KR102460275B1 - D-리보-2-헥술로스를 유효성분으로 포함하는 사코페니아 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 D-리보-2-헥술로스를 유효성분으로 포함하는 사코페니아 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)는 설탕을 대체할 수 있는 감미료로 인체에 무해하며 정상세포에 부작용을 유발하지 않아 인체에 안전하며, 근육 단백질의 분해를 억제하고, 근육량 증가를 통해 근력 강화 효과를 나타낼 수 있는바 사코페니아의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

D-리보-2-헥술로스를 유효성분으로 포함하는 사코페니아 예방, 개선 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing, alleviating, or treating Sarcopenia comprising D-ribo-2-hexulose as active ingredient}

본 발명은 D-리보-2-헥술로스를 유효성분으로 포함하는 사코페니아 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

사코페니아(Sarcopenia)는 정상적인 노화 과정에서 나타나는 근육 소실과 달리, 비정상적으로 급격히 근육량이 감소하는 질환으로, 나이가 들면서 위성세포로 알려진 성인 근육 줄기 세포의 수 및 분화능이 점차 감소하여 나타나는 것으로 알려져 있다.

세계보건기구(WHO)는 2016년 10월에 사코페니아에 새롭게 질병분류코드를 부여하여 정식으로 신종 노인성질환으로 분류하였다. 사코페니아 유병률은 70세 이하의 사람들에게서 13~24%로 나타나나, 80세 이상에서는 50% 이상으로 발병이 증가하는 것으로 나타났으며, 사코페니아에 걸릴 경우 근육량, 운동력, 및 근력이 감소하여 독립적인 생활이 어렵고, 뇌질환, 심장질환, 당뇨병 등의 다른 질환으로부터 호전되기가 어려운바 노년기에 삶의 질에 중요한 영향을 미치는 것으로 점차 인식되고 있다.

한편, D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)는 D-프럭토오스의 C-3 에피머로, 수크로오스의 가수분해 또는 D-글루코오스의 이성질화로부터 얻어진 D-글루코오스 및 D-프럭토오스의 상업용 혼합물에서 극소량 존재하는 천연당이며, 설탕 대비 70%의 감미도를 가진 단당류이다. D-리보-2-헥술로스는 인체 내에서 대사되지 않아 칼로리가 거의 없으며, 체지방 형성 억제 작용으로 체중 증가에 영향이 적은 감미료로 보고되어 있다. 최근에는 D-리보-2-헥술로스의 비우식 기능 및 항우식 기능에 대한 효과가 발표되어, 치아건강에 도움을 주는 소재로서, 설탕을 대체할 수 있는 감미료로의 개발이 활발하게 이루어지고 있다. 이와 같이, D-리보-2-헥술로스는 이의 특성과 기능성으로 체중증가 방지용 감미료로서 식품산업 분야로부터 각광받고 있으나, 고온에서 프럭토오스로부터 극소량 전환되기 때문에 화학적인 합성이 쉽지 않은 물질이다. 따라서, D-리보-2-헥술로스를 대량생산할 수 있는 방법에 관하여 연구되어 왔으며, 이의 일예로 프럭토오스와 D-타가토오스 에피머화 효소를 반응시키는 방법, 프럭토오스와 D-리보-2-헥술로스 에피머화 효소를 반응시키는 방법, 또는 효소 방법을 이용하여 수크로오스의 가수분해 또는 D-글루코오스의 이성질화로부터 대량으로 제조하는 방법 등이 보고되어 있다.

D-리보-2-헥술로스는 미국농무부 (USDA; United States Department of Agriculture)에 의해 GRAS (Generally Recognized As Safe; 일반적으로 안전한 물질로 인정됨)로서 간주된 물질로, D-리보-2-헥술로스가 지질 대사에 영향을 미친다는 연구는 보고되어 있지만, 신종 노인성 질환인 사코페니아와 관련하여 D-리보-2-헥술로스의 구체적 효과에 대해서는 명확히 밝혀지지 아니한 상태이다.

Cruz-Jentoft AJ, Bahat G, Bauer J, et al. Sarcopenia: revised European consensus on definition and diagnosis [published correction appears in Age Ageing. 2019 Jul 1;48(4):601]. Age Ageing. 2019;48(1):16-31.

본 발명자들은 사코페니아를 효과적으로 치료할 수 있거나 또는 그의 진행을 효과적으로 둔화시킬 수 있는 제제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 단당류의 일종인 D-리보-2-헥술로스가 운동을 하기 어려운 노화 마우스에서 운동 없이도 근육량 및 근력을 증가시키는 것을 확인함으로써 사코페니아를 효율적으로 개선할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)를 유효성분으로 포함하는 사코페니아 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)를 유효성분으로 포함하는 사코페니아 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)를 유효성분으로 포함하는 사코페니아 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)를 유효성분으로 포함하는 사코페니아 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 D-리보-2-헥술로스는 하기 특징 중 하나 이상을 만족시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:

a) IGF-1(insulin-like growth factor 1)의 발현을 증가시킴;

b) 마이오스타틴(Myostatin) 발현을 억제시킴;

