KR20230078798A - 약제학적 화합물의 결정형 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 화합물 (I)의 결정형 및 화합물 (I)의 결정형을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 화합물 (I)의 결정형을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 뿐만 아니라, 본 발명은 의약으로서 그리고 비정상적인 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질과 관련된 질병의 치료에서 이러한 화합물 (I)의 결정형을 사용하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 화합물 (I)의 결정형에 관한 것이다:
본 발명은 또한 화합물 (I)의 결정형을 제조하는 방법뿐만 아니라, 화합물 (I)의 결정형을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 화합물 (I)의 이러한 결정형을 약제로서 그리고 비정상적인 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 수반하는 질병의 치료에 사용하는 방법에 관한 것이다.
화합물이 약제학적 목적으로 사용될 때, 화합물의 결정 상태가 중요할 수 있다. 이는 결정 상태의 화합물의 형태, 입자 크기, 다형성, 용매화, 또는 수화가 약제학적 작용제(pharmaceutical agent)의 여과, 유동, 타정, 용해 및 생체이용률에 영향을 미칠 수 있기 때문이다.
데옥시노지리마이신 유도체는 의약 화학 및 약물 발견에서 중요한 분자 부류이다. N-(하이드록시에틸)-데옥시노지리마이신은 제2형 당뇨병에 대한 항당뇨병제로서 미그리톨(Miglitol)로 시판되고 있다. 미글리톨은 또한 여러 장내 글리코시다아제(말타아제, 수크로오스 및 락타아제)의 광범위(broad-spectrum) 억제제로 작용한다(Hillebrand et al., Diabetes, 1986, Vol. 35, A93-A93)(Scott and Spencer, Drugs, 2000, Vol. 59, 521-549).
N-부틸-데옥시노지리마이신(miglustat, Zavesca®)은 글루코실세라마이드 합성효소(세라마이드 글루코실트랜스퍼라아제라고도 함, EC 2.4.1.80, UniProt 코드: Q16739)의 억제제로 개발되었으며, 클리닉에서 리소좀 축적 장애, 고셔병(Platt et al., J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, 8362-8365)(Cox et al., Lancet, 2000, Vol. 355, 1481-1485) 및 니만-픽 타입 C 질병(Pineda et al. Orphanet J. Rare Dis., 2018, Vol. 13, 140) 환자를 치료하는 데 사용되고 있다.
WO2015/147639 A1은 화합물 (I)을 포함하는 데옥시노지리마이신의 신규 유도체를 기재하고 있으며;
비정상적인 수준의 세포질 또는 리소좀성 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질과 관련된 질병의 치료에 효과적이다. 화합물 (I)은 글루코실세라마이드 합성효소 및 비-리소좀성 글루코실세라미다아제(GBA2, UniProt 코드: Q9HCG7)의 강력한 이중 억제제이다.
비정상적인 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 치료하는데 유용한 치료 화합물은 종종 정제 형태로 투여된다. 이러한 정제에 사용하기 위한 약제학적 조성물 및 제형을 제조할 때, 낮은 수준의 흡습성 및/또는 낮은 수준의 조해성을 갖는 치료 화합물의 결정형을 갖는 것이 매우 바람직하며, 이로써 화합물이 원하는 형상 또는 크기로 압축될 수 있다.
또한, 치료 화합물의 상대적으로 높은 융점(일반적으로 약 80℃ 초과)은 분해에 대한 저항성에 유리하여, 치료 화합물의 보관을 용이하게 하고 저장 수명(shelf life)을 증가시키며, 이는 임의의 약제학적 작용제에 바람직할 수 있다.
약제학적 작용제의 취급, 제조, 및 보관을 고려할 때, 치료 화합물이 비흡습성이거나, 실질적으로 비흡습성인 것이 또한 특히 유익하다. 약제학적 작용제가 흡습성을 나타내는 경우, 예를 들어, 다음과 같은 많은 문제가 발생할 수 있다:
· 재료를 분쇄하여 작은 입자나 분말로 만드는 데 어려움이 있음;
· 원하지 않는 습기는 적절한 반응을 방해하고 원하지 않는 최종 생성물을 형성하여, 품질 저하와 저장 수명 단축을 초래함;
· 제조 중 연질 정제 생산, 또는 포장 내부의 수분 침투;
· 분말이 컨베이어에 들러붙어, 충진 공정에 영향을 줄 수 있음.
