KR20230082102A - 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 DN200434 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다. DN200434 화합물은 세포주기 진행의 억제, 미토콘드리아 호흡의 감소, 및 mTORC1의 활성의 억제를 통해 혈관평활근세포의 증식을 억제하고 신생내막 형성을 감소시키는 바, 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 혈관재협착증, 이식혈관협착증을 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환에 대한 효과적인 치료제로 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention or treatment of vascular smooth muscle cell hyper-proliferative disease}

본 발명은 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 DN200434 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.

관상 동맥성 심혈관질환은 현재 사망 원인의 30% 이상을 차지하고 있어 미국, 유럽 등 선진국에서 심각한 문제가 되고 있으며, 개발도상국에서도 식생활의 서구화, 운동 부족 등의 영향을 받아 증가하고 있는 추세이다. 이는 크게 죽상경화증(atherosclerosis), 중막경화증(medial calcification), 및 세동맥경화증(arteriosclerosis)의 3가지 질환으로 나눌 수 있으며, 수 많은 인자가 질환 유발에 관여하고 있다. 그 중에서도 혈소판 응집과 혈관평활근세포 증식은 뇌졸중, 심근경색 및 혈관형성 수술 후 재협착과 같은 죽상 동맥 혈전의 병리에서 필수적으로 나타난다.

혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell)는 동맥의 중막(medial layer)에 풍부하게 존재하는 세포이자, 혈관을 형성하는 핵심세포로서 혈관긴장도(vascular tone)를 조절한다. 일반적으로 혈관평활근세포는 느린 속도로 분열하며 수축형 형질(contractile form)을 유지하지만, 죽상동맥경화증과 같이 산화적 스트레스와 염증반응이 증가하면 빠르게 분열하는 세포로 형질전환(phenotypic switching)된다. 또한, 혈관평활근세포는 수축과 이완을 통해 혈압을 조절하는데 필수적인 역할을 한다. 이러한 혈관평활근세포의 비정상적 증식은 고혈압, 동맥경화증, 죽상동맥경화증 등 심혈관질환의 원인이 된다. 또한, 스탠드 삽입술, 관상 동맥 우회술 등의 수술로 인해 혈관에 손상이 발생하면 혈관평활근세포의 과증식이 촉진되고, 혈관 재협착이 발생하게 되는 바, 상기 질환의 또 다른 원인이 될 수 있다. 혈관평활근세포의 증식은 평활근세포 자체, 내막세포, 대식세포, 혈소판 등에서 분비되는 자가분비 성장인자와 측분비 성장인자에 의해 조절된다. 혈관평활근세포의 증식에 관련된 성장인자로서는 대표적으로 PDGF(platelet-derived growth factor), FBS(Fetal bovine serum), bFGF(basic fibroblast growth factor)가 있다. 혈관평활근세포의 이상 증식을 억제할 수 있다면 고혈압, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 심혈관계 질환, 이의 합병증 및 혈관재협착증과 같은 질환의 치료와 예방에 우수한 효과를 얻을 것으로 예상되는 바, 현재 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있다.

한편, DN200434 화합물이 혈관평활근세포의 이상 증식과 신생내막 형성에 미치는 영향에 대해서는 알려진 바가 없다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 DN200434 화합물이 혈관평활근세포의 증식 및 이동을 효과적으로 억제하고, 신생내막 형성을 감소시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2010-0047544호

본 발명은 DN200434 화합물이 세포주기 진행의 억제, 미토콘드리아 호흡의 감소, 및 mTORC1의 활성의 억제를 통해 혈관평활근세포의 증식을 억제하고 신생내막 형성을 감소시켜, 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 혈관재협착증, 이식혈관협착증을 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방, 개선, 또는 치료 효과가 있다는 점을 확인한 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명의 목적은 DN200434 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 DN200434 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DN200434 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 DN200434 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 DN200434 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 DN200434 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료 약제 제조를 위한 DN200434 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서 상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 만족함으로써 혈관평활근세포의 증식 또는 이동을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:

(a) 세포주기의 진행 억제;

(b) 미토콘드리아 호흡 감소; 및

(c) mTORC1의 활성 억제.

