KR20230126720A - 인간 및 원숭이 cd3에 결합하는 항체 및 그 용도 - Google Patents

인간 및 원숭이 cd3에 결합하는 항체 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

인간 및 원숭이 CD3, 또는 이의 항원-결합 영역에 결합하는 단일클론 항체뿐 아니라 염증성 질환의 치료 및 2중 특이성 항체의 제조에 있어 항체 또는 이의 항원-결합 영역의 용도가 개시된다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 포함하는, 예를 들어 CD3 및 CD20에 대한 2중 특이성 항체 및 암과 같은 질환 치료에서의 2중 특이성 항체의 용도 역시 제공된다.

Description

인간 및 원숭이 CD3에 결합하는 항체 및 그 용도
관련 출원 및 원용에 의한 통합
본 출원은 2020년 12월 23일에 출원된 중국 특허 출원번호 202011540874.8에 대해 우선권을 주장한다.
외국 출원, 및 여기에 또는 심사 중에 인용된 모든 문헌들 ("출원 관련 문헌") 및 본원에 인용되거나 또는 참조된 모든 문헌 (비-제한적으로, 본원에 인용된 모든 인쇄 문헌, 특허, 공개된 특허 출원)(본원에 인용된 문헌"), 및 본원에 인용된 문헌에 인용되거나 참조된 모든 문헌들은, 본원에 언급되거나 본원에 원용에 의해 통합된 임의 문헌에서 임의 제품에 대한 제조사의 지침서, 설명서, 제품 명세서 및 및 제품 시트와 더불어, 본원에 원용에 의해 본 명세서에 통합되며, 본 발명을 실시하는데 채택될 수 있다. 보다 상세하게는, 모든 참조 문헌들은 각각의 개별 문헌이 구체적이고 개별적으로 원용에 의해 포함되는 것과 동일한 수준으로 원용에 의해 통합된다. 본원에 언급된 모든 유전자은행 서열은 본원의 가장 빠른 유효 출원 일자의 유전자은행 서열로 원용에 의해 통합된다.
발명의 기술 분야
본 발명은 인간 및 원숭이 CD3ε에 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역, 및 자가면역 질환과 같은 염증 질환을 치료하거나 또는 개선하거나 또는 이식편 거부 반응을 완화 또는 소거하는데 있어 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 영역의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 예를 들어, CD3 및 CD20를 겨냥하는 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 포함하는 2중 특이성 항체, 및 암과 같은 질환 치료에서의 이러한 이중 특이성 항체의 용도를 제공한다.
T 세포 및 CD3
적응 면역 시스템에는 2가지 주요 면역 기전, 즉 세포성 및 체액성이 존재한다. 세포성 면역은 골수 (일부 경우에는, 배아 외 난황낭 및 태아 간)에 상주하는 조혈 줄기 세포로부터 기원하는 T 세포에 의해 매개된다. 조혈 줄기 세포는 다능성 전구세포로 분화한 다음 공통 림프구 전구세포로 분화되어 흉선으로 이동해 성숙된다. 생존해 흉선을 떠나는 공통 림프구 전구세포는 면역적격 T 세포가 된다.
연구들에서, T 세포 활성화, 증식 및 (작동자 세포로의) 분화가 T 세포 수용체 (TCR) 및 T 세포 상의 공동-자극 분자, 예를 들어 CD28 각각과 MHC/펩타이드 복합체 및 항원 제시 세포 상의 공동-자극 분자와의 동시적인 연합 (engagement)을 통해 발생하는 것으로, 입증된 바 있다.
T 세포 수용체 복합체는 TCR 분자와 CD3 분자를 포함한다. TCR 분자는 알파 (α) 쇄 및 베타 (β) 쇄, 또는 감마 (γ) 쇄와 델타 (δ) 쇄로 구성된다. 각각의 쇄는 항원성 펩타이드 결합을 담당하는 세포외 가변 영역, 세포 막에 인접한 세포외 불변 영역, 그리고 짧은 세포질 꼬리를 가지고 있다. TCR은 짧은 세포질 꼬리로 인해 신호 전달 (signal transduction)을 매개하기 위해서는 CD3가 필요하다. CD3 분자는 감마 (γ) 쇄, 델타 (δ) 쇄, 2개의 엡실론 (ε) 쇄, 그리고 2개의 제타 (ζ) 쇄로 구성되어, 이량체 3가지, εγ, εδ 및 ζζ를 TCR/CD3 복합체에서 형성한다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 쇄는 모두 면역글로불린 도메인을 가진 면역글로불린 슈퍼패밀리의 I형 막관통 단백질이고, CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 쇄의 세포내 꼬리는 면역수용체 티로신-계 활성화 모티프 (ITAM)를 총 10개 가지고 있으며, 인산화는 CD3 쇄가 T 세포 신호전달 캐스케이드에서 중요한 키나제인 ZAP70에 결합할 수 있게 한다. CD3ε 쇄는 최초 인간 항-CD3 항체인 Muromonab-CD3 (또는 OKT3) 등의 대부분의 항-CD3 항체가 결합하는 종들에 보존된 에피토프를 가지고 있다 (Jones M et al., (1993) Journal of Immunology 150(12): 5429-5435).
CD3 표적 항체
CD3 분자는 TCR 구조를 안정화하고 신호 전달을 수행하는 기능을 하므로, 부적절한 면역 반응을 차단하거나 또는 적어도 감소시켜 염증 질환 및/또는 자가면역 질환을 완화하기 위해, T 세포 활성화 신호전달을 조절하는 CD3에 대한 항체들이 다수 개발되었다. 예를 들어, OKT3는 이식편 거부 반응을 낮추거나/소거하고, 자가면역 질환을 치료/완화하기 위해 승인되었다.
항-CD3 항체는 종양 관련 항원과 같은 질환 관련 항원을 표적으로 하는 기능성 모이어티를 가진 2중 특이성 분자를 형성한다. 2중 특이성 분자는 T 세포를 질환 관련 항원과 물리적으로 연결하여, 질환 관련 세포 주변에서 T 세포를 활성화하며, 그래서 이들 세포에 대한 T 세포-매개 사멸을 달성한다. 예를 들어, CD3 분자와 종양 관련 항원 둘다에 특이적인 2중 특이성 분자는, T 세포가 활성화되어 단백질 280종 이상을 함유한 초분자 공격 입자 (SMAP)를 방출하도록, T 세포를 종양 세포에 더 가깝게 접근시킨다. SMAP는 그랜자임과 퍼포린을 세포외 유출하는데, 퍼포린은 표적 세포의 원형질막에, 그랜자임은 표적 세포의 세포질로 유입되는 것을 매개하는, 구멍을 만든다 (S. Balint et al., (2020) Science 368(6493): 897-901).
항-CD3 항체에 의해 유도되는 유해 반응
항-CD3 활성화된 T 세포는 종양 세포를 살상하면서, IL-2, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인을 방출해 세포 증식과 분화를 촉진한다. T 세포 증식 및 분화는 한편으로는 종양 세포를 사멸하기 위해 더 많은 T 세포를 생성하고, 다른 한편으로는 항-CD3 요법을 시술받는 개체들에서 심각한 독성, 즉 사이토카인 방출 증후군 (CRS)을 유발한다. CRS의 임상 징후와 증상으로는 열, 구역질, 두통, 발진, 빠른 심박동, 저혈압 및 경미하거나 또는 생명을 위협하는 호흡 곤란 등이 있다. CD19 및 CD3에 대한 2중 특이성 T 세포 인게이저 항체 (T cell engager antibody)인 Blincyto® blinatumomab에 대한 임상 시험에서, 심각한 CRS 및 신경 독성이 관찰되었다. 특히, 이 요법을 시술받은 개체의 약 50%에서 신경 독성이 발생하였다.
이러한 2중 특이성 요법에서 관찰된 또한 OKT3와 같은 단일-특이성 항-CD3 항체를 이용한 요법에서도 발생하였으며, CRS는 Fc 수용체 (FcR)에의 결합을 통한 항체 가교와 관련있는 것으로 보인다 (Herold KC et al., (2003) J Clin Invest. 111(3):409-418). 따라서, 후속적인 항체 개발에서는 Teplizumab과 같은 항-CD3 항체의 Fc 영역을 약한 FcR 결합력을 가지도록 조작하였다.
그러나, 기능성 모이어티를 표적으로 하는 질환 관련 항원이 표적 세포에 결합하면 항체 가교를 부여해 T 세포에 의한 다량의 사이토카인 방출을 유도하므로, 단일-특이성 항-CD3 항체의 Rc 영역에 대한 변형은 2중 특이성 항-CD3 항체에는 적용 불가하다. 따라서, 2중 특이성 항-CD3 항체를 개발하여 임상적으로 이용하기 위해서는, CD3 결합 친화성은 높지만 사이토카인 방출은 거의 유발하지 않는 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 찾는 것이 매우 중요하다.
CD3 및 CD20을 표적으로 하는 2중 특이성 항-CD3 항체
CD20은 조혈 줄기 세포, 프로-B 세포 또는 정상 혈장 세포가 아닌 악성 및 비-악성 프리-B 세포 및 성숙 B 세포의 표면에 발현되는 B 세포 마커이다. 항-CD20 항체 결합시 CD20 탈락 (shedding) 또는 내재화는 관찰되지 않는다. 이런 점에서, CD20은 B 세포 림프종 및 B 세포 백혈병을 진단 및/또는 치료하는데 유망한 항원이다.
CD3 및 CD20을 표적으로 하는 2중 특이성 항체는 악성 B 세포와 같은 CD20 양성 종양 세포와 T 세포를 물리적으로 연결하여, T 세포 활성화와 CD20 양성 B 악성에 대한 T 세포 매개 공격을 유발한다.
그러나, 전술한 바와 같이, 이러한 항체의 투여는 불가피하게 심각한 독성을 유발할 수 있다. CD3 및 CD20 결합 항체인 Mosunetuzumab의 안전성 및 약동학을 평가하는 다기관, 오픈-라벨, I/Ib 상 시험 (NCT02500407)에서, 이 요법을 받은 환자들 중 28.9%에서 CRS가 관찰되었다. 재발성 또는 불응성 (R/R) B 세포 비-호지킨 림프종 (NHL) 치료에서 T 세포 인게이징 2중 특이성 항체인 CD20-TCB의 효능, 안전성, 내약성 및 약동학을 평가하는 또 다른 다기관, 오픈-라벨, I/Ib 상 시험에서는 환자 67.9%에서 CRS가 발생하였다.
따라서, 강력한 항-종양 효과를 가지며 유해한 약물 반응을 매개할 수 있는 2중 특이성 CD3 및 CD20 결합 항체가 절실히 요구되고 있다. 이러한 2중 특이성 항체를 구축하기 위해, CD3 친화성이 높고 사이토카인 방출을 거의 유도하지 않는 CD3 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 필요하며, CD3 항체와 CD20 항체를 조합하는 방법을 최적화하여야 한다. 이런 항체는 CD3-CD20 표적 요법에 대해 더 나은 치료학적 윈도우를 제공할 것으로 예상된다.
본 출원에서 임의 문헌의 인용 또는 식별은 이러한 문헌이 본 발명에 대한 선행 기술로서 이용 가능함을 인정하는 것은 아니다.
본 발명자들은 인간 및 원숭이 CD3ε에 특이적으로 결합하는 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 발견하게 되었다. 선행 기술의 항-CD3 항체와 비교해, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 인간/원숭이 CD3ε 결합력이 더 높지 않더라도 비슷하며, 따라서 염증 질환 및/또는 자가면역 질환에 대한 치료 효과가 더 우수하지 않더라도 비슷하다. 보다 중요하게도, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 비슷한 또는 더 높은 CD3 결합성을 제공하면서 T 세포 활성화의 저하를 유도하므로, 심각한 부작용이 적다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 이용한 2중 특이성 항체는 또한 신체에 대해 독성이 더 낮다.
임의의 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 발명자는, 본 발명의 CD3ε 에피토프 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 결합하거나 및/또는 항체-항원-세포 복합체가 항체 또는 항원-결합 영역의 높은 CD3ε 결합 친화성과 T 세포에 의한 사이토카인 방출의 저하에 기여하는 것으로 생각한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 CD3ε 및 CD20과 같은 질환 관련 항원에 대한 2중 특이성 항체의 일부일 경우에도 이러한 특징을 유지하며, 즉 2중 특이성 항체는 표적 세포에 대한 살상 능력을 나타내며, 사이토카인 방출을 거의 유발하지 않는다.
이에, 제1 측면에서, 본 발명은 CD3ε에 결합하는 단리된 단일클론 항체, 예를 들어, 마우스, 키메라 또는 인간화 항체, 또는 이의 항원-결합 영역을 제공하며, 이는 (i) VH CDR1 영역, VH CDR2 영역 및 VH CDR3 영역을 포함할 수 있되, VH CDR1 영역, VH CDR2 영역 및 VH CDR3 영역이, (1) 서열번호 1 (X1=S), 2 (X1=D) 및 3 (X1=L, X2=Y) 각각; (2) 서열번호 1 (X1=T), 2 (X1=I) 및 3 (X1=L, X2=Y) 각각; (3) 서열번호 1 (X1=T), 2 (X1=D) 및 3 (X1=I, X2=W) 각각; 또는 (4) 서열번호 1 (X1=T), 2 (X1=I) 및 3 (X1=I, X2=Y) 각각에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있는, 중쇄 가변 영역; 및/또는 (ii) VL CDR1 영역, VL CDR2 영역 및 VL CDR3 영역을 포함할 수 있되, VL CDR1 영역, VL CDR2 영역 및 VL CDR3 영역이, (1) 서열번호 4 (X1=D, X2=S), 5 (X1=Q, X2=R, X3=S) 및 6 (X1=V) 각각; (2) 서열번호 4 (X1=Q, X2=N), 5 (X1=K, X2=Q, X3=R) 및 6 (X1=V) 각각; (3) 서열번호 4 (X1=K, X2=S), 5 (X1=N, X2=L, X3=H) 및 6 (X1=A) 각각; 또는 (4) 서열번호 4 (X1=R, X2=N), 5 (X1=R, X2=L, X3=S) 및 6 (X1=V) 각각에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있는, 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 VH CDR1 영역, VH CDR2 영역 및 VH CDR3 영역을 가진 중쇄 가변 영역과 VL CDR1 영역, VL CDR2 영역 및 VL CDR3 영역을 가진 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 여기서 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3는 (1) 서열번호 1 (X1=S), 2 (X1=D), 3 (X1=L, X2=Y), 4 (X1=D, X2=S), 5 (X1=Q, X2=R, X3=S) 및 6 (X1=V) 각각; (2) 서열번호 1 (X1=T), 2(X1=I), 3 (X1=L, X2=Y), 4 (X1=Q, X2=N), 5 (X1=K, X2=Q, X3=R) 및 6 (X1=V) 각각; (3) 서열번호 1 (X1=T), 2 (X1=D), 3 (X1=I, X2=W), 4 (X1=K, X2=S), 5 (X1=N, X2=L, X3=H) 및 6 (X1=A) 각각; 또는 (4) 서열번호 1 (X1=T), 2 (X1=I), 3 (X1=I, X2=Y), 4 (X1=R, X2=N), 5 (X1=R, X2=L, X3=S) 및 6 (X1=V) 각각에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
중쇄 가변 영역은 서열번호 7-14 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
경쇄 가변 영역은 서열번호 15-21 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 (1) 서열번호 7 및 15 각각; (2) 서열번호 8 및 16 각각; (3) 서열번호 9 및 17 각각; (4) 서열번호 9 및 18 각각; (5) 서열번호 10 및 17 각각; (6) 서열번호 10 및 18 각각; (7) 서열번호 11 및 19 각각; (8) 서열번호 12 및 20 각각; (9) 서열번호 13 및 20 각각; 또는 (10) 서열번호 14 및 21 각각에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 FcR 결합 친화성이 감소된/약한 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 가진다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 FcR 결합 친화성이 없는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 가진다. FcR 결합 친화성이 약하거나 또는 없는 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 (N297A), 예를 들어, 서열번호 22 (X1=A, X2=A, X3=N, X4=P)의 아미노산 서열을 가진 인간 IgG1 (L234A+L235A), 예를 들어, 서열번호 22 (X1=A, X2=A, X3=N, X4=G)의 아미노산 서열을 가진 인간 IgG1 (L234A+L235A+P329G), 예를 들어, 서열번호 22 (X1=A, X2=A, X3=A, X4=P)의 아미노산 서열을 가진 인간 IgG1 (L234A+L235A+N297A), 예를 들어, 서열번호 22 (X1=A, X2=A, X3=A, X4=G)의 아미노산 서열을 가진 인간 IgG1 (L234A+L235A+N297A+P329G), 인간 IgG2 (V234A+V237A), 인간 IgG1 (L234A+V235E) 중쇄 불변 영역, 또는 이들의 기능성 단편일 수 있다. 경쇄 불변 영역은 서열번호 23 또는 32의 아미노산 서열을 가진 인간 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역과 같은 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 단쇄 가변성 단편 (scFv) 항체, 또는 Fab 또는 F(ab')2 단편과 같은 항체 단편일 수 있다.
또한, 본 발명은 항체 또는 이의 항원-결합 영역과는 결합 특이성이 다른 제2 기능성 모이어티 (예를 들어, 제2 항체), 예를 들어 질환 관련 항원에 대한 제2 기능성 모이어티가 연결된, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 영역을 포함할 수 있는, 2중 특이성 분자를 제공한다.
2중 특이성 분자는 CD3ε, 및 질환 관련 항원을 표적으로 할 수 있다. 특정 구현예에서, 질환 관련 항원은 종양 관련 항원, 예를 들어 CD20, CD19, CD22, CD4, CD24, CD38, CD123, CD228, CD138, BCMA, GPC3, CEA, CD276, gp100, 5T4, GD2, EGFR, MUC-1, PSMA, EpCAM, MCSP, SM5-1, MICA, MICB, ULBP 및 HER-2이다. 특정 구현예에서, 질환 관련 항원은 감염성 질환 관련 항원, 예를 들어 CD4, BHsAg, LMP-1 및 LMP2이다. 특정 구현예에서, 질환 관련 항원은 염증성 질환 관련 항원, 예를 들어 IL17R 및 CD6이다. 특정 구현예에서, 질환 관련 항원은 CD20이다.
2중 특이성 분자는 링커를 통해 연결된 항원 결합성 도메인을 2개 가진 재조합 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, 결합성 도메인 2개는 링커 없이 또는 링커를 사용해, 예를 들어, scFv-scFv, Fab-Fab 또는 scFv-Fab 형태로 연결될 수 있다.
본 발명의 2중 특이성 분자는 CD3ε 결합성 도메인과 CD20 결합성 도메인을 함유한, CD3 및 CD20을 표적으로 하는 2중 특이성 항체일 수 있다.
2중 특이성 항체는 CD3ε 결합성 도메인 하나와 CD20 결합성 도메인 1-5개를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 2중 특이성 항체는 CD3ε 결합성 도메인 하나와 CD20 결합성 도메인 2개를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, CD20 결합성 도메인은 CD20에 특이적인, 항체 또는 이의 항원-결합 영역, 예를 들어, Fv 및/또는 scFv이다. 일 구현예에서, CD3 결합성 도메인은 본 발명의 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 영역, 예를 들어, Fv일 수 있다. CD20 결합성 도메인 2개는 서로 동일하거나 또는 서로 다른 항원 에피토프에 결합할 수 있거나, 동일한 또는 서로 다른 도메인 서열을 함유할 수 있거나, 및/또는 동일한 또는 서로 다른 항원-결합성 도메인 형태를 가질 수 있다.
일 구현예에서, CD3 결합성 도메인은 본 발명의 CDR 영역, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 함유할 수 있다. 일 구현예에서, CD20 결합성 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역과, 2) 서열번호 27의 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역을 함유한다.
CD3 및 CD20을 표적으로 하는 본 발명의 2중 특이성 항체는 IgG 유사 항체일 수 있다.
일 구현예에서, 2중 특이성 항체는
i) 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 함유한 제1 폴리펩타이드,
ii) 항-CD20 경쇄 가변 영역을 함유한 제2 폴리펩타이드,
iii) 항-CD20 중쇄 가변 영역, 항-CD20 경쇄 가변 영역, 항-CD3ε 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 함유한 제3 폴리펩타이드, 및
iv) 항-CD3ε 경쇄 가변 영역을 함유한 제4 폴리펩타이드를 포함하고,
제1 폴리펩타이드의 항-CD20 중쇄 가변 영역과 제2 폴리펩타이드의 항-CD20 경쇄 가변 영역은 연합 (association)하여 CD20에 대한 항원 결합 단편을 형성하고, 제3 폴리펩타이드의 항-CD20 중쇄 가변 영역과 항-CD20 경쇄 가변 영역은 연합하여 CD20에 대한 항원 결합 단편을 형성하고, 제3 폴리펩타이드의 항-CD3ε 중쇄 가변 영역과 제4 폴리펩타이드의 항-CD3ε 경쇄 가변 영역은 연합하여 CD3ε에 대한 항원 결합 단편을 형성하고, 제1 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역과 제3 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역은 예를 들어 놉-인투-홀 (knob-into-hole) 방식, 공유 결합 또는 이황화 결합을 통해 함께 연합된다.
제1 폴리펩타이드에서 중쇄 불변 영역은 T366W 돌연변이를 가진 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 이들의 기능성 단편과 같이 놉 (knob)을 가진 중쇄 불변 영역일 수 있다. 제1 폴리펩타이드에서 중쇄 불변 영역은 서열번호 34의 아미노산 서열을 가진 인간 IgG1 중쇄 불변 영역과 같이 놉을 가지며 FcR 결합 친화성이 약하거나 없는 중쇄 불변 영역일 수 있다. 제3 폴리펩타이드에서 중쇄 불변 영역은 T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 가진 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 이들의 기능성 단편과 같이 홀을 가진 중쇄 불변 영역일 수 있다. 제3 폴리펩타이드에서 중쇄 불변 영역은 서열번호 33의 아미노산 서열을 가진 인간 IgG1 중쇄 불변 영역과 같이 홀을 가지며 FcR 결합 친화성이 약하거나 없는 중쇄 불변 영역일 수 있다.
대안적으로, 제1 폴리펩타이드에서 중쇄 불변 영역은 T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 가진 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 이들의 기능성 단편과 같이 홀을 가진 중쇄 불변 영역일 수 있다. 제1 폴리펩타이드에서 중쇄 불변 영역은 서열번호 33의 아미노산 서열을 가진 인간 IgG1 중쇄 불변 영역과 같이 홀을 가지며 FcR 결합 친화성이 약하거나 또는 없는 중쇄 불변 영역일 수 있다. 제3 폴리펩타이드에서 중쇄 불변 영역은 T366W 돌연변이를 가진 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 이들의 기능성 단편과 같이 놉을 가진 중쇄 불변 영역일 수 있다. 제3 폴리펩타이드에서 중쇄 불변 영역은 서열번호 34의 아미노산 서열을 가진 인간 IgG1 중쇄 불변 영역과 같이 놉을 가지며 FcR 결합 친화성이 약하거나 없는 중쇄 불변 영역일 수 있다.
제3 폴리펩타이드에서 항-CD20 중쇄 가변 영역과 항-CD20 경쇄 가변 영역은 링커를 이용해 연결될 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 아미노산 잔기 약 5-30개 길이의 펩타이드일 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 아미노산 잔기 약 10-30개 길이의 펩타이드일 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 아미노산 잔기 약 10-15개 길이의 펩타이드일 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 예를 들어 서열번호 28의 아미노산 서열을 가진 GS 링커일 수 있다.
제3 폴리펩타이드에서 항-CD20 중쇄 가변 영역 또는 항-CD20 경쇄 가변 영역은 링커를 통해 항-CD3ε 중쇄 가변 영역과 연결될 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 아미노산 잔기 약 5-30개 길이의 펩타이드일 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 아미노산 잔기 약 10-30개 길이의 펩타이드일 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 아미노산 잔기 약 10-15개 길이의 펩타이드일 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 예를 들어 서열번호 28의 아미노산 서열을 가진 GS 링커일 수 있다.
일 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 제3 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD20 중쇄 가변 영역, 항-CD20 경쇄 가변 영역, 항-CD3ε 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하거나; 또는 대안적으로 항-CD20 경쇄 가변 영역, 항-CD20 중쇄 가변 영역, 항-CD3ε 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 제1 폴리펩타이드에서 중쇄 불변 영역은 놉을 가질 수 있으며, 제3 폴리펩타이드에서 중쇄 불변 영역은 홀을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 제3 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD20 중쇄 가변 영역, 링커, 항-CD20 경쇄 가변 영역, 링커, 항-CD3ε 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 제3 폴리펩타이드는 서열번호 29 또는 30의 아미노산 서열을 함유할 수 있다.
2중 특이성 항체는 제4 폴리펩타이드의 항-CD20 경쇄 가변 영역의 C 말단에서 경쇄 불변 영역을 함유할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 서열번호 31의 아미노산 서열을 가진 것과 같은 인간 λ 경쇄 불변 영역일 수 있다.
