KR20230096183A - 고효율 다중 스펙트럼 검출을 위한 라인 공초점 세포 계수기 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고효율 다중 스펙트럼 검출을 제공하는 공초점 세포 계수기에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 공초점 세포계수기는, 시료에 광을 조사하기 위한 광 조사 모듈; 분석하고자 하는 세포를 포함하는 시료가 이동하는 유속 채널 (flow channel); 유속 채널 내에서 시료를 이동시키기 위한 스캐닝 모듈 (scanning module); 조사된 광에 의해 세포로부터 여기된 형광단으로부터 방출되는 광자를 수집하는 콜렉션 옵틱스; 이색 빔 스플리터 어레이; 포커싱 렌즈; 및 카메라 영역 센서로 구성되어, 시 료내 하나 이상의 이벤트를 동시에 검출하는 것인, 라인 공초점 세포계수기를 제공한다.
Description
본 발명은 세포 계수기에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 다수의 세포를 고효율로 검출하기 위한 라인 공초점 세포 계수기에 관한 것이다.
세포 계수 및 생존율 평가는 세포 배양을 수행하는 실험실에서 일반적으로 수행되고 있다. 혈구계산기(hemocytometer)가 혈구 계수에 처음 사용된 이후, 시료 준비 및 계수의 자동화를 통해 분석 시간을 줄이고 정확도를 향상시키기 위해 다양한 자동화 또는 반자동 장비가 개발되어 왔다. 현재 사용 중인 자동화 또는 반자동 세포 계수기는 시료 분석 프로세스를 용이하게 하였으나 사용 가능한 염색(staining)이 제한적이다. 또한, 하드웨어와 소프트웨어의 기술적인 한계로 인해 일부 유형의 세포를 구별하는 데 부정확하다. 또한, 세포의 총 농도가 증가할수록 오류가 감소하는 반면에, 기존 장비에서 분석할 수 있는 시료의 양은 제한적이며 이는 검출 정확도에 영향을 미친다. 즉, 시료에 포함된 세포를 효율적으로 검출하기 위해서는 충분한 수의 세포가 전체 관측 시야 범위 내에 포함되어야 하는데, 이러한 가능성은 주요 세포의 밀도가 포화 상태에 있을 때에 보다 더 높으며, 이는 장치 분석 성능의 선형범위(linear range)를 결정한다. 이와 같이, 혈구 계수기에 있어서, 최대의 정밀도 (precision), 정확도 (accuracy) 및 선형성(linearity)을 얻기 위해서는 대량의 시료를 분석하는 것이 필요하다.
현재 자동화된 이미지 기반 세포 계수기는 로고스바이오시스템스 (Logos Biosystems), 써모-피셔 (Thermo-Fisher), 바이오-라드 (Bio-Rad) 등 몇몇 회사들에 의해 개발되어 시판 중이다. 이러한 자동화된 세포 계수 장치는, 이미지 획득을 위한 디지털 카메라로 구성되며, 사용자 개입이 최소화된 특화된 소프트웨어를 통해 분석이 수행된다. 자동화된 세포 계수기는 샘플 분석 프로세스를 용이하게 하였으나, 이용 가능한 세포 염색 (staining) 시약이 제한적이며, 하드웨어와 소프트웨어의 기술적 제한과 분석가능한 샘플 양의 제한으로 인해 정확도가 떨어질 수 있는 문제가 있다. 써모-피셔의 반자동 카운테스(Countess, 상표명)와 Beckman Coulter의 완전 자동화된 Vi-CELL XR(상표명)은 고효율 세포 계수에 사용되는 기기이며, 혈구 계수기와 함께 트립판 블루 (trypan blue) 배제 기술을 기반으로 생존 세포 계수에 이용될 수 있다. 구체적으로, 손상된 세포막을 투과한 염료에 의해 파란색으로 염색된 세포는 생존하지 않은 것으로 간주되는 반면, 염색되지 않은 세포는 손상되지 않고 생존한 세포로 간주되므로, 이들 장비를 이용하여 손상된 세포를 확인할 수 있다. 그러나 이들 장비 또한 사용가능한 분석 시료의 양이 제한적이고, 멀티플렉스 (multiplex) 데이터 분석을 위한 색 채널 (color channel) 수가 제한적이라는 한계가 있다. 또한, 이러한 반자동 장치는 트리판 블루 농도에 매우 민감하다. 이처럼, 현재 사용되는 자동화 및 반자동 세포 계수기는 샘플 분석 프로세스를 용이하게 하였으나, 호환 가능한 염색 옵션의 가용성이 제한적이고, 하드웨어와 소프트웨어 기술의 한계로 인해 일부 세포 유형은 이의 식별에 어려움이 있을 수 있다.
