KR20230104164A - 동물 세포주 및/또는 조직 외식편으로부터 콜라겐 및/또는 젤라틴 생산, 단리 및/또는 추출 - Google Patents
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Abstract
동물의 (연속) 세포주를 확립 및/또는 배양하는 방법, 동물의 (연속) 세포주를 조작 및/또는 유전적으로 변형시키는 방법, 동물의 (연속) 세포주로부터 콜라겐을 단리하는 방법, 응용분야를 위해 콜라겐의 DNA 서열을 변형 및/또는 유전적으로 조작하는 방법 및/또는 동물 세포에서 콜라겐 생성을 증가시키는 방법, 및 재료 및/또는 공정의 사용을 통해 배양된 동물 외식편으로부터 콜라겐을 추출하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 바람직한 예에서, 동물은 해파리이고, 동물 외식편은 해파리 외식편, 해파리 폴립 외식편, 해파리 메두사 외식편, 또는 해양 해면동물 외식편이다.
Description
관련 출원 섹션에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 10월 8일에 출원된 미국 가특허 특허 출원 S/N 63/089,285에 대한 우선권을 주장하는 미국 비-가특허 출원이며, 그 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
실시양태의 분야
본 발명의 분야 및 그 실시양태는 동물 세포주 및/또는 조직 외식편에서 콜라겐 및/또는 젤라틴을 생성하고 상기 동물 세포주 및/또는 조직 외식편으로부터 콜라겐 및/또는 젤라틴을 단리 및/또는 추출하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 해양 동물 세포주 및/또는 조직 외식편에서 콜라겐 및/또는 젤라틴을 생성하고 상기 해양 동물 세포주 및/또는 조직 외식편으로부터 콜라겐 및/또는 젤라틴을 단리 및/또는 추출하는 방법에 관한 것이다.
콜라겐은 동물 조직의 가장 풍부한 성분 중 하나이다. 콜라겐 제품은 다수의 의약 및 생명 공학 용도를 발견한다. 예를 들어, 콜라겐은 상처 드레싱을 위해, 조직 성장을 위한 매트릭스로서, 그리고 성형 수술, 재건 수술, 약물 전달 시스템 및 과학 연구를 위한 생체 재료로서 사용된다. 이러한 분야에서 사용되는 대부분의 콜라겐 제품은 소 또는 돼지 조직으로부터 유래된다. 추가적으로, 소, 돼지, 말, 양, 가금류, 고래, 상어, 어류와 같은 척추동물로부터 콜라겐의 추출을 기술하는 많은 절차가 알려져 있다. 그러나, 상기 방법은 동물에게 해를 끼친다. 이와 같이, 동물 세포주 및/또는 조직 외식편에서 콜라겐 및/또는 젤라틴을 생성하고 상기 동물 세포주 및/또는 조직 외식편으로부터 콜라겐 및/또는 젤라틴을 단리 및/또는 추출하기 위한 개선된 인도적인 방법이 필요하다.
관련 기술의 예로 다음을 포함한다:
JP2010018575A에는 세포 부착 억제 활성을 갖는 해파리 추출물 분획에 의한 해파리의 용도가 기재되어 있다.
JP2004099513A에는 해파리를 보다 효율적으로 처리하여 고부가가치의 콜라겐을 추출 및 회수하는 방법 및 시스템이 기재되어 있다.
JP3696018B2에는 해파리를 분쇄하는 단계, 해파리를 조각으로 파쇄하는 단계, 해파리를 분해하는 단계, 해파리를 가용화하는 단계, 및 해파리를 정제하는 단계를 포함하는 해파리로부터 유용한 물질(예컨대 콜라겐)에 대한 미정제 물질 추출 공정이 기재되어 있다.
JP2007051191A에는 해파리를 냉동하는 단계, 냉동된 해파리를 해동하여 해파리의 내인성 효소를 활성화시켜 해파리의 분해 반응을 개시하는 단계, 해동된 해파리를 혼합하여 천연 상태의 해파리의 콜라겐을 가용화하여 천연 콜라겐을 함유하는 중성 염 용액을 형성하는 단계, 및 중성 염 용액으로부터 천연 콜라겐을 회수하는 단계를 포함하는 콜라겐 회수 방법이 기재되어 있다.
JP2008031106A에는 해파리의 내인성 효소를 활성화하여 해파리의 분해 반응을 개시하도록 하고 해파리의 콜라겐을 변형되지 않은 상태로 가용화하여 변형되지 않은 콜라겐을 함유하는 중성 염 용액을 형성하기 위해 저온에서 해파리를 보관하는 저온 보관 단계를 포함하는 방법이 기재되어 있다.
상기 방법은 또한 중성 염 용액으로부터 변형되지 않은 콜라겐을 회수하기 위한 회수 단계를 포함한다.
WO2014157854A1 및 미국 공개 특허 출원 제2016/0052962 A1호에는 방사선 사용을 통해 해파리로부터 콜라겐을 단리하는 방법이 기재되어 있다.
WO2015005830A1에는 해파리로부터 콜라겐을 생산하는 방법이 기재되어 있다.
WO2015012682A2에는 알칼리 처리 후, 염 용액을 사용하여 콜라겐의 물리적 및/또는 기계적 처리 및 침전의 순차적 순서와 조합하여 산성 처리를 포함하는, 수생 동물(예컨대 해파리)로부터 콜라겐을 추출하기 위한 개선된 공정이 기재되어 있다. 상기 공정은 콜라겐의 수율과 품질을 증가시키면서 생산 시간을 단축시키고 지금까지 알려진 공정보다 더 비용 효율적이다.
WO2018220396A1에는 가수분해된 콜라겐 I형, II형, 및 V형 분말 조성물, 조성물의 제조 방법, 및 다양한 질환의 치료 시 조성물의 용도가 기재되어 있다. 콜라겐은 해파리, 말미잘, 극피동물, 삿갓조개, 홍합, 해삼, 소, 돼지, 설치류, 말 또는 어류와 같은 유기체로부터 유래한다. 해파리는 리조스토마스 풀모(Rhizostomas pulmo), 로필레마 에스쿨렌툼(Rhopilema esculentum), 로필레마 노마디카(Rhopilema nomadica), 스토몰로푸스 멜레아그리스(Stomolophus meleagris), 아우렐리아 종(Aurelia sp.), 네모필레마 노무라이(Nemopilema nomurai), 또는 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택될 수 있다.
해파리와 같은 동물로부터 콜라겐 및/또는 젤라틴을 추출하기 위해 일부 시스템이 존재한다. 그러나, 상기 시스템은 동물에게 해를 끼친다. 더욱이, 상기 시스템의 동작 수단은 본 개시내용과 실질적으로 상이한데, 이는 다른 발명들이 본 개시내용에 의해 교시된 모든 문제를 해결하지 못하기 때문이다.
본 발명 및 그 실시양태는 동물 조직 및/또는 세포 배양물에서 콜라겐 및/또는 젤라틴을 생성하고, 상기 동물 조직 및/또는 세포 배양물로부터 콜라겐 및/또는 젤라틴을 단리 및/또는 추출하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 해양 동물 조직 및/또는 세포 배양물에서 콜라겐 및/또는 젤라틴을 생성하고, 상기 해양 동물 조직 및/또는 세포 배양물로부터 콜라겐 및/또는 젤라틴을 단리 및/또는 추출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제1 실시양태는 방법을 설명한다. 상기 방법은 동물의 (연속) 세포주를 확립 및/또는 배양하는 단계와 같은 다수의 공정 단계를 포함한다. 동물은 무척추동물 또는 척추동물일 수 있다. 다른 예에서, 동물은 본원에 명시적으로 나열되지 않은 다른 예들 중에서 해양 동물, 돼지 동물, 소 동물, 또는 조류 동물일 수 있다. 동물이 해양 동물인 일부 예에서, 해양 동물은 본원에 명시적으로 나열되지 않은 다른 예들 중에서 해파리, 말미잘, 극피동물, 삿갓조개, 홍합, 해양 해면동물, 또는 해삼일 수 있다. 해파리는 리조스토마스 풀모, 로필레마 에스쿨렌툼, 로필레마 노마디카, 스토몰로푸스 멜레아그리스, 아우렐리아 종, 또는 네모필레마 노무라이일 수 있다.
