KR20230132190A

KR20230132190A - 식물줄기세포 배양추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20230132190A
Application number: KR1020220029400A
Authority: KR
Inventors: 엄승민; 김범준
Original assignee: 엄승민; 주식회사 아이젤
Priority date: 2022-03-08
Filing date: 2022-03-08
Publication date: 2023-09-15
Also published as: WO2023172023A2; WO2023172023A3

Abstract

본 발명은 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는 세포막 지질 성분과 물을 고압유화장치를 통해 지질복합체의 페이스트를 형성시킨 뒤, 상온에서 식물줄기세포 배양추출물과 유산균 엑소좀 수용액에 지질복합체를 넣고 역마이셀 (reverse micelle) 에멀젼을 상전환시켜 안정화시킨 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

식물줄기세포 배양추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic Composition Containing Plant Stem Cell Culture Extracts and Lactobacillus Exosome Stabilized In Osmocell As Active Ingredient}

본 발명은 식물줄기세포 배양추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 노화가 진행되기 전에는 피부세포의 생리활성이 활발하여 진피(Dermis)에 있는 섬유아세포(fibroblast)에서는 피부의 탄력 및 주름형성 억제에 중요한 콜라겐(collagen)의 합성과 신진대사가 왕성하며 또한 피부수분유지에 필수적인 히아루론산(Hyaluronic acid)을 포함한 당단백질류인 GAGS(Glucosaminoglycans) 합성도 활발하여 피부에 탄력성, 부드러움, 유연성 및 보습성을 부여한다. 또한 표피(Epidermis)에서는 기저세포(basal layer cell)의 증식(proliferation)이 활발하고, 피부세포간의 결합을 강화시키는 라미닌, 인테그린, 데스모좀과 같은 결합단백질(Adhesion protein)의 생성이 균형적으로 이루어져 피부 세포조직을 강화시켜 건강한 피부를 유지해 준다. 그러나 현대인의 피부는 외부의 각종 유해 환경 및 스트레스에 노출되어 다양한 손상을 받고 있고, 나이가 들면서 피부의 생리활성이 저하되고 손상된 피부의 회복속도가 느려지면서 피부는 탄력저하, 건조, 주름형성, 색소침착, 검버섯, 칙칙함 등의 다양한 피부노화 현상이 나타난다. 따라서 화장료의 가장 큰 목표는 이런 노화증세를 개선하는데 있고, 이를 위한 다양한 화장료가 개발되고 있다.

일반적으로, 피부탄력 감소, 피부주름, 색소침착 등의 피부노화현상은 콜라겐의 파괴, 콜라겐 합성의 감소, 엘라스틴의 소실 및 피부생리 저하에 따른 멜라닌 색소침착 등에 의해서 나타나는 것으로서, 피부 표피와 진피에서 일어나는 현상이라고 볼 수 있다. 최근, 피부 노화방지에 대한 피부 생리학적 연구가 많이 행해지고 있으며, 실제로 화장료에 있어서 피부주름방지를 위해 자외선 차단제, 항산화제, 세포활성촉진제 등이 사용되고 있고, 또한 콜라겐 합성에 따른 피부 주름개선 방법들이 제시되고 있다. 한편, 생화학 및 분자생물학의 발전을 기반으로 하여 우리 생체 내에 존재하는 성장인자와 같은 소량의 신호물질들이 발견되었으며, 이를 기반으로 한 생체의 노화이론이 재정립되고 있는 중이다. 또한 이 신호물질은 나이가 증가함에 따라 생체 내에서 감소하게 되는데 바로 이 성장인자의 감소가 우리의 노화와 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀지고 있다. 이러한 성장인자들은 각 조직의 기저에 존재하고 있는 줄기세포에서 다량 생산되고 있다.

화장품 분야에서의 줄기세포의 이용은 그 대사산물로서의 성장인자를 이용하는 것이다. 성장인자들은 세포의 표면에 있는 수용체와 결합하여 세포의 증식과 분화를 자극하는 작용을 하는 단백질이다. 성장인자들의 기능은 매우 다양하여 여러 가지 세포에 분열을 자극하는 작용을 하기도 하는 반면, 어떤 경우에는 특이한 세포형에만 작용하기도 한다. 성장인자는 세포 증식의 자극을 위해서 필수적인 성분으로서 세포 분화, 이주, 증식과정을 조절한다는 것이 밝혀졌다. 특이적 수용체에 성장인자가 결합하게 되면 신호 전달 사슬을 활성화하여 세포의 외부로부터 내부의 핵으로 신호가 전달된다. 신호 전달이 계속되면 다량의 다른 전달자와 같이 작용하여 최종적으로 새로운 단백질이 합성된다. 그러므로 성장인자는 세포간 상호작용의 전달, 기능 제어에 있어서 중요한 신호 전달 네트워크를 형성하게 된다. 또한 생쥐를 대상으로 한 피부 상처 재생 실험 결과에서도 줄기세포 유래 단백질을 적용했을 때 적용하지 않은 경우보다 상처 크기가 40%이상 줄어드는 것을 확인할 수 있다. 아울러 색소침착 현상을 갖고 있는 피검자를 대상으로 한 미백효과에서도 좋은 결과를 보여 화장품 원료로서 강한 효과가 규명되고 있지만 윤리적인 문제와 안전성에 대한 문제는 해결해야 할 과제이다.

대한민국 특허출원 제2005-55017호에는 동종유래 및/또는 자기유래 지방세포, 동종유래 및/또는 자기유래지방세포로부터 분리한 줄기세포 또는 이들로부터 분리된 섬유아세포성장인자를 함유하는 주름개선 및/또는 노화방지용 함유하는 화장료 조성물이 공지되어 있으며, 대한민국 특허등록 제848056호 발명은 줄기세포 배양액 또는 그 배양액에서 분리된 단백질을 포함하는 미백용 화장료 조성물이 공지되어 있고, 대한민국 특허출원 제2007-15211호에는 인간 지방 줄기세포를 항산화제, 비타민, 아미노산 및 무기질이 포함된 무혈청 배지에서 1일 이상 배양하여 수득한 조건배지를 함유하고, 조직 재생용 인간 줄기세포 함유 주사제에 사용되는 주사제용 첨가제가 공지되어 있다.

하지만 이런 인체 유래 줄기세포는 안전성이 확보되지 않아 화장료 조성물에 안전하게 사용하는데 여전히 한계가 있고, 특별히 윤리적인 문제가 남아 있어 향 후 그 사용에 많은 제약을 갖고 있을 뿐만 아니라, 인체유래 줄기세포 배양액 추출물 내에 함유되어 있는 다양한 유효성분, 좀 더 구체적으로는 다양한 세포 성장인자들의 피부 침투에 어려움이 있어 의학적인 치료목적에 우수한 효과를 보이는 것과는 달리 화장료로서 정상인의 피부에서는 그 효과에 한계가 있다. 따라서 현재 피부 노화 현상을 개선시키기 위해 피부과 영역에서는 직접 피부 안으로 인체유래 줄기세포 배양액 추출물을 주사 하거나 피부에 특수한 기구를 활용하여 미세한 통로(Hole)를 만들어 피부 침투를 유도하고 있지만 이 과정에서 다양한 피부 안전성의 문제점을 갖고 있어 이 방법을 화장료로 활용하는 것은 어려움이 있다.

식물에도 줄기세포가 있으며, 식물줄기세포도 인간줄기세포와 마찬가지로 강한 분화능력과 재생능력이 있다. 또한 인간줄기세포와 같은 윤리적 문제나 안전성 문제가 없어, 최근에 식물줄기세포의 활용에 대한 관심이 점점 높아지고 있다.

식물에는 싹 말단 생장점 (SAM, shoot apical meristem)과 뿌리 말단 생장점 (RAM, root apical meristem)에 줄기세포가 존재한다. 이 식물줄기세포는 고유의 성격대로 분화하여 뿌리와 줄기 등과 같은 식물의 조직과 기관을 새롭게 만드는 기능을 한다. 이러한 식물줄기세포를 다능성 (pluripotent) 줄기세포로 분류하는데, 전형적인 기능을 통하여 다양한 기관을 형성할 능력을 가지고 있다는 개념이다. SAM과 RAM에 존재하는 줄기세포는 분화를 통하여 식물의 성장을 이룩하는데, 줄기세포의 분화 및 줄기세포 밀도를 유지하는 것은 SAM과 RAM에서 이웃하고 있는 OC (organizing center) 또는 QC (quiescent center) 세포들과의 관계에 의하여 조절된다. 식물은 동물과 달리 전분화능력 (totipotency)이 있음은 1902년 호주의 식물학자 하버란트(Gottlieb Haberlandt)에 의하여 밝혀졌다. 식물의 전분화능은 식물세포가 다른 type의 세포나 식물체 전체로 분화할 수 있는 능력을 말한다.

식물체를 탈분화(de-differentiation)시켜, 미분화(un-differentiated) 세포인 캘러스(callus)를 얻을 수 있다. 식물체를 표면살균하고 잘라 상처를 내고, 적절한 식물호르몬 농도를 함유한 고체배지(solidified medium)에서 배양하면 캘러스 세포를 얻을 수 있다. 캘러스 세포는 그 상태로 계속 배양하거나, 액체배지에서 배양하여 현탁배양(suspension culture)을 이룰 수 있으며, 이를 통하여 많은 양의 세포를 얻을 수 있다. 캘러스 세포는 배지의 식물호르몬 농도 조절을 통하여 배(embryo)를 발생시키고, 다시 뿌리나 싹을 형성시킬 수 있다. 이렇게 발생한 배(embryo)나 싹, 뿌리는 발아 또는 성장을 통하여 완전한 식물체로 발전한다. 따라서 미분화 세포인 캘러스 세포는 줄기세포의 능력을 가지고 있어 줄기세포라 불릴 수 있다. 세포 치료 대상 세포로서의 응용적 측면에서 볼 때, 중간엽 줄기세포는 세포의 채취가 상대적으로 쉽고 안전하며 자가 이식이 가능하다는 점에서 배아줄기세포에 비해 많은 장점을 가지고 있다.

