JP2024503571A - プラットフォーム治療薬として使用するための、カルシウム活性化カリウムチャネルＫＣａ３．１の強力かつ選択的阻害剤 - Google Patents

Abstract

脳卒中などの、KCa3.1の増加または変化した活性に関連する病状を治療または予防するための薬剤の調製における、式(I)で示される化合物、ならびに特定の特定の具体的な化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは誘導体の使用が提供される。【選択図】図４

Description

本発明は、脳卒中などの、K_Ca3.1の増加または変化した活性に関連する病状を治療または予防するための薬剤の調製における、式(I)で示される化合物、ならびに特定の具体的な化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは誘導体の使用に関する。

本明細書における以前に公開された文書のリストまたは議論は、必ずしもその文書が最先端技術の一部であるか、または共通の一般知識であることを認めるものとして解釈されるべきではない。

ヒトゲノムにある78個のカリウムチャネル遺伝子のうちの1つであるK_Ca3.1(KCNN4)は、中間コンダクタンスのカルシウム活性化カリウムチャネルをコードする(S. P. Alexander et al.、Br. J. Pharmacol. 2017、174 Suppl 1、S1-S16；G. A. Gutman et al.、Pharmacol. Rev. 2005、57、473-508；L. K. Kaczmarek et al.、Pharmacol. Rev. 2017、69、1-11；and A. D. Wei et al.、Pharmacol. Rev. 2005、57、463-472)。このチャネルは、4つのK_Ca3.1サブユニットの複合体であり、それぞれがカルシウムセンサーとして機能するカルモジュリン(CaM)に結合している(図1A)。複合体のクライオEM構造は決定されており、阻害剤および活性化剤の結合部位は、突然変異誘発によって決定されている(図1B)。Ca²⁺活性化K⁺チャネルK_Ca3.1は、免疫細胞(リンパ球、ミクログリア、マクロファージ、肥満細胞)、赤血球、血小板、肺および胃腸管の上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、および一部の癌に含おいて、カルシウムの流入とカルシウムシグナル伝達を維持するカチオンカウンターバランサーとして機能する。これらの細胞では、外部シグナルが、関連する細胞表面受容体を活性化し、細胞内Ca²⁺の増加を引き起こし、K_Ca3.1チャネルを開く(図2)。

薬理学的および遺伝的研究により、K_Ca3.1が治療標的であることが検証された。K_Ca3.1阻害剤は、げっ歯類およびブタのモデルにおける血管狭窄とアテローム性動脈硬化を軽減する(D. Tharp et al.、Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 2008、28、1084-1089；K. Toyama et al.、J. Clin. Invest. 2008、118、3025-3037；R. Kohler et al.、Circulation 2003、108、1119-1125)。K_Ca3.1の遮断またはKCa3.1の遺伝子ノックアウトは、炎症性腸疾患(L. Di et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2010、107、1541-1546；D. Strobaek et al.、Br. J. Pharmacol. 2013、168、432-444；S. Ohya et al.、Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2014、306、G873-885)、多発性硬化症(E. Reich et al.、Eur. J. Immunol. 2005、35、1027-1036)、糸球体腎炎(H. Kang et al.、Cell Rep. 2014、8、1210-1224)、炎症性関節炎(H. Kang et al.、Cell Rep. 2014、8、1210-1224)、骨吸収(H. Kang et al.、Cell Rep. 2014、8、1210-1224)、アレルギー性鼻炎(H. Lin et al.、Sci. Rep. 2015、5、13127；H. Lin et al.、Int. Immunopharmacol. 2014、23、642-648)、結膜および角膜線維症(H. Yang et al.、Exp Eye Res 2013、110、76-87；G. Anumanthan et al.、PLoS One 2018、13)、心筋線維症(L. Zhao et al.、Pflugers Arch. 2015、467、2275-2285；L. Wang et al.、Pflugers Arch. 2016、468、2041-2051)、肺線維症(D. Amrutkar Experimental Biology Meeting 2021；L. Organ et al.、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2017、56、539-550；L. Organ et al.、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2017、56、539-550；U. Perera et al.、Can. Respir. J. 2021、6683、1955)、糖尿病性腎疾患(C. Huang et al.、Diabetes 2013、62、2923-2934；C. Huang et al.、PLoS One 2018、13、e0192800；I. Grgic et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009、106、14518-14523；C. Huang et al.、Nephrology Dialysis Transplantation 2014、29(2)、313-324；C. Huang et al.、Sci. Rep. 2016、6、23884)、食事誘発性肝脂肪症、非アルコール性脂肪症、肝線維症(L. Paka et al.、World J. Gastroenterol. 2017、23、4181-4190；C. Freise and U. Querfeld. Pharmacol. Res. 2014、85、6-14)、および鎌状赤血球病(L. De Franceschi et al.、J. Clin. Invest. 1994、93、1670-1676；J. Stocker et al.、Blood 2003、101(6)、2412-8；K. Ataga et al.、Pharmacotherapy 2006、26、1557-1564；K. Ataga et al.、Blood 2008、111(8)、3991-7；K. Ataga et al.、Expert. Opin. Investig. Drugs 2009、8(2),231-9；K. Ataga et al.、Br J Haematol. 2011、153(1)、92-104；K. Ataga et al.、Br J Haematol. 2021、192(5)、e129-e132)のげっ歯類モデルにおける疾患を改善する。神経系では、K_Ca3.1は、ミクログリアの活性化を調節し、チャネル阻害剤は、脳卒中(Y. Chen et al.、J. Cereb. Blood Flow Metab. 2011、31、2363-2374；Y. Chen et al.、J. Cereb. Blood Flow Metab. 2016、36、2146-2161；M. Yi et al.、J. Neuroinflammation 2017、14、203)、アルツハイマー病(M. Yi et al.、Mol. Cell Neurosci. 2016、76、21-32；T. Wei et al.、Front. Pharmacol. 2016、7、528；L. Jin et al.、Ann. Clin. Transl. Neurol. 2019、6、723-738)、パーキンソン病(J. Lu et al.、J. Neuroinflammation 2019、16、273) and traumatic brain injury(F. Mauler et al.、Eur. J. Neurosci. 2004、20、1761-1768；K. Urbahns et al.、Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005、15、401-404；K. Urbahns et al.、Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003、13、2637-2639)の動物モデルにおけるミクログリア媒介の神経損傷を抑制する。K_Ca3.1遮断剤は、筋線維芽細胞の阻害を介して、げっ歯類動物およびヒツジモデルの肺線維症、齧歯動物モデルの心筋線維症および腎線維症を治療する(L. Organ et al.、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2017、56、539-550；L. Organ et al.、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2017、56、539-550；U. Perera et al._Can. Respir. J. 2021、6683、1955；L. Zhao et al.、Pflugers Arch. 2015、467、2275-2285；L. Wang et al.、Pflugers Arch. 2016、468、2041-2051；C. Huang et al.、Diabetes 2013、62、2923-2934；C. Huang et al.、PLoS One 2018、13、e0192800；I. Grgic et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009、106、14518-14523；C. Huang et al.、Nephrology Dialysis Transplantation 2014、29(2)、313-324；C. Huang et al.、Sci. Rep. 2016、6、23884)。悪性神経膠腫患者の生存期間の短縮は、腫瘍内のK_Ca3.1発現の増加と関連しており、K_Ca3.1阻害剤は、げっ歯類動物異種移植モデルにおける腫瘍浸潤性を低下させる(G. D'Alessandro et al.、Cell Death Dis. 2013、4、e773；A. Grimaldi et al.、Cell Death Dis. 2016、7、e2174；K. Turner et al.、Glia 2014、62、971-981；G. D'Alessandro et al.、Oncotarget 2016、7、30781-30796)。遺伝子研究および薬理学的研究でも、K_Ca3.1は、肝臓(P. Song et al.、J. Cancer 2017、8、1568-1578)、卵巣(Z. Wang et al.、Oncogene 2007、26、5107-5114)、結腸(N. Sassi et al.、Biochim. Biophys. Acta. 2010、1797(6-7)、1260-7；U. De Marchi et al.、Cell Calcium 2009、45(5)、509-16)、直腸(H. Xu et al.、BMC Cancer 2014、10(14)、330；W. Lai et al.、Med. Oncol. 2013、30(2),566；W. Lai et al.、Oncol. Rep. 2011、26(4)、909-17)、膵臓(H. Jaeger et al.、Mol. Pharmacol. 2004、65(3)、630-638) and leukaemia(E. Groessinger et al.、Leukemia 2014、28、954-958).のがんの治療標的であることが証明されている。もう1つの可能性のある適応症は、影響を受けた赤血球(RBC)は、水分喪失、カリウム含有量の減少、および血液学的パラメータの変化を伴う赤血球膜の陽イオン漏出を特徴とする常染色体優性の先天性溶血性貧血である、遺伝性乾燥赤血球症である(I. Andolfo et al.、Am. J. Hematol. 2015、90、921-926；E. Fermo et al.、Sci. Rep. 2017、7、1744；R. Rapetti-Mauss et al.、Haematologica 2017、102、e415-e418；R. Rapetti-Mauss et al.、Haematologica 2016、101、e431-e435；and A. Rivera et al.、Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2019、317、C287-C302). In a subset of these patients、gain-of-function mutations of K_Ca3.1 cause a loss of KCl and water、leading to red blood cell shrinkage and anemia(E. Fermo et al.、Sci. Rep. 2017、7、1744；A. Rivera et al.、Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2019、317、C287-C302)。したがって、K_Ca3.1遮断剤は、これらの変化を逆転させ、血液学的パラメータを改善すると予測される(R. Rapetti-Mauss et al.、Haematologica 2016、101、e431-e435)。K_Ca3.1の薬理学的遮断は、KClと水分の損失を防ぎ、赤血球の収縮を減少させることにより、鎌状赤血球貧血の動物モデルとヒトの血液学的パラメーターを改善することがすでに示されている(J. Stocker et al.、Blood 2003、101(6)、2412-8；K. Ataga et al.、Blood 2008、111(8)、3991-7；K. Ataga et al.、Expert. Opin. Investig. Drugs 2009、8(2),231-9；K. Ataga et al.、Br J Haematol. 2011、153(1)、92-104；K. Ataga et al.、Br J Haematol. 2021、192(5)、e129-e132；C. Brugnara et al.、J. Clin. Invest. 1993、92(1)、520-6；S. Alper et al.、Blood Cells Mol. Dis. 2009、41(1)、22-34)。K_Ca3.1阻害剤のその他の潜在的な適応症は、動物モデルでの実験研究に基づいて、喘息(Z. Yu et al.、Front. Pharmacol. 2017、8、559；L. Chachi et al.、J Immunol 2013、191、2624-2636；J. Der Velden et al.、PLoS One 2013、8、e66886；ZH. Yu et al.、Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2013、48(6)、685-93；D. Hynes et al.、Steroids 2019、19、151、108459；P. Girodet et al.、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2013、48(2)、212-9；https：//ichgcp.net/clinical-trials-registry/NCT00861185)、アレルギー性鼻炎(H. Lin et al.、Sci. Rep. 2015、5、13127)、分泌性下痢(P. Rufo et al.、J. Clin. Invest. 1997、100、3111-3120)および嚢胞性線維症(A. Philp et al.、Sci. Rep. 2018、8、9320)である。

しかしながら、TRAM-34、NS6180、4-フェニル-4-ピラン、シクロヘキサジエンなどのK_Ca3.1の分子阻害剤は、経口での生物学的利用能と薬物動態特性が劣るため、臨床試験まで進んでいない。一方、Senicapoc(ICA-17043)は臨床試験まで進み安全であったが、特許が満了している。

したがって、良好な薬物動態特性を備え、経口で生物学的に利用可能で強力かつ選択的なK_Ca3.1阻害剤を発見する必要がある。

発明の概略
驚くべきことに、一連のフェニルジヒドロピリジンが望ましい特性を示すことが見出された。本発明の態様および実施形態について、以下の番号付き条項を参照して説明する。

1．式(I)：

[式中、
R₁は、H、ハロ、CF₃、CNまたはNO₂から選択される；
R₂およびR₃は独立して、H、ハロ、CH₃、CF₃、CNまたはNO₂から選択される；
R₄は、H、ハロ、CNまたはCF₃から選択される；
R₅およびR₆は独立して、R_9aC(O)O-、R_9bOC(O)-、R_9cC(O)NRd-、R_9eR_9fNC(O)-、または炭素原子が分枝状または非分枝状であり、非置換であるか、またはハロおよびNO₂から選択される1つまたは複数の置換基で置換される1～10個の炭素原子を有するアルキルケトンから選択される；
R₇およびR₈は独立して、H、NR_10aR_10b、OR_10c、または非置換であるか、またはハロから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるC₁～C₃アルキルから選択されるか、あるいは
R₅およびR₇またはR₆およびR₈のペアの1つは、それらが結合する炭素原子と一緒になって、炭素環式または複素環式であり、非置換であるか、またはハロ、=O、-OC(O)R_10d、-(O)COR_10e、およびC₁～C₆アルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換される4～14員の環系を形成する；
R_9a～R_9fおよびR_10a～R_10eは独立して、H、および非置換であるか、またはハロから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるC₁～C₆アルキルから選択される]
で示される化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。