c) 근력 감소를 억제시킴; 또는

d) 근육량을 증가시킴.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 식품 조성물은 건강기능성식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 사코페니아 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)를 유효성분으로 포함하는 조성물의 사코페니아 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)의 사코페니아 치료용 약제를 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)는 설탕을 대체할 수 있는 감미료로 인체에 무해하며 정상세포에 부작용을 유발하지 않아 인체에 안전하며, 근육 단백질의 분해를 억제하고, 근육량 증가를 통해 근력 강화 효과를 나타낼 수 있는바 사코페니아의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 YC(young mice control) 군, NC(negative control) 군, 및 DRH(D-리보-2-헥술로스 보충) 군 마우스들의 왼쪽 뒷다리 두께를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1b는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 전신 인장력을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1c는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 대퇴사두근(quadriceps, 좌측), 전방 경골(anterior tibialis, 중간), 및 비복근(gastrocnemius, 우측) 조직의 중량을 측정한 후 체중 100g 당 중량으로 나타낸 도면이다.
도 1d는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 비복근 조직에 대해 H&E 염색(좌측 상단) 및 Sirius red 염색(좌측 하단)을 수행한 결과, 및 비복근 조직의 근육 단면적(cross-sectional area; CSA, 우측 상단) 및 콜라겐 면적(우측 하단)을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2a는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 IGF-1 및 마이오스타틴(Myostatin) 발현을 IHC 분석으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2b는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 근력 관련 유전자(MyoD(myoblast determination protein 1), Myf5(myogenic factor 5), Myf6(myogenic factor 6), Myogenin, Mef2(myocyte enhancer factor-2), MuRF1(muscle-specific RING-finger protein-1), Atrogin1, 및 FoxO3(Forkhead box O3))의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2c는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 Akt, AMPK, PI3K, mTOR, PGC1-α 및 이들의 인산화 변이체의 단백질 수준을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a는 NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 Adiponectin, Adipsin, CISH(cytokine inducible SH2-containing protein), CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector c), Haptoglobin, Neuronatin, SCD1(stearoyl-coenzyme A desaturase 1), 및 CerS1(ceramide synthase 1)의 발현을 mRNA-시퀀싱 및 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3b는 NC 군 마우스들에 비해 DRH 군 마우스들에서 차등적으로 발현된 Adiponectin, NF-kB(NF-kappaB), Haptoglobin, 및 CerS1(ceramide synthase 1)의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3c는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 간 G6P(glucose-6-phosphatase)를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3d는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 미토콘드리아 호흡사슬복합체(respiratory chain complex)의 활성을 BN-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 visceral fat(내장 지방), 총 지방 조직 중량, 총 근육 조직 중량, 및 체중 100g 당 근육 조직 중량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4b는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 근육 및 혈장의 지질 프로파일을 확인한 도면이다 (TG: triglyceride, TC: total cholesterol, FA: fatty acid).
도 5a는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-4, IL-1β, 및 IL-6의 수준을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5b는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 간 GSH, PON 및 GR, 및 혈장 GSH 및 PON 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5c는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 간 및 적혈구 H₂O₂ 함량, 및 TBARs(thiobarbituric acid reactive substance) 활성을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5d는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 근육(대퇴사두근; quad) 및 간 글리코겐 함량, 및 공복 혈당을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5e는 YC 군, NC 군, 및 DRH 군 마우스들의 테스토스테론 및 코르티솔 수준을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명자들은 사코페니아를 효과적으로 치료할 수 있거나 또는 그의 진행을 효과적으로 둔화시킬 수 있는 제제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 단당류의 일종인 D-리보-2-헥술로스가 운동을 하기 어려운 노화 마우스에서 운동 없이도 근육량 및 근력을 증가시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)를 유효성분으로 포함하는 사코페니아 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 “사코페니아(sarcopenia)”는 노화에 따른 점진적인 골격 근육량의 감소 또는 근육의 밀도와 기능이 점차적으로 약화되는 질환으로, 직접적으로 근력의 저하를 유발하여 각종 신체기능의 감소 및 장애를 일으킨다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 사코페니아가 염러되는 30대 이상의 사람, 40대 이상의 사람, 50대 이상의 사람, 60대 이상의 사람, 70대 이상의 사람, 또는 80대 이상의 사람을 대상으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 26세 이상의 사람으로 점진적인 골격 근육량의 감소 또는 근육의 밀도와 기능이 점차적으로 약화된 사람을 대상으로 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, D-리보-2-헥술로스가 근육량을 증가시키거나 근력 감소를 억제함으로써 노화 관련 근육 손실을 개선할 수 있음을 확인하였다 (실험예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에 따르면, D-리보-2-헥술로스가 근육 조직에서 단백질 발현의 상류 인자인 IGF-1의 발현을 증가시키고, 단백질 분해의 상류 인자인 Myostatin의 발현을 억제하며, 근원성 전사인자 유전자 Myf5, Myf6, 및 Myogenin의 발현을 증가시키고, Akt, AMPK, PI3K, mTOR, PGC1-α 및 이들의 인산화 변이체의 단백질 수준 증가시킴으로써 근육 강화 인자 단백질 발현을 증가시키는 것을 확인하였다 (실험예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, D-리보-2-헥술로스가 비복근 조직의 산화적 인산화와 관련된 유전자 CISH 및 CerS1를 상향 조절하고, Adiponectin, Adipsin, CIDEC, Haptoglobin, Neuronatin, 및 SCD1를 하향 조절하는 것을 확인하였다 (실험예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, D-리보-2-헥술로스가 지방 중량에 대한 근육 중량 비율을 증가시키는 것을 확인하였다 (실험예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, D-리보-2-헥술로스가 항산화 시스템을 활성화하고, 혈당을 감소시키며, 테스토스테론 및 코르티솔 수준을 감소시키는 것을 확인하였다 (실험예 5 참조).