종래 유세포 분석 기술은 스캐터링 (scattering) 및 다중 스펙트럼 형광 지표(criteria)에 기초한 분류(classification)로 대량 시료의 분석에 이용될 수 있으나, 그 처리량은 일정 시간에서의 단일 세포 분석으로 제한된다. 고효율 이미징을 위해 현미경과 유세포 분석의 장점을 통합한 하이브리드 기술인 이미징 유세포 분석이 개발되었으며, 이는 세포 내 정보 콘텐츠에서 상당한 향상을 제공한다. 그러나, 고속으로 이동하는 단일 세포에 대한 고해상도 이미지의 필요성, 형광 및 명시야와 같은 여러 이미징 모드의 통합, 및 짧은 노출 시간 사용시 적절한 검출 감도의 실현 등을 포함하는 다수의 기술적인 문제로 인해, 기존의 유세포 분석기에 비해 거의 10배 낮은 수준의 분석 효율을 갖는다. 따라서 대량의 시료 내에서 많은 수의 세포를 계수하기 위한 자동화 기술의 성공적인 구현은, 세포 염색의 조절, 시그널 판독 매개변수 및 장치 성능에 따른다.
이에 본 발명자들은 대량의 시료로부터 세포를 계수하기 위한 방법 및 장치를 개발하고자 노력하였으며, 그 결과 라인 공초점 구조, 다중 스펙트럼, 및 가상 슬릿의 어레이를 통해 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 대량의 시료에 포함된 고밀도 세포에 대한 고효율 다중 스펙트럼 분석을 위한 방법 및 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 고효율 다중 스펙트럼 검출을 갖는 라인 공초점 세포 계수기를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 공초점 세포계수기로서, 시료에 광을 조사하기 위한 광 조사 모듈; 분석하고자 하는 세포를 포함하는 시료가 이동하는 유속 채널 (flow channel); 유속 채널 내에서 시료를 이동시키기 위한 스캐닝 모듈 (scanning module); 조사된 광에 의해 세포로부터 여기된 형광단으로부터 방출되는 광자를 수집하는 콜렉션 옵틱스 (collection optics); 이색 빔 스플리터 (dichroic beam splitter) 어레이; 포커싱 렌즈; 및 카메라 영역 센서로 구성된, 라인 공초점 세포계수기를 제공한다. 이와 관련된 일 구체예, 상기 라인 공초점 계수기는 슬릿을 통해 상기 유속 채널에 조사되는 광 입자의 얇은 라인이 상기 유속 채널의 물체 평면 내에 형성되고, 상기 콜렉션 옵틱스, 이색 빔 스플리터 어레이, 및 포커싱 렌즈를 통해 카메라 영역 센서 표면에서 가상 슬릿 어레이로 컨쥬게이션되는 것인, 라인 공초점 세포 계수기일 수 있다. 이와 관련된 일 구현예에서, 상기 카메라 영역 센서는 물체평면 내 시야의 개별 부분에 상응하는 개별 포토다이오드 (photodiodes) 일 수 있다.
