCa3.1 억제제는 설치류 및 돼지 모델에서 혈관 협착(vascular stenosis) 및 죽상동맥경화증(atherosclerosis)을 감소시킨다[참조: D. Tharp et al., Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 2008, 28, 1084-1089; K. Toyama et al., J. Clin. Invest. 2008, 118, 3025-3037; R. Kohler et al., Circulation 2003, 108, 1119-1125]. KCa3.1 차단 또는 KCa3.1의 유전자 녹아웃은 염증성 장 질환[참조: L. Di et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2010, 107, 1541-1546; D. Strobaek et al., Br. J. Pharmacol. 2013, 168, 432-444; S. Ohya et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2014, 306, G873-885], 다발성 경화증(multiple sclerosis)[참조: E. Reich et al., Eur. J. Immunol. 2005, 35, 1027-1036], 사구체신염(glomerulonephritis)[참조: H. Kang et al., Cell Rep. 2014, 8, 1210-1224], 염증성 관절염(inflammatory arthritis)[참조: H. Kang et al., Cell Rep. 2014, 8, 1210-1224], 골 흡수(bone resorption)[참조: H. Kang et al., Cell Rep. 2014, 8, 1210-1224], 알레르기 비염(allergic rhinitis)[참조: H. Lin et al., Sci. Rep. 2015, 5, 13127; H. Lin et al., Int. Immunopharmacol. 2014, 23, 642-648], 결막 및 각막 섬유증(conjunctival and corneal fibrosis)[참조: H. Yang et al., Exp Eye Res 2013, 110, 76-87; G. Anumanthan et al., PLoS One 2018, 13], 심장 섬유증(cardiac fibrosis)[참조: L. Zhao et al., Pflugers Arch. 2015, 467, 2275-2285; L. Wang et al., Pflugers Arch. 2016, 468, 2041-2051], 폐 섬유증(lung fibrosis)[참조: D. Amrutkar Experimental Biology Meeting 2021; L. Organ et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2017, 56, 539-550; L. Organ et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2017, 56, 539-550; U. Perera et al., Can. Respir. J. 2021, 6683, 1955], 당뇨병성 신장 질환(diabetic renal disease)[참조: C. Huang et al., Diabetes 2013, 62, 2923-2934; C. Huang et al., PLoS One 2018, 13, e0192800; I. Grgic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009, 106, 14518-14523; C. Huang et al., Nephrology Dialysis Transplantation 2014, 29(2), 313-324; C. Huang et al., Sci. Rep. 2016, 6, 23884], 식이-유도된 간지방증(diet-induced hepatosteatosis), 비-알코올성 지방증(non-alcoholic steatosis) 및 간 섬유증(liver fibrosis)[참조: L. Paka et al., World J. Gastroenterol. 2017, 23, 4181-4190; C. Freise and U. Querfeld. Pharmacol. Res. 2014, 85, 6-14], 및 겸상 적혈구 질환(sickle cell disease)[참조: L. De Franceschi et al., J. Clin. Invest. 1994, 93, 1670-1676; J. Stocker et al., Blood 2003 , 101(6), 2412-8; K. Ataga et al.,　Pharmacotherapy 2006, 26, 1557-1564; K. Ataga et al.,　Blood 2008, 111(8), 3991-7; K. Ataga et al., Expert. Opin. Investig. Drugs 2009, 8(2),231-9; K. Ataga et al., Br J Haematol. 2011, 153(1), 92-104; K. Ataga et al., Br J Haematol. 2021, 192(5), e129-e132]의 설치류 모델에서 질환을 개선시킨다. 신경계에서, KCa3.1은 미세아교세포 활성화를 조절하고, 이 채널의 억제제는 뇌졸중(stroke)[참조: Y. Chen et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 2011, 31, 2363-2374; Y. Chen et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 2016, 36, 2146-2161; M. Yi et al., J. Neuroinflammation 2017, 14, 203], 알츠하이머병(Alzheimer's disease)[참조: M. Yi et al., Mol. Cell Neurosci. 2016, 76, 21-32; T. Wei et al., Front. Pharmacol. 2016, 7, 528; L. Jin et al., Ann. Clin. Transl. Neurol. 2019, 6, 723-738], 파킨슨병(Parkinson's disease)[참조: J. Lu et al., J. Neuroinflammation 2019, 16, 273] 및 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury)[참조: F. Mauler et al., Eur. J. Neurosci. 2004, 20, 1761-1768; K. Urbahns et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 401-404; K. Urbahns et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 2637-2639]의 동물 모델에서 미세아교세포-매개 신경세포 손상을 억제한다. KCa3.1 차단제는 근섬유아세포의 억제를 통해 설치류 및 양 모델에서 폐 섬유증을 치료하고, 설치류 모델에서 심장 및 신장 섬유증을 치료한다[참조: L. Organ et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2017, 56, 539-550; L. Organ et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2017, 56, 539-550; U. Perera et al.Can. Respir. J. 2021, 6683, 1955; L. Zhao et al., Pflugers Arch. 2015, 467, 2275-2285; L. Wang et al., Pflugers Arch. 2016, 468, 2041-2051; C. Huang et al., Diabetes 2013, 62, 2923-2934; C. Huang et al., PLoS One 2018, 13, e0192800; I. Grgic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009, 106, 14518-14523; C. Huang et al., Nephrology Dialysis Transplantation 2014, 29(2), 313-324; C. Huang et al., Sci. Rep. 2016, 6, 23884]. 악성 신경교종 환자의 생존기간의 단축은 종양에서 더 높은 KCa3.1 발현과 관련이 있으며, KCa3.1 차단제는 설치류 이종이식 모델에서 종양-침습성을 감소시킨다[참조: G. D'Alessandro et al., Cell Death Dis. 2013, 4, e773; A. Grimaldi et al., Cell Death Dis. 2016, 7, e2174; K. Turner et al., Glia 2014, 62, 971-981; G. D'Alessandro et al., Oncotarget 2016, 7, 30781-30796]. 유전 및 약리학 연구에 의해, KCa3.1이 간[참조: P. Song et al., J. Cancer 2017, 8, 1568-1578], 난소[참조: Z. Wang et al., Oncogene 2007, 26, 5107-5114], 결장[참조: N. Sassi et al., Biochim. Biophys. Acta. 2010, 1797(6-7), 1260-7; U. De Marchi et al., Cell Calcium 2009, 45(5), 509-16], 직장[참조: H. Xu et al., BMC Cancer 2014, 10(14), 330; W. Lai et al., Med. Oncol. 2013, 30(2),566; W. Lai et al., Oncol. Rep. 2011, 26(4), 909-17], 췌장[참조: H. Jδger et al., Mol. Pharmacol. 2004, 65(3), 630-638] 및 백혈병(leukaemia)[참조: E. Grφssinger et al., Leukemia 2014, 28, 954-958]의 암에 대한 치료 표적으로서 검증되었다. 또 다른 잠재적 징후는 상염색체 우성 선천성 용혈성 빈혈인 유전성 적혈구 감소증이고, 여기서 발병된 적혈구(RBC)는 수분 손실, 칼륨 함량의 감소, 및 혈액학적 파라미터의 변화를 수반하는 적혈구 막의 양이온 누출을 특징으로 한다[참조: I. Andolfo et al., Am. J. Hematol. 2015, 90, 921-926; E. Fermo et al., Sci. Rep. 2017, 7, 1744; R. Rapetti-Mauss et al., Haematologica 2017, 102, e415-e418; R. Rapetti-Mauss et al., Haematologica 2016, 101, e431-e435; and A. Rivera et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2019, 317, C287-C302]. 이러한 환자 중 일부에서, KCa3.1의 기능-획득 돌연변이는 KCl과 수분 손실을 유발하여 적혈구 수축과 빈혈을 유도한다[참조: E. Fermo et al., Sci. Rep. 2017, 7, 1744; A. Rivera et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2019, 317, C287-C302]. 따라서, KCa3.1 차단제는 이러한 변화를 역전시키고 혈액학적 파라미터를 개선할 것으로 예상된다[참조: R. Rapetti-Mauss et al., Haematologica 2016, 101, e431-e435]. KCa3.1의 약리학적 차단은 이미 KCl과 수분 손실을 방지하고 RBC 수축을 감소시킴으로써 겸상 적혈구 빈혈을 갖는 동물 모델과 인간에서 혈액학적 파라미터를 개선하는 것으로 밝혀졌다[참조: J. Stocker et al., Blood 2003 , 101(6), 2412-8; K. Ataga et al.,　Blood 2008, 111(8), 3991-7; K. Ataga et al., Expert. Opin. Investig. Drugs 2009, 8(2),231-9; K. Ataga et al., Br J Haematol. 2011, 153(1), 92-104; K. Ataga et al., Br J Haematol. 2021, 192(5), e129-e132; C. Brugnara et al., J. Clin. Invest. 1993, 92(1), 520-6; S. Alper et al., Blood Cells Mol. Dis. 2009, 41(1), 22-34]. KCa3.1 억제제의 다른 잠재적 적응증은 동물 모델의 실험 연구를 기반으로 하는 천식(asthma)[참조: Z. Yu et al., Front. Pharmacol. 2017, 8, 559; L.　 Chachi et al., J Immunol 2013, 191, 2624-2636; J. Der Velden et al., PLoS One 2013, 8, e66886; ZH. Yu et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2013, 48(6), 685-93; D. Hynes et al., Steroids 2019, 19, 151, 108459; P. Girodet et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2013, 48(2), 212-9; https://ichgcp.net/clinical-trials-registry/NCT00861185], 알레르기 비염(allergic rhinitis)[참조: H. Lin et al., Sci. Rep. 2015, 5, 13127], 분비성 설사(secretory diarrhea)[참조: P. Rufo et al., J. Clin. Invest. 1997, 100, 3111-3120] 및 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)[참조: A. Philp et al., Sci. Rep. 2018, 8, 9320]이다.
그러나, TRAM-34, NS6180, 4-페닐-4-피란 및 사이클로헥사디엔 등의 KCa3.1의 분자 억제제는 경구 생체이용률(bioavailability)과 약물동태 특성(pharmacokinetic property)이 불충분하기 때문에 임상 시험으로 진행하지 못했다. 한편, 세니카포크(ICA-17043)는 임상 시험으로 진행하여 안전성이 확인되었지만, 이의 특허가 만료되었다.
따라서, 약물동태 특성이 우수한 경구용 생체이용성(bioavailable), 강력한 및 선택적 KCa3.1 억제제의 발견이 요구되고 있다.
놀랍게도, 일련의 페닐-디하이드로피리딘이 원하는 특성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 이제, 본 발명의 측면 및 실시형태를 하기 넘버링(numbering)된 조항을 참조하여 설명할 것이다.
1. 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및/또는 용매화물:
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
R1은 H, 할로, CF3, CN 또는 NO2로부터 선택되고;
R2 및 R3은 H, 할로, CH3, CF3, CN 또는 NO2로부터 독립적으로 선택되고;
R4는 H, 할로, CN 또는 CF3로부터 선택되고;
R5 및 R6은 R9aC(O)O-, R9bOC(O)-, R9cC(O)NRd-, R9eR9fNC(O)-, 또는 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알킬 케톤으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 탄소원자는 분지(branched) 또는 비분지(unbranched)이고, 비치환되거나 할로 및 NO2로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되고;　
R7 및 R8은 H, NR10aR10b, OR10c, 또는 비치환되거나 할로로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 C1 내지 C3 알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는
R5와 R7 또는 R6과 R8 쌍(pair) 중 하나는, 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께, 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭이고, 비치환되거나 할로, =O, -OC(O)R10d, -(O)COR10e 및 C1 내지 C6 알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 4 내지 14원의 환 시스템을 형성하고;
R9a 내지 R9f 및 R10a 내지 R10e는 H, 및 비치환되거나 할로로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환된 C1 내지 C6 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
2. 제1항에 있어서, 상기 R1은 H, F, Cl, Br, CF3 또는 NO2로부터 선택되는, 화합물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 R2 및 R3이 H, F, Cl, Br, CH3, CF3 또는 NO2로부터 독립적으로 선택되는, 화합물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R4가 H, F, Cl, Br 또는 CF3으로부터 선택되는, 화합물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R5 및 R6이 R9aC(O)O-, R9bOC(O)-, 또는 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알킬 케톤으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 탄소원자는 분지 또는 비분지이고, 비치환되거나 Cl, F 및 NO2로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는, 화합물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R7 및 R8이 H, 또는 비치환되거나 F 및 Cl로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 C1 내지 C3 알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는
R5와 R7 또는 R6과 R8 쌍 중의 하나가, 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께, 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭이고, 비치환되거나 F, Cl, =O 및 C1 내지 C6 알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 4 내지 10원의 환 시스템을 형성하는, 화합물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R9a 내지 R9f 및 R10a 내지 R10e가 H, 및 비치환되거나 F 및 Cl로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 C1 내지 C3 알킬로부터 독립적으로 선택되는, 화합물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
R1이 H, F, Cl 또는 CF3으로부터 선택되고;
R2 및 R3이 H, F, Cl 또는 CF3으로부터 독립적으로 선택되고;
R4가 H, F, Cl 또는 CF3으로부터 선택되고;
R5 및 R6이 R9bOC(O)-, 및 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 알킬 케톤으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 탄소원자는 비치환되거나 Cl 및 F로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되고;
R7 및 R8이 H, 또는 비치환되거나 F 및 Cl로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 메틸로부터 독립적으로 선택되는, 화합물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
R1이 H, F 또는 Cl로부터 선택되고/되거나;
R2가 CF3 또는 보다 특히 H 또는 F로부터 선택되고/되거나;
R3이 H 또는 CF3으로부터 선택되고/되거나;
R4가 H이고/이거나;
R5 및 R6이 CH3OC(O)- 또는 프로판-2-오닐(예: R5 및 R6은 모두 CH3OC(O)-임)로부터 독립적으로 선택되고/되거나;
R7 및 R8이 H 및 CH3으로부터 독립적으로 선택되는, 화합물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, R7 및 R8 중 적어도 하나가 H인, 화합물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R7 및 R8이 모두 H인, 화합물.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R7이 H이고, R8이 CH3인, 화합물.
13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R7 및 R8이 모두 CH3인, 화합물.
14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R7이 CH3이고, R8이 H인, 화합물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 목록으로부터 선택된 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물:
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 목록으로부터 선택된 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물:
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 목록으로부터 선택된 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물:
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 목록으로부터 선택된 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물:
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이
, 또는 이의 염 및 용매화물인, 화합물.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제(adjuvant) 또는 비히클(vehicle) 중 하나 이상과 조합하여 포함하는 약제학적 조성물.
21. 의약(medicine)에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물.
22. KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화와 관련된 질환 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물.
23. KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화와 관련된 질환 상태의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물의 용도.
24. KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화와 관련된 질환 상태의 치료 또는 예방 방법으로서,
상기 방법은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
25. 제19항, 제20항 또는 제21항에 있어서, KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화와 관련된 질환 상태가 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases; IBD), 섬유성 질환(fibrotic diseases)(폐, 간, 신장, 심장, 결막, 각막), 비-알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD), 비-알코올성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis; NASH), 신경교종(gliomas)(교모세포종(glioblastoma)), 폐암(lung cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 난소암(ovarian cancer), 대장암(colorectal cancer), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 당뇨병성 신장 질환(diabetic renal disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 골 흡수(bone resorption), 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 죽상 동맥경화증(atherosclerosis), 혈관성형술후 재협착(restenosis following angioplasty), 스텐트내 신생동맥경화증(in-stent neo-atherosclerosis), 뇌졸중(stroke), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 유전성 적혈구증(hereditary xerocytosis), 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia), 백혈병(leukaemia), 천식(asthma), 알레르기 비염(allergic rhinitis), 미세아교세포 활성화(microglial activation), 산화질소-의존성 신경퇴화(nitric oxide-dependent neurodegeneration), 신경-종양 질환(neuro-oncological diseases) 및 희귀 적혈구 장애(rphan red blood cell disorders) 중 하나 이상으로부터 선택되는, 사용하기 위한 화합물, 용도 또는 방법.
26. 제25항에 있어서, KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화와 관련된 질환 상태가 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases; IBD), 섬유성 질환(fibrotic diseases)(폐, 간, 신장, 심장, 결막, 각막), 비-알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD), 비-알코올성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis; NASH), 신경교종(gliomas)(교모세포종(glioblastoma)), 폐암(lung cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 난소암(ovarian cancer), 대장암(colorectal cancer), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 당뇨병성 신장 질환(diabetic renal disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 골 흡수(bone resorption), 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 혈관성형술후 재협착(restenosis following angioplasty), 스텐트내 신생-동맥경화증(in-stent neo-atherosclerosis), 뇌졸중(stroke), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 유전성 적혈구증(hereditary xerocytosis), 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia), 백혈병(leukaemia), 천식(asthma), 알레르기 비염(allergic rhinitis), 미세아교세포 활성화(microglial activation) 및 산화질소-의존성 신경퇴화(nitric oxide-dependent neurodegeneration) 중 하나 이상으로부터 선택되는, 사용하기 위한 화합물, 용도 또는 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 질환 상태가 뇌졸중(stroke)인, 사용하기 위한 화합물, 용도 또는 방법.
도 1은 (A) 각 KCa3.1 서브유닛(subunit)이 6개의 막관통 세그먼트(transmembrane segment)를 함유하고, 세그먼트 5와 6 사이의 루프(loop)가 기공(pore)을 형성하는 것을 나타낸다. 세포질 C-말단은 CaM에 구성적으로 결합되어 있다[참조: C. M. Fanger et al., J Biol Chem 1999, 274, 5746-5754]. 4개의 KCa3.1 서브유닛과 4개의 CaM은 기능 채널을 형성한다. 도면은 문헌[참조: H. Wulff & N. A. Castle, Expert Rev. Pharmacol. 2010, 3, 385-396]; 및 (B) KCa3.1-CaM 복합체의 저온-EM 구조로부터 취한 것이다. 차단제의 결합 부위가 제시되어 있다. 펩티드 억제제는 채널의 외부 입구에 결합한다. 저분자 억제제는 내부 기공 또는 내부 기공의 윈도우 영역에서 결합한다. 저분자 활성화제는 KCa3.1-CaM 복합체의 내부 표면에 결합한다. 도면은 문헌[참조: B. M. Brown et al., Annu. Rev. Toxicol. 2020, 60, 219-240]으로부터 취한 것이다.
도 2는 KCa3.1의 생리학적 역할을 나타낸다. (A)는 KCa3.1이 면역세포(미세아교세포, T 세포, B 세포, 비만 세포, 단핵구, 마크로파지), 적혈구, 혈소판, 폐 및 위장관의 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 근섬유아세포 및 일부 암에서 생리학적으로 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다. 이러한 세포에서, 외부 신호는 관련 세포 표면 수용체를 활성화하여 세포내 Ca2+를 증가시키고, 이는 KCa3.1 채널을 개방한다. 이 채널은 칼슘 신호전달을 유지하기 위한 양이온 상쇄제로서 기능한다. 도면은 문헌[참조: Wulff & N. A. Castle, Expert Rev. 　2010, 3, 385-396]으로부터 취한 것이고; (B)는 다수의 세포 유형이 원시-근섬유아세포로 분화할 수 있음을 나타낸다. 형질전환 성장인자 베타(TGF-b), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 피브로넥틴, 기계적 장력 등에 의해 자극되는 경우, 원시-근섬유아세포는 다수 기관의 섬유증에서 섬유화촉진 효과에 기여하는 근섬유아세포로 분화된다. 근섬유아세포는 KCa3.1 발현을 상향-조절하며, 이들의 차단은 근섬유아세포 증식 및 섬유화촉진 효과를 억제한다. 도면은 문헌[참조: S. W. M. van der Borne et al., Nat. Rev. Cardiol. 2010, 7, 30-37]으로부터 취한 것이고; (C) KCa3.1은 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 외상성 뇌 손상을 포함한 신경염증성 질환에 기여하는 전-염증성 미세아교세포에서 중요한 역할을 한다. KCa3.1은 미세아교세포가 M1 전-염증성 세포로 분화할 때에 상향-조절되고, 이 채널의 차단은 IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함한 신경염증의 매개인자의 생성을 억제한다. 대조적으로, 미세아교세포가 M2 항-염증 세포로 분화하면, 이들은 KCa3.1을 하향-조절한다. 따라서, KCa3.1 억제제는 전-염증성 미세아교세포를 우선적으로 표적화한다. 도면은 문헌[참조: S. R. Roig et al., J. Neurol. Neuromed. 2018, 3, 18-23]으로부터 취한 것이다.
도 3은 KCa3.1 전류에 대한 그룹 2-4의 예시적 화합물의 효과를 도시한다. 예시적 화합물의 농도-반응 곡선이 제시되어 있다.
도 4는 KCa3.1의 강력한 차단 및 CaV1.2에 대한 1000배 이상의 선택성(그룹 4c)에 대한 약물작용발생단(pharmacophore)을 도시한다.
도 5는 다른 분자 표적 패널에 대한 화합물 103(3μM에서 시험)의 선택성을 도시한다(Eurofins Pharmacological P9 Diversity Panel Safety Screen).
도 6은 단일 정맥 주사(5mg/kg) 또는 경구 투여(50mg/kg) 후에 랫트에서 화합물 103(그룹 4c)의 약물동태 평가를 도시한다.
도 7은 조직병리 분석을 나타낸다.
도 8은 (A) 7일간의 재관류와 함께 60분의 랫트 중등 대뇌 동맥 폐색(MCAO)을 적용한 랫트에서, 화합물 103이 비히클-대조군과 비교하여 경색 용적을 효과적으로 감소시켰고(n = 28), 양성 대조군인 에다라본(Edaravone)보다 더 효과적이었고; (B) 48시간(n = 8) 및 7일(n = 5)에 측정한 신경학적 거동 스코어를 에다라본보다 더 효과적으로 개선시켰음을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM을 나타내고, 통계적 유의성은 일원 분산분석(ANOVA)(A) 또는 이원 분산분석(ANOVA)(B)에 의해 분석했다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.
도 9는 화합물 103(10mg/kg)이 MCAO 또는 비히클 그룹과 비교하여 CA1, CPu, M1 및 S1의 뇌 영역에서 7일차에 Iba1+CD11b+ 이중 양성 활성화된 미세아교세포를 효과적으로 감소시켰음을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM을 나타내고, 통계적 유의성은 일원 분산분석(ANOVA)에 의해 분석했다. *p <0.05, n = 5.
상술한 바와 같이, 일련의 페닐-디하이드로피리딘이 본원에서 특정된 하나 이상의 문제를 극복하는 예상외로 우수한 특성을 나타낸다는 사실이 놀랍게도 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 제1 측면에서, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및/또는 용매화물이 제공된다:
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
R1은 H, 할로, CF3, CN 또는 NO2로부터 선택되고;
R2 및 R3은 H, 할로, CH3, CF3, CN 또는 NO2로부터 독립적으로 선택되고;
R4는 H, 할로, CN 또는 CF3로부터 선택되고;
R5 및 R6은 R9aC(O)O-, R9bOC(O)-, R9cC(O)NRd-, R9eR9fNC(O)-, 또는 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알킬 케톤으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 탄소원자는 분지 또는 비분지이고, 비치환되거나 할로 및 NO2로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되고;　
R7 및 R8은 H, NR10aR10b, OR10c, 또는 비치환되거나 할로로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 C1 내지 C3 알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는
R5와 R7 또는 R6과 R8 쌍 중 하나는, 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께, 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭이고, 비치환되거나 할로, =O, -OC(O)R10d, -(O)COR10e 및 C1 내지 C6 알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 4 내지 14원의 환 시스템을 형성하고;
R9a 내지 R9f 및 R10a 내지 R10e는 H, 및 비치환되거나 할로로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환된 C1 내지 C6 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
본원에서 "포함하는(comprising)"이라는 단어는 언급된 특징을 필요로 하지만, 다른 특징의 존재를 한정하지 않는 것으로 해석될 수 있다. 또는, "포함하는(comprising)"이라는 단어는 기재된 구성 요소/특징만이 존재하는 것을 의도하는 상황과도 관련될 수 있다(예: "포함하는(comprising)"이라는 단어는 "이루어진(consists of)" 또는 "본질적으로 이루어진(consists essentially of)"이라는 문구로 치환될 수 있음). 광의의 해석과 협의의 해석 모두가 본 발명의 모든 측면 및 실시형태에 적용될 수 있다는 것이 명시적으로 고려된다. 즉, "포함하는(comprising)"이라는 문구 및 이의 동의어는 "이루어진(consisting of)"이라는 문구 또는 "본질적으로 이루어진(consists essentially of)"이라는 문구 또는 이의 동의어로 치환될 수 있으며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
"본질적으로 이루어진"이라는 문구 및 이의 가명은 본원에서 미량의 불순물이 존재할 수 있는 물질을 지칭하는 것으로 해석될 수 있다. 예를 들면, 당해 물질은 순도 90% 이상, 예컨대, 순도 95% 초과, 예컨대, 순도 97% 초과, 예컨대, 순도 99% 초과, 예컨대, 순도 99.9% 초과, 예컨대, 순도 99.99% 초과, 예컨대, 순도 99.999% 초과, 예컨대, 순도 100%일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 복수형의 참조어를 포함한다.
본원에서(본 발명의 임의의 측면 또는 실시형태에서) 화학식 I의 화합물에 대한 언급은 이러한 화합물 자체, 이러한 화합물의 토우토머 및 이러한 화합물의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물 또는 약제학적으로 기능적 유도체에 대한 언급을 포함한다.
언급될 수 있는 약제학적으로 허용되는 염에는 산 부가 염 및 염기 부가 염이 포함된다. 이러한 염은 통상적 수단, 예를 들면, 화학식 I 화합물의 유리 산 또는 유리 염기 형태를 적절한 산 또는 염기의 하나 이상의 등가물과 임의로 용매 또는 염이 불용성인 매질에서 반응시키고, 이어서 표준 기술(예: 진공, 동결-건조 또는 여과)을 사용하여 상기 용매 또는 상기 매질을 제거함으로써 형성될 수 있다. 염은 또한, 예를 들면, 적절한 이온 교환 수지를 사용하여, 염 형태의 화학식 I의 화합물의 대이온을 또 다른 대이온과 교환함으로써 제조될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 염의 예에는 무기산 및 유기산으로부터 유도된 산 부가 염과 나트륨, 마그네슘, 또는 바람직하게는 칼륨 및 칼슘과 같은 금속에서 유도된 염이 포함된다.
산 부가염의 예에는 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아릴 설폰산(예: 벤젠설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 나프탈렌-1,5-디설폰산 및 p-톨루엔설폰산), 아스코르브산(예: 라스코르브산), L-아스파르트산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 부탄산, (+)캄포르산, 캄포르설폰산, (+)-(1S)-캄포르-10-설폰산, 카프르산, 카프론산, 카프릴산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실설폰산, 에탄-1,2-디설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 젠티스산, 글루코헵토산, 글루콘산(예: D-글루콘산), 글루쿠론산(예: D-글루쿠론산), 글루탐산(예: L-글루탐산), α-옥소글루타르산, 글리콜산, 히푸르산, 브롬화수소산, 염산, 요오드화수소산, 이세티온산, 락트산(예: (+)-L-락트산 및 (±)-DL-락트산), 락토바이온산, 말레산, 말산(예:. (-)-L-말산), 말론산, (±)-DL-만델산, 메타인산, 메탄설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 질산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 인산, 프로피온산, L-피로글루탐산, 살리실산, 4-아미노-살리실산, 세바산, 스테아르산, 숙신산, 황산, 탄닌산, 타르타르산(예: (+)-L-타르타르산), 티오시안산, 운데실렌산 및 발레르산으로 형성된 산 부가 염이 포함된다.
염의 구체적 예는 염산, 브롬화수소산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산과 같은 무기산; 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산, 아릴설폰산과 같은 유기산; 및 나트륨, 마그네슘 또는 바람직하게는 칼륨 및 칼슘과 같은 금속으로부터 유도된 염이다.
상술한 바와 같이, 화학식 I에 의해 포함되는 것은 화합물 및 이들의 염의 임의의 용매화물이다. 바람직한 용매화물은 본 발명의 화합물의 고체 구조(예를 들면, 결정 구조)에 무독성의 약제학적으로 허용되는 용매(이하, 용매화 용매로 지칭)의 분자를 도입함으로써 형성되는 용매화물이다. 이러한 용매의 예에는 물, 알코올(예: 에탄올, 이소프로판올 및 부탄올) 및 디메틸설폭사이드가 포함된다. 용매화물은 본 발명의 화합물을 용매 또는 용매화 용매를 함유하는 용매의 혼합물로 재결정화하여 제조할 수 있다. 용매화물이 임의의 소정 예에서 형성되었는지의 여부는 열중량 분석(TGE), 시차 주사 열량측정(DSC) 및 X-선 결정학과 같은 공지된 표준 기술을 사용하여 화합물의 결정을 분석에 제공함으로써 결정할 수 있다.
용매화물은 화학량론적 용매화물 또는 비화학량론적 용매화물일 수 있다. 특히 바람직한 용매화물은 수화물이며, 수화물의 예에는 반수화물, 1수화물 및 2수화물이 포함된다.
용매화물 및 용매화물의 제조 및 특성화에 사용되는 방법에 대한 상세한 내용은 문헌[참조: Bryn et al., Solid-State Chemistry of Drugs, Second Edition, published by SSCI, Inc of West Lafayette, IN, USA, 1999, ISBN 0-967-06710-3]을 참조한다.
본원에 정의된 화학식 I 화합물의 "약학적으로 기능적인 유도체"는 본 발명의 임의의 관련 화합물과 동일한 생물학적 기능 및/또는 활성을 갖거나, 또는 이들을 제공하는 에스테르 유도체 및/또는 유도체들을 포함한다. 따라서, 본 발명의 목적상, 이 용어에는 화학식 I 화합물의 프로드러그(prodrug)도 포함된다.
