JP2024501653A - ヒト及びサルｃｄ３と結合する抗体及びその使用 - Google Patents

Abstract

ヒト及びサルＣＤ３と結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合部分、並びに抗体又はその抗原結合部分の、炎症性疾患の処置及び二重特異性抗体の調製における使用が開示される。抗体又はその抗原結合部分を備える、例えばＣＤ３及びＣＤ２０に対する二重特異性抗体、及び二重特異性抗体の、癌などの疾患の処置における使用もまた提供される。

Description

（関連出願及び参照による組み込み）
本出願は、２０２０年１２月２３日に出願された中国特許出願第２０２０１１５４０８７４．８号の優先権を主張する。

上記の出願、及びそこで引用されたか又はその出願手続き中に引用されたすべての文献（「出願引用文献」）、及び本明細書で引用又は参照されたすべての文献（限定されないが、本明細書で引用されたすべての文献資料、特許、公開特許出願を含む）（「本明細書での引用文献」）、及び本明細書での引用文献で引用又は参照されたすべての文献は、本明細書又は本明細書に参照により組み込まれる任意の文献で言及された任意の製品に関する任意の製造元の指示、説明、製品仕様、及び製品シートと共に、ここで本明細書に参照により組み込まれ、本発明の実施で利用できるものである。より具体的には、参照されたすべての文献は、個々の各文献が参照によって組み込まれるように具体的かつ個別的に示された場合と同程度まで、参照により組み込まれる。本開示で言及された任意のＧｅｎｂａｎｋ配列は、本開示の最も早い有効出願日のＧｅｎｂａｎｋ配列とすることにより、参照により組み込まれる。

本開示は、ヒト及びサルＣＤ３εに結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分、及びこの抗体又はその抗原結合部分の、自己免疫疾患などの炎症性疾患の処置又は軽減、又は移植片拒絶の抑制又は排除における使用に関する。本開示はまた、例えばＣＤ３及びＣＤ２０に対するものである、抗体又はその抗原結合部分を備える二重特異性抗体、及びそのような二重特異性抗体の、癌などの疾患の処置における使用を提供する。

（Ｔ細胞及びＣＤ３）
獲得免疫系には細胞性及び液性という２つの主要な免疫機構がある。細胞性免疫は、骨髄（場合によっては胚外卵黄嚢及び胎児肝臓）に存在する造血幹細胞から作られるＴ細胞によって媒介される。造血幹細胞は、多能性前駆細胞、次いでリンパ球系共通前駆細胞に分化し、胸腺に遊走して成熟する。生存して胸腺を去るリンパ球系共通前駆細胞は、免疫適格性Ｔ細胞となる。

複数の研究は、Ｔ細胞の活性化、増殖及び分化（エフェクター細胞への）が、Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）及びＣＤ２８などのＴ細胞上の共刺激分子の、それぞれ抗原提示細胞上のＭＨＣ／ペプチド複合体及び共刺激分子との同時会合を介して生じることを示している。

Ｔ細胞受容体複合体はＴＣＲ分子及びＣＤ３分子を含む。ＴＣＲ分子は、アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖、又はガンマ（γ）鎖及びデルタ（δ）鎖から成る。各鎖は、抗原ペプチドとの結合を担う細胞外可変領域、細胞膜の近位の細胞外定常領域、及び短い細胞質尾部を含有する。短い細胞質尾部のため、ＴＣＲはシグナル伝達を媒介するのにＣＤ３を必要とする。ＣＤ３分子は、ガンマ（γ）鎖、デルタ（δ）鎖、２つのイプシロン（ε）鎖、及び２つのゼータ（ζ）鎖から構成され、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体において３つの二量体εγ、εδ及びζζを形成する。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖はすべて、免疫グロブリンドメインを有する免疫グロブリンスーパーファミリーのＩ型膜貫通タンパク質であり、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及びＣＤ３ζ鎖の細胞内尾部は、合計で１０の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ：ＩＴＡＭ）を含有し、そのリン酸化は、ＣＤ３鎖がＴ細胞シグナルカスケードにおける重要なキナーゼであるＺＡＰ７０に結合することを可能にする。ＣＤ３ε鎖は、最初のヒト抗ＣＤ３抗体であるムロモナブ－ＣＤ３（又はＯＫＴ３）を含む大半の抗ＣＤ３抗体が結合するエピトープが種間で保存されている（Ｊｏｎｅｓ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５０（１２）：５４２９－５４３５）。
（ＣＤ３標的抗体）

ＣＤ３分子はＴＣＲ構造を安定化させ、シグナル伝達を実行するように機能するため、Ｔ細胞活性化シグナル伝達を調節するＣＤ３に対する多くの抗体が、望ましくない免疫応答を阻止するか又は少なくとも抑制し、これにより炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患を軽減する目的で開発されている。例えば、ＯＫＴ３は移植片拒絶を抑制／排除し、自己免疫疾患を処置／軽減するために承認されている。

抗ＣＤ３抗体は、腫瘍関連抗原などの疾患関連抗原を標的とする機能部分と二重特異性分子を形成し得る。二重特異性分子は、Ｔ細胞を疾患関連抗原に物理的に連結させて、疾患関連細胞周辺のＴ細胞の活性化、及びしたがってＴ細胞によって媒介されるこれらの細胞の死滅をもたらす。例えば、ＣＤ３分子及び腫瘍関連抗原の両方に特異的な二重特異性分子は、Ｔ細胞を腫瘍細胞のより近くに引き寄せることができ、その結果、Ｔ細胞は、２８０より多いタンパク質を含有する超分子攻撃粒子（ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｔｔａｃｋ ｐａｒｔｉｃｌｅ：ＳＭＡＰ）を放出するように活性化される。ＳＭＡＰはグランザイム及びパーフォリンを開口放出し、パーフォリンは、標的細胞の形質膜に小孔を形成し、グランザイムの、標的細胞の細胞質への侵入を媒介する（Ｓ．Ｂａｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２０２０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６８（６４９３）：８９７－９０１）。
（抗ＣＤ３抗体によって誘導される有害反応）

抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞は、腫瘍細胞を死滅させる一方で、細胞の増殖及び分化を促進するＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αなどのサイトカインを分泌する。Ｔ細胞の増殖及び分化は、一方では腫瘍細胞を死滅させるより多くのＴ細胞を生成し、他方では、抗ＣＤ３療法を受けている対象において重度の毒性、すなわちサイトカイン放出症候群（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＣＲＳ）を引き起こす。ＣＲＳの臨床徴候及び症状としては、軽度か又は生命を脅かす、発熱、悪心、頭痛、発疹、頻拍、低血圧、及び呼吸困難が挙げられる。ＣＤ１９及びＣＤ３に対する二重特異性Ｔ細胞誘導抗体であるＢｌｉｎｃｙｔｏ（登録商標）ブリナツモマブの臨床試験において、重度のＣＲＳ及び神経毒性が観察された。具体的には、神経毒性は療法を受けた約５０％の対象において生じた。

二重特異性療法において観察されたそのようなＣＲＳは、ＯＫＴ３などの単一特異性抗ＣＤ３抗体を使用した療法においても生じ、ＣＲＳは、Ｆｃ受容体（Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＦｃＲ）への結合を介した抗体の架橋に関連すると考えられた（Ｈｅｒｏｌｄ ＫＣ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１１（３）：４０９－４１８）。したがって、その後の抗体開発では、テプリズマブなどの抗ＣＤ３抗体のＦｃ領域は、弱いＦｃＲ結合能を有するように操作された。

しかしながら、疾患関連抗原を標的とする機能部分の標的細胞への結合が抗体架橋を起こし、Ｔ細胞による大量のサイトカイン放出を誘導するため、単一特異性抗ＣＤ３抗体のＦｃ領域に対する改変は、二重特異性抗ＣＤ３抗体には適用できない。したがって、高いＣＤ３結合親和性を有するがより少ないサイトカイン放出を引き起こす抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分を見出すことが、二重特異性抗ＣＤ３抗体の開発及び臨床使用において極めて重要である。
（ＣＤ３及びＣＤ２０を標的とする二重特異性抗ＣＤ３抗体）

ＣＤ２０は、悪性及び非悪性の未熟及び成熟Ｂ細胞の表面には発現するが、造血幹細胞、プロＢ細胞又は正常形質細胞には発現しないＢ細胞マーカーである。ＣＤ２０の脱落又は内在化は、抗ＣＤ２０抗体の結合時には観察されない。この点において、ＣＤ２０はＢ細胞リンパ腫及びＢ細胞白血病の診断及び／又は処置において有望な抗原である。

ＣＤ３及びＣＤ２０の両方を標的とする二重特異性抗体は、Ｔ細胞及び悪性Ｂ細胞などのＣＤ２０陽性腫瘍細胞を物理的に連結し、Ｔ細胞活性化、及びＴ細胞媒介性のＣＤ２０陽性Ｂ悪性腫瘍への攻撃を誘導し得る。

しかしながら、上で言及したように、そのような抗体の投与は、重度の毒性を必然的に引き起こし得る。ＣＤ３及びＣＤ２０結合抗体であるモスネツズマブの安全性及び薬物動態を評価する多施設、非盲検、第Ｉ／Ｉｂ相試験（ＮＣＴ０２５００４０７）において、ＣＲＳは、そのような療法を受けた２８．９％の患者に観察された。Ｔ細胞誘導二重特異性抗体であるＣＤ２０－ＴＣＢの、再発又は難治性（ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ：Ｒ／Ｒ）Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ＮＨＬ）の処置における有効性、安全性、耐性及び薬物動態を評価するための、別の多施設、非盲検、第Ｉ／Ｉｂ相試験において、ＣＲＳは６７．９％の患者に生じた。

したがって、強力な抗腫瘍効果を有し、中等度の薬物有害反応を引き起こす二重特異性ＣＤ３及びＣＤ２０結合抗体に対する緊急の必要性が存在する。そのような二重特異性抗体の構築のために、高いＣＤ３親和性を有し、より少ないサイトカイン放出を誘導するＣＤ３抗体又はその抗原結合部分が必要とされ、ＣＤ３抗体及びＣＤ２０抗体を組み合わせる手段が最適化されるべきである。その抗体は、ＣＤ３－ＣＤ２０標的療法に対するより良好な治療濃度域を提供すると予期される。

本出願におけるいかなる文献の引用又は同定も、そのような文献が本発明の従来技術として利用可能であることを承認するものではない。

本開示の発明者らは、ヒト及びサルＣＤ３εと特異的に結合する抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分を見出した。従来技術の抗ＣＤ３抗体と比較した場合、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、より高いわけではないが同等のヒト／サルＣＤ３ε結合能を有し、したがって、炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患の処置において、より良好ではないが同等の有効性を提供する。より重要なことに、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、同等か又はより高いＣＤ３結合能を提供する一方で、Ｔ細胞活性化の抑制を誘導し、より低い重篤度の副作用をもたらす。本開示の抗体又はその抗原結合部分を使用する二重特異性抗体もまた身体に対してより低い毒性を生じる。

いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本開示の発明者らは、本開示の抗体又はその抗原結合部分が結合するＣＤ３εエピトープ、及び／又は抗体－抗原－細胞複合体の配置が、抗体又は抗原結合部分の高いＣＤ３ε結合親和性、及びＴ細胞によるサイトカイン放出の低減に寄与すると考えている。本開示の抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ３ε及びＣＤ２０などの疾患関連抗原に対する二重特異性抗体の一部になる場合、そのような特徴を保持する、すなわち、二重特異性抗体は、標的細胞に対する高い殺傷能を示し、より少ないサイトカイン放出を引き起こす。

したがって、第１の態様において、本開示は、ＣＤ３εに結合し、（ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域、及びＶＨ ＣＤＲ３領域を有することができ、前記ＶＨ ＣＤＲ１領域、前記ＶＨ ＣＤＲ２領域、及び前記ＶＨ ＣＤＲ３領域が、（１）それぞれ、配列番号１（Ｘ１＝Ｓ）、２（Ｘ１＝Ｄ）、及び３（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｙ）；（２）それぞれ、配列番号１（Ｘ１＝Ｔ）、２（Ｘ１＝Ｉ）、及び３（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｙ）；（３）それぞれ、配列番号１（Ｘ１＝Ｔ）、２（Ｘ１＝Ｄ）、及び３（Ｘ１＝Ｉ、Ｘ２＝Ｗ）；又は（４）それぞれ、配列番号１（Ｘ１＝Ｔ）、２（Ｘ１＝Ｉ）、及び３（Ｘ１＝Ｉ、Ｘ２＝Ｙ）と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域、及びＶＬ ＣＤＲ３領域を有することができ、前記ＶＬ ＣＤＲ１領域、前記ＶＬ ＣＤＲ２領域、及び前記ＶＬ ＣＤＲ３領域が、（１）それぞれ、配列番号４（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｓ）、５（Ｘ１＝Ｑ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｓ）、及び６（Ｘ１＝Ｖ）；（２）それぞれ、配列番号４（Ｘ１＝Ｑ、Ｘ２＝Ｎ）、５（Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｑ、Ｘ３＝Ｒ）、及び６（Ｘ１＝Ｖ）；（３）それぞれ、配列番号４（Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｓ）、５（Ｘ１＝Ｎ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｈ）、及び６（Ｘ１＝Ａ）；又は（４）それぞれ、配列番号４（Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ｎ）、５（Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｓ）、及び６（Ｘ１＝Ｖ）と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域を備えることができる単離モノクローナル抗体、例えば、マウス、キメラ、又はヒト化抗体、又はその抗原結合部分を提供する。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域、及びＶＨ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域、及びＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域、及びＶＬ ＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域を備えることができ、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３は、（１）それぞれ、配列番号１（Ｘ１＝Ｓ）、２（Ｘ１＝Ｄ）、３（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｙ）、４（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｓ）、５（Ｘ１＝Ｑ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｓ）、及び６（Ｘ１＝Ｖ）；（２）それぞれ、配列番号１（Ｘ１＝Ｔ）、２（Ｘ１＝Ｉ）、３（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｙ）、４（Ｘ１＝Ｑ、Ｘ２＝Ｎ）、５（Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｑ、Ｘ３＝Ｒ）、及び６（Ｘ１＝Ｖ）；（３）それぞれ、配列番号１（Ｘ１＝Ｔ）、２（Ｘ１＝Ｄ）、３（Ｘ１＝Ｉ、Ｘ２＝Ｗ）、４（Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｓ）、５（Ｘ１＝Ｎ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｈ）、及び６（Ｘ１＝Ａ）；又は（４）それぞれ、配列番号１（Ｘ１＝Ｔ）、２（Ｘ１＝Ｉ）、３（Ｘ１＝Ｉ、Ｘ２＝Ｙ）、４（Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ｎ）、５（Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｓ）、及び６（Ｘ１＝Ｖ）と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

前記重鎖可変領域は、配列番号７～１４のいずれか１つと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。

前記軽鎖可変領域は、配列番号１５～２１のいずれか１つと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を備えることができ、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域は、（１）それぞれ、配列番号７及び１５；（２）それぞれ、配列番号８及び１６；（３）それぞれ、配列番号９及び１７；（４）それぞれ、配列番号９及び１８；（５）それぞれ、配列番号１０及び１７；（６）それぞれ、配列番号１０及び１８；（７）それぞれ、配列番号１１及び１９；（８）それぞれ、配列番号１２及び２０；（９）それぞれ、配列番号１３及び２０；又は（１０）それぞれ、配列番号１４及び２１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域を備えることができる。特定の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、低下した／弱いＦｃＲ結合親和性を有する重鎖定常領域、及び／又は軽鎖定常領域を含有する。特定の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、ＦｃＲ結合親和性を有しない重鎖定常領域、及び／又は軽鎖定常領域を含有する。ＦｃＲ結合親和性が弱いか又は存在しない重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）、例えば配列番号２２（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｎ、Ｘ４＝Ｐ）のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ）、例えば配列番号２２（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｎ、Ｘ４＝Ｇ）のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｐ３２９Ｇ）、例えば配列番号２２（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ａ、Ｘ４＝Ｐ）のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｎ２９７Ａ）、例えば配列番号２２（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ａ、Ｘ４＝Ｇ）のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｎ２９７Ａ＋Ｐ３２９Ｇ）、ヒトＩｇＧ２（Ｖ２３４Ａ＋Ｖ２３７Ａ）、ヒトＩｇＧ１（Ｌ２３４Ａ＋Ｖ２３５Ｅ）重鎖定常領域、又はその機能的断片であり得る。軽鎖定常領域は、κ又はλ軽鎖定常領域、例えば、配列番号２３又は３２のアミノ酸配列を有するヒトκ又はλ軽鎖定常領域、又はその機能的断片であり得る。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、一本鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ：ｓｃＦｖ）抗体、又はＦａｂ又はＦ（ａｂ'）_２断片などの抗体断片であってもよい。

本開示はまた、本開示の抗体又はその抗原結合部分と異なる結合特異性を有する第２の機能部分（例えば、第２の抗体）、例えば、疾患関連抗原に対する第２の機能部分に連結されている、本開示の抗体又はその抗原結合部分を備えることができる二重特異性分子を提供する。

二重特異性分子は、ＣＤ３ε及び疾患関連抗原を標的とすることができる。特定の実施形態において、前記疾患関連抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２２８、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ、ＧＰＣ３、ＣＥＡ、ＣＤ２７６、ｇｐ１００、５Ｔ４、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ－１、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＭＣＳＰ、ＳＭ５－１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ、及びＨＥＲ－２などの腫瘍関連抗原である。特定の実施形態において、前記疾患関連抗原は、ＣＤ４、ＢＨｓＡｇ、ＬＭＰ－１、及びＬＭＰ２などの感染症関連抗原である。特定の実施形態において、前記疾患関連抗原は、ＩＬ１７Ｒ及びＣＤ６などの炎症性疾患関連抗原である。特定の実施形態において、前記疾患関連抗原はＣＤ２０である。

二重特異性分子は、リンカーを介して連結されている２つの抗原結合ドメインを含有する組換えタンパク質であってもよい。特定の実施形態において、２つの結合ドメインは、例えばｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ－Ｆａｂ、又はｓｃＦｖ－Ｆａｂフォーマットにおいて、リンカーを用いて、又は用いずに連結され得る。

本開示の二重特異性分子は、ＣＤ３ε結合ドメイン及びＣＤ２０結合ドメインを含有する、ＣＤ３及びＣＤ２０を標的とする二重特異性抗体であってもよい。

二重特異性抗体は、１つのＣＤ３ε結合ドメイン、及び１～５つのＣＤ２０結合ドメインを含有し得る。一実施形態において、二重特異性抗体は、１つのＣＤ３ε結合ドメイン、及び２つのＣＤ２０結合ドメインを含有し得る。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、ＣＤ２０に特異的な抗体又はその抗原結合部分、例えばＦｖ及び／又はｓｃＦｖである。一実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、本開示の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分、例えばＦｖであり得る。２つのＣＤ２０結合ドメインは、同じか又は異なる抗原エピトープに結合し得る、同じか又は異なるドメイン配列を含有し得る、及び／又は同じか又は異なる抗原結合ドメインフォーマットを有し得る。

一実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、本開示のＣＤＲ領域、重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域を含有し得る。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、１）配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び２）配列番号２７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含有する。

ＣＤ３及びＣＤ２０を標的とする本開示の二重特異性抗体は、ＩｇＧ様抗体であり得る。

一実施形態において、二重特異性抗体は、
ｉ）抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含有する第１のポリペプチド、
ｉｉ）抗ＣＤ２０軽鎖可変領域を含有する第２のポリペプチド、
ｉｉｉ）抗ＣＤ２０重鎖可変領域、抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、抗ＣＤ３ε重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含有する第３のポリペプチド、及び
ｉｖ）抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域を含有する第４のポリペプチド
を備えることができ、
前記第１のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び前記第２のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域は、会合してＣＤ２０に対する抗原結合断片を形成し、前記第３のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域は、会合してＣＤ２０に対する抗原結合断片を形成し、前記第３のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ３ε重鎖可変領域及び前記第４のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域は、会合してＣＤ３εに対する抗原結合断片を形成し、前記第１のポリペプチドにおける前記重鎖定常領域及び前記第３のポリペプチドにおける前記重鎖定常領域は、例えばノブ・イントゥ・ホール法、共有結合、又はジスルフィド結合を介して一緒に会合する。