2．R₁が、H、F、Cl、Br、CF₃またはNO₂から選択される、条項1に記載の化合物。

3．R₂およびR₃が独立して、H、F、Cl、Br、CH₃、CF₃またはNO₂から選択される、条項1または条項2に記載の化合物。

4．R₄が、H、F、Cl、Br、またはCF₃から選択される、前記条項のいずれか1つに記載の化合物。

5．R₅およびR₆が独立して、R_9aC(O)O-、R_9bOC(O)-、または炭素原子が分枝状または非分枝状であり、非置換であるか、またはCl、F、およびNO₂から選択される1つまたは複数の置換基で置換される1～10個の炭素原子を有するアルキルケトンから選択される、前記条項のいずれか1つに記載の化合物。

6．R₇およびR₈が独立して、H、または非置換であるか、またはFおよびClから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるC₁～C₃アルキルから選択されるか、あるいは
R₅およびR₇またはR₆およびR₈のペアの1つは、それらが結合する炭素原子と一緒になって、炭素環式または複素環式であり、非置換であるか、またはF、Cl、=O、およびC₁～C₆アルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換される4～10員の環系を形成する、前記条項のいずれか1つに記載の化合物。

7．R_9a～R_9fおよびR_10a～R_10eが独立して、H、および非置換であるか、またはFおよびClから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるC₁～C₃アルキルから選択される、前記条項のいずれか1つに記載の化合物。

8．R₁が、H、F、Cl、またはCF₃から選択される；
R₂およびR₃が独立して、H、F、Cl、またはCF₃から選択される；
R₄が、H、F、Cl、またはCF₃から選択される；
R₅およびR₆が独立して、R_9bOC(O)-、炭素原子が非置換であるか、またはClおよびFから選択される1つまたは複数の置換基で置換される1～3個の炭素原子を有するアルキルケトンから選択される；
R₇およびR₈が独立して、H、または非置換であるか、またはFおよびClから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるメチルから選択される、前記条項のいずれか1つに記載の化合物。

9．R₁が、H、F、またはClから選択される；および／または
R₂が、CF₃から選択されるか、または特にHまたはF選択される；および／または
R₃が、HまたはCF₃から選択される；および／または
R₄が、Hである；および／または
R₅およびR₆が独立して、CH₃OC(O)-またはプロパン-2-オニル(たとえば、R₅およびR₆が両方ともCH₃OC(O)-)である；および／または
R₇およびR₈が独立して、HおよびCH₃から選択される、前記条項のいずれか1つに記載の化合物。

10．R₇およびR₈ の少なくとも1つが、Hである、前記条項のいずれか1つに記載の化合物。

11．R₇およびR₈の両方が、Hである、前記条項のいずれか1つに記載の化合物。

12．R₇がHであり、R₈がCH₃である、条項1～10のいずれか1つに記載の化合物。

13．R₇およびR₈が両方ともCH₃である、条項1～10のいずれか1つに記載の化合物。

14．R₇がCH₃であり、R₈がHである、条項1～10のいずれか1つに記載の化合物。

15．以下のリスト：

から選択される、前記条項のいずれか1つに記載の化合物、またはその塩および溶媒和物。
16．以下のリスト：

から選択される、前記条項のいずれか1つに記載の化合物、またはその塩および溶媒和物。
17．以下のリスト：

から選択される、前記条項のいずれか1つに記載の化合物、またはその塩および溶媒和物。

18．以下のリスト：

から選択される、前記条項のいずれか1つに記載の化合物、またはその塩および溶媒和物。

19．化合物が、

である、前記条項のいずれか1つに記載の化合物、またはその塩および溶媒和物。

20．条項1～19のいずれか1つに記載の式(I)で示される化合物、またはその塩および溶媒和物を、薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルと組み合わせて含む医薬組成物。

21．薬剤における使用のための、条項1～19のいずれか1つに記載の式(I)で示される化合物、またはその塩および溶媒和物。

22．K_Ca3.1の増加または活性の変化に関連する病状の治療または予防における使用のための、条項1～19のいずれか1つに記載の式(I)で示される化合物、またはその塩および溶媒和物。

23．K_Ca3.1の増加または活性の変化に関連する病状の治療または予防のための薬剤の製造における使用のための、条項1～19のいずれか1つに記載の式(I)で示される化合物、またはその塩および溶媒和物。

24．K_Ca3.1の増加または活性の変化に関連する病状の治療または予防のための方法であって、それを必要とする患者に、条項1～19のいずれか1つに記載の式(I)で示される化合物、またはその塩および溶媒和物の有効量を投与することを含む、方法。

25．K_Ca3.1の増加または活性の変化に関連する病状が、白血病または、特に、炎症性腸疾患(IBD)、線維性疾患(肺、肝臓、腎臓、心臓、結膜、角膜)、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、神経膠腫(神経膠芽腫)、肺がん、膵臓がん、肝細胞がん、卵巣がん、結腸直腸がん、嚢胞性線維症、糖尿病性腎疾患、糸球体腎炎、骨吸収、炎症性関節炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、ステント内新生アテローム性動脈硬化症、脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、遺伝性乾赤球症、鎌状赤血球貧血、喘息、アレルギー性鼻炎、ミクログリア活性化、一酸化窒素依存性神経変性(nitric oxide-dependent neurodegeneration)、神経腫瘍疾患および希少赤血球障害(orphan red blood cell disorders)の1つまたは複数から選択される、条項19に記載の使用、条項20に記載の使用または条項21に記載の方法のための化合物。

26．K_Ca3.1の増加または活性の変化に関連する病状が、白血病または、特に、炎症性腸疾患(IBD)、線維性疾患(肺、肝臓、腎臓、心臓、結膜、角膜)、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、神経膠腫(神経膠芽腫)、肺がん、膵臓がん、肝細胞がん、卵巣がん、結腸直腸がん、嚢胞性線維症、糖尿病性腎疾患、糸球体腎炎、骨吸収、炎症性関節炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、ステント内新生アテローム性動脈硬化症、脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、遺伝性乾赤球症、鎌状赤血球貧血、喘息、アレルギー性鼻炎、ミクログリア活性化および一酸化窒素依存性神経変性(nitric oxide-dependent neurodegeneration)の1つまたは複数から選択される、条項25に記載の使用、使用または方法のための化合物。

27．病状が、脳卒中である、条項26に記載の使用、使用または方法のための化合物。

図1は、以下を示す。(A)各K_Ca3.1サブユニットは、6つの膜貫通セグメントを含み、セグメント5と6の間のループが細孔を形成する。細胞質のC末端は、構成的にCaMに結合する(C. M. Fanger et al.、J Biol Chem 1999、274、5746-5754)。4つのK_Ca3.1サブユニットと4つのCaMは、機能的チャネルを形成する。図は、H. Wulff & N. A. Castle、Expert Rev. Clin. Pharmacol. 2010、3、385-396から引用した；および(B)K_Ca3.1-CaM複合体のクライオEM構造。ブロッカーの結合部位が示される。ペプチド阻害剤は、チャネルの外側の口に結合する。小分子阻害剤は、内部細孔または内部細孔の窓領域に結合する。小分子活性化因子は、K_Ca3.1-CaM複合体の内面に結合する。図は、B. M. Brown et al.、Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2020、60、219-240から引用した。 図2は、K_Ca3.1の生理学的役割を示す。(A)は、K_Ca3.1が免疫細胞(ミクログリア、T細胞、B細胞、マスト細胞、単球、マクロファージ)、赤血球、血小板、肺および消化管の上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞および一部のがんにおいて生理学的に重要な役割を果たしていることを示す。これらの細胞では、外部シグナルが関連する細胞表面受容体を活性化し、細胞内Ca²⁺の増加を引き起こし、K_Ca3.1チャネルを開く。このチャネルは、カルシウムシグナル伝達を維持するためのカチオンカウンターバランサーとして機能する。図は、Wulff & N. A. Castle、Expert Rev. Clin. Pharmacol. 2010、3、385-396から引用した；(B)は、多くの細胞型が原筋線維芽細胞に分化できることを示す。トランスフォーミング成長因子ベータ(TGF-b)、血小板由来成長因子(PDGF)、上皮成長因子(EGF)、フィブロネクチン、機械的張力などによる刺激を受けると、原筋線維芽細胞は、多くの臓器の線維化において線維化促進効果に寄与する筋線維芽細胞に分化する。筋線維芽細胞は K_Ca3.1 の発現を上方制御し、その阻害により筋線維芽細胞の増殖と線維化促進効果が抑制される。図は、S. W. M. van der Borne et al.、Nat. Rev. Cardiol. 2010、7、30-37から引用した；および(C)K_Ca3.1は、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷などの神経炎症性疾患の一因となる炎症促進性ミクログリアにおいて重要な役割を果たす。K_Ca3.1は、ミクログリアがM1炎症誘発性細胞に分化するにつれて上方制御され、チャネルの遮断によりIL-1β、IL-6、TNF-αなどの神経炎症メディエーターの産生が抑制される。対照的に、ミクログリアがM2抗炎症細胞に分化すると、K_Ca3.1が下方制御される。したがって、K_Ca3.1阻害剤は、炎症促進性ミクログリアを優先的に標的とする。図は、S. R. Roig et al.、J. Neurol. Neuromed. 2018、3、18-23から引用した。 図3は、K_Ca3.1１電流に対するグループ2-4の例示的化合物の効果を示す。例示化合物の濃度応答曲線を示す。 図4は、K_Ca3.1の強力なブロックおよびCa_V1.2よりも>1000倍高い選択性に関するファーマコフォアを示す(グループ4c)。 図5は、他の分子標的のパネルに対する化合物103(3μMで試験)の選択性を示す(ユーロフィンズ薬理学的P9多様性パネル安全性スクリーニング)。 図6は、単回静脈内注射(5mg/kg)または経口投与(50mg/kg)後のラットにおける化合物103(グループ4c)の薬物動態評価を示す。 図7は、組織病理学的分析を示す。 図8は、(A)7日間の再灌流を伴う60分間のラット中大脳動脈閉塞(MCAO)を受けたラットにおいて、化合物103は、ビヒクルコントロールと比較して梗塞体積を効果的に減少させ(n=28)、陽性コントロールであるエダラボンよりも有効であったこと；および(B)48時間(n=8)および7日目(n=5)で測定された神経学的行動スコアは、エダラボンよりも効果的に改善されたこと；を示す。データは、平均±SEMを表し、統計的有意性は、一元配置分散分析(A)または二元配置分散分析(B)によって分析された；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。 図9は、化合物103(10mg/kg)が、MCAOまたはビヒクルグループと比較して、7日目にCA1、CPu、M1およびS1の脳領域においてIba1⁺CD11b⁺二重陽性活性化ミクログリアを効果的に減少させたことを示す。データは、平均±SEMを表し、統計的有意性は、一元配置分散分析によって分析された；*p<0.05、n=5。

説明
上述したように、驚くべきことに、一連のフェニルジヒドロピリジンが、これまでに特定された問題の1つまたは複数を克服する予想外に良好な特性を示すことが見出された。したがって、本発明の第1の態様は、式(I)：

[式中、
R₁は、H、ハロ、CF₃、CNまたはNO₂から選択される；
R₂およびR3は独立して、H、ハロ、CH₃、CF₃、CNまたはNO₂から選択される；
R₄は、H、ハロ、CNまたはCF₃から選択される；
R₅およびR₆は独立して、R_9aC(O)O-、R_9bOC(O)-、R_9cC(O)NRd-、R_9eR_9fNC(O)-、または炭素原子が分枝状または非分枝状であり、非置換であるか、またはハロおよびNO₂から選択される1つまたは複数の置換基で置換される1～10個の炭素原子を有するアルキルケトンから選択される；
R₇およびR₈は独立して、H、NR_10aR_10b、OR_10c、または非置換であるか、またはハロから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるC₁～C₃アルキルから選択されるか、あるいは
R₅およびR₇またはR₆およびR₈のペアの1つは、それらが結合する炭素原子と一緒になって、炭素環式または複素環式であり、非置換であるか、またはハロ、=O、-OC(O)R_10d、-(O)COR_10e、およびC₁～C₆アルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換される4～14員の環系を形成する；
R_9a～R_9fおよびR_10a～R_10eは独立して、H、および非置換であるか、またはハロから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるC₁～C₆アルキルから選択される]
で示される化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物を提供する。

本明細書で言及される「含む(comprising)」という用語は、言及された特徴を必要とするものとして解釈される場合もあるが、他の特徴の存在を限定するものではない。あるいは、「含む」という単語は、リストされた構成要素/機能のみが存在することが意図されている状況に関連する場合もある(たとえば、「含む」という単語は、「からなる」または「本質的にからなる」という語句に置き換えることができる)。より広い解釈とより狭い解釈の両方が本発明のすべての態様および実施形態に適用され得ることが明確に企図されている。言い換えれば、「含む」という単語およびその同義語は、「からなる」という語句または「本質的にからなる」という語句またはその同義語に置き換えることができ、またその逆も同様である。

「本質的にからなる」という語句およびその同義語は、本明細書では、微量の不純物が存在する可能性のある材料を示すと解釈される場合がある。たとえば、材料は、90％以上の純度、たとえば9、5％を越える純度、たとえば97％を越える純度、たとえば99％を越える純度、たとえば99.9％を越える純度、たとえば99.99%を越える純度、たとえば99.999%を越える純度、たとえば100%の純度などでありうる。

本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」には、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象が含まれる。

本明細書(本発明の任意の態様または実施形態)における式(I)で示される化合物への言及には、そのような化合物自体、そのような化合物の互変異性体、さらにはそのような化合物の薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、または薬学的に機能的な誘導体への言及が含まれる。