다른 구현예에서, 2중 특이성 항체는
i) 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 함유한, 제1 폴리펩타이드,
ii) 항-CD20 경쇄 가변 영역을 함유한, 제2 폴리펩타이드,
iii) 항-CD3ε 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 함유한, 제3 폴리펩타이드, 및
iv) 항-CD20 중쇄 가변 영역, 항-CD20 경쇄 가변 영역 및 항-CD3ε 경쇄 가변 영역을 함유한, 제4 폴리펩타이드를 함유할 수 있으며,
여기서, 제1 폴리펩타이드의 항-CD20 중쇄 가변 영역과 제2 폴리펩타이드의 항-CD20 경쇄 가변 영역은 연합하여 CD20에 대한 항원 결합 단편을 형성하고, 제3 폴리펩타이드의 항-CD3ε 중쇄 가변 영역과 제4 폴리펩타이드의 항-CD3ε 경쇄 가변 영역은 연합하여 CD3ε에 대한 항원 결합 단편을 형성하고, 제4 폴리펩타이드에서 항-CD20 중쇄 가변 영역과 항-CD20 경쇄 가변 영역은 연합하여 CD20에 대한 항원 결합 단편을 형성하고, 제1 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역과 제3 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역은 예를 들어 놉-인투-홀 방식, 공유 결합 또는 이황화 결합을 통해 서로 연합된다.
일 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 제3 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD3ε 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 제4 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD20 중쇄 가변 영역, 항-CD20 경쇄 가변 영역 및 항-CD3ε 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 항-CD20 경쇄 가변 영역, 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 항-CD3ε 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 항-CD3ε 경쇄 가변 영역, 항-CD20 경쇄 가변 영역 및 항-CD20 중쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는 대안적으로 항-CD3ε 경쇄 가변 영역, 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 항-CD20 경쇄 가변 영역을 포함한다.
제1 및 제3 폴리펩타이드에서 중쇄 불변 영역과 관련하여, 하나는 T366W 돌연변이를 가진 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 이들의 기능성 단편과 같이, 놉을 가진 중쇄 불변 영역, 예를 들어, 서열번호 34의 아미노산 서열을 가진, 놉을 가지며 FcR 결합 친화성이 약하거나 또는 없는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역이고, 다른 것은 T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 가진 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 이들의 기능성 단편과 같이 홀을 가진 중쇄 불변 영역, 예를 들어, 서열번호 33의 아미노산 서열을 가진, 홀을 가지며 FcR 결합 친화성이 약하거나 또는 없는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역이다.
제4 폴리펩타이드에서 항-CD20 중쇄 가변 영역과 항-CD20 경쇄 가변 영역은 링커를 통해 연결될 수 있다. 제4 폴리펩타이드에서 항-CD20 중쇄 가변 영역 또는 항-CD20 경쇄 가변 영역은 링커를 통해 항-CD3ε 경쇄 가변 영역과 연결될 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 아미노산 잔기 약 5-30개 길이의 펩타이드일 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 아미노산 잔기 약 10-30개 길이의 펩타이드일 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 아미노산 잔기 약 10-15개 길이의 펩타이드일 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 예를 들어 서열번호 28의 아미노산 서열을 가진 GS 링커일 수 있다.
2중 특이성 항체는 제4 폴리펩타이드의 C 말단에 경쇄 불변 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 2중 특이성 항체는 항-CD3ε 경쇄 가변 영역, 항-CD20 중쇄 가변 영역 또는 항-CD20 경쇄 가변 영역의 C 말단에서 경쇄 불변 영역을 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 2중 특이성 항체는 항-CD3ε 경쇄 가변 영역의 C 말단에서 경쇄 불변 영역을 함유하며, 이는 서열번호 32 또는 23의 아미노산 서열을 가진 것과 같은 인간 λ 경쇄 불변 영역일 수 있다.
CD3 및 CD20을 표적으로 하는 본 발명의 2중 특이성 항체는, CD20-TCB와 같은 선행 기술의 항체와 비교해, 더 높은 CD3 결합 활성 및 비슷한 표적 세포 사멸 활성을 가지지만, 사이토카인 방출은 더 낮은 수준으로 유발한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역 또는 2중 특이성 분자를 코딩하는 핵산 분자 역시 본원에 포함되며, 아울러 이러한 핵산을 포함할 수 있는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함할 수 있는 숙주 세포도 본원에 포함된다. (1) 숙주 세포에서 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 발현하는 단계, 및 (ii) 숙주 세포 및 또는 이의 세포 배양물로부터 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 단리하는 단계를 포함할 수 있는, 숙주 세포를 이용해 본 발명의 항-CD3 항체 (2중 특이성 항체 등) 또는 이의 항원-결합 영역을 제조하는 방법 역시 제공한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역, 2중 특이성 분자, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있는 약학적 조성물 역시 제공한다.
제2 측면에서, 본 발명은 CD3 및 질환 관련 항원을 둘다 표적화하는 2중 특이성 분자의 제조에 있어, 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 영역의 용도를 제공한다.
질환 관련 항원은 CD20, CD19, CD22, CD4, CD24, CD38, CD123, CD228, CD138, BCMA, GPC3, CEA, CD276, gp100, 5T4, GD2, EGFR, MUC-1, PSMA, EpCAM, MCSP, SM5-1, MICA, MICB, ULBP 및 HER-2와 같은 종양 관련 항원일 수 있다. 질환 관련 항원은 CD4, BHsAg, LMP-1 및 LMP2와 같은 감염성 질환 관련 항원일 수 있다. 질환 관련 항원은 IL17R 및 CD6와 같은 염증성 질환 관련 항원일 수 있다. 특정 구현예에서, 질환 관련 항원은 CD20이다.
2중 특이성 분자는 링커를 통해 연결된 항원 결합성 도메인을 2개 함유한 재조합 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, 결합성 도메인 2개는 링커를 이용해 또는 링커 없이, 예를 들어, scFv-scFv, Fab-Fab 또는 scFv-Fab 형태로 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 2중 특이성 분자는 IgG 유사 항체이다. 일 구현예에서, 2중 특이성 항체는 CD3ε 결합성 도메인 하나와 CD20 결합성 도메인 2개를 함유한다. 일 구현예에서, CD20 결합성 도메인은 CD20에 특이적인, 항체 또는 이의 항원-결합 영역, 예를 들어, Fv 및/또는 scFv이다. 일 구현예에서, CD3 결합성 도메인은 본 발명의 항-CD3 항원 또는 이의 항원-결합 영역, 예를 들어, Fv일 수 있다.
이에, 본 발명은 (i) 2중 특이성 분자 또는 이의 기능성 모이어티를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포에서 2중 특이성 분자를 발현하는 단계, 및 (ii) 숙주 세포 또는 이의 세포 배양물로부터 2중 특이성 분자 또는 이의 기능성 모이어티를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 2중 특이성 분자의 제조 방법을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 약제학적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체에서 염증 질환을 치료 또는 완화하거나 또는 이식편 거부 반응을 감소 또는 소거하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 염증성 질환은 다발성 경화증 (MS) 또는 염증성 장 질환 (IBD, 예, 크론 질환)이다. 특정 구현예에서, 자가면역 질환은 1형 당뇨병이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 경구로 투여된다.
제4 측면에서, 본 발명은 본 발명의 2중 특이성 분자를 약제학적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체에서 질환을 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 질환은 종양이다. 특정 구현예에서, 질환은 감염성 질환이다. 특정 구현예에서, 질환은 염증성 질환 또는 자가면역 질환이다.
본 발명은 CD3 및 CD20에 대한 본 발명의 2중 특이성 항체를 약제학적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체에서 B 세포 관련 질환을 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다. B 세포 관련 질환은 B-세포 림프종, B-세포 백혈병 또는 B-세포 매개 자가면역 질환일 수 있다. B-세포 림프종 및 B-세포 백혈병으로는 비-제한적으로 비-호지킨 림프종 (NHL), 만성 림프성 백혈병 (CLL) 및 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL) 등이 있다. 특정 구현예에서, 개체는 2중 특이성 항체로 치료받기 전 항-CD20 항체를 투여받는다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 아래 상세한 설명 및 예들로부터 명확해질 것이나, 이로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전체에서 인용된 모든 참조문헌, 유전자은행 번호, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 명확하게도 원용에 의해 본원에 통합된다.
이에, 본 발명의 목적은 출원인이 권리를 유보하고 이로써 이전에 공지된 임의의 제품, 공정 또는 방법에 대해 권리불요구를 개시하도록 이전에 공개된 임의의 제품, 제품의 제조 공정 및 이러한 제품의 이용 방법을 본 발명에 포함하지 않는 것이다. 아울러, 본 발명은 출원인이 권리를 유보하고 이로써 이전에 언급된 임의의 제품, 제품 제조 공정 또는 제품 이용 방법에 대해 권리불요구를 개시하도록, USPTO (35 U.S.C. §112, 제1 단락) 또는 EPO (EPC 제83조)의 기술 및 실시가능한 요건을 총족하지 않는, 임의의 제품, 공정 또는 품 제조 또는 제품 이용 방법은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 의도하지 않음에 유념한다. 본 발명의 실시에서는 EPC 제53(c)조 및 EPC 규정 28(b) 및 (c)를 준수하는 것이 유리할 수 있다. 본 출원의 계열 또는 임의의 다른 계열 또는 임의의 제3자가 이전에 제출한 출원에서 출원인에게 승인된 임의의 특허(들) 내용인 모든 구현예를 명백하게 포기하는 권리는 명확하게 유보한다. 본원에서 어떤 것도 약속으로서 해석되어서는 안된다.
본원에서, 특히 청구항 및/또는 단락들에서, "포함한다", "포함하였다", "포함하는" 등과 같은 용어들은 미국 특허법에 의거한 의미를 가질 수 있으며; 예를 들어 이들 용어는 "함유한다", "함유하였다", "비롯하여" 등을 의미할 수 있으며; "로 필수적으로 구성되는" 및 "로 필수적으로 구성된다"와 같은 용어들은 미국 특허법에 의거한 의미를 가지며, 예를 들어 이들 용어는 명확하게 언급되지 않은 요소들을 허용하지만 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특징에 영향을 미치거나 또는 선행 기술에서 확인된 요소들은 제외한다는 점에 유념한다.
후술한 상세한 설명은 예로서 제시되지만 본 발명을 기술된 구체적인 구현예로만 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 첨부된 도면을 참조하여 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1은 키메라 항-CD3 항체 CD3-19의 인간 CD3ε (A) 및 원숭이 CD3ε (B)에 대한 결합 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 CD3-19의 인간 CD3+ T 세포에 대한 결합 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 친화성-성숙된 항체의 인간 CD3ε (A) 및 원숭이 CD3ε (B)에 대한 결합 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 친화성-성숙된 항체의 인간 CD3+ T 세포에 대한 결합 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 T 세포 증식에 대한, 2차 항체에 결합된 (되어 항체를 가교할 수 있는) 경우 (A) 또는 비-결합 (B)된 경우의, CD3-19 및 친화성-성숙된 항체의 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 인간화된 19-26 항체의 인간 CD3ε (A) 및 원숭이 CD3ε (B)에 대한 결합 활성, 및 인간화된 19-15 항체의 인간 CD3ε (C) 및 원숭이 CD3ε (D)에 대한 결합 활성을 나타낸 것이다.
도 7은 인간 CD3+ T 세포에 대한 인간화된 19-26 항체 (A) 및 인간화된 19-15 항체 (B)의 결합 활성을 나타낸 것이다.
도 8은 인터페론-γ (IFN-γ) 분비 (A) 및 CD69 발현 (B)에 의해 측정한, 2차 항체에 결합된 (되어 항체를 가교할 수 있는) 경우에, 인간화 항체가 T 세포를 활성화하는 능력을 나타낸 것이다.
도 9는 IFN-γ 분비 (A) 및 CD69 발현 (B)에 의해 측정한, 2차 항체가 비-결합된 경우에 인간화 항체가 T 세포를 활성화하는 능력을 나타낸 것이다.
도 10은 Fc 영역이 돌연변이된 인간화 항체의 HEK293A/인간 CD16A (A), HEK293A/인간 CD64 (B), HEK293A/인간 CD32A (C) 및 HEK293A/인간 CD32B (D)에 대한 결합 활성을 나타낸 것이다.
도 11은 Fc 영역이 돌연변이된 인간화 항체의 Jurkat 세포에 대한 결합 활성을 나타낸 것이다.
도 12는 2차 항체가 비-결합된 경우, Fc 영역이 돌연변이된 인간화 항체가 인간 PBMC에 의한 IFN-γ 분비 (A), CD25 발현 (B), CD69 발현 (C) 및 CD69 + CD25 공동-발현 (D)을 유도하는 능력을 나타낸 것이다.
도 13은 2차 항체에 결합된 (되어 항체를 가교할 수 있는) 경우에, Fc 영역이 돌연변이된 인간화 항체가 인간 PBMC에 의한 IFN-γ 분비 (A), CD25 발현 (B), CD69 발현 (C) 및 CD69 + CD25 공동-발현 (D)을 유도하는 능력을 나타낸 것이다.
도 14는 CD3 및 CD20에 대한 본 발명의 2중 특이성 항체의 구조를 도시한 개략도이다.
도 15는 인간 CD3ε (A) 및 원숭이 CD3ε (B)에 대한 2중 특이성 항체의 결합 활성을 나타낸 것이다.
도 16은 HEK293A/인간 CD20 (A), HEK293A/원숭이 CD20 (B), Jurkat 세포 (C) 및 원숭이 PBMC (D)에 대한 2중 특이성 항체의 결합 활성을 나타낸 것이다.
도 17은 2차 항체에 비-결합된 경우에, 2중 특이성 항체가 인간 PBMC에 의한 IFN-γ 분비 (A), 종양 괴사 인자-α (TNF-α) 분비 (B), CD69 발현 (C), CD25 발현 (D), 및 CD69 + CD25 공동-발현 (E)을 유도하는 능력을 나타낸 것이다.
도 18은 2중 특이성 항체에 의해 매개되는 인간 PBMC에 의한 CD20+ Raji 세포 사멸을 나타낸 것이다.
도 19는 CD20+ Raji 세포와 인큐베이션하였을 경우 PMBC에 의한 TNF-α 분비 (A), IFN-γ 분비 (B) 및 인터루킨-2 (IL-2) 분비 (C)를 유도하는 2중 특이성 항체의 능력을 나타낸 것이다.
도 20은 2중 특이성 항체에 의해 매개되는, 인간 T 세포에 의한 HEK293A/인간 CD20 세포 (A) 및 CD20- HEK293A 세포 (B)의 사멸을 나타낸 것이다.
도 21은 HEK293A/인간 CD20 세포와 인큐베이션하였을 경우 T 세포에 의한 IFN-γ 분비 (A) 및 TNF-α 분비 (C)를 유도하고, CD20- HEK293A 세포와 인큐베이션하였을 경우 T 세포에 의한 IFN-γ 분비 (B) 및 TNF-α 분비 (D)를 유도하는 2중 특이성 항체의 능력을 나타낸 것이다.
도 22는 1 ㎍/ml MIL62로 전처리되거나 또는 전처리되지 않은 인간 PBMC에 의한 IL-2 분비 (A), TNF-α 분비 (B), CD25 발현 (C), CD69 발현 (D) 및 CD69 + CD25 공동-발현 (E)에 대한, 1 ㎍/ml MIL62와 함께 처리하거나 또는 처리하지 않았을 경우의, 2중 특이성 항체의 효과를 나타낸 것이다.
도 23은 1 ㎍/ml MIL62와 공동-투여하거나 또는 투여하지 않은 MBS303-1 (A) 및 MBS303-2 (B)에 의해 매개되는 T 세포에 의한 HEK293A/인간 CD20 세포의 사멸을 나타낸 것이다.
도 24는 인간화된 PMBC를 가진 종양-보유 마우스에서 2중 특이성 항체의 생체내 항-종양 효과를 나타낸 것이다. (A) MBS303-2 또는 비히클 투여 후 3일, 10일 및 17일차의 종양 세포의 평균 형광 강도; (B) 약물 투여 후 10일 및 17일차 종양 이미징; 및 (C) 종양-보유 마우스의 생존 곡선.
본 발명을 더 쉽게 이해할 수 있도록, 일부 용어들을 먼저 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전체에서 기술된다.
용어 "CD3"는 γ, δ, ε 및 ζ 쇄를 포함하는 분화 클러스터 3 (cluster of differentiation 3)을 지칭한다. 용어 "CD3ε"는 ε 쇄를 지칭한다. 용어 "CD3"는 변이체, 이소형, 상동체, 오르소로그 (ortholog) 및 파라로그 (paralog)를 망라할 수 있다. 예를 들어, 인간 CD3 단백질 (예, CD3ε)에 특이적인 항체는 일부 경우 원숭이와 같이 인간 이외의 종으로부터 유래한 CD3 단백질과 교차-반응할 수 있다. 다른 구현예에서, 인간 CD3 단백질에 특이적인 항체는 인간 CD3 단백질에 완전히 특이적이고, 다른 종 또는 다른 유형의 것에 대해서는 교차-반응성이 없을 수 있거나, 또는 다른 종들 모두가 아닌 일부 다른 종으로부터 유래한 CD3에 대해 교차 반응할 수 있다.
용어 "인간 CD3ε"는 NCBI 등재번호: NP_000724.1의 아미노산 서열 (Wipa P et al., (2020) Immunology 159(3): 298-308) 또는 서열번호 24에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 같이 인간으로부터 유래한 아미노산 서열을 가진 CD3ε 단백질을 지칭한다. 용어 "원숭이 CD3ε"는 NCBI 등재번호: NP_ 001244149.1의 아미노산 서열과 같이 원숭이 유래 아미노산 서열을 가진 CD3ε 단백질을 지칭한다 (Maudhoo MD et al., (2014) Gigascience 3: 14).
용어 "CD20"은 pro-B 단계부터 시작해 성숙할 때까지 점진적으로 농도 증가하여 모든 B 세포의 표면에서 발현되지만, 조혈 줄기 세포, pro-B 세포 또는 정상 형질세포에서는 발현되지 않는, 마커 분자를 지칭한다. 용어 "인간 CD20"은 서열번호 35의 아미노산 서열과 같이 인간 유래 아미노산 서열을 가진 CD20 단백질을 지칭한다. 용어 "원숭이 CD20" 또는 "시노몰구스 CD20"은 서열번호 36의 아미노산 서열과 같이 원숭이 유래 아미노산 서열을 가진 CD20 단백질을 지칭한다.
본원에서 언급되는 용어 "항체"는 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM 전체 (whole) 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 영역") 또는 이의 단쇄를 망라한다. 전체 항체는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄와 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨)과 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨)과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 영역과 VL 영역은, 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 더 보존적인 영역들이 그 사이에 존재하는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 지칭되는 과변이 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 CDR 3개와 FR 4개로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 다음과 같은 순서로 정렬된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은, 면역계의 다양한 세포 (예, 작동자 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 비롯한, 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 항체의 용어 "항원-결합 영역" (또는 간단히 "항체 영역")은, 항원 (예를 들어, CD3 단백질)에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 가진 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 달성될 수 있는 것으로 입증되어 있다. 항체의 "항원-결합 영역"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는, (i) VL, VH, CL 및 C H1 도메인들로 구성되는 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지부에서 이황화 결합에 의해 연결된 Fab 단편 2개를 포함하는 2가 단편, 즉 F(ab')2 단편; (iii) VH 도메인과 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 싱글 이암의 VL 도메인과 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (vii) 가변성 도메인 하나와 불변 도메인 2개를 함유한 중쇄 가변 영역인 나노바디를 포함한다. 아울러, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH는 각각 개별 유전자들에 의해 암호화되지만, 이들은 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 형성하여 일가 분자 (단쇄 Fv (scFv)로 공지됨)를 형성하는 단백질 단쇄로서 제조할 수 있는 합성 링커에 의한 재조합 방법을 이용해 서로 연결할 수 있다 (예로, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883을 참조함). 이러한 단쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합 영역"이라는 용어에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 통상적인 기법을 이용해 수득되며, 단편은 온전한 (intact) 항체와 동일한 방식으로 유용성을 스크리닝한다.
용어 "FcR" 또는 "Fc 수용체"는 세포 또는 병원체에 부착하여 식세포 또는 세포독성 세포가 예를 들어 항체-매개 식세포작용 또는 항체-의존적인 세포-매개 세포독성에 의해 병원체 또는 표적 세포를 파괴하도록 자극하는, 항체의 Fc 단편을 인지하는, B 림프구, 자연 살상 세포 및 대식세포와 같은 일부 면역 세포의 표면에서 발현되는 단백질을 지칭한다. FcR로는 FcαR, FcεR 및 FcγR이 있으며, FcγR은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하며, FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B) 및 FcγRIIIA (CD16A)를 비롯하여, 미생물의 식세포작용을 유도하는데 가장 중요한 Fc 수용체이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "단리된 항체"는 다른 항원 특이성을 가진 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미한다 (예를 들어, CD3 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 CD3 단백질 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 인간 CD3 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는, 그러나, 다른 종의 CD3 단백질 등의 다른 항원에 대해 교차 반응성을 가질 수도 있다. 아울러, 단리된 항체에는 다른 세포성 물질 및/또는 화학제가 실질적으로 없을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동질적인 항체 집단을 지칭하며, 즉 집단을 구성하는 개개 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 잠재적인 자연 생성 돌연변이 및/또는 번역 후 수정 (예를 들어, 이성질화, 아미드화)을 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이며, 단일한 항원성 부위를 겨냥한다. 전형적으로 여러가지 결정기 (에피토프)들을 겨냥하는 여러가지 항체를 포함하는 다클론 항체 집단과는 대조적으로, 단일클론 항체는 항원의 하나의 결정기를 겨냥한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "2중 특이성" 분자는 표적 분자 2종에 특이적으로 결합하거나 또는 동일한 표적 분자에서 서로 다른 에피토프 2개에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 2중 특이성 항체는 CD3 및 질환 관련 항원에 특이적으로 결합하며, 이는 2중 특이성 분자의 일종이다. 대조적으로, "단일 특이성" 분자는 특정한 표적 분자, 특히 표적 분자 내 특정 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "마우스 항체"는 프래임워크 및 CDR 영역 둘다가 마우스 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 영역을 가진, 항체를 포괄하는 것으로 의도된다. 아울러, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 역시 마우스 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래한다. 본 발명의 마우스 항체는 마우스 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적인 돌연변이 유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "마우스 항체"는 다른 포유류 종의 생식계열로부터 유래한 CDR 서열이 마우스 프래임워크 서열에 삽입된 항체를 포괄하는 것으로 의도되는 것은 아니다.
용어 "키메라 항체"는 비-인간 소스의 유전 물질을 인간의 유전 물질과 조합하여 제조된 항체를 의미한다. 또한, 보다 일반적으로는, 키메라 항체는 특정 종의 유전 물질을 다른 종의 유전 물질과 함께 가진 항체이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 천연적으로 인간에서 생성되는 항체 변이체들에 대한 유사성을 높이기 위해 변형된 단백질 서열을 가진 비-인간 종으로부터 유래한 항체를 의미한다.
"항원을 인지하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"라는 표현은 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호 호환적으로 사용된다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "인간 CD3에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 CD3 단백질 (및 잠재적으로 하나 이상의 비-인간 종으로부터 유래한 CD3 단백질)에 결합하지만 CD3가 아닌 단백질에는 실질적으로 결합하지 않는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 항체는 "고 친화성"으로, 즉 KD 1.0 x10-8 M 이하, 더 바람직하게는 5.0 x10-9 M 이하, 더 바람직하게는 1.0 x 10-9 M 이하로, 인간 CD3 단백질에 결합한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 단백질 또는 세포에 "실질적으로 결합하지 않는다"라는 표현은, 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나 또는 고 친화성으로 결합하지 않는다는 것을 의미하며, 즉, KD 1.0 x 10-6 M 이상, 더 바람직하게는 1.0 x 10-5 M 이상, 더 바람직하게는 1.0 x 10-4 M 이상, 더 바람직하게는 1.0 x 10-3 M 이상, 보다 더 바람직하게는 1.0 x 10-2 M 이상으로 단백질 또는 세포에 결합하는 것을 의미한다.
IgG 항체에 대한 용어 "고 친화성"은 표적 항원에 대한 KD가 1.0 x 10-6 M 이하, 더 바람직하게는 5.0 x 10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 1.0 x 10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 1.0 x 10-9 M 이하, 보다 더 바람직하게는 5.0 x 10-10 M 이하인 항체를 지칭한다. 그러나, "고 친화성" 결합은 다른 항체 이소형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고 친화성" 결합은 KD가 10-6 M 이하, 더 바람직하게는 10-7 M 이하, 보다 더 바람직하게는 10-8 M 이하인 항체를 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정한 항체-항원 상호작용의 결합 속도를 지칭하는 것으로 의도되며, 본 발명에서 사용되는 바와 같이 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "KD"는 Ka에 대한 Kd 비율 (즉, Kd/Ka)로 결정되고, 몰 농도 (M)로서 표시되는, 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 항체에 대한 KD 값은 당해 기술 분야에서 잘 확립된 방법을 이용해 결정할 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 바람직한 방법은 표면 플라스몬 공명을 이용하는, 바람직하게는 BiacoreTM 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 이용하는 것이다.
