KR20230005042A - 리프록스타틴-1을 유효성분으로 포함하는 신장 노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신장 노화의 예방 및/또는 치료를 위한 약학적 조성물 등에 관한 것으로, 본 발명자들은 신장 노화 마우스 모델을 제조하여 리프록스타틴-1를 투여한 후 신장 노화 증상의 변화를 관찰한 결과, 리프록스타틴-1을 투여한 마우스는 α-SMA 발현 및 신장 섬유화가 억제되고, 산화 스트레스 마커인 4-HNE 수준이 감소할 뿐만 아니라, 신장세포의 세포자멸사가 억제되는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 리프록스타틴-1은 신장의 구조적, 기능적 이상을 초래할 수 있는 신장 섬유화 등을 억제하는 효과가 있음이 확인된 바, 신장 노화는 물론, 신장의 지속적 기능 저하에 의한 만성 신장질환의 예방 및 치료에 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

리프록스타틴-1을 유효성분으로 포함하는 신장 노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical compositions for the prevention or the treatment of kidney aging comprising liproxstatin-1 as an effective ingredient}

본 발명은 신장 노화 예방, 개선 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

신장 (kidney)은 노폐물을 배설하고 산염기 및 전해질 대사 등 체내 항상성을 유지하는 주요 기관 중 하나이며, 다양한 호르몬을 생성 및 활성화하여 내분비 기능도 수행하기 때문에, 신장의 기능이 저하되거나 소실되는 경우 생명에 치명적이다.

신장이 질병이나 부상 등으로 인해 손상되어 제 기능을 하지 못하고 장애를 갖는 것을 신부전증 (신장질환) 이라고 하며, 진행 형태에 따라 급성 신부전과 만성 신부전으로 나눌 수 있다. 급성 신부전은 수시간 또는 수일 내에 급격하게 신장 기능이 저하되는 것으로, 병원에 입원하는 환자의 약 5%, 중환자실에 입원하는 환자의 약 30%에서 관찰된다. 급성 신부전의 주요 원인은 감염, 심한 화상, 신장 손상 또는 신장으로 가는 혈류의 막힘, 약물, 알코올, 저혈압, 요로 막힘 등이 있다. 급성 신부전의 사망률은 원인에 따라 다르지만 수술 후 혹은 외상 후 발생한 급성 신부전의 경우에는 60~70%에 이르는 것으로 보고되고 있다. 생존 환자는 병에 걸리기 전과 비슷한 정도로 신장 기능이 서서히 회복되지만 만성 신기능 저하 상태로 유지되는 경우도 있다.

만성 신부전은 3개월 이상 신장이 손상되어 있거나, 신장 기능 감소가 장기간에 걸쳐 지속적으로 나타나는 것을 말한다. 병의 진행이 지속되어 정상 신장에 비해 기능이 15% 이하로 심하게 감소하는 말기 질환이 유발되면 혈액투석이나, 복막투석, 신장이식과 같은 치료를 받지 않으면 정상적인 생활을 할 수 없는 상태가 된다. 당뇨병, 고혈압, 심장병과 같은 기타 질환, 신장 결석, 자가면역 질환, 만성 염증 등으로 인해 만성 신부전이 발생하는 것으로 알려져 있는데, 최근에는 인구의 평균 수명이 증가하면서 신장의 노화가 만성 신부전의 주 원인으로 꼽히고 있다.

노화 (aging)은 신장 외에도 다양한 기관의 기능 및 구조에 점진적인 저하를 초래하며, 특히 신장은 노화와 관련된 손상에 취약한 것으로 알려져 있다. 노화는 손상된 단백질, 지질, 세포기관 (organelles) 등의 축적을 초래하고 세포 기능을 저하시켜 재생능력을 제한한다. 또한 신장 노화에 수반되는, 활성 산소의 과도한 축적으로 인한 지질 과산화 (lipid peroxidation) 및 심장 섬유화 등은 신장의 정상적인 기능을 방해하여 만성 신장질환을 초래한다.

한편, 인간의 신장은 매우 많은 혈관을 가지고 있으며, 신장의 내피세포 (endothelial cells)은 혈류 및 사구체 여과 장벽의 혈관 투과성을 조절한다. 따라서 신장 내피 세포의 항상성은 사구체의 구조 및 기능 유지에 중요하다. 내피세포의 노화는 혈관의 구조적 및 기능적 변화를 유도하여 혈전증, 염증, 죽상동맥경화증 등을 촉진하고, 혈관 긴장 (vessel tone), 혈관신생 (angiogenesis), 및 혈관 완전성의 이상을 초래할 수 있다.