이와 관련된 본 발명의 다른 일 구체예에서, 본 발명의 공초점 계수기에서 상기 광 조사 모듈은 멀티컬러 레이져 모듈, 빔 성형 광학 모듈, 및 반사 미러로 구성되고, 상기 광 조사는 얇은 멀티컬러 레이저 라인일 수 있다.
이와 관련된 또 다른 일 구체예에서, 상기 가상 슬릿 어레이의 슬릿의 개수는 검출하고자 하는 형광단 색의 수에 상응하며, 슬릿의 두께(폭)가 조절 가능한 것일 수 있다.
이와 관련된 또 다른 구체예에서, 상기 가상 슬릿의 폭은 형광단 강도, 형광단 색의 수, 배경 노이즈 시그널의 수준, 세포 유속 및 카메라 매개변수에 따라 조절가능한 것일 수 있다.
이와 관려된 또 다른 일 구체예에서, 상기 가상 슬릿의 폭이 1 내지 10 픽셀까지 조절되는 것일 수 있다.
본 발명은 대량 분석 시료에 포함된 고밀도 세포에 대한 고효율 다중 스펙트럼 검출을 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 본 발명에 따른 라인 공초점 세포 계수기는 유세포 분석과 광 시야 세포 계수 기술 둘 모두의 장점을 포함하여, 하나의 카메라만을 사용하면서도 다수의 염색을 동시에 검출 할 수 있다. 따라서 본 발명의 라인 공초점 세포 계수기는 대량 시료 중에 포함된 고밀도 세포의 고효율 분석에 이용될 수 있다.
도 1은 컨쥬게이션된 가상 슬릿을 지닌 공초점 세포 계수기의 개략도이다.
도 2는 검출 대상 및 이미지 공간 내에 컨쥬게이션된 가상의 슬릿을 형성한 것을 나타내는 개략도이다.
도 2는 검출 대상 및 이미지 공간 내에 컨쥬게이션된 가상의 슬릿을 형성한 것을 나타내는 개략도이다.
본 발명은 대량의 분석 시료 내의 고밀도 세포에 대한 고효율 다중 스펙트럼 분석을 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 본 발명의 장치는 유세포 분석과 광 시야 세포 계수 기술 둘 모두의 장점을 갖는다. 유세포 분석 기술과 유사하게, 본 발명의 장치는 향상된 이미지 콘트라스트 (image contrast), 해상도 (resolution) 및 제한된 피사계심도(depth of field)를 위한 공초점 구조, 대용량 시료 분석, 및 다중 스펙트럼 검출을 특징으로 한다. 광 시야 세포 계수기와 유사하게, 본 발명의 카메라 영역 센서는, 물체평면(object plane) 내 시야의 개별 부분에 대응하는 개별 포토다이오드(photodiodes)의 어레이일 수 있다. 상기 개별 포토다이오드는 면적센서(area sensors)로서 활용되며, 여러 이벤트를 병렬로 검출할 수 있다. 즉, 하나 이상의 다수의 형광단 또는 염색을 통시에 검출 할 수 있다.
본 발명의 장치는, 컨쥬게이션된 라인 공초점 가상 슬릿(line conjugated confocal virtual slits)에 의해 제한되는 검출 영역 내 시야의 일부만이 카메라 영역 센서로 투사되고, 샘플이 외부 펌프에 의해 상기 제한된 라인 영역을 통해 펌핑될 때, 라인 스캐닝 모드에서 작동된다. 검출 볼륨 내의 이미지 영역은 얇은 멀티컬러 (multicolor) 레이저 라인으로 광 조사될 수 있다. 염색된 세포가 이 영역을 통과하면, 형광단(fluorophores)이 여기되고 방출된 광자가 현미경 렌즈에 의해 수집되며 이색 빔스플리터 (dichroic beamsplitter) 어레이를 통해 카메라 영역 센서 상으로 투영된다. 각 색상에 대응하는 카메라 영역 센서의 규정된 선형 부분은 시료의 레이저 조사 부분의 상응하는 영역 내에서 시그널 변동에 민감한 구분된 광검출기의 선형 어레이 기능을 한다. 따라서, 하나의 카메라 영역 센서만으로도 하나 이상의 다수의 형광단 또는 염색을 검출 할 수 있다.