따라서, 비흡습성 또는 실질적으로 비흡습성인 치료 화합물의 결정형을 갖는 것이 바람직하다.
화합물 (I)의 결정형은 이전에 보고된 바 없다. 따라서, 바람직하게는 실질적으로 비흡습성이고 및/또는 비교적 높은 융점을 갖는 안정한 및/또는 비조해성인 화합물 (I)의 결정형이 필요하다.
제1 양태에서, 본 발명은 화합물 (I)의 결정형을 제공한다:
본 명세서에서 정의된 각각의 양태 또는 실시형태는 명백히 달리 나타내지 않는 한 임의의 다른 양태(들) 또는 실시형태(들)와 조합될 수 있다. 특히 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형, 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 약제로 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형, 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 비정상적인 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 수반하는 질병을 치료하는데 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형, 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 니만-픽 타입 C 질병을 치료하는데 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형, 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형, 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물 환자에서 비정상 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 수반하는 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형, 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물 환자에서 니만-픽 타입 C 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 화합물 (I)의 샘플을 용매와 접촉시키는 것을 포함하는, 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형을 제조하는 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 공정을 수행하여 얻은 화합물 (I)의 결정형을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 화합물 (I)의 결정형을 제조하기 위한 화합물 (I)의 유리 염기의 용도를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 화합물 (I)의 유리 염기를 결정화하는 것을 포함하는 화합물 (I)의 결정형을 제조하는 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 화합물 (I)의 유리 염기를 결정화하는 것을 포함하는 결정형 화합물 (I)의 제조 방법에 의해 얻어진 화합물 (I)의 결정형을 제공한다.
본 발명에 따른 화합물의 다른 바람직한 실시형태는 명세서 전반에 걸쳐, 특히 실시예에 제시되어 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 안정하고 비조해성인 화합물 (I)의 결정형을 발견했다. 본 발명은 실질적으로 흡습성이 없고 상대적으로 높은 융점과 같은, 추가적인 유리한 특성을 갖는다.
예기치 않게도, 본 발명자들은 물에서 양호한 용해도를 나타내는 화합물 (I)의 결정형을 추가로 발견했다. 이러한 특성은 본 발명의 결정형을 약제학적 조성물에 사용하기에 특히 적합하게 만든다.
치료 화합물의 결정화에는 종종 다른 염의 사용이 포함된다. 일반적으로, 염은 쉽게 결정화되며, 생성된 물질은 치료 화합물의 후속 결정화를 촉진한다. 이러한 이유로, 염의 사용은 종종 치료 화합물을 결정화하는 데 선호되는 방법이다. 따라서, 본 발명자들이 화합물 (I)의 결정성 유리 염기 형태를 발견한 것은 놀라운 일이다.
임의의 치료 화합물의 결정성 유리 염기 형태는 반대이온의 존재를 필요로 하지 않기 때문에, 유리 염기 결정형 분말 중의 치료 화합물 농도는 일반적으로 상응하는 염 형태에서 더 높으며, 이는 치료 화합물의 제조 비용을 감소시키기 때문에 매우 유익하다.
이론에 구속됨을 원치 않으면서, 본 발명의 결정형은 결정 구조로 인해 상기 논의된 유리한 효과를 나타내는 경향이 있는 것으로 생각된다.
본 발명의 이러한 양태 및 다른 양태는 이제 첨부된 도면을 참조하여 설명될 것이다:
도 1은 아세토니트릴과의 평형화에 의해 얻어지는 형태 2로 명명된, 화합물 (I)의 결정형의 편광 현미경을 사용하여 얻은 예시적인 이미지를 나타낸다: 왼쪽: 건조 분말, 오른쪽: 파라핀 오일에 분산됨.
도 2는 아세토니트릴로 평형화하여 얻은 형태 2의 X선 분말 회절 패턴을 나타낸다.