화학식 I의 관련 화합물의 "프로드러그"라는 용어에는 경구 또는 비경구 투여 후 생체내에서 대사되어 실험적으로 검출가능한 양으로 소정 시간 내(예: 6시간 내지 24시간의 투여 간격내(즉, 1일 1 내지 4회))에 당해 화합물을 형성하는 모든 화합물이 포함된다.
화학식 I 화합물의 프로드러그는 이러한 프로드러그를 포유류의 대상체에 투여할 때에 생체내에서 변형이 절단되는 방식으로 화합물 상에 존재하는 작용기를 변형시킴으로써 제조할 수 있다. 이러한 변형은 전형적으로 프로드러그 치환기를 갖는 모 화합물을 합성함으로써 달성된다. 프로드러그에는 화학식 I의 화합물 중의 하이드록실, 아미노, 설프하이드릴, 카복실 또는 카보닐 그룹이 각각 유리 하이드록실, 아미노, 설프하이드릴, 카복실 또는 카보닐 그룹을 재생하기 위해 생체내에서 절단될 수 있는 임의의 그룹에 결합된 화합물이 포함된다.
프로드러그의 예에는 하이드록실 작용기의 에스테르 및 카바메이트, 카복실 작용기의 에스테르 그룹, N-아실 유도체 및 N-만니히 염기가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 프로드러그에 대한 일반 정보는, 예를 들면, 문헌[참조: Bundegaard, H. “Design of Prodrugs” p. I-92, Elsevier, New York-Oxford (1985)]에서 발견할 수 있다.
화학식 I의 화합물 및 이러한 화합물의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 및 약제학적으로 기능적 유도체는 간결성을 위해 이하에서는 "화학식 I의 화합물"로 총칭한다.
화학식 I의 화합물은 이중 결합을 함유할 수 있으며, 따라서 각각의 개별 이중 결합에 대해 E(entgegen) 및 Z(zusammen) 기하학적 이성체로서 존재할 수 있다. 이러한 모든 이성체 및 이들의 혼합물은 본 발명의 범위에 포함된다.
화학식 I의 화합물은 위치이성체로 존재할 수 있으며, 또한 토우토머성을 나타낼 수도 있다. 모든 토우토머 형태 및 이들의 혼합물은 본 발명의 범위에 포함된다.
화학식 I의 화합물은 하나 이상의 비대칭 탄소원자를 함유할 수 있으며, 따라서 광학이성체 및/또는 부분입체이성체(diasteroisomer)를 나타낼 수 있다. 부분입체이성체는 종래의 기술, 예를 들면, 크로마토그래피 또는 분별 결정화를 사용하여 분리할 수 있다. 다양한 입체이성체는 화합물의 라세미체 또는 기타 혼합물을 종래의 기술, 예를 들면, 분별 결정화 또는 HPLC를 사용하여 분리함으로써 단리할 수 있다. 또는, 원하는 광학 이성체는 라세미화 또는 에피머화를 유발하지 않는 조건하(즉, "키랄 풀" 방법)에서 적절한 광학 활성 출발 물질의 반응에 의해, 적절한 출발 물질과 적절한 단계에서 후속적으로 제거될 수 있는 "키랄 보조제"와의 반응에 의해, 유도체화(즉, 동적 분리를 포함하는 분리), 예를 들면, 호모키랄산과의 반응, 이어서 크로마토그래피와 같은 통상의 수단에 의해 부분입체이성체 유도체의 분리, 또는 적절한 키랄 시약 또는 키랄 촉매와의 반응에 의해 당업자에게 공지된 조건하에서 이루어질 수 있다. 모든 입체이성체 및 이들의 혼합물은 본 발명의 범위에 포함된다.
의심의 여지를 회피하기 위해, 본 발명의 문맥에서, "치료"라는 용어는 이러한 치료를 필요로 하는 환자의 치료적 또는 완화적 치료뿐만 아니라, 관련 질환 상태에 취약한 환자의 예방적 치료 및/또는 진단에 대한 언급을 포함한다.
"환자" 및 "환자들"이라는 용어는 포유동물(예: 인간) 환자에 대한 언급을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "대상체" 또는 "환자"라는 용어는 당업자에게 충분히 인식되어 있으며, 본원에서는 개, 고양이, 랫트, 마우스, 원숭이, 소, 말, 염소, 양, 돼지, 낙타 및 가장 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 치료를 필요로 하는 대상체 또는 질환 또는 장애를 갖는 대상체이다. 그러나, 다른 실시형태에서, 대상체는 정상 대상체일 수 있다. 이 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 성인 및 신생아 대상체는 남성이든 여성이든 모두 포괄하는 것으로 의도된다.
"유효량"이라는 용어는 치료받은 환자에게 치료 효과를 부여하는(예: 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한) 화합물의 양을 지칭한다. 효과는 객관적(즉, 특정 시험 또는 마커로 측정가능한 것)이거나 주관적(즉, 대상체가 효과에 대한 징후를 나타내거나 효과를 느끼는 것)일 수 있다.
본원에서 사용되는 "할로"라는 용어에는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도에 대한 언급이 포함된다.
본원에서 인용될 때, 본에서 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭인 4 내지 14원의 환 시스템이 언급되는 경우, 이는 1개 내지 3개의 환을 함유할 수 있다. 의심의 여지를 없애기 위해, 본원에서 언급된 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭인 4 내지 14원의 환 시스템은 이미 환의 일부인 원자를 사용하여 부분적으로 형성될 수 있으며, 이는 4 내지 14원의 환 시스템의 총 환 수에 계산되어서는 안 된다. 4 내지 14원의 환 시스템은 6 내지 10원의 환 시스템, 예컨대, 6 내지 8원의 환 시스템일 수 있으며, 모노사이클릭 또는 바이사이클릭일 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 "아릴"이라는 용어는 C6-14(예: C6-10) 아릴 그룹을 포함한다. 이러한 그룹은 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 트리사이클릭일 수 있으며, 적어도 하나의 환이 방향족인 6 내지 14개의 환 탄소원자를 가질 수 있다. 아릴 그룹의 부착점은 환 시스템의 임의의 원자를 통한 것일 수 있다. 그러나, 아릴 그룹이 바이사이클릭 또는 트리사이클릭인 경우, 이들은 방향족 환을 통해 분자의 나머지에　 연결된다. C6-14 아릴 그룹은 페닐, 나프틸 등, 예컨대, 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸, 인다닐, 인데닐 및 플루오레닐을 포함한다. 언급될 수 있는 본 발명의 실시형태는 아릴이 페닐인 것들을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, "알킬"이라는 용어는 비분지 또는 분지, 비사이클릭 또는 사이클릭, 포화 또는 불포화(예를 들면, 알케닐 또는 알키닐을 형성함) 하이드로카빌 라디칼을 지칭하며, 이는 치환되거나 비치환될 수 있다(예를 들면, 하나 이상의 할로 원자에 의해). 용어 "알킬"이 비사이클릭 그룹을 지칭하는 경우, 바람직하게는 C1-10 알킬이고, 더 바람직하게는 C1-6 알킬(예: 에틸, 프로필(예: n-프로필 또는 이소프로필), 부틸(예: 분지 또는 비분지 부틸), 펜틸 또는, 더 바람직하게는 메틸)이다. 용어 "알킬"이 사이클릭 그룹(이는 그룹 "사이클로알킬"이 지정된 경우일 수 있음)인 경우, 바람직하게는 C3-12 사이클로알킬이고, 더 바람직하게는 C5-10(예: C5-7) 사이클로알킬이다.
본원에서 달리 명시되지 않는 한, "헤테로사이클릭 환 시스템"은, 방향족(예: 헤테로아릴 그룹), 완전 포화 또는 부분 불포화일 수 있고 O, S 및 N으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 4 내지 14원, 예컨대, 5 내지 10원(예: 6 내지 10원)의 헤테로사이클릭 그룹일 수 있고, 이 헤테로사이클릭 그룹은 1개 또는 2개의 환을 포함할 수 있다. 본원에서 언급될 수 있는 헤테로사이클릭 환 시스템의 예에는 아제티디닐, 디하이드로푸라닐(예: 2,3-디하이드로푸라닐, 2,5-디하이드로푸라닐), 디하이드로피라닐(예: 3,4-디하이드로피라닐, 3,6-디하이드로피라닐), 4,5-디하이드로-1H-말레이미도, 디옥사닐, 디옥소라닐, 푸라닐, 푸라자닐, 헥사하이드로피리미디닐, 하이단토이닐, 이미다졸릴, 이소티아지올릴, 이소옥사졸리디닐, 이소옥사졸릴, 모르폴리닐, 1,2- 또는 1,3-옥사지나닐, 옥사졸리디닐, 옥사졸릴, 피페리디닐, 피페라지닐, 피라닐, 피라지닐, 피리다지닐, 피라졸릴, 피리디닐, 피리미디닐, 피롤리닐(예: 3-피롤리닐), 피롤릴, 피롤리디닐, 피롤리디노닐, 3-설폴레닐, 설폴라닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로피리디닐(예: 3,4,5,6-테트라하이드로피리디닐), 1,2,3,4-테트라하이드로피리미디닐, 3,4,5,6-테트라하이드로피리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라메틸렌설폭사이드, 테트라졸릴, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 티아졸리디닐, 티에닐, 티오펜에틸, 트리아졸릴 및 트리아지나닐을 포함한다.
본원에서 달리 명시되지 않는 한, "카보사이클릭 환 시스템"은, 방향족, 완전 포화 또는 부분 불포화일 수 있는 4 내지 14원(예: 5 내지 10원(예: 6원 또는 10원))의 카보사이클릭 그룹일 수 있으며, 이 카보사이클릭 그룹은 1 또는 2개의 환을 포함할 수 있다. 본원에서 언급될 수 있는 카보사이클릭 환 시스템의 예에는 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로옥틸, 페닐, 나프틸, 데칼리닐, 테트라리닐, 바이사이클로[4.2.0]옥타닐 및 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타하이드로-1H-인다닐이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 특히 바람직한 카보사이클릭 그룹은 페닐, 사이클로헥실 및 나프틸을 포함한다.
본원에서 사용되는 "헤테로아릴"이라는 용어는, 바람직하게는 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자(들)(예: 1개 내지 4개의 헤테로원자)를 함유하는 방향족 그룹을 지칭한다(따라서, 예를 들면, 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 트리사이클릭 헤테로방향족 그룹을 형성함). 헤테로아릴 그룹은 5 내지 14개(예: 10개)의 구성원을 갖고 환 중 적어도 하나가 방향족인 경우 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 트리사이클릭일 수 있는 것들을 포함한다. 그러나, 헤테로아릴 그룹이 바이사이클릭 또는 트리사이클릭인 경우, 이들은 방향족 환을 통해 분자의 나머지에 연결된다. 언급될 수 있는 헤테로사이클릭 그룹에는 벤조티아디아졸릴(2,1,3-벤조티아디아졸릴 포함), 이소티오크로마닐 및 보다 바람직하게는 아크리디닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조디옥사닐, 벤조디옥세피닐, 벤조디옥졸릴(1,3-벤조디옥졸릴 포함), 벤조푸라닐, 벤조푸라자닐, 벤조티아졸릴, 벤즈옥사디아졸릴(2,1,3-벤즈옥사디아졸릴 포함), 벤즈옥사지닐(3,4-디하이드로-2H-1,4-벤즈옥사지닐 포함), 벤즈옥사졸릴, 벤조모르폴리닐, 벤조셀레나디아졸릴(2,1,3-벤조셀레나디아졸릴 포함), 벤조티에닐, 카바졸릴, 크로마닐, 신놀리닐, 푸라닐, 이미다졸릴, 이미다조[1,2-a]피리딜, 인다졸릴, 인돌리닐, 인돌릴, 이소벤조푸라닐, 이소크로마닐, 이소인돌리닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀리닐, 이소티아지올릴, 이소옥사졸릴, 나프티리디닐(1,6-나프티리디닐 또는, 바람직하게는, 1,5-나프티리디닐 및 1,8-나프티리디닐 포함), 옥사디아졸릴(1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴 및 1,3,4-옥사디아졸릴 포함), 옥사졸릴, 페나지닐, 페노티아지닐, 프탈라지닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리딜, 피리미디닐, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 퀴놀리지닐, 퀴녹살리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐(1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀리닐 및 5,6,7,8-테트라하이드로이소퀴놀리닐 포함), 테트라하이드로퀴놀리닐(1,2,3,4-테트라하이드로퀴놀리닐 및 5,6,7,8-테트라하이드로퀴놀리닐 포함), 테트라졸릴, 티아디아졸릴(1,2,3-티아디아졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴 및 1,3,4-티아디아졸릴 포함), 티아졸릴, 티오크로마닐, 티오페네틸, 티에닐, 트리아졸릴(1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴 및 1,3,4-트리아졸릴 포함) 등이 포함된다. 헤테로아릴 그룹의 치환기는, 적절한 경우, 헤테로원자를 포함하여 환 시스템의 임의의 원자에 위치할 수 있다. 헤테로아릴 그룹의 부착점은 (적절한 경우) 헤테로원자(예: 질소 원자)를 포함하는 환 시스템의 임의의 원자, 또는 환 시스템의 일부로서 존재할 수 있는 임의의 융합된 카보사이클릭 환 상의 원자를 통해 이루어질 수 있다. 헤테로아릴 그룹은 또한 N- 또는 S-산화 형태일 수도 있다. 특히 바람직한 헤테로아릴 그룹에는 피리딜, 피롤릴, 퀴놀리닐, 푸라닐, 티에닐, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 피리미디닐, 인돌릴, 피라지닐, 인다졸릴, 피리미디닐, 티오페네틸, 티오페닐, 피라닐, 카바졸릴, 아크리디닐, 퀴놀리닐, 벤조이미다졸릴, 벤즈티아졸릴, 퓨리닐, 신놀리닐 및 프테르디닐이 포함된다. 특히 바람직한 헤테로아릴 그룹에는 모노사이클릭 헤테로아릴 그룹이 포함된다.
언급될 수 있는 본 발명의 추가 실시형태는 화학식 I의 화합물이 동위원소 표지된 것들을 포함한다. 그러나, 언급될 수 있는 본 발명의 다른 특정 실시형태는 화학식 I의 화합물이 동위원소 표지되지 않은 것들을 포함한다.
본원에서 사용되는 "동위원소 표지"라는 용어는 화합물 중의 하나 이상의 위치에 비천연 동위원소(또는 비천연 동위원소 분포)가 있는 화학식 I의 화합물에 대한 언급을 포함한다. 본원에서 "화합물 중의 하나 이상의 위치"에 대한 언급은 당업자에 의해 화학식 I의 화합물의 하나 이상의 원자를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, "동위원소 표지"라는 용어는 화합물 중의 하나 이상의 위치에서 동위원소적으로 농후화된(enriched) 화학식 I의 화합물에 대한 언급을 포함한다.
화학식 I의 화합물의 동위원소 표지 또는 농후화는 수소, 탄소, 질소, 산소, 황, 불소, 염소, 브롬 및/또는 요오드 중 어느 하나의 방사성 또는 비방사성 동위원소로 이루어질 수 있다. 이와 관련하여 언급될 수 있는 특정 동위원소에는 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 35S, 18F, 37CI, 77Br, 82Br 및 125l가 포함된다.