낮은 속도에서의 저효율 계수 (counting) 및 밝은 검체에 대한 광학적 백그라운드 노이즈는 무시할 수 있으나, 유속이 증가하거나 입자 크기가 감소함에 따라, 형광 시그널이 노이즈 플로어에서 검출될 수 없을 정도로 약화되므로, 이는 약하게 표지된 검체의 고효율 분석을 매우 어렵게 한다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 슬릿을 통해 물체 영역 유속 중앙부에 조사된 레이저 입자의 얇은 라인을 검출 영역에 있는 가상 슬릿 어레이로 컨쥬게이션 하여, 광 경로를 공간적으로 필터링 하였으며, 이는 이미징 센서의 영역을 각 검출 색상에 상응하는 일련의 좁은 라인 영역으로 스플리팅하여 수행된다. 이러한 "가상 슬릿"의 너비는 카메라 센서의 너비와 같으며, 가상 슬릿의 두께(폭)는 검출하고자 하는 검체의 크기 및 밝기뿐만 아니라 배경 (background) 노이즈에 따라 1 ~ 10 픽셀까지 조절 할 수 있다.
본 발명의 장치는 다음의 몇 가지 주요 기능적 서브시스템을 포함한다: 광 조사 모듈 또는 시스템, 유속 채널 내의 시료가 광 조사되는 영역을 통해 일정한 또는 가변 유속으로 이동하도록 시료를 연속적으로 또는 불연속적으로 펌핑하는 스캐닝 모듈, 유속 채널의 물체평면 내의 시료에 컨쥬게이션된 공간 필터 (spatial filter) 및 초점을 벗어나는 광을 제거하기 위한 검출기 평면, 색 분리를 위한 광학 스플리터 어레이 및 영역 광검출기, 각 색채널(color channel)에 대한 공간 필터는 시료 유속에 조사되는 레이저 라인에 의해 정해지는 물체평면 내 "가상 슬릿"을 감지 영역 내 개별적으로 조정 가능한 "가상 슬릿" 어레이에 컨쥬게이션 하는 것으로 규정되며, 이미징 센서를 각 감지 색상에 해당하는 일련의 좁은 선 영역으로 스플리팅 하는 것에 의해 수행된다. 이러한 가상 슬릿의 너비는 카메라 센서의 너비에 따라 조절 가능하며, 높이는 검출 대상 물체의 크기 및 밝기뿐만 아니라 배경 노이즈에 따라 1 ~ 10 픽셀까지 개별적으로 조정할 수 있다. 개별적으로 조정 가능하도록 컨쥬게이션된 가상 슬릿을 활용하는 이러한 구성은. 기존 세포 계수기와 비교하여 다음과 같은 장점을 제공한다: 휠씬 더 빠른 카운팅 및 결과적으로 증가된 처리량, 개선된 효율 및 감도 (sensitivity), 높은 신뢰성 및 다양한 유형의 샘플 및 염색에 대한 빠른 조정을 위한 훨씬 더 큰 유연성.