용어 "EC50"은 또한 최고 유효 농도의 1/2로도 알려져 있으며, 명시된 노출 시간이 경과한 후 베이스라인과 최고 수준 사이의 중간 수준에 해당하는 반응을 유도하는 항체의 농도를 의미한다.
용어 "IC50"은 또한 최고 저해 농도의 1/2로도 알려져 있으며, 특정한 생물학적 또는 생화학적 기능을 항체 부재시에 대해 50%까지 저해하는 항체의 농도를 의미한다.
용어 "가교한다" 또는 "가교"는 면역 세포 상의 FcR에 항체 Fc 영역이 결합함으로써 또는 표적 세포 상의 질환 관련 항원에 (예, 항원을 표적화하는 2중 특이성 분자의 모이어티에 의한) 항체가 결합함으로써 이루어지는 항체들의 응집 (aggregation)을 의미한다. 시험관내 검사에서, 항체 가교는 항체가 예를 들어, ELISA 플레이트에 커플링된 2차 항체에 결합하는 경우에 이루어진다. 본 발명의 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 항체 가교가 이루어지면 T 세포를 활성화할 수 있다. 대조적으로, 서로 또는 다른 분자와 상호작용해 항체 이량체 또는 폴리머를 형성하지 않는 본 발명의 "유리 (free)" 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 T 세포를 활성화하지 못한다.
용어 "개체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포괄한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유류 및 비-포유류, 예를 들어 인간을 제외한 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함하며, 인간을 제외한 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말과 같은 포유류가 바람직하다.
용어 "치료학적 유효량"은 질환 또는 병태 (예, 만성 염증)와 관련한 증상을 예방 또는 개선하거나, 및/또는 질환 또는 병태의 중증도를 낮추는데 충분한 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역의 양을 의미한다. 치료학적 유효량은 치료하고자 하는 병태 맥락에서 이해되며, 실제 유효량은 당해 기술 분야의 당업자에 의해 쉽게 결정된다.
본 발명의 다양한 측면들을 아래 하위 단락들에서 추가로 기술한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 기존 항-CD3 항체와 비교해 인간 및 원숭이 CD3에 대해 더 높지 않더라도 비슷한 결합력으로 특이적으로 결합한다.
본 발명의 "유리" 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 CD3에 결합할 순 있지만 T 세포를 활성화하지 못하지만, 항체 가교가 이루어진다면 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 CD3에 결합해 T 세포를 활성화할 수 있다.
따라서, FcR 결합 친화성이 약하거나 또는 없도록 제조된 본 발명의 항체 또는 항원-결합 영역은 체내에서 "유리"형이거나 또는 실질적으로 "유리"형일 수 있으며, 이를 이용한 내약성 (tolerance)을 유도함으로써 염증 질환 및 자가-면역 질환을 치료할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 CD3, 및 종양 관련 항원 또는 예를 들어 감염성 질환 또는 염증성 질환과 관련한 항원 등의 다른 표적을 겨냥하는 non-FcR 결합성의 2중 특이성 항체의 일환으로서 제조될 수 있으며, 이는 CD3 이외의 다른 표적에 결합하여 가교되면 T 세포가 활성화되고, 예를 들어 SMAP를 방출함으로써 표적 세포를 살상한다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 CD3 및 종양 관련 항원을 겨냥하는 2중 특이성의 non-FcR 결합성 항체의 일부로서 제조될 수 있으며, 이의 가교는 병변 부위에서 종양 관련 항원에 결합하였을 경우에만 이루어진다. 2중 특이성 항체는, 항체 가교가 이루어졌을 때 T 세포가 종양 세포를 살상하도록 활성화한다. 보다 중요하게는, 기존의 항-CD3 항체와 비교해, 본 발명의 2중 특이성 항체는 가교시 사이토카인 방출을 거의 유발하지 았으며, 그래서 독성이 낮다.
본 발명의 예시적인 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 하기 실시예에서 기술되고 후술한 바와 같이 구조적으로 및 화학적으로 특정된다. 중쇄 가변 영역 CDR 및 경쇄 가변 영역 CDR은 Kabat 번호 지정 시스템에 따라 정의되며, 이의 서열 ID 번호는 아래 표 1에 표시된다. 그러나, 당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, CDR 영역들은, 중쇄/경쇄 가변 영역 서열에 기반하여, Chothia, IMGT, AbM 또는 Contact 번호 지정 체계/방법 등의 다른 체계에 의해 결정될 수 있다. 중쇄/경쇄 가변 영역의 서열 ID 번호 역시 표 1에 표시되며, 일부 항체는 동일한 VH 및/또는 VL을 공유한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 예를 들어, 인간 IgG1 (N297A), 예를 들어, 서열번호 22 (X1=A, X2=A, X3=N, X4=P)의 아미노산 서열을 가진 인간 IgG1 (L234A+L235A), 예를 들어, 서열번호 22 (X1=A, X2=A, X3=N, X4=G)의 아미노산 서열을 가진 인간 IgG1 (L234A+L235A+P329G), 예를 들어, 서열번호 22 (X1=A, X2=A, X3=A, X4=P)의 아미노산 서열을 가진 인간 IgG1 (L234A+L235A+N297A), 예를 들어, 서열번호 22 (X1=A, X2=A, X3=A, X4=G)의 아미노산 서열을 가진 인간 IgG1 (L234A+L235A+N297A+P329G), 인간 IgG2 (V234A+V237A), 인간 IgG1 (L234A+V235E) 중쇄 불변 영역, 또는 이들의 기능성 단편 등의, FcR 결합 친화성이 약하거나 또는 없는, 중쇄 불변 영역을 함유할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 서열번호 23 또는 32의 아미노산 서열을 가진 인간 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역 등의 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역일 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 다른 기능성 분자, 예를 들어, 다른 펩타이드 또는 단백질 (예, 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)와 연결되어, 2 이상의 서로 다른 결합 부위 또는 표적 분자들에 결합하는 이중 특이성 분자를 구축하는, 본 발명의 하나 이상의 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 포함하는 이중 특이성 분자에 관한 것이다. 즉, 본 발명에 사용되는 바와 같이, "이중 특이성 분자"는 결합 특이성을 3개 이상 가진 분자를 포함한다.
이중 특이성 분자는, CD3 결합 특이성 외에도, 질환 관련 항원, 바람직하게는 병변 세포 상에 독특하게 발현되거나 또는 대안적으로 정상적인 카운터파트 상에서는 낮은 수준이지만 병변 세포 상에서는 높은 수준으로 발현되는 질환 관련 항원에 대해 제2의 특이성을 가진다.
특정 구현예에서, 질환 관련 항원은 CD20, CD19, CD22, CD4, CD24, CD38, CD123, CD228, CD138, BCMA, GPC3, CEA, CD276, gp100, 5T4, GD2, EGFR, MUC-1, PSMA, EpCAM, MCSP, SM5-1, MICA, MICB, ULBP 및 HER-2와 같은 종양 관련 항원이다.
특정 구현예에서, 질환 관련 항원은 병원체 또는 감염된 세포 상의 마커 단백질과 같은 감염성 질환 관련 항원이다. 감염성 질환 관련 항원은 CD4, BHsAg, LMP-1 및 LMP2일 수 있으며, 여기서 CD4는 AIDS 치료의 표적이다.
특정 구현예에서, 질환 관련 항원은 비-제한적으로 IL17R 및 CD6 등의 염증을 유발하는, 활성 면역 세포 상에 발현되는 마커 단백질과 같은 염증성 질환 관련 항원이다.
이중 특이성 분자는 많은 여러가지 포맷과 크기를 가질 수 있다. 이중 특이성 분자는, 크기 스펙트럼의 한쪽 끝은, 동일한 특이성을 가진 결합 아암 2개를 가지는 대신 각각 서로 다른 특이성을 가진 결합 아암 2개를 가지는 것을 제외하고는, 전통적인 항체 포맷을 유지하는 것이다. 다른 쪽 끝은 펩타이드 체인에 의해 연결된 2개의 단쇄 항체 단편 (scFv)으로 구성되는, 소위 Bs(scFv)2 구조체로 지칭되는, 이중 특이성 분자이다. 중간-크기의 이중 특이성 분자는 펩티딜 링커에 의해 연결된 서로 다른 F(ab) 단편 2개를 포함한다. 이러한 포맷의 이중 특이성 분자와 다른 포맷의 이중 특이성 분자는 유전자 조작, 체세포 교잡 (somatic hybridization) 또는 화학적 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 인용된 Kufer et al; Cao and Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635-644 (1998); 및 van Spriel et al., Immunology Today, 21 (8), 391-397 (2000)과, 이들 문헌에 인용된 참조문헌들을 참조한다.
본 발명의 2중 특이성 분자는 T 세포를 표적 세포에 가까이 접근시키게 한다. 2중 특이성 분자가 질환 관련 항원에 결합하면 2중 특이성 분자에 대해 가교가 이루어지고, T 세포가 활성화되어 표적 세포를 살상할 수 있다.
특정 구현예에서, 질환 관련 항원은 pre-B 세포 및 성숙 B 세포 상에 존재하지만 조혈 줄기 세포, pro-B 세포 또는 정상적인 형질세포 상에는 존재하지 않는 마커인 CD20로서, 이는 B 세포 림프종 및 B 세포 백혈병의 진단 및/또는 치료에서 기대되는 항원이다.
본 발명의 2중 특이성 항체는 CD3ε 결합성 도메인 하나와 CD20 결합성 도메인 1-5개를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 2중 특이성 항체는 CD3ε 결합성 도메인 하나와 CD20 결합성 도메인 2개를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, CD20 결합성 도메인은 CD20에 특이적인, 항체 또는 이의 항원-결합 영역, 예를 들어, Fv 및/또는 scFv이다. 일 구현예에서, CD3 결합성 도메인은 본 발명의 항-CD3 항원 또는 이의 항원-결합 영역, 예를 들어, Fv일 수 있다. CD20 결합성 도메인 2개는 동일한 에피토프 또는 서로 다른 항원 에피토프에 결합할 수 있거나, 동일한 또는 서로 다른 항원 결합성 도메인 서열을 함유할 수 있거나, 및/또는 동일한 또는 서로 다른 항원-결합성 도메인 포맷을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 2중 특이성 항체는 CD3에 특이적으로 결합하는 Fv 하나, CD20에 특이적으로 결합하는 Fv 하나, 그리고 CD20에 특이적으로 결합하는 scFv 하나를 함유한다. 일 구현예에서, CD20에 결합하는 Fv 및 scFv는 동일한 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 가진다.
CD3 및 CD20을 겨냥하는 2중 특이성 항체는 IgG 유사 항체일 수 있다. 일 구현예에서, 2중 특이성 항체는 CD3에 특이적인 half-IgG, CD20에 특이적인 half-IgG 및 anti-CD3 half-IgG의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 N 말단에 연결된 CD20에 대한 scFv를 포함한다.
일 구현예에서, 2중 특이성 항체는
i) 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 함유한, 제1 폴리펩타이드;
ii) 항-CD20 경쇄 가변 영역을 함유한, 제2 폴리펩타이드;
iii) 항-CD20 중쇄 가변 영역, 항-CD20 경쇄 가변 영역, 항-CD3ε 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 함유한, 제3 폴리펩타이드; 및
iv) 항-CD3ε 경쇄 가변 영역을 함유한, 제4 폴리펩타이드를 함유할 수 있으며,
여기서, 제1 폴리펩타이드의 항-CD20 중쇄 가변 영역과 제2 폴리펩타이드의 항-CD20 경쇄 가변 영역은 연합하여 CD20에 대한 항원 결합 단편을 형성하고, 제3 폴리펩타이드에서 항-CD20 중쇄 가변 영역과 항-CD20 경쇄 가변 영역은 연합하여 CD20에 대한 항원 결합 단편을 형성하고, 제3 폴리펩타이드의 항-CD3ε 중쇄 가변 영역과 제4 폴리펩타이드의 항-CD3ε 경쇄 가변 영역은 연합하여 CD3ε에 대한 항원 결합 단편을 형성하고, 제1 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역과 제3 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역은 예를 들어 놉-인투-홀 방식, 공유 결합 또는 이황화 결합을 통해 서로 연합된다.
일 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 제3 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD20 중쇄 가변 영역, 항-CD20 경쇄 가변 영역, 항-CD3ε 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하거나; 또는 대안적으로 항-CD20 경쇄 가변 영역, 항-CD20 중쇄 가변 영역, 항-CD3ε 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 제1 폴리펩타이드에서 중쇄 불변 영역은 놉을 가지고, 제3 폴리펩타이드에서 중쇄 불변 영역은 홀을 가진다.
다른 구현예에서, 2중 특이성 항체는
i) 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 함유한, 제1 폴리펩타이드;
ii) 항-CD20 경쇄 가변 영역을 함유한, 제2 폴리펩타이드;
iii) 항-CD3ε 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 함유한, 제3 폴리펩타이드; 및
iv) 항-CD20 중쇄 가변 영역, 항-CD20 경쇄 가변 영역 및 항-CD3ε 경쇄 가변 영역을 함유한, 제4 폴리펩타이드를 함유할 수 있으며,
여기서, 제1 폴리펩타이드의 항-CD20 중쇄 가변 영역과 제2 폴리펩타이드의 항-CD20 경쇄 가변 영역은 연합하여 CD20에 대한 항원 결합 단편을 형성하고, 제3 폴리펩타이드의 항-CD3ε 중쇄 가변 영역과 제4 폴리펩타이드의 항-CD3ε 경쇄 가변 영역은 연합하여 CD3ε에 대한 항원 결합 단편을 형성하고, 제4 폴리펩타이드에서 항-CD20 중쇄 가변 영역과 항-CD20 경쇄 가변 영역은 연합하여 CD20에 대한 항원 결합 단편을 형성하고, 제1 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역과 제3 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역은 예를 들어 놉-인투-홀 방식, 공유 결합 또는 이황화 결합을 통해 서로 연합된다.
일 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 제3 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD3ε 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 제4 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD20 중쇄 가변 영역, 항-CD20 경쇄 가변 영역 및 항-CD3ε 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 항-CD20 경쇄 가변 영역, 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 항-CD3ε 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 항-CD3ε 경쇄 가변 영역, 항-CD20 경쇄 가변 영역 및 항-CD20 중쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는 대안적으로 항-CD3ε 경쇄 가변 영역, 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 항-CD20 경쇄 가변 영역을 포함한다.
2중 특이성 항체에서 항-CD20 중쇄 가변 영역은 링커를 통해 항-CD20 경쇄 가변 영역과 연결되어 scFv를 형성할 수 있다. 항-CD20 중쇄 가변 영역 또는 항-CD20 경쇄 가변 영역은 링커를 통해 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 영역과 연결될 수 있다.
링커는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산, 바람직하게는 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 5-30개로 구성될 수 있으며, 여기서 아미노산은 자연 생성 아미노산 20개로부터 선택된다. 이들 아미노산 중 하나 이상은 당해 기술 분야의 당업자에게 이해되는 바와 같이 당화될 수 있다. 일 구현예에서, 아미노산 5-30개가 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 라이신으로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 대부분 글리신 및 알라닌과 같이 입체적으로 방해되지 않는 아미노산으로 구성된다. 예시적인 링커는 폴리글리신, 특히 폴리(Gly-Ala) 및 폴리알라닌이다. 본원에서 링커의 일예는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가진 링커이다.
또한, 링커는 비-펩타이드 링커일 수 있다. 예를 들어, -NH-, -(CH2)s-C(O)-와 같은 알킬 링커도 이용될 수 있으며, 여기서 s=2-20이다. 이들 알킬 링커는 저급 알킬 (예를 들어, C1-4), 저급 아실, 할로겐 (예를 들어, CI, Br), CN, NH2, 페닐 등과 같이 임의의 입체 비-간섭 기 (non-sterically hindering group)에 의해 추가로 치환될 수 있다.
다른 구현예에서, 항-CD3 항체, 및 예를 들어, CD3 및 CD20를 겨냥하는 2중 특이성 항체를 비롯한 본 발명의 항체는 중쇄 및/또는 경쇄 가변성 영역 서열 또는 하나 이상의 보존적인 변형을 가진 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함할 수 있다. 당해 기술 분야에서 항원 결합을 제거하는 일부 보존적인 서열 변형이 행해질 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, Brummell et al., (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al., (1997) Prot . Eng . 10:835-41; Komissarov et al., (1997) J. Biol . Chem . 272:26864-26870; Hall et al., (1992) J. Immunol . 149:1605-12; Kelley and O'Connell (1993) Biochem.32:6862-35; Adib-Conquy et al., (1998) Int . Immunol.10:341-6; 및 Beers et al., (2000) Clin . Can. Res. 6:2835-43을 참조한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보존적인 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유한 항체의 결합 특징에 유의하게 영향을 미치지 않거나 또는 변형하지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 보존적인 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결손을 포함한다. 변형은 부위-특이적인 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발 등의 당해 기술 분야에 공지된 표준 기법에 의해 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적인 아미노산 치환은, 아미노산 잔기를 비슷한 측쇄를 가진 아미노산으로 치환되는 것이다. 비슷한 측쇄를 가진 아미노산 잔기 계열들은 당해 기술 분야에서 정의되어 있다. 이들 계열은 염기성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비-하전된 극성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비-극성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지형 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열에 속하는 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있으며, 변형된 항체는 본원에 기술된 기능성 분석을 이용해 보유 기능 (즉, 전술한 기능)을 검사할 수 있다.
항-CD3 항체, 및 예를 들어, CD3 및 CD20을 겨냥하는 2중 특이성 항체를 비롯한 본 발명의 항체는 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 본 발명의 항체의 VH/VL 서열들 중 하나 이상을 가진 항체를 이용해 제조할 수 있다. 항체는 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 중 하나 또는 둘다에서, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역에서 및/또는 하나 이상의 프래임워크 영역에서, 하나 이상의 잔기를 변형하여, 조작할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 항체는, 예를 들어, 항체의 작동자 기능(들)을 변형하기 위해, 불변 영역(들) 내 잔기를 변형하여, 조작할 수 있다.
특정 구현예에서, CDR 그래프팅 (grafting)을 이용해 항체의 가변 영역을 조작할 수 있다. 항체는 대개 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 6개에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내 아미노산 서열은 CDR의 외부 서열에 비해 개별 항체들 사이에 다양성이 매우 높다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하므로, 다른 특성을 가진 다른 항체로부터 유래한 프래임워크 서열에 그래프팅된 특정한 자연 생성 항체로부터 유래하는 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써, 특정한 자연 생성 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다 (예를 들어, Riechmann et al., (1998) Nature 332:323-327; Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad U.S.A. 86:10029-10033; 미국 특허 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370을 참조함).
이에, 본 발명의 다른 구현예는, 전술한 바와 같이, 본 발명의 서열을 포함할 수 있는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역, 및/또는 전술한 바와 같이, 본 발명의 서열을 포함할 수 있는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 영역, 및/또는 2중 특이성 항체에 관한 것이다. 이들 항체는 본 발명의 단일클론 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하되 서로 다른 프래임워크 서열을 포함할 수 있다.
이러한 프래임워크 서열은 생식계열의 항체 유전자 서열을 포함하는 공개된 참조문헌 또는 공개된 DNA 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자들에 대한 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스 (인터넷 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능) 뿐 아니라 전술한 Kabat et al., (1991); Tomlinson et al., (1992) J. Mol . Biol . 227:776-798; 및 Cox et al., (1994) Eur . J. Immunol . 24:827-836에서 확인할 수 있으며; 이들 각각의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다. 다른 예로, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 유전자은행 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 예를 들어, HCo7 HuMAb 마우스에서 발견되는 다음과 같은 생식계열의 중쇄 서열은 첨부된 유전자은행 등재 번호로 이용가능하다: 1-69 (NG--0010109, NT--024637 & BC070333), 3-33 (NG--0010109 & NT--024637) 및 3-7 (NG--0010109 & NT--024637). 다른 예로, HCo12 HuMAb 마우스에서 발견되는 다음과 같은 생식계열의 중쇄 서열은 첨부된 유전자은행 등재 번호로 이용가능하다: 1-69 (NG--0010109, NT--024637 & BC070333), 5-51 (NG--0010109 & NT--024637), 4-34 (NG--0010109 & NT--024637), 3-30.3 (CAJ556644) & 3-23 (AJ406678).
항체 단백질 서열들은, 편집된 단백질 서열 데이터베이스에서, 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 공지된, Gapped BLAST (상기 Altschul et al., (1997) 문헌)로 지칭되는 서열 유사성 검색 방법들 중 하나를 사용해, 비교한다.
본 발명의 항체에 사용하기 바람직한 프래임워크 서열은 본 발명의 항체에 의해 사용되는 프래임워크 서열과 구조적으로 비슷한 것이다. VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을, 프래임워크 서열의 기원이 되는 생식계열의 면역글로불린 유전자에서 발견되는 서열과 동일한 서열을 가진 프래임워크 영역에 그래프팅하거나, 또는 CDR 서열을, 생식계열의 서열과 비교해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 프래임워크 영역에 그래프팅할 수 있다. 예를 들어, 일부 예에서, 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 강화하기 위해 프래임워크 영역 내 잔기를 돌연변이 유발하는 것이 유익한 것으로 밝혀져 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370을 참조함).
다른 타입의 가변 영역의 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내 아미노산 잔기에 돌연변이를 유발함으로써 대상 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예, 친화성)을 개선하는 것이다. 부위-특이적인 돌연변이 유발 또는 PCR-매개 돌연변이 유발을 수행하여 돌연변이(들)를 도입할 수 있으며, 항체 결합에 대한 효과 또는 다른 목적한 기능 특성을 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 시험관내 또는 생체내 분석으로 평가할 수 있다. 바람직하게는, (당해 기술 분야에 공지된 바와 같이) 보존적인 변형이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결손일 수 있으며, 바람직하게는 치환이다. 아울러, 전형적으로 CDR 영역에서 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 잔기가 변형된다.
본 발명의 조작된 항체는 예를 들어, 항체의 특성을 개선하기 위해 VH 및/또는 VL 내 프래임워크 잔기에 변형을 행하는 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프래임워크 변형은 항체의 면역원성을 낮추기 위해 수행된다. 예를 들어, 한가지 방법은 하나 이상의 프래임워크 잔기를 대응되는 생식계열의 서열로 "역 돌연변이"하는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이된 항체는 항체의 기원이 되는 생식계열의 서열과는 상이한 프래임워크 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프래임워크 서열을 항체가 기원한 생식계열의 서열과 비교함으로써 식별할 수 있다.
다른 타입의 프래임워크 변형은 프래임워크 영역 내, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역내 하나 이상의 잔기를 변형하여, T 세포 에피토프를 제거함으로써, 항체의 잠재적인 면역원성을 낮추는 것을 수반한다. 이러한 방식은 "면역원성 제거 (deimmunization)"라 하며, 이는 미국 특허 공개번호 20030153043에 보다 상세하게 기술되어 있다.
프래임워크 또는 CDR 영역에서 이루어진 변형과 더불어 또는 이의 대안으로서, 본 발명의 항체는, 전형적으로 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합성 및/또는 항원-의존적인 세포성 세포독성 등의 항체의 한가지 이상의 기능적인 특성을 변형하기 위해, Fc 영역에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는, 재차 항체의 한가지 이상의 기능적인 특성을 변형하기 위해, 화학적으로 변형되거나 (예, 하나 이상의 화학적 모이어티를 항체에 결합시킬 수 있음) 또는 이의 당화를 바꾸도록 변형될 수 있다.
일 구현예에서, CH1의 힌지부는, 힌지부 내 시스테인 잔기의 개수가 달라지 되도록, 예를 들어 증가 또는 감소하도록, 변형된다. 이러한 방식은 미국 특허 5,677,425에 추가적으로 기술되어 있다. CH1의 힌지부 내 시스테인 잔기의 개수는, 예를 들어 경쇄 또는 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 높이거나 또는 낮추기 위해, 변형된다.
다른 구현예에서, 항체의 Fc 힌지부는 항체의 생물학적 반감기를 단축하도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는, 항체가 네이티브 Fc-힌지 도메인 SpA 결합성과 비교해 손상된 스타필로코커스 단백질 A (SpA) 결합성을 가지도록, Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입된다. 이러한 방식은 미국 특허 6,165,745에 더 상세히 기술되어 있다.