薬学的に許容される塩としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。このような塩は、従来の手段、たとえば、式(I)で示される化合物の遊離酸または遊離塩基形態と1当量以上の適切な酸または塩基との、場合により溶媒中、または媒体中での反応により形成され得、塩が不溶性である場合、標準的な技術(たとえば、真空、凍結乾燥またはろ過)を使用して、前記溶媒または前記媒体を除去する。塩は、たとえば、適切なイオン交換樹脂を使用して、塩の形態の式(I)で示される化合物の対イオンを別の対イオンと交換することによっても調製され得る。

薬学的に許容される塩の例には、鉱酸および有機酸に由来する酸付加塩、ならびにナトリウム、マグネシウム、または好ましくはカリウムおよびカルシウムなどの金属に由来する塩が含まれる。

酸付加塩の例としては、酢酸、2,2-ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アリールスルホン酸(たとえば、ベンゼンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、p-トルエンスルホン酸)、アスコルビン酸(たとえば、ラスコルビン酸)、L-アスパラギン酸、安息香酸、4-アセトアミド安息香酸、ブタン酸、(+)-樟脳酸、樟脳スルホン酸、(+)-(1S)-樟脳-10-スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸(たとえば、D-グルコン酸)、グルクロン酸(たとえば、D-グルクロン酸)、グルタミン酸(たとえば、L-グルタミン酸)、α-オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、イセチオン酸、乳酸(たとえば、(+)-L-乳酸および(±)-DL-乳酸)、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸(たとえば、(-)-L-リンゴ酸)、マロン酸、(±)-DL-マンデル酸、メタリン酸、メタンスルホン酸、1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、L-ピログルタミン酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸(たとえば、(+)-L-酒石酸)、チオシアン酸、ウンデシレン酸および吉草酸と形成される酸付加塩が挙げられる。

塩の特定の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸などの鉱酸；酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、アリールスルホン酸などの有機酸；およびナトリウム、マグネシウム、または好ましくはカリウムおよびカルシウムなどの金属に由来する塩である。

上述したように、化合物およびそれらの塩の任意の溶媒和物も式Ｉに包含される。好ましい溶媒和物は、本発明の化合物の固体状態構造(たとえば、結晶構造)への非毒性の薬学的に許容される溶媒(以下、溶媒和溶媒と呼ぶ)の分子の組み込みによって形成される溶媒和物である。このような溶媒の例としては、水、アルコール(エタノール、イソプロパノール、ブタノールなど)およびジメチルスルホキシドなどが挙げられる。溶媒和物は、溶媒または溶媒和溶媒を含む溶媒の混合物を用いて本発明の化合物を再結晶化することによって調製することができる。殿よな場合でも、溶媒和物が形成されているかどうかは、化合物の結晶を、熱重量分析(TGE)、示差走査熱量分析(DSC)、X線結晶構造解析などのよく知られた標準的な手法を使用して分析することによって決定することができる。

溶媒和物は、化学量論的または非化学量論的溶媒和物であり得る。特に好ましい溶媒和物は水和物であり、水和物の例としては、半水和物、一水和物および二水和物が挙げられる。

溶媒和物とそれらを作成および特徴付けるために使用される方法についてのより詳細な説明については、Bryn et al.、Solid-State Chemistry of Drugs、Second Edition、published by SSCI、Inc of West Lafayette、IN、USA、1999、ISBN 0-967-06710-3を参照。

本明細書で定義される式(I)で示される化合物の「薬学的に機能的な誘導体」には、エステル誘導体および／または本発明の任意の関連化合物と同じ生物学的機能および／または活性を有するか、または提供する誘導体が含まれる。したがって、本発明の目的上、この用語には式(I)で示される化合物のプロドラッグも含まれる。

式(I)の関連化合物の「プロドラッグ」という用語には、経口または非経口投与後、生体内で代謝されて実験的に検出可能な量で、かつ所定の時間内(たとえば、6時間から24時間の間の投与間隔内(すなわち、1日1回から4回))にその化合物を形成する任意の化合物が含まれる。

式(I)で示される化合物のプロドラッグは、そのようなプロドラッグが哺乳類対象に投与されたときにインビボで修飾が切断されるような方法で、化合物上に存在する官能基を修飾することによって調製され得る。修飾は通常、プロドラッグ置換基を備えた親化合物を合成することによって実現される。プロドラッグには、式(I)で示される化合物中のヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシルまたはカルボニル基が、それぞれ生体内で切断されて遊離のヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシルまたはカルボニル基を再生することができる任意の基に結合している式(I)で示される化合物が含まれる。

プロドラッグの例には、ヒドロキシル官能基のエステルおよびカルバメート、カルボキシル官能基のエステル基、N-アシル誘導体およびN-マンニッヒ塩基が含まれるが、これらに限定されない。プロドラッグに関する一般的な情報はたとえば、Bundegaard、H."Design of Prodrugs" p. I-92、Elsevier、New York-Oxford(1985)に見出される。

式(I)で示される化合物、ならびにそのような化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物および薬学的に機能的な誘導体は、簡潔にするために、以下、まとめて「式(I)で示される化合物」と称する。

式(I)で示される化合物は二重結合を含む可能性があり、したがって個々の二重結合に関してＥ(エントゲーゲン)およびＺ(ズサンメン)幾何異性体として存在する可能性がある。このような異性体およびその混合物は、すべて本発明の範囲内に含まれる。

式(I)で示される化合物は位置異性体として存在することが可能であり、互変異性を示すことも可能である。すべての互変異性体およびその混合物は本発明の範囲内に含まれる。

式(I)で示される化合物は、1つまたは複数の不斉炭素原子を含む可能性があり、したがって光学異性および／またはジアステレオ異性を示す可能性があるジアステレオマーは、たとえば、クロマトグラフィーまたは分別結晶化などの従来の技術を使用して分離することができる。さまざまな立体異性体は、従来の技術、たとえば、分別結晶化またはHPLCなどを使用して化合物のラセミ体または他の混合物を分離することによって単離することができる。あるいは、所望の光学異性体は、ラセミ化またはエピマー化を引き起こさない条件下で適切な光学活性出発物質を反応させることによるか(すなわち、「キラルプール」法)、適切な出発物質と、誘導体化(すなわち、動的分割を含む分割)、たとえば、ホモキラル酸との反応に続いて、クロマトグラフィーなどの従来の手段によるジアステレオマー誘導体の分離により、その後適切な段階で除去することができる「不斉補助基」によるか、またはすべて当業者に知られている条件下で、適切なキラル試薬またはキラル触媒と反応させることによって、製造することができる。すべての立体異性体およびその混合物は本発明の範囲内に含まれる。

疑義を回避するために、本発明の文脈において、「治療」という用語には、そのような治療を必要とする患者の治療的または緩和的治療、ならびに関連する病状に感受性のある患者の予防的治療および／または診断への言及が含まれる。

「患者」および「患者たち」という用語には、哺乳類(ヒトなど)の患者への言及が含まれる。本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、当技術分野でよく認識されており、本明細書ではイヌ、ネコ、ネズミ、マウス、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、および最も望ましくはヒトを含む哺乳動物を示すために同じ意味で使用される。いくつかの実施形態では、対象は、治療を必要とする対象、または疾患もしくは障害を有する対象である。しかしながら、他の実施形態では、対象は、正常な対象であってもよい。この用語は特定の年齢や性別を意味するものではない。したがって、成人および新生児、男性または女性を対象とする。

「有効量」という用語は、治療される患者に治療効果を与える化合物の量(たとえば、疾患を治療または予防するのに十分な量)を示す。効果は、客観的(すなわち、何らかの試験またはマーカーによって測定可能)であるか、または主観的(すなわち、対象が効果を示す、または効果を感じる)でありうる。

「ハロ」という用語は、本明細書で使用される場合、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードへの言及を含む。

本明細書で使用される場合、炭素環式または複素環式である4～14員環系が本明細書で言及される場合、それは1～3個の環を含み得る。疑義を回避するために、本明細書で言及される炭素環式または複素環式の4～14員環系は、すでに環の一部である原子を部分的に使用して形成される場合があるが、これは、4～14員環系における環の総数に数えられるべきではない。4～14員環系は、6～10員環系、たとえば、6～8員環系であってもよく、単環式または二環式であってもよい。

本明細書において特に明記しない限り、本明細書で使用される「アリール」という用語には、C_6-14(C_6-10など)アリール基が含まれる。このような基は、単環式、二環式、または三環式であり、6～14個の環炭素原子を有し、少なくとも1つの環は芳香族である。アリール基の結合点は、環系の任意の原子を介していてもよい。しかしながら、アリール基が二環式または三環式の場合、それらは芳香環を介して分子の残りの部分と結合する。C_6-14アリール基として、フェニル、ナフチルなどが挙げられ、たとえば、1,2,3,4-テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニル、フルオレニルなどである。本発明の実施形態としては、アリールがフェニルであるものが挙げられる。

本明細書において特に明記しない限り、「アルキル」という用語は、非分岐または分岐、非環式または環式、飽和または不飽和(したがって、たとえば、アルケニルまたはアルキニルを形成する)ヒドロカルビルラジカルを示し、置換されるか、または非置換である(たとえば、1つ以上のハロ原子で)。「アルキル」という用語が非環式基を示す場合、それは好ましくはC_1-10アルキルであり、より好ましくはC_1-6アルキル(たとえば、エチル、プロピル、(たとえばn-プロピルまたはイソプロピル)、ブチル(たとえば、分岐または非分岐ブチル)、ペンチル、または、より好ましくはメチル)である。「アルキル」という用語が環状基である場合(基「シクロアルキル」と特定される場合もある)、好ましくはC_3-12シクロアルキルであり、より好ましくはC_5-10(たとえば、C_5-7)シクロアルキルである。

本明細書において特に明記しない限り、「複素環系」は、4～14員、たとえば、5～10員(たとえば、6～10員)の芳香族であってもよい複素環基(すなわち、ヘテロアリール基)、完全に飽和または部分的に不飽和であり、O、S、およびNから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を含み、1つまたは2つの環を含むことができる複素環基であってもよい。本明細書で言及される複素環系の例としては、アゼチジニル、ジヒドロフラニル(たとえば、2,3-ジヒドロフラニル、2,5-ジヒドロフラニル)、ジヒドロピラニル(たとえば、3,4-ジヒドロピラニル、3,6-ジヒドロピラニル)、4,5-ジヒドロ-1H-マレイミド、ジオキサニル、ジオキソラニル、フラニル、フラザニル、ヘキサヒドロピリミジニル、ヒダントイニル、イミダゾリル、イソチアジオリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、モルホリニル、1,2-または1,3-オキサジナニル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピラニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリニル(たとえば、3-ピロリニル)、ピロリル、ピロリジニル、ピロリジノニル、3-スルホレニル、スルホラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル(たとえば、3,4,5,6-テトラヒドロピリジニル)、1,2,3,4-テトラヒドロピリミジニル、3,4,5,6-テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラメチレンスルホキシド、テトラゾリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チアゾリジニル、チエニル、チオフェネチル、トリアゾリル、トリアジナニルが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において特に明記しない限り、「炭素環系」は、4員～14員、たとえば、5員～10員(たとえば、6員～10員、たとえば6員または10員)であってよく、炭素環基は、芳香族、完全飽和または部分不飽和であり、1つまたは2つの環を含むことができる。本明細書で挙げられる炭素環系の例としては、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル、フェニル、ナフチル、デカリニル、テトラリニル、ビシクロ[4.2.0]オクタニル、および2,3,3a,4,5,6,7,7a-オクタヒドロ-1H-インダニルが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい炭素環基には、フェニル、シクロヘキシルおよびナフチルが含まれる。

「ヘテロアリール」という用語は、本明細書で使用される場合、好ましくはN、OおよびSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子(たとえば、1～4個のヘテロ原子)を含む芳香族基を示す(たとえば、単環式、二環式または三環式複素芳香族基を形成する)。ヘテロアリール基には、5～14(たとえば10)員を有するものが含まれ、環の少なくとも1つが芳香族であることを条件として、単環式、二環式または三環式であってもよい。しかしながら、ヘテロアリール基が二環式または三環式の場合、それらは芳香環を介して分子の残りの部分に結合する。言及されうる複素環基としては、ベンゾチアジアゾリル(2,1,3-ベンゾチアジアゾリルを含む)、イソチオクロマニルおよびより好ましくは、アクリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾジオキサニル、ベンゾジオキセピニル、ベンゾジオキソリル(1,3-ベンゾジオキソリルを含む)、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル(2,1,3-ベンゾオキサジアゾリルを含む)、ベンゾオキサジニル(3,4-ジヒドロ-2H-1,4-ベンゾオキサジニルを含む)、ベンゾオキサゾリル、ベンゾモルホリニル、ベンゾセレナジアゾリル(2,1,3-ベンゾセレナジアゾリルを含む)、ベンゾチエニル、カルバゾリル、クロマニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、イミダゾ[1,2-a]ピリジル、インダゾリル、インドリニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアジオリル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル(1,6-ナフチリジニル、または好ましくは1,5-ナフチリジニルおよび1,8-ナフチリジニルを含む)、オキサジアゾリル(1,2,3-オキサジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾリルおよび1,3,4-オキサジアゾリルを含む)、オキサゾリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、キノリジニル、キノキサリニル、テトラヒドロイソキノリニル(1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリニルおよび5,6,7,8-テトラヒドロイソキノリニルを含む)、テトラヒドロキノリニル(1,2,3,4-テトラヒドロキノリニルおよび5,6,7,8-テトラヒドロキノリニルを含む)、テトラゾリル、チアジアゾリル(1,2,3-チアジアゾリル、1,2,4-チアジアゾリルおよび1,3,4-チアジアゾリルを含む)、チアゾリル、チオクロマニル、チオフェネチル、チエニル、トリアゾリル(1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリルおよび1,3,4-トリアゾリルを含む)などが挙げられる。ヘテロアリール基上の置換基は、必要に応じて、ヘテロ原子を含む環系内の任意の原子上に位置してもよい。ヘテロアリール基の結合点は、(必要に応じて)ヘテロ原子(窒素原子など)を含む環系内の任意の原子、または環系の一部として存在する可能性のある任意の縮合炭素環上の原子を介することができる。ヘテロアリール基は、NまたはS酸化体であってもよい。特に好ましいヘテロアリール基としては、ピリジル、ピロリル、キノリニル、フラニル、チエニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピリミジニル、インドリル、ピラジニル、インダゾリル、ピリミジニル、チオフェネチル、チオフェニル、ピラニル、カルバゾリル、アクリジニル、キノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、プリニル、シンノリニルおよびプテルジニルが挙げられる。特に好ましいヘテロアリール基としては、単環式ヘテロアリール基が挙げられる。

