RU2794773C1 - Способ культивирования биомассы миобластов, полученных из мышц стерляди - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и клеточной биологии, в частности к способу культивирования биомассы миобластов, полученных из мышц стерляди, с целью получения клеточного мясного продукта. Осуществление указанного способа проводят в три этапа: на первом этапе проводят выделение миобластов из малька стерляди, на втором – культивирование клеток миобластов, на третьем – определение индекса пролиферации миобластов стерляди как отношение числа выросших клеток к числу засеянных клеток. Для осуществления первого этапа сначала берут тушку стерляди в возрасте до 1,5 месяцев, стерилизуют, помещают в стерильные условия, удаляют кожу со спинной стороны, затем срезают белую мышечную ткань. Далее берут питательную среду DMEM и добавляют 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, получают культуральную питательную среду. После чего срезанную мышечную ткань измельчают, помещают в полученную культуральную питательную среду в соотношении мышечная ткань : культуральная питательная среда = 1 : 10, центрифугируют до выпадения осадка. При этом надосадочную жидкость выливают, к осадку добавляют 0,25 % раствор коллагеназы краба и 0,1 % раствор трипсина-версена из расчета по 1 мл растворов на 1 г осадка и подвергают ферментативному расщеплению в течение 50–80 мин при комнатной температуре при постоянном покачивании. Далее расщепленную мышечную ткань 2 раза центрифугируют, добавляя чистую питательную среду DMEM, надосадочную жидкость сливают и далее не используют, а осадок ресуспендируют в 0,1 % растворе трипсина-версена при температуре 37 °С и инкубируют в течение 20-22 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют, получают осаждением выделившиеся клетки миобластов. Затем клетки миобластов отмывают от трипсина-версена путем центрифугирования с питательной средой DMEM с добавлением пенициллина и стрептомицина, получают целевые клетки миобластов. Второй этап осуществляют так. Сначала к полученным на первом этапе целевым клеткам миобластов добавляют ростовую среду L-15 с добавлением 5 % FBS и 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина, в весовом соотношении целевые клетки : ростовая среда = 1 : 20. Далее полученную суспензию миобластов высевают на предварительно обработанную 0,1 % раствором желатина культуральную емкость с ростовой средой L-15, высеянные клетки выдерживают на культуральной емкости 30 мин, после чего не прикрепившиеся клетки вместе со средой сливают. Затем заливают прикрепившиеся клетки новой чистой ростовой средой L-15 и инкубируют при 20 °C. После чего при достижении миобластами плотности 70 % проводят рассев на культуральный пластик, снимая миобласты со дна культуральной емкости при помощи 0,25 % трипсина-версена, культивирование проводят не менее 96 ч, получают целевой продукт, состоящий из биомассы миобластов стерляди. И третий этап осуществляют так. Сначала миобласты снимают со дна культуральной емкости при помощи 0,25 % трипсина-версена и при помощи камеры Горяева подсчитывают количество клеток в 1 мл суспензии; затем миобласты высевают в 24-луночный планшет с желатиновым покрытием и культивируют при температуре 20 °C. При этом для установления скорости роста выращенные миобласты снимают с поверхности культуральной емкости при помощи 0,5 % трипсина-версена и проводят подсчет числа клеток в суспензии и определение индекса пролиферации миобластов стерляди с целью проверки качества целевого продукта. Настоящее изобретение позволяет получать биомассу миобластов стерляди с высоким индексом пролиферации, превышающим индекс пролиферации миобластов большинства рыб осетровых пород, который подходит для дальнейшего использования в пищевой промышленности. 2 пр.

Description

Изобретение относится в целом к области биотехнологии, более детально к клеточной технологии, а именно – к способу культивирования мышечных клеток in vitro для создания биомассы миобластов с целью получения миобластов стерляди. Заявленное техническое решение предназначено для разработки в перспективе промышленных технологий по выращиванию ценного пищевого продукта питания преимущественно для человека.

Далее в тексте заявителем приведены термины, которые необходимы для облегчения однозначного понимания сущности заявленных материалов и исключения противоречий и/или спорных трактовок при выполнении экспертизы по существу.

Питательная среда – однокомпонентный или многокомпонентный субстрат, применяемый для культивирования культур клеток высших организмов [Амчук Л. А. Питательные среды Архивная копия от 18 января 2021 на Wayback Machine // Большая медицинская энциклопедия, 3-е изд. — М.: Советская энциклопедия. — Т. 19].

Культуральная питательная среда – представляет собой жидкость или гель, разработана для поддержания роста/пролиферации клеток различного происхождения.
Среда для культивирования клеток состоит из определенного соотношения аминокислот, витаминов, солей, глюкозы, гормонов, факторов
прикрепления, факторов роста; поддерживает буферную систему и осмотическое давление. [https://www.dia-m.ru/page/sredy-dlya-kultivirovaniya-kletok/].