도 3a는 아세토니트릴로 평형화하여 얻은 형태 2의 TG-FTIR 써모그램을 나타낸다.
도 3b는 아세토니트릴로 평형화하여 얻은 형태 2의 시차 주사 열량계(DSC) 써모그램을 나타낸다.
도 4a는 아세토니트릴로 평형화하여 얻은 형태 2의 동적 증기 흡착(DVS) 등온선을 나타낸다: 시간의 함수로서 수분 함량(빨간색 곡선) 및 상대 습도(파란색 곡선)의 변화.
도 4b는 아세토니트릴로 평형화하여 얻은 형태 2의 DVS 등온선을 나타낸다: 상대 습도의 함수로서 수분 함량의 변화.
도 5는, 각각, 아세토니트릴, 아니솔, 또는 에틸 아세테이트로 평형화하여 얻은 형태 3으로 명명된 화합물 (I)의 결정형의 편광 현미경을 사용하여 수득한 예시적인 이미지를 나타낸다.
도 6a는 아세토니트릴로 평형화하여 얻은 형태 3의 X선 분말 회절 패턴을 나타낸다.
도 6b는, 각각, TBME, 물, 이소프로판올, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 또는 아니솔로 평형화하여 얻은 형태 3의 X선 분말 회절 패턴의 오버레이를 나타낸다.
도 7은 아세토니트릴로 평형화하여 얻은 화합물 (I)의 2가지 결정형의 X선 분말 회절 패턴의 오버레이를 나타낸다:
1) 형태 3(실시예 3) 및
2) 형태 2(실시예 2).
도 8a는 에틸 아세테이트로 평형화하여 얻은 형태 3의 TG-FTIR 써모그램을 나타낸다.
도 8b는 이소프로판올로 평형화하여 얻은 형태 3의 TG-FTIR 써모그램을 나타낸다.
도 8c는 에틸 아세테이트로 평형화하여 얻은 형태 3의 DSC 써모그램을 나타낸다.
도 9a는 에틸 아세테이트로 평형화하여 얻은 형태 3의 DVS 등온선을 나타낸다: 시간의 함수로서 수분 함량(빨간색 곡선) 및 상대 습도(파란색 곡선)의 변화.
도 9b는 에틸 아세테이트로 평형화하여 얻은 형태 3의 DVS 등온선: 상대 습도의 함수로서 수분 함량의 변화.
도 10은 정위 좌표를 보여주는 Paxinos & Franklin "The Mouse Brain Atlas, 2nd edition"에 기반한 절편 프로토콜에 따라 얻은 대략적인 중앙 시상(medio-sagittal) 수준을 나타낸다.
도 11은 생후(PND) 11일과 9주 사이에 마우스 체중의 변화 백분율을 나타낸다.
도 12는 PND 11-70까지의 반복 경구 투여 후 글루코실세라마이드 C16:0 및 C18:0 수준을 나타낸다.
도 13은 NPC(-/-) 비히클 및 AZ-3102 처치된 마우스에서 PND 56-70까지의 임상 징후에 대한 채점을 나타낸다.
도 14는 NPC(-/-) 비히클 및 AZ-3102 처치된 마우스에서 PND 56-70까지의 떨림 점수를 나타낸다.
도 15는 관심 영역(ROI)의 정의를 나타낸다. 이미지는 소뇌(cerebellum), 해마 형성(hippocampal formation), 뇌량(corpus callosum), 및 선조체(striatum)(미상핵(caudate)-피각(putamen))의 ROI 개요를 나타낸다.
도 16은 뇌 면역조직화학을 나타낸다: NPC(+/+, 야생형 마우스) 및 NPC(-/-) 처치된 마우스와 비교하여 NCP(-/-) 및 NPC(+/-) 비히클 처치된 마우스에서의 칼빈딘-D28k 라벨링.
도 17은 화합물 (I)(AZ-3102)의 결정형의 작용 기전을 요약한 것이다.