본 발명에 있어서, 식물줄기세포인 캘러스(callus)는 식물체에 상처가 났을 때, 세포가 분열 능력을 회복하여 상처를 막고 비대하여 지는 유상조직으로, 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하거나, 어떤 종류의 식물에 상처를 내거나, 상처 부위를 옥신으로 처리하거나 할 때에 생기는 미분화 조직 또는 세포덩어리를 말하는 것으로서, 새로운 배지에 계대 배양함으로써 영구적으로 분열 및 증식을 할 수 있다.

아울러 EGF(표피세포성장인자), vEGF(혈관내피성장인자), TGF(형질전환성장인자), HGF(간세포증식인자), FGF(섬유아세포성장인자), IGF(인슐린유사성장인자) 등 150여 가지의 성장인자(growth factor) 단백질 성분을 함유하고 있는 엑소좀에 대한 관심이 높아지고 있다.

엑소좀이란 미생물에서부터 인간에 이르는 모든 세포에서 세포 밖으로 분비되는 세포간 의사소통 물질로서 세포 밖 소포체(extracellular vesicles)에서 50~200nm 나노 크기의 물질이다. 이러한 나노 크기의 엑소좀은 물에 녹지 않는 막 단백질을 수송할 수 있다. 막 단백질이란 인지질 이중막에 있는 단백질로 소수성이기 때문에 기본적으로는 혈액에 의한 세포간 전달이 어렵다. 이에 반해 엑소좀은 인지질 이중막으로 이루어져 있어 막 단백질을 수송할 수 있다(등록특허 10-2253418). 또한, 엑소좀은 내용물을 인지질 이중막으로 둘러싸는 것을 통하여 외부의 분해 물질로부터 그 내용물을 보호할 수 있다는 것이다. 대표적인 예로 RNA 수송 기전을 들 수 있다. 세포 밖에 존재하는 RNA는 분해되는 반면에 엑소좀 안에 존재하는 RNA는 이들 물질로부터 보호되어 표적 세포로 원활하게 전달될 수 있다. 엑소좀을 수득하기 위한 방법과 관련된 기술로는, 한국등록특허 제10-2125567호「식물 엑소좀의 대량 생산 방법」, 한국등록특허 제10-2047768호「중간엽줄기세포 유래 고순도, 고농도 엑소좀을 포함하는 배양액 및 이의 제조방법」, 한국등록특허 제10-1895916호「엑소좀 및/또는 세포외 소포체 및 이를 포함하는 조성물의 제조 방법」, 한국등록특허 제10-1980482호「엑소좀을 분리하기 위한 다중 컬럼 및 엑소좀 분리 방법」 등이 있다.

이에 본 발명자들은 피부 노화방지를 개선하는 물질을 찾고자 예의 노력하던 중 인체 유래 줄기세포의 배양액 추출물이 갖고 있는 윤리적, 안전성의 문제를 극복하고 인체유래 줄기세포 배양액 추출물 내에 함유되어 있는 다양한 세포 성장인자들의 피부 침투가 어려워 정상인의 피부에서는 그 효과가 한계가 있는 문제점을 극복하고, 인체 유래 줄기세포 배양액의 유효성분에 부합되는 성분을 함유하고 있는 식물줄기세포배양 추출물과 인체 유래 줄기세포 배양액 내의 유효성분인 EGF(표피세포성장인자), vEGF(혈관내피성장인자), TGF(형질전환성장인자), HGF(간세포증식인자), FGF(섬유아세포성장인자), IGF(인슐린유사성장인자) 등 150여 가지의 성장인자(growth factor) 단백질 성분을 함유하고 있는 유산균 엑소좀이 피부 주름, 탄력저하, 수분 함유량 감소 및 색소침착과 같은 피부노화현상을 개선시키는 효과가 매우 우수하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀을 유효성분으로 함유하는 피부 노화방지 효과와 피부트러블 개선에 탁월한 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

상기한 과제는, 포스포리피드, 피토스핑고신, 세라마이드 엔피, 콜레스테롤, 피토스테롤, 베타-시토스테롤 및 스쿠알렌으로 이루어진 지질복합체에 식물줄기세포 배양 추출물 및 유산균 엑소좀이 내포되어 있는 오스모셀을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

바람직하게는, 상기 식물줄기세포 배양추출물은 산삼 줄기세포 배양추출물, 은행나무 줄기세포 배양추출물, 회화나무 줄기세포 배양추출물, 녹차 줄기세포 배양추출물, 에델바이스 줄기세포 배양추출물, 포도 줄기세포 배양추출물, 토마토 줄기세포 배양추출물, 장미 줄기세포 배양추출물, 알로에 줄기세포 배양추출물, 및 벼 줄기세포 배양추출물로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상을 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 유산균 엑소좀은 락토바실러스 플란타럼 배양액에서 분리될 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 오스모셀은 오스모셀 총 중량에 대하여, 지질복합체 0.1 내지 10 중량%, 식물줄기세포 배양 추출물 0.01~50.0 중량%, 유산균 엑소좀 0.00001~1.0 중량% 및 잔량의 정제수를 함유하고, 상기 지질복합체는 지질복합체 총 중량 대비 포스포리피드 0.1~30.0 중량%, 피토스핑고신 0.01~20.0 중량%, 세라마이드 엔피 0.01~30.0 중량%, 콜레스테롤 0.01~10.0 중량%, 피토스테롤 0.01~10.0 중량%, 베타-시토스테롤 0.01~10.0 중량% 및 스쿠알렌 0.01~90.0 중량%를 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 오스모셀은 전체 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001~100.0 중량%가 함유될 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 오스모셀은 포스포리피드, 피토스핑고신, 세라마이드 엔피, 콜레스테롤, 피토스테롤, 베타-시토스테롤 및 스쿠알렌을 고압에서 용해하여 반투명 젤 형태의 지질복합체를 만드는 단계 및 상온에서 상기 지질복합체, 상기 식물줄기세포 배양 추출물 및 상기 유산균 엑소좀을 혼합하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 피부 주름개선 효과, 미백 효과, 피부 탄력개선 효과를 갖는다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하고 안정화된 오스모셀을 유효성분으로 포함하여, 기존 리포좀에 내포된 화장료보다 피부 전달효과가 우수하여 보다 우수한 피부 노화방지 및 피부트러블 개선 효과를 갖는다. 또한 상온에서 유효성분을 오스모셀에 안정화시키기 때문에 유효성분의 열에 의한 파과를 방지하여 화장료의 효과를 극대화할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 함유한 오스모셀의 입자 분포를 나타낸 것이다.
도 2는 제조예 1에서 제조된 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 함유한 오스모셀의 SEM 사진이다.

본 발명은 피부 노화현상 및 피부트러블을 개선시키는 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀(OSMOCELL)을 함유하는 피부노화방지용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 피부노화방지란, 포괄적으로 주름개선, 피부미백 및 탄력 증진 효과를 포함하는 의미로 사용되며 피부트러블 개선은 피부에서 발생하는 홍반, 부종, 가려움과 같은 피부 염증 증상을 완화하는 의미로 사용된다.

본 발명은 식물줄기세포 배양 추출물 및 유산균 엑소좀이 내포되어 있는 오스모셀을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 식물줄기세포 배양추출물은 산삼 뿌리, 은행나무 줄기, 회화나무 줄기, 녹차 줄기, 에델바이스 꽃, 포도 줄기, 토마토 열매, 장미 꽃, 알로에 줄기 및 벼 줄기 표면을 살균하고 잘라 상처를 내고, 적절한 식물호르몬 농도를 함유한 고체배지 (solidified medium)에서 배양하여 캘러스 세포를 유도하고, 유도된 캘러스 세포를 액체배지에서 배양하여 현탁배양 (suspension culture) 하여 얻어진 것이다. 본 발명의 식물줄기세포 배양 추출물은 산삼줄기세포(캘러스), 은행나무줄기세포(캘러스), 회화나무줄기세포(캘러스), 녹차줄기세포(캘러스), 에델바이스줄기세포(캘러스), 포도줄기세포(캘러스), 토마토줄기세포, 장미 꽃, 알로에줄기세포(캘러스) 및 벼줄기세포(캘러스)를 분쇄한 후, 압착 및 여과하여 얻어진 산삼 줄기세포 배양추출물, 은행나무 줄기세포 배양추출물, 회화나무 줄기세포 배양추출물, 녹차 줄기세포 배양추출물, 에델바이스 줄기세포 배양추출물, 포도 줄기세포 배양추출물, 토마토 줄기세포 배양추출물, 장미 줄기세포 배양추출물, 알로에 줄기세포 배양추출물, 및 벼 줄기세포 배양추출물이다.