본 발명의 다른 구현예에서 상기 조성물은 신생내막 형성을 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 혈관평활근세포 이상 증식성 질환은 혈관재협착증, 혈관협착증, 이식혈관 협착증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 심부전증, 심근경색증, 협심증, 부정맥증, 고혈압성 심장질환증, 선천성 심장질환증, 뇌졸중, 및 말초혈관협착증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 조성물은 DN200434 화합물을 0.1 내지 100μM 농도로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

DN200434 화합물은 세포주기 진행의 억제, 미토콘드리아 호흡의 감소, 및 mTORC1의 활성의 억제를 통해 혈관평활근세포의 증식을 억제하고 신생내막 형성을 감소시키는 바, 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 혈관재협착증, 이식혈관협착증을 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환에 대한 효과적인 치료제로 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

도 1a는 혈관평활근세포에서 DN200434 화합물 처리에 따른 세포 증식 억제 효과를 세포 계수(Cell counting)를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 혈관평활근세포에서 DN200434 화합물 처리에 따른 세포주기 진행 억제 효과를 확인하기 위해 인산화된 Rb 단백(P-Rb), 사이클린 D1(Cyclin D1), p27 kip1의 발현 정도를 웨스턴 블롯을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 1c는 혈관평활근세포에서 DN200434 화합물 처리에 따른 세포주기 진행 억제 효과를 유세포 분석을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 FBS(Fetal bovine serum)에 의해 자극된 혈관평활근세포에 올리고마이신(oligomycin), CCCP(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone) 및 로테논(rotenone)을 연속적으로 주입하여 DN200434 화합물 처리에 따른 OCR의 변화를 Seahorse XF 분석기를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다(좌측). 또한, 혈관평활근세포에서 FBS에 의해 증가된 미토콘드리아의 기초 호흡률(Basal Respiration), 최대 호흡률(Maximal Respiration), 및 ATP 링크된 호흡률(ATP Production)이 DN200434 화합물 처리에 따라 감소하는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다(우측).
도 2b는 PDGF(platelet-derived growth factor)에 의해 자극된 혈관평활근세포에 올리고마이신(oligomycin), CCCP(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone) 및 로테논(rotenone)을 연속적으로 주입하여 DN200434 화합물 처리에 따른 OCR의 변화를 Seahorse XF 분석기를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다(좌측). 또한, 혈관평활근세포에서 PDGF에 의해 증가된 미토콘드리아의 기초 호흡률(Basal Respiration), 최대 호흡률(Maximal Respiration), 및 ATP 링크된 호흡률(ATP Production)이 DN200434 화합물 처리에 따라 감소하는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다(우측).
도 3a는 혈관평활근세포에서 FBS에 의해 증가된 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex I)의 활성이 DN200434 화합물 처리에 의해 억제되는 효과를 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 혈관평활근세포에서 PDGF에 의해 증가된 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex I)의 활성이 DN200434 화합물 처리에 의해 억제되는 효과를 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 신생내막 과증식 마우스 모델의 동맥 횡단면을 H&E 염색법(haematoxylin and eosin) 및 EVG 염색법(Elastic-van Gieson)을 통해 관찰하여, DN200434 화합물 처리에 따른 신생내막 증식을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, Sham: 대조군, Ligation: 경동맥 결찰군, Ligation+ DN434: 경동맥 결찰 + DN200434 화합물 투여군임.
도 4b는 신생내막 과증식 마우스 모델에서 DN200434 화합물 처리에 따른 내막 및 중막 두께와 중막에 대한 신생내막 형성 비율을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, Sham: 대조군, Ligation: 경동맥 결찰군, Ligation+ DN434: 경동맥 결찰 + DN200434 화합물 투여군임.
도 4c는 신생내막 과증식 마우스 모델에서 DN200434 화합물 처리에 따른 체중 및 식사 섭취량의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, Sham: 대조군, Ligation: 경동맥 결찰군, Ligation+ DN434: 경동맥 결찰 + DN200434 화합물 투여군임.