도 1은 아세토니트릴과의 평형화에 의해 얻어지는 형태 2로 명명된, 화합물 (I)의 결정형의 편광 현미경을 사용하여 얻은 예시적인 이미지를 나타낸다: 왼쪽: 건조 분말, 오른쪽: 파라핀 오일에 분산됨.
도 2는 아세토니트릴로 평형화하여 얻은 형태 2의 X선 분말 회절 패턴을 나타낸다.
도 3a는 아세토니트릴로 평형화하여 얻은 형태 2의 TG-FTIR 써모그램을 나타낸다.
도 3b는 아세토니트릴로 평형화하여 얻은 형태 2의 시차 주사 열량계(DSC) 써모그램을 나타낸다.
도 4a는 아세토니트릴로 평형화하여 얻은 형태 2의 동적 증기 흡착(DVS) 등온선을 나타낸다: 시간의 함수로서 수분 함량(빨간색 곡선) 및 상대 습도(파란색 곡선)의 변화.
도 4b는 아세토니트릴로 평형화하여 얻은 형태 2의 DVS 등온선을 나타낸다: 상대 습도의 함수로서 수분 함량의 변화.
도 5는, 각각, 아세토니트릴, 아니솔, 또는 에틸 아세테이트로 평형화하여 얻은 형태 3으로 명명된 화합물 (I)의 결정형의 편광 현미경을 사용하여 수득한 예시적인 이미지를 나타낸다.
도 6a는 아세토니트릴로 평형화하여 얻은 형태 3의 X선 분말 회절 패턴을 나타낸다.
도 6b는, 각각, TBME, 물, 이소프로판올, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 또는 아니솔로 평형화하여 얻은 형태 3의 X선 분말 회절 패턴의 오버레이를 나타낸다.
도 7은 아세토니트릴로 평형화하여 얻은 화합물 (I)의 2가지 결정형의 X선 분말 회절 패턴의 오버레이를 나타낸다:
1) 형태 3(실시예 3) 및
2) 형태 2(실시예 2).
도 8a는 에틸 아세테이트로 평형화하여 얻은 형태 3의 TG-FTIR 써모그램을 나타낸다.
도 8b는 이소프로판올로 평형화하여 얻은 형태 3의 TG-FTIR 써모그램을 나타낸다.
도 8c는 에틸 아세테이트로 평형화하여 얻은 형태 3의 DSC 써모그램을 나타낸다.
도 9a는 에틸 아세테이트로 평형화하여 얻은 형태 3의 DVS 등온선을 나타낸다: 시간의 함수로서 수분 함량(빨간색 곡선) 및 상대 습도(파란색 곡선)의 변화.
도 9b는 에틸 아세테이트로 평형화하여 얻은 형태 3의 DVS 등온선: 상대 습도의 함수로서 수분 함량의 변화.
도 10은 정위 좌표를 보여주는 Paxinos & Franklin "The Mouse Brain Atlas, 2nd edition"에 기반한 절편 프로토콜에 따라 얻은 대략적인 중앙 시상(medio-sagittal) 수준을 나타낸다.
도 11은 생후(PND) 11일과 9주 사이에 마우스 체중의 변화 백분율을 나타낸다.
도 12는 PND 11-70까지의 반복 경구 투여 후 글루코실세라마이드 C16:0 및 C18:0 수준을 나타낸다.
도 13은 NPC(-/-) 비히클 및 AZ-3102 처치된 마우스에서 PND 56-70까지의 임상 징후에 대한 채점을 나타낸다.
도 14는 NPC(-/-) 비히클 및 AZ-3102 처치된 마우스에서 PND 56-70까지의 떨림 점수를 나타낸다.
도 15는 관심 영역(ROI)의 정의를 나타낸다. 이미지는 소뇌(cerebellum), 해마 형성(hippocampal formation), 뇌량(corpus callosum), 및 선조체(striatum)(미상핵(caudate)-피각(putamen))의 ROI 개요를 나타낸다.
도 16은 뇌 면역조직화학을 나타낸다: NPC(+/+, 야생형 마우스) 및 NPC(-/-) 처치된 마우스와 비교하여 NCP(-/-) 및 NPC(+/-) 비히클 처치된 마우스에서의 칼빈딘-D28k 라벨링.