第１のポリペプチドにおける重鎖定常領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はその機能的断片などの、ノブを有する重鎖定常領域であり得る。第１のポリペプチドにおける重鎖定常領域は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１重鎖定常領域などの、ノブを有し、ＦｃＲ結合親和性が弱いか又は存在しない重鎖定常領域であり得る。第３のポリペプチドにおける重鎖定常領域は、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はその機能的断片などの、ホールを有する重鎖定常領域であり得る。第３のポリペプチドにおける重鎖定常領域は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１重鎖定常領域などの、ホールを有し、ＦｃＲ結合親和性が弱いか又は存在しない重鎖定常領域であり得る。

代替的に、第１のポリペプチドにおける重鎖定常領域は、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はその機能的断片などの、ホールを有する重鎖定常領域であり得る。第１のポリペプチドにおける重鎖定常領域は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１重鎖定常領域などの、ホールを有し、ＦｃＲ結合親和性が弱いか又は存在しない重鎖定常領域であり得る。第３のポリペプチドにおける重鎖定常領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はその機能的断片などの、ノブを有する重鎖定常領域であり得る。第３のポリペプチドにおける重鎖定常領域は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１重鎖定常領域などの、ノブを有し、ＦｃＲ結合親和性が弱いか又は存在しない重鎖定常領域であり得る。

第３のポリペプチドにおける抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び抗ＣＤ２０軽鎖可変領域は、リンカーで連結され得る。一実施形態において、リンカーは、約５～３０アミノ酸残基のペプチドであり得る。一実施形態において、リンカーは、約１０～３０アミノ酸残基のペプチドであり得る。一実施形態において、リンカーは、約１０～１５アミノ酸残基のペプチドであり得る。一実施形態において、リンカーは、例えば配列番号２８のアミノ酸配列を有するＧＳリンカーであり得る。

前記第３のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域又は前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域は、リンカーを介して、前記抗ＣＤ３ε重鎖可変領域に連結され得る。一実施形態において、リンカーは、約５～３０アミノ酸残基のペプチドであり得る。一実施形態において、リンカーは、約１０～３０アミノ酸残基のペプチドであり得る。一実施形態において、リンカーは、約１０～１５アミノ酸残基のペプチドであり得る。一実施形態において、リンカーは、例えば配列番号２８のアミノ酸配列を有するＧＳリンカーであり得る。

一実施形態において、前記第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び前記重鎖定常領域を有する。一実施形態において、前記第３のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域、前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、前記抗ＣＤ３ε重鎖可変領域、及び前記重鎖定常領域を有するか；又は代替的に、前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域、前記抗ＣＤ３ε重鎖可変領域、及び前記重鎖定常領域を有する。第１のポリペプチドにおける重鎖定常領域はノブを有するものであってもよく、第３のポリペプチドにおける重鎖定常領域はホールを有するものであってもよい。

一実施形態において、第３のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗ＣＤ２０重鎖可変領域、リンカー、抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、リンカー、抗ＣＤ３ε重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を有する。前記第３のポリペプチドは配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を含有し得る。

二重特異性抗体は、第４のポリペプチドにおける抗ＣＤ２０軽鎖可変領域のＣ末端に軽鎖定常領域を含有し得る。軽鎖定常領域は、ヒトλ軽鎖定常領域、例えば、配列番号３１のアミノ酸配列を含むものであり得る。

別の実施形態において、二重特異性抗体は、
ｉ）抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含有する第１のポリペプチド、
ｉｉ）抗ＣＤ２０軽鎖可変領域を含有する第２のポリペプチド、
ｉｉｉ）抗ＣＤ３ε重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含有する第３のポリペプチド、及び
ｉｖ）抗ＣＤ２０重鎖可変領域、抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、及び抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域を含有する第４のポリペプチド
を含有することができ、
第１のポリペプチドにおける抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び第２のポリペプチドにおける抗ＣＤ２０軽鎖可変領域は、会合してＣＤ２０に対する抗原結合断片を形成し、第３のポリペプチドにおける抗ＣＤ３ε重鎖可変領域及び第４のポリペプチドにおける抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域は、会合してＣＤ３εに対する抗原結合断片を形成し、第４のポリペプチドにおける抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び抗ＣＤ２０軽鎖可変領域は、会合してＣＤ２０に対する抗原結合断片を形成し、第１のポリペプチドにおける重鎖定常領域及び第３のポリペプチドにおける重鎖定常領域は、例えばノブ・イントゥ・ホール法、共有結合、又はジスルフィド結合を介して一緒に会合する。

一実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び重鎖定常領域を有する。一実施形態において、第３のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗ＣＤ３ε重鎖可変領域及び重鎖定常領域を有する。一実施形態において、第４のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗ＣＤ２０重鎖可変領域、抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、及び抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域；抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、抗ＣＤ２０重鎖可変領域、及び抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域；抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域、抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、及び抗ＣＤ２０重鎖可変領域；又は代替的に、抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域、抗ＣＤ２０重鎖可変領域、及び抗ＣＤ２０軽鎖可変領域を有する。

第１及び第３のポリペプチドにおける重鎖定常領域に関して、一方は、Ｔ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はその機能的断片などの、ノブを有する重鎖定常領域、例えば、ノブを有し、ＦｃＲ結合親和性が弱いか又は存在しない、配列番号３４のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であり、他方は、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はその機能的断片などの、ホールを有する重鎖定常領域、例えば、ホールを有し、ＦｃＲ結合親和性が弱いか又は存在しない、配列番号３３のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である。

第４のポリペプチドにおける抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び抗ＣＤ２０軽鎖可変領域は、リンカーを介して連結され得る。第４のポリペプチドにおける抗ＣＤ２０重鎖可変領域又は抗ＣＤ２０軽鎖可変領域は、リンカーを介して、抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域に連結され得る。一実施形態において、リンカーは、約５～３０アミノ酸残基のペプチドであり得る。一実施形態において、リンカーは、約１０～３０アミノ酸残基のペプチドであり得る。一実施形態において、リンカーは、約１０～１５アミノ酸残基のペプチドであり得る。一実施形態において、リンカーは、例えば配列番号２８のアミノ酸配列を有するＧＳリンカーであり得る。

二重特異性抗体は、第４のポリペプチドのＣ末端に軽鎖定常領域を含有し得る。例えば、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域、抗ＣＤ２０重鎖可変領域、又は抗ＣＤ２０軽鎖可変領域のＣ末端に軽鎖定常領域を含有し得る。一実施形態において、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域のＣ末端に軽鎖定常領域を含有し、これはヒトλ軽鎖定常領域、例えば、配列番号３２又は２３のアミノ酸配列を含むものであり得る。

ＣＤ３及びＣＤ２０を標的とする本開示の二重特異性抗体は、ＣＤ２０－ＴＣＢなどの従来技術の抗体と比較して、より高いＣＤ３結合活性及び同等の標的細胞殺傷活性を有するが、より低いレベルのサイトカイン放出を引き起こす。

本開示の抗体又はその抗原結合部分又は二重特異性分子をエンコードする核酸分子、並びにそのような核酸を有し得る発現ベクター及びそのような発現ベクターを備え得る宿主細胞もまた、本開示によって包含される。宿主細胞を使用して、本開示の抗ＣＤ３抗体（二重特異性抗体を含む）又はその抗原結合部分を調製するための方法もまた提供され、これは、（ｉ）抗体又はその抗原結合部分を宿主細胞において発現させる段階、及び（ｉｉ）抗体又はその抗原結合部分を宿主細胞又はその細胞培養物から単離する段階を備え得る。

本開示の抗体又はその抗原結合部分、二重特異性分子、核酸分子、発現ベクター、又は宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を備え得る医薬組成物もまた提供される。

第２の態様において、本開示は、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分の、ＣＤ３及び疾患関連抗原の両方を標的とする二重特異性分子の調製における使用を提供する。

疾患関連抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２２８、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ、ＧＰＣ３、ＣＥＡ、ＣＤ２７６、ｇｐ１００、５Ｔ４、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ－１、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＭＣＳＰ、ＳＭ５－１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ、及びＨＥＲ－２などの腫瘍関連抗原であり得る。疾患関連抗原は、ＣＤ４、ＢＨｓＡｇ、ＬＭＰ－１、及びＬＭＰ２などの感染症関連抗原であり得る。疾患関連抗原は、ＩＬ１７Ｒ及びＣＤ６などの炎症性疾患関連抗原であり得る。特定の実施形態において、疾患関連抗原はＣＤ２０である。

二重特異性分子は、リンカーを介して連結されている２つの抗原結合ドメインを含有する組換えタンパク質であってもよい。特定の実施形態において、２つの結合ドメインは、例えばｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ－Ｆａｂ、又はｓｃＦｖ－Ｆａｂフォーマットにおいて、リンカーを用いて、又は用いずに連結され得る。特定の実施形態において、二重特異性分子は、ＩｇＧ様抗体である。一実施形態において、二重特異性抗体は、１つのＣＤ３ε結合ドメイン、及び２つのＣＤ２０結合ドメインを含有する。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、ＣＤ２０に特異的な抗体又はその抗原結合部分、例えばＦｖ及び／又はｓｃＦｖである。一実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、本開示の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分、例えばＦｖであり得る。

したがって、本開示は、本開示の二重特異性分子を調製するための方法であって、（ｉ）二重特異性分子を、二重特異性分子又はその機能部分をエンコードする核酸を含有する宿主細胞において発現させる段階、及び（ｉｉ）二重特異性分子又はその機能部分を宿主細胞又はその細胞培養物から単離する段階を備える、方法を提供する。

第３の態様において、本開示は、炎症性疾患の処置又は軽減、又は移植片拒絶の抑制又は排除を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、薬学的有効量の、本開示の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分を投与する段階を備える、方法を提供する。特定の実施形態において、炎症性疾患は、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）又は炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ：ＩＢＤ、例えばクローン病）である。特定の実施形態において、自己免疫疾患はＩ型糖尿病である。特定の実施形態において、本開示の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分は経口投与される。

第４の態様において、本開示は、疾患の処置又は軽減を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、薬学的有効量の、本開示の二重特異性分子を投与する段階を備える、方法を提供する。特定の実施形態において、前記疾患は腫瘍である。特定の実施形態において、前記疾患は感染症である。特定の実施形態において、前記疾患は炎症性疾患又は自己免疫疾患である。

本開示は、Ｂ細胞関連疾患の処置又は軽減を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、薬学的有効量の、ＣＤ３又はＣＤ２０に対する本開示の二重特異性抗体を投与する段階を備える、方法を提供する。前記Ｂ細胞関連疾患は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、又はＢ細胞介在性自己免疫疾患であり得る。Ｂ細胞リンパ腫及びＢ細胞白血病としては、これらに限定されないが、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＬＬ）、及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ＤＬＢＣＬ）が挙げられる。特定の実施形態において、対象は、二重特異性抗体処置の前に抗ＣＤ２０抗体を投与される。

本開示の他の特徴及び利点は、限定するものとして解釈されるべきでない以下の詳細な説明及び例から明らかとなるだろう。本出願全体において引用されるすべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋエントリ、特許及び公開特許出願の内容は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。

したがって、本発明の目的は、出願人らが権利を留保するような任意の従来公知の製品、製品を製造するプロセス、又は製品を使用する方法を本発明に包含しないことであり、これにより、任意の従来公知の製品、プロセス、又は方法の免責事項を開示する。本発明は、出願人らが権利を留保するような、ＵＳＰＴＯ（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２、第１段落）又はＥＰＯ（ＥＰＣ第８３条）の記載要件及び実施可能要件を満たさない任意の製品、プロセス、又は製品の製造、又は製品を使用する方法を本発明の範囲に包含することを意図するものではないということが更に留意され、これにより、任意の過去に記載した製品、製品を製造するプロセス、又は製品を使用する方法の免責事項を開示する。ＥＰＣ第５３条（ｃ）、及びＥＰＣ規則２８（ｂ）及び（ｃ）に適合していることは、本発明の実施において有利であり得る。本出願の系統における、又は任意の他の系統における、又は任意の第三者の任意の先行出願における出願人の任意の許諾特許の対象である任意の実施形態を明示的に否認するすべての権利は、明示的に留保される。本明細書のいかなる内容も、約束と解釈されるべきではない。

本開示、特に特許請求の範囲及び／又は段落において、用語、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれに帰属する意味を有することができ；例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができ；「から本質的に成ること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰属する意味を有し、例えば、それらは、明示的に記載されていない要素を許容するが、従来技術に見出されるか又は本発明の基本又は新規の特徴に影響を及ぼす要素を除外することに留意されたい。

例として与えられるが、本発明を記載される具体的な実施形態のみに限定することを意図したものではない以下の詳細な説明は、添付図面と併せて最もよく理解され得る。

キメラ抗ＣＤ３抗体ＣＤ３－１９のヒトＣＤ３ε（Ａ）及びサルＣＤ３ε（Ｂ）に対する結合活性を示す。

ＣＤ３－１９のヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞に対する結合活性を示す。

親和性成熟抗体のヒトＣＤ３ε（Ａ）及びサルＣＤ３ε（Ｂ）に対する結合活性を示す。

親和性成熟抗体のヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞に対する結合活性を示す。

二次抗体（抗体架橋を可能にする）に結合した（Ａ）又はしなかった（Ｂ）場合における、ＣＤ３－１９及び親和性成熟抗体のＴ細胞増殖に対する効果を示す。

ヒト化１９－２６抗体のヒトＣＤ３ε（Ａ）及びサルＣＤ３ε（Ｂ）に対する結合活性、及びヒト化１９－１５抗体のヒトＣＤ３ε（Ｃ）及びサルＣＤ３ε（Ｄ）に対する結合活性を示す。

ヒト化１９－２６抗体（Ａ）及びヒト化１９－１５抗体（Ｂ）のヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞に対する結合活性を示す。

インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）放出（Ａ）及びＣＤ６９発現（Ｂ）によって測定される、二次抗体（抗体架橋を可能にする）に結合した場合のヒト化抗体の、Ｔ細胞を活性化する能力を示す。

ＩＦＮ－γ放出（Ａ）及びＣＤ６９発現（Ｂ）によって測定される、二次抗体に結合しなかった場合のヒト化抗体の、Ｔ細胞を活性化する能力を示す。

変異したＦｃ領域を有するヒト化抗体の、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ１６Ａ（Ａ）、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ６４（Ｂ）、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ３２Ａ（Ｃ）、及びＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ３２Ｂ（Ｄ）に対する結合活性を示す。

変異したＦｃ領域を有するヒト化抗体のＪｕｒｋａｔ細胞に対する結合活性を示す。

二次抗体に結合しなかった場合の変異したＦｃ領域を有するヒト化抗体の、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ－γ放出（Ａ）、ＣＤ２５発現（Ｂ）、ＣＤ６９発現（Ｃ）、及びＣＤ６９＋ＣＤ２５共発現（Ｄ）を誘導する能力を示す。

二次抗体（抗体架橋を可能にする）に結合した場合の変異したＦｃ領域を有するヒト化抗体の、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ－γ放出（Ａ）、ＣＤ２５発現（Ｂ）、ＣＤ６９発現（Ｃ）、及びＣＤ６９＋ＣＤ２５共発現（Ｄ）を誘導する能力を示す。

ＣＤ３及びＣＤ２０に対する本開示の二重特異性抗体の構造を示す概略図である。

二重特異性抗体のヒトＣＤ３ε（Ａ）及びサルＣＤ３ε（Ｂ）に対する結合活性を示す。

二重特異性抗体のＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ２０（Ａ）、ＨＥＫ２９３Ａ／サルＣＤ２０（Ｂ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｃ）、及びサルＰＢＭＣ（Ｄ）に対する結合活性を示す。

二次抗体に結合しなかった場合の二重特異性抗体の、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ－γ放出（Ａ）、腫瘍壊死因子－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α：ＴＮＦ－α）放出（Ｂ）、ＣＤ６９発現（Ｃ）、ＣＤ２５発現（Ｄ）、及びＣＤ６９＋ＣＤ２５共発現（Ｅ）を誘導する能力を示す。

二重特異性抗体により媒介される、ヒトＰＢＭＣによるＣＤ２０^＋Ｒａｊｉ細胞の死滅を示す。

二重特異性抗体の、ＣＤ２０^＋Ｒａｊｉ細胞とインキュベートした場合のＰＭＢＣによるＴＮＦ－α放出（Ａ）、ＩＦＮ－γ放出（Ｂ）、及びインターロイキン－２（ＩＬ－２）放出（Ｃ）を誘導する能力を示す。

二重特異性抗体により媒介される、ヒトＴ細胞によるＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ２０細胞（Ａ）及びＣＤ２０^－ＨＥＫ２９３Ａ細胞（Ｂ）の死滅を示す。

二重特異性抗体の、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ２０細胞とインキュベートした場合のＴ細胞によるＩＦＮ－γ放出（Ａ）及びＴＮＦ－α放出（Ｃ）を誘導する、及びＣＤ２０^－ＨＥＫ２９３Ａ細胞とインキュベートした場合のＴ細胞によるＩＦＮ－γ放出（Ｂ）及びＴＮＦ－α放出（Ｄ）を誘導する能力を示す。

１μｇ／ｍｌのＭＩＬ６２を伴って、又は伴わずに投与した場合の二重特異性抗体の、１μｇ／ｍｌのＭＩＬ６２で前処理したか又はしていないヒトＰＢＭＣによるＩＬ－２放出（Ａ）、ＴＮＦ－α放出（Ｂ）、ＣＤ２５発現（Ｃ）、ＣＤ６９発現（Ｄ）、及びＣＤ６９＋ＣＤ２５共発現（Ｅ）に対する効果を示す。

１μｇ／ｍｌのＭＩＬ６２と同時投与されたか又はされなかったＭＢＳ３０３－１（Ａ）及びＭＢＳ３０３－２（Ｂ）によって媒介された、Ｔ細胞によるＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ２０細胞の死滅を示す。

二重特異性抗体の、ヒト化ＰＢＭＣを有する担腫瘍マウスに対するｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を示す。（Ａ）ＭＢＳ３０３－２又はビヒクル投与の３、１０、及び１７日後の腫瘍細胞の平均蛍光強度。 二重特異性抗体の、ヒト化ＰＢＭＣを有する担腫瘍マウスに対するｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を示す。（Ｂ）薬物投与後１０日目及び１７日目の腫瘍画像。 二重特異性抗体の、ヒト化ＰＢＭＣを有する担腫瘍マウスに対するｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を示す。（Ｃ）担腫瘍マウスの生存曲線。

本開示がより容易に理解され得ることを保証するために、最初に特定の用語を定義する。追加の定義は、詳細な説明全体を通して記載される。

「ＣＤ３」という用語は、γ、δ、ε、及びζ鎖を含む分化抗原群３を指す。「ＣＤ３ε」という用語はε鎖を指す。「ＣＤ３」という用語は、バリアント、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ、及びパラログを含み得る。例えば、ヒトＣＤ３タンパク質（例えばＣＤ３ε）に特異的な抗体は、場合により、サルなどのヒト以外の種由来のＣＤ３タンパク質と交差反応し得る。他の実施形態において、ヒトＣＤ３タンパク質に特異的な抗体は、ヒトＣＤ３タンパク質に完全に特異的で、他の種に対する又は他の種類の交差反応性を示さなくてもよく、又は、すべての他の種ではないが特定の他の種由来のＣＤ３と交差反応してもよい。

「ヒトＣＤ３ε」という用語は、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＰ＿０００７２４．１を有するアミノ酸配列（Ｗｉｐａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０２０）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５９（３）：２９８－３０８）又は配列番号２４に記載のヌクレオチド配列によってエンコードされたアミノ酸配列などのヒト由来のアミノ酸配列を有するＣＤ３εタンパク質を指す。「サルＣＤ３ε」という用語は、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＰ＿００１２４４１４９．１を有するアミノ酸配列（Ｍａｕｄｈｏｏ ＭＤ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｇｉｇａｓｃｉｅｎｃｅ ３：１４）などのサル由来のアミノ酸配列を有するＣＤ３εタンパク質を指す。

「ＣＤ２０」という用語は、プロＢ期から出発し、成熟期まで濃度を徐々に増加するすべてのＢ細胞の表面に発現し、造血幹細胞、プロＢ細胞、又は正常形質細胞には発現しないマーカー分子を指す。「ヒトＣＤ２０」という用語は、配列番号３５のアミノ酸配列などのヒト由来のアミノ酸配列を有するＣＤ２０タンパク質を指す。「サルＣＤ２０」又は「カニクイザルＣＤ２０」という用語は、配列番号３６のアミノ酸配列などのサル由来のアミノ酸配列を有するＣＤ２０タンパク質を指す。