본 발명의 일 실시예에서는 혈관평활근세포에서 DN200434 화합물 처리에 따른 세포 증식 및 세포주기 진행 억제 효과를 확인하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 혈관평활근세포에서 DN200434 화합물 처리에 따른 미토콘드리아 호흡 감소 효과를 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 혈관평활근세포에서 DN200434 화합물 처리에 따른 mTORC1의 활성 억제 효과를 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 신생내막 과증식 마우스 모델에서 DN200434 화합물 처리에 따른 신생내막 과증식 억제 효과 확인하였다(실시예 4 참조).

따라서, 본 발명자들은 DN200434 화합물이 혈관평활근세포의 증식 및 이동을 효과적으로 억제하고, 신생내막 형성을 감소시킬 수 있음을 확인하였는바, DN200434 화합물을 동맥경화증, 혈관재협착증, 이식혈관협착증을 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용할 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 DN200434 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에 있어서, 상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 만족함으로써 혈관평활근세포의 증식 또는 이동을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:

(a) 세포주기의 진행 억제;

(b) 미토콘드리아 호흡 감소; 및

(c) mTORC1의 활성 억제.

본 명세서에 있어서, 상기 세포주기의 진행, mTORC1의 활성은 성장인자 자극에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 미토콘드리아 호흡은 성장인자 자극에 의해 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, 상기 성장인자는 PDGF(platelet-derived growth factor), 또는 FBS(Fetal bovine serum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, 상기 조성물은 신생내막 형성을 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, 상기 DN200434 화합물은 하기 화학식 1로 표시될 수 있으며, (E)-4-(5-hydroxy-1-(4-(4-isopropylpiperazin-1-yl)phenyl)-2-phenylpent-1-en-1-yl)phenol의 IUPAC 네임을 가질 수 있다. 또한, 화학식은 C₃₀H₃₆N₂O₂, 분자량은 456.62일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

[화학식 1]

본 명세서에 있어서, “혈관평활근세포(VSMC; vascular smooth muscle cell)"는 혈관 벽의 평활근을 구성하는 세포로서 혈관긴장도(vascular tone)를 조절한다. 일반적으로 혈관내피세포는 혈관평활근세포의 증식을 억제하는 물질을 분비하는 바, 혈관평활근세포는 느린 속도로 증식하거나 증식이 일어나지 않아 수축형 형질(contractile form)을 유지한다. 스텐트 삽입술, 관상동맥 조영술, 관상동맥 우회술 등에 의해 발생하는 혈관내피세포의 손상은 혈관평활근세포의 증식과 내피세포층으로 이동을 촉진시킬 뿐만 아니라 세포외 기질 침착에 의한 내막증식을 발생시킨다. 예를 들어, 혈관에 손상이 가해지면 동맥벽을 구성하는 모든 세포와 염증 세포가 PDGF 등의 성장인자를 분비하는데, PDGF는 AKT(protein　kinase　B) 인산화를 통해 mTORC1를 활성화하고 세포의 증식과 이동을 촉진시킨다.

본 명세서에 있어서, 상기 혈관평활근세포의 증식에는 많은 에너지와 전구물질의 합성이 필요하다. 이는 미토콘드리아 호흡을 통해서 얻으므로, 혈관평활근세포의 증식 과정에서 미토콘드리아의 산화적 인산화가 증가된다. 또한, PDGF 등의 성장인자는 미토콘드리아의 산화적 인산화에 관여하는 단백질을 증가시켜 세포 증식에 필요한 에너지 합성을 증가시킨다.