따라서 신장 노화 및 이로 인한 만성 신장질환을 예방 및 치료하기 위한 다양한 약물이 개발 중에 있으나, 신장 노화를 효과적으로 억제 및 개선할 수 있는 약물은 아직까지 발굴되지 못한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-1522596호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 신장 노화 마우스 모델을 제조한 후 리프록스타틴-1 (liproxstatin-1) 투여에 따른 효과를 관찰한 결과, 리프록스타틴-1이 신장 섬유화, 지질 과산화, 및 신장세포의 세포자멸사를 억제함으로써 신장 노화의 예방 및 치료 효과를 발휘할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신장 노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 리프록스타틴-1 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신장 노화 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 리프록스타틴-1 (Liproxstatin-1) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신장 노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신장 노화 또는 만성 신장질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 신장 노화 또는 만성 신장질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 신장 노화 또는 만성 신장질환 치료용 약제 제조를 위한 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 신장 섬유화를 억제함으로써 신장 노화를 예방 또는 치료하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 신장의 산화 스트레스 (oxidative stress)를 억제함으로써 신장 노화를 예방 또는 치료하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 신장세포 (renal cells)의 세포자멸사 (apoptosis)를 억제함으로써 신장 노화를 예방 또는 치료하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 신장의 α-SMA 및 4-hydroxynonenal (4-HNE)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 수준을 억제함으로써 신장 노화를 예방 또는 치료하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 만성 신장질환 치료에 사용되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 즉, 본 발명은 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적 조성물을 유효성분으로 포함하는, 만성 신장질환 치료 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 만성 신장질환은 α-SMA의 돌연변이를 수반한 만성 신장질환일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 만성 신장질환은 신장 파브리병, 신장 섬유화, 신장염, 당뇨병성 신증, 고혈압성 신증, 사구체 신염, 신우 신염, 간질성 신염, 루프스 신장염, 다낭성 신장질환, 및 신부전증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 리프록스타틴-1 (Liproxstatin) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신장 노화 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물을 포함한다.

또한, 본 발명은 리프록스타틴-1 (Liproxstatin) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신장 노화 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 신장 노화의 예방 및/또는 치료를 위한 약학적 조성물 등에 관한 것으로서, 본 발명자들은 신장 노화 마우스 모델을 제조하여 리프록스타틴-1를 투여한 후 신장 노화 증상의 변화를 관찰한 결과, 리프록스타틴-1을 투여한 마우스는 α-SMA 발현 및 신장 섬유화가 억제되고, 산화 스트레스 마커인 4-HNE 수준이 감소할 뿐만 아니라, 신장세포의 세포자멸사가 억제되는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 리프록스타틴-1은 신장의 구조적, 기능적 이상을 초래할 수 있는 신장 섬유화 등을 억제하는 효과가 있음이 확인된 바, 신장 노화는 물론, 신장의 지속적 기능 저하에 의한 만성 신장질환의 예방 및 치료에 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른, 신장 내피세포 특이적으로 Atg7이 녹아웃된 신장 노화 마우스 모델의 제조 과정을 나타낸 개략도이다.
도 2a는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 사구체 크기를 H&E 염색법으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 2b는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 사구체 직경을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 모세혈관 내강 직경을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 신장 내 CD31 단백질 발현을 면역조직화학법으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 5a는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 신장 내 CD31 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5b는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 신장 내 CD31 단백질 발현량의 정량적 비교 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 사구체 또는 신수질 내의 혈관 다발에서의 세포외기질 침착 정도를 Masson 삼색 염색법으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 세관사이질 섬유화 정도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 8a는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 신장 조직 내 TGF-β 단백질 발현을 면역조직화학 염색법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 8b는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 신장 조직 내 TGF-β 단백질 발현 영역을 정량적으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 8c는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 신장 조직 내 TGF-β 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 8d는 웨스턴 블롯을 통해 확인한 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 신장 조직 내 TGF-β 단백질 발현량을 정량적으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 9a는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 신장 조직 내 α-SMA 단백질 발현을 면역조직화학 염색법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9b는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 신장 조직 내 α-SMA 단백질 발현 영역을 정량적으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 9c는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 신장 조직 내 α-SMA 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9d는 웨스턴 블롯을 통해 확인한 신장 노화 마우스 모델과 대조군 모델의 신장 조직 내 α-SMA 단백질 발현량을 정량적으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 10a는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 처리한 후 α-SMA 발현 정도를 3,3'-다이아미노벤지딘 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 10b는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 처리한 후 α-SMA 발현 정도를 정량적으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 11a는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 처리한 후 신장 섬유화 정도를 Masson 삼색 염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 11b는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 처리한 후 세관사이질 섬유화 정도를 정량적으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 12a는 대조군 마우스 또는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 처리한 후 면역형광염색법으로 4-HNE의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 12b는 대조군 마우스 또는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 처리한 후 면역형광염색법으로 확인한 4-HNE 발현량을 정량적으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 13a는 대조군 마우스 또는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 처리한 후 TUNEL 분석법을 통해 세관에서 신장세포의 세포자멸사를 확인한 결과를 나타낸다.
도 13b는 대조군 마우스 또는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 처리한 후 TUNEL 분석법을 통해 확인한 세관 내 신장세포의 세포자멸사 정도를 정량적으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 14a는 대조군 마우스 또는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 처리한 후 TUNEL 분석법을 통해 사구체에서 신장세포의 세포자멸사를 확인한 결과를 나타낸다.
도 14b는 대조군 마우스 또는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 처리한 후 TUNEL 분석법을 통해 확인한 사구체 내 신장세포의 세포자멸사 정도를 정량적으로 비교한 결과를 나타낸다.