본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 식물줄기세포 배양추출물은 아래의 방법으로 제조할 수 있다. 먼저, 상기 식물의 꽃, 줄기, 열매 또는 뿌리를, 70 %(v/v) 에탄올에 30초간 침지시키고, 2 %(v/v) 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하여 표면을 소독한다. 이어서, 상기 식물의 꽃, 줄기, 열매 또는 뿌리의 표면을 날카로운 칼로 상처를 낸 후 잘라서 IAA(indole-3-acetic acid) 0.5㎎/L, 제아틴(Zeatin) 0.2㎎/L의 생장조절물질과 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0g/L를 함유한 M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 위에 치상하여 접종한 후 25±2℃의 암조건 배양실에서 4주간 배양하여 줄기세포를 유도한다. M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 식물호르몬인 옥신과 싸이토카인 농도를 배지에 0.01mg/L 내지 10mg/L로 바람직하게는 0.1mg/L 내지는 1mg/L로 적절하게 적용하여 식물 줄기세포인 캘러스 유도를 극대화하였다. 유도된 Totipotent embryogenic Stem Cell인 캘러스 양을 극대화하기 위해 성장속도를 높일 수 있는 액체배양을 암조건에서 2주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다. 액체배양을 위한 현탁배양기(Gyrotory Shaker)에는 위에서 언급한 M&S 액체배지를 이용하여 유도된 캘러스를 0.1g/L 내지 20g/L, 바람직하게는 1g/L 내지 5g/L로 접종하여 현탁배양을 통하여 많은 양의 줄기세포(캘러스)를 확보할 수 있고, 증식된 캘러스를 마지막 계대배양 단계에서 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지를 활용하여 상기 현탁배양기에서 25±2℃의 암조건에서 배양하였다. 대량생산을 위해서는 Bioreactor를 활용하는 것도 좋은 방안이다. 이렇게 얻어진 식물 줄기세포를 2~3회 정제수로 세척하여 배지 성분을 제거하고 저온에서 식물 줄기세포(캘러스)를 냉동 Stock 용기 내에서 호모게나이저를 이용하여 8,000~15,000 rpm 조건으로 2~3분간 고속 분쇄하고, 분쇄하여 압착추출한 식물 캘러스를 여과지를 이용하여 감압 여과하여 본 발명의 식물 줄기세포(캘러스)배양추출물을 얻는다.

본 발명의 유산균 엑소좀은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus Salivarius), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 및 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 등 장내 유산균 중에서 피부에도 존재하는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)을 멸균 우유에서 48시간 동안 배양하고, 그 배양액으로부터 분리한 것이다.

본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 유산균 엑소좀은 유산균인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)을 멸균 우유에 혼합하여 48시간 동안 배양하고, 유산균 배양액을 원심분리기를 이용하여 1,500~2,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등 배양액만을 취하여 유산균을 분리 및 제거하고, 다시 상등 배양액을 초고속 원심분리기를 이용하여 10,000~15,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등액을 취하여 유산균 및 잔여물을 분리 및 제거하며, 다시 상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 100,000~150,000g로 2~4시간 동안 원심분리 후, 엑소좀을 펠렛층에 가라앉힌 뒤 파이펫 및 볼텍스를 이용해 펠렛층을 PBS에 재부유시켜 엑소좀을 얻을 수 있다.

본 발명에서는 열에 불안정한 유효성분인 식물줄기세포배양 추출물 및 유산균 엑소좀을 안정화시키고 경피 흡수를 용이하게 하기 위해서 세포막을 구성하고 있는 지질 성분으로 구성된 지질복합체를 먼저 제조한 뒤 상온에서 열에 불안정한 식물줄기세포배양추출물과 유산균 엑소좀 내의 유효성분을 안정하게 포접하여 화장료에 함유시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 오스모셀은 기존의 리포좀이 레시틴 또는 레시틴 유사유화제, 유성성분 및 수성성분을 함유하여 이중막을 형성하는 것과는 달리, 피부 세포막을 구성하는 지질 성분만으로 구성되며, 상기 본 발명의 식물줄기세포배양추출물 및 유산균 엑소좀을 포접하여 세포막과 유사한 이중막 구조인 오스모셀(OSMOCELL)을 완성하였다.

본 발명의 오스모셀은 피부 침투가 용이하고 리포좀에 비해 수용성의 성분을 과량 내포할 수 있고 안정하다. 본 발명에서 오스모셀은 세포막을 구성하는 주요 지질 성분인 포스포리피드(Phospholipid), 피토스핑고신(Phytosphingosine), 세라마이드 엔피 (Ceramide NP), 콜레스테롤(Cholesterol), 피토스테롤(Phytosterol), 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 스쿠알렌(Squalene)을 사용하여 이중막의 베시클(Vesicle)을 형성하는 과정에 이 베시클 안에 본 발명의 생리활성 성분을 내포한 것을 의미한다. 이러한 오스모셀은 기존 리포좀들에 비해 좀 더 피부 친화적이며 안정적이다.

또한 오스모셀은 평균 소적 크기가 20 내지 500 nm이며, 바람직하게는 50 내지 250 nm이며, 가장 바람직하게는 100 내지 200nm인 나노화된 이중막의 베시클을 의미한다. 상기 오스모셀의 평균 소적 크기가 500nm를 초과하는 경우에는 피부 침투 및 제형 안정성이 매우 미약하다. 본 발명에서 오스모셀이란 용어는 본 발명의 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 포접하여 안정화시킨 나노화된 이중막의 베시클을 의미한다.

본 발명의 오스모셀은 다음의 방법으로 제조된다.

세포막을 구성하는 주요 지질 성분인 포스포리피드(Phospholipid), 피토스핑고신(Phytosphingosine), 세라마이드 엔피 (Ceramide NP), 콜레스테롤(Cholesterol), 피토스테롤(Phytosterol), 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 스쿠알렌(Squalene)을 고압유화장치(Microfludizer)를 활용하여 고압에서 용해하여 반투명 젤 형태의 지질복합체를 만든다. 다음으로 상온에서 이 지질복합체 적당량을 식물줄기세포배양 추출물과 유산균 엑소좀이 분산된 수용액에 넣고 섞어주면, 폐쇄된 이중층 구조를 가진 본 발명의 식물줄기세포배양 추출물과 유산균 엑소좀을 함유하는 오스모셀을 얻을 수 있다. 이때 반응 공정의 온도는 상온에서 진행된다. 기존의 고압유화장치(microfludizer)를 이용한 리포좀 제조공정이 고온(60℃ 이상)에서 리포좀이 형성됨으로 인해 온도에 민감한 성분들의 열 안정성을 확보할 수 없는 단점이 있었다. 본 발명은 지질복합체를 형성하는 재료를 혼합하기 위하여 고압유화장치를 사용하지만, 상기 종래기술의 리포좀 형성에 고압유화장치를 사용하는 것과는 다르다. 본 발명에서는 고압유화장치에서 용해되어 혼합된 지질복합체가 형성되고, 이들이 수용액 상(phase)에서 스스로 베시클을 형성하여 수용액 상에 분산되어 있는 유효성분, 즉 식물줄기세포배양 추출물과 유산균 엑소좀을 포접하여 오스모셀을 형성하게 된다.

상기 오스모셀은 오스모셀 총 중량에 대하여, 지질복합체 0.1 내지 10 중량%, 식물줄기세포 배양 추출물 0.01-50.0 중량%, 유산균 엑소좀 0.00001-1.0 중량% 및 잔량의 정제수를 함유한다.

보다 바람직하게는 상기 식물줄기세포 배양추출물의 함량은 오스모셀 총 중량에 대하여 0.1-10.0 중량%일 수 있고, 상기 유산균 엑소좀의 함량은 오스모셀 총 중량에 대하여 0.0005-0.1 중량% 함유한다.

또한, 상기 지질복합체는 포스포리피드, 피토스핑고신, 세라마이드 엔피, 콜레스테롤, 피토스테롤, 베타-시토스테롤 및 스쿠알렌으로 이루어질 수 있다. 상기 포스포리피드(phospholipid)는 지질복합체 총 중량에 대하여 0.1~30.0 중량% 함유되며, 바람직하게는 총 중량에 대하여 1.0~10.0 중량%로 함유된다. 피토스핑고신(Phytosphingosine)은 지질복합체 총 중량에 대하여 0.01~20.0 중량% 함유되며, 바람직하게는 총 중량에 대하여 0.1~5.0 중량%로 함유된다. 세라마이드 엔피 (Ceramide NP)는 지질복합체 총 중량에 대하여 0.01~30.0 중량% 함유되며, 바람직하게는 총 중량에 대하여 0.1~10.0 중량%로 함유된다. 콜레스테롤(Cholesterol)은 지질복합체 총 중량에 대하여 0.01-10.0 중량% 함유되며, 바람직하게는 총 중량에 대하여 0.1~5.0 중량%로 함유된다. 피토스테롤(Phytosterol)은 지질복합체 총 중량에 대하여 0.01~10.0 중량% 함유되며, 바람직하게는 총 중량에 대하여 0.1~5.0 중량%로 함유된다. 베타-시토스테롤(β-sitosterol) 함량은 지질복합체 총 중량에 대하여 0.01~10.0 중량% 함유되며, 바람직하게는 총 중량에 대하여 0.1~5.0 중량%로 함유된다. 스쿠알렌(Squalene) 함량은 지질복합체 총 중량에 대하여 0.01~90.0 중량% 함유되며, 바람직하게는 총 중량에 대하여 10.0~70.0 중량%로 함유된다.

본 발명에 따른 식물줄기세포배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀의 양은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.001~100.0 중량%이며, 바람직하게는 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 10.0~60.0 중량% 양으로 함유된다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 식물줄기세포배양 추출물과 유산균 엑소좀 이외에 생체 성분의 활성을 유지시켜주는 다양한 성분들, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명의 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이의 제형일 수 있다.

본 발명의 구체적인 예시에 따르면, 식물줄기세포배양 추출물과 유산균 엑소좀을 유효성분으로 포접한 오스모셀을 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 기존 리포좀을 포함하는 화장료보다 피부 전달효과가 우수하여 보다 우수한 피부 노화방지 및 피부트러블 개선효과를 가져올 수 있다. 또한 상온에서 유효성분을 오스모셀에 안정화시키기 때문에 유효성분의 열에 의한 안정성을 확보하여 화장료의 효능효과를 극대화할 수 있다.