본 명세서에 있어서, “미토콘드리아”는 에너지 공급원으로서 ATP(adenosine triphosphate) 합성 및 조절에 관여하는 진핵 세포의 생존에 필수적인 세포 소기관이다. 또한, 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸뿐만 아니라 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다.

본 명세서에 있어서, “mTORC1(mammalian target of rapamycin complex I)”은 세포 성장인자, 세포 영양분, 세포 스트레스, 세포 에너지 상태에 반응하여 리보솜 생합성, 단백질 합성, 전사조절, 영양분 흡수, 세포자멸사 과정 등 세포의 성장과 대사를 조절하는 인자이다. 또한, mTORC1이 활성화되면 혈관 내막에서 혈관평활근세포의 과증식이 발생한다. 반면에 mTORC1 억제제를 사용하면 혈관평활근세포의 증식과 혈관의 재협착이 감소한다.

본 명세서에 있어서, “혈관평활근세포 이상 증식성 질환”이란 혈관평활근세포의 과도한 증식 또는 이동에 기인하여, 신생내막이 과증식되어 발생하는 질환을 의미한다.

본 명세서에 있어서, 상기 혈관평활근세포 이상 증식성 질환은 혈관평활근세포의 이상 증식 또는 이동에 의해 직접적으로 발생되는 혈관재협착증, 혈관협착증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증뿐만 아니라, 혈관협착증, 혈관재협착증 또는 죽상동맥경화증에 의해 2차적으로 유발되는 심혈관계 질환인 심부전증, 심근경색증, 협심증, 부정맥증, 고혈압성 심장질환증, 선천성 심장질환증, 뇌졸중, 이식혈관 협착증, 및 말초혈관협착증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “동맥경화증(arteriosclerosis)”은 주로 혈관의 중막에 퇴행성 변화가 일어나서 섬유화가 진행되고 혈관의 탄성이 줄어드는 노화현상의 일종이다. 이로 인해, 수축기 고혈압이 초래되어 심장근육이 두꺼워지는 심장비대 현상이 나타나게 된다.

본 명세서에 있어서, “죽상동맥경화증(Atherosclerosis)”은 주로 혈관의 가장 안쪽을 덮고 있는 혈관 내막에 콜레스테롤이 침착되고, 혈관내피세포의 증식이 일어난 결과 형성된 죽종(atheroma)으로 인해 혈관이 좁아지거나 막히게 되어, 그 혈관이 말초로의 혈류 장애를 일으키는 질환을 의미한다. 즉, 동맥경화증이 혈관 중막 질환인 것과 달리, 죽상동맥경화증은 혈관 내막 질환이다.

본 명세서에 있어서, “혈관재협착증(restenosis)”은 혈관벽이 손상(traumatization)된 후 혈관 통로가 좁아지는 질환을 의미한다. 특히, 스텐트 삽입술 등의 수술 후에 발생하는 혈관재협착증은 혈관평활근세포의 증식 및 이동과 세포외 기질(extracellular matrix)의 분비 등이 주요 원인이다.

본 명세서에 있어서, 상기 조성물 내에 상기 DN200434 화합물은 0.1 내지 100μM, 0.1 내지 50μM, 0.1 내지 40μM, 0.1 내지 30μM, 0.1 내지 20μM, 1 내지 100μM, 1 내지 50μM, 1 내지 40μM, 1 내지 30μM, 1 내지 20μM, 2 내지 100μM, 2 내지 50μM, 2 내지 40μM, 2 내지 30μM, 2 내지 20μM, 3 내지 100μM, 3 내지 50μM, 3 내지 40μM, 3 내지 30μM, 3 내지 20μM, 4 내지 100μM, 4 내지 50μM, 4 내지 40μM, 4 내지 30μM, 4 내지 20μM, 5 내지 100μM, 5 내지 50μM, 5 내지 40μM, 5 내지 30μM, 또는 5 내지 20μM 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, DN200434 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.