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 D-리보-2-헥술로스는 하기 특징 중 하나 이상을 만족시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:

a) IGF-1(insulin-like growth factor 1)의 발현을 증가시킴;

b) 마이오스타틴(Myostatin) 발현을 억제시킴;

c) 근력 감소를 억제시킴; 또는

d) 근육량을 증가시킴.

본 명세서에서 “IGF-1(insulin-like growth factor 1, 인슐린 유사 성장인자 1)”은 자연적으로 발생하는 폴리펩타이드 단백질 호르몬으로 청소년기의 성장 촉진에 중요한 역할을 하며, 성인의 근육 조직을 생성하고 복구하는데 중요한 역할을 하는 것을 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 D-리보-2-헥술로스는 SCD1의 발현을 억제함으로써 AMPK를 활성화시키고, 활성화된 AMPK는 PGC1-α 및 IGF-1 발현을 증가시키고, 발현이 증가된 IGF-1은 근육 비대의 주요 신호 경로인 PI3K/Akt 경로와 단백질 번역을 위한 mTOR 경로를 활성화함으로써 단백질 합성과 근육 생성을 증가시킬 수 있으므로, 사코페니아를 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

본 명세서에서 “마이오스타틴(Myostatin)”은 근육 성장을 조절하는 단백질로서 transforming growth factor (TGF)-베타군에 속하며, 골격근 성장을 저해하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 D-리보-2-헥술로스는 NF-κB 발현을 억제함으로써 골격근 성장을 저해하는 마이오스타틴의 발현을 감소시키고 근육 위축을 자극하는 TNF-α의 발현을 감소시킬 수 있으므로, 근육 소실 및 근력 감소를 보다 근본적으로 예방, 개선, 또는 치료할 수 있다.

본 명세서에서 "근력 증가" 또는 "근력 감소 억제"는 골격근량의 증가 또는 근기능의 향상으로 인하여 전체적인 근력이 증가되는 현상을 말하는 것이며, 특정 질병의 환자군에 제한되는 효과를 말하는 것은 아니다.

본 명세서에서 "근육량 증가"는 신체 성분 중에서도 특히 근육의 성장을 향상시키는 것으로, 육체적 운동 및 지구력 향상을 통해 근육량을 증가시킬 수 있고, 근육 증가 효과를 가지는 물질을 체내에 투여하는 방식으로 근육량을 증가시킬 수 있으며, 근육의 종류는 제한되지 않는다.

본 명세서에서 “유효성분”은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명에서 “약학적 조성물”은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨데, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화활 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 아황산수소나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈(Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입(AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈(N, Es), 웨코비(W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

또한, 본 발명은 D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 사코페니아 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)를 유효성분으로 포함하는 조성물의 사코페니아 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)의 사코페니아 치료용 약제를 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명은 D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)를 유효성분으로 포함하는 사코페니아 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 D-리보-2-헥술로스를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 D-리보-2-헥술로스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 D-리보-2-헥술로스는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 건강기능성식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “건강기능식품”이란 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 사코페니아의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 동물의 사육 및 식이

48주령의 C57BL/6J 수컷 마우스 21마리와 8주령의 C57BL/6J 수컷 마우스 7마리를 JA BIO(대한민국)에서 구입하였다. 구입한 동물은 온도(20-23 ℃) 및 명암(12시간 주기)이 조절된 사육실에서 사육하였으며, 처음 1주 동안은 펠릿화된 상업용 비정제 사료를 제공하였다.

48주령의 노화 마우스들을 무작위로 두 그룹으로 나누어 12주 동안 하기 표 1에 나타낸 각각의 실험 식이를 제공하였다. 구체적으로, 음성 대조군(negative control group; NC, n=7, American Institute of Nutrition AIN93G Semisynthetic 식이); D-리보-2-헥술로스 처리 군(D-ribo-2-hexulose; DRH, n=7, AIN93G의 셀룰로오스 일부를 3% D-ribo-2-hexulose로 대체). 젊은 마우스 군(young mice control; YC, 8주령)에게는 실험 8주차부터 종료 때까지 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, AIN-93G를 제공하였다. D-리보-2-헥술로스의 용량은 이전에 진행하였던 동물 연구를 기반으로 3%로 설정하였다. 이전 연구에서는 투여량보다 낮은 투여량에서 생물학적 효과를 조사하기 위해 D-리보-2-헥술로스의 용량을 3%로 결정하였다. 실험 동안 마우스는 자유롭게 증류수에 접근할 수 있었으며, 마우스의 음식 섭취량과 몸무게는 매주, 혈당은 4주에 한번 측정하였다. 모든 동물 실험은 경북대학교 동물연구윤리위원회의 승인을 받았다 (승인 번호: KNU-2020-109).