본 발명자들은 신장 노화 마우스 모델에서 리프록스타틴-1 (liproxstatin-1) 투여에 따른 효과를 관찰한 결과, 리프록스타틴-1이 신장 섬유화, 산화 스트레스, 및 신장세포의 세포자멸사를 억제함으로써 신장 노화의 예방 및 치료 효과를 발휘할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 신장 원위 세뇨관 특이적으로 Atg7이 녹아웃된 마우스 (Atg7 ^flox/flox ;Tie2-Cre)를 제조하여 이의 신장 노화 증상을 관찰한 결과, 대조군 마우스에 비해 신장 노화 증상 (CD31 발현 감소, 신장 섬유화, TGF-β 및 α-SMA의 발현 증가 등)이 더욱 심화된 것을 관찰한 바, 본 발명에 따른 동물모델이 신장 노화 관련 연구에 활용될 수 있음을 확인하였다 (실시예 1).

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 투여한 후 신장 노화 증상 변화를 확인한 결과, 세관사이질 섬유화가 감소하고 지질 과산화로 인한 4-HNE 생성이 억제되었으며, 신장세포의 세포자멸사가 감소한 것을 관찰한 바, 리프록스타틴-1이 신장 노화를 예방 및 치료하는 효과가 있음을 확인하였다 (실시예 2).

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 리프록스타틴-1 (Liproxstatin-1) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신장 노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 “리프록스타틴-1 (Liproxstatin-1)”은 세포사멸 억제제로 활용되는 화합물로, 정식 명칭은 N-(3-Chlorophenyl)methyl-spiropiperidine-4,2′(1′H)-quinoxalin-3′-amine, 또는 N-(3-chlorophenyl)methylspiro4H-quinoxaline-3,4′-piperidine-2-amine로 알려져 있다 (CAS No.: 950455-15-9). 본 발명에 따른 리프록스타틴-1은 하기 화학식 1로 표시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

[화학식 1]