적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 조성물 내의 상기 DN200434 화합물의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, 폴리에칠렌글리콜 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16(Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입(AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈(N, Es), 웨코비(W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 명세서에 있어서, “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 명세서에 있어서, “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서, “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명은 DN200434 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 명세서에 있어서, “식품학적으로 허용 가능한 염”이란 식품학적으로 허용되는 유기산, 무기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.

본 발명의 DN200434 화합물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 DN200434 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 DN200434 화합물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실험예]

실험예 1. 신생내막 과증식 마우스 모델

마우스에 신생내막 과증식을 유도하기 위해 수컷 C57BL/6J 마우스의 온목동맥(common carotid artery) 말단 분기점 근처를 5.0 봉합 타이(suture tie)로 결찰시켜 일측 경동맥을 통한 혈류를 차단하였다. 4주 후 경동맥이 결찰된 마우스에 신생내막 과증식이 유도된 것을 확인할 수 있었다. 그런 다음, 신생내막 과증식이 유도된 마우스에 DN200434 화합물을 안락사 전까지 100mg/kg/day로 4주 동안 매일 경구로 투여하였다. 결찰 부위에 인접한 동맥은 H&E 염색법(haematoxylin and eosin) 및 EVG 염색법(Elastic-van Gieson)을 사용하여 분석하였다. 동맥의 단면의 내막 및 중막의 두께는 Image J 소프트웨어를 사용하여 정량화하였으며, 중막 두께에 대한 내막 두께의 비율(Intima/Media)은 측정된 값의 평균으로 계산하였다.

실험예 2. 세포 배양

래트 대동맥 혈관평활근세포(VSMC; vascular smooth muscle cell)는 문헌(Physiol Rev.　1979 Jan; 59(1): 1-61)을 참고하여 준비하였다. 구체적으로, 대동맥 혈관평활근세포는 수컷 Sprague-Dawley 래트(체중 90 내지 100g)로부터 대동맥 조각을 분리하여, 20% FBS로 보충된 저포도당 DMEM(low-glucose DMEM)을 포함하는 배양 디쉬(culture dishe)에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 2주 동안 배양하였으며, 배지는 매일 교체하였다. 세포는 4 내지 9회 계대 배양하여 실험에 사용하였다.

실험예 3. 세포 계수 (Cell counting)

혈관평활근세포를 혈청 기아(serum-starvation) 조건 하에서 18시간 동안 배양한 뒤, 10% FBS 또는 PDGF-BB(20ng/ml)의 존재 또는 부재 하에 10μM DN200434 화합물을 처리 또는 비처리하여 24시간 동안 배양하였다. 세포 계수는 트립판 블루(trypan blue) 용액으로 염색한 후 혈구 계산기(haemocytometer)를 사용하여 수행하였다.

실험예 4. 웨스턴 블롯 분석

웨스턴 블롯 분석은 문헌(Exp Ther Med.　2020 Jun; 19(6): 3454-3460)을 참고하여 수행하였다. 구체적으로, 단백질 샘플은 SDS-PAGE 겔에서 분리하여 PVDF 막으로 이동시킨 뒤, TBST 버퍼에서 5% 탈지유(skim milk)로 1시간 동안 블로킹(blocking)한 후, 적절한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤(overnight) 동안 인큐베이션(incubation)하였다. 막은 인산화된 Rb 단백(P-Rb), 사이클린 D1(cyclin D1), S6K, 인산화된 S6K(P-S6K), 4E-BP1(Eukaryotic initiation factor 4E binding protein1), 인산화된 4E-BP1(P-4E-BP1, Thr37), PCNA (proliferating cell nuclear antigen), 및 p27 Kip1(Cell Signaling Technology, MA, USA) 단백질과 β-액틴(1:5000, Sigma)에 특이적인 항체로 프로브(probe)한 뒤, TBST로 3회 세척한 후, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체로 인큐베이션 하였다. HRP는 ELC 시약(BioNote, 경기도, 한국)을 이용하여 검출하였다.