本明細書で言及される「抗体」という用語には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭ全抗体、及びその任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）又は一本鎖が含まれる。全抗体とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｈと略記される）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわち、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｌと略記される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインＣ_Ｌで構成される。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存的な領域の間に挿入されている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に細分化することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

本明細書において使用される場合、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えばＣＤ３タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１又は複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって発揮され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ及びＣ_Ｈ１ドメインから成る一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ'）_２断片；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ及びＣ_Ｈ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインから成るＦｖ断片、（ｖ）Ｖ_Ｈドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；及び（ｖｉｉｉ）単一の可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域であるナノボディが挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶ_Ｌ及びＶ_Ｈは、別個の遺伝子によってコードされるが、これらは、組換え法を使用して、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）としてこれらを作ることを可能にする合成リンカーによって結合することができる（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。そのような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して取得され、断片は、完全な抗体と同じ方式で、有用性に関してスクリーニングされる。

「ＦｃＲ」又は「Ｆｃ受容体」という用語は、細胞又は病原体に結合する抗体のＦｃ断片を認識し、貪食又は細胞傷害性細胞を刺激して、病原体又は標的細胞を、例えば抗体媒介性貪食又は抗体依存性細胞傷害によって破壊する、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、及びマクロファージなどの特定の免疫細胞の表面に発現するタンパク質を指す。ＦｃＲとしては、ＦｃαＲ、ＦｃεＲ、及びＦｃγＲが挙げられ、ＦｃγＲは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、微生物の貪食を誘導するのに最も重要なＦｃ受容体であり、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、及びＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）を含む。

本明細書において使用される場合、「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＣＤ３タンパク質と特異的に結合する単離抗体は、ＣＤ３タンパク質以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＣＤ３タンパク質と特異的に結合する単離抗体は、他の種由来のＣＤ３タンパク質などの他の抗原に対する交差反応性を有してもよい。更に、単離抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まないことがあり得る。

本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団を指す、すなわち、集団を構成する個別の抗体は、少量存在し得る、天然に存在し得る変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除き、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対する指向性を有する。異なる決定基（エピトープ）に対する指向性を有する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対する指向性を有する。

本明細書において使用される場合、「二重特異性」分子は、２つの標的分子、又は同じ標的分子における２つの異なるエピトープと特異的に結合する。本開示の二重特異性抗体は、ＣＤ３及び疾患関連抗原と特異的に結合し、二重特異性分子の一種である。対照的に、「単一特異性」分子は、特定の標的分子、特に標的分子における特定のエピトープと特異的に結合する。

本明細書において使用される場合、「マウス抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がマウス生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。更に、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまたマウス生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のマウス抗体は、マウス生殖系列免疫グロブリン配列によってエンコードされていないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏのランダム又は部位特異的変異誘発、又は、ｉｎ ｖｉｖｏの体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される場合、「マウス抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がマウスフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図していない。

「キメラ抗体」という用語は、非ヒト供給源からの遺伝物質をヒト由来の遺伝物質と組み合わせることによって作られる抗体を指す。又はより一般的には、キメラ抗体とは、特定の種由来の遺伝物質を別の種由来の遺伝物質と共に有する抗体のことである。

本明細書において使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒトにおいて天然に産生される抗体バリアントとの類似性を増加させるようにタンパク質配列が改変された、非ヒト種由来の抗体を指す。

「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と交換可能に使用される。

本明細書において使用される場合、「ヒトＣＤ３に特異的に結合する」抗体とは、ヒトＣＤ３タンパク質（及び、場合によっては、１又は複数の非ヒト種由来のＣＤ３タンパク質）に結合するが、非ＣＤ３タンパク質には実質的に結合しない抗体を指すことが意図される。好ましくは、抗体は、「高親和性」で、すなわち、１．０×１０^－８Ｍ又はそれ未満、より好ましくは５．０×１０^－９Ｍ又はそれ未満、より好ましくは１．０×１０^－９Ｍ又はそれ未満のＫ_ＤでヒトＣＤ３タンパク質に結合する。

本明細書において使用される場合、タンパク質又は細胞に「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質又は細胞に結合しないか、又は高親和性で結合しない、すなわち、１．０×１０^－６Ｍ又はそれよりも大きい、より好ましくは１．０×１０^－５Ｍ又はそれよりも大きい、より好ましくは１．０×１０^－４Ｍ又はそれよりも大きい、より好ましくは１．０×１０^－３Ｍ又はそれよりも大きい、更により好ましくは１．０×１０^－２Ｍ又はそれよりも大きいＫ_Ｄでタンパク質又は細胞に結合することを意味する。

ＩｇＧ抗体に対する「高親和性」という用語は、標的抗原に対して、１．０×１０^－６Ｍ又はそれ未満、より好ましくは５．０×１０^－８Ｍ又はそれ未満、更により好ましくは１．０×１０^－８Ｍ又はそれ未満、更により好ましくは１．０×１０^－９Ｍ又はそれ未満、更により好ましくは５．０×１０^－１０Ｍ又はそれ未満のＫ_Ｄを有する抗体を指す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変動し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、抗体が１０^－６Ｍ又はそれ未満、より好ましくは１０^－７Ｍ又はそれ未満、更により好ましくは１０^－８Ｍ又はそれ未満のＫ_Ｄを有することを指す。

本明細書において使用される場合、「Ｋ_{ａｓｓｏｃ}」又は「Ｋ_ａ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すことが意図され、本明細書において使用される場合、「Ｋ_ｄｉｓ」又は「Ｋ_ｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことが意図される。本明細書において使用される場合、「Ｋ_Ｄ」という用語は、Ｋ_ｄのＫ_ａに対する比（すなわち、Ｋ_ｄ／Ｋ_ａ）から取得され、モル濃度（Ｍ）で表される解離定数を指すことが意図される。抗体のＫ_Ｄ値は、本技術分野において十分に確立された方法を使用して決定され得る。抗体のＫ_Ｄを決定するための好ましい方法は、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを使用した表面プラズモン共鳴を使用することによるものである。

最大半量有効濃度としても公知の「ＥＣ_５０」という用語は、ベースライン及び指定された曝露時間後の最大値の間の中間の応答を誘導する抗体の濃度を指す。

最大半量阻害濃度としても公知の「ＩＣ_５０」という用語は、特定の生物学的又は生化学的機能を抗体の非存在時と比べて５０％阻害する抗体の濃度を指す。

「架橋」又は「架橋すること」という用語は、免疫細胞のＦｃＲへの抗体のＦｃ領域の結合を介した、又は標的細胞の疾患関連抗原への抗体の結合（例えば、抗原を標的とする二重特異性分子における部分による）を介した、抗体の凝集を指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では、抗体架橋は、抗体が例えばＥＬＩＳＡプレートに結合した二次抗体に結合する場合に生じる。本開示の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分は、抗体架橋が生じる場合、Ｔ細胞を活性化することができる。対照的に、互いに又は他の分子と相互作用して抗体二量体又はポリマーを形成することがない本開示の「遊離」抗体又はその抗原結合部分は、Ｔ細胞を活性化することができない。

「対象」という用語には、あらゆるヒト又は非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」という用語には、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類などの哺乳動物及び非哺乳動物が含まれるが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、及びウマなどの哺乳動物が好ましい。

「治療有効量」という用語は、疾患又は状態に関連する症状（例えば慢性炎症）を予防又は改善するのに、及び／又は疾患又は状態の重症度を軽減するのに十分な、本開示の抗体又は抗原結合部分の量を意味する。治療有効量は、処置されている状態の状況に沿うものと理解され、実際の有効量は、当業者によって容易に認識される。

本開示の様々な態様は、以下のサブセクションで更に詳細に説明される。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、従来技術の抗ＣＤ３抗体と比較してより高いわけではないが同等の結合能でヒト及びサルＣＤ３に特異的に結合する。

本開示の「遊離」抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ３と結合することはできるがＴ細胞を活性化せず、抗体架橋が生じる場合に、本開示の抗体又はその抗原結合部分はＣＤ３と結合してＴ細胞を活性化することができる。

したがって、ＦｃＲ結合親和性が弱いか又は存在しない、調製された本開示の抗体又はその抗原結合部分は体内で「遊離」又は実質的に「遊離」している可能性があり、寛容を誘導することによって炎症性疾患及び自己免疫疾患を処置するために使用することができる。

別の態様において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ３及び別の標的、例えば腫瘍関連抗原、又は例えば感染症又は炎症性疾患に関連する抗原に対する非ＦｃＲ結合二重特異性抗体の一部として調製されてもよく、これは、ＣＤ３以外の標的への結合を介して架橋した場合、Ｔ細胞を活性化し、例えばＳＭＡＰを放出することによって標的細胞を死滅させる。例えば、抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ３及び腫瘍関連抗原に対する二重特異性非ＦｃＲ結合抗体の一部として調製されてもよく、その架橋は、それが病変部位における腫瘍関連抗原に結合する場合にのみ生じる。二重特異性抗体は、抗体架橋が生じる場合、Ｔ細胞を活性化して腫瘍細胞を死滅させる。より重要なことに、従来技術の抗ＣＤ３抗体と比較して、本開示の二重特異性抗体は、架橋した場合、より少ないサイトカイン放出を引き起こし、毒性の低下をもたらす。

本開示の例示的な抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分は、以下に及び以下の実施例に記載されるように構造的及び化学的に特徴付けられる。重鎖可変領域ＣＤＲ及び軽鎖可変領域ＣＤＲは、配列番号が以下の表１に記載されているＫａｂａｔ番号付けシステムによって定義されている。しかしながら、本技術分野で周知であるように、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づくＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ、及びＩＭＧＴ、ＡｂＭ、又はＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステム／方法などの他のシステムによって決定することもできる。重鎖／軽鎖可変領域の配列番号もまた表１に記載されており、一部の抗体は同じＶＨ及び／又はＶＬを共有する。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、例えば弱いＦｃＲ結合親和性を有するか又はＦｃＲ結合親和性を有しない重鎖定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）、例えば配列番号２２（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｎ、Ｘ４＝Ｐ）のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ）、例えば配列番号２２（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｎ、Ｘ４＝Ｇ）のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｐ３２９Ｇ）、例えば配列番号２２（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ａ、Ｘ４＝Ｐ）のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｎ２９７Ａ）、例えば配列番号２２（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ａ、Ｘ４＝Ｇ）のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｎ２９７Ａ＋Ｐ３２９Ｇ）、ヒトＩｇＧ２（Ｖ２３４Ａ＋Ｖ２３７Ａ）、ヒトＩｇＧ１（Ｌ２３４Ａ＋Ｖ２３５Ｅ）重鎖定常領域、又はその機能的断片を含有し得る。軽鎖定常領域は、κ又はλ軽鎖定常領域、例えば、配列番号２３又は３２のアミノ酸配列を有するヒトκ又はλ軽鎖定常領域であり得る。

本開示は、少なくとも１つの他の機能分子、例えば別のペプチド又はタンパク質（例えば、別の抗体又は受容体に対するリガンド）に連結して少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成する、本開示の１又は複数の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分を備える二重特異性分子に関する。したがって、本明細書において使用される場合、「二重特異性分子」には、３つ又はそれよりも多い結合特異性を有する分子が含まれる。

二重特異性分子は、ＣＤ３結合特異性に加えて、疾患関連抗原、好ましくは病変細胞に固有に発現するか、又は代替的に病変細胞には高いレベルだが正常な対応物には低いレベルで発現する疾患関連抗原に対する第２の特異性を有する。

特定の実施形態において、疾患関連抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２２８、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ、ＧＰＣ３、ＣＥＡ、ＣＤ２７６、ｇｐ１００、５Ｔ４、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ－１、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＭＣＳＰ、ＳＭ５－１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ、及びＨＥＲ－２などの腫瘍関連抗原である。

特定の実施形態において、疾患関連抗原は、病原体又は感染細胞のマーカータンパク質などの感染症関連抗原である。感染症関連抗原は、ＣＤ４、ＢＨｓＡｇ、ＬＭＰ－１、及びＬＭＰ２であり得、ＣＤ４は標的ＡＩＤＳ処置の標的である。

特定の実施形態において、疾患関連抗原は、ＩＬ１７Ｒ及びＣＤ６を含むがこれらに限定されない、炎症を引き起こす活性免疫細胞に発現するマーカータンパク質などの炎症性疾患関連抗原である。

二重特異性分子には多くの異なるフォーマット及びサイズがあり得る。サイズの範囲の一端では、二重特異性分子は、同一の特異性の２つの結合アームを有する代わりに、それぞれが異なる特異性を有する２つの結合アームを有することを除いて、従来の抗体フォーマットを保持する。他端には、ペプチド鎖によって連結された２つの一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）から成る二重特異性分子、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）２構築物がある。中間サイズの二重特異性分子には、ペプチジルリンカーによって連結された２つの異なるＦ（ａｂ）断片が含まれる。これらの及び他のフォーマットの二重特異性分子は、遺伝子操作、体細胞ハイブリダイゼーション、又は化学的方法によって調製することができる。例えば、前掲のＫｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ；Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｕｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（６），６３５－６４４（１９９８）；及びｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，２１（８），３９１－３９７（２０００）、及びそこに引用された参考文献を参照されたい。

本開示の二重特異性分子はＴ細胞を標的細胞のより近くに引き寄せる。二重特異性分子が疾患関連抗原に結合する場合、二重特異性分子に架橋が生じ、Ｔ細胞は活性化されて、それに応じて標的細胞を死滅させることができる。

特定の実施形態において、疾患関連抗原は、未熟及び成熟Ｂ細胞には存在するが、造血幹細胞、プロＢ細胞又は正常形質細胞には存在しないマーカーであるＣＤ２０であり、これは、Ｂ細胞リンパ腫及びＢ細胞白血病の診断及び／又は処置において有望な抗原である。

本開示の二重特異性抗体は、１つのＣＤ３ε結合ドメイン、及び１～５つのＣＤ２０結合ドメインを含有し得る。一実施形態において、二重特異性抗体は、１つのＣＤ３ε結合ドメイン及び２つのＣＤ２０結合ドメインを含有し得る。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、ＣＤ２０に特異的な抗体又はその抗原結合部分、例えばＦｖ及び／又はｓｃＦｖである。一実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、本開示の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分、例えばＦｖであり得る。２つのＣＤ２０結合ドメインは、同じか又は異なる抗原エピトープに結合し得る、同じか又は異なる抗原結合ドメイン配列を含有し得る、及び／又は同じか又は異なる抗原結合ドメインフォーマットを有する。

一実施形態において、二重特異性抗体は、ＣＤ３と特異的に結合する１つのＦｖ、ＣＤ２０と特異的に結合する１つのＦｖ、及びＣＤ２０と特異的に結合する１つのｓｃＦｖを含有する。一実施形態において、ＣＤ２０と結合するＦｖ及びｓｃＦｖは同じ重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する。

ＣＤ３及びＣＤ２０に対する二重特異性抗体は、ＩｇＧ様抗体であり得る。一実施形態において、二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的な半ＩｇＧ、ＣＤ２０に特異的な半ＩｇＧ、及び抗ＣＤ３半ＩｇＧの重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のＮ末端に連結されているＣＤ２０に対するｓｃＦｖを含有する。

一実施形態において、二重特異性抗体は、
ｉ）抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含有する第１のポリペプチド、
ｉｉ）抗ＣＤ２０軽鎖可変領域を含有する第２のポリペプチド、
ｉｉｉ）抗ＣＤ２０重鎖可変領域、抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、抗ＣＤ３ε重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含有する第３のポリペプチド、及び
ｉｖ）抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域を含有する第４のポリペプチド
を含有することができ、
前記第１のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び前記第２のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域は、会合してＣＤ２０に対する抗原結合断片を形成し、前記第３のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域は、会合してＣＤ２０に対する抗原結合断片を形成し、前記第３のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ３ε重鎖可変領域及び前記第４のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域は、会合してＣＤ３εに対する抗原結合断片を形成し、前記第１のポリペプチドにおける前記重鎖定常領域及び前記第３のポリペプチドにおける前記重鎖定常領域は、例えばノブ・イントゥ・ホール法、共有結合、又はジスルフィド結合を介して一緒に会合する。

一実施形態において、前記第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び前記重鎖定常領域を有する。一実施形態において、前記第３のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域、前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、前記抗ＣＤ３ε重鎖可変領域、及び前記重鎖定常領域を有するか；又は代替的に、前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域、前記抗ＣＤ３ε重鎖可変領域、及び前記重鎖定常領域を有する。一実施形態において、第１のポリペプチドにおける重鎖定常領域はノブを有するものであり、第３のポリペプチドにおける重鎖定常領域はホールを有するものである。

別の実施形態において、二重特異性抗体は、
ｉ）抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含有する第１のポリペプチド、
ｉｉ）抗ＣＤ２０軽鎖可変領域を含有する第２のポリペプチド、
ｉｉｉ）抗ＣＤ３ε重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含有する第３のポリペプチド、及び
ｉｖ）抗ＣＤ２０重鎖可変領域、抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、及び抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域を含有する第４のポリペプチド
を含有することができ、
第１のポリペプチドにおける抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び第２のポリペプチドにおける抗ＣＤ２０軽鎖可変領域は、会合してＣＤ２０に対する抗原結合断片を形成し、第３のポリペプチドにおける抗ＣＤ３ε重鎖可変領域及び第４のポリペプチドにおける抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域は、会合してＣＤ３εに対する抗原結合断片を形成し、第４のポリペプチドにおける抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び抗ＣＤ２０軽鎖可変領域は、会合してＣＤ２０に対する抗原結合断片を形成し、第１のポリペプチドにおける重鎖定常領域及び第３のポリペプチドにおける重鎖定常領域は、例えばノブ・イントゥ・ホール法、共有結合、又はジスルフィド結合を介して一緒に会合する。

一実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び重鎖定常領域を有する。一実施形態において、第３のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗ＣＤ３ε重鎖可変領域及び重鎖定常領域を有する。一実施形態において、第４のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗ＣＤ２０重鎖可変領域、抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、及び抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域；抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、抗ＣＤ２０重鎖可変領域、及び抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域；抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域、抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、及び抗ＣＤ２０重鎖可変領域；又は代替的に、抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域、抗ＣＤ２０重鎖可変領域、及び抗ＣＤ２０軽鎖可変領域を有する。

二重特異性抗体において、抗ＣＤ２０重鎖可変領域は、リンカーを介して抗ＣＤ２０軽鎖可変領域に連結されて、ｓｃＦｖを形成することができる。抗ＣＤ２０重鎖可変領域又は抗ＣＤ２０軽鎖可変領域は、リンカーを介して抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分に連結され得る。

リンカーは、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸、好ましくはペプチド結合によって一緒に連結された５～３０アミノ酸から作ることができ、アミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸から選択される。当業者であれば理解できるように、これらのアミノ酸のうちの１又は複数は、グリコシル化され得る。一実施形態において、５～３０アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、セリン、及びリシンから選択され得る。一実施形態において、リンカーの大部分は、グリシン及びアラニンなどの、立体障害のないアミノ酸から作られる。例示的なリンカーはポリグリシン、特にｐｏｌｙ（Ｇｌｙ－Ａｌａ）、及びポリアラニンである。本開示における例示的なリンカーの１つは配列番号２８のアミノ酸配列を有するものである。

リンカーはまた、非ペプチドリンカーであってもよい。例えば、－ＮＨ－、－（ＣＨ_２）ｓ－Ｃ（Ｏ）－などのアルキルリンカー（ｓ＝２～２０）を使用できる。これらのアルキルリンカーは更に、例えば低級アルキル（例えばＣ_１－４）、低級アシル、ハロゲン（例えばＣＩ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ_２、フェニルなどの任意の非立体障害基によって置換され得る。

別の実施形態において、抗ＣＤ３抗体、及び例えばＣＤ３及びＣＤ２０に対する二重特異性抗体を含む本開示の抗体は、１又は複数の保存的改変を有する重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を備え得る。本技術分野において、抗原結合を除去しない特定の保存的配列改変が行われ得ることが理解される。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０－８；ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５－４１；Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４－２６８７０；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５－１２；Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ'Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５；Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１－６、及びＢｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５－４３を参照されたい。

本明細書において使用される場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に著しくは影響を及ぼさないか又は変更しないアミノ酸改変を指すことが意図される。そのような保存的改変はアミノ酸置換、付加及び欠失を含む。部位特異的変異導入及びＰＣＲ媒介変異導入などの本技術分野において知られている標準的な技法によって、本開示の抗体に改変が導入され得る。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられることである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは本技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域における１又は複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基に置き換えられ得、変更された抗体は、本明細書において記載された機能的アッセイを使用して、保持された機能（すなわち、上に記載された機能）について試験され得る。