특정 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 감소된 FcR 또는 보체 시스템 단백질 결합 친화성을 가지도록 돌연변이될 수 있다. 아미노산 잔기 돌연변이는 예를 들어, 인간 IgG1 중쇄 불변 영역에서의 N297A, L234A+L235A, L234A+V235E, L234A+L235A+P329G, L234A+L235A+N297A 및 L234A+L235A+N297A+P329G, 그리고 인간 IgG2 중쇄 불변 영역에서의 V234A+V237A일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 항체는 당화가 변형된다. 예를 들어, 비-당화된 (aglycosylated) 항체를 제조할 수 있다 (즉, 항체에 당화가 결핍됨). 당화는, 예를 들어 항체의 항원 친화성을 높이도록 변형될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열 내 하나 이상의 당회 부위를 변형함으로써, 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환을 수행하여, 하나 이상의 가변 영역 프래임워크의 당화 부위를 제거함으로써, 그 부위에서 당화를 없앨 수 있다. 이러한 비-당화는 항원에 대한 항체의 친화성을 높일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,714,350 및 6,350,861을 참조한다.
부가적으로 또는 대안적으로, 푸코실 잔기가 양적으로 감소된 저-푸코실화 (hypofucosylated) 항체 또는 바이섹팅 (bisecting) GlcNac 구조가 증강된 항체 등의, 당화 타입이 변형된 항체를 제조할 수 있다. 이러한 변형된 당화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 높이거나 또는 낮추는 것으로 입증되어 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 변형된 당화 기구를 이용해 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써, 달성할 수 있다. 당화 기구가 변형된 세포는 당해 기술 분야에 기술되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 숙주 세포로서 이용해 당화가 변형된 항체를 생산할 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709에는 푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8 (α(1,6)-푸코실트랜스퍼라제)가 결핍되어 있어, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체는 이의 탄수화물에 푸코스가 없다. Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 2개의 치환 벡터를 사용해 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자를 표적 파괴함으로써 구축한다 (미국 특허 공개번호 20040110704 및 Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22를 참조함). 다른 예로, EP 1,176,195에는 푸코실 트랜스퍼라제를 암호화하는 FUT8 유전자가 기능적으로 파괴되어, 이러한 세포주에서 발현된 항체가 α-1,6-결합된-관련 효소의 저하 또는 소거로 인해 저-푸코실화를 보이는, 세포주가 개시되어 있다. 또한, EP 1,176,195에는 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하는 활성이 낮은 효소를 가지거나 또는 효소 활성이 없는 세포주, 예를 들어 랫 골수종 세포주 YB2/0 (ATCC CRL 1662)가 개시되어 있다. PCR 공개공보 WO 03/035835에는, Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 결합시키는 능력이 저하된, 또한 숙주 세포에서 발현되는 항체의 저-푸코실화를 달성하는, CHO 세포주 변이체, Lec13 세포가 개시되어 있다 (Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740 참조). 당화 프로파일이 변형된 항체는 또한 PCT 공개공보 WO 06/089231에 기술된 바와 같이 계란에서 생산할 수 있다. 대안적으로, 당화 프로파일이 변형된 항체는 렘나 (Lemna)와 같은 식물 세포에서 생산할 수 있다. 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용해 절단 제거할 수 있으며; 예를 들어, 푸코시다제 α-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다 (Tarentino et al., (1975) Biochem. 14:5516-23).
본 발명에서 고려되는 본 발명의 항체에 대한 다른 변형은 페길화 (pegylation)이다. 항체는, 예를 들어 항체의 생물학적 (예, 혈청) 반감기를 연장하기 위해 페길화될 수 있다. 항체를 페길화하기 위해, 항체 또는 그 단편을, 전형적으로 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데하이드 유도체와 같은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과, 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 결합하는 조건 하에, 반응시킨다. 바람직하게는, 페길화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 폴리머)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 이루어진다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용된 바 있는 임의 형태의 PEG를 포괄하는 것으로 의도된다. 특정 구현예에서, 페길화할 항체는 비-당화된 항체이다. 단백질의 페길화 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EPO 154 316 및 EP 0 401 384를 참조한다.
항-CD3 항체, 및 예를 들어, CD3 및 CD20를 겨냥하는 2중 특이성 항체를 비롯한 본 발명의 항체는, 서로 다른 클래스를 검출하거나 및/또는 구분하기 위해, 다양한 물리적 특성으로 특정될 수 있다.
예를 들어, 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에 하나 이상의 당화 부위를 포함할 수 있다. 이러한 당화 부위는 항원 결합성 변형으로 인해 항체의 pK 변형 또는 항체의 면역원성 증가가 달성될 수 있다 (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706). 당화는 N-X-S/T 서열을 가진 모티프에서 생길 수 있는 것으로 알려져 있다. 일부 경우에, 가변 영역에 당화를 포함하지 않는 항-CD3 항체를 확보하는 것이 바람직하다. 이는 가변 영역에 당화 모티프를 포함하지 않는 항체를 선택하거나 또는 당화 영역 내 잔기를 돌연변이화함으로써, 달성될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항체는 아스파라긴 이성질화 부위 (asparagine isomerism site)를 포함하지 않는다. N-G 또는 D-G 서열에서 아스파라긴의 탈아미드화가 발생할 수 있으며, 그래서 폴리펩타이드 체인에 킹크 (kink)를 도입하여 이의 안정성을 떨어뜨리는 (이소아스파르트산 효과) 이소아스파르트산을 구현할 수 있다.
각각의 항체는 고유한 등전점 (pI)을 가질 것이며, 이는 일반적으로 pH 6-9.5 범위에 포함된다. IgG1 항체의 pI는 전형적으로 pH 7-9.5 범위이고, IgG4 항체의 pI는 전형적으로 pH 6-8 범위이다. pI가 정상 범위를 벗어난 항체는 생체내 조건에서 일부 비-폴딩되어 불안정할 수 있는 것으로 추측된다. 따라서, 정상 범위의 pI 값을 가진 항-CD3 항체를 가지는 것이 바람직하다. 이는 pI가 정상 범위인 항체를 선택하거나 또는 하전된 표면 잔기를 변형함으로써 달성할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은, 항-CD20 중쇄 가변 영역-링커-항-CD20 경쇄 가변 영역-링커-항-CD3 중쇄 가변 영역, 항-CD20 경쇄 가변 영역-링커-항-CD20 중쇄 가변 영역-링커-항-CD3 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자 등의, 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 영역 또는 2중 특이성 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 또는 CDR을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산은 완전한 세포 (whole cell) 내, 세포용해물 내 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은, 다른 세포성 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들어 다른 세포성 핵산 또는 단백질로부터 표준 기법에 의해 정제하는 경우, "단리"되거나 또는 "실질적으로 순수하게 제공"된다. 본 발명의 핵산은, 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산은 표준적인 분자 생물 기법으로 수득할 수 있다. 하이브리도마 (예, 아래에서 추가적으로 기술된 바와 같이 인간 면역글로불린 유전자를 운반하는 형질전환 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA를 표준적인 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기법에 의해 수득할 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 (예, 파지 디스플레이 기법을 이용하여) 수득하는 항체의 경우, 이러한 항체를 암호화하는 핵산은 유전자 라이브러리로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자는 CD3 단일클론 항체의 VH 및 VL 서열 또는 CDR을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. VH 및 VL 세그먼트를 암호화하는 DNA 단편들이 확보되면, 이들 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기법에 의해 추가적으로 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 체인 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 변환할 수 있다. 이러한 조작으로, VL- 또는 VH-암호화하는 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 유연한 링커 등의 다른 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결한다. 본원에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은, DNA 단편 2개에 의해 암호화되는 아미노산 서열이 인-프래임으로 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결되는 것을 의미한다.
VH 영역을 암호화하는 단리된 DNA는, VH-암호화하는 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써, 전장 중쇄 유전자로 변환할 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 이들 영역들을 망라하는 DNA 단편들은 표준적인 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있으며, 가장 바람직하게는, IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-암호화하는 DNA에 오직 중쇄 CH1 불변 영역을 암호화하는 다른 DNA 분자를 작동가능하게 연결할 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 단리된 DNA는, VL-암호화하는 DNA에 경쇄 불변 영역, CL를 암호화하는 다른 DNA를 작동가능하게 연결함으로써, 전장 경쇄 유전자 (아울러, Fab 경쇄 유전자)로 변환할 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 이들 영역을 포함하는 DNA 단편들은 표준적인 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 구축하기 위해, VH-코딩 및 VL-코딩 DNA 단편들은, VL 영역과 VH 영역이 유연한 링커에 의해 연결되어 VH 및 VL 서열이 연속적인 단쇄 단백질로서 발현될 수 있도록, 유연한 링커를 코딩하는, 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 다른 단편과 작동가능하게 연결된다 (예를 들어, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883; McCafferty et al.,, (1990) Nature 348:552-554 참조).
본 발명의 2중 특이성 항체의 경우, 항-CD3 항체의 CDR, VH 및 VL, 그리고 항-CD20 항체의 VH 및 VL 및 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 먼저 합성한 다음, 필요한 2중 특이성 항체의 구조에 따라 조합한다. 예를 들어, 항-CD20 중쇄 가변 영역, 링커, 항-CD20 경쇄 가변 영역, 링커 및 항-CD3 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 필요에 따라 작동가능하게 연결할 수 있다.
본 발명의 항-CD3 항체는 Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495에 따른 잘-알려진 체세포 하이브리드화 (하이브리도마) 기법을 이용해 제조할 수 있다. 단일클론 항체를 제조하는 다른 구현예는 B 림프구의 바이러스성 또는 종양성 (oncogenic) 형질전환 및 파지 디스플레이 기법을 포함한다. 키메라 또는 인간화 항체들은 당해 기술 분야에 또한 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 4,816,567; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370을 참조하며, 이들 문헌의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 명시적으로 포함된다. 본 발명의 항체는, 또한 숙주 세포 형질전환체에서, 예를 들어 재조합 DNA 기법 및 유전자 형질감염 방법을 조합 사용하여, 당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 생산할 수 있다 (예를 들어, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). 일 구현예에서, 표준 분자 생물학 기법으로 수득한 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 하나 이상의 발현 벡터에, 유전자들이 전사 및 번역 조절 서열과 작동가능하게 연결되도록 삽입한다. 이러한 맥락에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은, 벡터 내 전사 및 번역 제어 서열들이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도한 기능을 제공하도록, 항체 유전자가 벡터에 삽입되는 것을, 의미한다.
본 발명의 2중 특이성 항체, 특히 CD3 및 CD20을 겨냥하는 2중 특이성 항체는, i) 2중 특이성 항체의 폴리펩타이드 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 하나 이상의 발현 벡터에, 전사 또는 번역을 조절하는 전사 및 번역 조절 서열과 작동가능하게 연결되도록 삽입하고; (ii) 숙주 세포에 발현 벡터를 형질도입 또는 형질감염하고; 및 (iii) 폴리펩타이드 쇄를 발현시켜 본 발명의 2중 특이성 항체를 생산함으로써, 제조할 수 있다.
용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 항체 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 기타 발현 제어 요소 (예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))에 기술되어 있다. 포유류 숙주 세포에서 발현하기 위한 바람직한 조절 서열은 포유류 세포에서 고 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스성 인자, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 유인원 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP) 및 폴리오마 바이러스 인핸서로부터 유래한 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터와 같은 비-바이러스성 조절 서열도 이용할 수 있다. 또한, 조절 요소는, SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 1의 긴 말단 반복체로부터 유래한 서열을 포함하는, SRα 프로모터 시스템 등의, 서로 다른 소스로부터 유래된 서열들로 구성된다 (Takebe et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472). 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용할 발현 숙주 세포에 혼용가능하게 선택된다.
발현 벡터는 숙주 세포로부터 폴리펩타이드의 분비를 촉진하는 신호 펩타이드를 코딩할 수 있다. 항체 체인 유전자는, 신호 펩타이드가 항체 체인 유전자의 아미노 말단에 인-프래임으로 연결되도록, 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종의 신호 펩타이드 (즉, 비-면역글로불린성 단백질의 신호 펩타이드)일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는, 폴리펩타이드 체인 유전자 및 조절 서열 외에도, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예, 복제 오리진) 및 선별가능한 마커 유전자와 같은 부가적인 서열을 운반할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선별할 수 있게 한다 (예를 들어, 미국 특허 4,399,216; 4,634,665 및 5,179,017 참조). 예를 들어, 전형적으로, 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 히드로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대해 내성을 부여한다. 바람직한 선별가능한 마커 유전자로는 다이하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭으로 dhfr-숙주 세포에서 이용하는 경우) 및 neo 유전자 (G418 선별하는 경우)를 포함한다.
항-CD3 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 본 발명의 2중 특이성 항체의 폴리펩타이드 체인을 발현하기 위해, 발현 벡터(들)를 표준 기법에 의해 숙주 세포에 형질감염한다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에 도입하기 위해 통상적으로 사용되는 매우 다양한 기법, 예를 들어, 전기천공, 칼슘-포스페이트 침강, EDAE-덱스트란 형질감염 등을 망라하는 것으로 의도된다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본 발명의 항체를 발현하는 것은 이론적으로 가능하지만, 진핵생물 세포, 가장 바람직하게는 포유류 숙주 세포에서 항체를 발현하는 것이 가장 바람직하며, 그 이유는 원핵생물 세포에서보다는 진핵생물 세포, 특히 포유류 세포에서 적절하게 폴딩되어 면역학적으로 활성인 항체가 조립 및 분비될 가능성이 더 높기 때문이다.
본 발명에서 이용가능한 발현 벡터로는 비-제한적으로 플라스미드, 바이러스 벡터, 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC), 형질전환-적격 인공 염색체 (transformation-competent artificial chromosome TAC), 포유류 인공 염색체 (MAC) 및 인간 인공 에피솜 염색체 (HAEC) 등이 있다.
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기에 바람직한 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO 세포)(예를 들어 R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol . Biol. 159:601-621에 기술된 바와 같이 DHFR 선별 마커와 함께 사용되는, Urlaub and Chasin (1980) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216-4220에 기술된, dhfr- CHO 세포 등), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히 NSO 골수종 세포를 이용할 경우에 바람직한 다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 기술된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유류 숙주 세포에 도입할 경우, 숙주 세포에서 항체의 발현, 또는 더 바람직하게는 숙주 세포를 배양한 배양 배지로의 항체의 분비를 허용하기 위한 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 생산한다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 통해 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 영역, 2중 특이성 항체 또는 대안적으로 이를 발현할 수 있는 본 발명의 핵산 분자를 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된 형태로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 선택적으로 항-종양 항체, 항-감염 항체, 면역 강화 항체 또는 자가면역 질환에 대한 항체, 또는 대안적으로 비-항체성 항-종양제, 비-항체성 항-감염제, 비-항체성 면역 강화제 또는 비-항체성 항-염증제와 같은 하나 이상의 부가적인 약제학적 활성 성분을 함유할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 부가적인 항-종양제, 부가적인 항-감염제, 부가적인 면역 강화제 또는 부가적인 자가면역 질환-치료제와 병용하여 사용할 수 있다.
약학적 조성물은 부형제를 임의 개수로 포함할 수 있다. 이용가능한 부형제로는 담체, 계면활성제, 증점제, 유화제, 고체 결합제, 분산 또는 현탁 보조제, 용해제, 착색제, 착향제, 코팅제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 보존제, 등장화제 및 이들의 조합 등이 있다. 적절한 부형제의 선택 및 이용은 Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
바람직하게는, 약학적 조성물은 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 상피 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 성분은 이를 불활화할 수 있는 산 및 기타 천연 환경의 작용으로부터 이를 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "비경구 투여"라는 표현은, 통상적으로 주사에 의한, 장 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식을 의미하며, 이는, 비-제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 진피내, 복막내, 경기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 국소, 상피 또는 점막 투여 등의 비-경구 경로를 통해, 예를 들어 비강내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소적으로 투여할 수 있다.
약학적 조성물은 무균성 수성 용액 또는 분산물의 형태일 수 있다. 이는 또한 미세유제, 리포좀 또는 약물 고 농도에 적합한 기타 정렬된 구조로 제형화될 수 있다.
단일 투약 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료 중인 개체와 구체적인 투여 방식에 따라 결정될 것이며, 일반적으로 치료학적 효과를 발휘하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 그 양은, 100% 중, 활성 성분 약 0.01% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30% 범위일 것이며, 약제학적으로 허용가능한 담체와 병용된다.
투여 용법은 최적의 원하는 반응 (예, 치료학적 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스 (single bolus)로 투여하거나, 여러 개로 분할한 투여량으로 시간에 걸쳐 투여하거나, 또는 치료 상황의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이 투여량을 비례적으로 줄이거나 또는 높일 수 있다. 투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해 투여 단위 형태 (dosage unit form)로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유익하다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 투여 단위 형태는 치료할 개체에 대한 단위 투여 (unitary dosage)로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필수적인 약학적 담체와 조합하여 원하는 치료학적 효과를 발휘하도록 계산된 미리 결정된 양으로 활성 성분을 포함한다. 대안적으로, 항체는, 지속 방출 (sustained release) 제형으로서 투여할 수 있으며, 이 경우 투여 빈도는 더 줄어든다.
본 발명의 항-CD3 항체는 FDA 허가된 OKT3 용량을 참조하여 투여할 수 있으며, 최종적으로 개체에 따라, 예를 들어 개체의 성별, 나이, 병력 등에 따라 의사가 결정하여야 한다. CD20 및 CD3을 겨냥하는 본 발명의 2중 특이성 항체의 용량은 개체의 예를 들어 성별, 나이, 병력 등에 따라 의사가 결정할 수 있다.
본 발명의 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 영역 또는 CD3 및 CD20에 대한 2중 특이성 항체의 "치료학적 유효량"은 질환 증상의 중증도 저하, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속 기간 증가, 또는 병폐로 인한 장애 또는 불능의 예방을 달성할 수 있다. 예를 들어, 종양을 가진 개체를 치료하는 경우, "치료학적 유효량"은 바람직하게는 종양 크기를 비-치료 개체에 비해 적어도 약 20%, 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 80%까지 감소시킨다. 동종이계 이식을 받은 개체의 경우, "치료학적 유효량"은 바람직하게는 이식편 거부 반응을 비-치료 개체와 비교해 적어도 약 20%, 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 80%까지 감소시킨다. 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 가진 개체의 경우, "치료학적 유효량"은 바람직하게는 부적절한 염증을 비-치료 개체와 비교해 적어도 약 20%, 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 가장 바람직하게는 적어도 약 80%까지 감소시킨다.
약학적 조성물은 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화된 전달 시스템 등의 제어 방출형 제형 (controlled release formulation)일 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산 등의 생분해성의 생체적합한 폴리머를 이용할 수 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조한다.
약학적 조성물은 (1) 무-바늘성 피하 주사 기구 (예, 미국 특허 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 및 4,596,556); (2) 미세-주입 펌프 (미국 특허 4,487,603); (3) 경피 기구 (미국 특허 4,486,194); (4) 주입 장치 (미국 특허 4,447,233 및 4,447,224); 및 (5) 삼투압 기구 (미국 특허 4,439,196 및 4,475,196)와 같은 의료 기구를 통해 투여될 수 있으며; 이들 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 생체내 적절한 분포를 보장하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료학적 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있도록 하기 위해, 리포좀 형태로 제형화될 수 있으며, 리포좀은 특정 세포 또는 장기로의 선택적인 수송을 강화하기 위해 표적화 모이어티를 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 5,416,016; 및 5,399,331; V. V. Ranade (1989) J. Clin.Pharmacol.29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al., (1995) FEBS Lett.357:140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; 및 Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273을 참조한다.
본 발명의 약학적 조성물은 시험관내 또는 생체내 여러가지 용도를 가진다. 예를 들어, 조성물은 염증성 질환의 치료 및/또는 완화, 또는 이식편 거부 반응의 감소 또는 소거에 이용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 치료학적 유효량으로 포함하는 약학적 조성물을 이용해, 염증성 질환 및 자가면역 질환을 치료 및/또는 개선하거나, 또는 이식편 거부 반응을 감소 또는 소거할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 FcR 결합 친화성이 약하거나 또는 없는 중쇄 불변 영역을 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 염증성 질환은 다발성 경화증 (MS) 또는 염증성 장 질환 (IBD, 예를 들어 크론 질환)이다. 특정 구현예에서, 자가면역 질환은 1형 당뇨병이다.
다른 측면에서, 본 발명의 2중 특이성 항체를 치료학적 유효량으로 포함하는 약학적 조성물을 이용해 특정 질환을 치료할 수 있으며, 여기서 2중 특이성 항체는 CD3 및 질환 관련 항원에 특이적이고, Fc 영역을 함유하지 않거나, 또는 FcR 결합 친화성이 약하거나 없는 Fc 영역을 함유한다. 질환 관련 항원에 따라, 약학적 조성물을 이용해, 원발성 또는 전이성, 대장 선암종, 유방암, 신장 세포 암, 흑색종, 췌장암, 비-소 세포 폐암, 교모세포종 및 위암과 같은 다양한 종양; AIDS와 같은 감염성 질환; 및 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 치료할 수 있다.
특정 구현예에서, CD3 및 CD20을 겨냥하는 본 발명의 2중 특이성 항체 및/또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 약학적 조성물을 이용해, B 세포 관련 질환, 예를 들어 B-세포 림프종, B-세포 백혈병, 또는 B-세포 매개 자가면역 질환을 치료 또는 개선할 수 있다. B-세포 림프종 및 B-세포 백혈병으로는 비-제한적으로 비-호지킨 림프종 (NHL), 만성 림프성 백혈병 (CLL) 및 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL) 등이 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물을, 하나 이상의 부가적인 항체 또는 비-항체 물질과 공동-투여하는, 병용 요법의 방법을 제공한다. 일 구현예에서, CD3 및 CD20을 겨냥하는 본 발명의 2중 특이성 항체 및/또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 약학적 조성물을 투여하기 전 또는 이의 투여와 더불어, 부가적인 항-CD20 항체를 이를 필요로 하는 개체에 투여할 수 있다. 항-CD20 항체는 대부분의 CD20+ B 세포를 살상하여, 투여할 CD20 및 CD3에 대한 2중 특이성 항체의 양을 줄일 수 있으며, 그래서 2중 특이성 항체에 의해 유발되는 유해한 효과가 추가로 저하될 수 있다.
본원에서 논의되는 치료학적 물질들의 조합은 약제학적으로 허용가능한 담체 중의 단일 조성물로서 병행하여, 또는 각각의 물질이 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 포함되는 개별 조성물로서 병행하여 투여할 수 있다. 다른 구현예에서, 치료학적 물질들의 조합은 연속적으로 투여할 수 있다.
아울러, 병용 요법을 2회 이상 연속적으로 투여할 경우, 연속적인 투여 순서는 역 순서로 바뀌거나 또는 각각의 투여 시점에 동일한 순서로 유지될 수 있으며, 연속적인 투여는 병행 투여와 조합될 수 있거나, 또는 이의 임의 조합일 수 있다.
본 발명 및 이의 이점이 상세하게 기술되었지만, 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본원에 대해 다양한 변화, 치환 및 변경이 행해질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명이 후술한 실시예를 들어 추가적으로 예시되지만, 실시예는 추가적인 제한으로서 해석되어서는 안된다. 본 출원 전체에 인용된 모든 도면과 모든 참조문헌, 유전자은행 서열, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 통합된다.
실시예
실시예 1 마우스 항-CD3 단일클론 항체 구축
CD3ε (NCBI 참조 번호: NP_000724.1)-코딩 cDNA (서열번호 24)를 합성해, pcDNA3.1 플라스미드의 EcoRI 부위와 BamHI 부위 사이에 클로닝하여 hCD3ε-pcDNA3.1을 수득하였다. 마찬가지로, 발현 벡터 hCD3δ-pcDNA3.1은 서열번호 25에 기재된 바와 같이 hCD3δ (NCBI 참조 번호: NP_000723.1)을 코딩하는 cDNA를 이용해 구축하였다. 이들 벡터를 대량으로 확보하기 위해, 플라스미드를 Endofree Plasmid Giga 키트 (QIAGEN)에서 제조사의 지침에 따라 사용해 추출하였다.