도 1은 컨쥬게이션된 가상 슬릿을 지닌 공초점 세포 계수기의 개략도이다. 서로 다른 색으로 표지된 세포(10)의 유속은 외부의 주사기 (syringe) 펌프를 통해 유속채널 (20) 안으로 이동한다. 유속채널이 두껍고 세포의 수직 위치의 편차가 높은 경우, 세포를 유체 역학 (hydrodynamic), 초음파 또는 기타 유형의 포커싱 방법을 사용하여 포커싱하여, 세포의 얇은 슬래브(slab)가 유속채널 (20) 내에 형성되도록 하여야 한다. 유세포(flowing cells)의 얇은 슬래브는, 멀티컬러 레이저 모듈(31)에 의해 생성된 레이저 빔(33, 레이저 시트)으로 조명되고, 빔 성형 광학모듈(33)을 사용하여 얇은 시트로 재성형되며, 반사미러(34)에 의해 유속채널에서 편향된다. 세포가 레이저빔을 통과할 때, 형광단은 여기되어 광자(photonds)를 방출하며, 이는 콜렉션옵틱스(collection optics)에 의해 수집된다. 다음, 멀티플 컬러의 방출된 형광단의 단일 평행 빔은, 이색 빔 스플리터(51)의 어레이에 의해 개별 색상 빔(53)의 분리된 빔으로 스플릿된다. 다음, 이들 빔은 포커싱 렌즈(53)에 의해 카메라 영역 센서(60)의 표면으로 포커싱되어, 레이저 빔(33)에 의해 조명된 세포 유속 부분의 측면 분리된 이미지를 각각의 색상에 대해 개별적으로 형성한다. 따라서 복수의 형광단 또는 염색을 동시에 동시에 검출 할 수 있다.
도 2는 이미지 공간에서 가상 슬릿의 어레이와 컨쥬게이션된 레이저 빔(33)의 사선 조사 시트와 포커싱된 유세포(11)의 슬래브 시트의 단면에 의해 형성된 물체 공간의 가상 슬릿의 개략도를 나타낸다. 카메라 영역 센서(60)를 개별 슬릿으로 분할하여 형성된다. 레이저 사선 조사의 각도는 레이저 빔(33)으로부터 배경 신호를 형성하는 기생 광 (parasite light), 유속채널(flow channel)(20) 표면의 불완전성에서 산란된 빛, 채널 표면에 우연히 부착된 세포(12, 표면 부착 세포)에서 방출되는 형광이 콜렉션 옵틱스(41)에 의해 형성된 형광 콜렉션 콘(cone)(42)으로 들어오지 않도록 선택된다. 가상 슬릿 어레이는 가상 마스킹에 의해 카메라 영역 센서(60) 표면에 형성되고, 센서 내의 모든 원치 않는 픽셀이 판독되지 않도록 한다. 가상 슬릿의 수는 검출하고자 하는 형광단 색의 수에 상응한다. 가상 슬릿의 폭은 가변적이며 형광단 강도, 검출하고자 하는 형광단 색의 수, 배경 노이즈 시그널의 수준, 세포 유속 및 카메라 매개변수에 의해 정해진다. 이들 가상 슬릿의 최소 두께(높이)는 카메라 센서의 단일 픽셀 크기로 제한되며, 최대 두께(높이)는 다른 채널과 겹치지 않는 한계치에 따라 정해진다. 형광단의 각 유형의 효율성과 밝기에 따라 가상 슬릿의 두께가 각 컬러에 대해 개별적으로 조절되어 시그널 수준 및 배경으로부터의 제거를 개별적으로 조정할 수 있도록 할 수 있다. 상기 카메라 영역 센서는, 물체평면(object plane) 내 시야의 개별 부분에 대응하는 개별 포토다이오드(photodiodes)의 어레이일 수 있다.