抗ＣＤ３抗体、及び例えばＣＤ３及びＣＤ２０に対する二重特異性抗体を含む本開示の抗体は、本開示の抗体のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ配列のうちの１又は複数を有する抗体を、改変抗体を操作するための出発物質として使用して調製することができる。抗体は、一方又は両方の可変領域（すなわち、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ）、例えば１又は複数のＣＤＲ領域、及び／又は、１又は複数のフレームワーク領域における１又は複数の残基を改変することによって操作され得る。追加的又は代替的に、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域における残基を改変することによって操作され得る。

特定の実施形態において、抗体の可変領域を操作するために、ＣＤＲ移植が使用され得る。抗体は、主に６の重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を通じて標的抗原と相互作用する。この理由から、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外部の配列より、個別の抗体間の多様性が高い。ＣＤＲ配列は大半の抗体－抗原相互作用を担うため、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植された特定の天然に存在する抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．を参照されたい。Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９－１００３３；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号及び同第６，１８０，３７０号もまた参照されたい。）

したがって、本開示の別の実施形態は、上に記載したような本開示の配列を含み得るＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有し得る重鎖可変領域、及び／又は上に記載したような本開示の配列を含み得るＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有し得る軽鎖可変領域を備え得る単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分、及び／又は二重特異性抗体に関する。これらの抗体は本開示のモノクローナル抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ ＣＤＲ配列を含有するが、異なるフレームワーク配列を含有し得る。

そのようなフレームワーク配列は、公共のＤＮＡデータベース、又は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開されている参考文献から取得できる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネット上ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにおいて入手可能）、並びにそれぞれの内容が参照によって本明細書に明示的に組み込まれる、前掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８；及びＣｏｘ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６で見ることができる。別の例として、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋデータベースで見ることができる。例えば、ＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂマウスにおいて見られる以下の重鎖生殖系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋ受託番号：１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、３－３３（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）及び３－７（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）において入手可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ ＨｕＭＡｂマウスにおいて見られる以下の重鎖生殖系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋ受託番号：１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、５－５１（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）、４－３４（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）、３－３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）＆３－２３（ＡＪ４０６６７８）において入手可能である。

抗体タンパク質配列は、当業者に周知である、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（上記のＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７））と呼ばれる配列類似性検索方法の１つを使用して、コンパイルされたタンパク質配列データベースと比較される。

本開示の抗体において使用される好ましいフレームワーク配列は、本開示の抗体によって使用されるフレームワーク配列と同様の構造である。Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子において見られるものと同一の配列を有するフレームワーク領域に移植され得るか（フレームワーク配列は生殖系列免疫グロブリン遺伝子に由来する）、又は、ＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較して１又は複数の変異を含有するフレームワーク領域に移植され得る。例えば、特定の場合において、抗体の抗原結合能力を維持又は強化するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが分かった（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号及び同第６，１８０，３７０号を参照されたい）。

別の種類の可変領域改変は、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３領域におけるアミノ酸残基を変異させ、これによって、目的の抗体の１又は複数の結合特性（例えば親和性）を改善することである。変異を導入するために、部位特異的変異導入又はＰＣＲ媒介変異導入が実行され得、抗体結合に対する影響、又は、他の目的の機能特性が、本技術分野において知られているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイで評価され得る。好ましくは、保存的改変（本技術分野において知られている）が導入される。変異は、アミノ酸置換、付加、又は欠失であり得るが、好ましくは置換である。更に、典型的には、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４又は５以下の残基が変更される。

本開示の操作された抗体は、例えば、抗体の特性を改善するために、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ内のフレームワーク残基に改変が行われたものを含む。典型的には、そのようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１又は複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰変異」させることである。より具体的には、体細胞変異を経験した抗体は、抗体の由来元である生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体の由来元である生殖系列配列と比較することによって同定され得る。

別の種類のフレームワーク改変は、Ｔ細胞エピトープを除去するために、フレームワーク領域内、又は更には１又は複数のＣＤＲ領域内の１又は複数の残基を変異させ、これによって、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。このアプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号に更に詳細に記載されている。

フレームワーク又はＣＤＲ領域内で行われる改変に加えて、又は替えて、本開示の抗体は、典型的には、血中半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は、抗原依存性細胞傷害などの、抗体の１又は複数の機能特性を変更するために、Ｆｃ領域内に改変を含むように操作され得る。更に、本開示の抗体は、化学的に改変され得る（例えば、１又は複数の化学的部分が抗体に結合し得る）か、又は、そのグリコシル化を変更するために改変され得、これにより、同様に抗体の１又は複数の機能特性が変更される。

一実施形態において、Ｃ_Ｈ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変更されるように、例えば、増加又は減少するように改変される。このアプローチは、米国特許第５，６７７，４２５号に更に記載されている。Ｃ_Ｈ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖の組み立てを容易にするために、又は、抗体の安定性を増加又は減少させるために変更される。

別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるように変異される。より具体的には、天然のＦｃヒンジドメインのスタフィロコッカスタンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合と比べて弱いＳｐＡ結合を抗体が有するように、１又は複数のアミノ酸変異が、Ｆｃヒンジ断片のＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメイン境界領域に導入される。このアプローチは、米国特許第６，１６５，７４５号に更に詳細に記載されている。

特定の実施形態において、重鎖定常領域は、低下したＦｃＲ又は補体系タンパク質結合親和性を有するように変異される。アミノ酸残基変異は、例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域におけるＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ＋Ｖ２３５Ｅ、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｎ２９７Ａ、及びＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｎ２９７Ａ＋Ｐ３２９Ｇ、及びヒトＩｇＧ２重鎖定常領域におけるＶ２３４Ａ＋Ｖ２３７Ａであり得る。

更に別の実施形態において、抗体のグリコシル化は改変される。例えば、グリコシル化された抗体が作られ得る（すなわち、抗体はグリコシル化を有しない）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために変更され得る。そのような炭水化物改変は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１又は複数の部位を変更することによって達成され得る。例えば、１又は複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらす１又は複数のアミノ酸置換が行われ得、これによって、当該部位のグリコシル化を除去する。そのような非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増加し得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号を参照されたい。

追加的又は代替的に、フコシル残基の量が低減された低フコシル化抗体、又は、二分ＧｌｃＮａｃ構造を増加させた抗体などの、グリコシル化の種類が変更された抗体が作られ得る。そのような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増加又は低下することが実証されている。そのような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構を変更した宿主細胞において、抗体を発現させることによって達成され得る。グリコシル化機構を変更した細胞は本技術分野において記載されており、本開示の組換え抗体を発現させるための宿主細胞として使用され得、これによって、グリコシル化が変更された抗体が産生される。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１，６）－フコシルトランスフェラーゼ）を欠如しており、その結果、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９細胞株において発現された抗体は、それらの炭水化物にフコースを有しない。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９ ＦＵＴ８－／－細胞株は、２つの置換ベクターを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的化破壊によって作製された（米国特許出願公開第２００４０１１０７０４号及びＹａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４－２２を参照されたい）。別の例として、ＥＰ１，１７６，１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをエンコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株であって、その結果、そのような細胞株において発現された抗体が、α－１，６結合関連酵素の低減又は除去による低フコシル化を示す、細胞株を記載している。ＥＰ１，１７６，１９５号はまた、抗体のＦｃ領域に結合するＮ－アセチルグルコサミンにフコースを追加するための酵素活性が低いか又は該酵素活性を有しない細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）を記載している。ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に結合させる能力が低下したバリアントＣＨＯ細胞株のＬｅｃ１３細胞を記載しており、これもまた、その宿主細胞において発現した抗体の低フコシル化をもたらす（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０もまた参照されたい）。改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗体はまた、ＰＣＴ公開第ＷＯ０６／０８９２３１号に記載されているように、ニワトリの卵において産生され得る。代替的に、改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、アオウキクサなどの植物細胞において産生され得る。抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断することができ；例えば、フコシダーゼであるα－Ｌ－フコシダーゼは抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６－２３）。

本開示によって想定される本明細書の抗体の別の改変はＰＥＧ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血中）半減期を増加させるためにＰＥＧ化され得る。抗体をＰＥＧ化するために、抗体又はその断片は典型的には、１又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基が抗体又は抗体断片に結合する条件下において、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのＰＥＧと反応される。好ましくは、ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して実施される。本明細書において使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ_１－Ｃ_１０）アルコキシ又はアリールオキシ－ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール－マレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの任意の形態を包含することが意図される。特定の実施形態において、ＰＥＧ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をＰＥＧ化するための方法は本技術分野において知られ、本開示の抗体に適用され得る。例えば、ＥＰ０１５４３１６号及びＥＰ０４０１３８４号を参照されたい。

抗ＣＤ３抗体、及び例えばＣＤ３及びＣＤ２０に対する二重特異性抗体を含む本開示の抗体は、その異なるクラスを検出及び／又は区別するために様々な物理的特性によって特徴付けることができる。

例えば、抗体は、軽鎖又は重鎖可変領域のいずれかに１又は複数のグリコシル化部位を含有し得る。そのようなグリコシル化部位は、変更された抗原結合に起因して、抗体の免疫原性の増加、又は、抗体のｐＫの変更をもたらし得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ（１９７２）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１：６７３－７０２；Ｇａｌａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５４８９－９４；Ｗａｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８：１０９９－１０９；Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：４３Ｒ－５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４５２－７；Ｍｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：６９７－７０６）。グリコシル化は、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列を含有するモチーフにおいて発生することが知られている。いくつかの場合において、可変領域グリコシル化を含有しない抗ＣＤ３抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含有しない抗体を選択すること、又は、グリコシル化領域内の残基を変異させることのいずれかによって達成され得る。

好ましい実施形態において、抗体はアスパラギン異性部位を含有しない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ－Ｇ又はＤ－Ｇ配列において発生して、ポリペプチド鎖に連結を導入し、その安定性を減少させるイソアスパラギン酸残基の生成をもたらし得る（イソアスパラギン酸効果）。

各抗体は、一般的に６～９．５のｐＨ範囲に収まる固有の等電点（ｐＩ）を有する。ＩｇＧ１抗体のｐＩは典型的には、７～９．５のｐＨ範囲に収まり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは典型的には、６～８のｐＨ範囲に収まる。正常範囲外のｐＩを有する抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下において、いくらかのアンフォールディング及び不安定性を有し得ると考えられる。したがって、正常範囲に収まるｐＩ値を含有する抗ＣＤ３抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲のｐＩを有する抗体を選択すること、又は、荷電表面残基を変異させることのいずれかによって達成され得る。

別の態様において、本開示は、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分又は二重特異性抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域又はＣＤＲをエンコードする核酸分子、例えば、抗ＣＤ２０重鎖可変領域－リンカー－抗ＣＤ２０軽鎖可変領域－リンカー－抗ＣＤ３重鎖可変領域、抗ＣＤ２０軽鎖可変領域－リンカー－抗ＣＤ２０重鎖可変領域－リンカー－抗ＣＤ３重鎖可変領域をエンコードする核酸分子を提供する。核酸は、全細胞において、細胞溶解液において、又は、部分的に精製されたか又は実質的に純粋な形態において存在し得る。核酸は、標準的な技法によって、他の細胞成分又は他の混入物質、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から精製される場合、「単離」されるか又は「実質的に純粋」になる。本開示の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含有してもよく、又はしなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。

本開示の核酸は、標準的な分子生物学技法を使用して取得され得る。ハイブリドーマ（例えば、下で更に説明される、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体については、ハイブリドーマによって作られる抗体の軽鎖及び重鎖をエンコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技法によって取得され得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから（例えば、ファージディスプレイ技法を使用して）取得される抗体については、そのような抗体をエンコードする核酸は、遺伝子ライブラリから回収され得る。

本開示の好ましい核酸分子には、ＣＤ３モノクローナル抗体のＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ配列又はＣＤＲをエンコードするものが含まれる。Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_ＬセグメントをエンコードするＤＮＡ断片が取得されたら、これらのＤＮＡ断片は、標準的な組換えＤＮＡ技法によって、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するように更に処理することができる。これらの処理において、Ｖ_Ｌ又はＶ_ＨをエンコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域又は可動性リンカーなどの、別のタンパク質をエンコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。この文脈において使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってエンコードされるアミノ酸配列がインフレームに留まるように、２つのＤＮＡ断片が結合されることを意味することが意図される。

Ｖ_Ｈ領域をエンコードする単離ＤＮＡは、Ｖ_ＨをエンコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３）をエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、本技術分野において知られ、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、Ｖ_ＨをエンコードするＤＮＡは、重鎖Ｃ_Ｈ１定常領域のみをエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。

Ｖ_Ｌ領域をエンコードする単離ＤＮＡは、Ｖ_ＬをエンコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域Ｃ_Ｌをエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、本技術分野において知られ、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得る。

ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、Ｖ_Ｈ及びＶ_ＬをエンコードするＤＮＡ断片は、可動性リンカーをエンコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３をエンコードする別の断片に作動可能に連結され、その結果、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列は、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域が可動性リンカーによって結合された連続的な一本鎖タンパク質として発現され得る（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４を参照されたい）。

本開示の二重特異性抗体については、抗ＣＤ３抗体のＣＤＲ、ＶＨ及びＶＬ、及び抗ＣＤ２０抗体のＶＨ及びＶＬ、及びリンカーをエンコードするヌクレオチド配列がまず合成され、次いで、必要とされる二重特異性抗体の構造に応じて組み合わされる。例えば、抗ＣＤ２０重鎖可変領域、リンカー、抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、リンカー、及び抗ＣＤ３重鎖可変領域をエンコードするヌクレオチド配列は、必要に応じて作動可能に連結され得る。

本開示の抗ＣＤ３抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技法を使用して産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための他の実施形態は、Ｂリンパ球のウイルス又は発癌性形質転換、及び、ファージディスプレイ技法を含む。キメラ又はヒト化抗体も本技術分野において周知である。例えば、その内容の全体が参照によって本明細書に具体的に組み込まれる、米国特許第４，８１６，５６７号；同第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号、及び同第６，１８０，３７０号を参照されたい。本開示の抗体はまた、本技術分野において周知であるように、例えば、組換えＤＮＡ技法及び遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）。一実施形態において、標準的な分子生物学技法によって取得される部分的又は完全長軽鎖及び重鎖をエンコードするＤＮＡは、１又は複数の発現ベクターに挿入される。その結果、遺伝子は、転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結される。この文脈において、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するという意図された機能を担うように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味することが意図される。

本開示の二重特異性抗体、特にＣＤ３及びＣＤ２０に対するものは、ｉ）二重特異性抗体のポリペプチド鎖をエンコードするヌクレオチド配列を、転写又は翻訳を制御する、転写及び翻訳の調節配列に作動可能に連結する１又は複数の発現ベクターに挿入すること；ｉｉ）宿主細胞に発現ベクターを形質導入又はトランスフェクトすること；及びｉｉｉ）ポリペプチド鎖を発現させて、本開示の二重特異性抗体を形成することによって産生され得る。

「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び、抗体遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌに記載されている（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０：ＳＶ４０）アデノウイルスに由来するプロモーター及び／又はエンハンサー、例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ：ＡｄＭＬＰ）及びポリオーマウイルスエンハンサーなどの、哺乳動物細胞において高いレベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメントを含む。代替的に、ユビキチンプロモーター又はβ－グロブリンプロモーターなどの非ウイルス調節配列が使用されてもよい。更に、ＳＶ４０初期プロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長鎖末端反復配列由来の配列を含有するＳＲαプロモーターシステム（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６－４７２）などの、異なる供給源由来の配列から構成される調節エレメント。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選択される。

発現ベクターは、宿主細胞からのポリペプチド鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをエンコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームに連結されるように、ベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド、又は、異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。

ポリペプチド鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）及び選択マーカー遺伝子などの追加の配列を保有することができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号及び同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、選択マーカー遺伝子は典型的には、ベクターが導入された宿主細胞に対して、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅と共に、ｄｈｆｒ宿主細胞において使用）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。

本開示の抗ＣＤ３抗体の重鎖及び／又は軽鎖又は二重特異性抗体のポリペプチド鎖の発現について、発現ベクターは標準的な技法によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、外来性ＤＮＡを原核生物又は真核生物の宿主細胞に導入するために一般に使用される幅広い様々な技法、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。本開示の抗体を原核生物又は真核生物のいずれの宿主細胞において発現することも理論的に可能であるが、真核細胞（哺乳動物宿主細胞が最も好ましい）における抗体の発現が最も好ましい。なぜなら、そのような真核細胞、特に哺乳動物細胞は、原核生物の細胞と比較して、適切に折り畳まれた、免疫活性抗体を組み立てて分泌する可能性が高いからである。

本出願において使用され得る発現ベクターとしては、これらに限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、酵母人工染色体（ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：ＢＡＣ）、形質転換コンピテント人工染色体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：ＴＡＣ）、哺乳動物人工染色体（ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：ＭＡＣ）、及びヒト人工エピソーム染色体（ｈｕｍａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｅｐｉｓｏｍａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：ＨＡＥＣ）が挙げられる。

本開示の組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ：ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１に記載されているようなＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０に記載されるｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と共に使用する場合、別の好ましい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２号、ＷＯ８９／０１０３６号及びＥＰ３３８，８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をエンコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、又は、より好ましくは、宿主細胞が増殖する培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたって宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収され得る。

別の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された、１又は複数の抗体又はその抗原結合部分、二重特異性抗体、又は代替的にそれを発現することができる本開示の核酸分子を備え得る医薬組成物を提供する。医薬組成物は、任意選択で、抗腫瘍抗体、感染阻止抗体、免疫増強のための抗体、又は自己免疫疾患のための抗体、又は代替的に、抗体ではない抗腫瘍剤、抗体ではない抗感染剤、抗体ではない免疫増強剤、又は抗体ではない抗炎症剤などの１又は複数の追加の薬学的有効成分を含有してもよい。本開示の医薬組成物は、追加の抗腫瘍剤、追加の抗感染剤、追加の免疫増強剤、又は追加の自己免疫疾患処置剤と組み合わせて使用してもよい。

医薬組成物は、任意の数の賦形剤を備えてもよい。使用できる賦形剤としては、担体、表面活性剤、増粘又は乳化剤、固体結合剤、分散又は懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、着香剤、コーティング剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、保存料、等張剤、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な賦形剤の選択及び使用は、その開示が参照によって本明細書に組み込まれるＧｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）に教示されている。

好ましくは、医薬組成物は、（例えば注射又は注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与に好適である。投与経路に応じて、有効成分は、酸の作用及びそれを不活性化し得る他の天然の条件から保護する材料でコーティングすることができる。本明細書において使用される場合、「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入を含む。代替的に、本開示の抗体は、局所、表皮又は粘膜の投与経路などの非経口ではない経路を介して、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下又は局所により投与することができる。

医薬組成物は、滅菌水溶液又は分散剤の形態であり得る。これらは、マイクロエマルション、リポソーム、又は高い薬物濃度に好適な他の秩序構造に製剤化することもできる。

単回投与形態を生成するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、処置される対象、及び、特定の投与様式に応じて変動し、一般的に、組成物の、治療効果を生じさせる量である。一般的に、この量は、１００パーセントのうち、約０．０１％～約９９％の有効成分、好ましくは約０．１％～約７０％、最も好ましくは約１％～約３０％の、薬学的に許容される担体と組み合わされる有効成分の範囲であり得る。

最適な所望の反応（例えば治療反応）を提供するように投与計画が調整される。例えば、単回ボーラスを投与する場合も、いくつかの分割された用量を経時的に投与する場合も、又は、治療状況の緊急事態による指示に応じて用量を比例的に低減又は増加させる場合もある。投与を容易にするために、及び、投与量を統一するために、単位用量形態で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において使用される場合、単位用量形態とは、処置される対象のための単位投与量として好適な物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要な薬学的担体を伴って所望の治療効果を生じさせるために算出された所定量の有効成分を含有する。抗体は代替的に、徐放性製剤として投与できる。この場合、必要な投与頻度は少なくなる。

本開示の抗ＣＤ３抗体は、ＦＤＡによって承認されたＯＫＴ３用量を参照して投与してもよいが、最終的には、対象の、例えば性別、年齢、病歴などに応じて医師によって決定されるべきである。ＣＤ２０及びＣＤ３に対する本開示の二重特異性抗体の用量は、対象の、例えば性別、年齢、病歴などに応じて医師によって決定され得る。