인간 CD3에 결합하는 단일클론 항체를 구축하기 위해, 6주령의 BALB/c 마우스에 상기에서 준비한 플라스미드를 접종하였다. 간략하게는, 마우스에 1 mg/ml hCD3ε-pcDNA3.1 25 ㎕ 및 1 mg/ml hCD3δ-pcDNA3.1 25 ㎕를 근육내 주사하였다. 전극 2개가 장착된 BTX ECM830 펄스 발생기를 사용해 주사 부위에 전류를 인가하였다. 주사 및 전기천공을 3주 간격으로 부스트를 3회 수행하였다. 최종 면역화 부스트 후 4일차에, 파지 디스플레이 라이브러리 구축을 위해 비장을 회수하였다.
scFv 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하기 위해, 전체 비장 RNA를 Trizol 키트 (Invitrogen)를 사용해 추출하고, 역전사효소 키트 (Invitrogen)를 제조사의 설명서에 따라 사용해 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 사용한 PCR에 의해 유전자 증폭을 수행하였으며, 전용 파지미드 pTGS를 이용해 scFv 파지 라이브러리를 구축하였다. 간략하게는, 경쇄 가변 영역을 PCR에 의해 증폭하고, Qiagen PCR/정제 키트를 사용해 정제한 다음 제한효소 NheI 및 NotI (NEB)으로 효소 절단 처리하여 파지미드 pTGS (동일한 제한효소로 절단하고 아가로스 겔로 정제한)에 16℃에서 라이게이션하였다. 라이게이션한 후, 재조합 DNA를 석출하여 세척한 다음 증류수에 용해하였다. 그런 후, 재조합 DNA를 E. coli TG1 세포에 전기천공에 의해 형질전환하였다. 그 후 세포를 SOC 매질 10 ml에 현탁하여, 1시간 동안 37℃에서 부드럽게 교반하면서 배양하였다. 세포 배양물은 2YT 아가/암피실린에 도말하고, 암피실린 내성 콜로니를 계수하였다. 중쇄 가변성 단편을 클로닝하기 위해, PCR 산물을 NcoI 및 XhoI으로 효소 절단 처리하여 경쇄 가변 영역 라이브러리에 라이게이션한 다음 E. coli TG1에 형질전환하였다. 라이브러리를 큰 플레이트에서 긁어, 2YTAG 액체 배양 배지에 접종하였다. scFv 유전자 라이브러리가 함유한 TG1 샘플에 헬퍼 파지 대략 1012 pfu를 첨가하여, 37℃에서 교반하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 카나마이신 70 ㎍/ml을 첨가하여, 배양물을 밤새 30℃에서 교반하였다. 세포를 4000 rpm으로 15분간 4℃에서 원심분리하였다. 수득한 상층액을 20% PEG 8000/2.5 M NaCl 5 ml과 혼합해 얼음 위에서 30분간 인큐베이션한 다음 이를 8000 rpm에서 4℃에서 20분간 원심분리하여 파지를 석출하였다. 파지를 1% BSA 함유 PBS 1.5 ml에 다시 현탁하여 볼텍싱한 다음 13000 rpm에서 5분간 원심분리하여 잔류 박테리아를 제거하였다. 상층액은 4℃에서 보관하거나 또는 바이오피닝 (하기 참조)을 위해 바로 사용하였다.
인간 CD3ε-his (Cat#:10977-H08s, SinoBiological, China) 및 원숭이 CD3ε-his (Cat#: 90047-C08H, SinoBiological, China)를 이용해, 인간 및 원숭이 CD3 단백질에 대한 항체를 스크리닝하였다. 간략하게는, 파지를 인간 CD3ε-his 단백질이 커플링된 비드와 함께 교반기에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 비-결합된 파지는 PBS를 사용해 세척 제거한 다음 0.1M 글리신-HC1 (pH2.2)을 사용해 항원 결합된 파지를 용출하였다. 용출된 파지는 1.5M Tris-HCl (pH8.8)을 첨가하여 pH 7.0으로 중화하였다. 이러한 중화된 파지를 이용해, OD600 0.6까지 37℃에서 배양한 TG1 박테리아 10 ml에 감염시켰다. 박테리아 배양물을 원심분리에 의해 펠릿화하고, 펠릿을 배양 배지에 다시 현탁한 다음 다른 스크리닝 회차를 위해 2YTAG 플레이트에 도말하였다. 인간 CD3 결합에 대해 양성인 선택 파지를, 원숭이 CD3ε-his 단백질이 커플링된 비드와 함께 교반기에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 비-결합된 파지는 PBS를 사용해 세척 제거한 다음 0.1M 글리신-HC1 (pH2.2)을 사용해 항원 결합된 파지를 용출하였다. 용출된 파지는 1.5M Tris-HCl (pH8.8)을 첨가하여 pH 7.0으로 중화하였다. 이러한 중화된 파지를 이용해, OD600 0.6까지 37℃에서 배양한 TG1 박테리아 10 ml에 감염시켰다. 박테리아 배양물을 원심분리에 의해 펠릿화하고, 펠릿을 배양 배지에 다시 현탁한 다음 다른 스크리닝 회차를 위해 2YTAG 플레이트에 도말하였다. 이러한 농화 및 스크리닝을 총 3회 수행하였다.
바이오패닝 3차 라운드 후, 결합력이 우수한 파지를 수집하여 박테리아 세포를 감염시켰다. 단일 박테리아 콜로니를 취하여 96웰 플레이트에서 배양하였다. 파지-기반의 ELISA를 이용해 인간 CD3ε-his (Cat#:10977-H08s, SinoBiological, China) 및 원숭이 CD3ε-his (Cat#: 90047-C08H, SinoBiological, China) 둘다에 대한 우수한 결합 물질을 식별한 다음 이에 대한 DNA 서열분석을 수행하였다. 고 결합성 클론들에서 하나의 판독가능한 scFv 서열이 식별되었으며, 이를 CD3-19로 명명하였고 이의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 ID 번호는 표 1에 기재한다.
실시예 2 전장 항-CD3 항체의 발현 및 정제
스크리닝한 CD3-19 scFv 항체를 추가로 특정하기 위해 전장 항체로서 HEK293F (Cobioer, China) 세포에서 발현시켰다. 간략하게는, 중쇄/경쇄 가변 영역 + 인간 IgG1/카파 불변 영역 (각각 서열번호 22 및 23에 기재된 아미노산 서열 (X1=L, X2=L, X3=N, X4=P))을 pCDNA3.1의 EcoRI과 BamHI 부위 (Invitrogen, Carlsbad, USA) 사이에 클로닝하여, 발현 벡터를 구축하였다.
HEK-293F 세포에서 PEI 형질전환을 제조사의 매뉴얼에 따라 이용해 항-CD3 항체를 일시적으로 발현시켰다. 간략하게는, HEK-293F 세포에 벡터를 폴리에틸렌이민 (PEI)을 DNA:PEI 1:3 비율로 이용해 형질감염하였다. 형질감염에 사용된 플라스미드 농도는 1.5 ㎍/ml이었다. 형질감염된 HEK-293F 세포를 인큐베이터에서 120 RPM으로 교반하면서 5% CO2 및 37℃에서 배양하였다. 10-12일 후, 세포 배양 상층액을 회수하여, 이에 대해 3500 rpm에서 5분간 원심분리한 다음 0.22 ㎛ 캡슐제를 이용해 여과하여 세포 파편을 제거하였다. 그 후, 항체를 미리-평형화한 단백질-A 친화성 컬럼 (Cat#:17040501, Lot#: 10252250, GE, USA)을 사용해 정제하고, 용출 완충제 (20 mM 구연산, pH3.0-3.5)로 용출하였다. 완충제 교환 후, 항체는 PBS 완충제 (pH 7.0) 중에 보관하고, NanoDrop 장치로 농도를 결정하였다. 그 후, 정제한 단일클론 항체에 대해 추가적인 특정화를 수행하였다.
실시예 3 키메라 항체의 결합력
정제한 키메라 CD3-19 항체가 재조합 인간 및 원숭이 CD3ε 단백질에 결합하는 능력을 ELISA에 의해 검사하였다.
간략하게는, ELISA 플레이트에서 각 웰을 500 ng/ml 인간 CD3ε-his (Cat#:10977-H08s, SinoBiological, China) 100 ㎕로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 그 후, 각 웰을 차단 완충제 (PBS+1% BSA+1% 염소 혈청+0.05% Tween 20) 200 ㎕를 사용해 실온에서 2시간 동안 차단 처리한 다음, 연속 희석한 항-CD3 항체 (시작 농도 40 ㎍/ml) 100 ㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 PBST (PBS+0.05% Tween 20)로 3번 헹군 후, HRP 접합된 염소 항-인간 IgG (1:5000, Cat#: A0170-1ML, Sigma, USA)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트에 신선하게 준비한 Ultra-TMB (Cat#: 555214, BD, USA)를 5분 발색을 위해 첨가하고, 각 웰의 흡광도를 마이크로플레이트 리더 (SpectraMaxR i3X, Molecular Devies, USA)를 사용해 450 nm에서 판독하였다.
키메라 CD3-19 항체의 원숭이 CD3ε에 대한 교차 반응을 직접 ELISA에 의해 검사하였다. 간략하게는, 96웰 ELISA 플레이트를 각 웰을 500 ng/ml 원숭이 CD3ε-his (Cat#: 90047-C08H, SinoBiological, China) 100 ㎕로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 각 웰을 차단 완충제 (PBS+1% BSA+1% 염소 혈청+0.05% Tween 20) 200 ㎕를 사용해 실온에서 2시간 동안 차단 처리한 다음, 연속 희석한 항-CD3 항체 (시작 농도 40 ㎍/ml) 100 ㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트에 HRP 접합된 염소 항-인간 IgG (1:5000, Cat#: A0170-1ML, Sigma, USA)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트에 신선하게 준비한 Ultra-TMB (Cat#: 555214, BD, USA)를 5분 발색을 위해 첨가하고, 각 웰의 흡광도를 마이크로플레이트 리더 (SpectraMaxR i3X, Molecular Devies, USA)를 사용해 450 nm에서 판독하였다. 항-HEL 이소형 대조군 항체 (Cat#: LT12031, LifeTein, USA)를 음성 대조군으로 사용하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.
키메라 CD3-19 항체가 T 세포 표면 상의 TCR/CD3 복합체에 결합하는 능력을 CD4+ T 세포를 이용한 FACS에 의해 검사하였다. 간략하게는, 건강한 인간 기증자 혈액 샘플로부터 PBMC를 밀도 구배 원심분리에 의해 수집하여 RPMI1640 배지에 다시 현탁하였다. Invitrogen Dynabeads Untouched 인간 CD4+ T 세포 분리 키트 (Cat#: 11346D, Thermal Fisher Scientific, USA)를 사용해 PBMC로부터 CD4+ T 세포를 단리하였다. 그 후, T 세포를 96웰 플레이트에 1x105 세포/웰로 접종하고, 여기에 연속 희석한 항-CD3 항체 100 ㎕를 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 96웰 플레이트를 PBS로 3번 헹구고, 여기에 PE-염소 항-인간 IgG (H+L)(1: 500, Cat#: PA1-86078, Thermo, USA)를 첨가하였다. 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 96웰 플레이트를 PBS로 3번 헹군 다음 FACS 장치 (BD)로 세포 형광을 측정하였다. 항-HEL 이소형 대조군 항체 (Cat#: LT12031, LifeTein, USA)를 음성 대조군으로 사용하였다. 그 결과는 도 2에 나타낸다.
도 1에 도시된 바와 같이, 키메라 CD3-19 항체는 인간 및 원숭이 CD3ε 단백질에 특이적으로 결합할 수 있었다.
도 2에 따르면, 항체 CD3-19는 높은 결합 특이성 및 활성으로 인간 CD4+ T 세포에 결합할 수 있었다.
실시예 4 파지 디스플레이에 의한 CD3-19의 친화성 성숙
결합 친화성을 추가로 개선하기 위해, CD3-19에 대해 파지 디스플레이 기법에 의해 친화성 성숙을 이행하였다. 간략하게는, 3차원 모델링 시뮬레이션을 수행하여 CD3-19의 중쇄 및 경쇄 CDR에서 결합 친화성에 중요할 수 있는 아미노산 잔기를 동정하였다. 동정된 CDR 잔기는 특수 설계된 프라이머 및 부위-특이적인 돌연변이용 표준 프로토콜을 이용한 PCR에 의해 돌연변이 유발을 수행하였다. 그런 후, 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하고, 인간 CD3ε-his 단백질이 커플링된 비드를 이용해 실시예 1의 프로토콜에 따라 바이오패닝을 수행하였다.
바이오패닝을 3회 수행한 후, 고 결합성 물질을 선별하여 회수한 다음 이를 이용해 박테리아 세포를 감염시켰다. 박테리아 콜로니를 취해 96웰 플레이트에서 배양하였으며, ELISA를 이용해 추후 서열분석할 고 결합성 물질을 동정하였다. 중쇄 및 경쇄 CDR에서 유익한 돌연변이를 동정하여 이를 새로운 파지 디스플레이 바이브러리에 조합한 후 이에 대한 바이오패닝 및 농화를 다시 3회 수행한 다음 전술한 바와 같이 서열분석에 의해 검증하였다.
부모 항체 CD3-19와 비교해 결합력이 더 높은 scFv 항체 3종이 식별되었으며, 이의 가변성 영역 서열 ID 번호는 표 1에 열거된 19-15, 19-26 및 19-37로 명명하였다.
실시예 5 친화성 성숙에 의해 수득한 항체의 발현, 정제 및 결합력 특정
상기에서 선별한 scFv 항체 3종을 HEK293F 세포에서 전장 인간 IgG1/카파 항체로서 발현시켰으며, IgG1 불변 영역과 카파 불변 영역의 서열은 각각 서열번호 22 (X1=L, X2=L, X3=N, X4=P) 및 23에 기재하였다. 발현 및 정제는 실시예 2의 프로토콜을 이용해 수행하였다.
인간 CD3ε-his 및 원숭이 CD3ε-his에 대한 CD3-19, 19-15, 19-26 및 19-37의 결합력을 실시예 3의 프로토콜에 따라 ELISA에 의해 검사하였다. 그 결과는 도 3에 나타낸다. 일차 T 세포 상의 인간 TCR/CD3 복합체에 대한 이들 항체의 결합력을 실시예 3의 프로토콜에 따라 FACS에 의해 검사하였다. 그 결과는 도 4에 나타낸다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 친화성 성숙을 통해 수득한 항체 3종 모두 부모 항체 CD3-19에 비해 인간 및 원숭이 CD3에 대한 결합력이 더 우수하였다.
나아가, 도 4에 도시된 바와 같이, 친화성 성숙된 항체 19-15, 19-26 및 19-37은 부모 항체에 비해 일차 T 세포에 대해 더 우수한 결합력을 나타내었다.
실시예 6 SPR에 의한 항-CD3 항체의 결합 친화성 결정
인간 및 원숭이 CD3ε에 대한 키메라 항-CD3 항체의 결합 친화성을 BIAcoreTM 8K (GE Life Sciences, USA)에 의해 측정하였다.
간략하게는, 인간 CD3ε-his (Cat#: 10977-H08s, Sino Biological, China) 또는 원숭이 CD3ε-his (Cat#: 90047-C08H, Sino Biological, China)를 100-200 반응 단위 (response unit, RU)로 CM5 바이오센서 칩 (Cat#: BR-1005-30, GE Life Sciences)에 커플링한 다음, 미-반응 기를 1M 에탄올아민으로 차단 처리하였다. 연속 희석한 항체를 0.3 μM에서 10 μM 범위 농도로 SPR 전개 완충제 (HBS-EP 완충제, pH7.4, Cat#:BR-1006-69, GE Life Sciences, USA) 중에 30 ㎕/분으로 주입하였다. 블랭크 대조군의 RU를 제하여 결합 친화성을 계산하였다. 결합 속도 (ka) 및 해리 속도 (kd)를 1 대 1 랭큐어 결합 모델 (BIA Evaluation Software, GE Life Sciences)을 이용해 계산하였다. 평형 해리 상수 KD를 kd/ka 비율로서 계산하였다. 양성 대조군으로 사용한 Macrogenics 사 항체 mAB2는 CN107827985A에 개시된 가변 영역과 인간 IgG1/카파 불변 영역 (서열번호 22 (X1=L, X2=L, X3=N, X4=P) 및 23)을 이용해 준비하였다.
인간 CD3ε와 원숭이 CD3ε에 대한 항-CD3 항체의 결합 친화성을 결정하였으며, 이를 표 2 및 3에 요약 기술하였다.
표 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 친화성 성숙을 통해 수득된 항체들은 부모 항체와 비교해 결합 친화성이 더 높았으며, mAB2와 비슷하거나 또는 더 우수하였다. 항체들 중 19-37이 가장 높은 결합 친화성을 나타내었다.
표 2. 인간 CD3ε에 대한 항-CD3 항체의 결합 친화성
mAB2 CD3-19 19-15 19-26 19-37
ka 5.24E+05 1.19+05 2.29+05 2.74E+05 1.92E+06
kd 8.10E-05 2.63E-05 3.27E-05 5.05E-05 1.21E-05
KD 1.54E-10 2.22E-10 1.43E-10 1.84E-10 6.28E-12
표 3. 원숭이 CD3ε에 대한 항-CD3 항체의 결합 친화성
mAB2 CD3-19 19-15 19-26 19-37
ka 7.67E+05 1.08E+05 3.16E+05 2.69E+05 1.23E+06
kd 9.80E-05 3.76E-05 7.32E-05 6.38E-05 4.68E-06
KD 1.28E-10 3.47E-10 2.32E-10 2.37E-10 3.79E-12
실시예 7 항 -CD3 항체의 T 세포 활성에 대한 조절 효과
본원의 키메라 항-CD3 항체는 일차 인간 T 세포를 이용해 항체 가교 (antibody cross-linking)가 발생하였을 경우에 CD3/TCR 신호전달에 대한 그 효과를 검사하였다.
간략하게는, 96웰 세포 배양 플레이트에서 각 웰을 5 ㎍/ml F(ab')2-염소 항-인간 IgG Fc gamma 2차 항체 (Cat #: 31163, Invitrogen, USA) 100 ㎕로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 각 웰을 PBS로 2번 헹군 다음 항-CD3 항체 100 ㎕를 여러가지 농도로 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 한편, 건강한 인간 기증자의 혈액 샘플로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 수집하고, PBMC로부터 Invitrogen Dynabeads Untouched 인간 CD4+ T 세포 단리 키트 (Cat#: 11346D, Thermal Fisher Scientific, USA)를 제조사의 지침에 따라 이용해 CD4+ T 세포를 단리하였다. CD4+ T 세포를 RPMI 완전 배지에 세포 밀도 1.0x106 /ml로 재현탁하고, 2.5 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE, Cat#: C34554I, Invitrogen, USA)를 첨가해 37℃에서 10분간 인큐베이션하여 표지하였다. 세포를 RPMI 완전 배지 (RPMI + 10% FBS)에 생존가능한 세포 밀도 2.5x105 /ml로 재현탁하였다. 그 후, T 세포 현탁물 200 ㎕를 항-CD3 코팅 플레이트에 첨가하여, 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. FACS에 의해 CSFE 염색을 측정해 세포 증식률을 확인하였다. 양성 대조군으로 항체 mAB2를 사용하였다. 그 결과는 도 5 (A)에 나타내었다.
아울러, 유리형 키메라 항-CD3 항체를 대상으로, 항체 가교가 발생하지 않았을 경우에 T 세포 활성화에 대한 그 효과를 검사하였다. 간략하게는, 건강한 인간 기증자의 혈액 샘플로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 수집하고, PBMC로부터 Invitrogen Dynabeads Untouched 인간 CD4+ T 세포 단리 키트 (Cat#: 11346D, Thermal Fisher Scientific, USA)를 제조사의 지침에 따라 이용해 CD4+ T 세포를 단리하였다. CD4+ T 세포를 RPMI 완전 배지에 세포 밀도 1.0x106 /ml로 재현탁하고, 2.5 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE, Cat#: C34554I, Invitrogen, USA)를 첨가해 37℃에서 10분간 인큐베이션하여 표지하였다. 표지된 세포를 RPMI 완전 배지 (RPMI + 10% FBS)에 생존가능한 세포 밀도 5x105 /ml로 재현탁하였다. 그 후, T 세포 현탁물 100 ㎕를 항-CD3 100 ㎕가 여러 농도로 함유된 96웰 세포 배양 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. FACS에 의해 CSFE 염색을 측정해 세포 증식률을 확인하였다. 양성 대조군으로 항체 mAB2를 사용하였다. 그 결과는 도 5 (B)에 나타내었다.
도 5 (A)에서 확인된 바와 같이, 항-CD3 항체는 항체 가교를 제공하기 위해 플레이트에 코팅된 2차 항체에 결합하였을 경우, 용량 의존적인 방식으로 T 세포 증식을 높일 수 있었으며, 친화성 성숙에 의해 수득된 항체는 이러한 효과가 부모 항체에 비해 더 높게 관찰되었다. 그러나, T 세포 활성화에 대한 본원의 항-CD3 항체의 효과는 mAB2보다 모두 낮았는데 이는 본 발명의 항-CD3 항체가 결합력/친화성이 양성 항체 mAB2와 비교해 비슷하거나 또는 더 우수하지만, T 신호전달 활성화에 대해서는 그 활성이 더 낮다는 것을 의미한다. 다시 말해, T 세포에 대한 높은 결합력에도 불구하고, 본 발명의 항-CD3 항체는 과도한 CD3 신호전달을 유발하지 않을 것이며, 따라서 T 세포 활성화에 의해 유도되는 과도한 사이토카인 방출과 같은 잠재적인 독성을 낮출 수 있을 것이다.
나아가, 도 5 (B)에서 확인된 바와 같이, 항체 가교가 결핍된 유리형 항-CD3 항체에서는 T 세포 증식에 대한 효과가 관찰되지 않았다.
실시예 8 예시적인 항-CD3 항체의 인간화
상기한 기능성 분석에 기초하여, 인간화 및 추가적인 특정화를 위해 19-15 및 19-26을 선택하였다. 인간화는 예를 들어, 미국 특허 5,225,539에 기술되고 아래에서 상세히 명시된 바와 같이 잘-확립된 CDR-그래프팅 방법을 이용해 수행하였다.
19-15를 인간화하기 위한 어셉터 프래임워크를 선별하기 위해, 이 항체의 경쇄 및 중쇄 가변성 쇄 서열을 NCBI 웹사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/igblast/)에서 인간 면역글로불린 유전자 데이터베이스에 대해 blast 검색하여, 인간화를 위한 어셉터로서 가장 상동적인 인간 생식계열 IGVH 및 IGVλ를 각각 동정하였다. 선별한 인간 중쇄 어셉터는 IGHV3-23*05였으며, 선별한 인간 경쇄 어셉터는 IGLV7-43*01이었다.
19-26을 인간화하기 위한 어셉터 프래임워크를 선별하기 위해, 이 항체의 경쇄 및 중쇄 가변성 쇄 서열을 NCBI 웹사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/igblast/)에서 인간 면역글로불린 유전자 데이터베이스에 대해 blast 검색하여, 인간화를 위한 어셉터로서 가장 상동적인 인간 생식계열 IGVH 및 IGVλ를 각각 동정하였다. 선별한 인간 중쇄 어셉터는 IGHV3-23*05였으며, 선별한 인간 경쇄 어셉터는 IGLV7-43*01이었다.
CDR 루프 구조를 지지하는데 중요한 역할을 할 수도 있는 핵심 프래임워크 잔기를 동정하기 위해 항체 2종의 가변성 도메인의 3차 구조 3가지를 모델링하였으며, 그래서 인간화 항체에서 역 돌연변이를 설계하였다. 선택한 구조 주형은 19-15 및 19-26 각각에 대해 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3에 동일한 클래스의 표준적인 루프 구조 (canonical loop structure)를 가진다. 선택한 구조 주형을 토대로, 중쇄 및 경쇄에서 뮤라인 프래임워크를 인간 어셉터 프래임워크로 치환하여 구조 모델을 구축하였다. 그 후, 3차원 구조 모델링 시뮬레이션을 수행해, 중쇄 및 경쇄 계면 또는 CDR-루프 구조를 지지하는데 중요할 수 있는 핵심 프래임워크 잔기를 동정하였다. 뮤라인 항체 프래임워크 및 인간 어셉터 프래임워크 둘다 특정 부위에서 동일한 잔기를 공유한 경우에는 인간 생식계열 잔기를 유지시켰다. 한편, 뮤라인 항체 프래임워크와 인간 생식계열 어셉터 프래임워크가 특정 부위에서 서로 다른 잔기를 가진 경우에는, 이 잔기의 중요성을 구조 모델링에 의해 평가하였다. 뮤라인 항체의 프래임워크내 잔기가 CDR 잔기와 상호작용하여 영향을 미치는 것으로 확인되면, 이 잔기를 뮤라인 잔기로 역-돌연변이하였다. 아래 표 4는 항체 구조 시뮬레이션에서 이용된 구조 주형들을 열거한다.
표 4. 항체 구조 시뮬레이션에서 이용된 구조 주형들
항체 쇄 주형 구조의 PDB 코드 서열 동일성 서열 유사성
19-15 중쇄 5FCS 89% 97%
19-15 경쇄 1A6V 94% 95%
19-26 중쇄 5FCS 90% 98%
19-26 경쇄 1A6V 95% 97%
전술한 바와 같은 구조 모델링에 기반하여 19-15의 중쇄에 대해 가능한 역-돌연변이 5개 (S49A, A99V, N76D, V95M 및 K100R)가, 경쇄에 대해 가능한 역-돌연변이 7개 (F38V, Y51G, T2A, Q44H, P46F, A48G 및 T60V)가 동정되었으며; 19-26의 중쇄에 대해 가능한 역-돌연변이 5개 (S49A, A99V, N76D, V95M 및 K100R)가, 경쇄에 대해 가능한 역-돌연변이 7개 (F38V, Y51G, T2A, Q44H, P46F, A48G 및 T60V)가 동정되었다.