이하에서 제조예와 실시예를 들어서 본 발명을 상세하게 설명하지만, 이러한 제조예와 실시예에 의하여 본 발명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화장료 조성물을 위해 아래 제조예와 같이 식물줄기세포배양추출물, 유산균 엑소좀 및 식물줄기세포배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀을 제조하였다.

제조예 1-1: 산삼(Panax Ginseng)줄기세포배양 추출물의 제조

본 발명의 산삼(Panax Ginseng)줄기세포배양 추출물은 산삼 뿌리로부터 줄기세포(캘러스)를 유도하기 위하여, 산삼 뿌리를 70 %(v/v) 에탄올에 30초간 침지시키고, 2 %(v/v) 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하여 표면을 소독하였다. 소독된 산삼 뿌리 표면을 날카로운 칼로 상처를 낸 후 잘라서 IAA(indole-3-acetic acid) 0.5㎎/L, 제아틴(Zeatin) 0.2㎎/L의 생장조절물질과 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0g/L를 함유한 M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 위에 치상하여 접종한 후 25±2℃의 암조건의 배양실에서 12주간 배양하여 산삼줄기세포를 유도하였다. M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 식물호르몬인 옥신과 싸이토카인 농도를 배지에 0.5mg/L로 적용하여 산삼줄기세포인 산삼 캘러스 유도를 극대화하였다. 유도된 Totipotent embryogenic Stem Cell인 산삼 캘러스 양을 극대화하기 위해 성장속도를 높일 수 있는 액체배양을 암조건에서 4주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다. 액체배양을 위한 현탁배양기(Gyrotory Shaker)에는 위에서 언급한 M&S 액체배지를 이용하여 유도된 산삼캘러스를 2.5g/L로 접종하여 현탁배양을 통하여 많은 양의 산삼 줄기세포(캘러스)를 확보할 수 있고, 증식된 산삼 캘러스를 마지막 계대배양 단계에서 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지를 활용하여 상기 현탁배양기에서 25±2℃의 암조건에서 배양하였다. 대량생산을 위해서는 Bioreactor를 활용하는 것도 좋은 방안이다. 이렇게 얻어진 산삼 줄기세포를 2회 정제수로 세척하여 배지 성분을 제거하고 저온에서 산삼 줄기세포(캘러스)를 냉동 Stock 용기 내에서 호모게나이저를 이용하여 10,000 rpm 조건으로 2분간 고속 분쇄하고, 분쇄하여 압착추출한 산삼 캘러스를 여과지를 이용하여 감압 여과하여 본 발명의 산삼 줄기세포(캘러스)배양추출물을 얻는다.

제조예 1-2: 은행나무(Ginkgo Biloba)줄기세포배양 추출물의 제조

본 발명의 은행나무(Ginkgo Biloba)줄기세포배양 추출물은 은행나무 줄기로부터 줄기세포(캘러스)를 유도하기 위하여, 은행나무 줄기를 70 %(v/v) 에탄올에 30초간 침지시키고, 2 %(v/v) 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하여 표면을 소독하였다. 소독된 은행나무 줄기 표면을 날카로운 칼로 상처를 낸 후 잘라서 IAA(indole-3-acetic acid) 0.5㎎/L, 제아틴(Zeatin) 0.2㎎/L의 생장조절물질과 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0g/L를 함유한 M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 위에 치상하여 접종한 후 25±2℃의 암조건 배양실에서 12주간 배양하여 은행나무 줄기세포를 유도하였다. M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 식물호르몬인 옥신과 싸이토카인 농도를 배지에 0.5mg/L로 적절하게 적용하여 은행나무 줄기세포인 은행나무 캘러스 유도를 극대화하였다. 유도된 Totipotent embryogenic Stem Cell인 은행나무 캘러스 양을 극대화하기 위해 성장속도를 높일 수 있는 액체배양을 암조건에서 4주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다. 액체배양을 위한 현탁배양기(Gyrotory Shaker)에는 위에서 언급한 M&S 액체배지를 이용하여 유도된 은행나무 캘러스를 2.5g/L로 접종하여 현탁배양을 통하여 많은 양의 은행나무 줄기세포(캘러스)를 확보할 수 있고, 증식된 은행나무 캘러스를 마지막 계대배양 단계에서 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지를 활용하여 상기 현탁배양기에서 25±2℃의 암조건에서 배양하였다. 대량생산을 위해서는 Bioreactor를 활용하는 것도 좋은 방안이다. 이렇게 얻어진 은행나무 줄기세포를 2회 정제수로 세척하여 배지 성분을 제거하고 저온에서 은행나무 줄기세포(캘러스)를 냉동 Stock 용기 내에서 호모게나이저를 이용하여 10,000 rpm 조건으로 2분간 고속 분쇄하고, 분쇄하여 압착추출한 은행나무 캘러스를 여과지를 이용하여 감압 여과하여 본 발명의 은행나무 줄기세포(캘러스)배양추출물을 얻는다.

제조예 1-3: 회화나무(Sophora Japonica)줄기세포배양 추출물의 제조

본 발명의 회화나무(Sophora Japonica)줄기세포배양 추출물은 회화나무 줄기로부터 줄기세포(캘러스)를 유도하기 위하여, 회화나무 줄기를 70 %(v/v) 에탄올에 30초간 침지시키고, 2 %(v/v) 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하여 표면을 소독하였다. 소독된 회화나무 줄기 표면을 날카로운 칼로 상처를 낸 후 잘라서 IAA(indole-3-acetic acid) 0.5㎎/L, 제아틴(Zeatin) 0.2㎎/L의 생장조절물질과 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0g/L를 함유한 M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 위에 치상하여 접종한 후 25±2℃의 암조건 배양실에서 12주간 배양하여 회화나무 줄기세포를 유도하였다. M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 식물호르몬인 옥신과 싸이토카인 농도를 배지에 0.5mg/L로 적절하게 적용하여 회화나무 줄기세포인 회화나무 캘러스 유도를 극대화하였다. 유도된 Totipotent embryogenic Stem Cell인 회화나무 캘러스 양을 극대화하기 위해 성장속도를 높일 수 있는 액체배양을 암조건에서 4주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다. 액체배양을 위한 현탁배양기(Gyrotory Shaker)에는 위에서 언급한 M&S 액체배지를 이용하여 유도된 회화나무 캘러스를 2.5g/L로 접종하여 현탁배양을 통하여 많은 양의 회화나무 줄기세포(캘러스)를 확보할 수 있고, 증식된 회화나무 캘러스를 마지막 계대배양 단계에서 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지를 활용하여 상기 현탁배양기에서 25±2℃의 암조건에서 배양하였다. 대량생산을 위해서는 Bioreactor를 활용하는 것도 좋은 방안이다. 이렇게 얻어진 회화나무 줄기세포를 2회 정제수로 세척하여 배지 성분을 제거하고 저온에서 회화나무 줄기세포(캘러스)를 냉동 Stock 용기 내에서 호모게나이저를 이용하여 10,000 rpm 조건으로 2분간 고속 분쇄하고, 분쇄하여 압착추출한 회화나무 캘러스를 여과지를 이용하여 감압 여과하여 본 발명의 회화나무 줄기세포(캘러스) 배양추출물을 얻는다.

제조예 1-4: 녹차(Camellia Sinensis)줄기세포배양 추출물의 제조

본 발명의 녹차(Camellia Sinensis)줄기세포배양 추출물은 녹차 줄기로부터 줄기세포(캘러스)를 유도하기 위하여, 녹차 줄기를 70 %(v/v) 에탄올에 30초간 침지시키고, 2 %(v/v) 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하여 표면을 소독하였다. 소독된 녹차 줄기 표면을 날카로운 칼로 상처를 낸 후 잘라서 IAA(indole-3-acetic acid) 0.5㎎/L, 제아틴(Zeatin) 0.2㎎/L의 생장조절물질과 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0g/L를 함유한 M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 위에 치상하여 접종한 후 25±2℃의 암조건 배양실에서 12주간 배양하여 녹차 줄기세포를 유도하였다. M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 식물호르몬인 옥신과 싸이토카인 농도를 배지에 0.5mg/L로 적절하게 적용하여 녹차 줄기세포인 녹차 캘러스 유도를 극대화하였다. 유도된 Totipotent embryogenic Stem Cell인 녹차 캘러스 양을 극대화하기 위해 성장속도를 높일 수 있는 액체배양을 암조건에서 4주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다. 액체배양을 위한 현탁배양기(Gyrotory Shaker)에는 위에서 언급한 M&S 액체배지를 이용하여 유도된 녹차 캘러스를 2.5g/L로 접종하여 현탁배양을 통하여 많은 양의 녹차 줄기세포(캘러스)를 확보할 수 있고, 증식된 녹차 캘러스를 마지막 계대배양 단계에서 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지를 활용하여 상기 현탁배양기에서 25±2℃의 암조건에서 배양하였다. 대량생산을 위해서는 Bioreactor를 활용하는 것도 좋은 방안이다. 이렇게 얻어진 녹차 줄기세포를 2회 정제수로 세척하여 배지 성분을 제거하고 저온에서 녹차 줄기세포(캘러스)를 냉동 Stock 용기 내에서 호모게나이저를 이용하여 10,000 rpm 조건으로 2분간 고속 분쇄하고, 분쇄하여 압착추출한 녹차 캘러스를 여과지를 이용하여 감압 여과하여 본 발명의 녹차 줄기세포(캘러스)배양추출물을 얻는다.