Культуральная среда DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) – широко используемая базовая среда для поддержания роста многих различных клеток млекопитающих. Данная среда содержит высокое содержание глюкозы, пируват натрия, GlutaMAX™, феноловый красный, но не содержит HEPES (https://www.laboratorii.com/reaktivy/zhidkie-pitatelnye-sredy-dlya-mikrobiologii/47507/#:~:text=Описание.%20DMEM%20(Dulbecco's%20Modified%20Eagle,HeLa%2C%20293%2C%20Cos-7%20и%20PC-12).

Миобласты – молодые мышечные клетки у животных, из которых в процессе развития зародыша, а также при регенерации скелетной мускулатуры в послезародышевый период развития организма образуются поперечнополосатые мышечные волокна [https://www.msu.ru/science/news/uchenye-ustanovili-chto-antioksidanty-v-perspektive-mogut-oblegchit-slabost-myshts-litsa.html].

Факторы роста – естественные соединения, способные стимулировать рост, пролиферацию и/или дифференцировку живых клеток. Как правило, это пептиды или стероидные гормоны. Факторы роста функционируют как сигнальные молекулы для взаимодействия между клетками [https://ru.wikipedia.org/wiki/Факторы_роста].

Культивирование клеток – это совокупность методов, используемых для поддержания или выращивания клеток, тканей или органов в стерильных условиях [https://ru.wikipedia.org/wiki/Культура_клеток_и_тканей].

Биомасса клеток – это совокупная масса растительных или животных организмов, присутствующих в биогеоценозе определённого размера или уровня [https://ru.wikipedia.org/wiki/Биомасса].

Культуральный пластик – пластик, предназначенный для выращивания миобластов.

Индекс пролиферации – отношение числа выросших клеток к числу засеянных клеток [https://files.stroyinf.ru/Data2/1/4293732/4293732935.pdf?ysclid=l2uhj657c9, с. 330].

Стерлядь относится к семейству осетровых и по своим питательным свойствам превосходит других рыб из своего семейства [Vishnyakova, K. S., Mugue, N. S., Zelenina, D. A., Mikodina, E. V., Kovaleva, O. A., Madan, G. V., Yegorov, Y. E. Cell culture and karyotype of Sakhalin sturgeon Acipenser mikadoi / K. S. Vishnyakova, N. S. Mugue, D. A. Zelenina, E. V. Mikodina, O. A. Kovaleva, G. V. Madan, Y. E. Yegorov, // Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. – 2009. – Т. 3. – №. 1. – P. 42-54]. При этом в мире имеется тенденция одновременно к сокращению вылова рыбы и высокому спросу на рыбные продукты.

Развитие этой отрасли ограничивают различные проблемы, и одна из них – это время, необходимое большинству выращиваемых видов рыб семейства осетровых для достижения экономически жизнеспособного коммерческого размера, так как известно, что рыбы семейства осетровых растут довольно медленно [https://asu.edu.ru/images/File/dissertacii/dissovet21200913/Nguen-V%27et-Tyuy/dissertation-Nguen-V%27et-Tyuya.pdf]. Поэтому получение клеточного мясного продукта из рыб семейства осетровых актуально для пищевой промышленности. Однако на дату представления заявочных материалов из исследованного заявителем уровня техники не выявлены даже лабораторные технологии, подтверждающие возможность получения миобластов стерляди, из которых теоретически возможно получить образцы мяса стерляди.

На дату представления заявочных материалов заявителем выявлены несколько способов выделения и культивирования биомассы миобластов из мышц рыб.

Известны способы выделения культуры клеток-предшественников, в том числе миобластов, из клеток грудного плавника, включая мелкие фрагменты мягких тканей, описанные в источниках [Wang, G., Lapatra, S., Zeng, L., Zhao, Z., Lu, Y. Establishment, growth, cryopreservation and species of origin identification of three cell lines from white sturgeon, Acipenser transmontanus / G. Wang, S. Lapatra, L. Zeng, Z. Zhao, Y. Lu //Methods in Cell Science. – 2004. – Т. 25. – №. 3-4. – P. 211-220], [Wang, G., Lapatra, S., Zeng, L., Zhao, Z., Lu, Y. Establishment, Growth, Cryopreservation and Species of Origin Identification of Three Cell Lines from White Sturgeon, Acipenser transmontanus / G. Wang, S. Lapatra, L. Zeng, Z. Zhao, Y. Lu //Methods in Cell Science. – 2004. – Т. 25. – №. 3-4. – С. 211-220], [Fryer, J. L., Lannan, C. N. Three decades of fish cell culture: A current listing of cell lines derived from fishes / J. L. Fryer, C. N. Lannan // Journal of Tissue Culture Methods. – 1994. – Т. 16. – №. 2. – С. 87-94], [Grunow, B., Noglick, S., Kruse, C., Gebert, M. Isolation of cells from Atlantic sturgeon Acipenseroxyrinchus oxyrinchusand optimization of culture conditions / B. Grunow, S. Noglick, C. Kruse, M. Gebert //Aquatic Biology. – 2011. – Т. 14. – №. 1. – С. 67-75], [патент RU2412994]. Сущностью известных публикаций является то, что для выращивания культуры миобластов белого осетра использовали четыре питательные среды: MEM, L-15, M199 и RPMI-1640. Наиболее эффективными из них были питательные среды – это MEM, L-15 и M 199, с дополнением 10% FBS, HEPES, рН в пределах 7,0-7,9. Следует отметить, что температура инкубации для линий, выделенных из холодноводных рыб была 4-24 °C (оптимальная: 15-21 °C), для линий от тепловодных рыб - 15-37 °C (оптимальная 25-35 °C). Принимая во внимание необходимость подбора наиболее подходящей питательной среды для выращивания миобластов стерляди заявителем были проведены эксперименты по подбору наиболее подходящей питатальной среды из имеющихся. Эксперименты показали, что наиболее эффективной средой оказалась среда L-15, представляющая собой в целом раствор из ряда известных компонентов, выпускаемый серийно фирмой «Gibco» США.