표 1에 요약 개시한 바와 같이, 19-15에 대해 인간화된 중쇄 가변 영역 2개와 인간화된 경쇄 가변 영역 2개가 고안되었으며, 예시적인 인간화 항체 총 4개가 수득되었다. 19-26의 경우, 인간화된 중쇄 가변 영역 2개와 인간화된 경쇄 가변 영역 1개가 고안되었으며, 예시적인 인간화 항체 총 2개가 수득되었다.
인간화된 중쇄/경쇄 가변 영역 + 인간 IgG1/카파 불변 영역 (서열번호 22 (X1=L, X2=L, X3=N, X4=P) 및 23)을 코딩하는 서열을 합성한 다음 발현 벡터 pCDNA3.1(+)(Invitrogen, USA)에 BamHI 및 XhoI 제한효소 부위를 이용해 각각 서브 클로닝하였다. 발현 구조체들 모두 서열분석에 의해 검증하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 프로토콜에 따라 인간화된 항-CD3 항체 6종을 일시적으로 발현시켰다. 그리고 인간화 항체를 실시예 2에 따라 정제하였다.
실시예 9 인간 및 원숭이 CD3에 대한 예시적인 인간화된 항-CD3 항체의 결합력/결합 친화성
인간 및 원숭이 CD3ε 단백질에 대한 인간화된 항-CD3 항체의 결합력을 실시예 3의 프로토콜에 따라 ELISA에 의해 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
인간화 항체는, 실시예 3의 프로토콜을 이용해 FACS에 의해 인간 T 세포에 대한 이의 결합력을 추가로 검사하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
인간 및 원숭이 CD3ε 단백질에 대한 인간화된 항-CD3 항체의 결합력을 실시예 6의 프로토콜에 따라 SPR에 의해 측정하였다. 그 결과를 표 5 및 표 6에 요약 개시하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 예시적인 인간화 항체들 모두 인간 CD3ε 단백질 (도 6 (A) 및 6 (C)) 및 원숭이 CD3ε 단백질 (도 6 (B) 및 6 (D))에 대한 결합력을 가지고 있었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 예시적인 인간화 항체들 모두 인간 T 세포에 대해 결합력을 가지고 있었다.
표 5. 인간화된 항-CD3 항체의 인간 CD3ε에 대한 결합 친화성
mAb ka kd KD
1 15-H2L2 1.25E+06 6.64E-04 5.16E-10
2 15-H2L3 3.43E+06 3.58E-04 1.04E-10
3 15-H3L2 8.03E+05 1.65E-04 2.05E-10
4 15-H3L3 1.39E+06 1.34E-04 9.67E-11
5 26-H2L3 9.44E+05 3.77E-03 3.95E-09
6 26-H3L3 1.94E+05 1.68E-04 8.64E-10
표 6. 인간화된 항-CD3 항체의 원숭이 CD3ε에 대한 결합 친화성
mAb ka kd KD
1 26-H3L3 1.18E+06 2.26E-04 1.92E-10
2 26-H2L3 1.26E+06 2.86E-03 2.27E-09
3 15-H2L3 7.98E+06 6.20E-03 7.77E-10
4 15-H3L2 2.02E+05 1.20E-04 5.91E-10
5 15-H3L3 2.38E+05 1.47E-04 6.16E-10
6 15-H2L2 3.59E+04 2.10E-04 5.84E-09
표 5에 따르면, 예시적인 인간화 항체들 모두 인간 CD3 단백질에 대해 높은 결합 친화성을 유지하였다. 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 예시적인 인간화 항체들 모두 원숭이 CD3 단백질에 대해 교차-반응성을 유지하였다.
실시예 10 예시적인 인간화된 항-CD3 항체는 T 세포 활성을 유도한다.
예시적인 인간화 항체가 CD3/TCR 신호전달에 미치는 효과를 항체 가교가 발생하였을 경우에 일차 인간 R 세포를 이용해 실시예 7의 프로토콜에 따라 일부 수정하여 검사하였다. 간략하게는, 96웰 세포 배양 플레이트에서 각 웰을 5 ㎍/ml F(ab')2-염소 항-인간 IgG Fc gamma 2차 항체 (Cat #: 31163, Invitrogen, USA) 100 ㎕로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 각 웰을 PBS로 2번 헹군 다음 항-CD3 항체 100 ㎕를 여러가지 농도로 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 한편, 건강한 인간 기증자의 혈액 샘플로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 수집하고, PBMC로부터 Invitrogen Dynabeads Untouched 인간 CD4+ T 세포 단리 키트 (Cat#: 11346D, Thermal Fisher Scientific, USA)를 제조사의 지침에 따라 이용해 CD4+ T 세포를 단리하였다. CD4+ T 세포를 세포 밀도 2.5x105 /ml로 재현탁하였다. T 세포 현탁물 200 ㎕를 항-CD3 코팅 플레이트에 첨가하여, 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 배양물 상층액 50 ㎕를 ELISA 키트 (Cat#: SIF50, R&D, USA)를 제조사의 지침에 따라 사용해 IFN-γ 수준 측정에 이용하였다. 세포를 48시간 동안 추가로 배양하여 수집한 다음 PBS로 3번 헹군 후 2 ㎕ PE 마우스 항-인간 CD69 항체 (Cat#: 555531, BD, USA) 및 2 ㎕ FITC 마우스 항-인간 CD4 항체 (Cat#: 561842, BD, USA)와 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 원심분리하여 세포를 수집하고, PBS로 3번 헹군 후, 유세포 측정에 의한 CD69+CD4+ T 세포 : CD4+ T 세포의 비율을 FACS로 측정해, 항체 가교 발생시 T 세포 활성화에 대한 항체의 효과를 확인하였다. 분석은 트리플리케이트로 수행하였으며, 양성 대조군으로 mAB2를 사용하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.
또한, T 세포 활성화에 대한 유리형 항체의 효과도 분석하였다. 간략하게는, 건강한 인간 기증자의 혈액 샘플로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 수집하고, PBMC로부터 Invitrogen Dynabeads Untouched 인간 CD4+ T 세포 단리 키트 (Cat#: 11346D, Thermal Fisher Scientific, USA)를 제조사의 지침에 따라 이용해 CD4+ T 세포를 단리하였다. CD4+ T 세포를 RPMI 완전 배지에 밀도 5x105 /ml로 재현탁하였다. T 세포 현탁물 100 ㎕를, 항-CD3 항체 100 ㎕가 여러가지 농도로 첨가된 세포 배양 코팅 플레이트에 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양물 상층액 50 ㎕를 ELISA 키트 (Cat#: SIF50, R&D, USA)를 제조사의 지침에 따라 사용해 IFN-γ 수준 측정에 이용하였다. 세포를 48시간 동안 추가로 배양하여 수집한 다음 PBS로 3번 헹군 후 2 ㎕ PE 마우스 항-인간 CD69 항체 (Cat#: 555531, BD, USA) 및 2 ㎕ FITC 마우스 항-인간 CD4 항체 (Cat#: 561842, BD, USA)와 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 원심분리하여 세포를 수집하고, PBS로 3번 헹군 후, CD69+CD4+ T 세포 : CD4+ T 세포의 비율을 FACS로 측정해, T 세포 활성화에 대한 유리형 항체의 효과를 확인하였다. 분석은 트리플리케이트로 수행하였으며, 양성 대조군으로 mAB2를 사용하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 항체 가교가 이루어질 경우, 예시적인 인간화 항체들 모두 T 세포를 활성화할 수 있었으며, 그래서 인터페론 γ 분비, 및 T 세포 표면에서의 CD69 발현의 상향 조절이 유도되었다. 유리형 항체의 경우, 도 9에 나타낸 바와 같이, T 세포 활성에는 효과가 없었으며, 즉 인터페론 γ 분비 또는 CD69 발현에 영향을 미치지 않았다. 이들 결과는, 인간화 항체의 T 세포 활성화에 대한 효과가 항체 가교에 의존하고, 예시적인 인간화 항체들 모두 T 세포 활성화 및 사이토카인 방출을 양성 대조군에 비해 유의하게는 거의 유도하지 않음을, 시사해준다.
실시예 11 인간 또는 원숭이 단백질을 안정적으로 발현하는 HEK293A 세포주 구축
인간 CD20, 원숭이 CD20, 인간 CD16A, 인간 CD32A, 인간 CD32B 또는 인간 CD64를 안정적으로 발현하는 세포주를 HEK293A 세포를 이용해 구축하였다. 간략하게는, 인간 CD20, 원숭이 CD20, 인간 CD16A, 인간 CD32A, 인간 CD32B 및 인간 CD64를 코딩하는 서열 (각각 서열번호 35, 36, 37, 38, 39 및 40)을 합성한 다음 pLV-EGFP(2A)-Puro 벡터 (Beijing Inovogen, China)에 제한효소 부위 EcoRI과 BamHI 사이에 서브 클로닝하였다. 제조한 발현 벡터, psPAX 및 pMD2.G 플라스미드를 리포펙타민 3000 키트 (Thermo Fisher Scientific, USA)에서 지침에 따라 공동-형질감염하여, HEK293T 세포 (Cobioer, NJ, China)에서 렌티바이러스를 구축하였다. 공동-형질감염 후 3일차에, HEK293T 세포 배양물 상층액으로부터 렌티바이러스를 회수한 다음 이를 HEK293A 세포에 감염시켜, 인간 CD20, 원숭이 CD20, 인간 CD16A, 인간 CD32A, 인간 CD32B 또는 인간 CD64를 안정적으로 발현하는 HEK293A 세포주, 즉 HEK293A/인간 CD20, HEK293A/원숭이 CD20, HEK293A/인간 CD16A, HEK293A/인간 CD32A, HEK293A/인간 CD32B, 및 HEK293A/인간 CD64를 각각 구축하였다. 형질감염된 HEK293A 세포는 10% FBS (Cat#: FND500, Excell, China) 및 0.2 ㎍/ml 푸로마이신 (Cat#: A11138-03, Gibco)이 함유된 DMEM (Cat#: SH30022.01, Gibco, USA)에서 7일간 배양하였다. 상업적으로 이용가능한 항-인간/원숭이 CD20 항체 (PE 항-인간 CD20 항체, Cat#: E-AB-F1045D, Elabscience, China), 항-인간 CD16A 항체 (PE 항-인간 CD16 항체, Cat#: E-AB-F1005D, Elabscience, China), 항-인간 CD32A 항체 (PE Anti-CD32B + CD32A 항체, Cat#: ab30357, abcam, USA), 항-인간 CD32B 항체 (PE Anti-CD32B + CD32A 항체, Cat#: ab30357, abcam, USA) 및 항-인간 CD64 항체 (PE/Cy5 Anti-CD64 항체, Cat#: ab192338, abcam, USA)를 이용한 FACS에 의해 인간 CD20, 원숭이 CD20, 인간 CD16A, 인간 CD32A, 인간 CD32B 및 인간 CD64의 발현을 검증하였다.
실시예 12 항 -CD3 항체의 Fc 영역에서의 기능적인 변형
자체 Fc 영역을 통한 FcR과의 결합시 항-CD3 항체에 의해 유발되는 CD3 신호전달 활성화 및 T 세포 활성화를 낮추기 위해, 각 FcR 이소형에 대한 결합 친화성을 감소시키도록 Fc 영역을 변형하였다.
야생형 중쇄 IgG1 불변 영역 (서열번호 22, X1=L, X2=L, X3=N, X4=P), L234A/L235A 돌연변이가 존재하는 IgG1 불변 영역 (서열번호 22, X1=A, X2=A, X3=N, X4=P), L234A/L235A/P329G 돌연변이가 존재하는 IgG1 불변 영역 (서열번호 22, X1=A, X2=A, X3=N, X4=G), L234A/L235A/N297A 돌연변이가 존재하는 IgG1 불변 영역 (서열번호 22, X1=A, X2=A, X3=A, X4=P) 또는 L234A/L235A/N297A/P329G 돌연변이가 존재하는 IgG1 불변 영역 (서열번호 22, X1=A, X2=A, X3=A, X4=G), 및 서열번호 32의 인간 λ 경쇄 불변 영역을 가지도록, 항-CD3 항체 15H3L3를 조작하였다. 제조된 전장 항체를 각각 15H3L3-WT, 15H3L3-LL, 15H3L3-LLP, 15H3L3-LLN 및 15H3L3-LLNP로 명명하였다.
가변 영역 및 불변 영역을 코딩하는 서열들을 pCDNA3.1 플라스미드 (Invitrogen, USA)에 XhoI과 BamHI 제한효소 부위 사이에 삽입해, 발현 벡터를 구축하였다. 제조한 벡터를 PEI를 이용해 HEK-293F 세포에 형질감염하였다. 간략하게는, HEK-293F 세포를 Free StyleTM 293 발현 배지 (Cat#: 12338-018, Gibco)에서 배양하고, 발현 벡터를 폴리에틸렌이민 (PEI)을 DNA:PEI 1:3 비율로 사용해 형질감염하였다. 형질감염에 사용한 DNA 농도는 세포 배양물 ml 당 1.5 ㎍이었다. 형질감염된 HEK-293F 세포를 인큐베이터에 넣어 120 RPM으로 교반하면서 5% CO2 및 37℃에서 배양하였다. 10-12일 후, 세포 배양물 상층액을 회수하고, 이에 대해 3500 rpm으로 5분간 원심분리한 다음 0.22 ㎛ 막으로 여과해 세포 파편을 제거하였다. 그런 후, 단일클론 항체를 미리-평형화된 단백질-A 친화성 컬럼 (Cat#:17040501, GE, USA)으로 정제 및 농화하고, 용출 완충제 (20 mM 구연산, pH3.0-3.5)로 용출하였다. 정제한 항체는 PBS 완충제 (pH 7.0)에서 보관하였으며, NanoDrop 장치에서 농도를 결정하였다.
정제한 단일클론 항체가 CD16A, CD32A, CD32B 및 CD64에 결합하는 능력을 실시예 11에서 구축한 인간 CD16A, CD32A, CD32B 및 CD64를 각각 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 이용해 FACS에 의해 검사하였다. 간략하게는, 배양 배지 50 ㎕에 HEK293A 세포 105개로 96웰 플레이트에 접종하고, 여기에 연속 희석한 15H3L3 항체 50 ㎕를 첨가하였다. 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 96웰 플레이트를 PBST로 3번 헹구고, PE-F(ab')2-염소 항-인간 IgG Fc 2차 항체 (1: 500, Cat#: H10104, Life Technologies, USA)를 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 96웰 플레이트를 PBS로 3번 헹구고, FACS 장치 (BD)로 세포 형광성을 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
정제한 단일클론 항체가 CD3 복합체에 결합하는 능력을 Jurkat 세포 (Cat#: CBP60520，Nanjing Co-Bioer, China)를 이용해 FACS에 의해 검사하였다. 간략하게는, 배양 배지 50 ㎕에 Jurkat 세포 105개로 96웰 플레이트에 접종하고, 여기에 연속 희석한 15H3L3 항체 50 ㎕를 첨가하였다. 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 96웰 플레이트를 PBST로 3번 헹구고, PE-염소 항-인간 IgG (H+L)(1: 500, Cat#: PA1-86078, Thermo, USA)를 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 96웰 플레이트를 PBS로 3번 헹구고, FACS 장치 (BD)로 세포 형광성을 측정하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
T 세포 활성화에 대한 유리형 15H3L3 항체의 효과를, T 세포에 의한 활성화 마커 발현 및 사이토카인 방출을 측정함으로써, 검사하였다. 건강한 인간 기증자의 혈액 샘플로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 수집하고, 이를 RPMI 완전 배지 (RPMI1640+10% FBS)에 세포 밀도 2.5x105/ml로 재현탁하였다. 세포 현탁물을 96웰 플레이트에 웰 당 200 ㎕로 접종하고, 여기에 15H3L3 항체 50 ㎕를 여러 농도로 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션한 후, 세포 배양물 상층액을 수집하고, ELISA 키트 (Cat#: SIF50, R&D, USA)를 이용해 IFN-γ 수준을 측정하였다. PBMC를 회수해 PBS로 3번 헹구고, 2 ㎕ PE 마우스 항-인간 CD69 항체 (Cat#:555531, BD, USA), 2 ㎕ BV605 마우스 항-인간 CD25 항체 (Cat#: 562660, BD, USA) 및 2 ㎕ FITC 마우스 항-인간 CD4 항체 (Cat#: 561842, BD, USA)를 첨가해 실온에서 30분간 인큐베이션한 다음 원심분리하고, PBS로 3번 헹군 후 CD4+ T 세포에 대한 CD69+CD4+ T 세포, CD25+CD4+ T 세포 또는 CD69+CD25+CD4+ T 세포의 비율을 FACS에 의해 측정하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
또한, 가교된 15H3L3 항체가 CD4+ T 세포 활성화에 미치는 효과를, T 세포에 의한 활성화 마커 발현 및 사이토카인 방출을 측정함으로써, 검사하였다. 간략하게는, 96웰 세포 배양 플레이트에서 각 웰을 5 ㎍/ml F(ab')2-염소 항-인간 IgG Fc gamma 2차 항체 (Cat #: 31163, Invitrogen, USA) 100 ㎕로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 각 웰을 PBS로 2번 헹군 다음 15H3L3 항체 100 ㎕를 여러가지 농도로 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 한편, 건강한 인간 기증자의 혈액 샘플로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 수집하고, PBMC로부터 Invitrogen Dynabeads Untouched 인간 CD4+ T 세포 단리 키트 (Cat#: 11346D, Thermal Fisher Scientific, USA)를 제조사의 지침에 따라 이용해 CD4+ T 세포를 단리하였다. CD4+ T 세포를 RPMI 완전 배지 (RPMI1640 + 10% FBS)에 생존가능한 세포 밀도 2.5x105 /ml로 재현탁하였다. 세포 현탁물을 항-CD3 코팅 플레이트에 웰 당 200 ㎕로 첨가하여, 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 배양물 상층액을 웰 당 50 ㎕씩 수집하고, ELISA 키트 (Cat#: SIF50, R&D, USA)를 이용해 IFN-γ 수준을 측정하였다. 세포를 회수해 PBS로 3번 헹구고, 2 ㎕ PE 마우스 항-인간 CD69 항체 (Cat#:555531, BD, USA), 2 ㎕ BV605 마우스 항-인간 CD25 항체 (Cat#: 562660, BD, USA) 및 2 ㎕ FITC 마우스 항-인간 CD4 항체 (Cat#: 561842, BD, USA)를 첨가해 실온에서 30분간 인큐베이션한 다음 원심분리하고, PBS로 3번 헹군 후 CD4+ T 세포에 대한 CD69+CD4+ T 세포, CD25+CD4+ T 세포 또는 CD69+CD25+CD4+ T 세포의 비율을 FACS에 의해 측정하였다. 분석은 트리플리케이트로 수행하였으며, 그 결과는 도 13에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, Fc 영역에 돌연변이를 가진 항체들 모두 야생형 Fc 영역을 가진 것과 비교해 FcR 4종에 대한 결합력이 현저하게 더 낮게 관찰되었다. 이 중, 15H3L3-LLPN 및 15H3L3-LLN은 CD16A, CD32A, CD32B 및 CD64에 대한 결합력이 거의 검출 한계 미만이었고, 15H3L3-LLP는 CD32A 및 CD32B에 대해 약한 결합력을 가진 반면, 15H3L3-LL은 다른 변이체와 비교해 CD64, CD32A 및 CD32B에 대해 비교적 높은 결합력을 나타내었다.
도 11에 따르면, Fc 영역에서의 돌연변이는 항-CD3 항체가 CD3에 결합하는 능력에 영향을 미치지 않았다.
도 12에서 알 수 있는 바와 같이, Fc 영역에 돌연변이가 존재하는 항체들 모두, 야생형 Fc 영역을 가진 항체와 비교해, CD69 및 CD25와 같은 T 세포 성숙 마커의 발현 및 IFN-γ 분비를 현저하게 감소시킨다. 특히, 사이토카인 (예를 들어, IFN-γ) 방출 및 T 세포 성숙 마커 (예, CD69 및 CD25) 발현은 15H3L3-LLP, 15H3L3-LLPN 또는 15H3L3-LLN 처리 PBMC에서 거의 검출가능하지 않은 반면, 15H3L3-LL은 사이토카인 (예를 들어, IFN-γ) 방출 및 T 세포 성숙 마커 (예, CD69 및 CD25) 발현을 다소 정도 유도할 수 있었다.
나아가, 도 13에 나타낸 바와 같이, Fc 영역 돌연변이는 항체 가교시 T 세포 활성화에 대한 항-CD3 항체 효과에는 변화를 유도하지 않았다. 다시 말해, 항-Fc 2차 항체에 결합된 Fc 영역을 통해 항체 가교가 이루어졌을 경우, 돌연변이 Fc 영역을 가진 항-CD3 항체는 야생형 Fc 영역을 가진 항체와 비슷한 수준으로 사이토카인 (예를 들어, IFN-γ) 방출 및 T 세포 성숙 마커 (예, CD69 및 CD25) 발현을 유발할 수 있었다.
실시예 13 CD3 및 CD20에 대한 2중 특이성 항체의 구축 및 발현
2중 특이성 항체를 도 14에 도시한 구조로, 비대칭적인 형태 (CD20: CD3=2: 1)로서 구축하였다. CD20 결합 부분은 각각 서열번호 26 및 27의 아미노산 서열을 가진 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 채택하였으며 (항-CD20 항체 MIL62, 상세 내용은 CN108138186B 참조), CD3 결합 부분은 15H2L3 또는 15H3L3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 이용하였다. 절반-항체 단편 3개, 즉, MIL220 (서열번호 26의 항-CD20 중쇄 가변 영역, 서열번호 33 전체의 중쇄 불변 영역, 서열번호 27의 항-CD20 경쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 경쇄 불변 영역 함유), MIL221-1 (서열번호 29의 아미노산 서열을 가진 항-CD20 VH-링커-항-CD20 VL-링커-15H2L3 VH, 서열번호 34의 놉을 가진 중쇄 불변 영역, 서열번호 18의 15H2L3의 경쇄 가변 영역 및 서열번호 32의 경쇄 불변 영역 함유) 및 MIL221-2 (서열번호 30의 아미노산 서열을 가진 항-CD20 VH-링커-항-CD20 VL-링커-15H3L3 VH, 서열번호 34의 놉을 가진 중쇄 불변 영역, 서열번호 18의 15H3L3의 경쇄 가변 영역 및 서열번호 32의 경쇄 불변 영역 함유)를 ZL200510064335.0에 기술된 바와 같이 GS-벡터를 이용해 생산하였다.
MIL220의 VH와, MIL221-1 및 MIL221-2의 항-CD20 scFv-링커-항-CD3 VH를 코딩하는 서열들을 합성하였다. DNA 단편을 EcoRI과 NheI으로 효소 절단한 다음 중쇄 불변 영역을 함유한 벡터에 각각 클로닝하였다. MIL220의 VL, MIL221-1의 VL 및 MIL221-2의 VL을 코딩하는 DNA 서열들을 합성하여 ClaI과 BsiW으로 효소 절단한 다음 경쇄 불변 영역을 함유한 벡터에 라이게이션하였다. 경쇄 영역을 코딩하는 DNA 서열을 ClaI과 HindIII로 효소 절단하고, 중쇄 영역을 코딩하는 서열은 EcoRI과 XhoI으로 효소 절단하였다. pCMV-cofragment 플라스미드를 HindIII 및 EcoRI으로 효소 절단하고, GS-벡터를 ClaI 및 XhoI으로 효소 절단하엿다. DNA 단편 4개를 정제하여 연결해 박테리아에 형질전환하였다. 박테리아 콜로니 하나를 취해 서열분석하여 절반-항체 단편을 코딩하는 정확한 서열을 함유한 발현 벡터를 입수하였으며, GS-MIL220, GS-MIL221-1 및 GS-MIL221-2로 명명하였다. HEK-293F 세포 (Cobioer, China)를 상기에서 수득한 발현 벡터로 PEI를 이용해 실시예 12의 프로토콜에 따라 형질감염하였다. 형질감염된 HEK-293F 세포를 인큐베이터에서 120 RPM으로 교반하면서 5% CO2 및 37℃에서 배양하였다. 10-12일 후, 세포 배양 상층액을 회수하여, 이에 대해 3500 rpm에서 5분간 원심분리한 다음 0.22 ㎛ 필름 필터를 이용해 여과하여 세포 파편을 제거하였다. 그 후, 절반-항체 단편을 미리-평형화한 단백질-A 친화성 컬럼 (Cat#:17040501, GE, USA)을 사용해 정제하고, 용출 완충제 (20 mM 구연산, pH3.0-3.5)로 용출하였다. 완충제 교환 후, 단편은 PBS 완충제 (pH 7.0) 중에 보관하고, NanoDrop 장치로 농도를 결정하였다.