本発明のさらなる実施形態としては、式(I)で示される化合物が同位体標識されているものが挙げられる。しかしながら、言及され得る本発明の他の特定の実施形態には、式(I)で示される化合物が同位体標識されていないものが含まれる。

「同位体標識された」という用語は、本明細書で使用される場合、化合物中の1つまたは複数の位置に非天然同位体(または非天然同位体の分布)が存在する式(I)で示される化合物への言及を含む。本明細書における「化合物中の1つまたは複数の位置」への言及は、式(I)で示される化合物の1つまたは複数の原子を意味することが当業者には理解されるであろう。したがって、用語「同位体標識された」には、化合物中の1つまたは複数の位置で同位体富化された式(I)で示される化合物への言及が含まれる。

式(I)で示される化合物の同位体標識または富化は、水素、炭素、窒素、酸素、硫黄、フッ素、塩素、臭素および／またはヨウ素のいずれかの放射性または非放射性同位体により行うことができる。この点で挙げられる特定の同位体として、²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³⁵S、¹⁸F、³⁷Cl、⁷⁷Br、⁸²Br、および¹²⁵Iが挙げられる。

式(I)で示される化合物が放射性または非放射性同位体で標識または富化される場合、言及され得る式(I)で示される化合物には、化合物中の少なくとも1つの原子が、以下の放射性または非放射性同位体である同位体分布を示すものが含まれ、問題の原子の放射性または非放射性同位体は、自然レベルより少なくとも10％(たとえば、10％～5000％、特に50％～1000％、より具体的には100％～500％)高いレベルで存在する。

本発明の実施形態としては、式(I)で示される化合物がK_Ca3.1カルシウム活性化カリウムチャネルサブタイプを選択的に阻害するものが挙げられる。

K_Ca3.1カルシウム活性化カリウムチャネルの阻害に関して本明細書で使用される場合、「選択的」および「選択性」という用語は、同じ温度(たとえば、298Kなどの室温)での同じ化合のCa_v1.2カルシウム活性化カリウムチャネルサブタイプへの結合について決定されたIC₅₀値の少なくとも10分の1(たとえば、少なくとも20、50、100、500、または1000分の1)のIC₅₀値を有する化合物のK_Ca3.1への結合への言及を含む。

言及されてもよい本発明の実施形態には、式(I)で示される化合物がK_Ca3.1カルシウム活性化カリウムチャネルの選択的阻害剤であるものが含まれる。

K_Ca3.1カルシウム活性化カリウムチャネルの阻害に関して本明細書で使用される場合、用語「選択的」および「選択性」には、K_Ca3.1カルシウム活性化カリウムチャネルに対する化合物の結合に対する言及が含まれ、同じ温度(たとえば、298Kなどの室温)での同じ化合物の別のカルシウム活性化カリウムチャネルサブタイプ(たとえば、Ca_v1.2 カルシウム活性化カリウムチャネルサブタイプ)への結合について測定されたIC₅₀値の少なくとも10分の1(たとえば、少なくとも20、50、100、500、または1000分の1)である。K_Ca3.1カルシウム活性化カリウムチャネルに対する選択性は、他の1つのカルシウム活性化カリウムチャネルサブタイプを上回ることができるが、本発明の特定の実施形態では、2つ以上(たとえば、他のすべて)のカルシウム活性化カリウムチャネルサブタイプを上回る。

本発明の第2の態様では、K_Ca3.1チャネル阻害剤として使用するための、第1の態様に記載の化合物またはその誘導体が提供される。言及されてもよい本発明の実施形態としては、式(I)で示される化合物がK_Ca3.1チャネルを選択的に阻害するものが挙げられる。

KCa3.1チャネルの阻害に関して本明細書で使用される場合、用語「選択的」および「選択性」には、以下のチャネルの1つまたは複数への同じ化合物の結合について決定されたIC₅₀値より少なくとも10分の1(たとえば、少なくとも20、50、100、500、または1000分の1)のIC₅₀値で化合物がK_Ca3.1チャネルに結合することへの言及が含まれる：同じ温度(たとえば、298Kなどの室温)で、K_Ca1.1チャネル、K_Ca2.2チャネル、K_Ca2.3チャネル、KV1.1チャネル、KV1.2チャネル、K_V1.3チャネル、K_V1.4チャネル、K_V1.5チャネル、K_V1.7チャネル、K_V3.1チャネル、K_V4.2チャネル、K_V11.1チャネル。K_Ca3.1チャネルに対する選択性は、他の1つのカルシウムチャネルサブタイプおよび／または電位依存性チャネルサブタイプを超えることができるが、本発明の特定の実施形態では、2つ以上(たとえば、他のすべて)のカルシウムチャネルサブタイプおよび電位依存性チャネルサブタイプを超える。

本発明の実施形態では、以下の1つまたは複数が適用され得る：
(Ai) R₁は、H、F、Cl、Br、CF₃またはNO₂から選択され得る；
(Aii) R₂およびR₃は独立して、H、F、Cl、Br、CH₃、CF₃またはNO₂から選択され得る；
(Aiii) R₄は、H、F、Cl、Br、またはCF₃から選択され得る；
(Aiv) R₅およびR₆は独立して、R_9aC(O)O-、R_9bOC(O)-、または炭素原子が分枝状または非分枝状であり、非置換であるか、またはCl、FおよびNO₂から選択される1つまたは複数の置換基で置換される1～10個の炭素原子を有するアルキルケトンから選択され得る；
(Av) R₇およびR₈は独立して、Hまたは非置換であるか、またはFおよびClから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるC₁～C₃アルキルから選択され得るか、あるいは
R₅およびR₇またはR₆およびR₈のペアの1つは、それらが結合する炭素原子と一緒になって、炭素環式または複素環式であり、非置換であるか、またはF、Cl、=O、およびC₁～C₆アルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換される4～14員の環系を形成し得る；
(Avi) R_9a～R_9fおよびR_10a～R_10eは独立して、H、および非置換であるか、またはFおよびClから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるC₁～C₆アルキルから選択され得る。

本発明の特定の実施形態では、以下の1つまたは複数が適用され得る：
R₁は、H、F、Cl、またはCF₃から選択される；
R₂およびR₃は独立して、H、F、Cl、またはCF₃から選択される；
R₄は、H、F、Cl、またはCF₃から選択される；
R₅およびR₆は独立して、R_9bOC(O)-、または炭素原子が非置換であるか、またはClおよびFから選択される1つまたは複数の置換基で置換される1～3個の炭素原子を有するアルキルケトンから選択される；
R₇およびR₈は独立して、Hまたは非置換であるか、またはFおよびClから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるメチルから選択される。

本発明のさらに特定の実施形態では、以下の1つまたは複数が適用され得る：
R₁は、H、F、またはClから選択される；
R₂は、CF₃または、より具体的には、HもしくはFから選択される；
R₃は、HまたはCF₃から選択される；
R₄は、Hである；
R₅およびR₆は独立して、CH₃OC(O)-またはプロパン-2-オニル(たとえば、R₅およびR₆の両方が、CH₃OC(O)-)から選択される；
R₇およびR₈は独立して、HおよびCH₃から選択される。

本明細書で言及されうる本発明の特定の実施形態では、R₇およびR₈の少なくとも1つはHである。たとえば、R₇およびR₈の両方がHであってもよい。
本明細書で言及されうる別の実施形態では：
R₇はHであってもよく、およびR₈はCH₃であってもよい；
R₇およびR₈の両方が CH₃であってもよい；または
R₇はCH₃であってもよく、およびR₈はHであってもよい。

式(I)で示される化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、以下のリストからの1つ以上の化合物から選択され得る：

より具体的には、式(I)で示される化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、以下のリストからの1つ以上の化合物から選択され得る：

さらにより具体的には、式(I)で示される化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、以下のリストからの1つ以上の化合物から選択され得る：

さらにより具体的には、式(I)で示される化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、以下のリストからの1つ以上の化合物から選択され得る：

たとえば、式(I)で示される化合物、またはその塩および／または溶媒和物は、

であり得る。

理解されるように、本発明の化合物は対象を治療するのに適している可能性がある。したがって、本発明のさらなる態様では、上記の式(I)で示される化合物、またはその塩および溶媒和物を、1つまたは複数の薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルと組み合わせて含む医薬組成物が提供される。

式(I)で示される化合物は、薬学的に許容される剤形の化合物を含む医薬製剤の形態で、任意の適切な経路によって投与され得るが、特に、経口、静脈内、筋肉内、皮膚、皮下、経粘膜(たとえば、舌下または口腔)、直腸、経皮、経鼻、肺(たとえば、気管または気管支)、局所的に、他の非経口経路によって、投与され得る。特定の投与様式としては、経口、静脈内、皮膚、皮下、経鼻、筋肉内または腹腔内投与が挙げられる。

式(I)で示される化合物は、一般に、意図される投与経路および標準的な製薬実務を考慮して選択され得る、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体と混合した医薬製剤として投与される。このような薬学的に許容される担体は、活性化合物に対して化学的に不活性であり得、使用条件下で有害な副作用や毒性を有さない可能性がある。適切な医薬製剤は、たとえば、Remington The Science and Practice of Pharmacy、19th ed.、Mack Printing Company、Easton、Pennsylvania(1995)に見出すことができる。非経口投与の場合、発熱物質を含まず、必要なpH、等張性、および安定性を備えた、非経口的に許容される水溶液を使用することができる。適切な溶液は当業者にはよく知られており、多くの方法が文献に記載されている。薬物送達方法の簡単なレビューは、たとえば、Langer、Science(1990) 249、1527にも記載されている。

そうでない場合、適切な製剤の調製は、当業者によって日常的な技術を使用して、および／または標準および／または認められた製薬慣行に従って日常的に達成され得る。

本発明に従って使用される任意の医薬製剤中の式(I)で示される化合物の量は、治療される症状の重症度、治療される特定の患者、および採用される化合物などのさまざまな要因に依存する。いずれにしても、製剤中の式式(I)で示される化合物の量は、当業者によって日常的に決定され得る。

たとえば、錠剤やカプセルなどの固体経口組成物には、1～99%(w/w)の有効成分；0～99%(w/w)の希釈剤または充填剤；0～20%(w/w)の崩壊剤；0～5%(w/w)の滑沢剤；0～5%(w/w)の流動助剤；0～50%(w/w)の造粒剤または結合剤；0～5%(w/w)の酸化防止剤；および0～5%(w/w)の顔料が含まれ得る。制御放出錠剤にはさらに、0～90%(w/w)の放出制御ポリマーが含まれ得る。

非経口製剤(注射用の溶液または懸濁液、または輸液用の溶液など)には、1～50%(w/w)の活性成分；および50%(w/w)～99%(w/w)の液体または半固体の担体またはビヒクル(たとえば、水などの溶媒)；および0～20%(w/w)の緩衝剤、酸化防止剤、懸濁安定剤、張度調整剤および保存剤などの1つまたは複数の他の賦形剤が含まれ得る。

治療対象の疾患、患者、および投与経路に応じて、式(I)で示される化合物は、それを必要とする患者にさまざまな治療上有効な用量で投与され得る。

しかしながら、本発明の文脈において、哺乳動物、特にヒトに投与される用量は、妥当な期間にわたって哺乳動物に治療反応をもたらすのに十分なものでなければならない。当業者であれば、正確な用量および組成物、ならびに最も適切な送達計画の選択は、とりわけ製剤の薬理学的特性、治療される状態の性質および重症度、および身体的状態、レシピエントの精神的鋭敏さ、ならびに特定の化合物の効力、治療を受ける患者の年齢、状態、体重、性別および応答、および病気の段階／重症度にも影響されることを認識するであろう。

投与は連続的でも断続的でもよい(たとえば、ボーラス注射による)。投与量は、投与のタイミングと頻度によっても決定される。経口または非経口投与の場合、用量は式(I)で示される化合物で1日当たり約0.01mg～約1000mgまで変動し得る。

いずれにしても、医師またはその他の熟練者は、個々の患者に最も適した実際の投与量を日常的に決定することができる。上記の投与量は、平均的な場合の例である。もちろん、より高い用量範囲またはより低い用量範囲がメリットとなる個別の事例もあり得るが、それらは本発明の範囲内である。