화학식 I의 화합물이 방사성 또는 비방사성 동위원소로 표지되거나 농후화된 경우, 언급될 수 있는 화학식 I의 화합물에는, 화합물 중의 적어도 하나의 원자가 해당 원자의 방사성 또는 비방사성 동위원소가 해당 방사성 또는 비방사성 동위원소의 자연 수준을 적어도 10%(예를 들면, 10% 내지 5000%, 특히 50% 내지 1000%, 보다 구체적으로 100% 내지 500%) 상회하는 수준으로 존재하는 동위원소 분포를 나타내는 것이 포함된다.
언급될 수 있는 본 발명의 실시형태에는 화학식 I의 화합물이 KCa3.1 칼슘-활성화 칼륨 채널 서브타입을 선택적으로 억제하는 것이 포함된다.
본원에서 KCa3.1 칼슘-활성화 칼륨 채널의 억제와 관련하여 사용되는 경우, "선택적" 및 "선택성"이라는 용어는 IC50 값이 동일한 온도(예: 298K와 같은 실온)에서 Cav1.2 칼슘-활성화 칼륨 채널 서브타입에 대한 동일한 화합물의 결합에 대해 측정된 IC50 값보다 적어도 10배 낮은(예를 들면. 적어도 20배, 50배, 100배, 500배 또는 1000배 낮은) KCa3.1에 대한 화합물의 결합에 대한 언급을 포함한다.
또한 언급될 수 있는 본 발명의 실시형태는 화학식 I의 화합물이 KCa3.1 칼슘-활성 칼륨 채널의 선택적 억제제인 것을 포함한다.
본원에서 KCa3.1 칼슘-활성화 칼륨 채널의 억제와 관련하여 사용되는 경우, "선택적" 및 "선택성"이라는 용어는 IC50 값이 동일한 온도(예: 298K와 같은 실온)에서 또 다른 칼슘-활성화 칼륨 채널 서브타입(예를 들면, Cav1.2 칼슘-활성화 칼륨 채널 서브타입)에 대한 동일한 화합물의 결합에 대해 측정된 IC50 값보다 적어도 10배 낮은(예를 들면, 적어도 20배, 50배, 100배, 500배 또는 1000배 낮은) KCa3.1 칼슘-활성화 칼륨 채널에 대한 화합물의 결합에 대한 언급을 포함한다. KCa3.1 칼슘-활성화 칼륨 채널에 대한 선택성은 다른 하나의 칼슘-활성화 칼륨 채널 서브타입을 초과할 수 있지만, 본 발명의 특정 실시형태에서는 2개 이상(예를 들면, 다른 모든) 칼슘-활성화 칼륨 채널 서브타입을 초과한다.　　
본 발명의 제2 측면에서, KCa3.1 채널 억제제로서 사용하기 위한 제1 측면에서 기재된 바와 같은 화합물, 또는 이의 유도체가 제공된다. 언급될 수 있는 본 발명의 실시형태에는 화학식 I의 화합물이 KCa3.1 채널을 선택적으로 억제하는 것이 포함된다.
본원에서 KCa3.1 채널의 억제와 관련하여 사용되는 경우, "선택적" 및 "선택성"이라는 용어는 IC50 값이 동일한 온도(예를 들면, 실온, 예컨대, 298K)에서 하기 채널: KCa1.1 채널, KCa2.2 채널, KCa2.3 채널, KV1.1 채널, KV1.2 채널, KV1.3 채널, KV1.4 채널, KV1.5 채널, KV1.7 채널, KV3.1 채널, KV4.2 채널, KV11.1 채널 중 하나 이상에 대한 동일한 화합물의 결합에 대해 측정된 IC50 값보다 적어도 10배 낮은(예: 적어도 20배, 50배, 100배, 500배 또는 1000배 낮은) KCa3.1 채널에 대한 화합물의 결합에 대한 언급을 포함한다. KCa3.1 채널에 대한 선택성은 다른 하나의 칼슘 채널 서브타입 및/또는 전압 게이트 채널 서브타입을 초과할 수 있지만, 본 발명의 특정 실시형태에서, 2개 이상(예를 들면, 다른 모든)의 칼슘 채널 서브타입 및 전압 게이트 채널 서브타입을 초과한다.
본 발명의 실시형태에서, 하기 중 하나 이상이 적용될 수 있다:
(Ai) R1은 H, F, Cl, Br, CF3 또는 NO2로부터 선택될 수 있고;
(Aii) R2 및 R3은 H, F, Cl, Br, CH3, CF3 또는 NO2로부터 독립적으로 선택될 수 있고;
(Aiii) R4는 H, F, Cl, Br 또는 CF3로부터 선택될 수 있고;
(Aiv) R5 및 R6은 독립적으로 R9aC(O)O-, R9bOC(O)- 또는 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알킬 케톤으로부터 선택될 수 있고, 이 탄소원자는 분지 또는 비분지이고, 비치환되거나 Cl, F 및 NO2로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되고;
(Av) R7 및 R8는 독립적으로 H, 또는 비치환되거나 F 및 Cl로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 C1 내지 C3 알킬로부터 선택될 수 있거나, 또는
R5 및 R7 또는 R6 및 R8 쌍 중의 하나는, 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께, 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭이고, 비치환되거나 F, Cl, =O 및 C1 내지 C6 알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 4 내지 10원의 환 시스템을 형성할 수 있고;
(Avi) R9a 내지 R9f 및 R10a 내지 R10e는 H, 및 비치환되거나 F 및 Cl로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 C1 내지 C3 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
본원에서 언급될 수 있는 특정 실시형태는 하기 중 하나 이상이 적용될 수 있다:
R1은 H, F, Cl 또는 CF3로부터 선택되고;
R2 및 R3은 H, F, Cl 또는 CF3으로부터 독립적으로 선택되고;
R4는 H, F, Cl 또는 CF3로부터 선택되고;
R5 및 R6은 R9bOC(O)-, 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 알킬 케톤으로부터 독립적으로 선택되고, 이 탄소원자는 비치환되거나 Cl 및 F로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되고;
R7 및 R8은 H, 또는 비치환되거나 F 및 Cl로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 메틸로부터 독립적으로 선택된다.
본원에서 언급될 수 있는 본 발명의 보다 구체적 실시형태에서, 하기 중 하나 이상이 적용될 수 있다:
R1은 H, F 또는 Cl로부터 선택되고;
R2는 CF3 또는 더 구체적으로 H 또는 F로부터 선택되고;
R3은 H 또는 CF3로부터 선택되고;
R4는 H이고;
R5 및 R6는 CH3OC(O)- 또는 프로판-2-오닐(예: R5 및 R6은 모두 CH3OC(O)-임)로부터 독립적으로 선택되고;
R7 및 R8은 H 및 CH3로부터 독립적으로 선택된다.
본원에서 언급될 수 있는 본 발명의 특정 실시형태들에서, R7 및 R8 중 적어도 하나는 H이다. 예를 들면, R7 및 R8 둘 다는 H일 수 있다. 본원에서 언급될 수 있는 대체 실시형태들에서,
R7은 H일 수 있고 R8은 CH3일 수 있고;
R7 및 R8은 모두 CH3일 수 있거나, 또는
R7는 CH3일 수 있고 R8은 H일 수 있다.
화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및/또는 용매화물은 하기 목록의 화합물 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다:
보다 구체적으로, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및/또는 용매화물은 하기 목록의 화합물 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다:
보다 구체적으로, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및/또는 용매화물은 하기 목록의 화합물 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다:
더욱 구체적으로, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및/또는 용매화물은 하기 목록의 화합물 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다:
예를 들면, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및/또는 용매화물은 일 수 있다.
이해하는 바와 같이, 본 발명의 화합물은 대상체의 치료에 적합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 화학식 I의 화합물, 또는 이들의 염 및 용매화물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클과 조합하여 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
화학식 I의 화합물은 임의의 적절한 경로로 투여될 수 있지만, 특히 경구, 정맥내, 근육내, 피부, 피하, 경점막(예: 설하 또는 협측), 직장, 경피, 비강, 폐(예: 기관 또는 기관지), 국소, 기타 임의의 비경구 경로에 의해, 약제학적으로 허용되는 용량 형태의 화합물을 포함하는 약제학적 제제의 형태로 투여될 수 있다. 언급될 수 있는 특정 투여 방식에는 경구, 정맥내, 피부, 피하, 비강, 근육내 또는 복강내 투여가 포함된다.
화학식 I의 화합물은 일반적으로 약제학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 혼합하여 약제 제형으로서 투여되며, 이는 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 관행을 고려하여 선택될 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 활성 화합물에 대해 화학적으로 불활성일 수 있으며, 사용 조건에서 유해한 부작용 또는 독성을 갖지 않을 수 있다. 예를 들면, 적합한 약제학적 제형은 문헌[참조: Remington The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania (1995)]에서 발견할 수 있다. 비경구 투여의 경우, 발열원을 포함하지 않고 필요한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액을 사용할 수 있다. 적절한 용액은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 문헌에 다수의 방법이 기재되어 있다. 약물 전달 방법에 대한 간략한 총설은, 예를 들면, 문헌[참조: Langer, Science (1990) 249, 1527]에서 발견할 수 있다.
그렇지 않은 경우, 적절한 제형의 제조는 일상적 기술을 사용하거나 표준 및/또는 허용된 제약 관행에 따라 당업자에 의해 일상적으로 달성될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 임의의 약제학적 제형에서 화학식 I의 화합물의 양은 치료되는 상태의 중증도, 치료되는 특정 환자, 및 사용되는 화합물(들)과 같은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 어쨌든, 제형 중의 화학식 I의 화합물의 양은 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다.
예를 들면, 정제 또는 캡슐과 같은 고형 경구용 조성물은 1 내지 99%(w/w)의 활성 성분; 0 내지 99%(w/w)의 희석제 또는 충전제; 0 내지 20%(w/w)의 붕해제; 0 내지 5%(w/w)의 윤활제; 0 내지 5%(w/w)의 유동 보조제; 0 내지 50%(w/w)의 과립제 또는 결합제; 0 내지 5%(w/w)의 항산화제; 및 0 내지 5%(w/w)의 안료를 함유할 수 있다. 조절 방출 정제는 0 내지 90%(w/w)의 방출-조절 폴리머를 추가로 함유할 수 있다.
비경구 제형(예: 주사용 용액 또는 현탁액 또는 주입용 용액)은 1 내지 50%(w/w)의 활성 성분; 50%(w/w) 내지 99%(w/w)의 액체 또는 반고체 담체 또는 비히클(예: 물과 같은 용매); 및 0 내지 20%(w/w)의 완충제, 항산화제, 현탁 안정제, 등장성 조절제 및 보존제와 같은 하나 이상의 기타 부형제를 함유할 수 있다.
치료되는 질환 및 환자, 게다가 투여 경로에 따라, 화학식 I의 화합물은 이를 필요로 하는 환자에게 다양한 치료 유효 용량으로 투여될 수 있다.
그러나, 본 발명의 문맥에서 포유동물, 특히 인간에게 투여되는 용량은 합리적 기간 동안 포유동물에서 치료 반응을 일으키기에 충분해야 한다. 당업자는 정확한 용량 및 조성물 및 가장 적절한 전달 요법의 선택이 특히 제형의 약리학적 특성, 치료되는 질환의 성격 및 중증도, 수용자의 신체적 상태 및 정신력, 게다가 특정 화합물의 효능, 치료되는 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 반응, 질환의 단계/중증도에 의해 영향을 받는다는 것을 인식할 것이다.
투여는 연속적 또는 간헐적(예: 볼러스 주사에 의해)으로 이루어질 수 있다. 투여량은 또한 투여 타이밍 및 빈도에 따라 결정될 수 있다. 경구 또는 비경구 투여의 경우, 투여량은 화학식 I 화합물의 1일당 약 0.01mg 내지 약 1000mg의 범위로 달라질 수 있다.
어쨌든, 개업의 또는 기타 숙련자는 개별 환자에게 가장 적합한 실제 용량을 일상적으로 결정할 수 있다. 상기 언급된 투여량은 평균적 경우의 예시이며, 물론 더 높거나 낮은 투여량 범위가 적합한 개별 사례가 있을 수 있으며, 이러한 사례는 본 발명의 범위 내에 속한다.
주지하는 바와 같이, 본 발명의 또 다른 측면은 의약에서 사용하기 위한 본원에서 기재된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및/또는 용매화물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 추가 측면은 다음과 관련된다.
(a) KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화와 관련된 질환 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본원에 정의된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물.
(b) KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화와 관련된 질환 상태의 치료 또는 예방을 위한 의약을 제조하기 위한 본원에 정의된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염과 용매화물의 용도.
(c) 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 정의된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물을 유효량 투여하는 것을 포함하는, KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화와 관련된 장애 또는 상태의 치료 방법.
본 발명의 다양한 실시형태에서, KCa3.1 활성의 증가 또는 변경과 관련된 질환 상태는 백혈병(leukaemia) 또는 보다 구체적으로 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases; IBD), 섬유성 질환(fibrotic diseases)(폐, 간, 신장, 심장, 결막, 각막), 비-알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD), 비-알코올성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis; NASH), 신경교종(gliomas)(교모세포종(glioblastoma)), 폐암(lung cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 난소암(ovarian cancer), 대장암(colorectal cancer), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 당뇨병성 신장 질환(diabetic renal disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 골 흡수(bone resorption), 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 죽상 동맥경화증(atherosclerosis), 혈관성형술후 재협착(restenosis following angioplasty), 스텐트내 신생동맥경화증(in-stent neo-atherosclerosis), 뇌졸중(stroke), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 유전성 적혈구증(hereditary xerocytosis), 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia), 백혈병(leukaemia), 천식(asthma), 알레르기 비염(allergic rhinitis), 미세아교세포 활성화(microglial activation), 산화질소-의존성 신경퇴화(nitric oxide-dependent neurodegeneration), 신경-종양 질환(neuro-oncological diseases) 및 희귀 적혈구 장애(orphan red blood cell disorders) 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, KCa3.1 활성의 증가 또는 변화와 관련된 질환 상태는 백혈병(leukaemia), 또는 더욱 특히 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases; IBD), 섬유성 질환(fibrotic diseases)(폐, 간, 신장, 심장, 결막, 각막), 비-알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD), 비-알코올성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis; NASH), 신경교종(gliomas)(교모세포종(glioblastoma)), 폐암(lung cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 난소암(ovarian cancer), 대장암(colorectal cancer), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 당뇨병성 신장 질환(diabetic renal disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 골 흡수(bone resorption), 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 혈관성형술후 재협착(restenosis following angioplasty), 스텐트내 신생-동맥경화증(in-stent neo-atherosclerosis), 뇌졸중(stroke), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 유전성 적혈구증(hereditary xerocytosis), 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia), 백혈병(leukaemia), 천식(asthma), 알레르기 비염(allergic rhinitis), 미세아교세포 활성화(microglial activation) 및 산화질소-의존성 신경퇴화(nitric oxide-dependent neurodegeneration) 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 언급될 수 있는 특정 실시형태에서, KCa3.1 활성의 증가 또는 변화와 관련된 질환 상태는 뇌졸중일 수 있다.