본 발명에 있어서, “신장 노화”란 노화 (aging)에 의해 신장의 구조 및 기능이 감소, 저해, 또는 상실되는 것을 의미하는 것으로, 신장 노화의 예방 또는 치료란 신장의 노화를 지연 또는 방지하거나, 신장의 노화된 세포 (senescent cell)를 보다 젊은 세포 (young cell)로 전환시키는 것을 포함한다. 본 발명에 있어서 신장 노화는 신장 섬유화 (fibrosis), 신장의 활성 산소종 (reactive oxygen species) 축적에 따른 산화 스트레스 (oxidative stress) 및 지질 과산화 (lipid peroxidation), 및 신장세포 (renal cells)의 세포자멸사 (apoptosis) 증가에 의해 유발되는 것일 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 신장 섬유화를 억제함으로써 신장 노화를 예방 또는 치료하는 것일 수 있다. 본 발명에 있어 “신장 섬유화 (kidney fibrosis)”는 신장의 조직 및/또는 혈관 내에 섬유질 결합조직 (connective tissue)이 과도하게 형성되어 조직 및/또는 혈관이 단단하게 굳는 증상을 말한다. 바람직하게는, 본 발명에 있어 신장 섬유화는 신장 사구체 (glomerulus)의 섬유화, 신수질 (renal medulla)의 섬유화, 및/또는 세관사이질 (tubulointerstitium)의 섬유화일 수 있다. 후술하는 바와 같이, 본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 신장 노화 동물 모델에 리프록스타틴-1 투여시 신장 섬유화를 유도하는 것으로 알려진 α-SMA (Alpha-smooth muscle actin)의 발현이 감소하고, 사구체, 신수질, 및 세관사이질의 섬유화가 감소하는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 신장 섬유화 예방 또는 치료용 조성물로 활용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 신장 섬유화의 억제는 α-SMA의 발현 억제를 통해 이루어지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 신장의 산화 스트레스 (oxidative stress)를 억제함으로써 신장 노화를 예방 또는 치료하는 것일 수 있다. 구체적으로는, 상기 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 지질 과산화 (lipid peroxidation)를 억제함으로써 신장 노화를 예방 또는 치료하는 것일 수 있다. 산화 스트레스는 체내에 활성산소종 (reactive oxygen species), 즉, 화학적 반응성이 높은 산소가 많아져 생체 산화 균형이 무너진 상태로서, 과도한 활성산소종의 축적은 단백질, DNA 지질 등 세포의 구성 요소를 손상시킬 수 있다. 특히 “지질 과산화 (lipid peroxidation)”는 활성산소종에 의해 지질 내의 탄소-탄소 결합이 분해되는 것을 의미하며, 특히 세포막의 주요 구성성분인 인지질의 과산화는 세포 손상으로 이어질 수 있다. 지질 과산화의 축적은 매우 친전자성인 알데하이드 (highly electrophilic aldehydes)의 생성을 유발하는데, 대표적인 것이 4-hydroxynonenal (4-HNE)이다. 즉, 4-HNE는 지질 과산화의 바이오마커이자 산화 스트레스의 마커이다. 특히, 4-HNE는 염증을 유도하는 것으로 알려진 바, 과도한 지질 과산화에 따른 4-HNE 생성은 신장에 염증을 일으켜 신장 노화 및 만성 신장질환에 기여할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 본 발명자들은 구체적인 실험을 통해 본 발명에 따른 신장 노화 동물 모델에 리프록스타틴-1 투여시 4-HNE의 수준이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 신장의 산화 스트레스, 지질 과산화, 및/또는 염증 (즉, 신장염) 예방 또는 치료용 조성물로 활용될 수 있다. 또한, 상기 신장의 지질 과산화, 산화 스트레스, 및/또는 염증 억제는 신장에서의 4-HNE 생성을 억제함으로써 이루어지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 신장세포 (renal cells)의 세포자멸사 (apoptosis)를 억제함으로써 신장 노화를 예방 또는 치료하는 것일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, “세포자멸사 (apoptosis)”는 프로그램화 (programmed)된 세포사멸 과정으로, 일련의 유전자들의 발현에 의해 조절되는 세포사멸이며, 형태학적으로는 세포의 수축, 세포막의 농포화 (blebbing), 핵의 단편화 (nuclear fragmentation), 염색질 응축 (chromosomal condensation) 등을 특징으로 한다. 이는 세포가 괴사되어 세포내 성분이 누출되면서 염증 반응을 일으키는 네크로시스 (necrosis)와는 구별되는 것이다. 세포자멸사는 적절한 면역반응 등을 위해 일어나기도 하지만, 과도한 세포자멸사는 분열세포 (dividing cells)를 감소시켜 노화에 기여하는 것으로 알려져 있다. 후술하는 바와 같이, 본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 신장 노화 동물 모델에 리프록스타틴-1 투여시 신장세포의 세포자멸사가 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 신장세포의 세포자멸사 억제용 조성물로 활용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 만성 신장질환의 치료에 사용되는 것일 수 있다. 즉, 본 발명은 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 만성 신장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, “만성 신장질환 (chronic kidney disease, CKD)”는 단백뇨가 지속적으로 나오거나 혈뇨와 같은 신장 손상의 지속적인 증거가 있거나, 수개월 이상 (바람직하게는, 3개월 이상) 지속적으로 신장 기능이 감소하는 상태를 의미한다. 만성 신부전(Chronic renal failure, CRF)은 신장 기능이 50% 이하로 떨어진 상태가 3개월 이상 지속될 때 만성 신부전이라고 하며 만성 신장질환보다는 좁은 의미이다. 자각증세로는 다뇨, 눈 주위와 하지가 부음, 몸이 나른함, 쉽게 피로해짐, 식욕이 없음, 구역질이 남, 피부의 가려움, 구취(암모니아 냄새의 증세)등이 있으며, 빈혈과 고혈압의 증세를 동반하며 어린이는 발육이 늦어지고 안색이 나빠지는 증세를 동반할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 있어서 만성 신장질환은 신장 노화에 의해 유도된 만성 신장질환일 수 있으며, 바람직하게는 신장 섬유화로 인한 만성 신장질환일 수 있다. 또는, 본 발명에 있어서 만성 신장질환은 α-SMA의 돌연변이를 수반한 만성 신장질환일 수 있고, 바람직하게는 상기 α-SMA의 돌연변이는 α-SMA의 발현 또는 활성의 증가를 의미할 수 있다.