理解されるように、本発明のさらなる態様は、医薬における使用のための、上記の式(I)で示される化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物に関する。

したがって、本発明のさらなる態様は以下に関する。
(a)K_Ca3.1の増加または活性の変化に関連する疾患状態の治療または予防に使用するための、上記で定義した式(I)で示される化合物、またはその塩および溶媒和物。
(b)K_Ca3.1の増加または活性の変化に関連する疾患状態の治療または予防のための医薬の製造のための、上記で定義した式(I)で示される化合物、またはその塩および溶媒和物の使用。
(c)K_Ca3.1の増加または活性の変化に関連する障害または症状の治療方法であって、上記に定義した式(I)で示される化合物、またはその塩および溶媒和物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。

本発明のさまざまな実施形態では、K_Ca3.1活性の増加または変化に関連する疾患状態は、白血病、特に炎症性腸疾患(IBD)、線維性疾患(肺、肝臓、腎臓、心臓、結膜、角膜)、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、神経膠腫(神経膠芽腫)、肺がん、膵臓がん、肝細胞がん、卵巣がん、結腸直腸がん、嚢胞性線維症、糖尿病性腎疾患、糸球体腎炎、骨吸収、炎症性関節炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、ステント内新生アテローム性動脈硬化症、脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、乾性遺伝性有口赤血球症、鎌状赤血球貧血、喘息、アレルギー性鼻炎、ミクログリア活性化、一酸化窒素依存性神経変性、神経腫瘍疾患および希少赤血球障害の1つまたは複数から選択され得る。たとえば、K_Ca3.1活性の増加または変化に関連する疾患状態は、白血病、特に炎症性腸疾患(IBD)、線維性疾患(肺、肝臓、腎臓、心臓、結膜、角膜)、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、神経膠腫(神経膠芽腫)、肺がん、膵臓がん、肝細胞がん、卵巣がん、結腸直腸がん、嚢胞性線維症、糖尿病性腎疾患、糸球体腎炎、骨吸収、炎症性関節炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、ステント内新生アテローム性動脈硬化症、脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、乾性遺伝性有口赤血球症、鎌状赤血球貧血、喘息、アレルギー性鼻炎、ミクログリアの活性化および一酸化窒素依存性の神経変性の1つまたは複数から選択され得る。

本明細書で言及され得る特定の実施形態では、K_Ca3.1活性の増加または変化に関連する疾患状態は、脳卒中であり得る。

理解されるように、本明細書に開示される式(I)で示される化合物または誘導体は、効力、K_Ca3.1チャネルに対する選択性、経口バイオアベイラビリティ、優れた脳浸透性、およびげっ歯類における反復投与毒性研究における良好な忍容性という利点を有する。さらに、本明細書に開示される式(I)で示される化合物または誘導体は、K_Ca3.1活性の増加または変化に関連する疾患状態である脳卒中の治療に有効であることが判明している。

本明細書に記載される本発明の態様(たとえば、上記の化合物、組み合わせ、方法および使用)は、本明細書に記載される状態の治療において、医師および／または患者にとって、それらの状態またはその他の治療における使用のための従来技術で知られている類似の化合物、組み合わせ、方法(治療)または使用と比較して、より便利であり、より効果的であり、より毒性が低い、より優れた選択性を有する、より広範囲の活性を有する、より強力である、より少ない副作用しか引き起こさない、または他の有用な薬理学的特性を有するという利点を有し得る。

式(I)で示される化合物は、以下の実施例に示すように、既知の技術を使用して合成することができる。他の化合物が、同様の方法で調製することができる。本発明の化合物は、従来の技術(たとえば、再結晶、カラムクロマトグラフィー、分取HPLCなど)を使用してそれらの反応混合物から単離され得る。

実施例
材料
炭酸アンモニウム((NH₄)₂CO₃)、酢酸、酢酸アンモニウム(NH₄OAc)、ジシクロヘキシルカルバミド、4-ジメチルアミノピリジン、n,o-ジメチルヒドロキシルアミンHCl、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、クロロギ酸エチル、アセト酢酸メチル、ピペリジンおよびメタ過ヨウ素酸ナトリウムは、Avra Synthesis Pvt Ltd.から購入した。塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸(EGTA)、D-グルコース、グアノシン5'-三リン酸ナトリウム水和物(Na₂-GTP)、アデノシン5'-三リン酸マグネシウム塩(Mg-ATP)、ケトコナゾール、キニジン、スルファフェナゾールフォル(Sulphaphenazolefor)、ノートカトン、ベラパミル、ワルファリン、ナルトレキソン、塩酸ロペラミド、フェナセチン、レセルピン、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド2'-リン酸・還元四ナトリウム塩水和物(NADPH)、N-メチル-2-ピロリドン(NMP)、ソルトールHS-15、ポリエチレングリコール400(PEG-400)、トコファーソラン(TPGS)、酸化マンガンおよびジクロロメタンは、Sigma-Aldrichから購入した。酸化オスミウム(VIII)は、Chempure Pte Ltd.から購入した。プロピオン酸メチル、4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒド、3,4-ジフルオロ-5-(トリフルオロメチル)安息香酸、3-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒド、ビニルトリフルオロホウ酸カリウム(95%)、5-ブロモ-2-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)安息香酸および4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒドは、Combi-Blocks Inc.から購入した。1,1'-bis-(ジフェニルホスフィノ)-フェロセン]-パラダスジクロリドは、Hindustan Platinum Pte Ltd.から購入した。クロロホルムは、SAI Enterprisesから購入した。イソプロピルマグネシウムクロリド-塩化リチウム複合体、THF中の1.3M溶液、1,4-ジオキサン中の塩化水素 mol、およびジエチルエーテル中のメチルマグネシウムブロミド3M溶液は、Sainor Laboratories Pte. Ltd.から購入した。N,N,N,N-テトラメチルグアニジニウムアジドは、SelectLab Chemicals GmbHから購入した。プロピオン酸メチル、塩化テトラエチルアンモニウム(TEA-Cl)、および3-(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒド(97%)は、TCI Chemicals(India) Pte. Ltd.から購入した。N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸(HEPES)は、Thermo Fisher Scientificから購入した。フラフィリンは、BD Gentestから購入した。ギ酸は、Honeywell Research Chemicalsから購入した。アセトニトリル(ACN)は、Avantorから購入した。トルブタミドは、Supelcoから購入した。2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TCC)は、Vicmed Biotechnology から購入した。エダラボンは、TargetMolから購入した。他のすべての化学薬品と溶媒は、工業用化学薬品の供給業者から購入し、さらに精製することなく直接使用した。

分析手法
¹ H NMR分光法
すべての¹H NMRスペクトルは、400MHz(Bruker)および500MHz(Agilent)NMR分光計で記録された。すべての化学シフトは、内部標準としてテトラメチルシラン(TMS)を基準としたδ値として与えられる。

液体クロマトグラフィー－質量分析(LC-MS)
毒性研究には、Waters UPLC システムと組み合わせた LC-MS/MS AB SCIEX API-4000 Triple Quadrapole装置を使用した。シトクロムP450酵素阻害アッセイおよび血漿タンパク質結合アッセイには、LC SIL-HTc(Shimadzu)と組み合わせた質量分析計API-4000(Applied Biosystems)を使用した。ミクロソームの安定性研究には、LC SIL-HTc(島津製作所)と組み合わせた質量分析計TSQ Quantum Ultra(Thermo Scientific)を使用した。化合物の合成分析には、LCMS(SQD)-2010EV(Shimadzu)、LCMS(SQD)-1200シリーズ LC/G6125B-MS(Agilent)、UPLC/MS(SQD)(Waters)を使用した。

高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)
水溶解度測定には、Waters Alliance 2690 HPLCを使用した。化合物の合成分析には、HPLC 2010CHT(Shimadzu)を使用した。

この研究で研究したジヒドロピリジンを4つのグループに分類し、表1に示す。グループ4は、R7およびR8の部分に基づいて3つのサブグループ(4a、4b、4c)にさらに分割される。

グループ4bおよび4c類似体の合成を以下に示す。これらの化合物はすべて、SciFinderデータベースの検索に基づいた新しい化学物質である。

4-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-1,4-ジヒドロピリジン-3,5-ジカルボン酸ジメチル(103)

0℃に冷却した酢酸(800mL)中の4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒド(1.80 g、416.42mmol、1.0当量)の撹拌溶液に、プロピオン酸メチル(2.70 g、832.84mMol、 2.0当量)および(NH₄)₂CO₃(40g、416.42mmol、1.0当量)を加え、反応混合物を70℃で16時間撹拌した。反応完了後(薄層クロマトグラフ(TLC)で監視)、反応混合物を冷水(1L)で希釈し、次に、酢酸エチル(EtOAc、2×1L)で抽出した。有機相を飽和NaHCO₃溶液(2L)およびブライン溶液(2L)で洗浄し、無水Na₂SO₄で乾燥させ、ろ過し、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をヘキサン(800mL)を使用してトリチュレートし、デカントし、続いてMeOH(50mL)で結晶化し、ろ過して、103(44g、29.4%)を淡黄色固体で得た。TLC：50% EtOAc/ヘプタン(Rf：0.3)。

¹H NMR(DMSO-d₆、400 MHz)：δ 9.32(br s、1H)、7.55 - 7.50(m、1H)、7.48 - 7.44(m、1H)、7.43 - 7.37(m、3H)、4.80(s、1H)、3.55(s、6H)。

LC-MS：99.59%、m/z = 358.0 [M-H]-(カラム：EVO-C18(3.0 X 50mM、2.6μm)；Rt：2.83分；A：2.5mM NH₄OAc水溶液、B：アセトニトリル(CAN) T/B%：0.01/5、3/90、5/90、5.5/5、6/5；温度：50 ℃；および流速：0.8mL/分)。

HPLC：99.94%(カラム：X-SELECT CSH C-18(4.6 x 150mM、3.5μm)；Rt：10.20分；A：5.0mM NH4OAc水溶液、B：ACN T/B%：0.01/20、12/90、16/90；および流速：1.0mL/分)。

4-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-2-メチル-1,4-ジヒドロピリジン-3,5-ジカルボン酸ジメチル(104)

3-アジドアクリル酸メチル(3b)
クロロホルム(40mL)中のプロピオン酸メチル(3a、2.0 g、23.80mMol、1.0当量)の撹拌溶液に、N,N,N,N-テトラメチルグアニジニウムアジド(4.0 g、26.19mMol、1.1当量)を加え、反応物を室温(RT)で16時間撹拌した。反応が完了した後(TLCで監視)、反応混合物を35℃の水浴中で300mbarで濃縮した。粗生成物を最初に35℃の水浴中でハウスバキュームを用いて蒸留し、残留クロロホルムの大部分を除去した。真空ポンプを接続して真空にし、粗生成物を蒸留して、3bをオフホワイトの固体(1.5 g、粗製)として得た。粗生成物をさらに精製せずに次の反応に直接使用した。TLC：20% EtOAc/ヘプタン(Rf：0.5)。

(E)-3-((トリフェニル-15-ホスファニリデン)アミノ)アクリル酸メチル(3c)
DCM(50mL)中の3-アジドアクリル酸メチル(1.5 g、11.81mMol、1.0当量)の撹拌溶液に、トリフェニルホスフィン(3.0 g、11.80mMol、1.0当量)を加え、反応混合物を室温で16時間撹拌した。反応が完了した後(TLCで監視)、反応混合物を真空下で直接蒸発させて、3cをオフホワイトの固体として得た(1.0 g、粗製)。TLC：20% EtOAc/ヘプタン(Rf：0.5)。

(Z)-2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)ベンジリデン)-3-オキソブタン酸メチル(2)
トルエン(10mL)中の4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒド(1、0.5 g、2.60mMol、1.0当量)の溶液に、ピペリジン(22.1mg、0.26mMol、0.1当量)および酢酸(15.6mg、0.26mMol、0.1当量)を0℃で加え、反応混合物をRTで16時間撹拌した。反応完了後(TLCで監視)、反応混合物を冷水(20mL)で希釈し、DCM(2×50mL)で抽出した。有機相をブライン溶液(20mL)で洗浄し、無水Na₂SO₄で乾燥し、ろ過し、濃縮して粗生成物を得、これをヘキサン中の20～30% EtOAcを溶離液として使用するコンビフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、2を淡黄色固体として得た(0.5 g、66.2%)。TLC：30% EtOAc/ヘプタン(Rf：0.2)。

104
クロロホルム(20mL)中の2(0.5 g、1.72mMol、1.0当量)の撹拌溶液に、3c(0.930 g、2.58mMol、1.5当量)を加え、反応混合物を40℃で6時間撹拌した。反応の進行をTLCで監視し、生成物を後処理し、上記2のプロトコルに従って精製して、104を淡黄色固体(0.2 g、31%)として得た。TLC：40% EtOAc/ヘプタン(Rf：0.2)。

¹H NMR(DMSO-d₆、400 MHz)：δ 9.36(br s、1H)、7.55 - 7.50(m、1H)、7.48 - 7.44(m、2H)、7.43 - 7.37(m、1H)、4.82(s、1H)、3.55(s、6H) 2.25(s、3H)。