주지하는 바와 같이, 본원에 개시된 화학식 I의 화합물 또는 유도체는 설치류의 반복-투여 독성학 연구에서 효능, KCa3.1 채널에 대한 선택성, 경구 생체이용률, 우수한 뇌 침투성 및 내약성 등의 이점을 갖는다. 또한, 본원에 개시된 화학식 I의 화합물 또는 유도체는 KCa3.1 활성의 증가 또는 변화와 관련된 질환 상태인 뇌졸중의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다.
본원에 기재된 본 발명의 측면(예를 들면, 상술한 화합물, 조합물, 방법 및 용도)은 본원에 기재된 병태의 치료에서, 이러한 병태의 치료 또는 다른 용도로 사용하기 위해 종래 기술에 공지된 유사한 화합물, 조합물, 방법(치료) 또는 용도와 비교하여 의사 및/또는 환자에게 보다 편리하고, 보다 효과적이고, 보다 독성이 적고, 보다 우수한 선택성을 갖고, 보다 광범위한 활성을 갖고, 보다 강력하고, 보다 적은 부작용을 생성하거나, 또는 기타 유용한 약리학적 특성을 가질 수 있다는 이점을 가질 수 있다.
화학식 I의 화합물은 하기 실시예에서 입증된 바와 같이 공지된 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 기타 화합물은 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물은 종래의 기술(예: 재결정화, 컬럼 크로마토그래피, 예비 HPLC 등)을 사용하여 이들의 반응 혼합물로부터 단리할 수 있다.
실시예
재료
탄산암모늄((NH4)2CO3), 아세트산, 암모늄 아세테이트(NH4OAc), 디클로헥실 카바마이드, 4-디메틸 아미노피리딘, n,o-디메틸하이드록실아민 HCl, 2-(1H-벤조트리아졸-1-YL)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 에틸 클로로포르메이트, 메틸 아세토아세테이트, 피페리딘 및 나트륨 메타 퍼요오데이트는 아브라 신테시스 피브이티 리미티드(Avra Synthesis Pvt Ltd)로부터 구입했다. 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화칼슘, 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), D-글루코오스, 구아노신 5'-트리포스페이트 나트륨염 수화물(Na2-GTP), 아데노신 5'-트리포스페이트 마그네슘염(Mg-ATP), 케토코나졸, 퀴니딘, 설파페나졸포르, 누트카톤, 베라파밀, 와파린, 날트렉손, 로페르아미드 하이드로클로라이드, 페나세틴, 레세르핀, β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 2'-포스페이트 환원 4나트륨염 수화물(NADPH), N-메틸-2-피롤리돈(NMP), 솔루톨 HS-15, 폴리에틸렌 글리콜 400(PEG-400), 토코퍼솔란(TPGS), 산화망간 및 디클로로메탄은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 구입했다. 산화오스뮴(VIII)은 켐푸르 프테 리미티드(Chempure Pte Ltd)로부터 구입했다. 메틸 프로피올레이트, 4-클로로-3-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드, 3,4-디플루오로-5-(트리플루오로메틸)벤조산, 3-플루오로-5-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드, 칼륨 비닐 트리플루오로보레이트(95%), 5-브로모-2-플루오로-3-(트리플루오로메틸)벤조산 및 4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드는 콤비-블록 인코포레이티드(Combi-Blocks Inc)로부터 구입했다. 1,1'-비스-(디페닐포스피노)-페로센]-팔라듐 디클로라이드는 힌두스탄 플래티넘 프테 리미티드(Hindustan Platinum Pte Ltd.)로부터 구입했다. 클로로포름은 SAI 엔터프라이즈(SAI Enterprises)로부터 구입했다. 이소프로필마그네슘 클로라이드 - 염화리튬 복합체, THF 중의 1.3M 용액, 1,4-디옥산 중의 염화수소 4몰, 디에틸 에테르 중의 메틸마그네슘브로마이드 3M 용액은 사니노르 라보라토리즈 프테 리미티드(Sainor Laboratories Pte. Ltd)로부터 구입했다. N,N,N,N-테트라메틸구아니디늄 아지드는 셀렉트랩 케미컬스 게엠베하(SelectLab Chemicals GmbH)로부터 구입했다. 메틸 프로피올레이트, 테트라에틸암모늄 클로라이드(TEA-Cl) 및 3-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드(97%)는 TCI 케미칼스 (인디아) 프테 리미티드(TCI Chemicals (India) Pte. Ltd)로부터 구입했다. N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄 술폰산(HEPES)은 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)으로부터 구입했다. 푸라필린은 BD 젠시험(BD Gentest)로부터 구입했다. 포름산은 하니웰 리서치 케미컬스(Honeywell Research Chemicals)로부터 구입했다. 아세토니트릴(ACN)은 아반토르(Avantor)로부터 구입했다. 톨부타미드는 수펠코(Supelco)로부터 구입했다. 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TCC)는 빅메드 바이오테크놀로지(Vicmed Biotechnilogy)로부터 구입했다. 에다라본은 타겟몰(TargetMol)로부터 구입했다. 기타 모든 화학물질과 용매는 산업용 화학물질 공급업체로부터 구입했으며, 추가 정제없이 직접 사용했다.
분석 기술
1 H NMR 분광법
모든 1H NMR 스펙트럼은 400MHz(브루커) 및 500MHz(아길런트) NMR 분광기에서 기록되었다. 모든 화학적 이동은 내부 표준으로서 테트라 메틸 실란(TMS)을 기준으로 δ 값으로 제공되었다.
액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS)
독성학 연구에는 워터(Waters) UPLC 시스템과 결합된 LC-MS/MS AB SCIEX API-4000 삼중 사중극자 장치를 사용했다. 시토크롬 P450 효소 억제 검정 및 혈장 단백질 결합 검정에는 LC SIL-HTc(Shimadzu)와 결합된 질량 분석기 API-4000(Applied Biosystems)을 사용했다. 마이크로솜 안정성 연구에는 LC SIL-HTc(Shimadzu)와 결합된 질량 분석기 TSQ 퀀텀 울트라(Thermo Scientific)를 사용했다. 화합물 합성 분석에는 LCMS (SQD)-2010EV(Shimadzu), LCMS (SQD)-1200 시리즈 LC/ G6125B-MS(Agilent) 및 UPLC/MS (SQD)(Waters)를 사용했다.
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)
수용성 용해도 검정에는 워터스 얼라이언스(Waters Alliance) 2690 HPLC를 사용했다. 화합물 합성 분석에는 HPLC 2010CHT(Shimadzu)가 사용되었다.
실시예 1
이 연구에서 연구된 디하이드로피리딘은 4개의 그룹으로 분류되고, 표 1에 제시되어 있다. 그룹 4는 R7과 R8의 모이어티를 기준으로 3개의 서브-그룹(4a, 4b, 4c)으로 추가로 나뉘어진다.
[표 1]
그룹 4b 및 4c 유사체의 합성은 하기에 제시되어 있다. 이들 모든 화합물은 SciFinder 데이터베이스의 검색을 기반으로 신규 화학 물질이다.
디메틸 4-(4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-1,4-디하이드로피리딘-3,5-디카복실레이트( 103 )
0℃로 냉각한 아세트산(800mL) 중의 4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드(1, 80g, 416.42mmol, 1.0eq)의 교반 용액에 메틸 프로피올레이트(2, 70g, 832.84mmol, 2.0eq) 및 (NH4)2CO3(40g, 416.42mmol, 1.0eq)를 첨가하고, 반응 혼합물을 70℃에서 16시간 동안 교반했다. 반응 완료 후(박층 크로마토그래프(TLC)로 모니터링), 반응 혼합물을 냉수(1L)로 희석하고, 이어서 에틸 아세테이트(EtOAc, 2×1L)로 추출했다. 유기상을 포화 NaHCO3 용액(2L) 및 식염수 용액(2L)으로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과 및 농축하여 조 생성물을 수득했다. 조 생성물을 헥산(800mL)을 사용하여 삼투시키고, 경사분리하고, 이어서 MeOH(50mL)로 결정화하고, 여과하여 연황색 고체로서 　화합물 103(44g, 29.4%)를 수득했다. TLC: 50% EtOAc/헵탄(R f : 0.3).
1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz): δ 9.32 (br s, 1H), 7.55 - 7.50 (m, 1H), 7.48 - 7.44 (m, 1H), 7.43 - 7.37 (m, 3H), 4.80 (s, 1H), 3.55 (s, 6H).
LC-MS: 99.59%, m/z = 358.0 [M-H]- (컬럼: EVO-C18(3.0 × 50 mm, 2.6 μm); Rt: 2.83분; A: 수중 2.5mM NH4OAc, B: 아세토니트릴(CAN) T/B %: 0.01/5, 3/90, 5/90, 5.5/5, 6/5; 온도: 50℃; 및 유속: 0.8 mL/min).
HPLC: 99.94%(컬럼: X-SELECT CSH C-18(4.6 × 150mm, 3.5 μm); Rt: 10.20 분; A: 수중 5.0mM NH4OAc, B: ACN T/B %: 0.01/20, 12/90, 16/90; 및 유속: 1.0 mL/min).
디메틸 4-(4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-2-메틸-1,4-디하이드로피리딘-3,5-디카복실레이트( 104 )
메틸 3-아지도아크릴레이트( 3b )
클로로포름(40mL) 중의 메틸 프로피올레이트(3a, 2.0g, 23.80mmol, 1.0eq)의 교반 용액에 N,N,N,N-테트라메틸 구아니디늄 아지드(4.0g, 26.19mmol, 1.1eq)를 첨가하고, 반응을 실온(RT)에서 16시간 동안 교반했다. 반응이 완료된 후(TLC로 모니터링), 반응 혼합물을 35℃ 수욕에서 300mbar로 농축했다. 조 생성물을 먼저 35℃ 수욕에서 하우스 진공으로 증류하여, 잔류하는 클로로포름의 대부분을 제거했다. 진공 펌프를 연결하여 진공을 제공하고, 조 생성물을 증류하여 회백색 고체(1.5g, 조 생성물)로서 3b를 수득했다. 조 생성물은 추가 정제없이 다음 반응에 직접 사용되었다. TLC: 20% EtOAc/헵탄(R f : 0.5).
메틸 (E)-3-((트리페닐-l5-포스파네일리덴)아미노)아크릴레이트( 3c )
DCM(50mL) 중의 메틸 3-아지도아크릴레이트(1.5g, 11.81mmol, 1.0eq)의 교반 용액에 트리페닐포스핀(3.0g, 11.80mmol, 1.0eq)을 첨가하고, 반응 혼합물을 RT에서 16시간 동안 교반했다. 반응 완료 후(TLC로 모니터링), 반응 혼합물을 진공하에 직접 증발시켜 회백색 고체(1.0g, 조 생성물)로서 3c을 수득했다. TLC: 20% EtOAc/헵탄(R f : 0.5).
메틸 (Z)-2-(4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)벤질리덴)-3-옥소부타노에이트( 2 )
톨루엔(10mL) 중의 4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드(1, 0.5g, 2.60mmol, 1.0eq)의 교반 용액에 피페리딘(22.1mg, 0.26mmol, 0.1eq) 및 아세트산(15.6mg, 0.26mmol, 0.1eq)을 0℃에서 첨가하고, 반응 혼합물을 RT에서 16시간 동안 교반했다. 반응이 완료된 후(TLC로 모니터링), 반응 혼합물을 냉수(20mL)로 희석하고, 이어서 DCM(2 × 50mL)으로 추출했다. 유기상을 식염수 용액(20mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 및 농축하여 조 생성물을 수득하고, 헥산 중의 20 내지 30% EtOAc를 용출제로서 사용하여 콤비-플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 2을 연황색 고체(0.5g, 66.2%)로서 수득했다. TLC: 30% EtOAc/헵탄(R f : 0.2).
104
클로로포름(20mL) 중의 화합물 2(0.5g, 1.72mmol, 1.0eq)의 교반 용액에 화합물 3c(0.930g, 2.58mmol, 1.5eq)를 첨가하고, 반응 혼합물을 40℃에서 6시간 동안 교반했다. 반응 진행을 TLC로 모니터링하고, 상기 화합물 2에 대한 프로토콜에 따라 생성물을 작업 및 정제하여 연황색 고체(0.2g, 31%)로서 화합물 104를 수득했다. TLC: 40% EtOAc/헵탄(R f : 0.2).　　
1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz): δ 9.36 (br s, 1H), 7.55 - 7.50 (m, 1H), 7.48 - 7.44 (m, 2H), 7.43 - 7.37 (m, 1H), 4.82 (s, 1H), 3.55 (s, 6H) 2.25 (s, 3H).
LC-MS: 99.91%, m/z = 374.1 [M+H]+ (컬럼: EVO-C18(3.0 × 50 mm, 2.6 μm); Rt: 2.8＼8 min; A: 수중 2.5mM 암모늄 포르메이트, B: ACN T/B%: 0.01/5, 3/90, 5/90, 5.5/5, 6/5; 온도: 50℃; 및 유속: 0.8 mL/min).
HPLC: 99.94%(컬럼: X-SELECT CSH C-18(4.6 × 150mm, 3.5 μm); Rt: 10.95분; A: 수중 5.0mM 암모늄 아세테이트(NH4OAc), B: ACN T/B%: 0.01/20, 12/90, 16/90; 및 유속: 1.0mL/min).
디메틸 4-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-1,4-디하이드로피리딘-3,5-디카복실레이트( 108 )
0℃로 냉각한 아세트산(200mL) 중의 3-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드(1, 20g, 114.92mmol, 1.0eq)의 교반 용액에 메틸 프로피올레이트(2, 20.45mL, 229.85mmol, 2.0eq) 및 (NH4)2CO3(11g, 114.92mmol, 1.0eq)를 첨가하고, 80℃에서 16시간 동안 교반했다. 반응이 완료된 후(TLC로 모니터링), 반응 혼합물을 냉수(400mL)로 희석하고, 이어서 EtOAc(2 × 500mL)로 추출했다. 유기 층을 포화 NaHCO3 　용액(500mL) 및 　　식염수 용액(500mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 및 농축하여 조 생성물을 수득하고, 이를 헥산 중의 30 내지 40% EtOAc를 용출제로 사용하여 콤비-플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 연황색 고체(11.0g, 28%)로서 화합물 108를 수득했다. TLC: 40% EtOAc/헵탄(R f : 0.2).
1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz): δ 9.32 (br s, 1H), 7.55 - 7.50 (m, 3H), 7.48 - 7.44 (m, 1H), 7.43 - 7.37 (m, 2H), 4.80 (s, 1H), 3.55 (s, 6H).
LC-MS: 99.54%, m/z = 340.0 [M-H]- (컬럼: EVO-C18(3.0 × 50 mm, 2.6 μm); Rt: 2.65 분; A: 수중 2.5mM NH4OAc, B: ACN T/B%: 0.01/5, 3/90, 5/90, 5.5/5, 6/5; 온도: 50℃; 및 유속: 0.8 mL/min).