10: 세포; 11: 포커싱된 유세포; 12: 표면 부착 세포;
20: 유속채널;
31: 멀티컬러 레이져 모듈; 32: 빔 성형 광학모듈; 33: 레이저 빔; 34: 반사미러;
41: 콜렉션 옵틱스; 42: 콜렉션 콘;
51: 빔 스플리터; 52: 개별 색상 빔; 53: 포커싱 렌즈;
60: 카메라 영역 센서;
70: 세포
20: 유속채널;
31: 멀티컬러 레이져 모듈; 32: 빔 성형 광학모듈; 33: 레이저 빔; 34: 반사미러;
41: 콜렉션 옵틱스; 42: 콜렉션 콘;
51: 빔 스플리터; 52: 개별 색상 빔; 53: 포커싱 렌즈;
60: 카메라 영역 센서;
70: 세포
Claims (8)
- 시료에 광을 조사하기 위한 광 조사 모듈;
분석하고자 하는 세포를 포함하는 시료가 이동하는 유속 채널 (flow channel)의 물체평면 (object plane);
유속 채널 내에서 시료를 이동시키기 위한 스캐닝 모듈 (scanning module),
조사된 광에 의해 세포로부터 여기된 형광단으로부터 방출되는 광자를 수집하는 콜렉션 옵틱스 (collection optics);
포커싱 렌즈; 및
카메라 영역 센서로 구성된, 라인 공초점 세포계수기로서,
상기 유속 채널에 조사되는 광 입자의 얇은 라인이 상기 유속 채널의 물체평면 내에 형성되고, 상기 카메라 영역 센서 표면에서 가상 슬릿 어레이로 컨주게이션되어, 형광단(fluorophores)을 검출하는 것인,
라인 공초점 세포 계수기. - 시료에 광을 조사하기 위한 광 조사 모듈;
분석하고자 하는 세포를 포함하는 시료가 이동하는 유속 채널 (flow channel)의 물체평면 (object plane);
유속 채널 내에서 시료를 이동시키기 위한 스캐닝 모듈 (scanning module),
조사된 광에 의해 세포로부터 여기된 형광단으로부터 방출되는 광자를 수집하는 콜렉션 옵틱스 (collection optics);
이색 빔스플리터 (dichroic beamsplitter) 어레이;
포커싱 렌즈; 및
카메라 영역 센서로 구성된, 라인 공초점 세포계수기로서,
상기 유속 채널에 조사되는 광 입자의 얇은 라인이 상기 유속 채널의 물체평면 내에 형성되고, 상기 카메라 영역 센서 표면에서 가상 슬릿 어레이로 컨주게이션되어, 둘 이상의 형광단(fluorophores)을 동시에 검출하는 것인,
라인 공초점 세포 계수기. - 제2항에 있어서,
상기 광 조사 모듈은 멀티컬러 (multicolor) 레이져 모듈, 빔 성형 광학 모듈, 및 반사미러로 구성되고, 상기 광 조사는 멀티컬러 레이저 라인인 것인,
라인 공초점 세포 계수기. - 제2항 또는 제3항에 있어서,
상기 가상 슬릿 어레이에서 슬릿의 개수는 검출하고자 하는 형광단 색의 수에 상응하며, 슬릿의 폭이 조절 가능한 것인,
라인 공초점 세포 계수기. - 제4항에 있어서,
상기 가상 슬릿의 폭이 형광단 강도, 형광단 색의 수, 배경 노이즈 시그널의 수준, 세포 유속 및 카메라 매개변수에 따라 조절가능한 것인,
라인 공초점 세포 계수기. - 제1항 또는 제5항에 있어서,
상기 가상 슬릿의 폭이 1 내지 10 픽셀까지 조절되는 것인,
라인 공초점 세포 계수기. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 카메라 영역 센서는 물체평면 내 시야의 개별 부분에 대응하는 개별 포토다이오드(photodiodes)의 어레이인 것인,
라인 공초점 세포 계수기. - 제7항에 있어서,
물체평면 내 시야의 개별 부분에 대응하는 개별 포토다이오드(photodiodes)의 어레이를 포함하여, 시료 내 이벤트를 병렬 검출하는 것인,
라인 공초점 세포 계수기.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210184844A KR102645654B1 (ko) | 2021-12-22 | 2021-12-22 | 고효율 다중 스펙트럼 검출을 위한 라인 공초점 세포 계수기 |
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|---|---|
| KR20230096183A true KR20230096183A (ko) | 2023-06-30 |
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| KR102645654B1 (ko) | 2024-03-13 |
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