성 분(g)	AIN-93G	AIN-93G + 3% DRH
Casein	200	200
Corn Starch	397.5	397.5
Sucrose	100	100
Maltodextrin	132	132
Cellulose	50	20
Soybean Oil	70	70
Mineral Mix	35	35
Vitamin Mix	10	10
TBHQ, antioxidant	0.014	0.014
L-Cystine	3	3
Cholin Bitartrate	2.5	2.5
D-ribo-2-hexulose	-	30
총 합(g)	1000	1000
칼로리(Kcal/g)	3948	3948

실시예 2. 전신 인장력 및 왼쪽 뒷다리 두께

전신의 인장력은 디지털 포스 게이지(digital force gauge, 대한민국, JM Instruments Corp., FGJN.FGP Series)를 이용하여 측정하고 평가하였다. 각각의 마우스에 대해, 5일 간격으로 전신의 인장력을 측정하고 평가하였다. 실험 10주차에 전신의 인장력을 평가하기 위해 전신의 인장력 최대값의 평균값을 체중당 힘(N g^-1 BW)으로 계산하였다.

왼쪽 뒷다리 두께는 실험 기간 동안 4주마다 Bluetec 디지털 캘리퍼(caliper)(대한민국, BLUETEC, BD500)를 이용하여 측정하였고, 다리 두께는 개체에 따른 차이를 최소화하기 위하여 각 마우스의 체중으로 나누었다 (mm/100g×체중).

실시예 3. 혈장, 간, 및 근육 조직의 생화학적 프로파일

혈장 TG 및 TC 분석은 효소 키트(대한민국, 아산약품)를 사용하여 수행하였다. 유리지방산(Free fatty acid; FFA) 또한 효소 키트(미국, ABcam)를 사용하여 측정하였다. 간 및 근육 지질을 추출한 후, 건조된 지질 잔류물은 TG, TC, 및 FFA의 측정을 위해 1 mL의 에탄올에 용해시켰다. 유화 작용(emulsification)을 위해, 200 μL의 용해된 지질 용액에 Triton X-100 및 콜산나트륨(sodium cholate) 용액을 첨가하였다. TG, TC, 및 FFA는 혈장 지질 분석에 사용된 효소 키트와 동일한 키트에서 수행하였다.

사이토카인 분석을 위해 Merck Millipore 제품(미국, Merck, MCYTOMAG-70K)으로 혈장 사이토카인(TNF-α, IL-1β, 및 IL-4)을 측정하였다. 각 마우스의 혈장(30 μL)은 두 번씩 분석하였다. 호르몬 분석은 코티솔(cortisol) 및 테스토스테론(testosterone) 파라미터 분석 키트(parameter assay kit, 미국, R&D Systems)를 사용하여 수행하였다.

항산화 활성 분석을 위해, Marklund et al.의 방법을 수정한 후, 알카라인(alkaline) 상태에서 SOD(superoxide dismutase) 활성을 pyrogallol autoxidation을 이용하여 측정하였다. 또한, 카탈라아제(CAT) 활성은 Aebi et al.의 방법을 수정하여 측정하였다. PON(paraoxonase) 활성은 p-nitrophenol의 흡광도 증가를 측정하기 위해 Mackness et al.의 방법을 수정하여 측정하였다. GR(glutathione reductase) 활성은 NADPH 산화를 측정했던 Pinto와 Bartley의 방법을 수정하여 측정하였다. 총 GSH(glutathione) 함량은 Ellman et al.의 방법으로 측정하였다.

실시예 4. 조직병리학(histopathology) 및 IHC(ImmunoHistoChemistry) 분석

형태학적 조직 관찰을 위해, 간과 근육 조직의 일부를 24시간 동안 10% 포름알데히드 용액으로 고정하였다. 그런 다음, 샘플을 동일한 용액으로 두 번 교체하고, 이중 에탄올로 탈수하고, 파라핀으로 포맷하여 poly-L-lysine으로 처리한 5 μm 두께의 조직 조각을 제조하였다. 형태학적 분석을 위해, 제조한 조직 절편 중 간 조직은 H&E 및 MT로 염색하고, 근육 조직은 H&E 및 Sirius red로 염색하여 광학현미경으로 200배 확대하였다. IHC 분석을 위해, IGF-1과 Myostatin으로 염색한 후 광학현미경으로 근육 조직을 관찰하였다.

실시예 5. mRNA-시퀀싱

서열을 필터링하여 파라미터(>10% ambiguous (N) 염기로 구성된 read, phred 품질 점수 < 20인 염기가 >40%인 read, 및 평균 phred 품질 점수 < 20인 read(Trimmomatic 0.38))에 따라 데이터세트에서 낮은 품질의 read를 폐기하였다. 생성된 고품질 read는 aligner software STAR, v.2.6.0c를 사용하여 인간 참조 게놈(StringTie 버전 2.1.3b)에 매핑하였다.

HiSeq Illumina 시퀀싱은 간 조직을 사용하여 상업적으로(대한민국, Macrogen) 수행하였다. RNA-seq 라이브러리는 TruSeq Stranded mRNA 샘플 제조 키트를 사용하여 총 RNA로부터 제조하였다. 라이브러리는 paired-end run(2 × 75 염기)을 사용하여 Illumina Nextseq 500 sequencer에서 시퀀싱하였다. Illumina(https://sapac.illumina.com/)에서 자세한 프로토콜을 제공한다.

실시예 6. Real-Time PCR

총 RNA를 분리한 후, 총 cDNA(complementary DNA)를 합성하였다. Real-Time PCR 분석을 위해, 주형 cDNA를 RNAse free water로 희석하여 25 ngμL^-1의 농도로 사용하였으며, QuantitTeck SYBR Green PCR kit(QIAGEN, 독일)를 사용하여 유전자 발현을 분석하였다. 각 유전자의 발현을 분석할 수 있는 프라이머는 Genotech Co., Ltd. (대한민국, 대전)에 의뢰하여 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 합성하였다.