상기 만성 신장질환의 구체적인 종류에는 제한이 없으나, 예를 들면 신장 파브리병, 신장 섬유화, 신장염, 당뇨병성 신증, 고혈압성 신증, 사구체 신염, 신우 신염, 간질성 신염, 루프스 신장염, 다낭성 신장질환, 및 신부전증 등이 이에 포함될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, “약학적으로 허용 가능한 염”이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.

적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 조성물 내의 상기 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

또한, 본 발명은 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신장 노화 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명은 리프록스타틴-1 (Liproxstatin) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신장 노화 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, “식품학적으로 허용 가능한 염”이란 식품학적으로 허용되는 유기산, 무기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.

본 발명의 리프록스타틴-1 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 리프록스타틴-1 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 리프록스타틴-1 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 리프록스타틴-1 (Liproxstatin) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신장 노화 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 명세서에 있어서, “건강기능식품”이란 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 신장 노화 또는 만성 신장질환의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실험예]

실험예 1. 신장 노화 동물모델의 확립 및 조직 준비

신장 노화 동물모델을 제조하기 위해, Atg7 ^flox/flox 마우스를 Tie2-Cre 마우스 (Jackson Laboratories)와 교배하여 원위 세뇨관 (distal tubule) 특이적으로 Atg7이 녹아웃 (knockout)된 마우스 (Atg7 ^flox/flox ;Tie2-Cre)를 제조하였다. Atg7 ^flox/flox 한배새끼 (littermate)는 대조군으로 사용하였다. 모든 마우스는 C57BL6와 교배하였고, 수컷 마우스만을 연구에 사용하였다.

마우스는 다섯 그룹으로 나누어 연구를 수행했다: 대조군 어린 (WT young) 마우스 (3달, n=4), 대조군 노화 (WT old) 마우스 (18달, n=4), Atg7 ^flox/flox ;Tie2-Cre 노화 마우스 (18달, n=4), 및 리프록스타틴-1 (liproxstatin-1; Sigma-Aldrich)을 처리한 Atg7 ^flox/flox ;Tie2-Cre 노화 마우스 (18달, n=4). 리프록스타틴은 한 달 동안 10 mg/kg의 용량으로 Atg7 ^flox/flox ;Tie2-Cre 노화 마우스에 2일에 한 번씩 복강 내 투여하였다.

마우스를 안락사시키고 신장에 인산-완충 식염수 (phosphate-buffered saline, PBS, pH7.4)를 짧게 관류하여 남아있는 혈액을 헹구었다. 이어서 10분 동안 과요오드산염 (periodate)-리신(lysine)-2% 파라포름알데히드 용액으로 관류시켰다. 그 후, 신장을 확보하여 1 내지 2 mm 두께의 슬라이스로 자르고, 동일한 고정 용액에 4 ℃에서 밤새 담가 추가로 고정 (fixation) 하였다. 고정을 마친 후, 신장 슬라이스를 PBS에 헹군 후 일련의 에탄올 용액에서 탈수과정을 거친 후 파라핀에 포매시켰다. 모든 실험 과정은 부천 성모병원 동물 관리위원회의 승인을 받았으며 동물 보호 및 윤리 규정에 따라 수행하였다.