HPLC: 99.91%(컬럼: X-SELECT CSH C-18(4.6 × 150mm, 3.5 μm); Rt: 9.43분; A: 수중 5.0mM NH4OAc, B: ACN T/B%: 0.01/20, 12/90, 16/90; 및 유속: 1.0 mL/min).
4-(3-플루오로-5-(트리플루오로메틸)페닐)-1,4-디하이드로피리딘-3,5-디카복실레이트( 109 )
아세트산(10mL) 중의 3-플루오로-5-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드(1, 0.100g, 0.5208mmol, 1.0eq) 및 메틸 프로피올레이트(2, 0.085g, 1.041mmol, 2.0eq)의 교반 용액에 (NH4)2CO3(0.049g, 0.5208, 1.0eq)를 RT에서 서서히 첨가하고, 반응 혼합물을 70℃에서 14시간 동안 가열했다. 출발 물질이 완전히 소비된 후(TLC로 모니터링), 반응 혼합물을 RT로 냉각하고, 빙냉수(10mL)로 서서히 ?칭했다. 수성 층을 DCM(15mL × 2)으로 추출했다. 합한 유기 층을 식염수(10mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 감압하에 농축하여 조 생성물을 수득하고, 이를 n 헥산 중의 10 내지 40% EtOAc를 사용하여 콤비-플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 109를 연황색 고체(0.040g, 22%)로서 수득했다. TLC: 40% EtOAc/헥산(R f : 0.5).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.36 (brs, 1H), 7.40 - 7.50 (m, 3H), 7.32 (s, 1H), 7.26 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.81 (s, 1H), 3.53 (s, 6H).
LC-MS: 99.32%, m/z = 360.0 [M+H]+ (컬럼: X-Select CSH C18(3.0 × 50 mm, 2.5 μm); Rt: 1.941 분; A: 물:ACN(95:05) 중 0.05% 포름산, B: ACN 중 0.05% 포름산. 온도: 50℃; 및 유속: 1.2mL/min).
HPLC: 99.45%(컬럼: X-SELECT CSH C-18(4.6 × 150mm, 3.5 μm); Rt: 8.48분; A - 수중 0.1% 포름산, B: ACN T/B%: 0.01/5, 1.0/5, 8.0/100, 12.0/100, 14.0/5, 18.0/5 및 유속: 1.0mL/min).
디메틸 4-(3,4-디플루오로-5-(트리플루오로메틸)페닐)-1,4-디하이드로피리딘-3,5-디카복실레이트( 110 )
(3,4-디플루오로-5-(트리플루오로메틸)페닐)메탄올( 2 )
THF(20mL) 중의 3,4-디플루오로-5-(트리플루오로메틸)벤조산(1, 0.500g, 2.212mmol)의 교반 용액에 BH3:THF(6.6mL, 6.637mmol)를 0℃에서 서서히 첨가했다. 반응 혼합물을 RT에 도달하도록 하고, 12시간 동안 교반했다. 출발 물질이 완전히 소비된 후(TLC로 모니터링), 반응 혼합물을 3M HCl(30mL)으로 ?칭하고, 수성 층을 EtOAc(20mL)로 추출했다. 유기 층을 식염수(10mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 감압하에 농축하여 점성 무색 오일(0.300g, 64%)로서 화합물 2를 수득했다. 수득된 조 생성물은 추가 정제없이 다음 반응에 직접 사용되었다. TLC: DCM 중의 5% MeOH(R f : 0.6).
1H NMR(400MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.45 - 7.55 (m, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 4.58 - 4.68 (s, 2H).
3,4-디플루오로-5-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드( 3 )
DCM(20mL) 중의 (3,4-디플루오로-5-(트리플루오로메틸)페닐)메탄올(2, 0.300g, 1.415mmol)의 교반 용액에 MnO2(0.738g, 8.490mmol)을 RT에서 서서히 첨가하고, 12시간 동안 교반했다. 출발 물질이 완전히 소모된 후(TLC로 모니터링), 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과했다. 셀라이트 패드를 DCM(5mL)으로 세척하고, 수득된 여과액을 감압하에 농축하여 점성 무색 오일(0.200g, 67%)로서 화합물 3을 수득했다. 수득된 조 생성물은 추가 정제없이 다음 반응에 직접 사용되었다. TLC: 40% EtOAc/헥산(R f : 0.8).
1H NMR(400MHz, DMSO-d 6) δ 9.88 (br. s, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.45 (s, 1H).
110
아세트산(10mL) 중의 3,4-디플루오로-5-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드(3, 0.200g, 0.9523mmol) 및 메틸 프로피올레이트(2, 　0.159g, 1.904mmol)의 교반 용액에 (NH4)2CO3(0.091g, 0.9523mmol)을 RT에서 서서히 첨가하고, 반응 혼합물을 75℃에서 16시간 동안 가열했다. 출발 물질이 완전히 소비된 후(TLC로 모니터링), 반응 혼합물을 RT로 냉각하고, 빙냉수(10mL)로 서서히 ?칭했다. 수성 층을 DCM(20mL × 2)으로 추출했다. 합한 유기 층을 식염수(10mL)로 세척하고, Na2SO4에서 건조시키고, 감압하에 농축하여 조 생성물를 수득했다. 수득된 조 생성물를 n-헥산 중의 0 내지40% EtOAc를 사용하여 콤비-플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 연황색 고체(0.040g, 11 %)로서 화합물 110을 수득했다. TLC: 40% EtOAc/헥산(R f : 0.5).
1H NMR (400MHz, DMSO-d 6) δ 9.38 (br. s, 1H), 7.40 - 7.50 (m, 3H), 7.30 (s, 1H), 4.81 (s, 1H), 3.55 (s, 6H).
LC-MS: 99.64%, m/z = 360.0 [M+H]+ (컬럼: X-SELECT CSH C18(3.0 × 50 mm, 2.5 μm); Rt: 2.034분; A: 물:ACN(95:5) 중의 0.05% 포름산, B: ACN 중의 0.05% 포름산; 온도: 50℃; 및 유속: 1.2mL/min).
HPLC: 98.11%(컬럼; X-SELECT CSH C-18(4.6 × 150mm, 3.5 μm); Rt: 9.043분; A - 물 중의 0.1% 포름산, B: ACN T/B%: 0.01/5, 1.0/5, 8.0/100, 12.0/100, 14.0/5, 18.0/5; 및 유속: 1.0mL/min).
디메틸 4-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-1,4-디하이드로피리딘-3,5-디카복실레이트( 113 )
아세트산(10mL) 중의 4-클로로-3-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드(1, 0.100g, 0.4807mmol) 및 메틸 프로피올레이트(2, 0.080g, 0.9615mmol)의 교반 용액에 (NH4)2CO3(0.046g, 0.4807)을 RT에서 서서히 첨가하고, 반응 혼합물을 70℃에서 14시간 동안 가열했다. 출발 물질이 완전히 소비된 후(TLC로 모니터링), 반응 혼합물을 RT로 냉각하고, 빙냉수(10mL)로 서서히 ?칭했다. 수성 층을 DCM(20mL × 2)으로 추출했다. 합한 유기 층을 식염수(10mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 감압하에 농축하여 조 생성물을 수득했다. 조 생성물을 n-헥산 중의 0 내지 40% EtOAc를 사용하여 콤비-플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 연황색 고체(0.040g, 22%)로서 화합물 113을 수득했다. TLC: 40% EtOAc/헥산(R f : 0.8).
1H NMR (400MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.33 (br. s, 1H), 7.63 (d, J = 8.01 Hz, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.40 - 7.50 (m, 3H), 4.79 (s, 1H), 3.35 (s, 6H).
LC-MS: 99.75%, m/z = 376.0 (M+H)+ (컬럼: X-SELECT CSH C18(3.0 × 50 mm, 2.5 μm); Rt: 1.986 분; A: 수중 0.05% 포름산: ACN(95:05), B: ACN 중의 0.05% 포름산; 온도: 50℃; 및 유속: 1.2mL/min).
HPLC: 99.42%(컬럼: X-SELECT CSH C-18(4.6 × 150mm, 3.5 μm); Rt: 8.715분, A - 수중 0.1% 포름산, B: ACN T/B%: 0.01/5, 1.0/5, 8.0/100, 12.0/100, 14.0/5, 18.0/5; 및 유속: 1.0mL/min).
실시예 2
KCa3.1 채널에 대한 디하이드로피리딘의 패널을 구조-활성 상관을 이해하기 위해 패치 클램프를 사용하여 스크리닝했다.
K Ca 3.1 패치-클램프 프로토콜
KCa3.1 채널에 대한 화합물의 효과는 QPatch HTX 자동 전기생리학 플랫폼(Sophion, Denmark)을 사용한 패치-클램프와 수동 패치-클램프(HEKA, Germany)에 의해 평가했다. QPatch 실험에서는, 기가-씰 및 자동 전기생리학을 위한 전체 세포 요건은 다음과 같다: 최소 씰 저항 = 0.1GΩ, 유지 전위 = -80mV, 유지 압력 = -20mbar, 위치결정 압력 = -70mbar. KCa3.1 실험에서는, 외부 용액은 Na+-Ringer's이고, (mM 단위로) 160 NaCl; 10 HEPES; 4.5 KCl; 1 MgCl2; 및 2 CaCl2(pH = 7.4, 310 mOsm)을 함유했다. 내부 용액은 (mM 단위로) 120 KCl; 10 HEPES; 1.75 MgCl2; 1 Na2ATP; 10 EGTA; 및 8.6 CaCl2(1μM 유리 Ca2+) (pH = 7.2, 300 mOsm)을 함유했다. 전체 세포 구성을 확립한 후, 세포를 -80mV에서 유지하고, -80mV에서 20ms 동안 유지하고, -120mV에서 20ms 동안 단계적으로 상승시키고, 200ms에 걸쳐 -120로부터 +40mV로 상승시킨 다음, 다시 20ms 동안 -120mV까지 단계적으로 상승시키는 전압 프로토콜에 의해 KCa3.1 전류를 유발했다. 이 펄스 프로토콜은 10초마다 인가되었다. 전류 기울기(초당 암페어 단위)는 Sophion QPatch 소프트웨어를 사용하여 측정하고, 분석을 위해 마이크로소프트 엑셀 및 그래프패드 프리즘 7로 전송했다. -85 내지 -65mV의 기울기 감소를 사용하여 KCa3.1 억제에 대한 IC50을 결정했다. 곡선-피팅 및 IC50 결정은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
결과 및 토론
디하이드로피리딘의 IC50은 표 2에 요약되어 있다. 제1 그룹은 IC50 값이 5μM을 초과하는 KCa3.1을 차단했다. 제2 그룹은 1 내지 5μM에서 채널을 차단했다. 제3 그룹은 100 내지 200nM에서 KCa3.1을 차단했다. 제4 그룹은 낮은 나노몰 농도에서 KCa3.1을 차단했다. 선택된 그룹 2, 3, 4a, 4b 및 4c 화합물의 KCa3.1 전류에 대한 효과는 도 3에 제시되어 있다.
[표 2]
실시예 3
디하이드로피리딘은 L-유형 전압-게이트 칼슘 채널을 억제하기 때문에, 선택된 유사체는 CaV1.2에서 시험되었다.
Ca V 1.2 패치-클램프 프로토콜
CaV1.2 채널에 대한 화합물의 효과는 EPC-10 HEKA 증폭기를 사용한 수동 패치-클램프에 의해 평가했다. 외부 용액은 (mM 단위로) 140 TEA-Cl; 2 MgCl2; 10 CaCl2; 10 HEPES; 5 D-글루코스(pH = 7.4)를 함유했다. 내부 용액은 (mM 단위로) 120 CsCl; 1 MgCl2; 10 HEPES; 10 EGTA; 0.3 Na2-GTP; 및 4 Mg-ATP(pH = 7.2)를 함유했다. 전체 세포 구성을 확립한 후, CaV1.2 전류를 -80mV의 유지 막 전위에서 기록하고, 이어서 0.3초 동안 +10mV로 탈분극(시험 펄스는 납 IV 시험으로 인해 약간 변경됨)했다. 이 프로토콜을 20초 간격으로 반복하여 CaV1.2 전류의 피크에 대한 시험 화합물의 효과를 관찰했다. 각 세포를 5분 동안 또는 전류가 정상 상태에 도달할 때까지 각 시험 화합물과 함께 인큐베이팅되었다. 화합물은 저농도로부터 고농도까지 복수 농도로 적용되었다. 각 세포는 이의 자체 대조군으로 작용했다. 피크 전류의 감소를 사용하여 CaV1.2 억제에 대한 IC50를 결정했다. 곡선-피팅 및 IC50 계산은 IGOR 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
결과 및 토론
표 3은 선택된 유사체를 나타내고, KCa3.1 및 CaV1.2에 대해 선택된 유사체의 선택성을 비교한 것이다. 그룹 2 유사체는 KCa3.1과 비교하여 CaV1.2에 대한 선택성을 나타냈다. 그룹 3 유사체는 CaV1.2와 비교하여 CaCa3.1에 대해 약 10배의 선택성을 나타냈다. 그룹 4 유사체는 CaV1.2와 비교하여 KCa3.1에 대해 50배 이상의 선택성을 나타냈고, 그룹 4c 유사체는 KCa3.1에 대해 최고의 선택적이었다. KCa3.1의 낮은 nM IC50 차단, 및 CaV1.2와 비교하여 KCa3.1에 대한 1000배 이상의 선택성에 필요한 약리작용은 도 4에 제시되어 있다.
[표 3]
실시예 4
그룹 4로부터 선택된 유사체는 관련 칼륨 채널에서 시험했다.
칼륨 채널 패치-클램프 프로토콜
관련 칼륨 채널에 대한 그룹 4 화합물의 효과는 QPatch HTX 자동 전기생리학 플랫폼(Sophion, Denmark)을 사용하여 패치-클램프에 의해 평가했다. 자동 전기생리학에 대한 기가-씰 및 전체 세포 요건은 다음과 같다: 최소 씰 저항 = 0.1GΩ, 유지 전위 = -80mV, 유지 압력 = -20mbar, 위치결정 압력 = -70mbar. 시험한 각 특정 이온 채널에 대한 완충액 조성 및 전압 프로토콜은 표 4에 제시되어 있다.
[표 4]
결과 및 토론
그룹 4a, 4b 및 4c 유사체는 관련 칼륨 채널과 비교하여 KCa3.1에 대해 1000배 이상의 선택성을 나타냈다(표 5).
[표 5]
실시예 5
그룹 4의 화합물 101 및 103은 시토크롬 P450 효소를 억제하는 이들의 능력에 대해 시험했다. 또한, 이들의 혈장 단백질 결합 및 마이크로솜 안정성을 평가했다.