유전자(Gene ID)	방향	서열 (5'→3')
GAPDH(14433)	정방향	TGC AGT GGC AAA GTG GAG AT (서열번호 1)
	역방향	TTG AAT TTG CCG TGA GTG GA (서열번호 2)
Atrogin-1(67731)	정방향	AAC CGG GAG GCC AGC TAA AGA ACA (서열번호 3)
	역방향	TGG GCC TAC AGA ACA GAC AGT GC (서열번호 4)
FoxO3(56484)	정방향	TCG CCT CCT GGC GGG CTT A (서열번호 5)
	역방향	ACG GCG GTG CTA GCC TGA GA (서열번호 6)
Mef2(17260)	정방향	ACA CGC ATA ATG GAT GAG AGG AAC CGA C (서열번호 7)
	역방향	CAA CGA TAT CCG AGT TCG TCC TGC TTT C (서열번호 8)
Myf5(17877)	정방향	AGG AAA AGA AGC CCT GAA GC (서열번호 9)
	역방향	GCA AAA AGA ACA GGC AGA GG (서열번호 10)
Myf6(17878)	정방향	CAA GAA AAT CTT GAG GGT GCG G (서열번호 11)
	역방향	TTA GCC GTT ATC ACG AGC CC (서열번호 12)
MyoD(17927)	정방향	GCT TCT ATC GCC GCC ACT CC (서열번호 13)
	역방향	CGC ACA TGC TCA TCC TCA CG (서열번호 14)
Myogenin(17928)	정방향	CCT TGC TCA GCT CCC TCA (서열번호 15)
	역방향	TGG GAG TTG CAT TCA CTG G (서열번호 16)
MuRF1(4433766)	정방향	GAG AAC CTG GAG AAG CAG CT (서열번호 17)
	역방향	CCG CGG TTG GTC CAG TAG (서열번호 18)
CerS1(93898)	정방향	GCA GCC ACC ACA CAC AT (서열번호 19)
	역방향	ATG CCT GAC CTC CAG TCA TA (서열번호 20)
CIDEC(14311)	정방향	TCC AGG ACA TCT TGA AAC TT (서열번호 21)
	역방향	GGC TTG CAA GTA TTC TTC TGT (서열번호 22)
CISH(12700)	정방향	GGA CAT GGT CCT TTG CGT ACA G (서열번호 23)
	역방향	GGA GAA CGT CTT GGC TAT GCA C (서열번호 24)
SCD1(20249)	정방향	TCC TGC TCA TGT GCT TCA TC (서열번호 25)
	역방향	GGA TGT TCT CCC GAG ATT GA (서열번호 26)
Adipsin(11537)	정방향	AAC CGG ACA ACC TGC AAT C (서열번호 27)
	역방향	CCC ACG TAA CCA CAC CTT C (서열번호 28)
Adiponectin(11450)	정방향	CCG TTC AGC ATT CAG TGT (서열번호 29)
	역방향	CAG CCT TGT CCT TCT TGT A (서열번호 30)
Haptoglobin(15439)	정방향	CTG TGG AGT TGG GCA ATG ATG (서열번호 31)
	역방향	AAC CAA GTG CTC CAC ATA GCC (서열번호 32)
Neuronatin(18111)	정방향	GCT CAT CAT CGG CTG GTA CA (서열번호 33)
	역방향	CTT GGC AAG TGC TCC TCT GA (서열번호 34)

반응액의 조성은 각각 SYBR Green 10 μL, 주형 2 μL, 프라이머 200 μM이고, 최종 부피가 20 μL가 되도록 RNAse free water를 첨가한 후, 94 ℃에서 15초, 58 ℃및 72 ℃에서 30초 동안 반응시켰다. 한 사이클당 15초로 30초 동안 65 ℃에서 40회 반응시켰다. 이때, 각 주기에 대한 형광 신호를 모니터링하여 나타나는 Ct(threshold cycle)를 분석하여 각 실험군 간의 mRNA 발현을 CFX96 Real-time System(미국, Bio-Rad)을 이용하여 정량적으로 분석하였다. GAPDH(Gene ID 14433)는 내부 전사 마커로 사용하였으며, 증폭에 사용된 유전자 프라이머는 다음과 같다: MyoD(myoblast determination protein 1, Gene ID 17927), Myf5(Gene ID 17877), Myf6(Gene ID 17878), Myogenin(Gene ID 17928), Mef2(Gene ID 17260), MuRF1(Gene ID 4433766), Atrogin1(Gene ID 67731), FoxO3(Gene ID 56484), CerS1(Gene ID 93898(3)1), CIDEC1 (Gene ID 12700), SCD1(Gene ID 20249), Adipsin(complement factor D, Gene ID 11537), Adiponectin(Gene ID 11450), Haptoglobin(Gene ID 15439), 및 Neuronatin(Gene ID 18111).

실시예 7. 웨스턴 블랏

세포질과 막의 단백질 양은 Bradford 방법에 따라 정량화하였다. 그런 다음, 10% SDS-polyacrylamide gel에 protein load를 가하고 1시간 동안 Tris-glycine 전기영동 버퍼로 옮겨 전기영동하였다. Ponceau 용액으로 밴드의 위치를 확인한 후, 막에 대한 비특이적 반응을 감소시키기 위하여 블로킹(TBS/0.1% Tween-20에서 5% 탈지유)을 실온에서 60분간 수행하였다. 그런 다음, 샘플을 4℃에서 밤새 1차 항체와 반응시켰다.