실험예 2. 면역조직화학 분석법

일부 신장조직 절편은 가공하여 과요오드산-Schiff (periodic acid-Schiff, PAS) 염색 또는 Masson 삼색 염색 (Masson-trichrome staining)을 수행하였다. 나머지 절편은 가공하여 포매 후 면역화학 분석법(post-embedding immunohistochemistry analysis)을 수행하였다. 파라핀을 제거한 후, 절편을 수화시키고 0.5% Triton X-100/PBS 용액에서 30분 동안 인큐베이션 (incubation) 시킨 후 PBS로 세 번 세척하였다. 비특이적 결합 부위는 PBS로 1:10 비율로 희석한 당나귀 혈청으로 1시간 동안 블로킹 (blocking) 한 후, 4 ℃에서 밤새 1차 항체 (primary antibody)와 인큐베이션 하였다. 조직 절편을 PBS로 헹군 후, 과산화효소 (peroxidase)-결합된 항-마우스 또는 항-토끼 IgG (Jackson Immuno Research Laboratories)와 1시간 동안 인큐베이션 (incubation) 하였다. 착색 (coloration)을 위해, 조직 절편을 실온에서 0.01% H₂O₂를 함유한 0.05%의 3,3'-다이아미노벤지딘 (Diaminobenzidine, DAB) 용액과 함께, 갈색이 보일 때까지 인큐베이션한 다음 Tris 버퍼 (pH 7.6)로 세척하였으며, 헤마톡실린 (hematoxylin)으로 대비염색하였다. 염색된 조직 절편은 광학현미경으로 관찰하였다. 염색된 조직 절편을 Leica사 SCN400으로 스캔한 후 자동 디지털화 하였으며, Visiopharm 사의 Tissuemorph/DP 소프트웨어로 분석하였다.

실험예 3. 웨스턴블롯 (Western blot) 분석

신장 조직을 끓는 용해 버퍼 (lysis buffer) (1% SDS, 1 mM sodium orthovanadate, 및 10 mM Tris, pH 7.4)에서 균질화 (homogenization) 하였으며, 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트 (Pierce Biotechnology Inc.)를 이용하여 측정하였다. 동량의 단백질을 SDS 폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide) 젤에 로딩 (loading) 하였다. 젤은 NC 멤브레인 (membrane)에 트랜스퍼 (transfer) 하였다. 면역측정 (immunodetection)을 위해, 블롯을 1차 항체, Tween-20, 및 5% 탈지유를 함유한 PBS에서 밤새 인큐베이션 하였다. 그 후 블롯을 세척하고 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase, Jackson Immuno Research Laboratories)가 결합된 2차 항체와 인큐베이션 하였다. 블롯은 웨스턴 블롯 루미놀 용액 (luminol reagent) 키트 (Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 검출하였다.

실험예 4. 통계분석

수치는 평균 ± SD로 나타냈다. Mann-Whitney 검정 또는 Kruskal-Wallis 검정을 사용해 그룹간 데이터를 비교했다. P 값이 0.05 미만일 때 유의미한 것으로 보았다. 모든 통계 분석은 SPSS 16.0 소프트웨어로 수행했다.

[실시예]

실시예 1. 신장 노화 동물모델의 제조

리프록스타틴-1의 신장 노화 예방 및 치료 효과를 확인하기 위해 먼저 신장 노화를 유도한 동물 모델을 제조하였다. 구체적으로, 실험예 N에 따라 신장 혈관 내피세포 (endocellular cells, EC) 특이적으로 Atg7이 녹아웃된 마우스 모델 (Atg7 ^flox/flox ;Tie2-Cre⁺ mice)을 제조하였으며 (도 1), 상기 동물모델이 신장 노화 증상을 나타내는지 관찰하였다.

노화된 신장의 대표적인 구조적 특징은 사구체 비대증 (Glomerular hypertrophy) 및 사구체 모세혈관 내강 (lumen)의 팽창 (dilatation)이다. 따라서, Atg7 녹아웃 모델이 노화 신장과 유사한 형질을 나타내는지 확인하기 위해, 어린 야생형 (WT, 대조군) 마우스와 노화된 야생형 마우스, 및 Atg7 ^flox/flox ;Tie2-Cre⁺ 마우스 모델의 사구체의 크기 및 모세혈관 내강의 직경을 비교하였다.

먼저 H&E 염색법을 통해 사구체 크기를 비교한 결과, 어린 WT 마우스에 비해 노화된 WT 마우스의 신장에서 사구체의 크기가 상당히 증가한 것을 확인하였으며 (도 2a), 사구체의 직경을 구체적으로 측정하여 비교한 결과 노화된 WT 마우스 모델에 비해 Atg7 녹아웃 마우스 모델의 신장의 사구체 크기가 유의미하게 증가한 것을 확인하였다 (도 2b).