本開示の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分、又はＣＤ３及びＣＤ２０に対する二重特異性抗体の「治療有効投与量」は、疾患症状の重症度の減少、疾患症状がない期間の頻度及び長さの増加、又は疾患の罹患に起因する機能障害又は能力障害の予防をもたらし得る。例えば、腫瘍を有する対象の処置について、「治療有効投与量」は好ましくは、未処置対象と比べて、腫瘍サイズを少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、更により好ましくは少なくとも約６０％、更により好ましくは少なくとも約８０％縮小するか、又は更には腫瘍を除去する。同種移植を受ける対象については、「治療有効投与量」は好ましくは、未処置対象と比べて、移植片拒絶を少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、更により好ましくは少なくとも約６０％、更により好ましくは少なくとも約８０％抑制するか、又は更には移植片拒絶を排除する。炎症性疾患又は自己免疫疾患を有する対象については、「治療有効投与量」は好ましくは、未処置対象と比べて、不適切な炎症を少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、更により好ましくは少なくとも約６０％、更により好ましくは少なくとも約８０％抑制するか、又は更には炎症を排除する。

医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤であり得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性かつ生体適合性のポリマーを使用することができる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。

医薬組成物は、（１）無針皮下注射装置（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号；及び同第４，５９６，５５６号）；（２）マイクロ注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号）；（３）経皮装置（米国特許第４，４８６，１９４号）；（４）注入機器（米国特許第４，４４７，２３３号及び同第４，４４７，２２４号）；及び（５）浸透圧装置（米国特許第４，４３９，１９６号及び同第４，４７５，１９６号）などの医療用装置を介して投与することができ；これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態において、本開示の抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける適切な分布を保証するように製剤化され得る。例えば、本開示の治療抗体又はその抗原結合部分が血液脳関門を越えることを保証するために、それらは、特定の細胞又は臓器への選択的輸送を強化するために標的部分を更に含んでもよいリポソームに製剤化され得る。例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；同第５，４１６，０１６号；及び同第５，３９９，３３１号；Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５；Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８；Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０；Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０；Ｋｅｉｎａｎｅｎ ａｎｄ Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；及びＫｉｌｌｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３を参照されたい。

本開示の医薬組成物は、複数のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ用途を有する。例えば、組成物は、炎症性疾患の処置及び軽減、又は移植片拒絶の抑制又は排除に使用され得る。

一態様において、治療有効量の、本開示の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合部分を備える医薬組成物は、炎症性疾患及び自己免疫疾患を処置及び／又は軽減するため、又は移植片拒絶を抑制又は排除するために使用され得る。一実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、ＦｃＲ結合親和性が弱いか又は存在しない重鎖定常領域を含有し得る。特定の実施形態において、炎症性疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）又は炎症性腸疾患（ＩＢＤ、例えばクローン病）である。特定の実施形態において、自己免疫疾患はＩ型糖尿病である。

別の態様において、治療有効量の、本開示の二重特異性抗体を備える医薬組成物は、特定の疾患を処置するために使用され得、二重特異性抗体は、ＣＤ３及び疾患関連抗原に特異的であり、Ｆｃ領域を含有しないか、又はＦｃＲ結合親和性が弱いか又は存在しないＦｃ領域を含有する。疾患関連抗原に応じて、医薬組成物は、原発性又は転移性の結腸腺癌腫、乳癌、腎細胞癌、黒色腫、膵癌、非小細胞肺癌、膠芽腫、及び胃癌などの様々な腫瘍；ＡＩＤＳなどの感染症；及び炎症性疾患又は自己免疫疾患を処置するために使用され得る。

特定の実施形態において、ＣＤ２０及びＣＤ３に対する本開示の二重特異性抗体、及び／又はそれをエンコードするヌクレオチド分子を備える医薬組成物は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、又はＢ細胞介在性自己免疫疾患などのＢ細胞関連疾患を処置又は軽減するために使用され得る。Ｂ細胞リンパ腫及びＢ細胞白血病としては、これらに限定されないが、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）が挙げられる。

別の態様において、本開示は、本開示の医薬組成物が１又は複数の追加の抗体又は非抗体剤と同時投与される併用療法の方法を提供する。一実施形態において、ＣＤ２０及びＣＤ３に対する本開示の二重特異性抗体、及び／又はそれをエンコードするヌクレオチド分子を備える医薬組成物の投与の前又はそれと同時に、追加の抗ＣＤ２０抗体がそれを必要とする対象に投与され得る。抗ＣＤ２０抗体は、大半のＣＤ２０^＋Ｂ細胞を死滅させて、投与されるＣＤ２０及びＣＤ３に対する二重特異性抗体の量を減少させることができ、その結果、二重特異性抗体によって引き起こされる有害作用は更に低減され得る。

本明細書において論じられる治療剤の組み合わせは、薬学的に許容される担体における単一の組成物として同時に投与され得るか、又は、薬学的に許容される担体における各薬剤と共に別個の組成物として同時に投与され得る。別の実施形態において、治療剤の組み合わせは、順次に投与され得る。

更に、併用療法の１より多くの用量が順次に投与される場合、順次投与の順序は、投与の各時点において、逆になり得るか、又は、同じ順序に維持され得、順次投与は、同時投与、又は、それらの任意の組み合わせと組み合わされ得る。

本発明及びその利点を詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な改変、置換、及び変更を本明細書において行うことができることが理解されるべきである。

本開示は以下の例において更に例示されるが、これは、更なる限定として解釈されるべきではない。本出願全体において引用されるすべての図面及びすべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許及び公開特許出願の内容は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
（実施例）
（実施例１ マウス抗ＣＤ３モノクローナル抗体の生成）

ＣＤ３ε（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０００７２４．１）をコードするｃＤＮＡ（配列番号２４）を合成し、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位の間にクローニングして、ｈＣＤ３ε－ｐｃＤＮＡ３．１を取得した。同様に、配列番号２５に記載のｈＣＤ３δ（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０００７２３．１）をエンコードするｃＤＮＡを有する発現ベクターｈＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１を構築した。これらのベクターを大量に取得するために、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａキット（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の説明書に従って使用して、プラスミドを抽出した。

ヒトＣＤ３と結合するモノクローナル抗体を生成するために、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに上で調製したプラスミドを接種した。簡潔に説明すると、マウスに２５μｌの１ｍｇ／ｍｌ ｈＣＤ３ε－ｐｃＤＮＡ３．１及び２５μｌの１ｍｇ／ｍｌ ｈＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１を筋肉内注射した。２つの電極を備えるＢＴＸ ＥＣＭ８３０パルスジェネレータを用いて注射部位に電流を印加した。注射及び電気穿孔による３回のブーストを３週間の間隔で実行した。最終免疫化ブーストの４日後、ファージディスプレイライブラリ構築のために脾臓を回収した。

ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリを構築するために、Ｔｒｉｚｏｌキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全脾臓ＲＮＡを抽出し、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用してｃＤＮＡを合成した。上で合成したｃＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによって遺伝子増幅を行い、独占所有権のあるファージミドであるｐＴＧＳを使用してｓｃＦｖファージライブラリを構築した。簡潔に説明すると、軽鎖可変領域をＰＣＲによって増幅し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ／精製キットを使用して精製し、制限酵素ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で消化し、次いで、ファージミドｐＴＧＳ（同じ制限酵素で消化し、アガロースゲルによって精製した）に１６℃でライゲーションした。ライゲーション後、組換えＤＮＡを沈殿させ、洗浄し、蒸留水に溶解した。次いで、組換えＤＮＡを電気穿孔によって大腸菌ＴＧ１細胞に形質転換した。次いで、細胞を１０ｍｌのＳＯＣ培地に懸濁し、穏やかに振盪しながら３７℃で１時間培養した。細胞培養物を２ＹＴ寒天／アンピシリン上にプレーティングし、アンピシリン耐性コロニーを計数した。重鎖可変断片のクローニングについては、ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化し、軽鎖可変領域ライブラリにライゲーションし、大腸菌ＴＧ１に形質転換した。ライブラリを大きなプレートからこすり取り、２ＹＴＡＧ液体培養培地に播種した。およそ１０^１２ｐｆｕのヘルパーファージを、ｓｃＦｖ遺伝子ライブラリを含有するＴＧ１試料に添加し、振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加し、培養を３０℃で一晩振盪した。細胞を４℃で１５分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた上清を５ｍｌの２０％ＰＥＧ８０００／２．５Ｍ ＮａＣｌと混合し、氷上で３０分間インキュベートし、次いで、ファージを４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離によって沈殿させた。ファージを、１％ＢＳＡを含有する１．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、ボルテックスし、５分間１３０００ｒｐｍで遠心分離して、残存細菌を除去した。上清を４℃で保存したか、又はバイオパニングのために直接使用した（以下を参照されたい）。

ヒトＣＤ３ε－ｈｉｓ（カタログ番号：１０９７７－Ｈ０８ｓ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）及びサルＣＤ３ε－ｈｉｓ（カタログ番号：９００４７－Ｃ０８Ｈ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）を使用して、ヒト及びサルの両方のＣＤ３タンパク質に対する抗体をスクリーニングした。簡潔に説明すると、ファージを、ヒトＣＤ３ε－ｈｉｓタンパク質と結合したビーズと共に、振盪機において室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳを使用して未結合ファージを洗浄除去し、次いで０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）を使用して抗原結合ファージを溶出した。１．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）を使用して、溶出したファージをｐＨ７．０に中和した。上記中和ファージを使用して１０ｍｌのＴＧ１細菌を感染させ、これをＯＤ_６００が０．６に達するまで３７℃で培養した。細菌培養を遠心分離によってペレット化し、ペレットを培養培地に再懸濁し、次いで次回のスクリーニングのために２ＹＴＡＧプレート上にプレーティングした。ヒトＣＤ３結合に対して陽性の選択されたファージを、サルＣＤ３ε－ｈｉｓタンパク質と結合したビーズと共に、振盪機において室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳを使用して未結合ファージを洗浄除去し、次いで０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）を使用して抗原結合ファージを溶出した。１．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）を使用して、溶出したファージをｐＨ７．０に中和した。上記中和ファージを使用して１０ｍｌのＴＧ１細菌を感染させ、これをＯＤ_６００が０．６に達するまで３７℃で培養した。細菌培養を遠心分離によってペレット化し、ペレットを培養培地に再懸濁し、次いで次回のスクリーニングのために２ＹＴＡＧプレート上にプレーティングした。そのような濃縮及びスクリーニングを合計３回実施した。

３回のバイオパニング後、高い結合能を有するファージを採取し、細菌細胞を感染させるために使用した。単一細菌コロニーをピックアップし、９６ウェルプレートにおいて増殖させた。次いで、ファージベースのＥＬＩＳＡを使用して、ヒトＣＤ３ε－ｈｉｓ（カタログ番号：１０９７７－Ｈ０８ｓ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）及びサルＣＤ３ε－ｈｉｓ（カタログ番号：９００４７－Ｃ０８Ｈ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）の両方に対して高度に結合したものを同定し、次いで、これをＤＮＡ配列決定に供した。１つの可読ｓｃＦｖ配列を高結合クローンから同定し、ＣＤ３－１９と命名し、その重鎖及び軽鎖可変領域配列番号を表１に記載した。
（実施例２ 完全長抗ＣＤ３抗体の発現及び精製）

スクリーニングされたＣＤ３－１９ ｓｃＦｖ抗体を、更なる特性評価のためにＨＥＫ２９３Ｆ（Ｃｏｂｉｏｅｒ、中国）細胞において完全長抗体として発現させた。簡潔に説明すると、重鎖／軽鎖可変領域及びヒトＩｇＧ１／カッパ定常領域（それぞれ、配列番号２２（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｎ、Ｘ４＝Ｐ）及び２３に記載のアミノ酸配列）をｐｃＤＮＡ３．１のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）の間にクローニングすることによって、発現ベクターを構築した。

ＰＥＩトランスフェクションを製造業者のマニュアルに従って使用して、抗ＣＤ３抗体をＨＥＫ－２９３Ｆ細胞において一過性に発現させた。簡潔に説明すると、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ：ＰＥＩ）を１：３のＤＮＡ：ＰＥＩ比で使用して、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞にベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションのために使用したプラスミド濃度は１．５μｇ／ｍｌであった。トランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞を、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーターにおいて、１２０ＲＰＭで振盪しながら培養した。１０～１２日後、細胞培養上清を回収し、５分間３５００ｒｐｍの遠心分離に供し、次いで０．２２μｍカプセルを使用して濾過して細胞残屑を除去した。次いで、抗体を、予め平衡化したプロテインＡアフィニティーカラム（カタログ番号：１７０４０５０１、ロット番号：１０２５２２５０、ＧＥ、ＵＳＡ）を使用して精製し、溶出緩衝液（２０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０～３．５）を用いて溶出した。緩衝液交換後、抗体をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に保持し、ＮａｎｏＤｒｏｐ装置を使用して濃度を決定した。次いで、精製モノクローナル抗体を更なる特性評価に供した。
（実施例３ キメラ抗体の結合能）

精製キメラＣＤ３－１９抗体を、組換えヒト及びサルＣＤ３εタンパク質に対する結合能について、ＥＬＩＳＡによって試験した。

簡潔に説明すると、ＥＬＩＳＡプレートをウェルごとに１００μｌの５００ｎｇ／ｍｌヒトＣＤ３ε－ｈｉｓ（カタログ番号：１０９７７－Ｈ０８ｓ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）を用いて４℃で一晩コーティングした。次いで、２００μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋１％ヤギ血清＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）を用いて各ウェルを室温で２時間ブロッキングし、次いで１００μｌの段階希釈した抗ＣＤ３抗体（４０μｇ／ｍｌから出発）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて３回すすいだ後、ＥＬＩＳＡプレートにＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００、カタログ番号：Ａ０１７０－１ＭＬ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートに、新たに調製したＵｌｔｒａ－ＴＭＢ（カタログ番号：５５５２１４、ＢＤ、ＵＳＡ）を５分間の発色のために添加し、各ウェルの４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３Ｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）において読み取った。

キメラＣＤ３－１９抗体のサルＣＤ３εに対する交差反応を直接ＥＬＩＳＡによって試験した。簡潔に説明すると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをウェルごとに１００μｌの５００ｎｇ／ｍｌサルＣＤ３ε－ｈｉｓ（カタログ番号：９００４７－Ｃ０８Ｈ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）を用いて４℃で一晩コーティングした。次いで、２００μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋１％ヤギ血清＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて各ウェルを室温で２時間ブロッキングし、次いで１００μｌの段階希釈した抗ＣＤ３抗体（４０μｇ／ｍｌから出発）を添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、ＥＬＩＳＡプレートにＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００、カタログ番号：Ａ０１７０－１ＭＬ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートに、新たに調製したＵｌｔｒａ－ＴＭＢ（カタログ番号：５５５２１４、ＢＤ、ＵＳＡ）を５分間の発色のために添加し、各ウェルの４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３Ｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）において読み取った。抗ＨＥＬアイソタイプ対照抗体（カタログ番号：ＬＴ１２０３１、ＬｉｆｅＴｅｉｎ、ＵＳＡ）を陰性対照として使用した。結果を図１に示した。

Ｔ細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体に対するキメラＣＤ３－１９抗体の結合能を、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を使用してＦＡＣＳによって試験した。簡潔に説明すると、健康なヒトドナーの血液試料由来のＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって採取し、次いでＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キット（カタログ番号：１１３４６Ｄ、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して、ＰＢＭＣから単離した。次いで、Ｔ細胞を９６ウェルプレートに１×１０^５個／ウェルで播種し、次いでそこに１００μｌの段階希釈した抗ＣＤ３抗体を添加した。４℃での１時間のインキュベーション後、９６ウェルプレートをＰＢＳによって３回すすぎ、ＰＥヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：５００、カタログ番号：ＰＡ１－８６０７８、Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）を添加した。４℃での１時間のインキュベーション後、９６ウェルプレートをＰＢＳによって３回すすぎ、次いでＦＡＣＳ装置（ＢＤ）を使用して細胞蛍光を測定した。抗ＨＥＬアイソタイプ対照抗体（カタログ番号：ＬＴ１２０３１、ＬｉｆｅＴｅｉｎ、ＵＳＡ）を陰性対照として使用した。結果を図２に示した。

図１に示したように、キメラＣＤ３－１９抗体はヒト及びサルＣＤ３εタンパク質と特異的に結合することができた。

図２によると、抗体ＣＤ３－１９は高い結合特異性及び活性でヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞と結合することができた。
（実施例４ ファージディスプレイによるＣＤ３－１９の親和性成熟）

結合親和性を更に改善するために、ＣＤ３－１９をファージディスプレイ技法による親和性成熟に供した。簡潔に説明すると、３次元構造モデリングシミュレーションを実行して、結合親和性に重要である可能性がある、ＣＤ３－１９の重鎖及び軽鎖ＣＤＲにおけるアミノ酸残基を同定した。同定したＣＤＲ残基を、特別に設計したプライマー及び部位特異的変異導入の標準的なプロトコルを使用したＰＣＲによる変異導入に供した。次いで、ファージディスプレイライブラリを構築し、実施例１のプロトコルに従って、ヒトＣＤ３ε－ｈｉｓタンパク質と結合したビーズを使用したバイオパニングに供した。

３回のバイオパニング後、高度に結合したものを選択し、回収し、次いで細菌細胞を感染させるために使用した。細菌コロニーをピックアップし、９６ウェルプレートにおいて増殖させ、次いでＥＬＩＳＡを使用して高度に結合したものを同定し、その後これを配列決定した。重鎖及び軽鎖ＣＤＲにおける有益な変異を同定し、次いで組み合わせて新たなファージディスプレイライブラリにし、これを、上に記載したように、さらに３回のバイオパニング及び濃縮、その後の配列確認に供した。

親抗体ＣＤ３－１９よりも高い結合能を有する３つのｓｃＦｖ抗体を同定し、１９－１５、１９－２６、及び１９－３７と命名し、その可変領域配列番号を表１に記載した。
（実施例５ 親和性成熟において取得した抗体の発現、精製、及び結合能の特性評価）

上でスクリーニングされた３つのｓｃＦｖ抗体を、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞において完全長ヒトＩｇＧ１／カッパ抗体として発現させ、ＩｇＧ１定常領域及びカッパ定常領域配列をそれぞれ配列番号２２（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｎ、Ｘ４＝Ｐ）及び２３に記載した。発現及び精製は実施例２のプロトコルを使用して実行した。

ＣＤ３－１９、１９－１５、１９－２６、及び１９－３７のヒトＣＤ３ε－ｈｉｓ及びサルＣＤ３ε－ｈｉｓに対する結合能を、実施例３のプロトコルに従って、ＥＬＩＳＡによって試験した。結果を図３に示した。一次Ｔ細胞表面のヒトＴＣＲ／ＣＤ３複合体に対するこれらの抗体の結合能を、実施例３のプロトコルに従って、ＦＡＣＳによって試験した。結果を図４に示した。

図３に示したように、親和性成熟において取得した３つすべての抗体は、ヒト及びサルＣＤ３に対して親抗体ＣＤ３－１９よりも高い結合能を示した。

更に、図４に示したように、親和性成熟抗体１９－１５、１９－２６、及び１９－３７は、一次Ｔ細胞に対して親抗体よりも高い結合能を示した。
（実施例６ ＳＰＲによる抗ＣＤ３抗体の結合親和性決定）

キメラ抗ＣＤ３抗体のヒト及びサルＣＤ３εに対する結合親和性をＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）８Ｋ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）によって測定した。

簡潔に説明すると、１００～２００応答単位（ＲＵ）のヒトＣＤ３ε－ｈｉｓ（カタログ番号：１０９７７－Ｈ０８ｓ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）又はサルＣＤ３ε－ｈｉｓ（カタログ番号：９００４７－Ｃ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）をＣＭ５バイオセンサーチップ（カタログ番号：ＢＲ－１００５－３０、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合し、その後１Ｍエタノールアミンを用いて未反応基をブロッキングした。０．３μＭ～１０μＭの範囲の濃度の段階希釈した抗体をＳＰＲ用緩衝液（ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液、ｐＨ７．４、カタログ番号：ＢＲ－１００６－６９、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）に３０μＬ／分で注入した。結合親和性を、ブランク対照のＲＵを減算して算出した。１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して会合速度（ｋ_ａ）及び解離速度（ｋ_ｄ）を算出した。平衡解離定数Ｋ_Ｄをｋ_ｄ／ｋ_ａ比として算出した。陽性対照として使用したＭａｃｒｏｇｅｎｉｃｓの抗体ｍＡＢ２を、ＣＮ１０７８２７９８５Ａ号に開示されている可変領域、及びヒトＩｇＧ１／カッパ定常領域（配列番号２２（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｎ、Ｘ４＝Ｐ）及び２３）を使用して調製した。