실시예 14 CD3 및 CD20에 대한 2중 특이성 항체 제작
정제한 절반-항체 단편들을 시험관내에서 조립하였다. 간략하게는, MIL220과 MIL221-1을, 그리고 MIL220과 MIL221-2를 1:1 비율로 각각 혼합하였다. 이들 혼합물에 Tris 베이스 완충제를 pH 8.0까지 첨가한 다음 환원제 글루타티온 (GSH)을 첨가하였으며, 이를 저속으로 교반하면서 25℃에서 밤새 반응시켰다. 그 후, 혼합물에 2 M 아세트산 용액을 첨가해 pH 5.5로 적정하였다. 환원제를 한외여과에 의해 제거해 반응을 정지시켰다. 조립된 항체는 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피를 이용해 정제하였다. 음이온 교환 컬럼은 저-염 Tris 완충제 (pH8.0)로 평형화한 다음 항체 샘플을 주입하였다. 컬럼을 통과한 성분들을 수집하여, UV280에서 베이스라인에 도달할 때까지 저-염 Tris 완충제 (pH8.0)로 헹구었다. 수집한 샘플은 아세트산 용액을 첨가해 pH5.5로 적정한 다음 30 kDa 울트라필터 관을 이용해 1 ml로 농축한 다음 0.2 μm 막으로 여과하였다. 양이온 교환 컬럼은 저-농도 아세테이트 완충제 (pH5.5)로 평형화한 다음 항체 샘플을 주입하였다. 저-농도 아세테이트 완충제 (pH5.5)를 이용해 컬럼을 다시 평형화하였으며, 20 CV 아세테이트 용액 (농도 0-100%, pH5.5)을 이용해 용출을 수행하였다.
MIL220과 MIL221-1으로 구성된 2중 특이성 항체는 MBS303-1로 명명하고, MIL220과 MIL221-2로 구성된 2중 특이성 항체는 MBS303-2로 명명하였다. 질량 스펙트럼으로 측정시 90% 이상의 고순도의 정제된 항체를 아래에서 추가로 특정화하였다.
실시예 15 2중 특이성 항체는 인간 CD3, 원숭이 CD3 및 CD20에 결합한다.
정제한 2중 특이성 항체가 재조합 인간 및 원숭이 CD3ε 단백질에 결합하는 능력에 대해 ELISA에 의해 실시예 3의 프로토콜에 따라 검사하였다. CD3 및 CD20을 겨냥하는 REGN1979 (US 2014/0088295A1, 또는 대안적으로 http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/details.cgi?pdbcode=11035에 공개된 INN 11035_H, INN 11035_L 및 INN 11035_M에 개시된 아미노산을 이용해 제작), 및 CD20-TCB (WO2018220099A1, 또는 대안적으로 http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/details.cgi?pdbcode=11145에 공개된 INN 11145_H, INN 11145_L, INN 11145_M 및 INN 11145_N에 개시된 아미노산을 이용해 제작)를 기준 항체로 이용하였으며, 항-HEL 항체 (Cat#: LT12031, LifeTein, USA)는 음성 대조군으로 이용하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다 (도 15, A 및 B).
HEK293A 세포 상에 발현된 인간 및 원숭이 CD20 단백질에 대한 2중 특이성 항체의 결합력을 인간 또는 원숭이 CD20을 안정적으로 발현하는 실시예 11에서 구축된 HEK293 세포를 이용해 실시예 12의 프로토콜에 따라 FACS에 의해 추가로 검사하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다 (도 16, A 및 B).
2중 특이성 항체가 인간 및 원숭이 CD3에 결합하는 능력을 Jurkat 세포 및 원숭이 PBMC를 이용해 실시예 12의 프로토콜에 따라 FACS에 의해 추가로 검사하였으며, 단 PBMC는 건강한 원숭이 혈액 샘플에서 밀도 구배 원심분리에 의해 수집하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다 (도 16, C 및 D).
도 15에 나타낸 바와 같이, MBS303-1, MBS303-2 및 CD20-TCB는 인간 및 원숭이 CD3ε에 특이적으로 결합하는 반면 REGN1979는 인간 또는 원숭이 CD3ε에 결합하지 못하였다.
도 16 (A 및 B)에 따르면, 검사한 2중 특이성 항체들 모두 세포 표면에 발현된 인간 및 원숭이 CD20에 결합하였으며, MBS303-1, MBS303-2 및 CD20-TCB는 인간 CD20에 대한 결합 능력이 REGN1979보다 현저하게 우수하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이 (C 및 D), 2중 특이성 항체들 모두 세포 표면 상의 인간 및 원숭이 CD3 복합체에 결합하였으며, MBS303-1, MBS303-2 및 REGN1979가 인간 CD3 복합체에 대한 결합 능력이 CD20-TCB보다 현저하게 우수하였다.
실시예 16 SPR에 의한 2중 특이성 항체의 결합 친화성 결정
본 발명의 2중 특이성 항체가 인간 및 원숭이 CD3ε에 결합하는 친화성을 BIAcoreTM 8K (GE Life Sciences, USA)를 이용해 실시예 6의 프로토콜에 따라 검사하였다.
BIAcoreTM에 의해 측정한 결합 친화성을 표 7에 요약 개시하였다. REGN1979가 인간 또는 원숭이 CD3ε에 결합하는 친화성은 검출할 수 없었으며, 다른 2중 특이성 항체들은 결합 친화성이 nM 수준이었다. FACS 검사 결과와 일관적으로, MBS303-1 및 MBS303-2는 CD20-TCB와 비교해 인간 및 원숭이 CD3ε에 대해 더 높은 결합 친화성을 나타내었다.
표 7. 2중 특이성 항체의 인간/원숭이 CD3ε에 대한 결합 친화성
항체 인간 CD3ε 원숭이 CD3ε
Ka Kd KD Ka Kd KD
REGN1979 / / / / / /
CD20-TCB 5.43E+5 3.04E-3 5.60E-9 5.50E+05 2.21E-03 4.01E-09
MBS303-1 2.23E+5 4.43E-4 1.99E-9 3.47E+05 5.37E-04 1.55E-09
MBS303-2 2.07E+5 3.7E-4 1.79E-9 2.79E+05 5.04E-04 1.81E-09
실시예 17 2중 특이성 항체가 T 세포 활성화에 미치는 효과
유리형 2중 이성 항체가 CD3/TCR 신호전달 활성화에 미치는 효과를 일차 인간 PBMC를 이용해 실시예 12의 프로토콜에 따라 일부 수정하여 검사하였다. 구체적으로, 세포 배양물 상층액을 48시간 배양한 후 수집하고, ELISA 키트 (Cat#: 430107, Biolegend, USA; Cat#: 430207, Biolegend, USA)를 제조사의 지침에 따라 사용해 IFN-γ 및 TNF-α 수준을 둘다 측정하였다.
그 결과를 도 17 (A 및 B)에 나타내었다. REGN1979에 의해 유발된 IFN-γ 및 TNF-α 수준은 CD20-TCB, MBS303-1 또는 MBS303-2에 의해 유발된 것보다 현저하게 낮았으며, CD20-TCB가 가장 높은 사이토카인 방출을 유발하였다. 도 17 (C, D 및 E)은 T 세포 활성화 마커의 발현 수준을 보여주며, 이는 사이토카인 수준 검사 결과와 일치하였다. 구체적으로, REGN1979는 CD20-TCB, MBS303-1 및 MBS303-2와 비교해 T 세포 활성화를 현저하게 낮은 활성 수준으로 유발하였으며, CD20-TCB는 T 세포를 활성화하는 활성이 가장 우수하였다.
실시예 18 2중 특이성 항체는 T 세포 활성화 및 PBMC에 의한 CD20 + 종양 세 포의 사멸을 유발한다.
2중 특이성 항체에 대해, PBMC에 의한 CD20+ Raji 세포의 사멸 유도 능력을 추가로 검사하였다. Raji 세포를 녹색 형광의 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르로 표지하였다. 구체적으로, Raji 세포를 RPMI 완전 배지에 세포 밀도 1.0x106/ml로 재현탁한 다음 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE, Cat#: C34554I, Invitrogen, USA)로 제조사의 지침에 따라 표지하였으며, 단 세포는 2.5 μM CFSE와 37℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 표지한 세포를 RPMI 완전 배지 (RPMI + 10% FBS)에 생존가능한 세포 밀도 2.5x105/ml로 재현탁하였다. 건강한 인간 기증자의 혈액 샘플로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 수집하고, RPMI 완전 배지 (RPMI1640 + 10% FBS)에 생존가능한 세포 밀도 5x105/ml로 재현탁하였다. Raji 세포 (100 ㎕)와 PBMC (100 ㎕)를 96웰 플레이트에 작동자:표적 2:1 비율로 접종한 다음 2중 특이성 항체를 여러가지 농도로 100 ㎕ 첨가하였다. 세포/항체 혼합물을 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
각 웰에서 세포 배양물 상층액 50 ㎕를 수집하여, IFN-γ, IL-2 및 TNF-α 수준을 3가지 키트 (Cat#: 430107, Biolegend, USA; Cat#: S2050, R&D, USA; Cat#: 430207, Biolegend, USA)를 이용해 측정하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다.
Raji 세포의 생존성을 LIVE/DEADTM 고정가능한 바이올렛 사멸 세포 염색 키트 (Cat#: L34964, Thermo Fisher, USA)에 의해 측정하였다. 상기한 세포/항체 혼합물을 PBS로 3번 헹구고, 염료와 함께 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 다시 3번 헹구고, FACS 측정을 수행하였다. 녹색 형광성을 가진 세포 (Raji 세포)의 사멸률을 결정하고, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 따르면, 2중 특이성 항체들 모두 T 세포 매개 Raji 세포 사멸을 유발할 수 있었다. 항체들 중 REGN1979는 Raji 세포 사멸을 유도하는 활성이 가장 낮았고, MBS303-1과 MBS303-2의 활성은 REGN1979에 대해 더 높았으며 CD20-TCB와는 비슷하거나 또는 약간 더 약하였다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 2중 특이성 항체들 모두 T 세포에 의한 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α 방출을 유도하였다. 항체들 중, CD20-TCB는 대부분의 사이토카인 방출을 유도한 반면, MBS303-1 및 MBS303-2에 의해 유도된 사이토카인 수준은 CD20-TCB에 의해 유도된 수준보다 훨씬 낮았으며, REGN1979에 의해 유도된 수준과는 비슷하거나 또는 약간 더 높았다.
실시예 19 2중 특이성 항체는 CD3 + T 세포 활성화 및 CD3 + T 세포에 의한 CD20 + 종양 세포 사멸을 특이적으로 유도한다.
2중 특이성 항체에 대해, T 세포에 의한 CD20+ 종양 세포의 표적 사멸을 유도하는 능력을 추가로 검사하였다. 실시예 11에서 구축한 HEK293A/hCD20 세포를 CD20+ 종양 세포로 사용하였고, 부모 HEK293A 세포는 CD20- 종양 세포로 사용하였다. pLV-EGFP(2A)-Puro 플라스미드를 사용해 HEK293A/hCD20 세포를 구축하여 녹색 형광의 GFP를 과다 발현시키고, HEK293A 세포는 실시예 18의 프로토콜에 따라 녹색 형광성 CFSE로 표지하였다.
간략하게는, 건강한 인간 기증자의 혈액 샘플로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 수집하고, CD4+ T 세포를 PBMC로부터 Invitrogen Dynabeads Untouched 인간 CD4+ T 세포 단리 키트 (Cat#: 11346D, Thermal Fisher Scientific, USA)를 제조사의 지침에 따라 사용해 단리하였다. 표적 세포 (HEK293A/hCD20 세포/HEK293A 세포) 및 작동자 세포 (T 세포)를 1200 rpm으로 5분간 원심분리한 다음, RIPM1640 완전 배지 (RIPM1640 + 10% FBS)에 생존가능한 세포 95%로 재현탁하였다. 표적 세포 및 T 세포는 세포 밀도 각각 2.5x105/ml 및 5x105/ml로 적정하고, 표적 세포 100 ㎕ 및 T 세포 100 ㎕를 작동자-표적 2:1 비율로 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 그 후, 희석 항체 (1:10 희석, 10 ㎍/ml에서 희석 개시) 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 세포/항체 혼합물을 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. ADCC 활성이 강화된 비-푸코실화된 항-CD20 단일 특이성 항체 MIL62 (CN108138186B에 개시된 아미노산 서열 및 제조 방법을 이용해 제작), REGN1979 및 CD20-TCB를 양성 대조군으로 이용하였다.
48시간 인큐베이션한 후, 세포 배양물 상층액 50 ㎕을 각 웰에서 수집하고, IFN-γ 및 TNF-α 수준을 2개의 키트 (Cat#: SIF50, R&D, USA; Cat#: 430207, Biolegend, USA)를 사용해 측정하였다. 그 결과를 도 21에 나타내었다.
종양 세포의 생존성을 LIVE/DEADTM 고정가능한 바이올렛 사멸 세포 염색 키트 (Cat#: L34964, Thermo Fisher, USA)에 의해 측정하였다. 구체적으로, 상기한 세포/항체 혼합물을 PBS로 3번 헹구고, 염료와 함께 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 다시 3번 헹구고, FACS 검사를 수행하였다. 녹색 형광성을 가진 세포 (HEK293/hCD20 세포 또는 HEK293 세포)의 사멸률을 결정하였으며, 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20에 따르면, 2중 특이성 항체들 모두 T 세포에 의한 CD20+ 종양 세포의 표적 사멸을 유도할 수 있었지만, CD20- 세포에 대해서는 이러한 효과가 없었다. 2중 특이성 항체는 단일 특이성 항-CD20 항체 MIL62와 비교해 CD20+ 종양 세포를 현저하게 더 많이 살상하였다. 2중 특이성 항체들 중, REGN1979는 표적 사멸을 유도하는 활성이 가장 약하였으며, MBS303-1 및 MBS303-2의 활성은 REGN1979보다 높고, CD20-TCB와는 비슷하거나 약간 낮았다.
도 21에 나타낸 바와 같이, 2중 특이성 항체에 의해 유도된, T 세포에 의한 IFN-γ 및 TNF-α 방출이 CD20+ 세포에 의해 매개되었으며, 특이 항체는 CD20- 세포를 이용한 T 세포에 의한 사이토카인 방출은 유도하지 못하였다. 2중 특이성 항체들 중, CD20-TCB는 대부분 사이토카인을 방출하였지만, MBS303-1 및 MBS303-2에 의해 유도된 사이토카인 수준은 CD20-TCB에 의해 유도된 수준보다 훨씬 더 낮았다.
실시예 20 MIL62 전처리는 PBMC에 의한 2중 특이성 항체의 사이토카인 방출 유도를 감소시킨다.
본 발명의 2중 특이성 항체를 MIL62와 조합 사용할 경우 PBMC에 의한 사이토카인 방출에 미치는 효과를 검사하였다. 간략하게는, 건강한 인간 기증자의 혈액 샘플로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 수집하여, RPMI 완전 배지 (RPMI 1640 + 10% FBS)에 현탁한 다음 2개의 분액으로 나누었다. 분액 하나에는 MIL62를 최종 농도 1 ㎍/ml로 첨가해 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하였으며, 다른 분액은 바로 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. PBMC를 PBS로 3번 헹구고, RPMI 완전 배지 (RPMI 1640 + 10% FBS)에 세포 밀도 5x105/ml로 현탁하였다. 각 웰에 PBMC 현탁물 200 ㎕를 첨가하였다. MIL62로 전처리된 PMBC의 경우, 각 웰에 MIL62를 최종 농도 1 ㎍/ml로, 그리고 MBS303-2 또는 MBS303-1을 여러가지 농도로 첨가하였다. MIL62 비-처리 PMBC의 경우, 각 웰에 MBS303-2를 여러가지 농도로 첨가하였다. PBMC/항체 혼합물을 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하고, IFN-γ 및 TNF-α 수준을 ELISA 키트 2종 (Cat#: SIF50, R&D, USA; Cat#: 430207, Biolegend, USA)을 제조사의 지침에 따라 사용해 측정하기 위해 세포 배양물 상층액 50 ㎕를 수집하였다. 세포를 수집해 PBS로 3번 헹구고, 2 ㎕ PE 마우스 항-인간 CD69 항체 (Cat#: 555531, BD, USA), 2 ㎕ BV605 마우스 항-인간 CD25 항체 (Cat#: 562660, BD, USA) 및 2 ㎕ FITC 마우스 항-인간 CD4 항체 (Cat#: 561842, BD, USA)를 첨가한 다음 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리에 의해 수집해 PBS로 3번 헹구고, CD4+ T 세포에 대한 CD69+CD4+ T 세포, CD25+CD4+ T 세포 또는 CD69+CD25+CD4+ T 세포의 비율을 FACS에 의해 측정하였다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 2중 특이성 항체를 단독 처리한 경우, PBMC는 IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인을 비교적 높은 수준으로 방출하였으며, CD69 및 CD25와 같은 T 세포 활성화 마커를 비교적 높은 수준으로 발현하였다. 그러나, PBMC를 MIL62로 전처리한 다음 MIL62와 본 발명의 2중 특이성 항체를 조합 사용하였을 경우에는 사이토카인 방출 또는 T 세포 활성화 마커의 발현이 거의 관찰되지 않았다.
실시예 21 MIL62와 조합한, 예시적인 2중 특이성 항체의 항-종양 효과
본 발명의 2중 특이성 항체와 조합한 MIL62의 항-종양 효과를 T 세포에 의한 CD20+ 세포 (즉, HEK293A/hCD20 세포) 사멸에 의해 검사하였다. 간략하게는, 건강한 인간 기증자의 혈액 샘플로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 수집하고, CD4+ T 세포를 PBMC로부터 Invitrogen Dynabeads Untouched 인간 CD4+ T 세포 단리 키트 (Cat#: 11346D, Thermal Fisher Scientific, USA)를 제조사의 지침에 따라 사용해 단리하였다. HEK293A/hCD20 세포는 pLV-EGFP(2A)-Puro 플라스미드를 사용해 구축하여 녹색 형광의 GFP를 과다 발현시켰다. 표적 세포와 작동자 세포 (즉, T 세포)를 1200 rpm으로 5분간 원심분리한 다음, RIPM1640 완전 배지 (RIPM1640 + 10% FBS)에 생존가능한 세포 약 95%로 재현탁하였다. 표적 세포 및 T 세포는 세포 밀도 각각 2.5x105/ml 및 5x105/ml로 적정하고, 표적 세포 100 ㎕ 및 T 세포 100 ㎕를 작동자-표적 2:1 비율로 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 제조된 혼합 현탁물을 2개의 분액으로 나누었으며, 분액 하나에는 2중 특이성 항체 희석물 (10배 희석, 10 ㎍/ml에서 희석 개시) 50 ㎕를 첨가하고, 다른 분액에는 MIL62를 최종 농도 1 ㎍/ml로, 그리고 2중 특이성 항체 희석물 (10배 희석, 10 ㎍/ml에서 희석 개시) 50 ㎕를 첨가하였다. 세포/항체 혼합물을 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. HEK293A/hCD20 세포의 생존성을 LIVE/DEADTM 고정가능한 바이올렛 사멸 세포 염색 키트 (Cat#: L34964, Thermo Fisher, USA)를 사용해 측정하였다. 구체적으로, 상기한 세포/항체 혼합물을 PBS로 3번 헹구고, 염료와 함께 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 3번 헹구고, FACS 측정을 수행하였다. 녹색 형광성을 가진 세포의 사멸율 (HEK293A/hCD20 세포)을 결정하였다.
그 결과를 도 23에 나타낸 바, MIL62 및 2중 특이성 항체는 상승적인 항-종양 효과를 나타내었다. EC50은 MBS303-1 단독 처리시 7.6 ng/ml였으며, MBS303-1을 MIL62와 조합한 경우에는 3.2 ng/ml로 감소하였다. MBS303-2는 단독 사용시 EC50 9.8 ng/ml였으며, MIL62와 조합 사용한 경우에는 EC50 3.9 ng/ml이었다.
실시예 22 2중 특이성 항체의 생체내 항-종양 효과
MBS303-2의 생체내 항-종양 효과를, 루시퍼라제를 발현하는 Raji 세포 (Raji-luc 세포로 명명됨, Yicon (Beijing) Medical Science And Technology Co., Ltd.)를 PBMC 인간화된 면역결핍 마우스 (GemPharmatech Co. Ltd, China)에 이식하여 구축한 동물 모델을 이용해 조사하였다. 마우스 일부에는 건강한 인간 기증자로부터 수집한 PBMC 100 ㎕를 세포 밀도 5x107/ml로 꼬리 정맥 주사에 의해 주사하였다. 3일 후, Raji-luc 세포를 PBS에 밀도 5x106/ml로 재현탁하고, Raji-luc 세포 현탁물 100 ㎕를 꼬리 정맥을 통해 PBMC 투여 또는 비-투여 동물에 주사하였으며, 이 일자를 0일로 명명하였다. 동물을 군 당 8마리로 이루어진 군 5개로 무작위 할당하고, 3일, 10일 및 17일에 PBS 또는 MBS303-2를 각각 0.05 mg/kg, 0.15 mg/kg 및 0.5 mg/kg로 투여하였다.
종양 크기, 마우스의 상태 및 마우스 체중을 경시적으로 모니터링하였다. 매일 마우스에서 건강 상태를 관찰하였으며, Raji-luc 주사 개시부터 사망 또는 안락사할 때까지 생존 기간을 기록하였다. 안락사는, 수의사의 판단에 따라, 1) 마우스의 체중이 20% 이상 감소하거나, 2) 마우스가 더 이상 물을 능동적으로 마실 수 없거나, 3) 마우스의 종양 부하가 평균 방사선 (p/sec/cm2/sr)에 따라 5x107에 도달하거나, 및/또는 4) 동물 복지 및/또는 실험에 부정적인 영향을 미치는 특별한 사건이 발생하였을 경우에, 수행하였다. 각 군에서 종양-보유 마우스의 중앙 생존 시간 (MST) 및 처리 군에서 수명 증가 (ILS %)를 결정하였다. ILS %는 (처리군의 중앙 생존 일수/대조군의 중앙 생존 일수 -1) x 100%로 계산하였다. 치료는, 통계학적 유의성이 대조군에 대해 확인될 경우 유효한 것으로 간주하였다. 마우스는 여러 군으로 할당한 후 주 당 1회로 루시퍼라제에 대한 기질 15 mg/ml을, 10 ㎕/체중 g으로 복막내 주사하였으며, 이소플루란으로 마취한 다음 소형 동물 촬상 장치 (IVIS Lumina Series III, PerkinElmer)를 이용해 마우스에서 종양 증식을 특정화하기 위해 형광 신호를 수집하였다. 일원식 ANOVA를 이용해 군들에서 신호 차이를 분석하였으며, 카플란-마이어 및 로그 순위를 이용해 종양-보유 마우스의 생존 시간에 대한 군별 차이를 분석하였다. 통계학적 유의성은 P<0.05일 경우에 확정하였다.
도 24 (A 및 B)에 나타낸 바와 같이, 이미징 또는 형광 강도 분석에서는, MBS303-2가 용량-의존적인 방식으로 종양 증식을 유의하게 저해하는 것으로 확인되었다. 도 24 (C)에 따르면, MBS303-2는 종양-보유 마우스의 생존성을 유의하게 연장하였으며, 이는 생체내 항-종양 활성을 명확하게 보여준다.
본 발명에서의 서열을 아래에 요약 개시한다.