특히, 면역조직화학법을 통해 CD31을 염색하여 모세혈관 내강 직경을 비교한 결과 Atg7가 녹아웃된 마우스는 어릴 때부터 WT 마우스에 비해 모세혈관 내강 직경이 증가되어 있었으며, 나이가 들수록 모세혈관 내강 직경의 증가가 더욱 심화되는 것을 확인할 수 있었다 (도 3, 도4).

이어서, 신장이 노화될수록 발현이 감소하는 것으로 알려진 단백질인 CD31의 발현을 비교관찰 하였다. 웨스턴 블롯을 통해 CD31 단백질 발현량을 확인한 결과 대조군 마우스에 비해 Atg7 녹아웃 마우스의 CD31 발현이 감소한 것을 추가로 확인하였다 (도 5a 및 도 5b)

다음으로, 신장 섬유화 정도를 확인하기 위해 신장 사구체 및 신수질 (kidney medulla) 내의 혈관 다발 (vascular bundles)에 대해 Masson 삼색 염색 (Masson-trichrome staining)을 수행하였다. 그 결과, 어린 마우스에 비해 노화된 WT 마우스의 신장 사구체, 및 사구체 바깥 부분인 세관사이질 (tubulointerstitium) 내에서 세포외 기질 침착 (extracellular matrix deposition)이 증가한 것을 확인하였으며, 이와 같은 세포외 기질 침착은 Atg7 ^flox/flox ;Tie2-Cre⁺ 마우스에서 더욱 심화된 것으로 나타났다 (도 6). Atg7 녹아웃에 따른 세관사이질 내의 섬유화 증가는 정량적 측정 결과에서 더욱 두드러졌다 (도 7).

TGF-β (Transforming growth factor-β)는 세포외기질 단백질의 생성을 촉진하여 신장 섬유화를 유도하는 주요 단백질 중 하나로, TGF-β의 증가는 비정상적인 신장 기능을 일으켜 만성 신장질환에 기여하는 것으로 알려져 있다. 또한, α-SMA (Alpha-smooth muscle actin)은 평활근세포의 마커 단백질로서 신장 섬유화를 유도하는 것으로 알려진 바, 특히 α-SMA의 발현 증가를 특징으로 하는 혈관사이세포 (mesangial cells)의 활성화는 세포외기질의 침착 및 사구체경화증 (glomerulosclerosis) 등을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따른 신장 노화 모델에서 신장 섬유화와 관련된 주요 단백질인 TGF-β 및 α-SMA의 발현 변화가 있는지 확인하였다. 면역조직화학 염색 및 웨스턴 블롯 결과, Atg7 녹아웃 마우스의 사구체 내의 혈관사이질 (mesangium) 및 신수질의 세관사이질에서 TGF-β (도 8a 내지 도 8d) 및 α-SMA (도 9a 내지 도 9d)의 발현이 대조군 노화 마우스에 비해 증가한 것으로 나타났으며, 특히 α-SMA의 경우 어린 대조군 마우스에 비해 어린 Atg7 녹아웃 마우스에서 발현이 더욱 증가한 것으로 나타났다.

상기 결과들은 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에서 신장 노화의 병리학적 현상 (사구체 크기 증가, 신장 모세혈관 직경 증가, 신장 섬유화)이 더욱 심화된다는 것을 보여주며, 따라서 본 발명에 따른 마우스 모델이 신장 노화 억제 또는 치료용 약물 스크리닝 등에 적합하다는 것을 암시한다.

실시예 2. 리프록스타틴-1의 신장 노화 억제 효과 확인

실시예 1을 통해 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델이 신장 노화 증상을 재현하는 것을 확인하였으므로, 상기 동물 모델을 이용하여 리프록스타틴-1이 신장 노화 치료 효과를 갖는지 확인하였다.

구체적으로, 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 처리하거나 처리하지 않은 후 신장 섬유화를 유도하는 단백질인 α-SMA의 발현 정도 및 신장 섬유화 정도를 비교하였다. 먼저 3,3'-다이아미노벤지딘 (Diaminobenzidine, DAB) 염색으로 α-SMA의 발현 정도를 확인한 결과 리프록스타틴-1을 처리하지 않은 마우스에 비해 리프록스타틴-1을 처리한 마우스 조직에서 α-SMA의 발현이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었으며 (도 10a 및 도 10b), 신장 섬유화 정도를 확인하기 위해 Masson 삼색 염색법을 수행한 결과, 신장 노화 마우스 모델에서는 심각한 세관사이질 섬유화가 관찰되었으나, 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 투여하였을 때에는 세관사이질 섬유화가 현저하게 개선된 것을 확인할 수 있었다 (도 11a 및 도 11b). 상기 결과는 리프록스타틴-1이 신장 노화 및 만성 신장질환에 기여하는 신장 섬유화를 억제하는 효과가 있음을 보여준다.