방법은 또한 동물의 (연속) 세포주를 조작 및/또는 유전적으로 변형시키는 단계 및 동물의 (연속) 세포주로부터 제1 콜라겐 및/또는 제1 젤라틴을 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 제1 콜라겐은 내인성 콜라겐 또는 외인성 콜라겐일 수 있다. 선택적으로, 방법은 본원에 명시적으로 나열되지 않은 다른 응용분야들 중에서 식품 응용분야, 음료 응용분야, 화장품 응용분야, 의약 응용분야, 건강관리 응용분야, 및/또는 제약 응용분야와 같은 응용분야를 위해 제1 콜라겐의 DNA 서열을 변형 및/또는 유전적으로 조작하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 제2 콜라겐 및/또는 제2 젤라틴은 생성물에서 제1 콜라겐 및/또는 제1 젤라틴으로 대체된다. 다른 예에서, 방법은 동물의 세포에서 제1 콜라겐의 생성을 증가시키기 위해 제1 콜라겐의 DNA 서열을 변형 및/또는 유전적으로 조작하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 변형 및/또는 유전적 조작은 CRISPR(Clustered Regular-Interspaced Short Palindromic Repeats) 기술을 사용하여 발생한다.
본 발명의 제2 실시양태는 방법을 설명한다. 방법은 배지를 사용하여 동물의 (연속) 세포주를 배양하는 단계와 같은 다수의 공정 단계를 포함한다. 동물은 무척추동물 또는 척추동물일 수 있다. 다른 예에서, 동물은 본원에 명시적으로 나열되지 않은 다른 예들 중에서 해양 동물, 돼지 동물, 소 동물, 및/또는 조류 동물일 수 있다. 방법은 또한 다음을 포함할 수 있다: 재료 및/또는 공정의 사용을 통해 동물의 (연속) 세포주로부터 콜라겐을 추출하는 단계. 재료는 완충제, 염, 효소, 산 및/또는 염기일 수 있다. 효소는 다른 예들 중에서 콜라게나제 및/또는 펩신을 포함할 수 있다. 공정은 동결 건조(freeze-drying) 및/또는 동결건조(lyophilizing)를 포함할 수 있다.
본 발명의 제3 실시양태는 재료 및/또는 공정의 사용을 통해 배양된 동물 외식편으로부터 콜라겐을 추출하는 방법을 설명한다. 동물 외식편은 척추동물 외식편 및 무척추동물 외식편을 포함한다. 다른 예에서, 동물 외식편은 본원에 명시적으로 나열되지 않은 다른 예들 중에서 조류 동물 외식편, 소 동물 외식편, 돼지 동물 외식편, 및/또는 해양 동물 외식편을 포함한다. 해양 동물 외식편은 본원에 명시적으로 나열되지 않은 다른 예들 중에서 해파리 외식편, 해파리 폴립 외식편, 해파리 메두사 외식편, 및/또는 해양 해면동물 외식편이다.
일반적으로, 본 발명은 다음과 같은 이점 및 목적을 부여하는 데 성공한다.
본 발명의 목적은 (연속) 동물 세포주를 생성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 (연속) 해파리 세포주를 생성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 (연속) 동물 세포주로부터 콜라겐 및/또는 젤라틴을 추출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 소 또는 돼지 공급원으로부터의 전통적인 콜라겐 및/또는 젤라틴을 (연속) 동물 세포주로부터의 콜라겐 및/또는 젤라틴으로 대체하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 소 또는 돼지 공급원으로부터의 전통적인 콜라겐 및/또는 젤라틴을 (연속) 해파리 세포주로부터의 콜라겐 및/또는 젤라틴으로 대체하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 동물에게 해를 끼치지 않는 (연속) 동물 세포주로부터 콜라겐을 추출하는 인도적인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 해파리에게 해를 끼치지 않는 (연속) 해파리 세포주로부터 콜라겐을 추출하는 인도적인 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 해파리의 해부구조를 도시하는 절단 개략도를 도시한다.
도 2는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른 방법의 블록도를 도시한다.
도 3은 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른 또 다른 방법의 블록도를 도시한다.
도 4는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른 추가적인 방법의 블록도를 도시한다.
도 5는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, DMEM/F-12, DMEM 어드밴스드(advanced), 및 RPMI 1640 어드밴스드 배지에서 픽시리우스 레드 염색(Picsirius red stain)에서 콜라겐에 대해 염색된 소 및 돼지 세포의 이미지를 도시한다.
도 6a는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 인간 세포에 대한 상이한 배지에서의 콜라겐 생성의 그래프 표현을 도시한다.
도 6b는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 소 세포에 대한 상이한 배지에서의 콜라겐 생성의 그래프 표현을 도시한다.
도 7a는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 40,000개 소 세포/웰의 시딩 밀도를 갖는, 다양한 농도의 비타민 C 하에서의 콜라겐 생성의 그래프 표현을 도시한다.
도 7b는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 70,000개 소 세포/웰의 시딩 밀도를 갖는, 다양한 농도의 비타민 C 하에서의 콜라겐 생성의 그래프 표현을 도시한다.
도 7c는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 40,000개 인간 세포/웰의 시딩 밀도를 갖는, 다양한 농도의 비타민 C 하에서의 콜라겐 생성의 그래프 표현을 도시한다.
도 7d는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 70,000개 인간 세포/웰의 시딩 밀도를 갖는, 다양한 농도의 비타민 C 하에서의 콜라겐 생성의 그래프 표현을 도시한다.
도 8은 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 다양한 세포 유형에서 인삼의 콜라겐 생성에 미치는 영향의 그래프 표현을 도시한다.
도 9는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 다양한 세포 유형에서 팔미톨레산이 콜라겐 생성에 미치는 영향의 그래프 표현을 도시한다.
도 10은 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 다양한 세포 유형에서 스피루리나가 콜라겐 생성에 미치는 영향의 그래프 표현을 도시한다.
도 11은 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 시판되는 소 세포주 및 본 발명의 1차 소 섬유아세포 세포주에서 하나 이상의 인자의 첨가에 기초한 콜라겐 수율의 효과의 그래프 표현을 도시한다.
도 12는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 본 발명의 1차 소 섬유아세포 세포주, 시판되는 소 섬유아세포 세포주, 인간 켈로이드 섬유아세포 세포주, 및 시판되는 돼지 세포주의 시각적 비교를 도시한다.
도 2는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른 방법의 블록도를 도시한다.
도 3은 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른 또 다른 방법의 블록도를 도시한다.
도 4는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른 추가적인 방법의 블록도를 도시한다.
도 5는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, DMEM/F-12, DMEM 어드밴스드(advanced), 및 RPMI 1640 어드밴스드 배지에서 픽시리우스 레드 염색(Picsirius red stain)에서 콜라겐에 대해 염색된 소 및 돼지 세포의 이미지를 도시한다.
도 6a는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 인간 세포에 대한 상이한 배지에서의 콜라겐 생성의 그래프 표현을 도시한다.
도 6b는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 소 세포에 대한 상이한 배지에서의 콜라겐 생성의 그래프 표현을 도시한다.
도 7a는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 40,000개 소 세포/웰의 시딩 밀도를 갖는, 다양한 농도의 비타민 C 하에서의 콜라겐 생성의 그래프 표현을 도시한다.
도 7b는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 70,000개 소 세포/웰의 시딩 밀도를 갖는, 다양한 농도의 비타민 C 하에서의 콜라겐 생성의 그래프 표현을 도시한다.
도 7c는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 40,000개 인간 세포/웰의 시딩 밀도를 갖는, 다양한 농도의 비타민 C 하에서의 콜라겐 생성의 그래프 표현을 도시한다.
도 7d는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 70,000개 인간 세포/웰의 시딩 밀도를 갖는, 다양한 농도의 비타민 C 하에서의 콜라겐 생성의 그래프 표현을 도시한다.
도 8은 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 다양한 세포 유형에서 인삼의 콜라겐 생성에 미치는 영향의 그래프 표현을 도시한다.
도 9는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 다양한 세포 유형에서 팔미톨레산이 콜라겐 생성에 미치는 영향의 그래프 표현을 도시한다.
도 10은 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 다양한 세포 유형에서 스피루리나가 콜라겐 생성에 미치는 영향의 그래프 표현을 도시한다.
도 11은 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 시판되는 소 세포주 및 본 발명의 1차 소 섬유아세포 세포주에서 하나 이상의 인자의 첨가에 기초한 콜라겐 수율의 효과의 그래프 표현을 도시한다.