도 17은 화합물 (I)(AZ-3102)의 결정형의 작용 기전을 요약한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 용어의 의미와 범위는 명확해야 하지만, 잠재된 모호성이 있는 경우, 본 명세서에 제공된 정의가 임의의 사전적 또는 외부 정의보다 우선한다.
"a", "an" 및 "the"와 같은 단수형 전치사는 종종 편의상 사용되지만 단수형의 모든 사례는 명시적으로 또는 문맥에서 달리 표시되지 않는 한 복수형을 포함하는 것을 의도한다. 용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including), "갖는(having)"은 포괄적인 것으로, 나열된 구성요소 외에 추가적인 구성요소가 존재할 수 있음을 의미한다. 또한, 본 명세서에 언급된 저널 기사, 서적, 특허, 기술 문서 등을 포함하는 모든 참고문헌은 모든 목적을 위해 그의 전문이 본 명세서에 참조로 통합됨을 이해해야 한다.
수치 데이터에 대해 본 명세서에서 사용되는 "약(about)"이라는 용어는 기본 파라미터의 10% 이내의 값(즉, 플러스 또는 마이너스 10%)을 지칭하고, 값의 문자열의 시작 부분에서 "약"이라는 용어의 사용은 각각의 값을 변경한다(즉, "약 1, 2 및 3"은 약 1, 약 2 및 약 3을 의미함). 예를 들어, "약 85℃"의 온도는 75℃와 95℃ 사이의 온도를 포함할 수 있다.
기술 분야에서 "융점(melting point)"이라는 용어. 본 명세서에서 사용되는 용어 "상대적으로 높은 융점(relatively high melting point)"은 약제학적 조성물로 제형화되기에 충분히 안정한 결정형을 포함하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, "상대적으로 높은 융점(relatively high melting point)"이라는 용어는 약 65℃보다 높은 융점을 기술한다. 더 바람직하게는 융점은 약 80℃보다 높다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조성물(composition)"은 특정 성분을 특정 양으로 포함하는 제품뿐만 아니라 특정 성분을 특정 양으로 조합하여 직접 또는 간접적으로 생성되는 모든 제품을 포함하는 것으로 의도된다. 약제학적 조성물과 관련하여 이러한 용어는, 화합물 (I)의 결정형, 및 임의 선택적으로 담체를 구성하는 추가 성분을 포함하는 생성물 뿐만 아니라, 임의의 2개 이상의 성분의 조합, 복합 또는 응집으로부터, 또는 하나 이상의 성분의 해리로부터, 또는 하나 이상의 성분의 다른 유형의 반응 또는 상호작용으로부터 직접 또는 간접적으로 초래되는 임의의 생성물을 포괄한다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 결정형, 및 임의 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 임의의 조성물을 포함한다. "약제학적으로 허용되는(pharmaceutically acceptable)"은 담체, 희석제 또는 부형제가 제형의 다른 성분과 상용성이어야 하고 이의 수용자에게 유해하지 않아야 함을 의미한다.
용어 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은, 질병을 치료하기 위해 환자에게 투여될 때, 질병에 대한 그러한 치료를 수행하기에 충분한 결정형 또는 약제학적 조성물의 양을 의미한다. "치료적 유효량"은 질병 및 그 중증도, 치료할 환자의 연령 및 체중에 따라 달라질 것이다. 용어 "환자(patient)"(또는 "대상체(subject)")는, 예를 들어, 포유동물과 같은 동물을 포함하지만, 이로만 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 환자는 인간이다.
본 발명은 화합물 (I)의 결정형을 제공한다:
화합물 (I)의 결정형은 임의의 결정 상태일 수 있다. 화합물 (I)의 결정형은 결정성 염 또는 결정성 유리 염기(비이온화 형태)일 수 있다. 바람직하게는 화합물 (I)의 결정형은 결정성 유리 염기이다. 또한, 화합물 (I)은 공결정(co-crystal)을 형성할 수 있다.
화합물 (I)의 결정형이 결정성 염인 경우, 상기 화합물 (I)의 분자 구조는 양성자화된 질소 원자를 포함한다.