다음으로, 리프록스타틴-1이 신장 내 4-hydroxynonenal (4-HNE) 수준에 미치는 영향을 확인하였다. 상술한 바와 같이 4-HNE는 세포 내의 지질 과산화 (lipid peroxidation)에 의해 생성되는 α, β-불포화 하이드록시알케날 (hydroxyalkenal)로서, 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)의 과생성으로 인한 산화 스트레스 발생시 지질 과산화 및 4-HNE 생성이 유도되는 것으로 알려져 있으며, 4-HNE의 증가는 염증 유발성 신호 경로를 활성화하여 신장 노화 및 신장 노화 관련 질환에 기여하는 것으로 보고된 바 있다. 이에, 대조군 모델 또는 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 처리하거나 처리하지 않은 후 면역형광염색법으로 4-HNE의 생성 수준을 비교하였다. 그 결과, 도 12a 및 12b에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스의 노화에 따라 4-HNE의 생성이 증가하였으며, 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에서는 노화에 따른 4-HNE의 생성 증가가 더욱 심화되었으나, 리프록스타틴-1을 처리한 경우에는 4-HNE의 생성이 현저하게 감소하였다. 이는 리프록스타틴-1이 산화 스트레스 및 그에 따른 지질 과산화 및 4-HNE 생성을 억제하여 신장 노화를 억제할 수 있음을 시사한다.

이어서, 신장의 노화는 신장세포의 세포자멸사 (apoptosis)를 수반하는 것으로 알려져 있으므로, 리프록스타틴-1이 산장세포의 세포자멸사를 억제하는 효과가 있는지 확인하였다. 이를 위해, 대조군 모델 및 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에 리프록스타틴-1을 처리하거나 처리하지 않은 후 TUNEL 분석법을 통해 세관 (tubules) 및 사구체의 세포자멸사 정도를 측정하였다. 그 결과, 도 13a 및 도 13b에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스 모델에서 노화에 따라 세관에서 증가하였던 세포자멸사 정도가 본 발명에 따른 신장 노화 마우스 모델에서는 더욱 심화되었으나, 리프록스타틴-1을 처리하였을 때 세포자멸사가 현저하게 감소한 것으로 나타났다. 마찬가지로 사구체의 세포자멸사 역시, 대조군 모델이 노화되었을 때 증가하였으며 이는 본 발명의 신장 노화 모델에서 더욱 증가하였으나, 리프록스타틴-1이 처리된 마우스 모델의 사구체에서는 세포자멸사가 두드러지게 감소한 것으로 나타났다 (도 14a 및 14b). 상기 결과는 리프록스타틴-1이 신장세포의 세포자멸사를 억제하여 신장 노화 및 만성 신장질환을 억제할 수 있음을 보여준다.

종합적으로, 상기 결과들은 리프록스타틴-1이 신장의 섬유화, 산화 스트레스 및 신장세포의 세포자멸사를 억제하여 신장 노화를 치료 및 개선할 수 있음을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (10)

1. 리프록스타틴-1 (Liproxstatin-1) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신장 노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 신장 섬유화를 억제함으로써 신장 노화를 예방 또는 치료하는 것인, 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 신장의 산화 스트레스 (oxidative stress)를 억제함으로써 신장 노화를 예방 또는 치료하는 것인, 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 신장세포 (renal cells)의 세포자멸사 (apoptosis)를 억제함으로써 신장 노화를 예방 또는 치료하는 것인, 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 리프록스타틴-1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 신장의 α-SMA 및 4-hydroxynonenal (4-HNE)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 수준을 억제함으로써 신장 노화를 예방 또는 치료하는 것인, 약학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 약학적 조성물은 만성 신장질환 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 만성 신장질환은 α-SMA의 돌연변이를 수반한 만성 신장질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
8. 제6항에 있어서,
   상기 만성 신장질환은 신장 파브리병, 신장 섬유화, 신장염, 당뇨병성 신증, 고혈압성 신증, 사구체 신염, 신우 신염, 간질성 신염, 루프스 신장염, 다낭성 신장질환, 및 신부전증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
9. 리프록스타틴-1 (Liproxstatin) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신장 노화 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
10. 리프록스타틴-1 (Liproxstatin) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신장 노화 예방 또는 개선용 건강기능식품.
    

Images