Недостатком известных технических решений по сравнению с заявленным техническим решением является выделение миобластов из клеток только грудного плавника белого осетра. Данная линия может быть использована в лабораторных исследованиях при производстве вирус-вакцин для профилактики болезней рыб выращиваемых искуственно и диагностикумов для выделения, накопления, титрования и изучения вируса-возбудителя вирусной геморрагической септицемии лососевых (VHSV), инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV), весенней виремии карпов (SVCV), иридовируса карпов (CCIV) и герпес-вируса осетровых (SbSHV), однако полученные клетки могут использоваться только в фундаментальных исследованиях и не могут быть применены для призводства биотехнологического продукта для образцов натурального мяса из культуры миобластов в пищевой промышленности, в силу отсутствия у исследователей задачи по производству мяса осетровых.

Известен источник [Charli Kruse, Marina Gebert, Lars Lüllwitz Method for producing fish cells with increased high quality unsaturated fatty acids and use of these fish cells to produce fish-specific products / 2015-02-25 Publication of EP2500412B8]. Сущностью является способ выделения клеток из личинок атлантического осетра с помощью применения трипсина, в результате чего получается стабильная, хорошо пролиферирующая культура клеток. Условия культивирования этих клеток были оптимизированы с целью поддержки производства большого количества биомассы. Результаты показали, что наилучшая температура культивирования составляет 25 °C, а состав среды состоит из DMEM, дополненной 10 или 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки были стабильны в процессе длительного культивирования в течение 33 пассажей и могли быть криоконсервированы.

Недостатком известных технических решений по сравнению с заявленным техническим решением является назначение выделяемой клеточной культуры. Этот способ извлечения биомассы был подобран для получения рыбных продуктов, таких как рыбная мука, рыбные белки, рыбий жир и/или жирные кислоты, но с его помощью невозможно получить миобласты.

Известна публикация [Kim, M. S., Nam, Y. K., Park, C., Kim, H. W., Ahn, J., Lim, J. M., Gong, S. P. Establishment condition and characterization of heart-derived cell culture in Siberian sturgeon (Acipenser baerii) / M. S. Kim, Y. K. Nam, C. Park, H. W. Kim, J. Ahn, J. M. Lim, S. P. Gong, //In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. – 2014. – Т. 50. – №. 10. – С. 909-917]. Сущностью является способ выделения клеток, полученных из сердца сибирского осетра. Для культивирования клеток использовали два типа сред: среда L-15 и DMEM, содержащая ХЕПЕС. Каждая среда была дополнена 20% (v/v) FBS и 1% (v/v) смесь пенициллина и стрептомицина, и рН среды доводили до 7,4. Клетки, полученные из сердца, культивировали в лунке с 0,1% желатином - пластины для культивирования тканей с покрытием.

Недостатком известного технического решения по сравнению с заявленным является получение клеток из сердца сибирского осетра, что представляет сложность в выделении клеток.

Известно изобретение по патенту RU № 2348689 «Постоянная линия клеток sso-2 пула паренхиматозных органов сибирского осетра Аcipenser baeri». Сущностью является постоянная клеточная линия SSO-2 пула паренхиматозных органов сеголетков сибирского осетра, Acipenser baeri, используемая в вирусологических исследованиях и чувствительная к 7 вирусам разных видов рыб, депонирована в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под № 67.

Кратко сущностью известного технического решения является то, что получаемую постоянную клеточную линию SSO-2 пула паренхиматозных органов (почка, печень, селезенка) сеголетков сибирского осетра, Acipenser baeri, используют в вирусологических исследованиях, так как данная клеточная линия чувствительна к 7 вирусам разных видов рыб. В известном техническом решении указано, что клеточную линию SSO-2 культивируют в монослойных культурах в среде 199 с добавлением 10% FBS. 

Недостатком известного технического решения является то, что оно относится к биотехнологии, в частности к получению перевиваемых линий клеток рыб, пригодных для выделения и изучения вирусов рыб разных таксономических групп. Линия SSO-2 может быть использована как тест-культура для выделения, накопления, титрования и изучения герпесвируса сибирского осетра (SSHV), вирусов весенней виремии карпа (SVCV), вирусной геморрагической септицемии (VHSV), инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV), рабдовируса европейского угря, мальков щуки европейской озерной кумжи. Полученная линия клеток не может быть использована в пищевой промышленности, потому что ее выделяют из паренхиматозных органов - селезенка, почка, печень. Данная линия клеток в будущем не может быть использована для культивирования клеточного пищевого продукта. Одним из недостатков также является сложность и трудоемкость выделения культуры клеток из паренхиматозных органов.