도 12는 본원에 개시된 적어도 일부 실시양태에 따른, 본 발명의 1차 소 섬유아세포 세포주, 시판되는 소 섬유아세포 세포주, 인간 켈로이드 섬유아세포 세포주, 및 시판되는 돼지 세포주의 시각적 비교를 도시한다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 이제 도면을 참조하여 설명될 것이다. 다양한 도면에서 동일한 요소는 동일한 참조 부호로 식별된다. 이제 본 발명의 각 실시양태에 대하여 상세히 참조할 것이다. 상기 실시양태는 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것으로, 이에 제한되는 것은 아니다. 실제로, 당업자는 본 명세서를 읽고 본 도면을 보면 이에 대해 다양한 수정 및 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
해파리 해부구조
도 1에 도시된 바와 같이, "해파리"(100)는 자포동물문(phylum Cnidaria)의 주요 부분인 메두소조아(Medusozoa) 아문의 특정 젤라틴 구성원의 메두사-단계에 부여된 비공식적인 일반명이다. 해파리(100)는 주로 우산 형상의 갓(bell)과 후행 촉수(112)를 가진 자유롭게 헤엄치는 해양 동물이다. 일반적으로, 해파리(100)는 3개의 층으로 구성된다: 외층(예를 들어, 표피(102)), 중간층(예를 들어, 중교(mesoglea) (104)) 및 내층(예를 들어, 위층(gastrodermis))(106))이다.
해파리(100)의 주요 특징은 우산 형상의 갓이다. 우산 형상의 갓은 동물의 정수압 골격을 형성하는 투명한 젤리 같은 물질 덩어리(예를 들어, 중교(104))로 이루어진 속이 빈 구조이다. 갓은 해파리(100)에 추진력을 제공하기 위해 맥동할 수 있다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[Edward E. Ruppert, et al., "Invertebrate Zoology," 2004, 7th edition, Cengage Learning, Pages 148-174]을 참조한다.
중교(104)의 대략 95% 이상이 물로 이루어져 있지만, 이것은 또한 콜라겐 및 다른 섬유질 단백질뿐만 아니라 잔해물과 박테리아를 삼킬 수 있는 유주 아메바세포(wandering amoebocyte)를 포함하고 있다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[Yun-Hwa Hsieh, "Potential of utilizing jellyfish as food in Western countries," Trends in Food Science & Technology, 2004, 5 (7), Pages 225-229]; 및 [Seiya Miura, et al., "Jellyfish Mesogloea Collagen," The Journal of Biological Chemistry, 1985, Vol. 260, No. 28, Pages 15352-15356]을 참조한다. 또한, 갓의 가장자리는 종종 둥근 돌출부(lobe)(예를 들어, 연판(lappet))로 나뉘어 갓이 구부러질 수 있도록 한다. 연판 사이의 틈이나 틈새에는 안점(rhopalia)으로 알려진 기초적인 감각 기관이 매달려 있고, 갓의 가장자리에는 종종 촉수(112)가 있다. 문헌[Edward E. Ruppert, et al.]을 참조한다.
더욱이, 해파리(100)는 또한 해파리(100)의 갓 둘레를 따라 흐르는 환상관(circular canal)(108)을 포함할 수 있다. 방사관(radial canal)(120)은 위로부터 멀리 퍼져 나갈 수 있고, 이어서 존재하는 경우, 고리관(ring canal)에 연결된 다음, 다시 위까지 연결될 수 있다. 방사관(120), 고리관(존재하는 경우), 및 위 또는 위강(116)은 위내배엽계를 형성한다. 더욱이, 해파리(100)의 갓의 최상부 돔형 표면에는 외부표피(exumbrella)(118)가 있다. 해파리(100)의 갓의 돔형 표면의 하부면에는 내부표피(subumbrella)(122)가 있다.
내부표피(122)의 중앙은 돌출부(projection)(예를 들어, 구병(manubrium))가 매달려 있고, 그 말단에 입(126)이 있다. 입(126)은 종종 4개의 구완(oral arms)(114)에 의해 둘러싸여 있다. 위는 중앙 챔버와 측면에서 나오는 4개의 주머니로 나뉜다. 주머니에는 생식선(110) 또는 정자 및/또는 난자를 생산하는 생식 기관이 들어 있다. 안점(또는 안점들)(124)은 해파리강(Scyphozoa)(예를 들어, 전형적인 해파리) 및 입방해파리강(Cubozoa)(예를 들어, 상자해파리)의 작은 감각 구조이다.
콜라겐
콜라겐은 동물의 결합 조직의 세포외 기질에서 우세한 구조 단백질이며 조직 재생 및 기타 산업 응용분야에서 널리 사용된다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[K.E. Kadler, et al., "Collagens at a Glance," Journal of Cell Science, 2007, 120, Pages 1955-1958]을 참조한다. 콜라겐은 원섬유성 또는 비원섬유성일 수 있다. 원섬유성 콜라겐은 I형, II형, III형, V형 및 XI형이 포함된다. 비원섬유성 콜라겐은 중단된 삼중 나선을 갖는 피브릴 관련 콜라겐(또는 FACIT)(예를 들어, IX형, XII형, XIV형, XIX형 및 XXI형), 단쇄 콜라겐(VIII형 및 X형), 기저막 콜라겐(예를 들어, IV형), 중단이 있는 다중 삼중 나선 도메인(또는 멀티플렉신)(예를 들어, XV형 및 XVIII형), 중단된 삼중 나선이 있는 막 관련 콜라겐(또는 MACIT)(예를 들어, XIII형 및 XVII형) 및 기타(예를 들어, VI형 및 VII형)를 포함한다. 콜라겐의 가장 일반적인 5가지 유형은 I형(예를 들어, 뼈의 유기 부분의 주요 구성요소), II형(예를 들어, 연골의 주요 콜라겐 구성요소), III형(예를 들어, 망상 섬유의 구성요소), IV형(기저판, 기저막의 상피 분비층 형성) 및 V형(예를 들어, 세포 표면, 모발, 및 태반)을 포함한다.
상업적으로 시판되는 콜라겐 기반 제제는 일반적으로 소 및 돼지 공급원으로부터 유래된다. 그러나, 소 기원의 콜라겐은 소 해면상뇌증(BSE)(또는 광우병) 및 전염성 해면상뇌증(TSE)의 전염뿐만 아니라 인간에게 전염될 수 있는 잠재적인 바이러스 벡터와 관련이 있다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[M. Ogawa, et al., "Biochemical Properties of Bone and Scale Collagens Isolated from the Subtropical Fish Black Drum (Pogonia cromis) and Sheepshead Seabream (Archosargus probatocephalus)," Food Chem., 2004, 88(4), Pages 495-501]; [H. Li, et al., "Studies on Bullfrog Skin Collagen," Food Chem., 2004, 84(1), Pages 65-9]; 및 [J.P. Widdowson J.P., et al., "In Vivo Comparison of Jellyfish and Bovine Collagen Sponges as Prototype Medical Devices," J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater, 2018, 106, Pages 1524-1533]을 참조한다. 더욱이, 돼지 콜라겐은 종교 및/또는 윤리적 문제를 야기할 수도 있다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[B. Hoyer, et al., "Jellyfish Collagen Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering," Acta Biomater, 2014, 10, Pages 883-892]을 참조한다. 또한, 포유류 콜라겐은 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 및 구제역과 같은 전염된 질환의 병리학적 위험으로 간주되기 때문에 포유류 콜라겐의 지속적인 사용에 대한 규제 우려가 커지고 있다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[F. Subhan, et al., "Marine Collagen: an Emerging Player in Biomedical Applications," J. Food Sci. Technol., 2015, 52, Pages 4703-4707]을 참조한다. 일부는 또한 다양한 포유류 콜라겐 기반 물질이 이들의 정제 과정으로 인해 염증촉진 조직 반응을 유도한다는 것을 보여주었다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[T. Miyata, et al., "Collagen Engineering for Biomaterial Use. Clin. Mater," 1992, 9, Pages 139-148]; 및 [J.M. Aamodt, et al., "Extracellular Matrix-Based Biomaterial Scaffolds and the Host Response," Biomaterials, 2016, 86, Pages 68-82]을 참조한다.