시토크롬 P450 효소 억제 검정
인산 칼륨 완충액(50mM, pH = 7.4) 중의 마이크로솜 현탁액을, 37℃에서 5분간 평형화하기 전에, 각 프로브 기질과 혼합했다. DMSO 대조군, 참조 억제제(3A4의 경우 케토코나졸, 2D6의 경우 퀴니딘, 2C9의 경우 설파페나졸, 2C19의 경우 노트카톤, 1A2의 경우 푸라필린) 및 화합물 101 또는 103을 다양한 농도(0.009μM, 0.027μM, 0.082μM, 0.247μM, 0.741μM, 2.222μM, 6.667μM 및 20μM)로 제조된 마이크로솜 및 프로브 기질 혼합물에 스파이킹하고, 37℃에서 5분 동안 진탕 수욕에서 인큐베이팅했다. NADPH(10mM)를 모든 샘플에 첨가하여 반응을 개시했다. 내부 표준으로서 베라파밀(200ng)과 와파린(200ng)을 함유한 ACN을 혼합물에 첨가하여, 37℃에서 10분간 배양한 후에 반응을 중단했다. 샘플을 온화하게 교반하고, LC-MS/MS 시스템에 주입하기 전에, 4℃에서 20분 동안 1021g에서 원심분리했다. 상기 조건하에 각 기질에 대한 대사산물 형성은 하기 공식을 사용하여 추정했다: 억제율 = [1-(시험 면적 비율/대조군 면적 비율)]x100. IC50 값은 그래프패드 프리즘® 5 소프트웨어에서 시그모이드 용량-반응 곡선(가변 구배)을 사용하여 결정되었다.
혈장 단백질 결합 검정
시험 화합물(3μM, 최종 농도) 및 인산나트륨 완충액(150μL, 100mM, pH 7.4)을 함유하는 인간 및 마우스 혈장(150μL)을 평형 투석 장치에 첨가하고, 37℃에서 4.5시간 동안 일정하게 진탕하면서 평형화했다. 평형화 후, 혈장 10μL를 웰의 제1 절반부에서 채취하고, 50μL의 블랭크 완충액과 혼합한 후, 내부 표준으로 로페라미드, 페나세틴 및 톨부타미드 100ng/mL를 함유한 ACN 중의 0.05% 포름산 200μL로 ?칭했다. 유사하게, 50μL의 혈장을 웰의 제2 절반부에서 채취하고, 10μL의 블랭크 혈장과 혼합한 후 ?칭시켰다. 회수 샘플을 제조하기 위해, 3μM의 화합물 101 또는 103을 함유한 혈장 10μL를 50μL의 블랭크 완충액에 첨가하고, 켄칭했다. 모든 샘플을 4℃에서 5분간 14,000rpm으로 원심분리했다. 와파린 및 날트렉손은 양성 대조군으로 사용했다. 모든 샘플의 상청액을 LC-MS/MS로 분석했다.
마이크로솜 안정성 연구
인간 마이크로솜(20mg/mL)을 인산칼륨 완충액(66.7mM, pH = 7.4)에 배양 혼합물로 현탁했다. 1μL의 시험 화합물 또는 대조군(1.1mM)을 1.1μM의 작동 농도로 되도록 인큐베이팅 혼합물에 첨가하고, 4개의 튜브에 분주하여 4개 시점 검정(0, 5, 15, 30분)을 수행했다. 모든 튜브와 NADPH 용액(10mM)을 37℃에서 5분간 진탕 수욕에서 사전-배양했다. 사전-배양 후, NADPH 용액(10mM)을 5분, 15분 및 30분의 튜브에 첨가했다. 0분 튜브에 완충액을 첨가하여 시험 화합물 또는 참조 표준에 대한 최종 농도 1μM를 수득했다. 각 튜브의 인큐베이팅 기간이 종류한 시점에서, ?칭 용액(내부 표준으로 와파린 및 로페라미드 100ng/mL를 함유한 ACN)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 수득된 샘플을 3,220g에서 20분 동안 원심분리하고, 각 반응 튜브로부터의 상청액을 LC-MS/MS 분석용으로 채취했다.
결과 및 토론
그룹 4c 유사체는 그룹 4a 화합물보다 사이토크롬 P450 효소와 비교하여 KCa3.1에 더 선택적이고 혈장 단백질 결합이 적고 cLogP 값이 낮고 안정성과 용해도가 더 높았다(표 6).
[표 6]
그룹 4c의 화합물 103은 KCa3.1을 낮은 나노몰 효능(IC50 = 6nM)으로 차단하고, 다른 채널 및 약 100개 분자 표적의 패널과 비교하여 KCa3.1에 대해 1000배 이상의 선택성을 갖기 때문에, 후속 연구에 사용되었다.
실시예 6
화합물 103의 선택성은 97개 표적에 대한 경쟁적 결합, 효소 및 흡수 검정으로 평가되었다.
경쟁적 결합 검정
개별 경쟁 결합 검정의 실험 조건은 표 7에 제시되어 있다. 화합물 103은 3μM에서 시험되었다. 결과는 대조군 특이적 결합에 대한 백분율 억제[100-(측정된 특이적 결합/대조군 특이적 결합*100)]로 표현된다. IC50 값과 Hill 계수(nH)는 세레프(Cerep)에서 개발한 소프트웨어(Hill 소프트웨어)로 수행한 Hill 방정식 곡선 피팅을 사용하여 평균 복제 값으로 생성된 경쟁 곡선의 비선형 회귀 분석에 의해 결정되었고, 상용 소프트웨어 SigmaPlot® 4.0에 의해 생성된 데이터와 비교하여 검증되었다.
[표 7]
효소 및 흡수 검정
개별 효소 및 흡수 검정에 대한 실험 조건은 하기 표에 제시되어 있다. 화합물 103은 3μM에서 시험되었다. 결과는 대조군 특이적 활성의 백분율 억제[100-(측정된 특이적 활성/대조군 특이적 활성*100)]로 표시된다. IC50 값, EC50 값 및 Hill 계수(nH)는 세레프(Cerep)에서 개발한 소프트웨어(Hill 소프트웨어)로 수행된 힐 방정식 곡선 피팅을 사용하여 평균 복제 값으로 생성된 억제/농도-반응 곡선의 비선형 회귀 분석에 의해 결정되었고, 상용 소프트웨어 SigmaPlot® 4.0으로 생성된 데이터와 비교하여 검증했다.
[표 8]
개별 효소 및 흡수 검정을 위한 실험 조건
결과 및 토론
결과는 도 5에 제시되어 있다.
실시예 7
화합물 103에 대한 용해도 및 약물동태를 평가했다.
용해도 시험
20mM 스톡으로부터 1, 5, 10, 50, 100, 200 및 300μM의 보정 표준을 DMSO에서 제조했다. 0.01M PBS(pH = 7.4) 198μL를 다중-스크린 용해도 필터 플레이트의 이중 웰에 분배하고, 이어서 시험 화합물 용액(20mM) 2μL를 분배했다. 플레이트를 덮고, 분당 150회 회전으로 90분 동안 진탕시켰다. 90분 후, 멀티스크린 HTS 진공 매니폴드 어셈블리를 사용하여 샘플을 여과하고, 여액을 수용체 플레이트에 수집했다. 상기 96-웰 수용체 플레이트로부터의 여액의 분취량(150μL)을 HPLC 바이알로 옮기고, HPLC-UV에 의해 분석했다. 베라파밀, 케토코나졸 및 레세르핀을 각각 고용성, 중용성 및 저용성 참조 표준으로 사용했다.
약물동태 분석
6 내지 8주령의 수컷 스프라그 다울리(SD) 랫트(200 내지 240g)를 사용했다(n = 3, 연속 샘플링). 화합물 103을 정맥 투여(IV)용으로 5mg/kg으로 DMSO:솔루톨-에탄올:생리식염수(10:10:80; v/v)에서 제형화하고, 경구 투여(PO)용으로 50 mg/kg으로 5% v/v NMP, 7.5% v/v 솔루톨 HS-15, 50% v/v PEG-400 및 37.5% v/v TPGS(수중 10% w/v)에서 제형화했다. 혈장 수집 시점은 IV 및 PO 투여가 각각 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24시간 및 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 10, 24시간이었다. 혈장 샘플은 LC-MS/MS로 분석하고, PK 파라미터는 푀닉스(Phoenix) 소프트웨어 버전 8.1로 계산했다.
결과 및 토론
화합물 103은 pH 7.4의 PBS에서 최대 87.4μM까지 용해되는 것으로 확인되었다(표 9).
[표 9]
화합물 103의 혈장 말단 반감기(t1/2)는 마우스에서 5mg/kg으로 단일 정맥내 주사한 후에 1.15시간, 및 50mg/kg으로 단일 경구 투여한 후에 4시간이었다. 생체 이용률은 랫트에서 44.1%로 추정되었다(도 6).
실시예 8
마우스에서 화합물 103의 뇌 침투 능력을 평가했다.
혈장 및 뇌 분포 연구
체중 20 내지 35g의 수컷 C57BL/6 마우스(8 내지 12주령)에 25mg/kg 및 50mg/kg으로 단일 복강내 투여한 후에 화합물 103의 혈장 및 뇌 분포를 측정했다. 사용된 제형 비히클은 5% v/v NMP, 7.5% v/v 솔루톨 HS-15, 50% v/v PEG-400 및 37.5% v/v TPGS(10% w/v)였다. 복강내 투여를 위한 투여량은 5mL/kg이었다. 혈액을 수집한 후, 동물을 희생시키고, 이들의 복부 대정맥을 절개하고, 10mL 생리식염수를 사용하여 심장으로부터 전신을 관류시켰다. 뇌 샘플은 3마리 마우스 세트로부터 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 10시간에서 수집했다. 단리 후, 뇌 샘플을 빙냉 생리식염수로 3회 세정하고(각 세정을 위해 휴대용 페트리 접시에서 10 내지 20mL의 생리식염수를 사용하여 세정당 5 내지 10초간), 블로팅 페이퍼에서 건조시켰다. 뇌 샘플은 빙냉 인산염 완충 생리식염수(pH = 7.4)를 사용하여 균질화했다. 총 균질액 용적은 조직 중량의 3배였다. 모든 균질물은 생물학적 분석이 이루어질 때까지 -70℃ 이하에서 보관했다. 마우스 혈장 및 뇌 샘플 중의 화합물 103의 농도는 목적에 적합한 LC-MS/MS 방법에 의해 측정했다. 약물동태 파라미터를 평가하기 위해 푀닉스 윈논린(Phoenix WinNonlin®)(버전 8.0)의 비구획 분석 툴을 사용했다.
결과 및 토론
화합물 103을 25mg/kg 및 50mg/kg으로 단일 복강내 투여한 후, 혈장 및 뇌 농도의 피크는 각각 0.5시간 및 0.25시간에 관찰되어 신속한 뇌 침투를 시사한다. 말기 소실 반감기는 2.24시간과 1.63시간에서 관찰되었다. 전반적으로, 뇌 농도는 혈장 농도보다 높고, 뇌-Kp는 1.97 및 4.4였다(표 10).
[표 10]
화합물 103(그룹 4c)의 혈장 및 뇌 분포.
# 뇌 Cmax 및 AUC는 각각 ng/g 및 h*ng/g으로 표시된다.
실시예 9
마우스에서 화합물 103의 혈장 및 간 농도를 평가했다.
혈장 및 간 연구
5% v/v NMP, 7.5% v/v 솔루톨 HS-15, 50% v/v PEG-400, 37.5% v/v TPGS(10% w/v)로 제조한 화합물 103를 수컷(18.7 내지 20.8g) 및 암컷(17.7 내지 18.9g) C57/BL6 마우스에게 25 및 50mg/kg/BID로 14일간 반복 경구 투여한 후, 혈장 및 간 시험 항목 농도는 워터(Waters) UPLC 시스템과 결합된 AB SCIEX LC-MS/MS 트리플 쿼드라폴(Quadrapole) 장치를 사용하여 정량화했다.
결과 및 토론
수컷 및 암컷의 간 대 혈장 농도 비율은 25mg/kg/BID에서 36.03 및 85.59, 및 50mg/kg/BID에서 19.57 및 31.90이었다(표 11).
[표 11]
혈장 및 간 농도 화합물 103 (그룹 4c).
실시예 10
화합물 103의 안전성 프로파일은 경구 투여에 의해 평가했다.
마우스에서 2주간 비-GLP 독성학
화합물 103의 안전성 프로파일은 마우스에서 1일 2회 25mg/kg 및 50mg/kg을 2주간 경구 투여하여 평가했다. 사용된 제형은 5% v/v NMP, 7.5% v/v 솔루톨 HS-15, 50% v/v PEG-400 및 37.5% v/v TPGS(10% w/v)였다. 총 6개의 동물 그룹을 사용하고, 이 중 3개 그룹은 수컷 마우스(18.7 내지 20.8g)이고, 3개 그룹은 암컷 마우스(17.6~18.9g)이며, 마우스의 연령은 5 내지 8주령이었다. 각 그룹에는 6마리의 마우스가 포함되었다. 동물은 연구 기간 중에 분석되었고, 연구의 종료시에 혈액과 조직을 분석했다.
결과 및 토론
비정상적 임상 징후는 발견되지 않았고, 모든 동물이 연구 종료까지 생존했다. 마우스의 체중과 체중 증가는 변화하지 않았고(표 12-13), 음식 섭취량도 변화하지 않았다(표 14).
[표 12a]
수컷 마우스의 체중
키: N = 동물의 수
[표 12b]
암컷 마우스의 체중
키: N = 동물의 수
[표 13a]
수컷 마우스의 체중 증가율(%)
키: N = 동물의 수, *↓ = p<0.05에서 대조군 그룹으로부터 유의적으로 감소된 그룹의 평균 값.
[표 13b]
암컷 마우스의 체중 증가율(%)
키: N = 동물의 수
[표 14a]
수컷 마우스에 의한 음식 소비(g/동물)
키: N = 케이지의 수
[표 14b]
암컷 마우스에 의한 음식 소비(g/동물)
키: N = 케이지의 수
혈액학적 평가는, 25mg/kg 및 50mg/kg 치료한 수컷 및 암컷 마우스에서 백혈구(WBC)가 통계적으로 유의하게 감소(최대 3.4배)한 것으로 나타났다. 기타 독성학적으로 유의한 변화는 검출되지 않았다(표 15). 추가로, 임상 화학 평가는 수컷 및 암컷 마우스에서 어떤 파라미터에서도 유의한 독성학적 변화를 나타내지 않았다(표 16). 기관 중량은 화합물 103에 의해 변화되지 않았고(표 17), 명백한 총 병리도 관찰되지 않았다. 조직병리학 분석은 대조군과의 차이가 검출되지 않았다(도 7).
[표 15a]
수컷 마우스의 혈액학적 파라미터
키: N = 동물의 수, *↓ = p<0.05에서 대조군 그룹으로부터 유의적으로 감소된 그룹의 평균 값. *↑ = p<0.05에서 대조군 그룹으로부터 유의적으로 증가된 그룹의 평균 값.
키: N = 동물의 수
키: N = 동물의 수
[표 15b]
암컷 마우스의 혈액학적 파라미터
키: N = 동물의 수, *↓ = p<0.05에서 대조군 그룹으로부터 유의적으로 감소된 그룹의 평균 값. *↑ = p<0.05에서 대조군 그룹으로부터 유의적으로 증가된 그룹의 평균 값.