Известно изобретение по патенту JP5702092B2 «Новая установленная клеточная линия осетрового происхождения», сущностью являются клетки STIP-2 (FERM BP-11274), представляющие собой клеточные линии, полученные из клеток пигментного эпителия радужной оболочки глазного яблока бестера, одного из видов осетровых.

Недостатком известного технического решения является то, что полученные линии клеток  ожидается использовать для диагностики вирусных инфекций осетровых, для изготовлении эффективных вакцин против вирусных инфекций осетровых, для изучения цитотоксичности химических веществ и тяжелых металлов. Данная линия клеток не подходит в последующем для получения клеточного пищевого продукта. Одним из недостатков также можно отметить сложность выделения линии клеток из эпителиальных клеток глаза.

Известно изобретение по патенту JP4065150B2 «Новая установленная клетка, полученная из осетровых», сущностью является линия клеток глазного яблока осетровых рыб. Линия клеток по п.1, отличающаяся тем, что осетр является бестером. Линия клеток по п.1, полученная из эпителиальных клеток глаза. Линия клеток по п.1, полученная из клеток пигментного эпителия радужки. Линия клеток по любому из пп.1-4, которую можно пересевать без добавления внеклеточного матрикса. Линия клеток по любому из пп.1-5, которую можно пересевать 50 раз или более. Линия клеток по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что время удвоения со 2-го по 6-й день после начала культивирования при 20 °С составляет менее 50 часов. Линия клеток по любому из пп.1-7, в которой скорость оседания от добавления в чашку для культивирования до адгезии составляет 75% или более через 1 час. Клетки STIP-1 (FERM P-18909), представляющие собой клеточные линии осетровых рыб. Клетки STIP-3 (FERM P-18910), которые представляют собой клеточные линии осетровых рыб.

Недостатком известного технического решения является то, что полученные линии клеток  ожидается использовать для диагностики вирусных инфекций осетровых, для изготовлении эффективных вакцин против вирусных инфекций осетровых, для изучения цитотоксичности химических веществ и тяжелых металлов. Данная линия клеток не подходит в последующем для получения клеточного пищевого продукта. Одним из недостатков также можно отметить сложность выделения линии клеток из эпителиальных клеток глаза.

Известно изобретение по патенту US7132230B2 «Цитотоксический анализ и новая созданная клеточная линия осетровых рыб». Сущностью является цитотоксический анализ, в котором оценка токсичности образца проводится на основе его токсичности для установленной клеточной линии, происходящей от осетровых рыб. Цитотоксический анализ по п. 1, отличающийся тем, что используют установленную клеточную линию бестерского происхождения. Цитотоксический анализ по п. 1, отличающийся тем, что используют установленную клеточную линию эпителиального происхождения. Цитотоксический анализ по п. 3, отличающийся тем, что используют установленную клеточную линию, происходящую из глазных эпителиальных клеток. Цитотоксический анализ по п. 4, отличающийся тем, что используют установленную клеточную линию, происходящую из клеток пигментированного эпителия радужки. Цитотоксический анализ по п. 1, отличающийся тем, что используют установленную клеточную линию, пассирование которой возможно без добавления внеклеточного матрикса. Цитотоксический анализ по п. 1, отличающийся тем, что используют установленную клеточную линию, в которой возможно 50-кратное или более пассирование культур. Цитотоксический анализ по п. 1, отличающийся тем, что используют стабильную клеточную линию, имеющую время удвоения менее 50 часов со второго по шестой день после инициации культивирования при 20°С. Цитотоксический анализ по п. 1, отличающийся тем, что используют установленную клеточную линию, имеющую эффективность посева 75% или более, которая представляет собой процент клеток, прикрепленных к чашке для культивирования через один час после добавления этих клеток в чашку для культивирования. Цитотоксический анализ по п. 1, отличающийся тем, что используют клетки STIP-1 (FERM BP-8421), которые включены в установленную клеточную линию, происходящую из глазного яблока осетровых. Цитотоксический анализ по п. 1, отличающийся тем, что используют клетки STIP-3 (FERM BP-8422), которые включены в установленную клеточную линию, происходящую из глазного яблока осетровых. Цитотоксический анализ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки токсичности образца используют анализ с аламаровым синим. Установленная клеточная линия происхождения глазного яблока бестера. Установленная клеточная линия по п. 13, отличающаяся тем, что рыба осетровой породы представляет собой гибрид белуги и стерляди - бестер. Установленная клеточная линия по п. 13, отличающаяся тем, что установленная клеточная линия имеет происхождение из глазных эпителиальных клеток. Укоренившаяся клеточная линия по п. 13, отличающаяся тем, что укоренившаяся клеточная линия имеет происхождение из клеток пигментированного эпителия радужки. Установленная клеточная линия по п. 13, отличающаяся тем, что пассирование культуры возможно без добавления внеклеточного матрикса. Установленная клеточная линия по п. 13, отличающаяся тем, что возможно 50-кратное или более пассирование культур. Укоренившаяся клеточная линия по п. 13, отличающаяся тем, что время ее удвоения составляет менее 50 часов со второго по шестой день после инициации культивирования при 20°C. Установленная клеточная линия по п. 13, отличающаяся тем, что эффективность посева составляет 75% или более, что представляет собой процент клеток, прикрепленных к чашке для культивирования через один час после добавления этих клеток в чашку для культивирования. Клетки STIP-1 (FERM BP-8421), установленная клеточная линия глазного яблока осетра. Клетки STIP-3 (FERM BP-8422), установленная клеточная линия глазного яблока осетра.