이러한 결함으로 인해, 해양 유기체는 잠재적인 의학적 및 경제적 이점 때문에 생체 재료 응용분야를 위한 대안적인 비포유류 콜라겐 공급원으로 관심을 받고 있다. 흥미롭게도, 해양 유기체는 BSE 위험과 잠재적인 바이러스 벡터가 없기 때문에 매력적인 대안을 제시한다. 특히, 해파리는 미네랄, 단백질 및 콜라겐이 풍부하기 때문에 그러한 대안 중 하나로 간주되었다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[Y.P. Hsieh, et al., "Jellyfish as Food," Hydrobiologia, 2001, 451(1-3), Pages 11-7]을 참조한다.
다양한 어류 및 해파리 종으로부터 콜라겐의 단리 및 특성화가 설명되었다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[S. Addad, et al., "Isolation, Characterization and Biological Evaluation of Jellyfish Collagen for Use in Biomedical Applications," Mar. Drugs, 2011, 9, Pages 967-983]; [Z. Rastian, et al., "Type I Collagen from Jellyfish Catostylus Mosaicus for Biomaterial Applications," ACS Biomater. Sci. Eng, 2018, 4, Pages 2115-2125]; [S. Krishnan, et al., "Preparation and Biomedical Characterization of Jellyfish (Chrysaora Quinquecirrha) Collagen from Southeast Coast of India," Int. J. Pharm. Pharm. Sci, 2013, 5, Pages 698-701; 및 [S. Yamada, et al., "Potency of Fish Collagen as a Scaffold for Regenerative Medicine," Biomed Res. Int, 2014, Page 302932]을 참조한다. 더욱이, 해양 콜라겐의 유용성은 이미 분석되었으며 해파리 콜라겐은 무독성이며 소 콜라겐에 비해 섬유아세포와 조골세포의 세포 생존율을 높이는 것으로 나타났다. 문헌[S. Addad, et al.]을 참조한다. 또한, 다른 사람들은 다양한 콜라겐 정제 방법을 조사하기 위해 다양한 지중해 해파리 종을 시험하는 연구를 수행하였다. 문헌[S. Addad, et al.]을 참조한다. 본 연구를 바탕으로, 리조스토마스 풀모(R. pulmo)를 사용하여 가장 우수한 콜라겐 수율을 얻었으며, 또한 생물학적 분석 시, 알. 풀모 콜라겐의 세포독성은 포유류 콜라겐과 비교하여 차이가 없었다. 문헌[S. Addad, et al.]을 참조한다.
해파리 콜라겐의 생체적합성의 가능성을 뒷받침하는 추가 연구가 수행되었으며, 여기에는 세포독성 시험, 염증촉진 사이토카인 분비 및 항체 분비 측정뿐만 아니라 생체 내 이식 후 면역 세포의 집단 변화가 포함된다. 문헌[S. Addad, et al.]을 참조한다. 그러한 한 연구에서는 해파리 콜라겐을 이식한 마우스에서의 수지상 세포(CD11c+)와 대식세포(F4/80+)의 수가 소 및 젤라틴을 이식한 마우스의 것과 유사한 것으로 밝혀졌다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[E. Song, et al., "Collagen Scaffolds Derived from a Marine Source and Their Biocompatibility," Biomaterials, 2006, 27, Pages 2951-2961]을 참조한다. 따라서, 이 연구는 해파리 콜라겐 스캐폴드가 소 콜라겐 또는 젤라틴에 의해 야기되는 것과 필적할만한 면역 반응을 유도할 수 있다고 결론지었다. 문헌[E. Song, et al.]을 참조한다.
또한, 또 다른 연구에서는 알. 에스쿨렌툼으로부터 유래된 펩타이드가 자발적 고혈압 래트의 혈압을 낮추고 기능성 식품의 항고혈압 화합물로서 사용될 수 있다고 보고하였다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[X. Liu, et al., "Purification and Characterization of Angiotensin I Converting Enzyme Inhibitory Peptides from Jellyfish Rhopilema esculentum," Food Res Int., 2013, 50(1), Pages 339-43]을 참조한다. 또 다른 그룹은 해파리 알. 에스쿨렌툼으로부터 단리된 단백질이 강력한 항산화 활성을 보여 식품 및 제약 산업에 적용될 수 있다고 보고하였다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[H. Yu, et al., "In vitro Determination of Antioxidant Activity of Proteins from Jellyfish Rhopilema esculentum," Food Chem, 2006, 95(1), Pages 123-30]을 참조한다.
해파리 콜라겐은 삼중 나선 구조를 나타내는 콜라겐 분자의 공통된 특징을 가지고 있으며 펩신 소화에 저항성이 있다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[A. Miki, et al., "Structural and Physical Properties of Collagen Extracted from Moon Jellyfish under Neutral pH Conditions," Biosci Biotechnol Biochem, 2015, 79, Pages 1603-1607]; 및 [B. Hoyer, et al.]을 참조한다. 더욱이, 포유류 I형, II형, III형, V형 및 IX형에 대한 이의 동질성 및 이의 배치 간(batch-to-batch) 일관된 생산성으로 인해 "콜라겐 0형"으로 정의될 수 있는 해파리 콜라겐은 포유류 콜라겐 기반 생체 재료의 대안으로서 (골) 조직 재생과 관련된 다양한 의료 응용분야에서 특히 중요하다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[Iris Flaig, et al., "In Vivo Analysis of the Biocompatability and Immune Responses of Jellyfish Collagen Scaffolds and its Suitability for Bone Regeneration," International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(12), Page 4518]을 참조한다.
일부는 여러 종의 해파리로부터 추출한 콜라겐이 독특한 기능적 특성을 나타낸다는 것을 보여주었다. 예를 들어, 네모필레마 종은 식용 가능하고 무해한 해파리로 알려져 있으며, 이들의 콜라겐은 TLR4 신호전달 경로를 통해 면역 반응을 자극한다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[H. Morishige, et al., "Immunostimulatory Effects of Collagen from Jellyfish in vivo," Cytotechnology, 2011, 63, Pages 481-492]; 및 [A.B. Putra, et al., "Jellyfish Collagen Stimulates Production of TNF-α and IL-6 by J774.1 Cells Through Activation of NF-κB and JNK via TLR4 Signaling Pathway," Mol Immunol, 2014, 58, Pages 32-37]을 참조한다. 다른 사람들은 이 종으로부터 추출한 콜라겐이 중간엽 줄기 세포로부터 연골 분화를 가속화한다고 보고하였다. 문헌[B. Hoyer, et al.]을 참조한다. 아우렐리아 종(무럼 해파리(moon jellyfish))으로부터 추출한 콜라겐은 다른 종의 해파리로부터 추출한 콜라겐에는 없는 높은 수용성이라는 독특한 특성을 가지고 있다. 문헌[A. Miki, et al.]을 참조한다. 이러한 유망한 이점에도 불구하고, 해파리와 같은 무척추동물에 있는 콜라겐 단백질의 구조와 기능은 완전히 이해되지 않았다.
콜라겐-함유 물질로부터 콜라겐을 추출하는 전통적인 방법은 다수의 공정 단계를 포함할 수 있다. 예에서, "콜라겐-함유 물질"이라는 어구는 콜라겐을 추출하고자 하는 공급원 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 콜라겐-함유 물질은 유기체, 예컨대 해파리, 말미잘, 극피동물, 삿갓조개, 홍합, 해삼, 소, 돼지, 설치류, 말, 또는 어류로부터 유래된다. 상기 방법은 WO 2018/220396 A1에 기재되어 있을 수 있으며, 그 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 하나의 이러한 예시적인 방법은 (a) 콜라겐-함유 물질을 약 4℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 적어도 1시간 동안 산성 용액 중에서 인큐베이션하여 항온처리물을 형성하는 단계; (b) 단계 (a)로부터 항온처리물을 정용여과하여 항온처리물 내에서 가용화된 콜라겐을 실질적으로 정제하여 잔류물을 형성하는 단계; (c) 단계 (b)로부터 수득된 잔류물의 가용성 물질과 불용성 물질을 분리하여 잔류하는 불용성 물질을 제거하는 단계; 및 (d) 선택적으로, 잔류하는 불용성 물질에 대해 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 (c)로부터 수득된 가용성 물질은 실질적으로 순수한 콜라겐 용액이다. 그러나. 상기 방법은 동물에게 해를 끼친다. 이와 같이, 유기체로부터 콜라겐을 추출하기 위해서는 인도적인 대안이 필요하다.