제조예 1-5: 에델바이스(Leontopodium Alpinum)줄기세포배양 추출물의 제조

본 발명의 에델바이스(Leontopodium Alpinum)줄기세포배양 추출물은 에델바이스 꽃으로부터 줄기세포(캘러스)를 유도하기 위하여, 에델바이스 꽃을 70 %(v/v) 에탄올에 30초간 침지시키고, 2 %(v/v) 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하여 표면을 소독하였다. 소독된 에델바이스 꽃 표면을 날카로운 칼로 상처를 낸 후 잘라서 IAA(indole-3-acetic acid) 0.5㎎/L, 제아틴(Zeatin) 0.2㎎/L의 생장조절물질과 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0g/L를 함유한 M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 위에 치상하여 접종한 후 25±2℃의 암조건 배양실에서 4주간 배양하여 에델바이스 줄기세포를 유도하였다. M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 식물호르몬인 옥신과 싸이토카인 농도를 배지에 0.5mg/L로 적절하게 적용하여 에델바이스 줄기세포인 에델바이스 캘러스 유도를 극대화하였다. 유도된 Totipotent embryogenic Stem Cell인 에델바이스 캘러스 양을 극대화하기 위해 성장속도를 높일 수 있는 액체배양을 암조건에서 2주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다. 액체배양을 위한 현탁배양기(Gyrotory Shaker)에는 위에서 언급한 M&S 액체배지를 이용하여 유도된 에델바이스 캘러스를 2.5g/L로 접종하여 현탁배양을 통하여 많은 양의 에델바이스 줄기세포(캘러스)를 확보할 수 있고, 증식된 에델바이스 캘러스를 마지막 계대배양 단계에서 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지를 활용하여 상기 현탁배양기에서 25±2℃의 암조건에서 배양하였다. 대량생산을 위해서는 Bioreactor를 활용하는 것도 좋은 방안이다. 이렇게 얻어진 에델바이스 줄기세포를 2회 정제수로 세척하여 배지 성분을 제거하고 저온에서 에델바이스 줄기세포(캘러스)를 냉동 Stock 용기 내에서 호모게나이저를 이용하여 10,000 rpm 조건으로 2분간 고속 분쇄하고, 분쇄하여 압착추출한 에델바이스 캘러스를 여과지를 이용하여 감압 여과하여 본 발명의 에델바이스 줄기세포(캘러스)배양추출물을 얻는다.

제조예 1-6: 포도(Vitis Vinifera)줄기세포배양 추출물의 제조

본 발명의 포도(Vitis Vinifera)줄기세포배양 추출물은 포도 줄기로부터 줄기세포(캘러스)를 유도하기 위하여, 포도 줄기를 70 % 에탄올에 30초간 침지시키고, 2 % 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하여 표면을 소독하였다. 소독된 포도 줄기 표면을 날카로운 칼로 상처를 낸 후 잘라서 IAA(indole-3-acetic acid) 0.5㎎/L, 제아틴(Zeatin) 0.2㎎/L의 생장조절물질과 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0g/L를 함유한 M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 위에 치상하여 접종한 후 25±2℃의 암조건 배양실에서 6주간 배양하여 포도 줄기세포를 유도하였다. M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 식물호르몬인 옥신과 싸이토카인 농도를 배지에 0.5mg/L로 적절하게 적용하여 포도 줄기세포인 포도 캘러스 유도를 극대화하였다. 유도된 Totipotent embryogenic Stem Cell인 포도 캘러스 양을 극대화하기 위해 성장속도를 높일 수 있는 액체배양을 암조건에서2주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다. 액체배양을 위한 현탁배양기(Gyrotory Shaker)에는 위에서 언급한 M&S 액체배지를 이용하여 유도된 포도 캘러스를 2.5g/L로 접종하여 현탁배양을 통하여 많은 양의 포도 줄기세포(캘러스)를 확보할 수 있고, 증식된 포도 캘러스를 마지막 계대배양 단계에서 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지를 활용하여 상기 현탁배양기에서 25±2℃의 암조건에서 배양하였다. 대량생산을 위해서는 Bioreactor를 활용하는 것도 좋은 방안이다. 이렇게 얻어진 포도 줄기세포를 2회 정제수로 세척하여 배지 성분을 제거하고 저온에서 포도 줄기세포(캘러스)를 냉동 Stock 용기 내에서 호모게나이저를 이용하여 10,000 rpm 조건으로 2분간 고속 분쇄하고, 분쇄하여 압착추출한 포도 캘러스를 여과지를 이용하여 감압 여과하여 본 발명의 포도 줄기세포(캘러스)배양추출물을 얻는다.

제조예 1-7: 토마토(Solanum Lycopersicum)줄기세포배양 추출물의 제조

본 발명의 토마토(Solanum Lycopersicum)줄기세포배양 추출물은 토마토 열매로부터 줄기세포(캘러스)를 유도하기 위하여, 토마토를 70 %(v/v) 에탄올에 30초간 침지시키고, 2 %(v/v) 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하여 표면을 소독하였다. 소독된 토마토 표면을 날카로운 칼로 상처를 낸 후 잘라서 IAA(indole-3-acetic acid) 0.5㎎/L, 제아틴(Zeatin) 0.2㎎/L의 생장조절물질과 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0g/L를 함유한 M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 위에 치상하여 접종한 후 25±2℃의 암조건 배양실에서 3주간 배양하여 토마토 줄기세포를 유도하였다. M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 식물호르몬인 옥신과 싸이토카인 농도를 배지에 0.5mg/L로 적절하게 적용하여 토마토 줄기세포인 토마토 캘러스 유도를 극대화하였다. 유도된 Totipotent embryogenic Stem Cell인 토마토 캘러스 양을 극대화하기 위해 성장속도를 높일 수 있는 액체배양을 암조건에서 2주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다. 액체배양을 위한 현탁배양기(Gyrotory Shaker)에는 위에서 언급한 M&S 액체배지를 이용하여 유도된 토마토 캘러스를 2.5g/L로 접종하여 현탁배양을 통하여 많은 양의 토마토 줄기세포(캘러스)를 확보할 수 있고, 증식된 토마토 캘러스를 마지막 계대배양 단계에서 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지를 활용하여 상기 현탁배양기에서 25±2℃의 암조건에서 배양하였다. 대량생산을 위해서는 Bioreactor를 활용하는 것도 좋은 방안이다. 이렇게 얻어진 토마토 줄기세포를 2회 정제수로 세척하여 배지 성분을 제거하고 저온에서 토마토 줄기세포(캘러스)를 냉동 Stock 용기 내에서 호모게나이저를 이용하여 10,000 rpm 조건으로 2분간 고속 분쇄하고, 분쇄하여 압착추출한 토마토 캘러스를 여과지를 이용하여 감압 여과하여 본 발명의 토마토 줄기세포(캘러스)배양추출물을 얻는다.

제조예 1-8: 장미(Rosa Hybrid)줄기세포배양 추출물의 제조

본 발명의 장미(Rosa Hybrid)줄기세포배양 추출물은 장미꽃으로부터 줄기세포(캘러스)를 유도하기 위하여, 장미꽃을 70 %(v/v) 에탄올에 30초간 침지시키고, 2 %(v/v) 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하여 표면을 소독하였다. 소독된 장미꽃 표면을 날카로운 칼로 상처를 낸 후 잘라서 IAA(indole-3-acetic acid) 0.5㎎/L, 제아틴(Zeatin) 0.2㎎/L의 생장조절물질과 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0g/L를 함유한 M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 위에 치상하여 접종한 후 25±2℃의 암조건 배양실에서 4주간 배양하여 장미 줄기세포를 유도하였다. M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 식물호르몬인 옥신과 싸이토카인 농도를 배지에 0.5mg/L로 적절하게 적용하여 장미 줄기세포인 장미 캘러스 유도를 극대화하였다. 유도된 Totipotent embryogenic Stem Cell인 장미 캘러스 양을 극대화하기 위해 성장속도를 높일 수 있는 액체배양을 암조건에서 2주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다. 액체배양을 위한 현탁배양기(Gyrotory Shaker)에는 위에서 언급한 M&S 액체배지를 이용하여 유도된 장미 캘러스를 2.5g/L로 접종하여 현탁배양을 통하여 많은 양의 장미 줄기세포(캘러스)를 확보할 수 있고, 증식된 장미 캘러스를 마지막 계대배양 단계에서 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지를 활용하여 상기 현탁배양기에서 25±2℃의 암조건에서 배양하였다. 대량생산을 위해서는 Bioreactor를 활용하는 것도 좋은 방안이다. 이렇게 얻어진 장미 줄기세포를 2회 정제수로 세척하여 배지 성분을 제거하고 저온에서 장미 줄기세포(캘러스)를 냉동 Stock 용기 내에서 호모게나이저를 이용하여 10,000 rpm 조건으로 2분간 고속 분쇄하고, 분쇄하여 압착 추출한 장미 캘러스를 여과지를 이용하여 감압 여과하여 본 발명의 장미 줄기세포(캘러스)배양추출물을 얻는다.