LC-MS：99.91%、m/z = 374.1 [M+H]+(カラム：EVO-C18(3.0 X 50mM、2.6μm)；Rt：2.8＼8分；A：2.5mM ギ酸アンモニウム水溶液、B：ACN T/B%：0.01/5、3/90、5/90、5.5/5、6/5；温度：50 ℃；および流速：0.8mL/分)。

HPLC：99.94%(カラム：X-SELECT CSH C-18(4.6 x 150mM、3.5μm)；Rt：10.95分；A：5.0mM 酢酸アンモニウム(NH₄OAc)水溶液、B：ACN T/B%：0.01/20、12/90、16/90；および流速：1.0mL/分)。

4-(3-(トリフルオロメチル)フェニル)-1,4-ジヒドロピリジン-3,5-ジカルボン酸ジメチル(108)

0℃に冷却した酢酸(200mL)中の3-(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒド(1、20 g、114.92mMol、1.0当量)の撹拌溶液に、プロピオン酸メチル(2、20.45mL、229.85mMol、2.0当量)と(NH₄)₂CO₃(11g、114.92mmol、1.0当量)を加え、80℃で16時間撹拌した。反応が完了した後(TLCで監視)、反応混合物を冷水(400mL)で希釈し、次いでEtOAc(2×500mL)で抽出した。有機層を飽和NaHCO₃溶液(500mL)およびブライン溶液(500mL)で洗浄し、無水Na₂SO₄で乾燥し、ろ過し、濃縮して粗生成物を得、これを溶離液としてヘキサン中の30～40%EtOAcを使用するコンビフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、108を淡黄色固体として得た(11.0g、28%)。TLC：40% EtOAc/ヘプタン(Rf：0.2)。

¹H NMR(DMSO-d₆、400 MHz)：δ 9.32(br s、1H)、7.55 - 7.50(m、3H)、7.48 - 7.44(m、1H)、7.43 - 7.37(m、2H)、4.80(s、1H)、3.55(s、6H)。

LC-MS：99.54%、m/z = 340.0 [M-H]-(カラム：EVO-C18(3.0 X 50mM、2.6μm)；Rt：2.65分；A：2.5mM NH₄OAc水溶液、B：ACN T/B%：0.01/5、3/90、5/90、5.5/5、6/5；温度：50 ℃；および流速：0.8mL/分)。

HPLC：99.91%(カラム：X-SELECT CSH C-18(4.6 x 150mM、3.5μm)；Rt：9.43分；A：5.0mM NH₄OAc水溶液、B：ACN T/B%：0.01/20、12/90、16/90；および流速：1.0mL/分)。

4-(3-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)フェニル)-1,4-ジヒドロピリジン-3,5-ジカルボキシレート(109)

酢酸(10mL)中の3-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒド(1、0.100 g、0.5208mMol、1.0当量)とプロピオン酸メチル(2、0.085 g、1.041mMol、2.0当量)の溶液を撹拌し、(NH₄)₂CO₃(0.049 g、0.5208、1.0当量)を室温でゆっくり加え、反応混合物を70℃で14時間加熱した。出発物質が完全に消費された後(TLCにより監視)、反応混合物を室温まで冷却し、氷冷水(10mL)でゆっくりとクエンチした。水層をDCM(15mL×2)で抽出した。合わせた有機層をブライン(10mL)で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥させ、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これをnヘキサン中10～40% EtOAcを使用するコンビフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、109を淡黄色固体として得た。 (0.040 g、22%)。TLC：40% EtOAc/ヘキサン(Rf：0.5)。

¹H NMR(400 MHz、DMSO-d₆) δ 9.36(brs、1H)、7.40 - 7.50(m、3H)、7.32(s、1H)、7.26(d、J = 7.9 Hz、1H)、4.81(s、1H)、3.53(s、6H)。

LC-MS：99.32%、m/z = 360.0 [M+H]+(カラム：X-Select CSH C18(3.0 x 50mM、2.5μm)；Rt：1.941分；A：0.05% ギ酸水溶液：ACN(95：05)、B：0.05% ギ酸ACN溶液。温度：50 ℃；および流速：1.2mL/分)。

HPLC：99.45%(カラム：X-SELECT CSH C-18(4.6 x 150mM、3.5μm)；Rt：8.48分；A - 0.1% ギ酸水溶液、B：ACN T/B%：0.01/5、1.0/5、8.0/100、12.0/100、14.0/5、18.0/5および流速：1.0mL/分)。

4-(3,4-ジフルオロ-5-(トリフルオロメチル)フェニル)-1,4-ジヒドロピリジン-3,5-ジカルボン酸ジメチル(110)

(3,4-ジフルオロ-5-(トリフルオロメチル)フェニル)メタノール(2)
THF(20mL)中の3,4-ジフルオロ-5-(トリフルオロメチル)安息香酸(1、0.500 g、2.212mMol)の撹拌溶液に、BH₃：THF(6.6mL、6.637mMol)を0℃でゆっくり加えた。反応混合物を室温に戻し、12時間撹拌した。出発物質が完全に消費された後(TLCで監視)、反応混合物を3M HCl(30mL)でクエンチし、水層をEtOAc(20mL)で抽出した。有機層をブライン(10mL)で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、減圧下で濃縮して、2を粘稠な無色油状物として得た(0.300 g、64%)。得られた粗生成物をさらに精製することなく次の反応に直接使用した。TLC：5% MeOH in DCM(Rf：0.6)。

¹H NMR(400 MHz、DMSO-d₆) δ 7.45 - 7.55(m、1H)、7.25(s、1H)、6.95(s、1H)、4.58 - 4.68(s、2H)。

3,4-ジフルオロ-5-(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒド(3)
DCM(20mL)中の(3,4-ジフルオロ-5-(トリフルオロメチル)フェニル)メタノール(2、0.300 g、1.415mMol)の撹拌溶液に、MnO₂(0.738 g、8.490mMol)を室温でゆっくり加え、12時間撹拌した。出発物質が完全に消費された後(TLCによって監視)、反応混合物をセライトのパッドを通してろ過した。セライトパッドをDCM(5mL)で洗浄し、得られたろ液を減圧下で濃縮して、3を粘稠な無色油状物として得た(0.200g、67%)。得られた粗生成物をさらに精製することなく次の反応に直接使用した。TLC：40% EtOAc/ヘキサン(Rf：0.8)。

¹H NMR(400 MHz、DMSO-d₆) δ 9.88(br. s、1H)、7.73(s、1H)、7.45(s、1H)。

110
酢酸(10mL)中の3,4-ジフルオロ-5-(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒド(3、0.200 g、0.9523mMol)とプロピオン酸メチル(2、0.159 g、1.904mMol)の溶液を撹拌し、(NH₄)₂CO₃(0.091 g、0.9523mMol)を室温でゆっくりと加え、反応混合物を75℃で16時間加熱した。出発物質が完全に消費された後(TLCにより監視)、反応混合物を室温まで冷却し、氷冷水(10mL)でゆっくりとクエンチした。水層をDCM(20mL×2)で抽出した。合わせた有機層をブライン(10mL)で洗浄し、Na₂S_O4で乾燥させ、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物を、n-ヘキサン中の0～40% EtOAcを使用するコンビフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、110を淡黄色固体(0.040 g、11%)として得た。TLC：40% EtOAc/ヘキサン(Rf：0.5)。

¹H NMR(400 MHz、DMSO-d₆) δ 9.38(br. s、1H)、7.40 - 7.50(m、3H)、7.30(s、1H)、4.81(s、1H)、3.55(s、6H)。

LC-MS：99.64%、m/z = 360.0 [M+H]+(カラム：X-Select CSH C18(3.0 x 50mM、2.5μm)；Rt：2.034分；A：0.05% ギ酸水溶液：ACN(95：5)、B：0.05% ギ酸ACN溶液；温度：50 ℃；および流速：1.2mL/分)。

HPLC：98.11%(カラム；X-SELECT CSH C-18(4.6 x 150mM、3.5μm)；Rt：9.043分；A - 0.1% ギ酸水溶液、B：ACN T/B%：0.01/5、1.0/5、8.0/100、12.0/100、14.0/5、18.0/5；および流速：1.0mL/分)。

4-(4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-1,4-ジヒドロピリジン-3,5-ジカルボン酸ジメチル(113)

酢酸(10mL)中の4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒド(1、0.100 g、0.4807mMol)とプロピオン酸メチル(2、0.080 g、0.9615mMol)の溶液に、(NH₄)₂CO₃(0.046 g、0.4807)を室温でゆっくりと加え、反応混合物を70℃で14時間加熱した。出発物質が完全に消費された後(TLCにより監視)、反応混合物を室温まで冷却し、氷冷水(10mL)でゆっくりとクエンチした。水層をDCM(20mL×2)で抽出した。合わせた有機層をブライン(10mL)で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、n-ヘキサン中の0～40% EtOAcを使用するコンビフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、113を淡黄色固体(0.040 g、22%)として得た。TLC：40% EtOAc/ヘキサン(Rf：0.8)。

¹H NMR(400 MHz、DMSO-d₆) δ 9.33(br. s、1H)、7.63(d、J = 8.01 Hz、1H)、7.57(s、1H)、7.40 - 7.50(m、3H)、4.79(s、1H)、3.35(s、6H)。

LC-MS：99.75%、m/z = 376.0(M+H)+(カラム：X-Select CSH C18(3.0 x 50mM、2.5μm)；Rt：1.986分；A：0.05% ギ酸水溶液：ACN(95：05)、B：0.05% ギ酸ACN溶液；温度：50 ℃；および流速：1.2mL/分)。

HPLC：99.42%(カラム：X-SELECT CSH C-18(4.6 x 150mM、3.5μm)；Rt：8.715 min、A - 0.1% ギ酸水溶液、B：ACN T/B%：0.01/5、1.0/5、8.0/100、12.0/100、14.0/5、18.0/5；および流速：1.0mL/分)。

K_Ca3.1チャネル上のジヒドロピリジンのパネルを、構造と活性の関係を理解するためにパッチクランプを使用してスクリーニングした。

K _Ca 3.1パッチクランププロトコル
K_Ca3.1チャネルに対する化合物の効果を、QPatch HTX自動電気生理学プラットフォーム(Sophion、デンマーク) を使用したパッチクランプと手動パッチクランプ(HEKA、ドイツ)によって評価した。QPatch実験の場合、自動電気生理学のためのギガシールとホールセルの要件は次のとおりであった：最小シール抵抗 = 0.1GΩ；保持電位 = -80 mV；保持圧力 = -20 mbar；およびポジショニング圧力 = -70 mbar。K_Ca3.1実験の場合、外部溶液はNa⁺-リンゲル液であり、以下を含んだ(mMで)：160 NaCl；10 HEPES；4.5 KCl；1mgCl₂；および2 CaCl₂(pH = 7.4、310 mOsm)。内部溶液は、以下を含んだ(mMで)；120 KCl；10 HEPES；1.75mgCl₂；1 Na₂ATP；10 EGTA；および8.6 CaCl₂(1μM 遊離Ca²⁺) (pH = 7.2、300 mOsm)。ホールセル構成の確立後、細胞を-80 mVに保持し、-80 mVで20 ms 保持し、20 msで-120 mVにステップアップし、200 msで-120から+40 mVに上昇し、その後20 msで-120 mVに戻った。このパルスプロトコルは10秒ごとに適用された。電流のスロープ(アンペア/秒)は、Sophion QPatch ソフトウェアを使用して測定され、分析のためにMicrosoft ExcelおよびGraphPad Prism 7にエクスポートされた。-85と-65 mVの間のスロープの減少を使用して、K_Ca3.1阻害のIC₅₀を決定した。カーブフィッティングとIC₅₀の決定は、GraphPad Prismソフトウェアを使用して実行された。

結果および考察
ジヒドロピリジンのIC₅₀を表2にまとめる。最初のグループは、5μMを超えるIC₅₀値でK_Ca3.1をブロックした。2番目のグループは、1～5μMでチャネルをブロックした。3番目のグループは、100～200nMでK_Ca3.1をブロックした。4番目のグループは、低ナノモル濃度でK_Ca3.1をブロックした。選択したグループ2、3、4a、4b、および4cの化合物のK_Ca3.1電流に対する影響を図3に示す。

ジヒドロピリジンは、L型電位依存性カルシウムチャネルを阻害するので、選択した類似体をCa_V1.2に対して試験した。

Ca _V 1.2パッチクランププロトコル
Ca_V1.2 チャネルに対する化合物の効果を、EPC-10 HEKAアンプを使用した手動パッチクランプによって評価した。外部溶液は、140 TEA-Cl、2mgCl₂、10 CaCl₂、10 HEPES、および5 D-グルコースを含んだ(mM)(pH = 7.4)。内部溶液は、120 CsCl、1mgCl₂、10 HEPES、10 EGTA、0.3 Na₂-GTP、および 4mg-ATPを含んだ(mM)(pH = 7.2)。ホールセル構成の確立後、膜電位を-80 mVに保持してCa_V1.2電流を記録し、次に、0.3秒間+10 mV(リードIV試験のためテストパルスはわずかに変更された)に脱分極した。このプロトコルを20秒間隔で繰り返し、Ca_V1.2 電流のピークに対する試験化合物の効果を観察した。各細胞を各試験化合物とともに5分間、または電流が定常状態に達するまでインキュベートした。化合物は低濃度から高濃度までの複数の濃度で適用された。各セルは独自のコントロールとして機能した。ピーク電流の減少は、Ca_V1.2阻害のIC₅₀を決定するために使用された。曲線適合とIC₅₀の計算は、IGORソフトウェアを使用して実行した。