抗ＣＤ３抗体のヒトＣＤ３ε及びサルＣＤ３εに対する結合親和性を決定し、表２及び３に要約した。

表２及び３に示すように、親和性成熟において取得した抗体は、親抗体よりも高い結合親和性を有し、ｍＡＢ２のものと同等か又はより高かった。上記抗体のうち、１９－３７は最も高い結合親和性を示した。
（実施例７ 抗ＣＤ３抗体のＴ細胞活性に対する調節効果）

本開示のキメラ抗ＣＤ３抗体を、抗体架橋が生じた場合のＣＤ３／ＴＣＲシグナル伝達に対する効果について、一次ヒトＴ細胞を使用して試験した。

簡潔に説明すると、９６ウェル細胞培養プレートをウェルごとに１００μｌの５μｇ／ｍｌ Ｆ（ａｂ'）_２ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃガンマ二次抗体（カタログ番号：３１１６３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳを用いて各ウェルを２回すすぎ、異なる濃度の１００μｌの抗ＣＤ３抗体を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。一方、健康なヒトドナーの血液試料由来のＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって採取し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キット（カタログ番号：１１３４６Ｄ、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用して、ＰＢＭＣから単離した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞をＲＰＭＩ完全培地に１．０×１０^６／ｍｌの細胞密度で再懸濁し、２．５μＭカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ：ＣＦＳＥ、カタログ番号：Ｃ３４５５４Ｉ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて、３７℃、１０分間のインキュベーションによって標識した。細胞をＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）に２．５×１０^５／ｍｌの生細胞密度で再懸濁した。次いで、２００μｌのＴ細胞懸濁液を抗ＣＤ３コーティングプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。ＣＳＦＥ染色をＦＡＣＳによって測定して、細胞増殖率を決定した。抗体ｍＡＢ２を陽性対照として使用した。結果を図５の（Ａ）に示した。

加えて、遊離キメラ抗ＣＤ３抗体を、抗体架橋が生じなかった場合のＴ細胞活性化に対する効果について試験した。簡潔に説明すると、健康なヒトドナーの血液試料由来のＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって採取し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キット（カタログ番号：１１３４６Ｄ、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用して、ＰＢＭＣから単離した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞をＲＰＭＩ完全培地に１．０×１０^６／ｍｌの細胞密度で再懸濁し、２．５μＭカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、カタログ番号：Ｃ３４５５４Ｉ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて、３７℃、１０分間のインキュベーションによって標識した。標識細胞をＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）に５×１０^５／ｍｌの生細胞密度で再懸濁した。次いで、１００μｌのＴ細胞懸濁液を、異なる濃度の１００μｌの抗ＣＤ３抗体と共に９６ウェル細胞培養プレートに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。ＣＳＦＥ染色をＦＡＣＳによって測定して、細胞増殖率を決定した。抗体ｍＡＢ２を陽性対照として使用した。結果を図５の（Ｂ）に示した。

図５の（Ａ）に示したように、抗ＣＤ３抗体は、プレートにコーティングした二次抗体に結合して抗体架橋を起こした場合、Ｔ細胞増殖率を用量依存的に増加させることができ、親和性成熟によって取得された抗体は、親抗体よりも高いそのような効果を示した。しかしながら、本開示の抗ＣＤ３抗体のＴ細胞活性化に対する効果はすべて、ｍＡＢ２のものよりも低く、これは、本開示の抗ＣＤ３抗体が、陽性抗体ｍＡＢ２と比較して、同等か又はより高い結合能／親和性だが、Ｔシグナル伝達活性化に対してより低い活性を有したことを意味した。換言すれば、Ｔ細胞に対する高い結合能にもかかわらず、本開示の抗ＣＤ３抗体は、過剰なＣＤ３シグナル伝達を引き起こさず、これにより、Ｔ細胞活性化によって誘導される過剰なサイトカイン放出などの潜在的な毒性を低下した。

更に、図５の（Ｂ）に示したように、抗体架橋を有しない遊離抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞増殖に対する効果を示さなかった。
（実施例８ 例示的な抗ＣＤ３抗体のヒト化）

上の機能的アッセイに基づいて、１９－１５及び１９－２６をヒト化及び更なる特性評価のために選択した。ヒト化は、例えば米国特許第５，２２５，５３９号に記載され、以下に詳細に明記される十分に確立したＣＤＲ移植法を使用して行った。

１９－１５のヒト化のためのアクセプターフレームワークをスクリーニングするために、この抗体の軽鎖及び重鎖可変鎖配列をＮＣＢＩのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）におけるヒト免疫グロブリン遺伝子データベースに対してＢＬＡＳＴ検索して、それぞれ、最も相同性の高いヒト生殖系列ＩＧＶＨ及びＩＧＶλをヒト化のためのアクセプターとして同定した。選択したヒト重鎖アクセプターはＩＧＨＶ３－２３＊０５であり、選択したヒト軽鎖アクセプターはＩＧＬＶ７－４３＊０１であった。

１９－２６のヒト化のためのアクセプターフレームワークをスクリーニングするために、この抗体の軽鎖及び重鎖可変鎖配列をＮＣＢＩのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）におけるヒト免疫グロブリン遺伝子データベースに対してＢＬＡＳＴ検索して、それぞれ、最も相同性の高いヒト生殖系列ＩＧＶＨ及びＩＧＶλをヒト化のためのアクセプターとして同定した。選択したヒト重鎖アクセプターはＩＧＨＶ３－２３＊０５であり、選択したヒト軽鎖アクセプターはＩＧＬＶ７－４３＊０１であった。

ＣＤＲループ構造を支持すること、したがってヒト化抗体における復帰変異を設計することに重要な役割を果たし得る鍵フレームワーク残基を同定するために、上記２つの抗体の可変ドメインの３次元構造をモデル化した。選択された構造の鋳型は、１９－１５及び１９－２６それぞれについて、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、及びＨ－ＣＤＲ３において同じクラスのカノニカルループ構造を有した。選択された構造鋳型を使用して、重鎖及び軽鎖について、マウスフレームワークをヒトアクセプターのフレームワークと置き換えることによって構造モデルを構築した。次いで、３次元構造モデリングシミュレーションを実行し、ＣＤＲループ構造又は重鎖及び軽鎖境界を支持するのに重要である可能性がある鍵フレームワーク残基を同定した。マウス抗体フレームワーク及びヒトアクセプターフレームワークの両方が特定の部位で同じ残基を共有する場合は、ヒト生殖系列残基を保持した。他方、マウス抗体フレームワーク及びヒト生殖系列アクセプターフレームワークが特定の部位で異なる残基を有する場合は、この残基の重要性を構造モデリングによって評価した。マウス抗体のフレームワークにおける残基がＣＤＲ残基と相互作用し、それに影響することが分かった場合、この残基をマウス残基に復帰変異した。以下の表４に抗体構造シミュレーションにおいて使用した構造鋳型を記載した。

上に記載したような構造モデリングに基づいて、５つの潜在的な復帰変異（Ｓ４９Ａ、Ａ９９Ｖ、Ｎ７６Ｄ、Ｖ９５Ｍ、及びＫ１００Ｒ）を１９－１５の重鎖について同定し、７つの潜在的な復帰変異（Ｆ３８Ｖ、Ｙ５１Ｇ、Ｔ２Ａ、Ｑ４４Ｈ、Ｐ４６Ｆ、Ａ４８Ｇ、及びＴ６０Ｖ）を軽鎖について同定し；５つの潜在的な復帰変異（Ｓ４９Ａ、Ａ９９Ｖ、Ｎ７６Ｄ、Ｖ９５Ｍ、及びＫ１００Ｒ）を１９－２６の重鎖について同定し、７つの潜在的な復帰変異（Ｆ３８Ｖ、Ｙ５１Ｇ、Ｔ２Ａ、Ｑ４４Ｈ、Ｐ４６Ｆ、Ａ４８Ｇ、及びＴ６０Ｖ）を軽鎖について同定した。

表１に要約したように、１９－１５については、２つのヒト化重鎖可変領域及び２つのヒト化軽鎖可変領域を設計し、合計で４つの例示的なヒト化抗体を取得した。１９－２６については、２つのヒト化重鎖可変領域及び１つのヒト化軽鎖可変領域を設計し、合計で２つの例示的なヒト化抗体を取得した。

ヒト化重鎖／軽鎖可変領域及びヒトＩｇＧ１／カッパ定常領域（配列番号２２（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｎ、Ｘ４＝Ｐ）及び２３）をエンコードする配列を合成し、次いで、それぞれＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限部位を使用して、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）にサブクローニングした。すべての発現構築物を配列決定によって確認した。６つのヒト化抗ＣＤ３抗体を、実施例２に記載したプロトコルに従って一過性に発現させた。そして、ヒト化抗体を、実施例２に従って精製した。
（実施例９ 例示的なヒト化抗ＣＤ３抗体のヒト及びサルＣＤ３に対する結合能／親和性）

ヒト化抗ＣＤ３抗体のヒト及びサルＣＤ３εタンパク質に対する結合能を、実施例３のプロトコルに従って、ＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図６に示した。

ヒト化抗体を、ヒトＴ細胞に対する結合能について、実施例３のプロトコルを使用して、ＦＡＣＳによって更に試験した。結果を図７に示した。

ヒト化抗ＣＤ３抗体のヒト及びサルＣＤ３εタンパク質に対する結合親和性を、実施例６のプロトコルに従って、ＳＰＲによって測定した。結果を表５及び表６に要約した。

図６に示したように、すべての例示的なヒト化抗体は、ヒトＣＤ３εタンパク質（図６の（Ａ）及び図６の（Ｃ））、及びサルＣＤ３εタンパク質（図６の（Ｂ）及び図６の（Ｄ））に対する結合能を保持した。

図７に示したように、すべての例示的なヒト化抗体は、ヒトＴ細胞に対する結合能を保持した。

表５によると、すべての例示的なヒト化抗体は、ヒトＣＤ３タンパク質に対して高い結合親和性を保持した。表６から、すべての例示的なヒト化抗体がサルＣＤ３タンパク質に対する交差反応を保持したことが分かる。
（実施例１０ 例示的なヒト化抗ＣＤ３抗体はＴ細胞活性を誘導した）

抗体架橋が生じた場合の例示的なヒト化抗体のＣＤ３／ＴＣＲシグナル伝達に対する効果を、わずかな変更を加えた実施例７のプロトコルに従って、一次ヒトＴ細胞を使用して試験した。簡潔に説明すると、９６ウェル細胞培養プレートをウェルごとに１００μｌの５μｇ／ｍｌ Ｆ（ａｂ'）_２ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃガンマ二次抗体（カタログ番号：３１１６３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳを用いて各ウェルを２回すすぎ、異なる濃度の１００μｌの抗ＣＤ３抗体を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。一方、健康なヒトドナーの血液試料由来のＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって採取し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キット（カタログ番号：１１３４６Ｄ、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用して、ＰＢＭＣから単離した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を２．５×１０^５／ｍｌの生細胞密度で再懸濁した。２００μｌのＴ細胞懸濁液を抗ＣＤ３コーティングプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。５０μｌの細胞培養上清を、ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号：ＳＩＦ５０、Ｒ＆Ｄ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用したＩＦＮ－γレベル測定のために使用した。細胞を更に４８時間培養し、採取し、ＰＢＳによって３回すすぎ、２μｌのＰＥマウス抗ヒトＣＤ６９抗体（カタログ番号：５５５５３１、ＢＤ、ＵＳＡ）及び２μｌのＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ４抗体（カタログ番号：５６１８４２、ＢＤ、ＵＳＡ）と共に室温で３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離により採取し、ＰＢＳによって３回すすぎ、ＦＡＣＳによってＣＤ６９^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する比をフローサイトメトリーによって測定して、抗体架橋が生じた場合の抗体のＴ細胞活性化に対する効果を決定した。アッセイを３連で行い、ｍＡＢ２を陽性対照として使用した。結果を図８に示した。

遊離抗体のＴ細胞活性化に対する効果もまたアッセイした。簡潔に説明すると、健康なヒトドナーの血液試料由来のＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって採取し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キット（カタログ番号：１１３４６Ｄ、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用して、ＰＢＭＣから単離した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞をＲＰＭＩ完全培地に５×１０^５／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。１００μｌのＴ細胞懸濁液を細胞培養プレートに添加し、そこに１００μｌの異なる濃度の抗ＣＤ３抗体を添加した。３７℃、５％ＣＯ_２での２４時間のインキュベーション後、５０μｌの細胞培養上清を、ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号：ＳＩＦ５０、Ｒ＆Ｄ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用したＩＦＮ－γレベル測定のために使用した。細胞を更に４８時間培養し、採取し、ＰＢＳによって３回すすぎ、２μｌのＰＥマウス抗ヒトＣＤ６９抗体（カタログ番号：５５５５３１、ＢＤ、ＵＳＡ）及び２μｌのＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ４抗体（カタログ番号：５６１８４２、ＢＤ、ＵＳＡ）と共に室温で３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離により採取し、ＰＢＳによって３回すすぎ、ＦＡＣＳによってＣＤ６９^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する比を測定して、遊離抗体のＴ細胞活性化に対する効果を決定した。アッセイを３連で行い、ｍＡＢ２を陽性対照として使用した。結果を図９に示した。

図８に示したように、抗体架橋が生じた場合、すべての例示的なヒト化抗体は、Ｔ細胞を活性化し、インターフェロンγ放出を誘導し、Ｔ細胞表面のＣＤ６９発現を上方調節することができた。一方、図９に示したように、遊離抗体はＴ細胞活性に対して効果を有しなかった、すなわち、それらはインターフェロンγ放出又はＣＤ６９発現に影響を及ぼさなかった。これらの結果は、ヒト化抗体のＴ細胞活性化に対する効果が抗体架橋に依存すること、及びすべての例示的なヒト化抗体が陽性対照よりも有意に少ないＴ細胞活性化及びサイトカイン放出を誘導することを示唆した。
（実施例１１ ヒト又はサルタンパク質を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞株の構築）

ＨＥＫ２９３Ａ細胞を使用して、ヒトＣＤ２０、サルＣＤ２０、ヒトＣＤ１６Ａ、ヒトＣＤ３２Ａ、ヒトＣＤ３２Ｂ、又はヒトＣＤ６４を安定的に発現する細胞株を構築した。簡潔に説明すると、ヒトＣＤ２０、サルＣＤ２０、ヒトＣＤ１６Ａ、ヒトＣＤ３２Ａ、ヒトＣＤ３２Ｂ、及びヒトＣＤ６４をエンコードする配列（それぞれ、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、及び４０）を合成し、次いでｐＬＶ－ＥＧＦＰ（２Ａ）－Ｐｕｒｏベクター（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｉｎｏｖｏｇｅｎ、中国）の制限部位ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位の間にサブクローニングした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）における、得られた発現ベクター、ｐｓＰＡＸ及びｐＭＤ２．Ｇプラスミドの説明書に従った共トランスフェクションによって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｏｂｉｏｅｒ、ＮＪ、中国）においてレンチウイルスを生成した。共トランスフェクションの３日後、レンチウイルスをＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養上清から回収し、次いでＨＥＫ２９３Ａ細胞を感染させるために使用して、ヒトＣＤ２０、サルＣＤ２０、ヒトＣＤ１６Ａ、ヒトＣＤ３２Ａ、ヒトＣＤ３２Ｂ、又はヒトＣＤ６４を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞株、すなわち、それぞれ、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ２０、ＨＥＫ２９３Ａ／サルＣＤ２０、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ１６Ａ、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ３２Ａ、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ３２Ｂ、及びＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ６４を生成した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ａ細胞を、１０％ＦＢＳ（カタログ番号：ＦＮＤ５００、Ｅｘｃｅｌｌ、中国）及び０．２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（カタログ番号：Ａ１１１３８－０３、Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ（カタログ番号：ＳＨ３００２２．０１、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）において７日間培養した。ヒトＣＤ２０、サルＣＤ２０、ヒトＣＤ１６Ａ、ヒトＣＤ３２Ａ、ヒトＣＤ３２Ｂ、及びヒトＣＤ６４の発現を、市販の抗ヒト／サルＣＤ２０抗体（ＰＥ抗ヒトＣＤ２０抗体、カタログ番号：Ｅ－ＡＢ－Ｆ１０４５Ｄ、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ、中国）、抗ヒトＣＤ１６Ａ抗体（ＰＥ抗ヒトＣＤ１６抗体、カタログ番号：Ｅ－ＡＢ－Ｆ１００５Ｄ、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ、中国）、抗ヒトＣＤ３２Ａ抗体（ＰＥ抗ＣＤ３２Ｂ＋ＣＤ３２Ａ抗体、カタログ番号：ａｂ３０３５７、ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）、抗ヒトＣＤ３２Ｂ抗体（ＰＥ抗ＣＤ３２Ｂ＋ＣＤ３２Ａ抗体、カタログ番号：ａｂ３０３５７、ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）、及び抗ヒトＣＤ６４抗体（ＰＥ／Ｃｙ５抗ＣＤ６４抗体、カタログ番号：ａｂ１９２３３８、ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）を使用したＦＡＣＳによって確認した。
（実施例１２ 抗ＣＤ３抗体のＦｃ領域の機能改変）

抗ＣＤ３抗体がＦｃ領域を介してＦｃＲに結合した場合に、それらによって引き起こされるＣＤ３シグナル伝達活性化及びＴ細胞活性化を抑制するために、Ｆｃ領域を改変して各ＦｃＲアイソタイプに対する結合親和性を減少させた。

抗ＣＤ３抗体１５Ｈ３Ｌ３を、野生型重鎖ＩｇＧ１定常領域（配列番号２２、Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｎ、Ｘ４＝Ｐ）、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ１定常領域（配列番号２２、Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｎ、Ｘ４＝Ｐ）、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ１定常領域（配列番号２２、Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｎ、Ｘ４＝Ｇ）、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｎ２９７Ａ変異を有するＩｇＧ１定常領域（配列番号２２、Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ａ、Ｘ４＝Ｐ）、又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｎ２９７Ａ／Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ１定常領域（配列番号２２、Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ａ、Ｘ４＝Ｇ）、及び配列番号３２のヒトλ軽鎖定常領域を有するように操作した。得られた完全長抗体をそれぞれ１５Ｈ３Ｌ３－ＷＴ、１５Ｈ３Ｌ３－ＬＬ、１５Ｈ３Ｌ３－ＬＬＰ、１５Ｈ３Ｌ３－ＬＬＮ、及び１５Ｈ３Ｌ３－ＬＬＮＰと命名した。

可変領域及び定常領域をエンコードする配列をｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）のＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ部位の間に挿入して、発現ベクターを構築した。結果として得たベクターを、ＰＥＩを使用してＨＥＫ－２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。簡潔に説明すると、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞をＦｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ（登録商標）２９３発現培地（カタログ番号：１２３３８－０１８、Ｇｉｂｃｏ）において培養し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を１：３のＤＮＡ：ＰＥＩ比で使用して、発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションのために使用したＤＮＡの濃度は、細胞培養物１ミリリットル当たり１．５μｇであった。トランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞を、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーターにおいて、１２０ＲＰＭで振盪しながら培養した。１０～１２日後、細胞培養上清を回収し、５分間３５００ｒｐｍの遠心分離に供し、次いで０．２２μｍフィルムを使用して濾過して細胞残屑を除去した。次いで、モノクローナル抗体を、予め平衡化したプロテインＡアフィニティーカラム（カタログ番号：１７０４０５０１、ＧＥ、ＵＳＡ）を使用して精製及び濃縮し、溶出緩衝液（２０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０～３．５）を用いて溶出した。精製抗体をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に保持し、ＮａｎｏＤｒｏｐ装置を使用して濃度を決定した。

精製モノクローナル抗体のＣＤ１６Ａ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、及びＣＤ６４に対する結合能を、それぞれヒトＣＤ１６Ａ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、及びＣＤ６４を安定的に発現する実施例１１において構築したＨＥＫ２９３細胞を使用して、ＦＡＣＳによって試験した。簡潔に説明すると、５０μｌの培養培地中１０^５個のＨＥＫ２９３Ａ細胞を９６ウェルプレートに播種し、そこに５０μｌの段階希釈した１５Ｈ３Ｌ３抗体を添加した。４℃での１時間のインキュベーション後、９６ウェルプレートをＰＢＳＴによって３回すすぎ、ＰＥ－Ｆ（ａｂ'）_２ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体（１：５００、カタログ番号：Ｈ１０１０４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を添加した。４℃での１時間のインキュベーション後、９６ウェルプレートをＰＢＳによって３回すすぎ、ＦＡＣＳ装置（ＢＤ）を使用して細胞蛍光を測定した。結果を図１０に示した。