제조예 1-9: 알로에(Aloe Barbadensis)줄기세포배양 추출물의 제조

본 발명의 알로에(Aloe Barbadensis)줄기세포배양 추출물은 알로에 줄기로부터 줄기세포(캘러스)를 유도하기 위하여, 알로에 줄기를 70 %(v/v) 에탄올에 30초간 침지시키고, 2 %(v/v) 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하여 표면을 소독하였다. 소독된 알로에 줄기 표면을 날카로운 칼로 상처를 낸 후 잘라서 IAA(indole-3-acetic acid) 0.5㎎/L, 제아틴(Zeatin) 0.2㎎/L의 생장조절물질과 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0g/L를 함유한 M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 위에 치상하여 접종한 후 25±2℃의 암조건 배양실에서 3주간 배양하여 알로에 줄기세포를 유도하였다. M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 식물호르몬인 옥신과 싸이토카인 농도를 배지에 0.5mg/L로 적절하게 적용하여 알로에 줄기세포인 알로에 캘러스 유도를 극대화하였다. 유도된 Totipotent embryogenic Stem Cell인 알로에 캘러스 양을 극대화하기 위해 성장속도를 높일 수 있는 액체배양을 암조건에서 2주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다. 액체배양을 위한 현탁배양기(Gyrotory Shaker)에는 위에서 언급한 M&S 액체배지를 이용하여 유도된 알로에 캘러스를 2.5g/L로 접종하여 현탁배양을 통하여 많은 양의 알로에 줄기세포(캘러스)를 확보할 수 있고, 증식된 알로에 캘러스를 마지막 계대배양 단계에서 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지를 활용하여 상기 현탁배양기에서 25±2℃의 암조건에서 배양하였다. 대량생산을 위해서는 Bioreactor를 활용하는 것도 좋은 방안이다. 이렇게 얻어진 알로에 줄기세포를 2회 정제수로 세척하여 배지 성분을 제거하고 저온에서 알로에 줄기세포(캘러스)를 냉동 Stock 용기 내에서 호모게나이저를 이용하여 10,000 rpm 조건으로 2분간 고속 분쇄하고, 분쇄하여 압착 추출한 알로에 캘러스를 여과지를 이용하여 감압 여과하여 본 발명의 알로에 줄기세포(캘러스)배양추출물을 얻는다.

제조예 1-10: 벼(Oryza Sativa)줄기세포배양 추출물의 제조

본 발명의 벼(Oryza Sativa)줄기세포배양 추출물은 알로에 줄기로부터 줄기세포(캘러스)를 유도하기 위하여, 벼 줄기를 70 %(v/v) 에탄올에 30초간 침지시키고, 2 %(v/v) 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하여 표면을 소독하였다. 소독된 벼 줄기 표면을 날카로운 칼로 상처를 낸 후 잘라서 IAA(indole-3-acetic acid) 0.5㎎/L, 제아틴(Zeatin) 0.2㎎/L의 생장조절물질과 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0g/L를 함유한 M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 위에 치상하여 접종한 후 25±2℃의 암조건 배양실에서 2주간 배양하여 벼 줄기세포를 유도하였다. M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지에 식물호르몬인 옥신과 싸이토카인 농도를 배지에 0.5mg/L로 적절하게 적용하여 벼 줄기세포인 벼 캘러스 유도를 극대화하였다. 유도된 Totipotent embryogenic Stem Cell인 벼 캘러스 양을 극대화하기 위해 성장속도를 높일 수 있는 액체배양을 암조건에서 1주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다. 액체배양을 위한 현탁배양기(Gyrotory Shaker)에는 위에서 언급한 M&S 액체배지를 이용하여 유도된 벼 캘러스를 2.5g/L로 접종하여 현탁배양을 통하여 많은 양의 벼 줄기세포(캘러스)를 확보할 수 있고, 증식된 벼 캘러스를 마지막 계대배양 단계에서 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지를 활용하여 상기 현탁배양기에서 25±2℃의 암조건에서 배양하였다. 대량생산을 위해서는 Bioreactor를 활용하는 것도 좋은 방안이다. 이렇게 얻어진 벼 줄기세포를 2회 정제수로 세척하여 배지 성분을 제거하고 저온에서 벼 줄기세포(캘러스)를 냉동 Stock 용기 내에서 호모게나이저를 이용하여 10,000 rpm 조건으로 2분간 고속 분쇄하고, 분쇄하여 압착 추출한 벼 캘러스를 여과지를 이용하여 감압 여과하여 본 발명의 벼 줄기세포(캘러스)배양추출물을 얻는다.

제조예 2: 유산균 엑소좀의 제조

본 발명의 유산균 엑소좀(Lactobacillus Exosome)은 유산균인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)을 멸균 우유에 혼합하여 48시간 동안 배양하고, 유산균 배양액을 원심분리기를 이용하여 1,7000g로 25분 동안 원심분리 후, 상등 배양액만을 취하여 유산균을 분리 및 제거하고, 다시 상등 배양액을 초고속 원심분리기를 이용하여 12,000g로 25분 동안 원심분리 후, 상등액을 취하여 유산균 및 잔여물을 분리 및 제거하며, 다시 상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 120,000g로 3시간 동안 원심분리 후, 엑소좀을 펠렛층에 가라앉힌 뒤 파이펫 및 볼텍스를 이용해 펠렛층을 PBS에 재부유시켜 장내 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하여 본 발명의 유산균 엑소좀을 얻는다.

제조예 3: 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀의 제조

오스모셀(Osmocell)은 아래 표 1의 함량으로 포스포리피드(Phospholipid), 피토스핑고신(Phytosphingosine), 세라마이드 엔피 (Ceramide NP), 콜레스테롤(Cholesterol), 피토스테롤(Phytosterol), 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 스쿠알렌(Squalene)을 1,000bar의 압력으로 고압유화장치(microfludizer)를 3회 통과시켜 반투명 젤 형태의 지질복합체를 만들었다. 수용액 상에 본 발명의 제조예 1에서 제시안 10종의 식물줄기세포 배양 추출물과 제조예 2의 유산균 엑소좀을 분산시킨 용액을 제조하였다. 다음으로 표 2와 같이 상온에서 이 지질복합체를 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀이 분산된 수용액상에 첨가하여 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀이 내포된 오스모셀을 제조하였다. 도 1은 제조예 3에 따른 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀의 입자분포를 나타낸 것이다. 도 2는 제조예 3에 따른 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀의 SEM 사진이다.

성 분	함량(중량%)
포스포리피드(Phospholipid)	10.0
피토스핑고신(Phytosphingosine)	5.0
세라마이드 엔피 (Ceramide NP)	10.0
콜레스테롤(Cholesterol)	2.5
피토스테롤(Phytosterol)	2.0
베타-시토스테롤(β-sitosterol)	0.5
스쿠알렌(Squalene)	70.0
계	100

성 분	함량(중량%)
지질복합체	0.5
산삼 줄기세포 배양추출물	4.0
은행나무 줄기세포 배양추출물	1.0
회화나무 줄기세포 배양추출물	1.0
녹차 줄기세포 배양추출물	1.0
에델바이스 줄기세포 배양추출물	0.5
포도 줄기세포 배양추출물	0.5
토마토 줄기세포 배양추출물	0.5
장미 줄기세포 배양추출물	0.5
알로에 줄기세포 배양추출물	0.5
벼 줄기세포 배양추출물	0.5
유산균 엑소좀	0.001
정제수	잔량
계	100

본 발명의 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀 입자의 입도 분포를 알아보기 위해 아래와 같이 실험예 1을 실시하였다.

실험예 1

본 발명의 오스모셀 입자의 입도 분포를 분석하기 위하여 상기 제조예 3에서 얻은 오스모셀을 10%-Microplasma Hyopnemoniae OD410=0.1 완충용액에 적당한 농도로 희석한 후 오스모셀 입자의 입도를 측정하였다. 상기 오스모셀 입자의 입도는 제타사이저 엔에스(Zetasizer NS) 장비를 이용하여 빛 산란방식을 분석하고 그 결과를 도 1의 그래프에 나타내었다. 이렇게 얻어진 오스모셀의 입자크기는 평균 120nm 로서, 기존 고압유화장치(microfluidizer)를 이용하여 제조된 리포좀에 비하여 입도 균질성이 향상되어 안정성을 향상시킬 수 있다. 아울러 도 2는 제조예 3에서 제조된 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀의 SEM 사진이다.

하기 표 3과 같이, 제조예 3에서 제조된 식물줄기세포줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀을 함유한 조성물(실시예 1)과 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 함유한 일반적인 기존의 리포좀을 함유한 조성물(비교실시예 1)이 제조되었다.

비교실시예 1의 기존 리포좀은 레시틴 3.0%, 플로필렌글리콜 10%, 에틸알콜 10%, 미네랄오일 3%를 혼합한 뒤 6

까지 가온하여 용해한다. 그 뒤 식물줄기세포배양 추출물 10%와 유산균 엑소좀 0.001%가 포함된 수용액을 위의 용해액에 부어 교반한 후 고압유화장치(microfluidizer)에서 1,000bar의 압력에서 2회 통과시켜 리포좀을 얻었다.

성분(중량%)		실시예 1	비교실시예 1
토타롤		0.2	0.2
오스모셀		50.0	-
리포좀		-	50.0
A	아라키딜알콜	3.0	3.0
	글리세릴스테아레이트	1.5	1.5
	스쿠알란	5.0	5.0
	하이드록시폴리데신	2.0	2.0
	트리옥타노인	5.0	5.0
	폴리솔베이트 80	1.0	1.0
	솔비탄스테아레이트	0.5	0.5
	사이클로펜타실록산	3.0	3.0
	토코페릴아세테이트	0.2	0.2
	BHT	0.05	0.05
B	정제수	잔량	잔량
	농글리세린	4.0	4.0
	1,3-부틸렌글리콜	2.0	2.0
	디메치콘/비닐디메치콘크로스폴리머	0.4	0.4
	EDTA-2Na	0.05	0.05
향, 방부제		적량	적량
계		100	100

실험예 2

상기 본 발명의 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀을 함유하는 화장료에 대한 피부주름 개선 효과(기기적 평가)를 측정하였다. 20세 이상의 여성 20명(평균연령 39.5세)을 2그룹(A,B)으로 나누어 A그룹을 대상으로는 실시예를, B그룹을 대상으로는 비교실시예를 각각 상기 표 3에 따라 제형하여 팔의 상박 2X2 ㎠의 면적에(2회/일, 0.2g/회) 8주간 도포하면서, 투명한 실리콘 재질의 용액을 이용하여 피부 주름의 레플리카(Replica)를 떠서 피부주름측정기(SKIN VISIOMETER SV400, C+K Electronics GmbH. Germany)로 피부주름변화를 측정하였다. 레플리카의 상을 CCD 카메라로 3차원적 분석하고, 각각의 주름의 거칠기(R_m: m은 1이상의 정수)의 합을 주름의 개수로 나눈 값인 하기 수학식 1의 평균주름거칠기(R_z)로 주름개선 효과를 분석하였다. 6주후 피부주름 개선효과에 시험결과는 하기 표 4에 나타내었다.