Недостатком известного технического решения является то, что полученные линии клеток  ожидается использовать для диагностики вирусных инфекций осетровых, для изготовлении эффективных вакцин против вирусных инфекций осетровых, для изучения цитотоксичности химических веществ и тяжелых металлов. Данная линия клеток не подходит в последующем для получения клеточного пищевого продукта. Одним из недостатков также можно отметить сложность выделения линии клеток из эпителиальных клеток глаза.

Таким образом, из исследованного уровня техники можно сделать вывод, о том, что известные технические решение совпадают с заявленным техническим решением по отдельным признакам, но не совпадают по назначению, поэтому прототип не определен и формула изобретения составлена без ограничительной части.

Техническим результатом заявленного технического решения является разработка способа культивирования биомассы миобластов, полученных из мышц стерляди, для применения в биотехнологии, для подтверждения возможности получения из выделенных миобластов образцов мяса стерляди с возможностью дальнейшей разработки технологии промышленного изготовления мяса стерляди. В результате проведенных исследований, достигнута возможность получения биомассы миобластов стерляди с высоким индексом пролиферации, превышающий индекс пролиферации миобластов большинства рыб осетровых пород, который подходит для дальнейшего использования в пищевой промышленности.

Сущностью заявленного технического решения является способ культивирования биомассы миобластов, полученных из мышц стерляди, заключающийся в том, что культивирование проводят в три этапа: на первом этапе проводят выделение миобластов из малька стерляди, для чего берут тушку стерляди в возрасте до 1,5 месяцев, стерилизуют, помещают в стерильные условия, удаляют кожу со спинной стороны, затем срезают белую мышечную ткань; далее берут питательную среду и добавляют 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, получают культуральную питательную среду; далее срезанную мышечную ткань измельчают, помещают в полученную культуральную питательную среду в соотношении мышечная ткань : культуральная питательная среда = 1 : 10, центрифугируют до выпадения осадка; далее надосадочную жидкость выливают, к осадку добавляют 0,25% раствор коллагеназы краба и 0,1 % раствор трипсина-версена из расчета по 1 мл растворов на 1 г осадка, и подвергают ферментативному расщеплению в течение 50 – 80 мин при комнатной температуре при постоянном покачивании; затем расщепленную мышечную ткань 2 раза центрифугируют, добавляя чистую питательную среду, надосадочную жидкость сливают, и далее не используют, а осадок ресуспендируют в 0,1% растворе трипсина-версена при температуре 37 °С, и инкубируют в течение 20-22 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют, получают осаждением выделившиеся клетки миобластов; далее клетки миобластов отмывают от трипсина-версена путем центрифугирования с питательной средой DMEM с добавлением пенициллина и стрептомицина, получают целевые клетки миобластов; на втором этапе выполняют культивирование клеток миобластов, для чего к полученным на Этапе 1 целевым клеткам миобластов добавляют ростовую среду L-15 с добавлением 5% FBS и 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина, в весовом соотношении целевые клетки : ростовая среда = 1 : 20; далее полученную суспензию миобластов высевают на предварительно обработанную 0,1% раствором желатина культуральную емкость с культуральной средой L-15, далее высеянные клетки выдерживают на культуральной емкости 30 мин, после чего не прикрепившиеся клетки вместе со средой сливают; далее заливают прикрепившиеся клетки новой чистой ростовой средой и инкубируют при 20 °C; далее, при достижении миобластами плотности 70%, проводят рассев на культуральный пластик, снимая миобласты со дна культуральной емкости при помощи 0,25% трипсина-версена, культивирование проводят не менее 96 часов, получают целевой продукт, состоящий из биомассы миобластов стерляди; на третьем этапе проводят определение индекса пролиферации миобластов стерляди, как отношение числа выросших клеток к числу засеянных клеток, для чего миобласты снимают со дна культуральной емкости при помощи 0,25% трипсина-версена, и при помощи камеры Горяева подсчитывают количество клеток в 1 мл суспензии; затем миобласты высевают в 24-луночный планшет с желатиновым покрытием и культивируют при температуре 20 °C; при этом для установления скорости роста выращенные миобласты снимают с поверхности культуральной емкости при помощи 0,5% трипсина-версена и проводят подсчет числа клеток в суспензии и определение индекса пролиферации миобластов стерляди с целью проверки качества целевого продукта. Биомасса миобластов, полученная способом по п.1, состоящая из миобластов мышечной ткани стерляди.

Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.

Заявленный технический результат достигается получением заявленной массы миобластов, пригодных для масштабирования до промышленных объёмов заявленным способом.

В целом сущность заявленного технического решения заключается в выполнении следующей последовательности операций из трёх этапов.

Этап 1. Выделение миобластов из малька стерляди.

Берут тушку стерляди в возрасте до 1,5 месяцев, стерилизуют, например, 70% этиловым спиртом, помещают в стерильные условия, удаляют кожу со спинной стороны, затем срезают белую мышечную ткань.

Далее берут питательную среду и добавляют 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, получают культуральную питательную среду.

Срезанную мышечную ткань измельчают, помещают в полученную культуральную питательную среду в соотношении мышечная ткань: культуральная питательная среда = 1 : 10, центрифугируют до выпадения осадка.

Далее надосадочную жидкость выливают, к осадку добавляют 0,25% раствор коллагеназы краба и 0,1 % раствор трипсина-версена из расчета по 1 мл растворов на 1 г осадка, и подвергают ферментативному расщеплению в течение 50 – 80 мин при комнатной температуре при постоянном покачивании.

Затем расщепленную мышечную ткань 2 раза центрифугируют, добавляя чистую питательную среду.

Надосадочную жидкость сливают и далее не используют, осадок ресуспендируют в 0,1% растворе трипсина-версена при температуре 37 °С, и инкубируют в течение 20-22 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют, получают осаждением выделившиеся клетки миобластов.

Затем клетки миобластов отмывают от трипсина-версена путем центрифугирования с питательной средой DMEM с добавлением пенициллина и стрептомицина, с получением целевых клеток миобластов.

Этап 2. Культивирование клеток миобластов.

К полученным целевым клеткам миобластов добавляют ростовую среду L-15 с добавлением 5% FBS и 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина, в весовом соотношении целевые клетки : ростовая среда = 1 : 20.

Полученную суспензию миобластов высевают в предварительно обработанную 0,1% раствором желатина культуральную емкость с культуральной средой L-15.

Высеянные клетки выдерживают на культуральной емкости 30 мин., затем не прикрепившиеся клетки вместе со средой сливают.

Далее заливают прикрепившиеся клетки новой чистой ростовой средой, и инкубируют при 20 °C.

При достижении миобластами плотности 70% проводят рассев на культуральный пластик, снимая миобласты со дна культуральной емкости при помощи 0,25% раствора трипсина-версена.

Культивирование проводят не менее 96 часов.

Получают целевой продукт – заявленную биомассу миобластов стерляди.

Этап 3. Определение индекса пролиферации миобластов стерляди.

Далее выполняют расчёт индекса пролиферации, как отношение числа выросших клеток к числу засеянных клеток.

Для этого миобласты снимают со дна культуральной емкости при помощи 0,25% трипсина-версена, и при помощи камеры Горяева подсчитывают количество клеток в 1 мл суспензии, затем миобласты высевают в 24-луночный планшет с желатиновым покрытием и культивируют при температуре 20 °C.

Для установления скорости роста выращенные миобласты снимают с поверхности культуральной емкости при помощи 0,5% трипсина-версена и проводят подсчет числа клеток в суспензии и определение индекса пролиферации миобластов стерляди с целью проверки качества целевого продукта.

Далее заявителем приведены примеры осуществления заявленного технического решения, выполненные в соответствии с описанной выше последовательностью действий.

Пример 1. Выделение миобластов из малька стерляди при времени ферментативного расщепления 50 мин.

Этап 1. Берут тушку стерляди в возрасте до 1,5 месяцев, стерилизуют, например, 70% этиловым спиртом, помещают в стерильные условия, например, в ламинарный бокс, удаляют кожу со спинной стороны, затем срезают белую мышечную ткань, например, массой 10 г.

Далее берут питательную среду, например, DMEM (ПанЭко, Россия) и добавляют 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, например, ООО НПП «ПанЭко», получают готовую питательную среду для выделения миобластов.

Срезанную мышечную ткань измельчают, помещают в полученную среду в примерном соотношении 1:10, центрифугируют, например, при 1400 об/мин. до выпадения осадка.

Далее надосадочную жидкость выливают, к осадку добавляют 0,25% раствор коллагеназы краба и 0,1 % раствор трипсина-версена из расчета по 1 мл растворов на 1 г осадка, и подвергают ферментативному расщеплению в течение 50 мин при комнатной температуре при постоянном покачивании, например, при 180 об/мин.

Затем расщепленную мышечную ткань центрифугируют, например 2 раза, добавляя чистую питательную среду.

Надосадочную жидкость выливают и далее не используют, а осадок ресуспендируют, например, в 0,1% растворе трипсина-версена при температуре 37 °С, и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют, например, при оборотах 1400 об/мин, получают осаждением выделившиеся клетки.