結果および考察
表3は、選択された類似体を示し、K_Ca3.1とCa_V1.2に対する選択された類似体の選択性を比較する。グループ2の類似体は、K_Ca3.1よりもCa_V1.2への選択性を示した。グループ3の類似体は、Ca_V1.2よりもK_Ca3.1に対して～10倍の選択性を示した。グループ4の類似体は、Ca_V1.2よりもK_Ca3.1に対して>50倍の選択性を示し、グループ4cの類似体が、K_Ca3.1に対して最も選択的であった。K_Ca3.1の低いnMのIC₅₀ブロックおよびCa_V1.2よりもK_Ca3.1に対する>1000倍の選択性に必要であるファルマコフォアを図４に示す。

グループ4からの選択された類似体を、関連するカリウムチャネルでテストした。

カリウムチャネルパッチクランププロトコル
関連するカリウムチャネルに対するグループ4化合物の効果を、QPatch HTX自動電気生理学プラットフォーム(Sophion、デンマーク)を使用したパッチクランプによって評価した。自動電気生理学のためのギガシールおよびホールセルの要件は次のとおりであった：最小シール抵抗 = 0.1GΩ、保持電位 = -80 mV、保持圧力 = -20 mbar、およびポジショニング圧力 = -70 mbar。試験した特定のイオンチャネルごとの緩衝液組成と電圧プロトコルを表4に示す。

結果および考察
グループ4a、4b、および4cの類似体は、関連するカリウムチャネルよりもK_Ca3.1に対して>1000倍の選択性を示した(表5)。

グループ4の化合物101および103を、シトクロムP450酵素を阻害する能力について試験した。さらに、それらの血漿タンパク質結合およびミクロソーム安定性を評価した。

シトクロムP450酵素阻害アッセイ
リン酸カリウム緩衝液(50mM、pH = 7.4)中のミクロソーム懸濁液をそれぞれのプローブ基質と混合した後、37℃で5分間平衡化した。DMSOコントロール、参照阻害剤(3A4に対するケトコナゾール、2D6に対するキニジン、2C9に対するスルファフェナゾール、2C19に対するノートカトン、1A2に対するフラフィリン)およびさまざまな濃度(0.009μM、0.027μM、0.082μM、0.247μM、0.741μM、2.222μM、6.667μMおよび20μM)の化合物101または103を、調製したミクロソームとプローブ基質の混合物にスパイクし、振とう水浴中で37℃で5分間インキュベートした。NADPH(10mM)をすべてのサンプルに添加して反応を開始した。内部標準としてベラパミル(200ng)およびワルファリン(200ng)を含むACNを混合物に添加し、37℃で10分間インキュベートした後、反応を停止させた。サンプルを穏やかにボルテックスし、4℃、1021gで20分間遠心分離した後、LC-MS/MSシステムに注入した。上記の条件下での各基質の代謝産物の形成は、次の式を使用して推定した：阻害パーセント = [1-(試験面積比/コントロール面積比)]x100。IC₅₀値は、GraphPad Prism(登録商標)5ソフトウェアのシグモイド用量反応曲線(可変勾配)を使用して決定した。

血漿タンパク質結合アッセイ
試験化合物(3μM、最終濃度)およびリン酸ナトリウム緩衝液(150μL、100mM、pH7.4)を含むヒトおよびマウスの血漿(150μL)を平衡透析装置に添加し、一定に振とうしながら37℃で4.5時間平衡化した。平衡化後、ウェルの第一半分(the first half)から血漿10μLを取り出し、50μLのブランク緩衝液と混合し、その後、内部標準として100ng/mLのロペラミド、フェナセチンおよびトルブタミドを含む0.05%ギ酸ACN溶液200μLでクエンチした。同様に、ウェルの第二半分(the second half)から50μLの血漿を採取し、10μLのブランク血漿と混合した後、クエンチした。回収サンプルを調製するために、3μMの化合物101または103を含む10μLの血漿を50μLのブランク緩衝液に添加し、クエンチした。すべてのサンプルを4℃、14,000rpmで5分間遠心分離した。ワルファリンとナルトレキソンをポジティブコントロールとして使用した。すべてのサンプルの上清をLC-MS/MSで分析した。

ミクロソームの安定性研究
ヒトミクロソーム(20mg/mL)をインキュベーション混合物としてリン酸カリウム緩衝液(66.7mM、pH = 7.4)に懸濁した。1μLの試験化合物またはコントロール(1.1mM)をインキュベーション混合物に添加して1.1μMの作業濃度(working concentration)とし、4時点アッセイ(0、5、15および30分)のために4本のチューブに等分した。すべてのチューブとNADPH溶液(10mM)を振とう水浴中、37℃で5分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、NADPH溶液(10mM)を5分、15分、および30分のチューブに加えた。緩衝液を0分のチューブに添加して、試験化合物または参照標準の最終濃度1μMを得た。各チューブのインキュベーション期間の終わりに、クエンチング溶液(内部標準として100ng/mLのワルファリンおよびロペラミドを含むACN)を添加して反応を停止した。得られたサンプルを3,220gで20分間遠心分離し、各反応チューブからの上清を LC-MS/MS分析用に採取した。

結果および考察
グループ4cの類似体は、グループ4aの化合物と比較して、シトクロムP450酵素よりもK_Ca3.1に対してより選択的で、血漿タンパク質結合が少なく、cLogP値が低く、安定性と溶解度が優れていた(表6)。

グループ4cの化合物103は、低いナノモル効力(IC50 = 6 nM)でK_Ca3.1をブロックし、他のチャネルおよび～100の分子標的パネルに比べて、K_Ca3.1に対して>1000倍の選択性を有するため、その後の研究で使用された。

化合物103の選択性は、97個の標的に対する競合結合、酵素、および取り込みアッセイによって評価した。

競合結合アッセイ
個々の競合結合アッセイの実験条件を表７に示す。化合物103は、3μMで試験した。結果は、コントロール特異的結合の阻害パーセント[100-(測定された特異的結合/コントロール特異的結合×100)]として表される。IC₅₀値とヒル係数(nH)は、Cerepで開発されたソフトウェア(Hill software)で実行されたヒル方程式曲線フィッティングを使用して、平均反復値で生成された競合曲線の非線形回帰分析によって決定され、商用ソフトウェアSigmaPlot(登録商標)4.0によって生成されたデータとの比較によって検証された。

酵素および取り込みアッセイ
個々の酵素および取り込みアッセイの実験条件を表に示す。化合物103は、3μMで試験した。結果は、コントロール特異的活性の阻害パーセント[100-(測定された特異的活性/コントロール特異的化成×100)]として表される。IC₅₀値、EC₅₀値、とヒル係数(nH)は、Cerepで開発されたソフトウェア(Hill software)で実行されたヒル方程式曲線フィッティングを使用して、平均反復値で生成された濃度応答曲線の非線形回帰分析によって決定され、商用ソフトウェアSigmaPlot(登録商標)4.0によって生成されたデータとの比較によって検証された。

結果および考察
結果を図5に示す。

化合物103の溶解度と薬物動態を評価した。

溶解度試験
1、5、10、50、100、200、および 300μMの較正基準を20mMストックから DMSOで調製した。0.01M PBS(pH = 7.4)のアリコート198μLをマルチスクリーン溶解度フィルタープレートの2つのウェルに分注し、続いて、試験化合物溶液(20mM)2μLを分注した。プレートに蓋をし、毎分150回転で90分間振とうした。90分の終わりに、MultiScreen HTS 真空マニホールドアセンブリを使用してサンプルをろ過し、ろ液をアクセプタープレート上に収集した。上記の96ウェルアクセプタープレートからのろ液のアリコート(150μL)をHPLCバイアルに移し、HPLC-UVによって分析した。ベラパミル、ケトコナゾール、レセルピンをそれぞれ高、中、低溶解性参照基準として使用した。

薬物動態分析
6～8週齢の雄性スプラーグ・ドーリー(SD)ラット(200～240g)を使用した(n = 3、連続サンプリング)。化合物103は、静脈内投与用に(IV)、DMSO：ソルトール-エタノール：生理食塩水(10：10：80；v/v)中に5mg/kgで、および経口投与用に、5%v/v NMP、7.5%v/v 溶液HS-15、50%v/v PEG-400および37.5% v/v TPGS(10% w/v 水溶液)中に50mg/kgで、配合された。IVおよびPO投与についての血漿収集時点は、それぞれ0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24時間および0.25、0.5、1、2、4、8、10、24時間であった。血漿サンプルは、LC-MS/MSで分析され、PKパラメータは、Phoenixソフトウェアver.8.1で計算された。

結果および考察
化合物103は、pH7.4のPBSに87.4μMまで可溶であることが見出された(表9)。

化合物103の血漿終末半減期(t_1/2)は、マウスに5mg/kgで単回静脈内注射した後は、1.15 時間、50mg/kgで単回経口投与した後は、4時間であった。ラットにおけるバイオアベイラビリティは44.1%と推定された(図6)。

マウスにおける化合物103の脳透過能力を評価した。

血漿および脳の分布研究
化合物103の血漿および脳分布を、体重20～35gの雄性C57BL/6マウス(8～12週齢)において、25mg/kgおよび50mg/kgでの単回腹腔内投与後に測定した。使用した製剤ビヒクルは、5%v/v NMP、7.5%v/v Solutol HS-15、50%v/v PEG-400および37.5%v/v TPGS(10% w/v)であった。腹腔内投与の投与量は、5mL/kgであった。採血後、動物を屠殺し、腹部大静脈を切開し、10mLの生理食塩水を用いて心臓から全身を灌流した。脳サンプルを、0.08、0.25、0.5、1、2、4、8、および10時間の時点で3匹のマウスのセットから採取した。単離後、脳サンプルを氷冷生理食塩水で3回洗浄し(各洗浄には使い捨てペトリ皿にて～10－20mLの生理食塩水を使用し、5～10秒間洗浄)、吸い取り紙上で乾燥させた。脳サンプルは、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水(pH = 7.4)を使用してホモジナイズした。ホモジネートの総量は、組織重量の3倍であった。すべてのホモジネートは、生物分析まで-70℃以下で保管された。マウスの血漿および脳サンプル中の化合物103の濃度は、目的に応じたLC-MS/MS法によって測定された。薬物動態パラメータの評価には、Phoenix WinNonlin(登録商標)(バージョン8.0)のNon-Compartmental-Analysisツールを使用した。

結果および考察
化合物103を25mg/kgおよび50mg/kgで単回腹腔内投与した後、血漿濃度および脳濃度のピークがそれぞれ0.5時間および0.25時間で観察され、急速な脳浸透が示唆された。最終排出半減期は、2.24時間および1.63時間で観察された。全体として、脳濃度は血漿よりも高く、脳-Kpは、1.97および4.4であった(表 10)。

マウスにおける化合物103の血漿および肝臓濃度を評価した。

血漿および肝臓の研究
5～8週齢の雄性(18.7～20.8g)および雌性(17.6～18.9g)C57/BL6マウスの両方に25および50 mg/kg/BIDで、5%v/v NMP、7.5%v/v Solutol HS-15、50%v/v PEG-400、37.5%v/v TPGS(10%w/v)中で調製した化合物103を14日間反復経口投与した後、血漿および肝臓の検査項目の濃度を、Waters UPLC システムと組み合わせたAB SCIEX LC-MS/MSトリプル四重極装置を使用して定量した。

結果および考察
雄性と雌性の肝臓と血漿の濃度比は、25mg/kg/BIDで36.03および85.59、50mg/kg/BIDで19.57および31.90であった(表11)。

化合物103の安全性プロファイルを経口投与により評価した。
マウスにおける2週間の非GLP毒性
化合物103の安全性プロファイルを、マウスに1日2回、25mg/kgおよび50mg/kgで2週間経口投与することによって評価した。使用した製剤は、5%v/v NMP、7.5%v/v Solutol HS-15、50%v/v PEG-400および37.5%v/v TPGS(10％w/v)であった。合計6匹の動物群を使用し、そのうち3グループは雄性マウス(18.7～20.8g)、3グループは雌性マウス(17.6～18.9g)であり、マウスは5～8週齢であった。各グループには6匹のマウスが含まれた。動物を研究全体を通して分析し、研究の最後に血液および組織を分析した。

結果および考察
異常な臨床徴候は検出されず、すべての動物は試験終了まで生存した。マウスの体重および体重増加は変化せず(表12～13)、摂餌量も変化しなかった(表14)。

血液学的評価は、25mg/kgおよび50mg/kgで処置した雄性マウスおよび雌性マウスの白血球(WBC)が統計的に有意な減少(最大3.4倍)を示した。他の毒性学的に有意な変化は検出されなかった(表15)。さらに、臨床化学評価は、雄性マウスおよび雌性マウスのいずれのパラメータにおいても有意な毒性学的変化を示さなかった(表16)。臓器重量は、化合物103によって変化せず(表17)、明らかな巨視的病理は認められなかった。組織病理学的分析では、コントロールとの差は検出されなかった(図7)。