구분	평균주름거칠기(R_z,㎛)
	실시예			비교실시예
	T0	T8	β_z	T0	T8	β_z
피검자 1	130	60	-70	132	92	-40
피검자 2	132	39	-93	130	89	-41
피검자 3	121	35	-86	122	85	-37
피검자 4	132	55	-77	133	97	-36
피검자 5	122	25	-97	120	80	-40
피검자 6	136	43	-93	132	74	-58
피검자 7	134	36	-98	133	85	-48
피검자 8	120	37	-83	118	69	-49
피검자 9	125	35	-90	123	91	-32
피검자 10	123	37	-86	120	79	-41
평균			-87.3			-42.2

시험 결과, 8주 후 평균주름거칠기(R_z)는 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀을 함유한 실시예는 87.3㎛ 낮아져(p<0.01) 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 일반 리포좀을 함유한 비교실시예 보다 약 106.9% 정도 주름이 더 개선되었다. 따라서 위의 결과로부터 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀을 함유한 실시예 1이 일반 리포좀을 함유한 비교실시예 1보다 주름개선효과가 매우 효과적으로 상승되었음을 알 수 있다.

실험예 3

상기 본 발명의 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀을 함유하는 화장료에 대한 피부주름 개선에 대한 육안평가를 실시하였다.

20세 이상의 여성 20명(평균연령 39.5세)을 2그룹(A,B)으로 나누어 A그룹을 대상으로는 실시예 1을, B그룹을 대상으로는 비교실시예 1을 각각 상기 표 3에 따라 제형하여 주름이 있는 눈가를 중심으로 8주간 도포(2회/일)한 후, 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가를 다음의 6등급으로 분류하여 평가함으로써 피부주름의 개선정도(△W)를 측정하였다. 피부주름개선 임상효과는 하기 표 5(숙련자의 객관적 평가) 와 표 6(피검자의 주관적 평가)에 나타내었다.

<피부주름개선 평가 기준>

-3: 극히 심하게 악화; -2: 악화; -1: 약간 악화; 0: 변화없음; 1: 약간 개선; 2: 개선; 3: 매우 개선

구분	피부주름 개선정도(△W)
	실시예 1		비교실시예 1
	T0	T8	T0	T8
피검자 1	0	3	0	1
피검자 2	0	3	0	1
피검자 3	0	3	0	2
피검자 4	0	2	0	1
피검자 5	0	2	0	2
피검자 6	0	3	0	2
피검자 7	0	3	0	1
피검자 8	0	3	0	2
피검자 9	0	2	0	2
피검자 10	0	3	0	2
△W(T8-T0)	2.7		1.6

구분	피부주름 개선정도(△W)
	실시예 1		비교실시예 1
	T0	T8	T0	T8
피검자 1	0	3	0	2
피검자 2	0	3	0	2
피검자 3	0	3	0	1
피검자 4	0	2	0	2
피검자 5	0	3	0	2
피검자 6	0	3	0	1
피검자 7	0	3	0	2
피검자 8	0	3	0	2
피검자 9	0	2	0	3
피검자 10	0	2	0	1
△W(T8-T0)	2.7		1.8

육안 평가 결과 실시예 1의 경우 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가가 각각 2.7, 2.7로 주름개선 효과가 매우 우수함을 알 수 있다. 이는 리포좀에 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포한 비교실시예 1에 비해 숙련자의 객관적 평가에서는 68.8%, 피검자의 주관적 평가에서는 50% 증가한 것으로 나타나 본 발명의 오스모셀에 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포한 화장료가 기존 리포좀에 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포한 화장료 보다 매우 효과적으로 주름을 개선시킴을 알 수 있다.

실험예 4

피부 미백 효과는 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포한 오스모셀(제조예 3)의 멜라노사이트(Melanocyte)에서 멜라닌 생성에 대한 저해 효과를 측정하였다. 멜라노사이트는 마우스 유래 B-16 멜라노마(ATCC CRL 6323) 세포주를 구입하여 사용하였다. 멜라노마 세포주를 포도당 4.5 g/L, 10% 혈청, 1% 항생제가 함유된 DMEM 배지에 접종하여 50㎖ T-플라스크에 37℃에서 배양한다. 5% CO₂조건하에서 24시간 배양한 후, 0.02% EDTA가 함유된 0.05% 트립신(Trypsin)을 처리하여 세포를 분리한 후 50㎖ T-플라스크에 접종하여 48시간 배양한다. 이때 세포수는 5.76 Х 10⁶ 세포/플라스크이다. 여기에 적당 농도의 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포한 오스모셀(제조예 3)과 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포한 일반 리포좀에 DMEM 배지에 희석시켜 배양된 멜라노마 세포에 처리하여 37℃에서 5일간 배양한다. 오스모셀과 일반 리포좀에 포접하기 위해 사용한 식물줄기세포 배양 추출물 10 중량%과 유산균 엑소좀 0.001 중량%의 양은 동일하게 사용하여 본 실험에 적용할 오스모셀과 일반 리포좀을 얻었다. 배양 후 배지를 모두 제거하고, 0.02% EDTA와 0.05%트립신을 함유한 살린-포스페이트 완충용액(PBS)을 1㎖ 처리하여 세포를 분리시킨 후 5분간 원심 분리하여 세포만을 수집한다. 5% 트리클로로아세테이트(TCA)를 처리하여 교반하고, 원심 분리하여 침전된 멜라닌을 살린-포스페이트 완충용액으로 세척한다.

침전된 멜라닌에 1N NaOH를 처리하여 용해시킨 후, 475nm에서 흡광도를 측정한다. 멜라닌 농도는 합성 멜라닌(시그마사)의 표준 농도 곡선으로부터 결정하였다. 실험 결과는 표 7에 나타낸 바와 같다.

농도 (㎍/㎖)	멜라닌 생성 억제율(%)
농도 (㎍/㎖)	오스모셀	일반리포좀
무처리	-	-
1	25.2	1.4
2	45.2	2.3
5	61.5	4.1
10	84.7	7.8
20	89.5	10.3
50	95.8	13.8
100	96.2	15.5

이상의 결과에서 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀이 내포된 오스모셀은 일반 리포좀에 내포된 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 처리했을 때 보다 높은 멜라닌 합성 억제효과가 높게 나타나는 것을 알 수 있다. 이는 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀 제조 공정이 상온에서 진행되는데 비해, 기존의 일반 리포좀은 제조공정에 고압유화장치 (microfludizer)를 통과 시 고온(60℃ 이상) 공정을 거치면서 성장인자와 같은 온도에 민감한 성분들이 발생한 열에 의해 활성이 떨어지거나 변성되어 멜라닌 합성 저해 효과가 떨어진다고 볼 수 있다. 본 시험예를 통해 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀은 멜라노사이트의 멜라닌 생성을 억제하여 매우 우수한 피부 미백효과를 보임을 알 수 있다.

실험예 5

상기 본 발명의 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀을 함유하는 화장료에 대한 피부탄력 증진 효과를 측정하였다.

온도 24~26℃ 습도 75% 조건에서 20세 이상의 여성 20명(평균연령 39.5세)을 2그룹(A,B)으로 나누어 A그룹을 대상으로는 실시예 1을, B그룹을 대상으로는 비교실시예 1을 각각 상기 표 3에 따라 제형하여 눈가를 중심으로 8주간 도포(2회/일)한 후, 피부탄력측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다. 시험 결과는 하기 표 8에 Cutometer SEM 575의 β주)-R8(0주)) 값으로 나타내었다. R8 값은 피부 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.

구분	피부점탄성(R₈)
	실시예			비교실시예
	T0	T8	△R₈	T0	T8	△R₈
피검자 1	0.25	0.75	0.50	0.23	0.51	0.28
피검자 2	0.28	0.77	0.49	0.26	0.55	0.29
피검자 3	0.23	0.79	0.56	0.25	0.49	0.24
피검자 4	0.33	0.77	0.44	0.33	0.53	0.20
피검자 5	0.41	0.75	0.34	0.38	0.62	0.24
피검자 6	0.29	0.82	0.53	0.30	0.65	0.35
피검자 7	0.21	0.74	0.53	0.24	0.43	0.19
피검자 8	0.44	0.69	0.25	0.41	0.55	0.14
피검자 9	0.22	0.62	0.40	0.20	0.48	0.28
피검자 10	0.38	0.60	0.22	0.38	0.57	0.19
평균			0.426			0.240

이상의 결과에서 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀이 내포된 오스모셀을 함유하는 실시예는 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 일반 리포좀을 함유한 비교실시예보다 피부탄력이 77.5% 증가하여, 높은 피부탄력 증진 효과를 갖고 있음을 알 수 있다.

실험예 6

상기 본 발명의 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀에 대한 피부침투효과를 측정하였다.