각 항체를 다음과 같은 비율로 희석한 5% 탈지유와 반응시켰다: 토끼 항-마우스 PGC1-α (1:1000; 미국, 산타크루스), 토끼 항-마우스 α-tubulin (1:1000; 미국, Cell Signaling Technology), 토끼 항마우스 p-Akt (1:1000; Cell Signaling Technology, USA), 토끼 항-마우스 Akt (1:1000; 미국, Cell Signaling Technology), 토끼 항-마우스 p-PI3K (1:1000; 미국, Cell Signaling Technology), 토끼 항-마우스 PI3K (1:1000; Cell Signaling Technology), 토끼 항-마우스 mTOR (1:1000; 미국, Cell Signaling Technology), 토끼 항-마우스 TNF-α (1:1000; 미국, Cell Signaling Technology), 토끼 항-마우스 Adiponectin (1:1000; 미국, Cell Signaling Technology), 토끼 항-마우스 Haptoglobin(1:1000; 미국, ABcam), 토끼 항-마우스 SCD1(1 :000; 미국, Cell Signaling Technology), 염소 항마우스 CerS1(1:1000; Novus Biologicals, USA) 및 토끼 항-마우스 NF-κB(1:000; 미국, Cell Signaling Technology). 단백질 밴드를 세척한 후, 막을 30분 동안 TBST 버퍼(25 mM Tris-base, 155 mM NaCl, 0.1% Tween-20), 항-토끼 lgG (1:1000; 영국, 아머샴) 또는 항-염소 lgG (1:1000; 미국, ABcam) 이차 항체에서 일차 항체와 반응시키고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 막을 30분 동안 TBST 버퍼로 다시 세척하였다. ECL kit(Pierce Chemical Co., IL)를 이용하여 필름에 면역반응 밴드를 현상하여 최종 상태의 밴드를 확인하였다.

실시예 8. BN-PAGE(blue native polyacrylamide gel electrophoresis) 분석

미토콘드리아는 Potter-Elvehjem 방법에 의해 대퇴사두근에서 분리하였다. 호흡기 SC를 추출하기 위해, 샘플 버퍼 칵테일을 50 μg 단백질 당 digitonin(미국, Invitrogen) 8 μL, 50 μg 단백질 당 샘플 버퍼(미국, Invitrogen) 4×5 μL 및 50 μg 단백질당 물 7 μL로 만들었다. 그런 다음, 용액을 미토콘드리아와 혼합하였다. BN-PAGE 실행 및 전송을 수행하였다. Ox-Phos Rodent WB 항체 칵테일(미국, Invitrogen)은 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 2차 항체 용액 Alk-Phos(미국, Invitrogen, USA)를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 크로모겐(BCIP/NBT)을 사용하여 면역반응 밴드를 현상하였다. 그런 다음 최종 상태의 밴드를 확인하였다.

실시예 9. 통계 분석

모든 실험 결과의 통계 분석은 SPSS(Statistical Package for Social Science) 패키지 프로그램을 사용하여 수행하였다. 데이터는 평균±표준 오차(SE)로 표시하였다. Mann-Whitney U 테스트를 통해 그룹 간 유의한 차이를 확인하였다. p < 0.05 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

[실험예]

실험예 1. 노화 관련 근육 손실을 개선하는 D-리보-2-헥술로스

하기 표 3에 따르면, 최종 체중과 체중 증가량은 DRH 군이 NC 군보다 유의하게 낮았다. 음식 섭취량(food intake)은 NC 군과 DRH 군 간에 유의한 차이가 없었다. 반면, 식품 효율 비율(FER)은 NC 군에 비해 DRH 군에서 유의하게 감소하였다. DRH 군의 경우 NC 군에 비해 간 무게가 감소하였고, 신장 무게는 증가하였다. 비장 무게는 큰 차이가 없었다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 실험 12주차에 왼쪽 뒷다리 두께는 NC 군에 비해 YC 군과 DRH 군 모두에서 유의하게 증가하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 전신 인장력은 YC 군에 비해 NC 군에서 유의하게 감소하였다. 그러나, D-리보-2-헥술로스는 DRH 군에서 전신 인장력의 감소를 극적으로 보완하였다. 근육 중량은 YC 군에 비해 NC 군에서 유의하게 감소하였다. 도 1c에 나타낸 바와 같이, 오른쪽 및 왼쪽 대퇴사두근(quadriceps)과 왼쪽 전방 경골(anterior tibialis)은 NC 군에 비해 DRH 군에서 유의하게 증가하였다. 도 1d에 나타난 바와 같이, 근육 조직의 H&E(헤마톡실린 및 에오신) 염색에 기초한 형태학적 분석 결과, NC 군에 비해 YC 군에서 근섬유 크기가 유의하게 증가하였다.

또한, 도 1d에 나타난 바와 같이, NC 군에서 관찰된 감소는 DRH 군의 마우스에서도 개선되었으며, 근육 조직의 Sirius red 염색 분석 결과, YC 군과 비교하여 NC 군에서 섬유증이 진행된 것을 확인할 수 있었다. DRH 군의 섬유증 진행은 YC 군 수준으로 감소하였다.