설명/
서열/서열번호
마우스 및 키메라 CD3-19 항체의 VH-CDR1
X1YAMN (서열번호 1) X1=S
SYAMN
마우스, 키메라 및 인간화된 19-15 및 19-26 항체, 마우스 및 키메라 19-37 항체의 VH-CDR1
X1YAMN (서열번호 1) X1=T
TYAMN
마우스 및 키메라 CD3-19 항체, 마우스, 키메라 및 인간화된 19-26 항체의 VH-CDR2
RIRSKYNNYATYYAX1SV (서열번호 2) X1=D
RIRSKYNNYATYYADSV
마우스, 키메라 및 인간화된 19-15 항체, 마우스 및 키메라 19-37 항체의 VH-CDR2
RIRSKYNNYATYYAX1SV (서열번호 2) X1=I
RIRSKYNNYATYYAISV
마우스 및 키메라 CD3-19 항체, 마우스, 키메라 및 인간화된 19-15 항체의 VH-CDR3
HGNFGNSYX1SX2WAY (서열번호 3) X1=L, X2=Y
HGNFGNSYLSYWAY
마우스 및 키메라 19-37 항체의 VH-CDR3
HGNFGNSYX1SX2WAY (서열번호 3) X1=I, X2=Y
HGNFGNSYISYWAY
마우스, 키메라 및 인간화된 19-26 항체의 VH-CDR3
HGNFGNSYX1SX2WAY (서열번호 3) X1=I, X2=W
HGNFGNSYISWWAY
마우스 및 키메라 CD3-19 항체의 VL-CDR1
X1SSTGAVTTX2NYAN (서열번호 4) X1=D, X2=S
DSSTGAVTTSNYAN
마우스, 키메라 및 인간화된 19-15 항체의 VL-CDR1
X1SSTGAVTTX2NYAN (서열번호 4) X1=Q, X2=N
QSSTGAVTTNNYAN
마우스, 키메라 및 인간화된 19-26 항체의 VL-CDR1
X1SSTGAVTTX2NYAN (서열번호 4) X1=K, X2=S
KSSTGAVTTSNYAN
마우스 및 키메라 19-37 항체의 VL-CDR1
X1SSTGAVTTX2NYAN (서열번호 4) X1=R, X2=N
RSSTGAVTTNNYAN
마우스 및 키메라 CD3-19 항체의 VL-CDR2
GTX1X2X3AP (서열번호 5) X1=Q, X2=R, X3=S
GTQRSAP
마우스, 키메라 및 인간화된 19-15 항체의 VL-CDR2
GTX1X2X3AP (서열번호 5) X1=K, X2=Q, X3=R
GTKQRAP
마우스, 키메라 및 인간화된 19-26 항체의 VL-CDR2
GTX1X2X3AP (서열번호 5) X1=N, X2=L, X3=H
GTNLHAP
마우스 및 키메라 19-37 항체의 VL-CDR2
GTX1X2X3AP(서열번호 5)X1=R, X2=L, X3=S
GTRLSAP
마우스 및 키메라 CD3-19 항체, 마우스, 키메라 및 인간화된 19-15 항체, 마우스 및 키메라 19-37 항체의 VL-CDR3
X1LWYSNLWV (서열번호 6) X1=V
VLWYSNLWV
마우스, 키메라 및 인간화된 19-26 항체의 VL-CDR3
X1LWYSNLWV (서열번호 6) X1=A
ALWYSNLWV
마우스 및 키메라 CD3-19 항체의 VH
EVKLLESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN SYAMN WVRQAPGKGLEWVA RIRSKYNNYATYYADSV KDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVR HGNFGNSYLSYWAY WGQGTLVTVSA (서열번호 7)
마우스 및 키메라 CD3-19 항체의 VL
QAVVTQESALTTSPGETVTLTC DSSTGAVTTSNYAN WVQEKPDHLFTGLIG GTQRSAP GVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFC VLWYSNLWV FGGGTKLTVL (서열번호 15)
마우스 및 키메라 19-15 항체의 VH
EVKLLESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN TYAMN WVRQAPGKGLEWVA RIRSKYNNYATYYAISV KDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVR HGNFGNSYLSYWAY WGQGTLVTVSA (서열번호 8)
인간화 항체 15H2L2 및 15H2L3의 VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN TYAMN WVRQAPGKGLEWVA RIRSKYNNYATYYAISV KDRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCVK HGNFGNSYLS YWAY WGQGTL VTVSS(서열번호 9)
인간화 항체 15H3L2 및 15H3L3의 VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN TYAMN WVRQAPGKGLEWVA RIRSKYNNYATYYAISV KDRFTISRDDSKNT LYLQMNSLRAEDTAMYYCVR HGNFGNSYLS YWAY WGQGTL VTVSS (서열번호 10)
마우스 및 키메라 19-15 항체의 VL
QAVVTQESALTTSPGETVTLTC QSSTGAVTTNNYAN WVQEKPDHLFTGLIG GTKQRAP GVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFC VLWYSNLWV FGGGTKLTVL (서열번호 16)
인간화 항체 15H2L2 및 15H3L2의 VL
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC QSSTGAVTTNNYAN WVQQKPGQAPRALIG GTKQRAP GTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYC VLWYSNLWV FGGGTKLTVL (서열번호 17)
인간화 항체 15H2L3 및 15H3L3의 VL
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC QSSTGAVTTNNYAN WVQQKPGHAFRGLIG GTKQRAP GVPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYC VLWYSNLWV FGGGTKLTVL(서열번호 18)
마우스 및 키메라 19-26 항체의 VH
EVKLLESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN TYAMN WVRQAPGKGLEWVA RIRSKYNNYATYYADSV KDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVR HGNFGNSYISWWAY WGQGTLVTVSA (서열번호 11)
인간화 항체 26-H2L3의 VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN TYAMN WVRQAPGKGLEWVA RIRSKYNNYATYYADSV KDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVK HGNFGNSYISWWAY WGQGTLVTVSS (서열번호 12)
인간화 항체 26-H3L3의 VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN TYAMN WVRQAPGKGLEWVA RIRSKYNNYATYYADSV KDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVR HGNFGNSYISWWAY WGQGTLVTVSS (서열번호 13)
마우스 및 키메라 19-26 항체의 VL
QAVVTQESALTTSPGETVTLTC KSSTGAVTTSNYAN WVQEKPDHLFTGLIG GTNLHAP GVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFC ALWYSNLWV FGGGTKLTVL (서열번호 19)
인간화 항체 26-H2L3 및 26-H3L3의 VL
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC KSSTGAVTTSNYAN WVQQKPGHAFRGLIG GTNLHAP GVPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYC ALWYSNLWV FGGGTKLTVL (서열번호 20)
마우스 및 키메라 19-37 항체의 VH
EVKLLESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN TYAMN WVRQAPGKGLEWVA RIRSKYNNYATYYAISV KDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVR HGNFGNSYISYWAY WGQGTLVTVSA (서열번호 14)
마우스 및 키메라 19-37 항체의 VL
QAVVTQESALTTSPGETVTLTC RSSTGAVTTNNYAN WVQEKPDHLFTGLIG GTRLSAP GVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFC VLWYSNLWV FGGGTKLTVL (서열번호 21)
IgG1 - 야생형 Fc
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEX1X2GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYX3STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALX4APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 22) X1=L, X2=L, X3=N, X4=P
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG1 Fc L234A/L235A
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEX1X2GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYX3STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALX4APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 22) X1=A, X2=A, X3=N, X4=P
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG1 Fc L234A/L235A/P329G
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEX1X2GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYX3STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALX4APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 22) X1=A, X2=A, X3=N, X4=G
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG1 Fc L234A/L235A/N297A
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEX1X2GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYX3STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALX4APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 22) X1=A, X2=A, X3=A, X4=P
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG1 Fc L234A/L235A/N297A/P329G
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEX1X2GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYX3STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALX4APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 22) X1=A, X2=A, X3=A, X4=G
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
인간 λ 경쇄 불변 영역
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(서열번호 23)
인간 CD3ε cDNA
ATGCAGTCGGGCACTCACTGGAGAGTTCTGGGCCTCTGCCTCTTATCAGTTGGCGTTTGGGGGCAAGATGGTAATGAAGAAATGGGTGGTATTACACAGACACCATATAAAGTCTCCATCTCTGGAACCACAGTAATATTGACATGCCCTCAGTATCCTGGATCTGAAATACTATGGCAACACAATGATAAAAACATAGGCGGTGATGAGGATGATAAAAACATAGGCAGTGATGAGGATCACCTGTCACTGAAGGAATTTTCAGAATTGGAGCAAAGTGGTTTTATGTCTGCTACCCCAGAGGAAGCAAACCAGAAGATGCGAACTTTTATCTCTACCTGAGGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCATGGAGATGGATGTGATGTCGGTGGCCACAATTGTCATAGTGGACATCTGCATCACTGGGGGCTTGCTGCTGCTGGTTTACTACTGGAGCAAGAATAGAAAGGCCAAGGCCAAGCCTGTGACACGAGGAGCGGGTGCTGGCGGCAGGCAAAGGGGACAAAACAAGGAGAGGCCACCACCTGTTCCCAACCCAGACTATGAGCCCATCCGGAAAGGCCAGCGGGACCTGTATTCTGGCCTGAATCAGAGACGCATCTGA(서열번호 24)
인간 CD3δ cDNA
ATGGAACATAGCACGTTTCTCTCTGGCCTGGTACTGGCTACCCTTCTCTCGCAAGTGAGCCCCTTCAAGATACCTATAGAGGAACTTGAGGACAGAGTGTTTGTGAATTGCAATACCAGCATCACATGGGTAGAGGGAACGGTGGGAACACTGCTCTCAGACATTACAAGACTGGACCTGGGAAAACGCATCCTGGACCCACGAGGAATATATAGGTGTAATGGGACAGATATATACAAGGACAAAGAATCTACCGTGCAAGTTCATTATCGAATGTGCCAGAGCTGTGTGGAGCTGGATCCAGCCACCGTGGCTGGCATCATTGTCACTGATGTCATTGCCACTCTGCTCCTTGCTTTGGGAGTCTTCTGCTTTGCTGGACATGAGACTGGAAGGCTGTCTGGGGCTGCCGACACACAAGCTCTGTTGAGGAATGACCAGGTCTATCAGCCCCTCCGAGATCGAGATGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGAGGAAACTGGGCTCGGAACAAGTGA (서열번호 25)
MIL62의 VH
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYAFS YSWINWVRQA PGQGLEWMGR IFPGDGDTDY NGKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARNV FDGYWLVYWG QGTLVTVSS (서열번호 26)
MIL62의 VL
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSSKSLL HSNGITYLYW YLQKPGQSPQ LLIYQMSNLV SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCAQNLELP YTFGGGTKVE IK (서열번호 27)
링커
GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 28)
MIL62 VH - 링커 - MIL62 VL - 링커 - 15H2L3 VH
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYAFS YSWINWVRQA PGQGLEWMGR IFPGDGDTDY NGKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARNV FDGYWLVYWG QGTLVTVSSG GGGSGGGGSG GGGSDIVMTQ TPLSLPVTPG EPASISCRSS KSLLHSNGIT YLYWYLQKPG QSPQLLIYQM SNLVSGVPDR FSGSGSGTDF TLKISRVEAE DVGVYYCAQN LELPYTFGGG TKVEIKGGGG SGGGGSGGGG SEVQLLESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF N TYAMN WVRQ APGKGLEWV A RIRSKYNNYA TYYAISV KDR FTISRDNSKN TLYLQMNSLR AEDTAVYYCV K HGNFGNSYL SYWAY WGQGT LVTVSS (서열번호 29)
MIL62 VH - 링커 - MIL62 VL - 링커 - 15H3L3 VH
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYAFS YSWINWVRQA PGQGLEWMGR IFPGDGDTDY NGKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARNV FDGYWLVYWG QGTLVTVSSG GGGSGGGGSG GGGSDIVMTQ TPLSLPVTPG EPASISCRSS KSLLHSNGIT YLYWYLQKPG QSPQLLIYQM SNLVSGVPDR FSGSGSGTDF TLKISRVEAE DVGVYYCAQN LELPYTFGGG TKVEIKGGGG SGGGGSGGGG SEVQLLESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF NTYAMNWVRQ APGKGLEWVA RIRSKYNNYA TYYAISVKDR FTISRDDSKN TLYLQMNSLR AEDTAMYYCV RHGNFGNSYL SYWAYWGQGT LVTVSS (서열번호 30)
MIL220 및 MIL62의 경쇄 불변 영역
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 31)
MIL221-1 및 MIL221-2의 경쇄 불변 영역
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPT (서열번호 32)
MIL220의 중쇄 불변 영역
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 33)
MIL221-1 및 221-2의 중쇄 불변 영역
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 34)
인간 CD20
MTTPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEETETNFPEPPQDQESSPIENDSSP (서열번호 35)
원숭이 CD20
MTTPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQPGPKPLLRRMSSLVGPTQSFFMRESKALGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRVHTPYINIYYCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWRRTCSRPKSSVVLLSAEEKKEQVIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEETETNFPEPPQDQESSPIENDSSP (서열번호 36)
인간 CD16A
MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK (서열번호 37)
인간 CD32A
MTMETQMSQNVCPRNLWLLQPLTVLLLLASADSQAAAPPKAVLKLEPPWINVLQEDSVTLTCQGARSPESDSIQWFHNGNLIPTHTQPSYRFKANNNDSGEYTCQTGQTSLSDPVHLTVLSEWLVLQTPHLEFQEGETIMLRCHSWKDKPLVKVTFFQNGKSQKFSHLDPTFSIPQANHSHSGDYHCTGNIGYTLFSSKPVTITVQVPSMGSSSPMGIIVAVVIATAVAAIVAAVVALIYCRKKRISANSTDPVKAAQFEPPGRQMIAIRKRQLEETNNDYETADGGYMTLNPRAPTDDDKNIYLTLPPNDHVNSNN (서열번호 38)
인간 CD32B
MGILSFLPVLATESDWADCKSPQPWGHMLLWTAVLFLAPVAGTPAAPPKAVLKLEPQWINVLQEDSVTLTCRGTHSPESDSIQWFHNGNLIPTHTQPSYRFKANNNDSGEYTCQTGQTSLSDPVHLTVLSEWLVLQTPHLEFQEGETIVLRCHSWKDKPLVKVTFFQNGKSKKFSRSDPNFSIPQANHSHSGDYHCTGNIGYTLYSSKPVTITVQAPSSSPMGIIVAVVTGIAVAAIVAAVVALIYCRKKRISALPGYPECREMGETLPEKPANPTNPDEADKVGAENTITYSLLMHPDALEEPDDQNRI (서열번호 39)
인간 CD64
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHVLFYLAVGIMFLVNTVLWVTIRKELKRKKKWDLEISLDSGHEKKVISSLQEDRHLEEELKCQEQKEEQLQEGVHRKEPQGAT (서열번호 40)
***
본 발명의 구체적인 바람직한 구현예들이 기술되었지만, 상기한 단락들에 의해 정의되는 본 발명이 본 발명의 사상 또는 범위로부터 이탈하지 않으면서 여러가지 명백한 변형이 가능하므로 상기한 설명에 기술된 구체적인 내용으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
<110> Beijing Mabworks Biotech Co., Ltd <120> Antibodies Binding Human and Monkey CD3 and Uses Thereof <130> 55556 00058 <150> CN202011540874.8 <151> 2020-12-23 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of mouse and chimeric CD3-19 and 19-37, mouse, chimeric and humanized 19-15 and 19-26 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> Xaa can be Ser or Thr <400> 1 Xaa Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of mouse and chimeric CD3-19 and 19-37, mouse, chimeric and humanized 19-15 and 19-26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15) <223> Xaa can be Asp or Ile <400> 2 Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Xaa Ser 1 5 10 15 Val <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of mouse and chimeric CD3-19 and 19-37, mouse, chimeric and humanized 19-15 and 19-26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa can be Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> Xaa can be Tyr or Trp <400> 3 His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Xaa Ser Xaa Trp Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of mouse and chimeric CD3-19 and 19-37, mouse, chimeric and humanized 19-15 and 19-26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa can be Asp, Gln, Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa can be Ser or Asn <400> 4 Xaa Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Xaa Asn Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2of mouse and chimeric CD3-19 and 19-37, mouse, chimeric and humanized 19-15 and 19-26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa can be Gln, Lys, Asn or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Xaa can be Arg, Gln or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa can be Ser, Arg or His <400> 5 Gly Thr Xaa Xaa Xaa Ala Pro 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of mouse and chimeric CD3-19 and 19-37, mouse, chimeric and humanized 19-15 and 19-26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa can be Val or Ala <400> 6 Xaa Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val 1 5 <210> 7 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of mouse and chimeric CD3-19 <400> 7 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Tyr Trp 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 125 <210> 8 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of mouse and chimeric 19-15 <400> 8 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ile 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Tyr Trp 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 125 <210> 9 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of 15H2L2 and 15H2L3 <400> 9 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ile 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Lys His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Tyr Trp 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 10 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of 15H3L2 and 15H3L3 <400> 10 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ile 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Tyr Trp 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 11 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of mouse and chimeric 19-26 <400> 11 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Trp Trp 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 125 <210> 12 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of 26-H2L3 <400> 12 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Lys His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Trp Trp 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 13 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of 26-H3L3 <400> 13 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Trp Trp 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 14 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of mouse and chimeric 19-37 <400> 14 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ile 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 125 <210> 15 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of mouse and chimeric CD3-19 <400> 15 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Asp Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Gln Arg Ser Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 16 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of mouse and chimeric 19-15 <400> 16 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gln Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Asn 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Lys Gln Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 17 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of 15H2L2 and 15H3L2 <400> 17 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser 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Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250 <210> 38 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu 1 5 10 15 Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp 20 25 30 Ser Gln Ala Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro 35 40 45 Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly 50 55 60 Ala Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn 65 70 75 80 Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn 85 90 95 Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser 100 105 110 Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr 115 120 125 Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His 130 135 140 Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln 165 170 175 Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly 180 185 190 Tyr Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro 195 200 205 Ser Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile Ile Val Ala Val Val Ile 210 215 220 Ala Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr 225 230 235 240 Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala 245 250 255 Ala Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg 260 265 270 Gln Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr 275 280 285 Met Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr 290 295 300 Leu Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn 305 310 315 <210> 39 <211> 310 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Met Gly Ile Leu Ser Phe Leu Pro Val Leu Ala Thr Glu Ser Asp Trp 1 5 10 15 Ala Asp Cys Lys Ser Pro Gln Pro Trp Gly His Met Leu Leu Trp Thr 20 25 30 Ala Val Leu Phe Leu Ala Pro Val Ala Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro 35 40 45 Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu 50 55 60 Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp 65 70 75 80 Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln 85 90 95 Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr 100 105 110 Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val 115 120 125 Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu 130 135 140 Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu 145 150 155 160 Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg 165 170 175 Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly 180 185 190 Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys 195 200 205 Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile 210 215 220 Ile Val Ala Val Val Thr Gly Ile Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala 225 230 235 240 Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Leu Pro 245 250 255 Gly Tyr Pro Glu Cys Arg Glu Met Gly Glu Thr Leu Pro Glu Lys Pro 260 265 270 Ala Asn Pro Thr Asn Pro Asp Glu Ala Asp Lys Val Gly Ala Glu Asn 275 280 285 Thr Ile Thr Tyr Ser Leu Leu Met His Pro Asp Ala Leu Glu Glu Pro 290 295 300 Asp Asp Gln Asn Arg Ile 305 310 <210> 40 <211> 374 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser 20 25 30 Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu 35 40 45 Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln 50 55 60 Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser 65 70 75 80 Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile 85 90 95 Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg 100 105 110 Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys 115 120 125 Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe 130 135 140 Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile 145 150 155 160 Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr 165 170 175 Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro 180 185 190 Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val 195 200 205 Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn 225 230 235 240 Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly 245 250 255 Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg 260 265 270 Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro 275 280 285 Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu 290 295 300 Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys 305 310 315 320 Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys 325 330 335 Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys 340 345 350 Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys 355 360 365 Glu Pro Gln Gly Ala Thr 370

Claims (20)

  1. VH CDR1 영역, VH CDR2 영역 및 VH CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 VL CDR1 영역, VL CDR2 영역 및 VL CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD3에 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역으로서,
    상기 VH CDR1 영역, VH CDR2 영역, VH CDR3 영역, VL CDR1 영역, VL CDR2 영역 및 VL CDR3 영역이 (1) 각각 서열번호 1 (X1=S), 2 (X1=D), 3 (X1=L, X2=Y), 4 (X1=D, X2=S), 5 (X1=Q, X2=R, X3=S) 및 6 (X1=V); (2) 각각 서열번호 1 (X1=T), 2 (X1=I), 3 (X1=L, X2=Y), 4 (X1=Q, X2=N), 5 (X1=K, X2=Q, X3=R) 및 6 (X1=V); (3) 각각 서열번호 1 (X1=T), 2 (X1=D), 3 (X1=I, X2=W), 4 (X1=K, X2=S), 5 (X1=N, X2=L, X3=H) 및 6 (X1= A); 또는 (4) 각각 서열번호 1 (X1=T), 2 (X1=I), 3 (X1=I, X2=Y), 4 (X1=R, X2=N), 5 (X1=R, X2=L, X3=S) 및 6 (X1=V)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 7-14 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 15-21 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 (1) 각각 서열번호 7 및 15; (2) 각각 서열번호 8 및 16; (3) 각각 서열번호 9 및 17; (4) 각각 서열번호 9 및 18; (5) 각각 서열번호 10 및 17; (6) 각각 서열번호 10 및 18; (7) 각각 서열번호 11 및 19; (8) 각각 서열번호 12 및 20; (9) 각각 서열번호 13 및 20; 또는 (10) 각각 서열번호 14 및 21에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역.
  5. 제1항에 있어서,
    중쇄 가변 영역에 연결된, 서열번호 22의 아미노산 서열 (X1=A, X2=A, X3=N, X4=P; X1=A, X2=A, X3=N, X4=G; X1=A, X2=A, X3=A, X4=P; 또는 X1=A, X2=A, X3=A, X4=G)을 가진 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 가변 영역에 연결된, 서열번호 23 또는 32의 아미노산 서열을 가진 경쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역.
  6. 제1항에 있어서,
    (a) 인간 CD3에 결합하거나; (b) 원숭이 CD3에 결합하거나; (c) 유리형 항체 또는 이의 항원-결합 영역으로서 존재하는 경우에는 T 세포를 활성화하지 않거나; 및/또는 (d) 가교 형성 (cross linking)시 T 세포를 활성화하는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역.
  7. i) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 포함하는, CD3에 대한 항원 결합성 도메인, 및
    ii) 질환 관련 항원에 대한 항원 결합성 도메인을 포함하고,
    상기 질환 관련 항원이 종양 관련 항원, 감염성 질환 관련 항원 또는 염증성 질환 관련 항원인, 2중 특이성 항체 (bispecific antibody).
  8. 제7항에 있어서,
    상기 질환 관련 항원이 CD20이고, CD20에 대한 상기 항원 결합성 도메인이 CD20에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 포함하는, 2중 특이성 항체.
  9. 제8항에 있어서,
    CD3에 대한 항원 결합성 도메인 1개와 CD20에 대한 항원 결합성 도메인 2개를 포함하는, 2중 특이성 항체.
  10. 제9항에 있어서,
    i) 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하는, 제1 폴리펩타이드;
    ii) 항-CD20 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제2 폴리펩타이드;
    iii) 항-CD20 중쇄 가변 영역, 항-CD20 경쇄 가변 영역, 항-CD3ε 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하는, 제3 폴리펩타이드; 및
    iv) 항-CD3ε 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제4 폴리펩타이드를 포함하고,
    상기 제1 폴리펩타이드의 항-CD20 중쇄 가변 영역과 제2 폴리펩타이드의 항-CD20 경쇄 가변 영역이 연합 (association)하여 CD20에 대한 항원 결합 단편을 형성하고,
    상기 제3 폴리펩타이드에서 항-CD20 중쇄 가변 영역과 항-CD20 경쇄 가변 영역이 연합하여 CD20에 대한 항원 결합 단편을 형성하고,
    상기 제3 폴리펩타이드의 항-CD3ε 중쇄 가변 영역과 제4 폴리펩타이드의 항-CD3ε 경쇄 가변 영역이 연합하여 CD3ε에 대해 항원 결합 단편을 형성하고,
    상기 제1 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역과 제3 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역이 서로 연합되는, 2중 특이성 항체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 제1 및 제3 폴리펩타이드에 포함된 항-CD20 중쇄 가변 영역이 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 및 제3 폴리펩타이드에 포함된 항-CD20 경쇄 가변 영역이 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는, 2중 특이성 항체.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 제1 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역이 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역이 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는, 2중 특이성 항체.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 제1 폴리펩타이드가 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 제3 폴리펩타이드가 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD20 중쇄 가변 영역, 항-CD20 경쇄 가변 영역, 항-CD3ε 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하거나; 또는
    상기 제1 폴리펩타이드가 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD20 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 제3 폴리펩타이드가 N 말단에서 C 말단 방향으로 항-CD20 경쇄 가변 영역, 항-CD20 중쇄 가변 영역, 항-CD3ε 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하는, 2중 특이성 항체.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 항-CD20 중쇄 가변 영역이 서열번호 28의 링커를 통해 항-CD20 경쇄 가변 영역에 연결되고, 상기 항-CD20 경쇄 가변 영역이 서열번호 28의 링커를 통해 항-CD3ε 중쇄 가변 영역에 연결되는, 2중 특이성 항체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 제3 폴리펩타이드가 서열번호 29 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는, 2중 특이성 항체.
  16. 제10항에 있어서,
    상기 제2 폴리펩타이드가 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 C 말단에서 추가로 포함하고, 상기 제4 폴리펩타이드가 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 C 말단에서 추가로 포함하는, 2중 특이성 항체.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역의 약제학적 유효량 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하거나; 또는
    제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 2중 특이성 항체의 약제학적 유효량 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 약제학적 유효량으로 약제학적 담체와 함께 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체에서 염증성 질환을 치료 또는 완화하는 방법.
  19. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 2중 특이성 항체를 약제학적 유효량으로 약제학적 담체와 함께 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 종양, 감염성 질환 또는 염증성 질환을 치료 또는 완화하는 방법.
  20. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 2중 특이성 항체를 약제학적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체에서 B 세포 관련 질환을 치료 또는 완화하는 방법으로서,
    상기 B 세포 관련 질환이 B-세포 림프종, B-세포 백혈병 또는 B-세포 매개 자가면역 질환인, 방법.
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