精製モノクローナル抗体を、ＣＤ３複合体に対する結合能について、Ｊｕｒｋａｔ細胞（カタログ番号：ＣＢＰ６０５２０、Ｎａｎｊｉｎｇ Ｃｏ－Ｂｉｏｅｒ、中国）を使用して、ＦＡＣＳによって試験した。簡潔に説明すると、５０μｌの培養培地中１０^５個のＪｕｒｋａｔ細胞を９６ウェルプレートに播種し、次いでそこに５０μｌの段階希釈した１５Ｈ３Ｌ３抗体を添加した。４℃での１時間のインキュベーション後、９６ウェルプレートをＰＢＳによって３回すすぎ、ＰＥヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：５００、カタログ番号：ＰＡ１－８６０７８、Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）を添加した。４℃での１時間のインキュベーション後、９６ウェルプレートをＰＢＳによって３回すすぎ、ＦＡＣＳ装置（ＢＤ）を使用して細胞蛍光を測定した。結果を図１１に示した。

遊離１５Ｈ３Ｌ３抗体のＴ細胞活性化に対する効果を、Ｔ細胞によるサイトカイン放出及び活性化マーカー発現を測定することによって試験した。健康なヒトドナーの血液試料由来のＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって採取し、次いでＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）に２．５×１０^５／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。細胞懸濁液を９６ウェルプレート上に２００μｌ／ウェルでプレーティングし、そこに５０μｌの異なる濃度の１５Ｈ３Ｌ３抗体を添加した。３７℃、５％ＣＯ_２での４８時間のインキュベーション後、細胞培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号：ＳＩＦ５０、Ｒ＆Ｄ、ＵＳＡ）を使用してＩＦＮ－γレベルを測定した。ＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳによって３回すすぎ、２μｌのＰＥマウス抗ヒトＣＤ６９抗体（カタログ番号：５５５５３１、ＢＤ、ＵＳＡ）、２μｌのＢＶ６０５マウス抗ヒトＣＤ２５抗体（カタログ番号：５６２６６０、ＢＤ、ＵＳＡ）、及び２μｌのＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ４抗体（カタログ番号：５６１８４２、ＢＤ、ＵＳＡ）を添加し、室温で３０分間インキュベートし、遠心分離し、ＰＢＳによって３回すすぎ、ＦＡＣＳによってＣＤ６９^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞、又はＣＤ６９^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する比を測定した。結果を図１２に示した。

架橋を有する１５Ｈ３Ｌ３抗体のＣＤ４^＋Ｔ細胞活性化に対する効果もまた、Ｔ細胞によるサイトカイン放出及び活性化マーカー発現を測定することによって試験した。簡潔に説明すると、９６ウェル細胞培養プレートをウェルごとに１００μｌの５μｇ／ｍｌ Ｆ（ａｂ'）_２ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃガンマ二次抗体（カタログ番号：３１１６３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳを用いて各ウェルを２回すすぎ、異なる濃度の１００μｌの１５Ｈ３Ｌ３抗体を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。一方、健康なヒトドナーの血液試料由来のＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって採取し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キット（カタログ番号：１１３４６Ｄ、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用して、ＰＢＭＣから単離した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞をＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）に２．５×１０^５／ｍｌの生細胞密度で再懸濁した。細胞懸濁液を抗ＣＤ３コーティングプレートに２００μｌ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートした。ウェル１つ当たり５０μｌの細胞培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号：ＳＩＦ５０、Ｒ＆Ｄ、ＵＳＡ）を使用してＩＦＮ－γレベルを測定した。細胞を回収し、ＰＢＳによって３回すすぎ、２μｌのＰＥマウス抗ヒトＣＤ６９抗体（カタログ番号：５５５５３１、ＢＤ、ＵＳＡ）、２μｌのＢＶ６０５マウス抗ヒトＣＤ２５抗体（カタログ番号：５６２６６０、ＢＤ、ＵＳＡ）、及び２μｌのＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ４抗体（カタログ番号：５６１８４２、ＢＤ、ＵＳＡ）を添加し、室温で３０分間インキュベートし、遠心分離し、ＰＢＳによって３回すすぎ、ＦＡＣＳによってＣＤ６９^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞、又はＣＤ６９^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する比を測定した。アッセイを３連で行い、結果を図１３に示した。

図１０に示したように、Ｆｃ領域に変異を有するすべての抗体は、４つのＦｃＲに対して、野生型Ｆｃ領域のものよりも有意に低い結合能を示した。これらのうち、１５Ｈ３Ｌ３－ＬＬＰＮ及び１５Ｈ３Ｌ３－ＬＬＮのＣＤ１６Ａ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、及びＣＤ６４に対する結合能は、ほぼ検出限界未満であり、１５Ｈ３Ｌ３－ＬＬＰは、ＣＤ３２Ａ及びＣＤ３２Ｂに対して弱い結合能を保持し、１５Ｈ３Ｌ３－ＬＬは、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、及びＣＤ３２Ｂに対して、他のバリアントと比較して比較的高い結合能を示した。

図１１によると、Ｆｃ領域における変異は、抗ＣＤ３抗体のＣＤ３に対する結合能に対して効果を有しなかった。

図１２において、Ｆｃ領域に変異を有するすべての抗体が、ＩＦＮ－γ放出、及びＣＤ６９及びＣＤ２５などのＴ細胞成熟マーカーの発現を、野生型Ｆｃ領域のものと比較して有意に減少させたことが分かる。具体的には、サイトカイン（例えばＩＦＮ－γ）放出及びＴ細胞成熟マーカー（例えばＣＤ６９及びＣＤ２５）発現は、１５Ｈ３Ｌ３－ＬＬＰ、１５Ｈ３Ｌ３－ＬＬＰＮ、又は１５Ｈ３Ｌ３－ＬＬＮを用いて処理したＰＢＭＣにおいてほぼ検出不能であったが、１５Ｈ３Ｌ３－ＬＬは、サイトカイン（例えばＩＦＮ－γ）放出及びＴ細胞成熟マーカー（例えばＣＤ６９及びＣＤ２５）発現をある程度誘導することができた。

更に、図１３に示したように、Ｆｃ領域変異は、抗体架橋が生じた場合、抗ＣＤ３抗体のＴ細胞活性化に対する効果を変化させなかった。換言すれば、抗Ｆｃ二次抗体に結合したＦｃ領域を介して抗体架橋が生じた場合、変異型Ｆｃ領域を有する抗ＣＤ３抗体は、サイトカイン（例えばＩＦＮ－γ）放出及びＴ細胞成熟マーカー（例えばＣＤ６９及びＣＤ２５）発現を、野生型Ｆｃ領域のものと同等のレベルで誘導することができた。
（実施例１３ ＣＤ３及びＣＤ２０に対する二重特異性抗体の構築及び発現）

二重特異性抗体を非対称フォーマット（ＣＤ２０：ＣＤ３＝２：１）で構築し、構造を図１４に示した。ＣＤ２０結合部分は、それぞれ配列番号２６及び２７のアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖可変領域を利用し（抗ＣＤ２０抗体ＭＩＬ６２、ＣＮ１０８１３８１８６Ｂ号における詳細を参照されたい）、ＣＤ３結合部分は、１５Ｈ２Ｌ３又は１５Ｈ３Ｌ３の重鎖及び軽鎖可変領域を使用した。３つの半抗体断片、すなわち、ＭＩＬ２２０（配列番号２６の抗ＣＤ２０重鎖可変領域、配列番号３３のホールを有する重鎖定常領域、配列番号２７の抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、及び配列番号３１の軽鎖定常領域を含有）、ＭＩＬ２２１－１（配列番号２９のアミノ酸配列を有する抗ＣＤ２０ ＶＨ－リンカー－抗ＣＤ２０ ＶＬ－リンカー－１５Ｈ２Ｌ３ ＶＨ、配列番号３４のノブを有する重鎖定常領域、配列番号１８の１５Ｈ２Ｌ３の軽鎖可変領域、及び配列番号３２の軽鎖定常領域を含有）、及びＭＩＬ２２１－２（配列番号３０のアミノ酸配列を有する抗ＣＤ２０ ＶＨ－リンカー－抗ＣＤ２０ ＶＬ－リンカー－１５Ｈ３Ｌ３ ＶＨ、配列番号３４のノブを有する重鎖定常領域、配列番号１８の１５Ｈ３Ｌ３の軽鎖可変領域、及び配列番号３２の軽鎖定常領域を含有）を、ＺＬ２００５１００６４３３５．０号に記載のＧＳベクターを使用して作製した。

ＭＩＬ２２０のＶＨ、及びＭＩＬ２２１－１及びＭＩＬ２２１－２の抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ－リンカー－抗ＣＤ３ ＶＨをエンコードする配列を合成した。ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩで消化し、次いで、それぞれ重鎖定常領域を含有するベクターにクローニングした。ＭＩＬ２２０のＶＬ、ＭＩＬ２２１－１のＶＬ、及びＭＩＬ２２１－２のＶＬをエンコードするＤＮＡ配列を合成し、ＣｌａＩ及びＢｓｉＷＩで消化し、軽鎖定常領域を含有するベクターにライゲーションした。軽鎖領域をエンコードするＤＮＡ配列をＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、重鎖領域をエンコードする配列をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化した。ｐＣＭＶ共断片（ｐＣＭＶ－ｃｏｆｒａｇｍｅｎｔ）プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ＧＳベクターをＣｌａＩ及びＸｈｏＩで消化した。４つのＤＮＡ断片を精製し、ライゲーションし、細菌に形質転換した。単一細菌コロニーをピックアップし、配列決定し、半抗体断片をエンコードする正確な配列を含有する発現ベクターを取得し、ＧＳ－ＭＩＬ２２０、ＧＳ－ＭＩＬ２２１－１、及びＧＳ－ＭＩＬ２２１－２と命名した。上で取得した発現ベクターを、実施例１２のプロトコルに従って、ＰＥＩを使用してＨＥＫ－２９３Ｆ細胞（Ｃｏｂｉｏｅｒ、中国）にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞を、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーターにおいて、１２０ＲＰＭで振盪しながら培養した。１０～１２日後、細胞培養上清を回収し、５分間３５００ｒｐｍの遠心分離に供し、次いで０．２２μｍフィルムフィルターを使用して濾過して細胞残屑を除去した。次いで、半抗体断片を、予め平衡化したプロテインＡアフィニティーカラム（カタログ番号：１７０４０５０１、ＧＥ、ＵＳＡ）を使用して精製し、溶出緩衝液（２０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０～３．５）を用いて溶出した。緩衝液交換後、断片をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に保持し、ＮａｎｏＤｒｏｐ装置を使用して濃度を決定した。
（実施例１４ ＣＤ３及びＣＤ２０に対する二重特異性抗体の調製）

精製半抗体断片をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて組み立てた。簡潔に説明すると、それぞれ１：１のモル比で、ＭＩＬ２２０及びＭＩＬ２２１－１を混合し、ＭＩＬ２２０及びＭＩＬ２２１－２もまた混合した。混合物にＴｒｉｓ塩基緩衝液をｐＨ８．０まで、その後還元剤グルタチオン（ＧＳＨ）を添加し、低速で撹拌しながら２５℃で一晩反応させた。次いで、混合物に２Ｍ酢酸溶液を添加して、ｐＨを５．５に調整した。還元剤を限外濾過によって除去して、反応を停止した。組み立てられた抗体を、陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製した。陰イオン交換カラムを低塩Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化し、抗体試料を充填した。カラムを通過した成分を採取し、ＵＶ２８０がベースラインに向かうまで、低塩Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）によってすすいだ。採取した試料を、酢酸溶液を使用してｐＨ５．５に調整し、３０ｋＤａ超濾過管を使用して１ｍｌに濃縮し、０．２μｍ膜を使用して濾過した。陽イオン交換カラムを低濃度酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化し、抗体試料を充填した。低濃度酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を使用してカラムを再度平衡化し、２０ＣＶの酢酸溶液（０～１００％の濃度、ｐＨ５．５）を使用して溶出を行った。

ＭＩＬ２２０及びＭＩＬ２２１－１から成る二重特異性抗体をＭＢＳ３０３－１と命名し、ＭＩＬ２２０及びＭＩＬ２２１－２から構成される二重特異性抗体をＭＢＳ３０３－２と称した。質量スペクトルによって測定された９０％より高い純度を有する精製抗体を以下で更に特徴付けた。
（実施例１５ 二重特異性抗体はヒトＣＤ３、サルＣＤ３及びＣＤ２０と結合した）

精製二重特異性抗体を、組換えヒト及びサルＣＤ３εタンパク質に対する結合能について、実施例３のプロトコルに従って、ＥＬＩＳＡによって試験した。ＣＤ３及びＣＤ２０に対するＲＥＧＮ１９７９（米国特許出願公開第２０１４／００８８２９５Ａ１号に開示されているアミノ酸、又は代替的にｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝１１０３５に公開されているＩＮＮ１１０３５＿Ｈ、ＩＮＮ１１０３５＿Ｌ、及びＩＮＮ１１０３５＿Ｍを使用して調製）、及びＣＤ２０－ＴＣＢ（ＷＯ２０１８２２００９９Ａ１号に開示されているアミノ酸、又は代替的にｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝１１１４５に公開されているＩＮＮ１１１４５＿Ｈ、ＩＮＮ１１１４５＿Ｌ、ＩＮＮ１１１４５＿Ｍ、及びＩＮＮ１１１４５＿Ｎを使用して調製）を参照抗体として使用し、抗ＨＥＬ抗体（カタログ番号：ＬＴ１２０３１、ＬｉｆｅＴｅｉｎ、ＵＳＡ）を陰性対照として使用した。結果を図１５に示した（図１５のＡ及びＢ）。

ＨＥＫ２９３Ａ細胞に発現したヒト及びサルＣＤ２０タンパク質に対する二重特異性抗体の結合能を、ヒト又はサルＣＤ２０を安定的に発現する実施例１１において構築したＨＥＫ２９３細胞を使用して、実施例１２のプロトコルに従って、ＦＡＣＳによって更に試験した。結果を図１６に示した（図１６のＡ及びＢ）。

二重特異性抗体のヒト及びサルＣＤ３に対する結合能を、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びサルＰＢＭＣを使用して、ＰＢＭＣを健康なサルの血液試料から密度勾配遠心分離によって採取したことを除いては実施例１２のプロトコルに従って、ＦＡＣＳによって更に試験した。結果を図１６に示した（図１６のＣ及びＤ）。

図１５に示したように、ＭＢＳ３０３－１、ＭＢＳ３０３－２、及びＣＤ２０－ＴＣＢはヒト及びサルＣＤ３εと特異的に結合したが、ＲＥＧＮ１９７９はヒト又はサルＣＤ３εと結合しなかった。

図１６によると（図１６のＡ及びＢ）、試験されたすべての二重特異性抗体は、細胞表面に発現したヒト及びサルＣＤ２０に結合し、ＭＢＳ３０３－１、ＭＢＳ３０３－２、及びＣＤ２０－ＴＣＢのヒトＣＤ２０に対する結合能は、ＲＥＧＮ１９７９のものよりも有意に高かった。図１６に示したように（図１６のＣ及びＤ）、すべての二重特異性抗体は、細胞表面のヒト及びサルＣＤ３複合体と結合し、ＭＢＳ３０３－１、ＭＢＳ３０３－２、及びＲＥＧＮ１９７９のヒトＣＤ３複合体に対する結合能は、ＣＤ２０－ＴＣＢのものよりも有意に高かった。
（実施例１６ ＳＰＲによる二重特異性抗体の結合親和性決定）

本開示の二重特異性抗体のヒト及びサルＣＤ３εに対する結合親和性を、実施例６のプロトコルに従って、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）８Ｋ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用して試験した。

ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）によって測定した結合親和性を表７に要約した。ＲＥＧＮ１９７９のヒト又はサルＣＤ３εに対する結合親和性は検出不能であり、他の二重特異性抗体の結合親和性はｎＭのオーダーであった。ＦＡＣＳ試験結果と一致して、ＭＢＳ３０３－１及びＭＢＳ３０３－２は、ヒト及びサルＣＤ３εサブユニットに対して、ＣＤ２０－ＴＣＢよりも高い結合親和性を示した。
（実施例１７ 二重特異性抗体のＴ細胞活性化に対する効果）

ＣＤ３／ＴＣＲシグナル伝達の活性化に対する遊離二重特異性抗体の効果を、以下の変更を加えた実施例１２のプロトコルに従って、一次ヒトＰＢＭＣを使用して試験した。具体的には、細胞培養上清を４８時間のインキュベーション後に採取し、ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号：４３０１０７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ；カタログ番号：４３０２０７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）によって、製造業者の説明書に従って、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの両方のレベルを測定した。

結果を図１７に示した（Ａ及びＢ）。ＲＥＧＮ１９７９によって誘導されたＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αレベルは、ＣＤ２０－ＴＣＢ、ＭＢＳ３０３－１、又はＭＢＳ３０３－２によって誘導されたものよりも有意に低く、ＣＤ２０－ＴＣＢは最も高いサイトカイン放出を誘導した。図１７は、Ｔ細胞活性化マーカーの発現レベルを示し（Ｃ、Ｄ、及びＥ）、これはサイトカインレベル試験結果と一致した。具体的には、ＲＥＧＮ１９７９は、ＣＤ２０－ＴＣＢ、ＭＢＳ３０３－１、及びＭＢＳ３０３－２よりも有意に低い活性でＴ細胞活性化を誘導し、ＣＤ２０－ＴＣＢの活性は、Ｔ細胞活性化の誘導に関して最も高かった。
（実施例１８ 二重特異性抗体はＴ細胞活性化及びＰＢＭＣによるＣＤ２０^＋腫瘍細胞の死滅を誘導した）

二重特異性抗体を、ＰＢＭＣによるＣＤ２０^＋Ｒａｊｉ細胞の死滅を誘導する能力について更に試験した。Ｒａｊｉ細胞を、緑色蛍光を有するカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルを用いて標識した。具体的には、Ｒａｊｉ細胞をＲＰＭＩ完全培地に１．０×１０^６／ｍｌの細胞密度で再懸濁し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、カタログ番号：Ｃ３４５５４Ｉ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて、細胞を２．５μＭ ＣＦＳＥと共に３７℃で１０分間インキュベートしたことを除いては製造業者の説明書に従って標識した。標識細胞をＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）に２．５×１０^５／ｍｌの生細胞密度で再懸濁した。健康なヒトドナーの血液試料由来のＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって採取し、ＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）に５×１０^５／ｍｌの生細胞密度で再懸濁した。Ｒａｊｉ細胞（１００μｌ）及びＰＢＭＣ（１００μｌ）を２：１のエフェクター－標的比で９６ウェルプレートに播種し、次いで異なる濃度の１００μｌの二重特異性抗体を添加した。細胞／抗体混合物を３７℃及び５％ＣＯ_２のインキュベーターにおいて４８時間インキュベートした。

５０μｌの細胞培養上清を各ウェルから採取し、３つのキット（カタログ番号：４３０１０７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ；カタログ番号：Ｓ２０５０、Ｒ＆Ｄ、ＵＳＡ；カタログ番号：４３０２０７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）を使用して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αレベルを測定した。結果を図１９に示した。

Ｒａｊｉ細胞の生存率を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（カタログ番号：Ｌ３４９６４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）によって測定した。上の細胞／抗体混合物をＰＢＳによって３回すすぎ、染料と共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳによって更に３回すすぎ、ＦＡＣＳ測定に供した。緑色蛍光を有する細胞（Ｒａｊｉ細胞）の死亡率を決定し、結果を図１８に示した。

図１８によると、すべての二重特異性抗体は、Ｔ細胞媒介Ｒａｊｉ細胞死を誘導することができた。抗体のうち、ＲＥＧＮ１９７９は、Ｒａｊｉ細胞死の誘導において最も弱い活性を有し、ＭＢＳ３０３－１及びＭＢＳ３０３－２の活性は、ＲＥＧＮ１９７９のものよりも高く、ＣＤ２０－ＴＣＢのものと同等か又はそれよりも少し弱かった。