Затем клетки миобластов отмывают от трипсина-версена путем центрифугирования, например, с питательной средой DMEM с добавлением пенициллина и стрептомицина.

Этап 2. Культивирование клеток миобластов.

К полученному на Этапе 1 осадку (целевым клеткам миобластов) добавляют ростовую среду L-15 с добавлением 5% FBS и 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина, в весовом соотношении целевые клетки : ростовая среда = 1 : 20.

Полученную суспензию миобластов высевают на предварительно обработанную 0,1% раствором желатина культуральную емкость с культуральной средой L-15.

Высеянные клетки выдерживают на культуральной емкости, например, 30 мин, затем не прикрепившиеся клетки вместе со средой сливают.

Далее заливают прикрепившиеся клетки новой чистой ростовой средой L-15, и инкубируют при 20 °C, например, в СО2-инкубаторе.

При достижении миобластами плотности, например, 70%, проводят рассев на культуральный пластик, например, на культуральную емкость объемом зоны роста 175 см², снимая миобласты со дна культуральной емкости при помощи, например, 0,25% трипсина-версена.

Культивирование проводят не менее 96 часов.

Получают целевой продукт – заявленную биомассу миобластов стерляди.

Этап 3. Определение индекса пролиферации миобластов стерляди.

Далее выполняют расчёт индекса пролиферации, как отношение числа выросших клеток к числу засеянных клеток.

Для этого миобласты снимают со дна культуральной емкости при помощи, например, 0,25% трипсина-версена, и при помощи камеры Горяева подсчитывают количество клеток в 1 мл суспензии. Затем миобласты высевают, например, в 24-луночный планшет с желатиновым покрытием и культивируют, например, в СО₂-инкубаторе, например, при 20 °C.

Для установления скорости роста выращенные миобласты снимают с поверхности культуральной емкости при помощи 0,5% трипсина-версена, например, через 24, 48, 72, 96 ч соответственно, и проводят подсчет числа клеток в суспензии и определение индекса пролиферации миобластов стерляди с целью проверки качества целевого продукта.

Индекс пролиферации составил: через 24, 48, 72 и 96 часов культивирования 0,5; 0,7; 1,0 и 4,0 соответственно.

Таким образом, для достижения заявленного технического результата необходимо проводить культивирование не менее 96 часов.

Пример 2. Выделение миобластов из малька стерляди при времени ферментативного расщепления 80 мин.

Этап 1. Берут тушку стерляди в возрасте до 1,5 месяцев, стерилизуют, например, 70% этиловым спиртом, помещают в стерильные условия, например, в ламинарный бокс, удаляют кожу со спинной стороны, затем срезают белую мышечную ткань, например, массой 10 г.

Далее берут питательную среду, например, DMEM (ПанЭко, Россия) и добавляют 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, например, ООО НПП «ПанЭко», получают готовую питательную среду для выделения миобластов.

Срезанную мышечную ткань измельчают, помещают в полученную среду в примерном соотношении 1:10, центрифугируют, например, при оборотах 1400 об/мин до выпадения осадка.

Далее надосадочную жидкость выливают, к осадку добавляют 0,25% раствор коллагеназы краба и 0,1 % раствор трипсина-версена из расчета по 1 мл растворов на 1 г осадка, и подвергают ферментативному расщеплению в течение 80 мин при комнатной температуре при постоянном покачивании, например, при 180 об/мин.

Затем расщепленную мышечную ткань центрифугируют, например 2 раза, добавляя чистую питательную среду.

Надосадочную жидкость сливают и далее не используют, а осадок ресуспендируют, например, в 0,1% растворе трипсина-версена при температуре 37 °С, и инкубируют в течение 22 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют, например, при оборотах 1400 об/мин, получают осаждением выделившиеся клетки миобластов.

Затем клетки миобластов отмывают от трипсина-версена путем центрифугирования, например, с питательной средой DMEM с добавлением пенициллина и стрептомицина.

Этап 2. Культивирование клеток миобластов.

К полученному на Этапе 1 осадку (целевым клеткам миобластов) добавляют ростовую среду L-15 с добавлением 5% FBS и 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина, в весовом соотношении целевые клетки : ростовая среда = 1 : 20.

Полученную суспензию миобластов высевают на предварительно обработанную 0,1% раствором желатина культуральную посуду с культуральной средой L-15.

Высеянные клетки выдерживают на культуральной емкости, например, 30 мин, после чего не прикрепившиеся клетки вместе со средой сливают.

Далее заливают прикрепившиеся клетки новой чистой ростовой средой L-15, и инкубируют при 20 °C, например, в СО2-инкубаторе.

При достижении миобластами плотности, например, 70%, проводят рассев на культуральный пластик, например, на культуральную емкость объемом зоны роста 175 см², снимая миобласты со дна культуральной емкости при помощи, например, 0,25% трипсина-версена.

Культивирование проводят не менее 96 часов.

Получают целевой продукт – состоящий из заявленных миобластов мышечной ткани стерляди.

Этап 3. Определение индекса пролиферации миобластов стерляди.