젤라틴
젤라틴은 통상적으로 산 가수분해, 알칼리 가수분해, 및 효소 가수분해를 통해 변성된 콜라겐으로부터 유래된다. 식품 산업에서 일반적으로 사용되는 A형 및 B형 젤라틴은 각각 산 및 알칼리성 공정에 의해 유래된다. 해파리로부터 생성된 A형 젤라틴은 식품 응용분야를 위한 젤라틴의 대체 공급원으로 사용될 수 있다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[U. Rodsuwan, et al., "Functional Properties of Type A Gelatin from Jellyfish (Lobonema smithii)," International Food Research Journal, 2016, 23(2), Pages 507-514]을 참조한다.
방법
본 발명은 다수의 인도적인 방법을 기술한다. 제1 방법이 도 2에 도시되어 있다. 도 2의 방법은 방법을 시작하는 공정 단계(202)와 같은 다수의 공정 단계를 포함한다. 공정 단계(204)는 공정 단계(202)에 뒤따르고 물의 (연속) 세포주를 확립 및/또는 배양하는 단계를 포함한다. 동물은 무척추동물 또는 척추동물일 수 있다. 다른 예에서, 동물은 본원에 명시적으로 나열되지 않은 다른 예들 중에서 해양 동물, 돼지 동물, 소 동물, 또는 조류 동물일 수 있다. 동물이 해양 동물인 일부 예에서, 해양 동물은 본원에 명시적으로 나열되지 않은 다른 예들 중에서 해파리, 말미잘, 극피동물, 삿갓조개, 홍합, 해양 해면동물, 또는 해삼일 수 있다. 다른 예에서, 홍합은 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis)일 수 있고, 해삼은 스티코푸스 몰리스(Stichopus mollis)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 동물은 해파리일 수 있으며, 해파리는 리조스토마스 풀모, 로필레마 에스쿨렌툼, 로필레마 노마디카, 스토몰로푸스 멜레아그리스, 아우렐리아 종, 또는 네모필레마 노무라이일 수 있다.
공정 단계(206)는 공정 단계(204)에 뒤따르고 동물의 (연속) 세포주를 조작 및/또는 유전적으로 변형시키는 단계를 포함한다. 제1 콜라겐은 내인성 콜라겐 또는 외인성 콜라겐일 수 있다. "내인성 콜라겐"은 동물의 신체에서 합성된 천연 콜라겐이고 "외인성 콜라겐"은 외부 공급원으로부터 유래된다는 점을 인식해야 한다. 다음으로, 공정 단계(208)는 공정 단계(206)에 뒤따르고 동물의 (연속) 세포주로부터 제1 콜라겐 및/또는 제1 젤라틴을 단리하는 단계를 포함한다. 공정 단계(210)는 공정 단계(208)에 뒤따르고 생성물 내의 제2 콜라겐 및/또는 제2 젤라틴을 제1 콜라겐 및/또는 제1 젤라틴으로 대체하는 단계를 포함한다. 공정 단계(212)는 공정 단계(210)에 뒤따르고 도 2의 방법을 종료한다.
도 2의 방법은 본원에 명백히 열거되지 않은 다른 용도들 중에서 식품 응용분야, 음료 응용분야, 화장품 응용분야, 의약 응용분야, 건강관리 응용분야, 및/또는 제약 응용분야와 같은 응용분야를 위해 제1 콜라겐의 DNA 서열을 변형 및/또는 유전적으로 조작하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 다른 예에서, 방법은 동물의 세포에서 제1 콜라겐의 생성을 증가시키기 위해 제1 콜라겐의 DNA 서열을 변형 및/또는 유전적으로 조작하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 변형 및/또는 유전적 조작은 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기술을 사용하여 발생한다.
"CRISPR"은 박테리아 및 고세균과 같은 원핵 유기체의 게놈에서 발견되는 DNA 서열의 계열을 지칭한다는 것을 인식해야 한다. 이러한 서열은 이전에 원핵생물을 감염시켰던 박테리오파지의 DNA 단편으로부터 유래되며 후속 감염 동안 유사한 박테리오파지의 DNA를 검출하고 파괴하는 데 사용된다. 이와 같이, 이러한 서열은 원핵생물의 항바이러스(즉, 항-파지) 방어 시스템에서 중요한 역할을 한다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[R. Barrangou, "The roles of CRISPR-Cas Systems in Adaptive Immunity And Beyond," Current Opinion in Immunology, 2015, 32, Pages 36-41]; 및 [Yingxiao Zhang, et al., "The Emerging and Uncultivated Potential of CRISPR Technology in Plant Science," Natural Plants, 2019, 5, Pages 778-794]을 참조한다. CRISPR 기술은 게놈 편집을 위한 간단하면서도 강력한 도구이며 연구자들이 DNA 서열을 쉽게 변경하고 유전자 기능을 변형할 수 있도록 한다. CRISPR 기술은 유전적 결함 교정, 질환 확산 치료 및 예방, 작물 개량을 포함한 다양한 응용분야를 가지고 있다.
일부 예에서, 젤라틴은 아우렐리아 아리타(Aurelia arita)와 같은 해파리로부터 얻어질 수 있다는 것을 인식해야 한다. 해파리로부터 젤라틴을 생산하는 공정은 하기와 같은 하나 이상의 공정 단계를 포함할 수 있다: 갓을 제외한 해파리 부분을 제거하는 단계, 해파리 갓을 조각으로 절단하는 단계, 증류수로 해파리 갓을 세척하는 단계, 해파리 갓을 뜨거운 물에 담가 해파리 갓의 지방 함량을 감소시키는 단계, 약 100℃에서 약 30분 동안 해파리 갓을 조리하는 단계, 해파리 갓을 산성 또는 알칼리성 세척액(예를 들어, 20 mM 수산화암모늄)에 약 5일 동안 담그는 단계, 해파리 갓을 증류수에서 걸러내고(strainig) 비등시키는 단계, 해파리 갓으로부터 남아있는 조직 조각을 여과 제거하는 단계, 해파리 갓을 탈수시키는 단계, 및 절구와 공이를 사용하여 해파리 갓을 분말로 분쇄하는 단계.
도 3은 본 발명의 또 다른 방법을 도시한다. 도 3의 방법은 공정 단계(302)로 시작한다. 공정 단계(304)는 공정 단계(302)에 뒤따르고 배지를 사용하여 동물의 (연속) 세포주를 배양하는 단계를 포함한다. 동물은 무척추동물 또는 척추동물일 수 있다. 다른 예에서, 동물은 본원에 명시적으로 나열되지 않은 다른 예들 중에서 해양 동물, 돼지 동물, 소 동물, 및/또는 조류 동물일 수 있다. 바람직한 예에서, 동물은 해양 동물일 수 있으며, 보다 구체적으로는 해파리일 수 있다.
공정 단계(306)는 공정 단계(304)에 뒤따르고 재료 및/또는 공정의 사용을 통해 동물의 (연속) 세포주로부터 콜라겐을 추출하는 단계를 포함한다. 재료는 완충액, 염, 효소, 산 및/또는 염기일 수 있다. 일부 예에서, 효소는 다른 예들 중에서 콜라게나제 및/또는 펩신을 포함할 수 있다. 공정은 동결 건조(freeze-drying) 또는 동결건조(lyophilizing)를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, "동결건조(lyophilization)" 또는 "동결건조(freeze-drying)"는 생성물을 동결시키고, 압력을 낮춘 다음, 승화에 의해 얼음을 제거하는 단계를 포함하는 저온 탈수 공정이다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[P. Fellows, "Freeze drying and freeze concentration," Food processing technology: Principles and practice, 2017, 4th ed., Kent: Woodhead Publishing/Elsevier Science, Pages 929-940]을 참조한다. 공정 단계(308)는 공정 단계(306)에 뒤따르고 도 3의 방법을 종료한다.
추가의 예에서, 본 발명은 재료 및/또는 공정의 사용을 통해 배양된 동물 외식편으로부터 콜라겐을 추출하는 방법을 설명한다. 일부 예에서, 동물 외식편은 척추동물 외식편 및/또는 무척추동물 외식편을 포함한다. 다른 예에서, 동물 외식편은 본원에 명시적으로 나열되지 않은 다른 예들 중에서 조류 동물 외식편, 소 동물 외식편, 돼지 동물 외식편, 및/또는 해양 동물 외식편을 포함한다. 해양 동물 외식편은 본원에 명시적으로 나열되지 않은 다른 예들 중에서 해파리 외식편, 해파리 폴립 외식편, 해파리 메두사 외식편, 및/또는 해양 해면동물 외식편이다.