図１９に示したように、すべての二重特異性抗体は、Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－α放出を誘導した。抗体のうち、ＣＤ２０－ＴＣＢは、最も多いサイトカイン放出を誘導し、ＭＢＳ３０３－１及びＭＢＳ３０３－２によって誘導されたサイトカインレベルは、ＣＤ２０－ＴＣＢによって誘導されたものよりも遥かに低く、ＲＥＧＮ１９７９によって誘導されたものと同等か又はそれよりも少し高かった。
（実施例１９ 二重特異性抗体はＣＤ３^＋Ｔ細胞活性化及びＣＤ３^＋Ｔ細胞によるＣＤ２０^＋腫瘍細胞の死滅を特異的に誘導した）

二重特異性抗体を、Ｔ細胞によるＣＤ２０^＋腫瘍細胞の標的化死滅を誘導する能力について更に試験した。実施例１１において構築したＨＥＫ２９３Ａ／ｈＣＤ２０細胞をＣＤ２０^＋腫瘍細胞として使用し、親ＨＥＫ２９３Ａ細胞をＣＤ２０^－腫瘍細胞として使用した。ｐＬＶ－ＥＧＦＰ（２Ａ）－Ｐｕｒｏプラスミドを使用してＨＥＫ２９３Ａ／ｈＣＤ２０細胞を調製し、これにより緑色蛍光を有するＧＦＰを過剰発現させた一方で、ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、実施例１８のプロトコルに従って、緑色蛍光を有するＣＦＳＥを用いて標識した。

簡潔に説明すると、健康なヒトドナーの血液試料由来のＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって採取し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キット（カタログ番号：１１３４６Ｄ、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用して、ＰＢＭＣから単離した。標的細胞（ＨＥＫ２９３Ａ／ｈＣＤ２０細胞／ＨＥＫ２９３Ａ細胞）及びエフェクター細胞（Ｔ細胞）を５分間１２００ｒｐｍの遠心分離に供し、次いでＲＩＰＭ１６４０完全培地（ＲＩＰＭ１６４０＋１０％ＦＢＳ）に再懸濁し、ここで生細胞は約９５％を占めた。標的細胞及びＴ細胞をそれぞれ２．５×１０^５／ｍｌ及び５×１０^５／ｍｌの細胞密度に調整し、２：１のエフェクター－標的比で１００μｌの標的細胞及び１００μｌのＴ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。次いで、５０μｌの希釈抗体（１：１０の希釈倍率、１０μｇ／ｍｌから出発）を各ウェルに添加した。細胞／抗体混合物を３７℃及び５％ＣＯ_２のインキュベーターにおいて４８時間インキュベートした。ＡＤＣＣ活性が強化された、非フコシル化された抗ＣＤ２０単一特異性抗体ＭＩＬ６２（ＣＮ１０８１３８１８６Ｂ号に開示されているアミノ酸配列及び調製方法を使用して調製）、ＲＥＧＮ１９７９、及びＣＤ２０－ＴＣＢを陽性対照として使用した。

４８時間のインキュベーション後、５０μｌの細胞培養上清を各ウェルから採取し、２つのキット（カタログ番号：ＳＩＦ５０、Ｒ＆Ｄ、ＵＳＡ；カタログ番号：４３０２０７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）を使用して、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αレベルを測定した。結果を図２１に示した。

腫瘍細胞の生存率を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（カタログ番号：Ｌ３４９６４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）によって測定した。具体的には、上の細胞／抗体混合物をＰＢＳによって３回すすぎ、染料と共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳによって更に３回すすぎ、ＦＡＣＳ試験に供した。緑色蛍光を有する細胞（ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞又はＨＥＫ２９３細胞）の死亡率を決定し、結果を図２０に示した。

図２０によると、すべての二重特異性抗体は、Ｔ細胞によるＣＤ２０^＋腫瘍細胞の標的化死滅を誘導することができたが、ＣＤ２０^－細胞に対してはそのような効果を有しなかった。そして、二重特異性抗体は、単一特異性抗ＣＤ２０抗体ＭＩＬ６２よりも有意に多くのＣＤ２０^＋腫瘍細胞を死滅させた。二重特異性抗体のうち、ＲＥＧＮ１９７９は、標的化死滅の誘導において最も弱い活性を有し、ＭＢＳ３０３－１及びＭＢＳ３０３－２の活性は、ＲＥＧＮ１９７９のものよりも高く、ＣＤ２０－ＴＣＢのものと同等か又はそれよりも少し弱かった。

図２１に示したように、二重特異性抗体によって誘導されたＴ細胞によるＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α放出は、ＣＤ２０^＋細胞によって媒介され、特異性抗体は、ＣＤ２０^－細胞に関しては、Ｔ細胞によるサイトカイン放出を誘導することができなかった。二重特異性抗体のうち、ＣＤ２０－ＴＣＢは、最も多いサイトカイン放出を誘導し、ＭＢＳ３０３－１及びＭＢＳ３０３－２によって誘導されたサイトカインレベルは、ＣＤ２０－ＴＣＢによって誘導されたものよりも遥かに低かった。
（実施例２０ ＭＩＬ６２前処理はＰＢＭＣによる二重特異性抗体誘導サイトカイン放出を減少させた）

ＭＩＬ６２と組み合わせて使用した場合における本開示の二重特異性抗体の、ＰＢＭＣによるサイトカイン放出に対する効果を試験した。簡潔に説明すると、健康なヒトドナーの血液試料由来のＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって採取し、ＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）に再懸濁し、２つのアリコートに分けた。一方のアリコートは、ＭＩＬ６２を１μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、３７℃及び５％ＣＯ_２のインキュベーターにおいて４８時間インキュベートし、他方は、そのまま、３７℃及び５％ＣＯ_２のインキュベーターにおいて４８時間インキュベートした。ＰＢＭＣをＰＢＳによって３回すすぎ、ＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）に５×１０^５／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。各ウェルに２００μｌのＰＢＭＣ懸濁液を添加した。ＭＩＬ６２で前処理したＰＭＢＣについては、各ウェルに１μｇ／ｍｌの最終濃度のＭＩＬ６２、及び異なる濃度のＭＢＳ３０３－２又はＭＢＳ３０３－１を添加した。ＭＩＬ６２での前処理をしなかったＰＢＭＣについては、各ウェルに異なる濃度のＭＢＳ３０３－２を添加した。ＰＢＭＣ／抗体混合物を３７℃及び５％ＣＯ_２のインキュベーターにおいて４８時間インキュベートし、５０μｌの細胞培養上清を、２つのＥＬＩＳＡキット（カタログ番号：ＳＩＦ５０、Ｒ＆Ｄ、ＵＳＡ；カタログ番号：４３０２０７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用したＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αレベルの測定のために採取した。細胞を採取し、ＰＢＳによって３回すすぎ、２μｌのＰＥマウス抗ヒトＣＤ６９抗体（カタログ番号：５５５５３１、ＢＤ、ＵＳＡ）、２μｌのＢＶ６０５マウス抗ヒトＣＤ２５抗体（カタログ番号：５６２６６０、ＢＤ、ＵＳＡ）、及び２μｌのＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ４抗体（カタログ番号：５６１８４２、ＢＤ、ＵＳＡ）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離により採取し、ＰＢＳによって３回すすぎ、ＦＡＣＳによってＣＤ６９^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞、又はＣＤ６９^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する比を測定した。

図２２に示したように、二重特異性抗体単独で処理した場合、ＰＢＭＣは、比較的高いレベルのＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αなどのサイトカインを放出し、比較的高いレベルのＣＤ６９及びＣＤ２５などのＴ細胞活性化マーカーを発現した。しかしながら、ＰＢＭＣをＭＩＬ６２で前処理し、その後ＭＩＬ６２及び本開示の二重特異性抗体を組み合わせて使用した場合、サイトカイン放出又はＴ細胞活性化マーカー発現はほぼ観察されなかった。
（実施例２１ ＭＩＬ６２と組み合わせた例示的な二重特異性抗体の抗腫瘍効果）

本開示の二重特異性抗体と組み合わせたＭＩＬ６２の抗腫瘍効果を、Ｔ細胞によるＣＤ２０^＋細胞（すなわちＨＥＫ２９３Ａ／ｈＣＤ２０細胞）の死滅によって試験した。簡潔に説明すると、健康なヒトドナーの血液試料由来のＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって採取し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キット（カタログ番号：１１３４６Ｄ、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用して、ＰＢＭＣから単離した。ｐＬＶ－ＥＧＦＰ（２Ａ）－Ｐｕｒｏプラスミドを使用することによってＨＥＫ２９３Ａ／ｈＣＤ２０細胞を調製し、これにより緑色蛍光を有するＧＦＰを過剰発現させた。標的細胞及びエフェクター細胞（すなわちＴ細胞）を５分間１２００ｒｐｍの遠心分離に供し、次いでＲＩＰＭ１６４０完全培地（ＲＩＰＭ１６４０＋１０％ＦＢＳ）に再懸濁し、ここで約９５％が生細胞であった。標的細胞及びＴ細胞をそれぞれ２．５×１０^５／ｍｌ及び５×１０^５／ｍｌの細胞密度に調整し、２：１のエフェクター－標的比で１００μｌの標的細胞及び１００μｌのＴ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。得られた混合懸濁液を２つのアリコートに分け、一方には５０μｌの希釈二重特異性抗体（１０倍希釈、１０μｇ／ｍｌから出発）を添加し、他方には１μｇ／ｍｌの最終濃度のＭＩＬ６２及び５０μｌの希釈二重特異性抗体（１０倍希釈、１０μｇ／ｍｌから出発）を添加した。細胞／抗体混合物を３７℃及び５％ＣＯ_２のインキュベーターにおいて４８時間インキュベートした。ＨＥＫ２９３Ａ／ｈＣＤ２０細胞の生存率を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（カタログ番号：Ｌ３４９６４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）によって測定した。具体的には、上の細胞／抗体混合物をＰＢＳによって３回すすぎ、染料と共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳによって３回すすぎ、ＦＡＣＳ測定に供した。緑色蛍光を有する細胞（ＨＥＫ２９３Ａ／ｈＣＤ２０細胞）の死亡率を決定した。

結果を図２３に示し、ＭＩＬ６２及び二重特異性抗体は相乗的な抗腫瘍効果をもたらした。ＥＣ_５０は、ＭＢＳ３０３－１処理単独の場合、７．６ｎｇ／ｍｌであり、ＭＢＳ３０３－１をＭＩＬ６２と組み合わせて使用した場合、３．２ｎｇ／ｍｌまで減少した。ＭＢＳ３０３－２は、単独で使用した場合、９．８ｎｇ／ｍｌのＥＣ_５０を有し、ＭＩＬ６２と共に使用した場合、３．９ｎｇ／ｍｌのＥＣ_５０を有した。
（実施例２２ 二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果）

ルシフェラーゼを発現するＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ－ｌｕｃ細胞と命名、Ｙｉｃｏｎ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）をＰＢＭＣヒト化免疫不全マウス（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄ、中国）に移植することによって構築した動物モデルを使用して、ＭＢＳ３０３－２のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を検討した。一部のマウスに、健康なヒトドナーから採取した１００μｌのＰＢＭＣを５×１０^７／ｍｌの細胞密度で尾静脈注射によって注射した。３日後、Ｒａｊｉ－ｌｕｃ細胞をＰＢＳに５×１０^６／ｍｌの密度で再懸濁し、１００μｌのＲａｊｉ－ｌｕｃ細胞懸濁液を、ＰＢＭＣを投与されたか又はされていない動物に尾静脈注射によって注射し、この日を０日目とした。動物を５つの群に１群当たり８匹で無作為に割り付け、ＰＢＳ又はＭＢＳ３０３－２を３日目、１０日目、及び１７日目に、それぞれ０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、及び０．５ｍｇ／ｋｇで投与した。

腫瘍サイズ、マウスの状態、及びマウスの体重を経時的にモニタリングした。マウスを健康状態について毎日観察し、Ｒａｊｉ－ｌｕｃ注射から死亡又は安楽死までの生存時間を記録した。安楽死は、１）マウスの体重が２０％超減少した場合、２）マウスがもはや積極的に水を飲むことができない場合、３）マウスの腫瘍量が平均照射（ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ^２／ｓｒ）に基づいて５×１０^７に達した場合、及び／又は４）獣医師によって決定される、動物の福祉及び／又は実験に悪影響を及ぼす異常なことが起こった場合に行われた。各群における担腫瘍マウスの生存時間中央値（ｍｅｄｉａｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅ：ＭＳＴ）及び処置群における寿命延長率（ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ：ＩＬＳ％）を決定した。ＩＬＳ％は、（処置群における生存日数中央値／対照群における生存日数中央値－１）×１００％として算出した。対照群と比べて統計的有意性が見出された場合、処置は効果的であると考えられた。異なる群に割り付けた後、マウスにルシフェラーゼの基質（１５ｍｇ／ｍｌ、１０μｌ／ｇ体重）を、週に１回、腹腔内注射し、イソフルランを用いた麻酔に供し、その後、マウスにおける腫瘍増殖を特徴付けるために、小動物イメージング装置（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して蛍光シグナルを収集した。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、群間のシグナル差を解析し、カプラン・マイヤー及びログランクを使用して、担腫瘍マウスの生存時間に関する群の差を解析した。統計的有意性はＰ＜０．０５の場合に見出された。

図２４Ａ及び図２４Ｂに示したように（Ａ及びＢ）、イメージング又は蛍光強度解析のいずれも、ＭＢＳ３０３－２が腫瘍増殖を用量依存的に有意に阻害したことを示した。図２４Ｃによると（Ｃ）、ＭＢＳ３０３－２は、担腫瘍マウスの生存期間を有意に延長し、そのｉｎ ｖｉｖｏにおける明白な抗腫瘍活性を示唆した。

本出願における配列を以下に要約する。

このように、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明したが、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、その多くの明白な変形が可能であるので、上記の段落によって定義された本発明は、上記の説明に記載された特定の詳細に限定されないことが理解されるべきである。

Claims (20)

1. ＣＤ３に結合し、ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域、及びＶＨ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域、及びＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域、及びＶＬ ＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域を備え、前記ＶＨ ＣＤＲ１領域、前記ＶＨ ＣＤＲ２領域、前記ＶＨ ＣＤＲ３領域、前記ＶＬ ＣＤＲ１領域、前記ＶＬ ＣＤＲ２領域、及び前記ＶＬ ＣＤＲ３領域が、（１）それぞれ、配列番号１（Ｘ１＝Ｓ）、２（Ｘ１＝Ｄ）、３（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｙ）、４（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｓ）、５（Ｘ１＝Ｑ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｓ）、及び６（Ｘ１＝Ｖ）；（２）それぞれ、配列番号１（Ｘ１＝Ｔ）、２（Ｘ１＝Ｉ）、３（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｙ）、４（Ｘ１＝Ｑ、Ｘ２＝Ｎ）、５（Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｑ、Ｘ３＝Ｒ）、及び６（Ｘ１＝Ｖ）；（３）それぞれ、配列番号１（Ｘ１＝Ｔ）、２（Ｘ１＝Ｄ）、３（Ｘ１＝Ｉ、Ｘ２＝Ｗ）、４（Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｓ）、５（Ｘ１＝Ｎ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｈ）、及び６（Ｘ１＝Ａ）；又は（４）それぞれ、配列番号１（Ｘ１＝Ｔ）、２（Ｘ１＝Ｉ）、３（Ｘ１＝Ｉ、Ｘ２＝Ｙ）、４（Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ｎ）、５（Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｓ）、及び６（Ｘ１＝Ｖ）のアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
2. 前記重鎖可変領域が、配列番号７～１４のいずれか１つと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
3. 前記軽鎖可変領域が、配列番号１５～２１のいずれか１つと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
4. 前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、（１）それぞれ、配列番号７及び１５；（２）それぞれ、配列番号８及び１６；（３）それぞれ、配列番号９及び１７；（４）それぞれ、配列番号９及び１８；（５）それぞれ、配列番号１０及び１７；（６）それぞれ、配列番号１０及び１８；（７）それぞれ、配列番号１１及び１９；（８）それぞれ、配列番号１２及び２０；（９）それぞれ、配列番号１３及び２０；又は（１０）それぞれ、配列番号１４及び２１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
5. 前記重鎖可変領域に連結されている、配列番号２２（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｎ、Ｘ４＝Ｐ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｎ、Ｘ４＝Ｇ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ａ、Ｘ４＝Ｐ；又はＸ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ａ、Ｘ４＝Ｇ）のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、及び前記軽鎖可変領域に連結されている、配列番号２３又は３２のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を備える、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
6. （ａ）ヒトＣＤ３と結合する；（ｂ）サルＣＤ３と結合する；（ｃ）遊離抗体又はその抗原結合部分として存在する場合、Ｔ細胞を活性化しない；及び／又は（ｄ）架橋した場合、Ｔ細胞を活性化する、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
7. ｉ）請求項１から６のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を有する、ＣＤ３に対する抗原結合ドメイン、及び
   ｉｉ）疾患関連抗原に対する抗原結合ドメイン、ここで、前記疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原、感染症関連抗原、又は炎症性疾患関連抗原である
   を備える二重特異性抗体。
8. 前記疾患関連抗原がＣＤ２０であり、Ｄ２０に対する前記抗原結合ドメインがＣＤ２０と結合する抗体又はその抗原結合部分を有する、請求項７に記載の二重特異性抗体。
9. ＣＤ３に対する１つの抗原結合ドメイン及びＣＤ２０に対する２つの抗原結合ドメインを備える、請求項８に記載の二重特異性抗体。
10. ｉ）抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び重鎖定常領域を有する第１のポリペプチド、
    ｉｉ）抗ＣＤ２０軽鎖可変領域を有する第２のポリペプチド、
    ｉｉｉ）抗ＣＤ２０重鎖可変領域、抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、抗ＣＤ３ε重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を有する第３のポリペプチド、及び
    ｉｖ）抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域を有する第４のポリペプチド
    を備え、
    前記第１のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び前記第２のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域が、会合してＣＤ２０に対する抗原結合断片を形成し、
    前記第３のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域が、会合してＣＤ２０に対する抗原結合断片を形成し、
    前記第３のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ３ε重鎖可変領域及び前記第４のポリペプチドにおける前記抗ＣＤ３ε軽鎖可変領域が、会合してＣＤ３εに対する抗原結合断片を形成し、
    前記第１のポリペプチドにおける前記重鎖定常領域及び前記第３のポリペプチドにおける前記重鎖定常領域が一緒に会合する、
    請求項９に記載の二重特異性抗体。
11. 前記第１及び前記第３のポリペプチドに含有されている前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域が、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、前記第２及び前記第３のポリペプチドに含有されている前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域が、配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
12. 前記第１のポリペプチドにおける前記重鎖定常領域が、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記第３のポリペプチドにおける前記重鎖定常領域が、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項１０または１１に記載の二重特異性抗体。
13. 前記第１のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び前記重鎖定常領域を有し、前記第３のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域、前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、前記抗ＣＤ３ε重鎖可変領域、及び前記重鎖定常領域を有するか；又は
    前記第１のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域及び前記重鎖定常領域を有し、前記第３のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域、前記抗ＣＤ３ε重鎖可変領域、及び前記重鎖定常領域を有する、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
14. 前記抗ＣＤ２０重鎖可変領域が、配列番号２８のリンカーを介して、前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域に連結されており、前記抗ＣＤ２０軽鎖可変領域が、配列番号２８のリンカーを介して、前記抗ＣＤ３ε重鎖可変領域に連結されている、請求項１３に記載の二重特異性抗体。
15. 前記第３のポリペプチドが配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の二重特異性抗体。
16. 前記第２のポリペプチドが、Ｃ末端に、配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を更に有し、前記第４のポリペプチドが、Ｃ末端に、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を更に有する、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
17. 薬学的有効量の、請求項１から６のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分、及び薬学的に許容される担体；又は
    薬学的有効量の、請求項７から１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、及び薬学的に許容される担体を備える医薬組成物。
18. 炎症性疾患の処置又は軽減を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、薬学的有効量の、請求項１から６のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分、及び薬学的に許容される担体を有する医薬組成物を投与する段階を備える、方法。
19. 対象に、薬学的有効量の、請求項７から１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、及び薬学的に許容される担体を有する医薬組成物を投与する段階を備える、腫瘍、感染症、又は炎症性疾患を処置又は軽減するための方法。
20. Ｂ細胞関連疾患の処置又は軽減を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、薬学的有効量の、請求項８から１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を投与する段階を備え、前記Ｂ細胞関連疾患が、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、又はＢ細胞介在性自己免疫疾患である、方法。

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