실험예 2. 근육 강화 인자 단백질 발현을 증가시키는 D-리보-2-헥술로스

IHC 분석 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 단백질 합성의 상류 인자인 IGF-1(insulin-like growth factor 1)의 발현 수준은 YC 군에 비해 NC 군에서 유의하게 감소한 반면, D-리보-2-헥술로스의 보충은 이러한 감소를 개선하였다. 비복근 섬유에서 단백질 분해의 상류 인자인 마이오스타틴(Myostatin)의 발현 수준은 YC 군에 비해 NC 군에서 유의하게 증가하였다. 그러나, D-리보-2-헥술로스의 보충은 YC 군 수준 만큼 이러한 증가를 억제하였다.

근력 관련 유전자 발현 분석 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 근육 세포 사멸 억제 유전자인 MyoD를 포함하여 MuRF1(muscle-specific RING-finger protein-1), Atrogin1, FoxO3(Forkhead box O3)와 같은 근육 단백질 분해 억제 유전자의 발현에서 3 그룹 모두 유의한 차이를 나타내지 않았다. 그러나, 근원성 전사 인자 유전자인 Myf5(myogenic factor 5), Myf6(myogenic factor 6), Myogenin, 및 Mef2(myocyte enhancer factor-2)의 발현은 YC 군에 비해 NC 군에서 유의하게 감소하였다. 이러한 감소는 특히 Myf5, Myf6, 및 Myogenin의 발현에서 D-리보-2-헥술로스의 보충으로 부분적으로 개선되었다. NC 군과 DRH 군 사이에는 상당한 차이가 있었다.

Akt, AMPK, PI3K, mTOR, PGC1-α 및 이들의 인산화 변이체의 단백질 수준을 측정하여 근력 증가의 원인을 조사하였다. 그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 모든 단백질 발현 인자는 YC 군에 비해 NC 군에서 유의하게 감소하였다. D-리보-2-헥술로스의 보충은 NC 군에 비해 DRH 군에서 유전자 발현을 유의하게 증가시켰다. DRH 군의 마우스에서 TNF-α 발현은 NC 군보다 유의하게 감소하였다.

실험예 3. 비복근 조직의 전사 반응 및 산화적 인산화에 대한 D-리보-2-헥술로스의 효과

D-리보-2-헥술로스는 비복근 조직의 산화적 인산화와 관련된 전사 반응과 인자를 변경시켰다. 따라서, 비복근 조직의 전사체 프로파일을 조사하기 위해 RNA 시퀀싱(mRNA-seq) 분석을 수행하였다. 차등적으로 발현된 유전자(DifferentiDRHy expressed genes; DEG)는 배수 변화(fold change; FC) ≥2 컷오프 및 p-값 < 0.05를 사용하여 확인하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, D-리보-2-헥술로스의 보충은 NC 군과 비교하여 2개의 유전자(즉, CISH(cytokine inducible SH2-containing protein) 및 CerS1(ceramide synthase 1))를 상향 조절하고 6개의 유전자(즉, Adiponectin, Adipsin, CIDEC(cell death-inducing DFFA-like effector c), Haptoglobin, Neuronatin, 및 SCD1(stearoyl-coenzyme A desaturase 1))를 하향 조절하였다. mRNA-seq 결과를 검증하기 위해 DEG에 대해 RT-PCR 분석 및 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, mRNA-seq로 얻은 결과와 일관된 결과를 보였다.

도 3c에 나타낸 바와 같이, 간 G6P(glucose-6-phosphatase)는 YC 군보다 NC 군에서 유의하게 감소한 반면, NC 군에 비해 DRH 군에서 유의하게 증가하였다. 미토콘드리아 호흡사슬복합체(respiratory chain complex) 주로, 복합체 I, II, III, 및 IV를 BN-PAGE를 통해 분석하였다. 그 결과, 도 3d에 나타낸 바와 같이, 복합체 IV는 YC 군에 비해 NC 군에서 유의하게 감소한 반면, D-리보-2-헥술로스의 보충은 NC 군에 비해 복합체 IV가 유의하게 증가하였다.

실험예 4. 지방 및 근육 중량에 대한 D-리보-2-헥술로스의 효과

도 4a에 나타낸 바와 같이, D-리보-2-헥술로스의 보충이 지방 중량을 감소시켰으나, NC 군과 DRH 군의 마우스 간에 총 근육 조직 무게에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 그러나, 총 지방 조직 중량에 대한 총 근육 조직 중량 비율은 NC 군에 비해 DRH 군에서 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

도 4b에 나타낸 바와 같이, 근육 TG(triglyceride) 수준은 노화와 함께 증가하였지만, D-리보-2-헥술로스의 보충은 이러한 증가를 유의하게 감소시켰다. 근육 TC(total cholesterol)와 지방산 수준은 YC 군에 비해 NC 군에서 증가하였다. 그럼에도 불구하고, DRH 군과 NC 군 간에는 유의한 차이가 없었다. 또한, 혈장 TG 및 TC 수준은 YC 군보다 NC 군에서 유의하게 증가하였으며, 이러한 증가는 D-리보-2-헥술로스의 보충으로 개선되었다. 혈장 지방산은 YC 군과 NC 군 사이에 유의한 차이가 없었으나 NC 군보다 DRH 군에서 유의하게 감소하였다.