실험예 5. 유세포 분석 (Flow cytometry analysis)

세포주기 분석을 위해, 6시간 동안 혈청 기아 처리하여 세포를 G1기에서 동기화(synchronisation) 하였다. 세포는 10% FBS의 존재 또는 부재 하에서, DN200434 화합물을 처리 또는 비처리하여 12시간 동안 배양한 뒤, 트립신 처리하고 2% FBS를 포함하는 차가운 PBS로 세척하였다. 다음으로, 세포를 70% 차가운 에탄올(-20℃)로 1시간 동안 고정한 뒤, 광 차단(light blocking)을 하고 PI/RNase Staining Buffer(BD Pharmingen™NJ, USA)로 30분 동안 염색하였다. PI-DNA 복합체에서 방출되는 형광은 Epics XL 유세포 분석기(BD Bioscience, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.

실험예 6. OCR(산소 소비율; oxygen consumption rates) 측정

혈관평활근세포를 Seahorse XF24 플레이트에 시딩(seeding)하고, 18시간 동안 기아 상태(starvation)로 유지한 후, 10% FBS 또는 PDGF-BB(20ng/ml)의 존재 또는 부재 하에서, 10μM DN200434 화합물을 처리 또는 비처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포 배양용 플레이트(cell plate)를 5.55mM 포도당 및 1mM 피루브산 나트륨(sodium pyruvate)으로 보충된 Seahorse XF DMEM로 교체한 뒤, 측정 전 CO₂-free 인큐베이터에서 37℃로 1시간 동안 전배양(pre-incubation)하였다. 그 후, 지정된 시간에 1μM 올리고마이신(oligomycin, Sigma), 2μM CCCP(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone, Sigma), 및 1μM 로테논(rotenone, Sigma)을 연속 주입하여 세포 호흡의 변화를 시간에 따라 평가하였다. OCR은 제조업체의 프로토콜에 따라 Seahorse XF 분석기를 이용하여 자동으로 측정하였다.

실험예 7. 통계 분석

그래프의 모든 값은 평균 ± SEM로 표기하였다. 실험의 결과는 일원분산분석(one-way analysis of variance) 후, Dunnett 다중 비교 검정(Dunnett's multiple comparison test)을 이용하여 그룹 간의 차이를 평가하였다.

[실시예]

실시예 1. 혈관평활근세포에서 DN200434 화합물 처리에 따른 세포 증식 및 세포주기 진행 억제 효과 확인

1.1. 세포 증식 억제 효과 확인

성장인자인 FBS 또는 PDGF 자극에 의한 혈관평활근세포의 증식을 유도하고 DN200434 화합물을 세포에 처리하여, 화합물에 의한 세포 증식 억제 효과를 분석하였다. 그 결과는 도 1a에 나타내었다.

도 1a에 나타난 바와 같이, DN200434 화합물은 FBS 또는 PDGF 자극에 의한 혈관평활근세포의 증식을 유의하게 억제하였다.

1.2. 세포주기 진행 억제 효과 확인

혈관에 있는 대부분의 혈관평활근세포는 정상적인 조건의 경우 G0기에 있지만, 기구에 의해 손상되거나 FBS 또는 PDGF 자극 등이 있는 경우 세포주기의 변화가 유도된다. 따라서, DN200434 화합물이 혈관평활근세포의 세포주기의 진행에 미치는 영향을 확인하고자, G1기에서 S기로 진행에 관여하는 인산화된 Rb 단백(P-Rb); 세포주기를 조절하는 키나아제로 G1기에서 S기로 진행하는 과정을 조절하는 사이클린 D1(Cyclin D1); 및 CDK1 억제제로 세포의 비정상적인 성장을 억제하는 p27 kip1;의 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 그 결과는 도 1b에 나타내었다.