인체 정상 섬유아세포(Human normal fibroblast) 1x10⁵ cells/ml 세포를 인체의 결합조직을 이루는 섬유조직과 유사한 콜라겐 젤 구조에 콜라겐 수용액 3mg/ml : 5X DMEM : 2.2% 소듐바이카보네이트(Sodium bicarbonate)와 200mM Hepes 완충액이 포함된 0.05N 수산화나트륨이 7:2:1로 혼합된 배지에 접종하여 5% CO², 37℃에서 7일 동안 배양하여 얻은 Dermal Equivalent(DE) 를 3μm 다공성 폴리카보네이트(Porous polycarbonate) 재질로 된 막(Membrane)에 의해 안쪽과 바깥쪽이 구분된 플레이트(Plates)의 안쪽에 넣고 섬유아세포가 배양된 Dermal Equivalent(DE) 표면 위에 표피 각질형성세포(Epidermal Keratinocyte) 1x10⁵ cells/ml 세포를 접종하여 EGF와 BPE가 함유된 K-SFM 배지를 안쪽과 바깥쪽에 넣고 7일 동안 배양한다. 그 후 플레이트 안쪽의 배지를 버려 공기가 배양세포의 표면에 접촉 되도록 하고 바깥쪽에 10% FBS가 함유된 K-SFM과 EGF가 들어있지 않은 DMEM이 동량으로 혼합된 배지를 넣어 2주간 배양하여 다층의 표피와 진피가 형성된 인공피부를 얻는다. 여기에 본 발명의 실시예 오스모셀 및 비교실시예 리포좀을 맨 위층의 인공피부 조직에 적용하여 4시간 배양한 후 EGF가 들어있지 않은 DMEM 배지에서 인공피부의 표피와 진피를 침투하여 통과된 실시예의 오스모셀과 비교실시예의 리포좀에 함유되어 EGF 양을 HPLC로 분석하였다. 이때 식물줄기세포배양 추출물과 유산균 엑소좀에 EGF를 추가하여 EGF 함량이 50μg/1㎖ 되도록 실시예의 오스모셀과 비교실시예의 리포좀을 제조하였다. 피부침투효과에 대한 시험결과는 하기 표 9에 나타내었다.

구분	배지중의 EGF의 양(μg/1㎖)
실시예 1	18.9
비교실시예 1	7.2

이상의 결과에서 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀이 내포된 오스모셀은 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀이 내포된 일반 리포좀 보다 2배 이상의 매우 높은 피부침투효과가 있음을 알 수 있다.

이는 본 발명의 오스모셀이 좀 더 피부 친화적일 뿐만 아니라 제조 공정이 상온에서 진행되어 열에 민감한 EGF의 안정성에 일반 리포좀 보다 오스모셀이 높은 활성을 유지함으로 인해 피부침투량이 높게 나왔으리라 본다.

실험예 7

상기 본 발명의 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포하는 오스모셀을 함유하는 화장료에 대한 안정성를 측정하였다.

화장료의 안정성을 시험하기 위해 본 발명의 실시예 및 비교실시예를 표 3에 따라 제형하여 45℃로 일정하게 유지되는 항온조에서 불투명 초자 용기에 담아 12주동안 보관하고, 또한 4℃로 일정하게 유지되는 완전히 차광된 냉장고 내에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관한 후, 분리 정도 및 변색 정도를 비교 측정하였다.

그 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 이때 제품 분리 및 변색 정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가하였다.

<제품 변색 평가기준>

0: 변화 없음; 1: 극히 조금 분리(변색); 2: 조금 분리(변색); 3: 조금 심하게 분리(변색); 4: 심하게 분리(변색); 5: 극히 심하게 분리(변색)

온도	시험물질 변색 정도
온도	실시예	비교실시예
45℃	0	1.8
4℃	0	0

상기 표 10에서 알 수 있는 바와 같이, 오스모셀을 함유한 실시예는 4℃와 45℃에서 모두 변색이나 분리 증상이 없이 안정하였으나 일반 리포좀을 함유한 비교실시예는 4℃는 변색이나 분리 증상이 없었으나 45℃에서 약간의 분리 증상이 나타나 불안정함을 알 수 있다.

실험예 8

상기 본 발명의 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포한 오스모셀을 함유한 화장료에 대한 피부 안전성 시험을 실시하였다.

피검자 20명(평균연령 30.5세, 연령분포 18세~40세)을 본 발명의 실시예 1 및 비교실시예 1을 표 3에 따라 제형하여 Haye's Test Chamber를 이용 상박에 피부 첩포시험(Patch Test)을 실시하였다. 단 건선(Psoriasis), 습진(Eczema), 기타 피부병변 보유자나 임신, 수유부 또는 피임제, 항히스타민제 등을 복용하고 있는 사람은 본 실험에서 제외 하였다. 시험부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시키고, 실시예와 비교실시예를 각각 15μg씩 Chamber에 적하시킨 후, 시험 부위인 상박 부위에 얹어 고정시킨다. 첩포는 24시간 동안 도포하고 첩포를 제거한 후에는 Marking Pen으로 시험부위를 표시하여 각각 24시간, 48시간 후에 시험부위를 관찰한다. 판정은 첩포 제거 24시간, 48시간 후에 행하며 피부반응은 하기 표 11의 국제접촉피부염연구회(International Contact Dermatitis Research Group :ICDRG)의 규정에 따라 판정하였다. 시험결과는 하기 표 12에서 피부 안정성으로 나타내었다.

기호	판 정 기 준	평 가	Mean Score
±	Doubtful or slight reaction and erythema	미소자극	0~0. 9
+	Erythema + Induration	경자극	1.0~2.9
++	Erythema + Induration + Vesicle	중자극	3.0~4.9
+++	Erythema + Induration + Bullae	강자극	5.0이상
-	Negative	무자극	0

경과시간	실시예1	비교실시예1
24시간	0	0.0
48시간	0	0.0

표 12에서 본 바와 같이 피부안전성 시험 결과, 실시예와 비교실시예 모두 평균 자극도가 0으로서, 피부에 자극이 없는 안전한 화장료임을 알 수 있다.

이하 상기한 실험예들의 결과를 근거로 하여 식물줄기세포 배양 추출물과 유산균 엑소좀을 내포한 오스모셀을 함유하는 화장료를 조성하여 제시한다. 그러나, 본 발명의 조성물을 하기의 제형예들로 한정하고자 하는 것은 아니다.

제형예 1: 유연화장수(스킨로션)

성분	중량%
오스모셀	10.0
1,3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
올레일알코올	0.1
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	15.0
벤조페논-9	0.05
향, 방부제	미량
정제수	to 100

제형예 2: 영양화장수(밀크로션)

성분	중량%
오스모셀	10.0
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올아민	1.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동 파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다미아너트오일	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.0
카르복시비닐 폴리머	1.0
비에치티이	0.01
이디티에이-2엔에이	0.01
향, 방부제	미량
정제수	to 100

제형예 3: 영양크림

성분	중량%
오스모셀	20.0
세토스테아릴알콜	2.0
글리세릴스테아레이트	1.5
트리옥타노인	5.0
폴리솔베이트 60	1.2
솔비탄스테아레이트	0.5
스쿠알란	5.0
유동파라핀	3.0
싸이클로메치콘	3.0
비에치티이	0.05
델타-토코페롤	0.2
농글리세린	4.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
산탄검	0.1
이디티에이-2엔에이	0.05
향, 방부제	미량
정제수	to 100

제형예 4: 마사지크림

성분	중량%
오스모셀	3.0
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올아민	0.5
밀납	2.0
토코페릴아세테이트	0.1
폴리솔베이트 60	3.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.5
세테아릴알코올	2.0
유동파라핀	30.0
카르복시비닐폴리머	0.5
향, 방부제	미량
정제수	to 100

제형예 5: 팩

성분	중량%
오스모셀	2.0
프로필렌글리콜	2.0
글리세린	4.0
카르복시비닐폴리머	0.3
에탄올	7.0
피이지-40 히드로게비이티드 캐스터 오일	0.8
트리에탄올아민	0.3
비에치티이	0.01
이디티에이-2엔에이	0.01
향, 방부제	미량
정제수	to 100

Claims

포스포리피드, 피토스핑고신, 세라마이드 엔피, 콜레스테롤, 피토스테롤, 베타-시토스테롤 및 스쿠알렌으로 이루어진 지질복합체에 식물줄기세포 배양 추출물 및 유산균 엑소좀이 내포되어 있는 오스모셀을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 식물줄기세포 배양추출물은 산삼 줄기세포 배양추출물, 은행나무 줄기세포 배양추출물, 회화나무 줄기세포 배양추출물, 녹차 줄기세포 배양추출물, 에델바이스 줄기세포 배양추출물, 포도 줄기세포 배양추출물, 토마토 줄기세포 배양추출물, 장미 줄기세포 배양추출물, 알로에 줄기세포 배양추출물, 및 벼 줄기세포 배양추출물로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유산균 엑소좀은 락토바실러스 플란타럼 배양액에서 분리된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 오스모셀은 오스모셀 총 중량에 대하여, 지질복합체 0.1 내지 10 중량%, 식물줄기세포 배양 추출물 0.01~50.0 중량%, 유산균 엑소좀 0.00001~1.0 중량% 및 잔량의 정제수를 함유하고, 상기 지질복합체는 지질복합체 총 중량 대비 포스포리피드 0.1~30.0 중량%, 피토스핑고신 0.01~20.0 중량%, 세라마이드 엔피 0.01~30.0 중량%, 콜레스테롤 0.01~10.0 중량%, 피토스테롤 0.01~10.0 중량%, 베타-시토스테롤 0.01~10.0 중량% 및 스쿠알렌 0.01~90.0 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 오스모셀은 전체 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001~100.0 중량%가 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 오스모셀은 포스포리피드, 피토스핑고신, 세라마이드 엔피, 콜레스테롤, 피토스테롤, 베타-시토스테롤 및 스쿠알렌을 고압에서 용해하여 반투명 젤 형태의 지질복합체를 만드는 단계 및 상온에서 상기 지질복합체, 상기 식물줄기세포 배양 추출물 및 상기 유산균 엑소좀을 혼합하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 주름개선 효과, 미백 효과, 피부 탄력개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.