또 다른 예에서, 이중 염료 검정을 사용하는 콜라겐 검출 방법이 도 4에 기재되고 도시되어 있다. 이 방법은 콜라겐을 추출하지 않고 배양물에서 부착 세포의 콜라겐 생성을 추정하기 위해 염료를 사용하여 샘플의 콜라겐 함량을 측정한다. 샘플은 본원에 명시적으로 나열되지 않은 다른 예들 중에서 소 진피 1차 섬유아세포 세포주 또는 BJ 인간 섬유아세포/1차 세포를 포함할 수 있다.
도 4의 방법에서 사용된 재료는 다음을 포함한다: 약 70% 에탄올, 멸균수, 피크르산(또는 2,4,6-트리니트로페놀), 포화 피크르산 중 약 0.1% 패스트 그린(Fast Green) FCF 용액, 포화 피크르산 중 약 0.4% 패스트 그린 FCF 용액 및 약 0.11% 시리우스 레드(Sirius Red), 및 메탄올 중 약 0.1% NaOH. 패스트 그린 FCF 염료는 총 단백질에 사용되며 시리우스 레드 염료는 콜라겐 함량 측정에 사용된다. 도 4의 방법과 함께 사용되는 장비는 층류 캐비닛, 분광광도계, 및 피펫을 포함한다.
도 4의 방법은 공정단계(402)로 시작하고, 이어서 공정 단계(404)가 이어진다. 공정 단계(404)는 세포 배양 플라스크로부터 배지를 제거하는 단계를 포함한다. 배지는 본원에 명시적으로 나열되지 않은 다른 배지 중에서 최소 필수 배지 (MEM), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)-고 글루코스, DMEM-F12, FM, DMEM 어드밴스드, 및/또는 RPMI 1640 어드밴스드를 포함할 수 있다.
공정 단계(406)는 공정 단계(404)에 뒤따르고 제1 양의 패스트 그린 염료를 함유하는 증류수 중의 피크르산의 포화 용액을 첨가하는 단계를 포함한다. 예에서, 제1 양의 패스트 그린 염료는 약 0.01%이다. 공정 단계(408)는 공정 단계(406)에 뒤따르고 암실에서 실온에서 제1 기간 동안 배지를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 예에서, 제1 기간은 약 15분이다. 구체적으로, 이 공정 단계는 시험 플레이트의 24웰에 0.01%의 패스트 그린 염료 300 μL/웰을 첨가하고 암실에서 실온에서 약 15분 동안 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다.
공정 단계(410)는 공정 단계(408)에 뒤따르고 증류수로 배지를 세척하는 단계를 포함한다. 이 공정 단계에서, 세척은 약 3 내지 약 4회 발생할 수 있다. 공정 단계(412)는 공정 단계(410)에 뒤따르고 제2 양의 패스트 그린 염료 및 제1 양의 시리우스 레드 염료를 함유하는 증류수 중의 피크르산의 포화 용액을 배지에 첨가하는 단계를 포함한다. 예에서, 제2 양의 패스트 그린 염료는 약 0.04%이고, 제1 양의 시리우스 레드 염료는 약 0.11%이다. 보다 구체적으로, 이 공정 단계는 피크린산에 0.04%의 패스트 그린 염료와 0.11%의 다이렉트 레드 80/시리우스 레드 염료 300 μL/웰을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
공정 단계(414)는 공정 단계(412)에 뒤따르고 암실에서 제2 기간 동안 배지를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 제2 기간은 약 30분이다. 공정 단계(416)는 공정 단계(414)에 뒤따르고 증류수로 약 3회 내지 약 4회 배지를 세척하는 단계를 포함한다. 공정 단계(416)가 발생한 후, 세포를 현미경 하에서 이미지화할 수 있다. 이러한 이미지들은 도 5에 도시될 수 있다.
공정 단계(418)는 공정 단계(416)에 뒤따르고 무수 메탄올(1:1) 중 일정량의 NaOH를 배지에 첨가하고, 배지를 세포 시트로부터 긁어내고, 배지를 새로운 세포 배양 플레이트로 옮기는 단계를 포함한다. 약 0.3 mL의 0.1% NaOH가 공정 단계(418)에서 사용된다.
공정 단계(420)는 공정 단계(418)에 뒤따르고 분광광도계를 사용하여 540 nm 및 630 nm에서의 흡광도를 측정하는 단계를 포함한다. 공정 단계(422)는 공정 단계(420)에 뒤따르고 도 4의 방법을 종료한다.
녹색 형광 프로브 Col-F가 사용될 수 있음을 인식해야 한다. 녹색 형광 프로브 Col-F는 콜라겐 및 엘라스틴에 친화력을 나타내므로 신선한 냉동된 동물 조직에서 복잡한 콜라겐 및 탄성 구조의 형광 3차원 이미징에 편리한 도구이다. 이 방법에서 형광 현미경을 추가로 사용하여 3차원 이미징을 분석할 수 있다.
도 4의 방법에 기초하고 도 5에 나타낸 바와 같이, 1차 소 섬유아세포는 소 세포보다 빠르게 증식했고, 1차 소 섬유아세포는 1차 돼지 섬유아세포에 비해 우수한 콜라겐 공급원인 것으로 밝혀졌으며, 1차 소 및 돼지 섬유아세포 둘 모두 RPMI 1640 어드밴스드 배지에 비해 DMEM/F-12 배지 및 DMEM 어드밴스드 배지를 선호했다.
본 발명은 또한 콜라겐 생성에 미치는 그 영향에 대해 상이한 배지를 시험하는 추가의 방법을 제공한다. 구체적으로, 도 6a 및 도 6b는 각각 인간 및 소 세포주에 대한 상이한 배지에서의 콜라겐 생성을 도시한다. 도 6a 및 도 6b는 다양한 배지(예를 들어, MEM, DMEM-고 글루코스, DMEM-F12 및 FM 배지)와 관련된 x축(602) 및 mg 단위로 측정된 콜라겐 생성과 관련된 y축(604)을 도시한다. 콜라겐 생성(606) 및 총 단백질 농도(608) 둘 모두가 도 6a와 도 6b에 도시되어 있다. 도 6a와 도 6b 둘 모두에 나타낸 바와 같이, DMEM-F12 배지에서 콜라겐 생성(606) 및 총 단백질 농도(608)가 가장 높았다.
또한, 본 발명은 소, 돼지, 인간 및 다른 관심 있는 세포주 내에서 콜라겐 생성에 미치는 영향에 대한 인자를 시험하는 추가의 방법을 제공한다. 이러한 인자의 예로는 특히 비타민 C, 오메가-7 지방산(또는 팔미톨레산), 글리신, 인삼 추출물, 황산아연, 재조합 인간 인슐린, 히드로코르티손 헤미숙시네이트, 리놀레산, 아시아티코사이드, 인간 혈청 알부민(HSA), 레시틴, 또는 스피루리나(예를 들어, 조류 보충제)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 연구자들은 비타민 C를 첨가한 후 세포 모폴로지가 변한다는 것을 발견하였다. 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[Richard I. Schwarz, "Collagen I and the Fibroblast: High Protein Expression Requires a New Paradigm of Post-Transcriptional, Feedback Regulation," Biochemistry and Biophysics Reports, 2015, 3, Pages 38-44, DOI: 10.1016/j.bbrep.2015.07.007]을 참조한다. 구체적으로, 비타민 C는 콜라겐 합성에 필요한 두 가지 효소인 프롤릴 히드록실라제(예를 들어, 콜라겐 분자를 안정화하기 위해) 및 리실 히드록실라제(예를 들어, 구조적 강도 가교결합을 제공하기 위해)에 대한 필수 보조인자이다.
또한, 도 7a는 40,000개 소 세포/웰의 시딩 밀도로, 다양한 농도의 비타민 C 하에서의 콜라겐 생성을 도시한다. 도 7b는 70,000개 소 세포/웰의 시딩 밀도로, 다양한 농도의 비타민 C 하에서의 콜라겐 생성을 도시한다. 도 7c는 40,000개 인간 세포/웰의 시딩 밀도로, 다양한 농도의 비타민 C 하에서의 콜라겐 생성을 도시한다. 도 7d는 70,000개 인간 세포/웰의 시딩 밀도로, 다양한 농도의 비타민 C 하에서의 콜라겐 생성을 도시한다. 도 7a 내지 도 7d에 도시된 결과와 관련된 실험은 96웰 플레이트에서 수행되었다.