도 1b에 나타낸 바와 같이, FBS의 자극에 의해 증가한 P-Rb 및 사이클린 D1의 발현이 DN200434 화합물에 의해 감소한 반면, 성장인자 자극에 의해 감소한 p27 kip1 발현은 DN200434 화합물에 의해 증가함을 확인하였다.

또한, DN200434 화합물이 FBS 자극에 의한 G1기에서 S기로의 진행을 방해하는지 확인하기 위해, 유세포 분석을 하였다. 그 결과는 도 1c에 나타내었다.

도 1c에 나타낸 바와 같이, DN200434 화합물 처리에 따라 G1기 세포 비율은 증가하였으나(FBS 자극 세포: 66.2 % → 80.3 %), S기 세포 비율은 감소한 것(FBS 자극 세포: 14.8 % → 4.51 %)을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통해, DN200434 화합물이 혈관평활근세포에서 FBS 또는 PDGF 자극에 의한 세포주기 진행 및 세포 증식을 억제함을 확인하였다.

실시예 2. 혈관평활근세포에서 DN200434 화합물 처리에 따른 미토콘드리아 호흡 감소 효과 확인

미토콘드리아의 산화적 인산화 증가는 빠르게 분열하는 세포에 필수적이다 반면, 미토콘드리아의 산화적 인산화가 감소하면 세포 성장이 억제된다. 위암, 신경교종, 간암 세포에서 미토콘드리아 산화적 인산화 억제제를 투여하면 세포의 산소 소비량과 산화적 인산화에 의한 ATP 합성이 감소되고 세포 분열이 억제된다고 알려져있다. 또한, 혈관평활근세포의 혈관 내막의 과증식 과정에서 미토콘드리아의 산화적 인산화가 증가하게 된다.

따라서, DN200434 화합물이 미토콘드리아의 산화적 인산화에 미치는 영향을 확인하기 위해서, FBS 또는 PDFG에 의해 자극된 혈관평활근세포에 올리고마이신(oligomycin), CCCP(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone) 및 로테논(rotenone)을 연속적으로 주입하여 DN200434 화합물 처리에 따른 OCR의 변화를 Seahorse XF 분석기로 분석하였다. 이를 통해 기초 호흡률(Basal Respiration), 최대 호흡률(Maximal Respiration), 및 ATP 링크된 호흡률(ATP Production)의 증감을 알 수 있었다. 그 결과는 도 2a 및 2b에 나타내었다.

도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이, FBS 또는 PDGF 자극 후 미토콘드리아의 기초 호흡률, 최대 호흡률, 및 ATP 링크된 호흡률이 증가하였으나, DN200434 화합물을 혈관평활근세포에 처리한 후 유의미하게 감소함을 확인하였다.

상기 결과를 통해, DN200434 화합물이 FBS 또는 PDGF 자극에 의해 증식하는 혈관평활근세포의 미토콘드리아의 산화를 감소시킴을 확인하였다.

실시예 3. 혈관평활근세포에서 DN200434 화합물 처리에 따른 mTORC1의 활성 억제 효과 확인

mTORC1는 세포의 성장과 대사에 있어 중요한 역할을 한다. 혈관에 손상이 가해지면 동맥벽을 구성하는 모든 세포와 염증 세포가 PDGF 등 성장인자를 분비하는데, PDGF는 AKT 인산화를 통해 mTORC1를 활성화하고 세포의 증식과 이동을 촉진시켜, 혈관평활근세포의 과증식이 발생한다. 반면에 mTORC1 억제제를 사용하면 mTOR 의존 S6K와 elF4E(Eukaryotic translation initiation factor 4E)를 감소시켜 세포의 G1기 정지를 유도하는 바, 혈관평활근세포의 증식과 혈관의 재협착이 감소한다.