키: N = 동물의 수
키: N = 동물의 수
[표 16a]
수컷 마우스의 임상 화학 평가
키: N = 동물의 수, *↓ = p<0.05에서 대조군 그룹으로부터 유의적으로 감소된 그룹의 평균 값.
키: N = 동물의 수, *↓ = p<0.05에서 대조군 그룹으로부터 유의적으로 감소된 그룹의 평균 값. *↑ = p<0.05에서 대조군 그룹으로부터 유의적으로 증가된 그룹의 평균 값.
[표 16b]
암컷 마우스의 임상 화학 평가
키: N = 동물의 수, *↓ = p<0.05에서 대조군 그룹으로부터 유의적으로 감소된 그룹의 평균 값.
키: N = 동물의 수
[표 17a]
수컷 마우스의 체중에 대한 기관 중량(%)
키: N = 동물의 수,
[표 17b]
수컷 마우스의 체중에 대한 기관 중량(%)
키: N = 동물의 수, *↑ = p<0.05에서 대조군 그룹으로부터 유의적으로 증가된 그룹의 평균 값.
따라서, C57BL/6 마우스에 대한 경구 경로에 의해 화합물 103을 14일간 연속하여 1일 2회 투여한 경우, 허용 용량은 ≥0mg/kg/BID였다고 결론지을 수 있다.
실시예 11
KCa3.1 유전자 녹아웃 또는 선택적 KCa3.1 차단을 기반으로 실험적으로 검증된 다수의 잠재적 임상 적응증 중에서, 개념 증명 연구로서, 1개의 임상 적응증, 즉 뇌졸중에 대한 동물 모델에서 화합물 103을 평가했다. 허혈/재관류 뇌졸중의 마우스 및 랫트 모델에서 KCa3.1의 유전자 녹아웃 또는 약리학적 차단은 경색 크기, 미세아교세포-매개 신경염증 및 성상교세포증을 감소시키고, 신경학적 스코어를 개선시켰다[참조: Y. J. Chen et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 2011, 31, 2363-2374; M. Yi et al., J. Neuroinflammation 2017, 14, 203; M. S. V. Elkind et al., Neurology 2020, 95, e1091-e1104; and Z. Yu et al., Front. Cell. Neurosci. 2017, 11, 319]. 화합물 103은 우수한 뇌 투과성을 갖기 때문에, 허혈성 뇌졸중의 설치류 모델에서 화합물 103의 개념-증명 연구를 수행하여, 화합물 103이 급성 허혈-재관류 뇌졸중 후의 신경-염증-매개 이차 뇌 손상을 억제함으로써 뇌졸중의 치료에 효과적인지를 판단했다.
MCAO 허혈-재관류 모델
양성 대조군으로, 뇌졸중 후의 환자의 회복을 돕기 위해 사용되는, 임상적으로 승인된 동급 최초의 약물인 에다라본이 사용되었다.　　
간단히 말해서, 체중 240 내지 270g의 SD 수컷 랫트를 7일간 재관류로 MCAO 연구에 사용했다. 국소 대뇌 허혈은 우측 중대뇌동맥(MCA)의 폐색에 의해 유도되었다. 목의 중앙 절개를 수행하여, 우측 총경동맥, 내경동맥 및 외경동맥을 노출시켰다. 총경동맥의 슬립결절, 외경동맥 근위부의 사멸 결절, 총경동맥 분기점 근처의 외경동맥의 슬립결절은 실크 트레드로 묶었다. 외경동맥의 2개 결절 사이의 작은 개구부를 절단하여 경동맥에 트레드 플러그를 삽입하고, 내측으로 중대뇌동맥에 전진시켰다. 플러그를 60분 동안 정 위치에 유지하고, 이어서 혈관으로부터 회수하고 제거하여 혈액 공급을 회복했다. 12시간 재관류 후, 마우스는 12시간마다 7일간 화합물 103을 2, 5, 10mg/kg 또는 비히클을 복강내 주사를 통해 투여했다. 에다라본 5mg/kg은 참조 대조군으로서 7일간 매일 복강내 투여했다. 경색 영역의 평가는 전두엽부터 개시하는 전체 뇌 절편(2mm 두께)의 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색에 의해 수행되었고, 스캔된 이미지는 ImageJ로 분석했다.
신경학적 행동 평가
표 18에 기재된 스코어링 방법에 따라 동물들을 개별적으로 평가했다.
[표 18]
신경학적 행동 스코어링 방법
결과 및 토론
복강내 주사에 의해 1일 2회 투여한 화합물 103은 경색 용적을 10mg/kg에서 거의 50%까지 효과적으로 감소시키며, 양성 대조군인 에다라본(5mg/kg)보다 더 효과적이었다(도 8A). 18점 시스템을 사용한 신경 행동 평가는 화합물 103이 에다라본보다 효과적으로 신경 행동 스코어를 개선하는 것으로 시사했다(도 8B).
실시예 12
미세아교세포 및 백혈구 마커에 대한 면역조직화학 분석
동물을 이소플루란(RWD Life Science)으로 마취하고, 관류하고, 4% PFA(Sinopharm Chemical Reagent)로 고정했다. 뇌 조직을 추가로 4% PFA에 4℃에서 4시간 동안 밤새 침지하고, 이어서 수크로즈 용액의 구배(20 내지 30%, Sinopharm Chemical Reagent)로 처리하고, 이어서 OCT(라이카)를 매립하고 -80℃에서 동결했다. 면역형광 염색을 위해, 뇌는 일차 체감각 피질(S1), 일차 운동 피질(M1), 해마(CA1)의 필드 CA1 및 미상핵(선조체, CPu)로부터 30분 동안 가열하고, 이어서 0.01M PBS(pH = 7.2-7.4, 5분 × 3)로 세척했다. 세척 후, 절편을 실온에서 10% 양 혈청(Solarbio)에서 0.3% 트리톤X-100(Solarbio)로 1시간 동안 차단했다. 차단 용액의 제거 후, 뇌 절편을 1차 항체 Iba1(Proteintech, Cat.10904-1-AP) 및 CD11b(Thermo Fisher, Cat. MA5-17857)로 4℃에서 밤새 인큐베이팅했다. 0.01M PBS로 3회 세척한 후(각 5분), 절편을 백라이트와 이차 항체(Abcam, Cat. ab150113; Cat.ab150080)로 RT에서 2시간 동안 인큐베이팅했다. 3회 세척한 후, 핵을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Beyotime Biotech, Cat. C1006)로 염색했다. 전체 뇌 절편의 이미지는 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM, Leica STELLARIS 5, Germany)으로 취득했다. 미세아교세포를 가시화하는 2개의 마커, 즉 Iba1(미세아교세포에서 발현되고, 미세아교세포 활성화 동안 상향-조절되는 17-kDa EF 핸드 단백질)과 CD11b(인테그린 수용체 CD11b/CD18의 α-쇄(αMβ2, Mac-1 및 CR3로도 공지되어 있음)는 미세아교세포를 포함한 선천성 면역 세포의 표면에 고도로 발현된다)를 사용했다. Iba1+CD11b+ 이중 양성 미세아교세포의 수는 Image J V1.8.0에 의해 분석했다. 미세아교세포/대식세포 활성화는 절편당 Iba1 및 CD11b 공국재화 세포의 수로 표시된다.
결과 및 토론
화합물 103에 의한 치료는, MCAO 또는 비히클 그룹과 비교하여, CA1, CPu, M1 및 S1의 뇌 영역에서 7일차에 Iba1+CD11b+ 이중 양성 미세아교세포의 수를 유의적으로 감소시켰다(도 9). 화합물 103은, 랫트에서 재관류 후 12시간부터 투여한 경우, CD11b 미세아교세포에서 미세아교세포 활성화를 감소시켰다.
요약하면, 본 시리즈의 기타 유사체와 비교하여, 화합물 103은 혈장 단백질 결합이 적고, cLogP 값이 낮으며, 더 가용성이고, 단일 용량 투여 후에 혈장보다 뇌에 더 고농도로 축적하고, 25 및 50mg/kg/BID로 14일간 매일 반복 투여 후에 비정상적 임상 징후 및 사망률을 초래하지 않는다. 추가로, 탐색적 개념-증명 연구에서, 화합물 103은 허혈/재관류 뇌졸중의 랫트 모델에서 경색 용적의 감소, 미세아교세포 활성화, 신경 및 행동 스코어의 개선에 효과적이었다.

Claims (27)

  1. 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및/또는 용매화물:
    [화학식 I]

    상기 화학식 I에서,
    R1은 H, 할로, CF3, CN 또는 NO2로부터 선택되고;
    R2 및 R3은 H, 할로, CH3, CF3, CN 또는 NO2로부터 독립적으로 선택되고;
    R4는 H, 할로, CN 또는 CF3로부터 선택되고;
    R5 및 R6은 R9aC(O)O-, R9bOC(O)-, R9cC(O)NRd-, R9eR9fNC(O)-, 또는 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알킬 케톤으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 탄소원자는 분지(branched) 또는 비분지(unbranched)이고, 비치환되거나 할로 및 NO2로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되고;　
    R7 및 R8은 H, NR10aR10b, OR10c, 또는 비치환되거나 할로로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 C1 내지 C3 알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는
    R5와 R7 또는 R6과 R8 쌍 중 하나는, 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께, 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭이고, 비치환되거나 할로, =O, -OC(O)R10d, -(O)COR10e 및 C1 내지 C6 알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 4 내지 14원의 환 시스템을 형성하고;
    R9a 내지 R9f 및 R10a 내지 R10e는 H, 및 비치환되거나 할로로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환된 C1 내지 C6 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R1이 H, F, Cl, Br, CF3 또는 NO2로부터 선택되는, 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 R2 및 R3이 H, F, Cl, Br, CH3, CF3 또는 NO2로부터 독립적으로 선택되는, 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R4가 H, F, Cl, Br 또는 CF3으로부터 선택되는, 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R5 및 R6이 R9aC(O)O-, R9bOC(O)-, 또는 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알킬 케톤으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 탄소원자는 분지 또는 비분지이고, 비치환되거나 Cl, F 및 NO2로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는, 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R7 및 R8이 H, 또는 비치환되거나 F 및 Cl로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 C1 내지 C3 알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는
    R5와 R7 또는 R6과 R8 쌍 중의 하나가, 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께, 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭이고, 비치환되거나 F, Cl, =O 및 C1 내지 C6 알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 4 내지 10원의 환 시스템을 형성하는, 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R9a 내지 R9f 및 R10a 내지 R10e가 H, 및 비치환되거나 F 및 Cl로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 C1 내지 C3 알킬로부터 독립적으로 선택되는, 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    R1이 H, F, Cl 또는 CF3으로부터 선택되고;
    R2 및 R3이 H, F, Cl 또는 CF3으로부터 독립적으로 선택되고;
    R4가 H, F, Cl 또는 CF3으로부터 선택되고;
    R5 및 R6이 R9bOC(O)-, 및 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 알킬 케톤으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 탄소원자는 비치환되거나 Cl 및 F로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되고;
    R7 및 R8이 H, 또는 비치환되거나 F 및 Cl로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 메틸로부터 독립적으로 선택되는, 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    R1이 H, F 또는 Cl로부터 선택되고/되거나;
    R2가 CF3, 또는 보다 특히 H 또는 F로부터 선택되고/되거나;
    R3이 H 또는 CF3으로부터 선택되고/되거나;
    R4가 H이고/이거나;
    R5 및 R6이 CH3OC(O)- 또는 프로판-2-오닐(예: R5 및 R6은 모두 CH3OC(O)-임)로부터 독립적으로 선택되고/되거나;
    R7 및 R8이 H 및 CH3으로부터 독립적으로 선택되는, 화합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, R7 및 R8 중 적어도 하나가 H인, 화합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R7 및 R8이 모두 H인, 화합물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R7이 H이고, R8이 CH3인, 화합물.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R7 및 R8이 모두 CH3인, 화합물.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R7이 CH3이고, R8이 H인, 화합물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 목록으로부터 선택된 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물:


    .
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 목록으로부터 선택된 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물:

    .
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 목록으로부터 선택된 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물:
    .
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 목록으로부터 선택된 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물:
    .
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이
    또는 이의 염 및 용매화물인, 화합물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제(adjuvant) 또는 비히클(vehicle) 중 하나 이상과 조합하여 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 의약(medicine)에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물.
  22. KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화(altered activity)와 관련된 질환 상태(disease condition)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물.
  23. KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화와 관련된 질환 상태의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물의 용도.
  24. KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화와 관련된 질환 상태의 치료 또는 예방 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 및 용매화물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제19항, 제20항 또는 제21항에 있어서, KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화와 관련된 질환 상태가 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases; IBD), 섬유성 질환(fibrotic diseases)(폐, 간, 신장, 심장, 결막, 각막), 비-알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD), 비-알코올성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis; NASH), 신경교종(gliomas)(교모세포종(glioblastoma)), 폐암(lung cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 난소암(ovarian cancer), 대장암(colorectal cancer), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 당뇨병성 신장 질환(diabetic renal disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 골 흡수(bone resorption), 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 죽상 동맥경화증(atherosclerosis), 혈관성형술후 재협착(restenosis following angioplasty), 스텐트내 신생동맥경화증(in-stent neo-atherosclerosis), 뇌졸중(stroke), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 유전성 적혈구증(hereditary xerocytosis), 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia), 백혈병(leukaemia), 천식(asthma), 알레르기 비염(allergic rhinitis), 미세아교세포 활성화(microglial activation), 산화질소-의존성 신경퇴화(nitric oxide-dependent neurodegeneration), 신경-종양 질환(neuro-oncological diseases) 및 희귀 적혈구 장애(orphan red blood cell disorders) 중 하나 이상으로부터 선택되는, 사용하기 위한 화합물, 용도 또는 방법.
  26. 제25항에 있어서, KCa3.1의 증가 또는 활성의 변화와 관련된 질환 상태가 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases; IBD), 섬유성 질환(fibrotic diseases)(폐, 간, 신장, 심장, 결막, 각막), 비-알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD), 비-알코올성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis; NASH), 신경교종(gliomas)(교모세포종(glioblastoma)), 폐암(lung cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 난소암(ovarian cancer), 대장암(colorectal cancer), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 당뇨병성 신장 질환(diabetic renal disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 골 흡수(bone resorption), 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 혈관성형술후 재협착(restenosis following angioplasty), 스텐트내 신생-동맥경화증(in-stent neo-atherosclerosis), 뇌졸중(stroke), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 유전성 적혈구증(hereditary xerocytosis), 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia), 백혈병(leukaemia), 천식(asthma), 알레르기 비염(allergic rhinitis), 미세아교세포 활성화(microglial activation) 및 산화질소-의존성 신경퇴화(nitric oxide-dependent neurodegeneration) 중 하나 이상으로부터 선택되는, 사용하기 위한 화합물, 용도 또는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 질환 상태가 뇌졸중(stroke)인, 사용하기 위한 화합물, 용도 또는 방법.
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