Далее выполняют расчёт индекса пролиферации, как отношение числа выросших клеток к числу засеянных клеток.

Для этого миобласты снимают со дна культуральной емкости при помощи, например, 0,25% трипсина-версена, и при помощи камеры Горяева подсчитывают количество клеток в 1 мл суспензии. Затем миобласты высевают, например, в 24-луночный планшет с желатиновым покрытием и культивируют, например, в СО2-инкубаторе, например, при 20 °C.

Для установления скорости роста выращенные миобласты снимают с поверхности культуральной емкости при помощи 0,5% трипсина-версена, например, через 24, 48, 72, 96 ч соответственно, и проводят подсчет числа клеток в суспензии и определение индекса пролиферации миобластов стерляди с целью проверки качества целевого продукта.

Индекс пролиферации составил: через 24, 48, 72 и 96 часов культивирования 0,5; 0,7; 1,0 и 4,0 соответственно.

Таким образом, для достижения заявленного технического результата необходимо проводить культивирование не менее 96 часов.

По мнению заявителя, заявленный способ возможно использовать в промышленных масштабах при культивировании в биореакторах, поскольку в них возможно выдержать режим, описанный в примерах 1 и 2. При этом возможно получить клеточный пищевой продукт, содержащий миобласты стерляди.

Из описанного выше можно сделать вывод, что заявителем достигнут заявленный технический результат, а именно: разработан способ культивирования биомассы миобластов, полученных из мышц стерляди, для применения в биотехнологии, пищевой технологии, в результате чего достигнута возможность получения биомассы миобластов стерляди с высоким индексом пролиферации для дальнейшего использования в пищевой промышленности.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как при определении уровня техники не выявлено техническое решение, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) совокупности признаков, перечисленных в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками заявленного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как может быть изготовлено с использованием известных материалов и оборудования.

Claims (16)

1. Способ культивирования биомассы миобластов, полученных из мышц стерляди, заключающийся в том, что культивирование проводят в три этапа:
2. на первом этапе проводят выделение миобластов из малька стерляди, для чего берут тушку стерляди в возрасте до 1,5 месяцев, стерилизуют, помещают в стерильные условия, удаляют кожу со спинной стороны, затем срезают белую мышечную ткань;
3. далее берут питательную среду DMEM и добавляют 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, получают культуральную питательную среду;
4. далее срезанную мышечную ткань измельчают, помещают в полученную культуральную питательную среду в соотношении мышечная ткань : культуральная питательная среда = 1 : 10, центрифугируют до выпадения осадка;
5. далее надосадочную жидкость выливают, к осадку добавляют 0,25 % раствор коллагеназы краба и 0,1 % раствор трипсина-версена из расчета по 1 мл растворов на 1 г осадка и подвергают ферментативному расщеплению в течение 50–80 мин при комнатной температуре при постоянном покачивании;
6. затем расщепленную мышечную ткань 2 раза центрифугируют, добавляя чистую питательную среду DMEM,
7. надосадочную жидкость сливают и далее не используют, а осадок ресуспендируют в 0,1 % растворе трипсина-версена при температуре 37 °С и инкубируют в течение 20-22 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют, получают осаждением выделившиеся клетки миобластов;
8. далее клетки миобластов отмывают от трипсина-версена путем центрифугирования с питательной средой DMEM с добавлением пенициллина и стрептомицина, получают целевые клетки миобластов;
9. на втором этапе выполняют культивирование клеток миобластов, для чего к полученным на первом этапе целевым клеткам миобластов добавляют ростовую среду L-15 с добавлением 5 % FBS и 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина, в весовом соотношении целевые клетки : ростовая среда = 1 : 20;
10. далее полученную суспензию миобластов высевают на предварительно обработанную 0,1 % раствором желатина культуральную емкость с ростовой средой L-15,
11. далее высеянные клетки выдерживают на культуральной емкости 30 мин, после чего не прикрепившиеся клетки вместе со средой сливают;
12. далее заливают прикрепившиеся клетки новой чистой ростовой средой L-15 и инкубируют при 20 °C;
13. далее, при достижении миобластами плотности 70 %, проводят рассев на культуральный пластик, снимая миобласты со дна культуральной емкости при помощи 0,25 % трипсина-версена, культивирование проводят не менее 96 ч, получают целевой продукт, состоящий из биомассы миобластов стерляди;
14. на третьем этапе проводят определение индекса пролиферации миобластов стерляди как отношение числа выросших клеток к числу засеянных клеток, для чего
15. миобласты снимают со дна культуральной емкости при помощи 0,25 % трипсина-версена и при помощи камеры Горяева подсчитывают количество клеток в 1 мл суспензии; затем миобласты высевают в 24-луночный планшет с желатиновым покрытием и культивируют при температуре 20 °C;
16. при этом для установления скорости роста выращенные миобласты снимают с поверхности культуральной емкости при помощи 0,5 % трипсина-версена и проводят подсчет числа клеток в суспензии и определение индекса пролиферации миобластов стерляди с целью проверки качества целевого продукта.