따라서, DN200434 화합물이 혈관평활근세포에서 혈관 내막의 과증식에 기여하는 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex I)에 미치는 영향을 확인하기 위하여, mTORC1의 하위 조절인자인 세린/트레오닌 단백질 키나아제인 S6K; 인산화된 S6K(P-S6K); 단백질 합성 변역 개시 인자인 4E-BP1; 인산화된 4E-BP1(P-4E-BP1); 및 DNA 복제에 관여하는 PCNA;의 발현을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 그 결과는 도 3a 및 3b에 나타내었다.

도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, DN200434 화합물 처리시 FBS 또는 PDGF 자극에 의해 유도된 S6K, P-4E-BP1, 및 PCNA의 발현이 감소함을 확인하였다.

상기 결과를 통해서 DN200434 화합물이 mTORC1의 활성을 억제시키는 바, 혈관평활근세포의 과증식과 이동에 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 4. 신생내막 과증식 마우스 모델에서 DN200434 화합물 처리에 따른 신생내막 과증식 억제 효과 확인

혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 경우, 중막에 있던 혈관평활근세포가 내막으로 이동하여 내막이 두터워지면서 진행된다. 따라서, DN200434 화합물이 신생내막 형성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 쥐 경동맥의 결찰을 시행하고 4주 뒤 신생내막 과증식 억제 효과를 분석하였다. 그 결과는 도 4a 내지 4c에 나타내었다.

도 4a에 나타난 바와 같이, 경동맥 결찰 4주 후에 DN200434 화합물을 투여하지 않는 그룹의 동맥 횡단면에서 심각한 신생내막 병변의 형성이 확인되었으나, DN200434 화합물을 투여한 그룹에서는 병변이 완화된 것을 확인할 수 있었다.

도 4b에 나타난 바와 같이, 경동맥 결찰을 통해 중막에 있던 평활근 세포가 내막으로 이동하게 되어, 내막 두께와 중막에 대한 신생내막 형성 비율이 증가하였으나, DN200434 화합물의 투여로 인하여 내막 두께와 중막에 대한 신생내막 형성 비율이 유의하게 감소하였다.

도 4c에 나타난 바와 같이, 그룹 간 체중 및 식사 섭취량의 변화는 확인되지 않았다.

상기 결과를 통해, DN200434 화합물이 체중 및 식사 섭취량에 영향없이 신생내막 과증식 억제에 효과가 우수하다는 것을 확인하였다.

종합하면, DN200434 화합물은 세포주기 진행의 억제, 미토콘드리아 산화의 억제, 및 mTORC1의 활성의 억제를 통해 혈관평활근세포의 증식을 억제하고 신생내막 형성을 감소시킴으로써, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 이식혈관협착증, 재협착증 등 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 및 치료에 도움이 될 것으로 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (10)

1. DN200434 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 만족함으로써 혈관평활근세포의 증식 또는 이동을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
   (a) 세포주기의 진행 억제;
   (b) 미토콘드리아 호흡 감소; 및
   (c) mTORC1의 활성 억제.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 신생내막 형성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 혈관평활근세포 이상 증식성 질환은 혈관재협착증, 혈관협착증, 이식혈관 협착증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 심부전증, 심근경색증, 협심증, 부정맥증, 고혈압성 심장질환증, 선천성 심장질환증, 뇌졸중, 및 말초혈관협착증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 DN200434 화합물을 0.1 내지 100μM 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
6. DN200434 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 만족함으로써 혈관평활근세포의 증식 또는 이동을 억제하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물:
   (a) 세포주기의 진행 억제;
   (b) 미토콘드리아 호흡 감소; 및
   (c) mTORC1의 활성 억제.
   
8. 제6항에 있어서,
   상기 조성물은 신생내막 형성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
   
9. 제6항에 있어서,
   상기 혈관평활근세포 이상 증식성 질환은 혈관재협착증, 혈관협착증, 이식혈관 협착증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 심부전증, 심근경색증, 협심증, 부정맥증, 고혈압성 심장질환증, 선천성 심장질환증, 뇌졸중, 및 말초혈관협착증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
   
10. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 DN200434 화합물을 0.1 내지 100μM 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.

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