구체적으로, 도 7a 내지 도 7d 각각은 비타민 C의 mg/mL 농도와 관련된 x축(702) 및 콜라겐 농도(606) 및 단백질 농도(608)를 측정하는 y축(704)을 포함한다. 도 7a 내지 도 7d에 나타낸 바와 같이, 가장 높은 콜라겐 농도(706)는 비타민 C의 농도가 10 mg/mL와 100 mg/mL 사이일 때 발생하였다.
더욱이, 도 8은 다양한 세포 유형에서 인삼이 콜라겐 생성에 미치는 영향을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 8은 세포 유형 및 μg/mL 단위의 인삼 농도와 관련된 x축(802), 및 콜라겐 농도(806) 및 단백질 농도(808)를 측정하는 y축(704)을 갖는다.
또한, 도 9는 다양한 세포 유형에서 팔미톨레산이 콜라겐 생성에 미치는 영향을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 9는 세포 유형 및 μg/mL 단위의 팔미톨레산 농도와 관련된 x축(902), 및 콜라겐 농도(906) 및 단백질 농도(908)를 측정하는 y축(904)을 갖는다.
도 10은 다양한 세포 유형에서 스피루리나 추출물이 콜라겐 생성에 미치는 영향을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 10은 세포 유형 및 μg/mL 단위의 스피루리나 추출물 농도와 관련된 x축(1002), 및 콜라겐 농도(1006) 및 단백질 농도(1008)를 측정하는 y축(1004)을 갖는다.
도 8, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 인삼 보충제, 팔미톨레산 및 스피루리나 추출물은 콜라겐 생성에 큰 영향을 미치지 않았다. 그러나, 소 세포에서는 총 단백질 함량이 증가한다.
또 다른 실시양태에서, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 상업적으로 시판되는 세포주(소, 돼지 및 인간 KEL-FIB)에서 콜라겐 생산을 향상시키는 그들의 능력에 대해 이들 인자의 하위세트를 평가하였다.
[표 1]
이 실시양태에서, 세포를 48웰 플레이트의 웰당 대략 3500 내지 4500개 세포로 시딩하고, 인자를 첨가하기 전에 약 48시간 동안 침강시켰다. 약 48시간 후, 사용한 배지를 제거하고 관심 있는 인자가 보충된 성장 배지로 교체하였다. 세포는 인자의 초기 도입 후 약 3 내지 10일 동안 계속 성장했으며 콜라겐 함량은 Sircol™ 콜라겐 검정으로 정량화되었다. 또한, 약 48 내지 72시간마다 배지/인자 보충 유무에 관계없이 실험을 수행하였다.
시험된 인자들 중, 비타민 C, 황산아연 및 아시아티코사이드는 상업적으로 시판되는 세포주(소, 돼지 및 인간 KEL-FIB)에서 콜라겐 생성을 증가시켰다. 특히, 비타민 C는 소 세포주에서 약 28-36%까지, 그리고 인간 KEL-FIB 세포주에서 약 50%까지 콜라겐 생성을 증가시켰다.
이들 인자의 혼합물은 또한 소 세포주에서 인자가 콜라겐 생성에 미치는 상승 효과를 평가하기 위해 시험되었다. 도 11은 이 결과를 도시한다. 구체적으로, 도 11은 하나 이상의 인자와 관련된 x축(1102) 및 μg 단위의 콜라겐 농도와 관련된 y축을 포함한다. 시판되는 소 세포주(1106)와 본 발명의 1차 소 섬유아세포 세포주(1108) 사이의 다양한 인자에 대한 콜라겐 수율의 비교는 인자가 72시간마다 보충되는 7일 후에 도시된다는 것을 인식해야 한다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 비타민 C와 아시아티코사이드의 조합은 시판되는 소 세포주(1106)에서 콜라겐 생성을 최대로 증가시키는 것으로 밝혀졌으며, 비타민 C와 황산아연은 본 발명의 1차 소 섬유아세포주(1108)에서 콜라겐 생성을 가장 많이 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
추가의 실시양태에서, 다양한 세포주에서 콜라겐 함량을 비교 및 대조하는 방법이 또한 본원에서 고려된다. 구체적으로, 도 12는 본 발명의 1차 소 섬유아세포 세포주(1202), 시판되는 소 섬유아세포 세포주(1204), 인간 켈로이드 섬유아세포 세포주(1206) 및 시판되는 돼지 섬유아세포 세포주(1208)의 시각적 비교를 도시한다. 도 12의 세포를 대략 동일한 세포 수로 시딩하고 약 72시간 동안 인큐베이션하였다.
본 발명의 1차 소 섬유아세포 세포주(1202)는 다른 시판되는 세포주를 능가하였다. 특히, 본 발명의 1차 소 섬유아세포주(1202)는 시판되는 소 섬유아세포 세포주(1204)보다 각각 약 3일 및 약 7일 후에 콜라겐 생성 면에서 약 17% 및 약 28% 능가하였다. 구체적으로, 본 발명의 1차 소 섬유아세포주(1202)는 약 7.4 μg 콜라겐과 회합되어 있고, 시판되는 소 섬유아세포 세포주(1204)는 약 6.3 μg 콜라겐과 회합되어 있고, 인간 켈로이드 섬유아세포 세포주(1206)는 약 4.4 μg 콜라겐과 회합되어 있고, 시판되는 돼지 섬유아세포주(1208)는 약 4.1 μg 콜라겐과 회합되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 콜라겐을 추출하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 제 1 방법에서는, 아세트산을 사용하여 부착 세포로부터 콜라겐을 추출하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법에 사용되는 물질은 약 70% 에탄올, 멸균 PBS, 약 0.5M 아세트산 용액, 및 대부분 컨플루언트 세포의 플라스크가 포함된다. 이 방법에 사용되는 장비에는 층류 캐비닛, 피펫, 팔콘(falcon) 튜브, 스크레이퍼 및 에펜도르프(Eppendorf) 튜브가 포함될 수 있다.
첫 번째 방법은 다음과 같은 다수의 공정 단계를 포함한다: 세포 배양 전에 약 15회 층류 캐비닛을 켜고 0.5M 아세트산 용액이 차갑고 멸균되었는지 확인하는 단계. 다음으로, 방법은 세포 배양 플라스크 또는 접시를 인큐베이터로부터 층류 캐비닛으로 이동시키고, 액체 폐기물 용기에 배양 배지를 배치하는 단계를 포함한다. 이어서, 방법은 세포를 1X PBS로 약 3회 세척하는 단계를 포함한다. 일단 세척되면, PBS를 배수하고 얼음 위에 놓는다. 소량의 아세트산을 첨가한다. 플라스크를 기울여 전체 표면이 아세트산과 접촉하도록 한 다음, 상기 방법은 플라스크 바닥에서 세포외 기질(ECM)과 세포를 긁어내어 플라스크로부터 용액을 에펜도르프 또는 팔콘 튜브로 옮기는 단계를 포함한다. 이어서, 튜브를 4℃ 냉장고에 넣고 약 24시간 동안 인큐베이션한다. 약 30분마다, 튜브를 교반하거나 회전시킨다. 24시간이 경과하면, 튜브를 +4에서 약 30분 동안 약 15000 rpm에서 원심분리한다. 상청액을 수집한다. 이어서, 적절한 검정을 사용하여 콜라겐 농도를 측정한다.
두 번째 예에서, 수산화암모늄을 사용하여 세포층의 ECM을 추출하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 ECM을 추출하기 위해 배양 플라스크 또는 디쉬에서 세포를 용해하고 제거한다. 이 방법에 사용되는 재료에는 약 70% 에탄올, 멸균 PBS, 멸균 탈이온수, 수산화암모늄의 스톡 용액 및 대부분 컨플루언트 세포의 플라스크가 포함된다. 이 방법에 사용되는 장비에는 층류 캐비닛, 피펫, 팔콘 튜브 및 스크레이퍼가 포함된다.
이 방법은 세포 배양 적어도 15분 전에 층류 캐비닛을 켜는 단계와 같은 다양한 공정 단계를 포함한다. 다음으로, 방법은 20 mM 수산화암모늄 용액을 제조하는 단계를 포함한다. 1 M의 수산화암모늄을 일반적으로 4℃에서 보관한다. 이어서, 약 300 μL의 수산화암모늄을 14.7 mL 멸균수에 첨가하고 혼합하여 15 mL의 20 mM NH4OH를 제조하였다. 이어서, 방법은 세포 배양 플라스크 또는 디쉬를 인큐베이터로부터 층류 캐비닛으로 이동시키고, 배양 배지를 액체 폐기물 용기에 폐기하는 단계를 포함한다.