실험예 5. 염증성 사이토카인, 항산화 시스템, 혈액 글리코겐, 및 호르몬에 대한 D-리보-2-헥술로스 보충의 효과

도 5a에 나타낸 바와 같이, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-4(interleukin-4), IL-1β, 및 IL-6의 수준은 그룹 간에 유의한 차이가 없었다. 항산화 효소 활성 분석 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 간 GSH, PON, GR, 및 혈장 PON 활성은 YC 군보다 NC 군에서 유의하게 감소한 반면, D-리보-2-헥술로스의 보충은 간 GSH-Px, PON, GR, 및 혈장 PON 활성을 증가시켰다. 도 5c에 나타낸 바와 같이, 과산화지방질 및 과산화수소 함량, 간 H₂O₂ 함량, TBARs(thiobarbituric acid reactive substance), 및 적혈구 TBARs는 YC 군에 비해 NC 군에서 유의하게 증가하였다. D-리보-2-헥술로스의 보충은 간 H₂O₂ 함량을 유의하게 감소시켰다.

도 5d에 나타낸 바와 같이, 근육과 간 글리코겐 함량은 그룹 간에 유의한 차이가 없었다. NC 군의 공복 혈당 수준은 8주에서 12주까지 YC 군에 비해 유의하게 증가했지만, DRH 군은 NC 군에 비해 12주에 유의하게 감소하였다.

도 5e에 나타낸 바와 같이, 테스토스테론 수준은 YC 군에 비해 NC 군에서 유의하게 감소하였으나, DRH 군과 NC 군 사이에서는 유의한 차이를 나타내지 않았다. 코르티솔 수준은 YC 군에 비해 NC 군에서 유의하게 증가한 반면, DRH 군에서는 감소하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for preventing, alleviating, or treating Sarcopenia comprising D-ribo-2-hexulose as active ingredient <130> MP21-016P1 <150> KR 10-2021-0029041 <151> 2021-03-04 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_F <400> 1 tgcagtggca aagtggagat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_R <400> 2 ttgaatttgc cgtgagtgga 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrogin-1_F <400> 3 aaccgggagg ccagctaaag aaca 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrogin-1_R <400> 4 tgggcctaca gaacagacag tgc 23 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FoxO3_F <400> 5 tcgcctcctg gcgggctta 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FoxO3_R <400> 6 acggcggtgc tagcctgaga 20 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mef2_F <400> 7 acacgcataa tggatgagag gaaccgac 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mef2_R <400> 8 caacgatatc cgagttcgtc ctgctttc 28 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myf5_F <400> 9 aggaaaagaa gccctgaagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myf5_R <400> 10 gcaaaaagaa caggcagagg 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myf6_F <400> 11 caagaaaatc ttgagggtgc gg 22 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myf6_R <400> 12 ttagccgtta tcacgagccc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyoD_F <400> 13 gcttctatcg ccgccactcc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyoD_R <400> 14 cgcacatgct catcctcacg 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myogenin_F <400> 15 ccttgctcag ctccctca 18 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myogenin_R <400> 16 tgggagttgc attcactgg 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MuRF1_F <400> 17 gagaacctgg agaagcagct 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MuRF1_R <400> 18 ccgcggttgg tccagtag 18 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CerS1_F <400> 19 gcagccacca cacacat 17 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CerS1_R <400> 20 atgcctgacc tccagtcata 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CIDEC_F <400> 21 tccaggacat cttgaaactt 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CIDEC_R <400> 22 ggcttgcaag tattcttctg t 21 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CISH_F <400> 23 ggacatggtc ctttgcgtac ag 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CISH_R <400> 24 ggagaacgtc ttggctatgc ac 22 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCD1_F <400> 25 tcctgctcat gtgcttcatc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCD1_R <400> 26 ggatgttctc ccgagattga 20 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adipsin_F <400> 27 aaccggacaa cctgcaatc 19 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adipsin_R <400> 28 cccacgtaac cacaccttc 19 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adiponectin_F <400> 29 ccgttcagca ttcagtgt 18 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adiponectin_R <400> 30 cagccttgtc cttcttgta 19 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Haptoglobin_F <400> 31 ctgtggagtt gggcaatgat g 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Haptoglobin_R <400> 32 aaccaagtgc tccacatagc c 21 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neuronatin_F <400> 33 gctcatcatc ggctggtaca 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neuronatin_R <400> 34 cttggcaagt gctcctctga 20

Claims (5)

1. D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)를 유효성분으로 포함하는 사코페니아 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 D-리보-2-헥술로스는 하기 특징 중 하나 이상을 만족시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
   a) IGF-1(insulin-like growth factor 1)의 발현을 증가시킴;
   b) 마이오스타틴(Myostatin) 발현을 억제시킴;
   c) 근력 감소를 억제시킴; 또는
   d) 근육량을 증가시킴.
   
3. D-리보-2-헥술로스(D-ribo-2-hexulose)를 유효성분으로 포함하는 사코페니아 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 식품 조성물은 건강기능성식품 조성물인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
   
5. 제3항에 있어서,
   상기 D-리보-2-헥술로스는 하기 특징 중 하나 이상을 만족시키는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물:
   a) IGF-1(insulin-like growth factor 1)의 발현을 증가시킴;
   b) 마이오스타틴(Myostatin) 발현을 억제시킴;
   c) 근력 감소를 억제시킴; 또는
   d) 근육량을 증가시킴.

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