したがって、化合物103をC57BL/6マウスに経口経路で14日間連続1日2回投与した場合、耐用量は≧５0mg/kg/BIDであったと結論付けることができる。

K_Ca3.1遺伝子ノックアウトまたは選択的K_Ca3.1遮断に基づいて実験的に検証されている多くの可能性のある臨床適応症のうち、概念実証研究として、我々は1つの臨床適応症、すなわち脳卒中について動物モデルで化合物103を評価した。虚血／再灌流脳卒中のマウスおよびラットモデルにおけるK_Ca3.1の遺伝子ノックアウトまたは薬理学的遮断により、梗塞サイズ、ミクログリア媒介神経炎症および星状神経膠症が減少し、神経学的スコアが改善された(Y. J. Chen et al.、J. Cereb. Blood Flow Metab. 2011、31、2363-2374；M. Yi et al.、J. Neuroinflammation 2017、14、203；M. S. V. Elkind et al.、Neurology 2020、95、e1091-e1104；およびZ. Yu et al.、Front. Cell. Neurosci. 2017、11、319)。化合物103は優れた脳透過性を持っているため、化合物103が急性期虚血再灌流脳卒中に続く神経炎症媒介の二次脳損傷を抑制することにより脳卒中の治療に有効であるかどうかを確認するために、虚血性脳卒中のげっ歯類モデルにおける化合物103の概念実証研究が実施された。

MCAO虚血再灌流モデル
ポジティブコントロールとして、脳卒中後の患者の回復を助けるために使用される臨床的に承認されたファースト・イン・クラスの薬剤であるエダラボンを使用した。

簡潔には、体重240～270gのSD雄性ラットを、7日間の再灌流によるMCAO研究に使用した。限局性脳虚血は、右中大脳動脈(MCA)の閉塞によって誘発された。首の正中切開を行い、右総頸動脈、内頸動脈および外頸動脈を露出させた。総頚動脈にスリップノット、外頚動脈近位側にデッドノット、総頚動脈分岐付近の外頸動脈にスリップノットを絹糸で結んだ。外頸動脈の2つの結び目の間の小さな開口部を切り取り、糸プラグを頸動脈に挿入し、中大脳動脈の内側に進めた。プラグを60分間留置した後、血管から引き抜き、血液供給を回復させた。12時間の再灌流後、マウスに2、5、10mg/kgの化合物103またはビヒクルを12時間毎に7日間腹腔内注射した。参照コントロールとして、エダラボン5mg/kgを7日間毎日腹腔内投与した。梗塞面積の評価は、前頭極から始まる全脳切片(厚さ2mM)の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色によって行い、スキャンされた画像をImageJで分析した。

神経学的行動評価
動物を、表18に記載のスコアリング法に基づいて個別に評価した。

結果および考察
腹腔内注射により1日2回投与された化合物103は、梗塞体積を効果的に減少させ、10mg/kgでほぼ50%減少させ、ポジティブコントロールであるエダラボン(5mg/kg)よりも効果的であった(図8A)。18ポイントシステムを用いた神経学的行動評価は、化合物103がエダラボンよりも効果的に神経学的行動スコアを改善することを示唆した(図8B)。

ミクログリアおよび白血球マーカーの免疫組織化学分析
動物をイソフルラン(RWD Life Science)で麻酔し、4% PFA(Sinopharm Chemical Reagent)で灌流し、固定した。脳組織をさらに4% PFAに4℃で4時間一晩浸漬し、その後、スクロース溶液(20～30%、Sinopharm Chemical Reagent)の勾配で処理した後、OCT(Leica)で包埋し、-80℃で凍結した。免疫蛍光染色では、一次体性感覚野(S1)、一次運動野(M1)、海馬CA1野(CA1)および尾状核被殻(線条体、CPu)の脳切片を30分間加熱し、その後、0.01M PBSで洗浄した(pH=7.2～7.4、5分×3)。洗浄後、切片を10%羊血清(Solarbio)中の0.3% TritonX-100(Solarbio)を用いて室温で1時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去した後、脳切片を一次抗体Iba1(Proteintech、Cat. 10904-1-AP)およびCD11b(Thermo Fisher、Cat. MA5-17857)と共に4℃で一晩インキュベートした。0.01MのPBSで3回洗浄した後(各5分)、切片をBacklight＋二次抗体(Abcam、Cat. ab150113；Cat. ab150080)と共に室温で２時間インキュベートした。3回洗浄した後、核を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、Beyotime Biotech、Cat. C1006)で染色した。脳全体の切片の画像は、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM、Leica STELLARIS 5、ドイツ)によって取得した。ミクログリアを視覚化するために、Iba1(ミクログリアで発現され、ミクログリアの活性化中に上方制御される17 kDaのEFハンドタンパク質)とCD11b(ミクログリアを含む自然免疫細胞の表面に高度に発現するインテグリン受容体のα鎖CD11b/CD18(αMβ2、Mac-1、および CR3としても知られる))の2つのマーカーを使用した。Iba1⁺CD11b⁺ 二重陽性ミクログリアの数をImage J V1.8.0で分析した。ミクログリア／マクロファージの活性化を、切片当たりのIba1およびCD11b共局在細胞の数として示す。

結果および考察
化合物103による処置は、MCAOまたはビヒクル群と比較して、7日目にCA1、CPu、M1およびS1の脳領域におけるIba1⁺CD11b⁺ 二重陽性ミクログリアの数を有意に減少させた(図9)。化合物103は、再灌流の12時間後にラットに投与を開始すると、CD11bミクログリアのミクログリア活性化を減少させた。

要約すると、我々のシリーズの他の類似体と比較して、化合物103は血漿タンパク質への結合が少なく、cLogP値が低く、より溶けやすく、単回投与後、血漿よりも脳内に高濃度で蓄積し、25および50mg/kg/BIDを毎日14日間繰り返し投与しても、異常な臨床症状または死亡は生じない。さらに、探索的概念実証研究において、化合物103は、虚血／再灌流脳卒中のラットモデルにおいて、梗塞体積の減少、ミクログリアの活性化、および神経学的および行動スコアの改善に有効であった。

Claims (27)

1. 式(I)：
   

   

   [式中、
   R₁は、H、ハロ、CF₃、CNまたはNO₂から選択される；
   R₂およびR₃は独立して、H、ハロ、CH₃、CF₃、CNまたはNO₂から選択される；
   R₄は、H、ハロ、CNまたはCF₃から選択される；
   R₅およびR₆は独立して、R_9aC(O)O-、R_9bOC(O)-、R_9cC(O)NRd-、R_9eR_9fNC(O)-、または炭素原子が分枝状または非分枝状であり、非置換であるか、またはハロおよびNO₂から選択される1つまたは複数の置換基で置換される1～10個の炭素原子を有するアルキルケトンから選択される；
   R₇およびR₈は独立して、H、NR_10aR_10b、OR_10c、または非置換であるか、またはハロから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるC₁～C₃アルキルから選択されるか、あるいは
   R₅およびR₇またはR₆およびR₈のペアの1つは、それらが結合する炭素原子と一緒になって、炭素環式または複素環式であり、非置換であるか、またはハロ、=O、-OC(O)R_10d、-(O)COR_10e、およびC₁～C₆アルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換される4～14員の環系を形成する；
   R_9a～R_9fおよびR_10a～R_10eは独立して、H、および非置換であるか、またはハロから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるC₁～C₆アルキルから選択される]
   で示される化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
2. R₁が、H、F、Cl、Br、CF₃またはNO₂から選択される、請求項1に記載の化合物。
3. R₂およびR₃が独立して、H、F、Cl、Br、CH₃、CF₃またはNO₂から選択される、請求項1または請求項2に記載の化合物。
4. R₄が、H、F、Cl、Br、またはCF₃から選択される、前記請求項のいずれか1つに記載の化合物。
5. R₅およびR₆が独立して、R_9aC(O)O-、R_9bOC(O)-、または炭素原子が分枝状または非分枝状であり、非置換であるか、またはCl、F、およびNO₂から選択される1つまたは複数の置換基で置換される1～10個の炭素原子を有するアルキルケトンから選択される、前記請求項のいずれか1つに記載の化合物。
6. R₇およびR₈が独立して、H、または非置換であるか、またはFおよびClから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるC₁～C₃アルキルから選択されるか、あるいは
   R₅およびR₇またはR₆およびR₈のペアの1つは、それらが結合する炭素原子と一緒になって、炭素環式または複素環式であり、非置換であるか、またはF、Cl、=O、およびC₁～C₆アルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換される4～10員の環系を形成する、前記請求項のいずれか1つに記載の化合物。
7. R_9a～R_9fおよびR_10a～R_10eが独立して、H、および非置換であるか、またはFおよびClから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるC₁～C₃アルキルから選択される、前記請求項のいずれか1つに記載の化合物。
8. R₁が、H、F、Cl、またはCF₃から選択される；
   R₂およびR₃が独立して、H、F、Cl、またはCF₃から選択される；
   R₄が、H、F、Cl、またはCF₃から選択される；
   R₅およびR₆が独立して、R_9bOC(O)-、炭素原子が非置換であるか、またはClおよびFから選択される1つまたは複数の置換基で置換される1～3個の炭素原子を有するアルキルケトンから選択される；
   R₇およびR₈が独立して、H、または非置換であるか、またはFおよびClから選択される1つまたは複数の置換基で置換されるメチルから選択される、前記請求項のいずれか1つに記載の化合物。
9. R₁が、H、F、またはClから選択される；および／または
   R₂が、CF₃から選択されるか、または特にHまたはF選択される；および／または
   R₃が、HまたはCF₃から選択される；および／または
   R₄が、Hである；および／または
   R₅およびR₆が独立して、CH₃OC(O)-またはプロパン-2-オニル(たとえば、R₅およびR₆が両方ともCH₃OC(O)-)である；および／または
   R₇およびR₈が独立して、HおよびCH₃から選択される、前記請求項のいずれか1つに記載の化合物。
10. R₇およびR₈ の少なくとも1つが、Hである、前記請求項のいずれか1つに記載の化合物。
11. R₇およびR₈の両方が、Hである、前記請求項のいずれか1つに記載の化合物。
12. R₇がHであり、R₈がCH₃である、請求項1～10のいずれか1つに記載の化合物。
13. R₇およびR₈が両方ともCH₃である、請求項1～10のいずれか1つに記載の化合物。
14. R₇がCH₃であり、R₈がHである、請求項1～10のいずれか1つに記載の化合物。
15. 以下のリスト：
    

    

    

    から選択される、前記請求項のいずれか1つに記載の化合物、またはその塩および溶媒和物。
16. 以下のリスト：
    

    

    

    から選択される、前記請求項のいずれか1つに記載の化合物、またはその塩および溶媒和物。
17. 以下のリスト：
    

    

    から選択される、前記請求項のいずれか1つに記載の化合物、またはその塩および溶媒和物。
18. 以下のリスト：
    

    

    から選択される、前記請求項のいずれか1つに記載の化合物、またはその塩および溶媒和物。
19. 化合物が、
    

    

    である、前記請求項のいずれか1つに記載の化合物、またはその塩および溶媒和物。
20. 請求項1～19のいずれか1つに記載の式(I)で示される化合物、またはその塩および溶媒和物を、薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルと組み合わせて含む医薬組成物。
21. 薬剤における使用のための、請求項1～19のいずれか1つに記載の式(I)で示される化合物、またはその塩および溶媒和物。
22. K_Ca3.1の増加または活性の変化に関連する病状の治療または予防における使用のための、請求項1～19のいずれか1つに記載の式(I)で示される化合物、またはその塩および溶媒和物。
23. K_Ca3.1の増加または活性の変化に関連する病状の治療または予防のための薬剤の製造における使用のための、請求項1～19のいずれか1つに記載の式(I)で示される化合物、またはその塩および溶媒和物。
24. K_Ca3.1の増加または活性の変化に関連する病状の治療または予防のための方法であって、それを必要とする患者に、請求項1～19のいずれか1つに記載の式(I)で示される化合物、またはその塩および溶媒和物の有効量を投与することを含む、方法。
25. K_Ca3.1の増加または活性の変化に関連する病状が、炎症性腸疾患(IBD)、線維性疾患(肺、肝臓、腎臓、心臓、結膜、角膜)、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、神経膠腫(神経膠芽腫)、肺がん、膵臓がん、肝細胞がん、卵巣がん、結腸直腸がん、嚢胞性線維症、糖尿病性腎疾患、糸球体腎炎、骨吸収、炎症性関節炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、ステント内新生アテローム性動脈硬化症、脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、遺伝性乾赤球症、鎌状赤血球貧血、白血病、喘息、アレルギー性鼻炎、ミクログリア活性化、一酸化窒素依存性神経変性(nitric oxide-dependent neurodegeneration)、神経腫瘍疾患および希少赤血球障害(orphan red blood cell disorders)の1つまたは複数から選択される、請求項19に記載の使用、請求項20に記載の使用または請求項21に記載の方法のための化合物。
26. K_Ca3.1の増加または活性の変化に関連する病状が、炎症性腸疾患(IBD)、線維性疾患(肺、肝臓、腎臓、心臓、結膜、角膜)、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、神経膠腫(神経膠芽腫)、肺がん、膵臓がん、肝細胞がん、卵巣がん、結腸直腸がん、嚢胞性線維症、糖尿病性腎疾患、糸球体腎炎、骨吸収、炎症性関節炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、ステント内新生アテローム性動脈硬化症、脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、遺伝性乾赤球症、鎌状赤血球貧血、白血病、喘息、アレルギー性鼻炎、ミクログリア活性化および一酸化窒素依存性神経変性(nitric oxide-dependent neurodegeneration)の1つまたは複数から選択される、請求項25に記載の使用、使用または方法のための化合物。
27. 病状が、脳卒中である、請求項26に記載の使用、使用または方法のための化合物。

Images