다음으로, 방법은 세포를 PBS로 약 3회 세척하는 단계를 포함한다. 일단 세척되면, PBS를 배수하고 적절한 양의 수산화암모늄을 첨가한다. 이어서, 플라스크를 실온에서 약 5분 동안 인큐베이션한다. 1분마다 플라스크를 부드럽게 흔들어 모든 세포가 용해되도록 한다.
다음으로, 수산화암모늄과 용해된 세포가 폐기하고, 부착된 ECM만 그 자리에 남는다. 이제, ECM에 세포가 없으며 스크레이퍼를 사용하여 추출하고 멸균수에 4℃에서 보관하거나 새로운 세포를 ECM 층에 도말할 수 있다.
더욱이, 본 발명에는 물리화학적 특성화, 질감 분석, 블룸 강도(bloom strength) 등과 같은 정제된 콜라겐을 특성화하기 위한 다수의 방법, 및 당업자에게 공지된 기타 방법이 기재되어 있다. 예를 들어, Blue Native PAGE 및 웨스턴 블롯팅(Western Blotting)을 사용하여 배양 세포로부터 단리된 콜라겐을 특성화할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시형태에 대한 설명은 예시의 목적으로 제시되었지만, 개시된 실시양태에 대해 포괄적이거나 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 기술된 실시양태의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 많은 수정 및 변형이 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 사용된 용어는 실시양태의 원리, 시장에서 발견되는 기술에 대한 실제 적용 또는 기술적 개선을 가장 잘 설명하거나, 다른 사람 또는 당업자가 본원에 개시된 실시양태를 이해할 수 있도록 선택되었다.
본 개시내용의 요소 또는 이의 실시양태를 도입할 때, 관사 "a", "an" 및 "the"는 하나 이상의 요소가 존재한다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 유사하게, 요소를 소개하는 데 사용되는 형용사 "또 다른"은 하나 이상의 요소를 의미하는 것으로 의도된다. "포함하는" 및 "갖는"이라는 용어는 나열된 요소 외에 추가적인 요소가 있을 수 있도록 포괄하는 것으로 의도된다.
본 발명이 어느 정도의 구체적으로 설명되었지만, 본 개시내용은 단지 예시에 의해서만 이루어졌으며, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 부분의 구성 및 배열의 세부사항에 있어서의 다수의 변경이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
Claims (29)
- 동물의 (연속) 세포주를 확립하는 단계;
동물의 (연속) 세포주를 조작 및/또는 유전적으로 변형시키는 단계;
동물의 (연속) 세포주로부터 제1 콜라겐 및/또는 제1 젤라틴을 단리하는 단계; 및
생성물 내의 제2 콜라겐 및/또는 제2 젤라틴을 제1 콜라겐 및/또는 제1 젤라틴으로 대체하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 동물은 무척추동물 및 척추동물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 동물은 해양 동물, 돼지 동물, 소 동물, 및 조류 동물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제3항에 있어서,
동물은 해양 동물이고,
해양 동물은 해파리, 말미잘, 극피동물, 삿갓조개, 홍합, 해양 해면동물, 및 해삼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법. - 제4항에 있어서, 해파리는 리조스토마스 풀모(Rhizostomas pulmo), 로필레마 에스쿨렌툼(Rhopilema esculentum), 로필레마 노마디카(Rhopilema nomadica), 스토몰로푸스 멜레아그리스(Stomolophus meleagris), 아우렐리아 종(Aurelia sp.), 네모필레마 노무라이(Nemopilema nomurai), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 제1 콜라겐은 내인성 콜라겐 또는 외인성 콜라겐인 방법.
- 제1항에 있어서, 제1 콜라겐은 인간 콜라겐인 방법.
- 제6항에 있어서, 외인성 콜라겐은 동물 세포에서 생성되는 것인 방법.
- 제8항에 있어서,
동물 세포는 조류 세포, 돼지 세포, 소 세포, 및 해양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고,
해양 세포는 해양 무척추동물 세포 및 해양 척추동물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고,
해양 무척추동물 세포는 해파리 세포이고,
해양 척추동물 세포는 어류 세포인 방법. - 제1항에 있어서,
응용분야를 위해 제1 콜라겐의 DNA 서열을 변형 및/또는 유전적으로 조작하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제10항에 있어서, 응용분야는 식품 응용분야, 음료 응용분야, 화장품 응용분야, 의약 응용분야, 건강관리 응용분야, 및 제약 응용분야로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서,
동물의 세포에서 제1 콜라겐의 생성을 증가시키기 위해 제1 콜라겐의 DNA 서열을 변형 및/또는 유전적으로 조작하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제12항에 있어서, 동물의 세포에서 제1 콜라겐의 생성을 증가시키기 위한 제1 콜라겐의 DNA 서열의 변형 및/또는 유전적 조작은 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기술을 사용하여 발생하는 것인 방법.
- 배지를 사용하여 동물의 (연속) 세포주를 배양하는 단계; 및
재료 및/또는 공정의 사용을 통해 동물의 (연속) 세포주로부터 콜라겐을 추출하는 단계
를 포함하는 방법. - 제14항에 있어서, 동물은 무척추동물 및 척추동물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 동물은 해양 동물, 돼지 동물, 소 동물, 및 조류 동물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 재료는 완충액, 효소, 산, 및 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 효소는 콜라게나제 및 펩신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 공정은 동결건조를 포함하는 것인 방법.
- 재료 및/또는 공정의 사용을 통해 배양된 동물 외식편으로부터 콜라겐을 추출하는 방법.
- 제20항에 있어서, 동물 외식편은 척추동물 외식편 및 무척추동물 외식편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제20항에 있어서, 동물 외식편은 조류 동물 외식편, 소 동물 외식편, 돼지 동물 외식편, 및 해양 동물 외식편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 해양 동물 외식편은 해파리 외식편, 해파리 폴립 외식편, 해파리 메두사 외식편, 및 해양 해면동물 외식편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 콜라겐 검출 방법으로서,
세포 배양 플라스크로부터 배지를 제거하는 단계;
제1 양의 제1 염료를 함유하는 증류수 중의 피크르산의 포화 용액을 첨가하는 단계;
암실에서 실온에서 제1 기간 동안 배지를 인큐베이션하는 단계;
증류수로 배지를 세척하는 단계;
제2 양의 제1 염료 및 제1 양의 제2 염료를 함유하는 증류수 중의 피크르산의 포화 용액을 배지에 첨가하는 단계;
암실에서 실온에서 제2 기간 동안 배지를 인큐베이션하는 단계;
증류수로 배지를 세척하는 단계;
무수 메탄올 중 일정량의 수산화나트륨을 배지에 첨가하는 단계;
배지를 새로운 세포 배양 플레이트로 옮기는 단계; 및
분광광도계를 사용하여 다양한 파장에서 콜라겐의 흡광도를 측정하는 단계
를 포함하는, 콜라겐 검출 방법, - 제24항에 있어서, 배지는 최소 필수 배지(MEM), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)-고 글루코스, DMEM-F12, FM, DMEM 어드밴스드(advanced), 및 RPMI 1640 어드밴스드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 콜라겐 검출 방법.
- 제24항에 있어서, 제1 염료는 패스트 그린 염료(Fast Green dye)이고, 제2 염료는 시리우스 레드 염료(Sirius Red dye)인 콜라겐 검출 방법.
- 세포주에서 콜라겐 생성에 대한 인자의 효과를 시험하는 방법으로서, 상기 방법은:
웰-플레이트에서 세포주의 세포를 시딩하는 단계;
제1 기간 후, 소비된 배지를 인자로 보충된 성장 배지로 교체하는 단계; 및
검정을 사용하여 콜라겐 함량을 정량화하여 인자가 세포주에서 콜라겐 생성에 미치는 영향을 결정하는 단계
를 포함하는, 세포주에서 콜라겐 생성에 대한 인자의 효과를 시험하는 방법. - 제27항에 있어서, 인자는 비타민 C, 오메가-7 지방산, 글리신, 인삼 추출물, 황산아연, 재조합 인간 인슐린, 히드로코르티손 헤미숙시네이트, 리놀레산, 아시아티코사이드, 인간 혈청 알부민(HSA), 레시틴, 및 스피루리나로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 세포주는 소 세포주, 돼지 세포주, 및 인간 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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