본 발명은 화합물 (I)의 단일 결정형에 제한되지 않는다. 고체 물질은 하나 이상의 결정형으로 존재할 수 있다. 이러한 대체 결정형을 다형체라고 한다. 각 다형체는 결정 격자에서 분자의 방향 및/또는 형태가 다르다. 각 결정 상태 또는 "다형체(polymorph)"는 결정 구조의 차이로 인해 고유한 일련의 물리화학적 특성을 나타낸다.
다형 형태는 유동성 및 압축성과 같은 다양한 기계적 특성을 가질 수 있으며, 이는 화합물의 기술적인 특성에 영향을 미친다. 화합물의 안정성 및 저장 기간은 또한 다형체에 따라 달라질 수 있다.
다형체는 서로 다른 방식으로 구별할 수 있다. 다형체는 분명히 분광학적 특성을 나타내며, 이들은, 예를 들어, 적외선 분광법, 라만 분광법, 및 13С-NMR 분광법을 사용하여 결정할 수 있다. 각 결정형이 서로 다른 방식으로 X선을 굴절시킨다는 사실을 고려할 때, X선 분말 회절(XPD)을 사용하여 다형체를 특성화할 수도 있다. 또한, 시차 주사 열량계(DSC) 및 열중량 분석(TTA)과 같은 열 분석법은 특정 다형체에 대한 고유한 정보를 제공할 수 있다.
분말 X선 회절 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 분말 X선 회절 스펙트럼의 상대적 피크 높이를 사용하여 다양한 결정형을 설명할 수 있다. 따라서, '형태 3' 측면에서, 본 발명은 X선 분말 회절 패턴에서 17.8±0.2°에서 2θ값으로 표시되는 반사를 나타내는 화합물 (I)의 결정형을 제공하며, 17.8±0.2°에서의 반사는 X선 분말 회절 패턴에서 가장 강한 4가지 반사 중 하나이다. 바람직하게는, 17.8±0.2°에서의 반사는 X-선 분말 회절 패턴에서 3개의 가장 강한 반사 중 하나이거나, 17.8±0.2°에서의 반사는 X-선 분말 회절 패턴에서 2개의 가장 강한 반사 중 하나이다. 더 바람직하게는, 17.8±0.2°에서의 반사는 X선 분말 회절 패턴에서 가장 강한 반사이다. 여전히 더 바람직하게는, '형태 3' 양태에서, 화합물 (I)의 결정형은 X선 분말 회절 패턴에서 17.8±0.1°에서 2θ 값으로 표시되는 반사를 나타내며, 여기서 17.8±0.1°에서의 반사는 X선 분말 회절 패턴에서 가장 강한 4가지 반사 중 하나이다. 바람직하게는, 17.8±0.1°에서의 반사는 X-선 분말 회절 패턴에서 3개의 가장 강한 반사 중 하나이거나, 17.8±0.1°에서의 반사는 X-선 분말 회절 패턴에서 2개의 가장 강한 반사 중 하나이다. 보다 바람직하게는 17.8±0.1°에서의 반사가 X선 분말 회절 패턴에서 가장 강한 반사이다.
"가장 강한 반사(strongest reflection)"라는 용어는 X선 분말 회절 패턴의 가장 높은 피크를 나타낸다. 분말 X선 회절 패턴의 피크 높이는 X선 강도(카운트 또는 카운트/초 단위)에 따라 결정된다. 따라서, 가장 강한 반사는 X-선 분말 회절 패턴에서 가장 높은 X-선 강도를 나타내는 반사이다. 예를 들어, 도 6a에 표시된 X선 회절 패턴의 가장 강한 반사는 17.8±0.2°에서 2θ 값으로 표시된 반사이다.
달리 명시적으로 언급하지 않는 한, 모든 X선 분말 회절 패턴은 약 25℃에서 구리 K-알파 방사선을 사용하여 결정된다.
바람직하게는, '형태 3' 양태에서, 화합물 (I)의 결정형은, X선 분말 회절 패턴에서, 4.1±0.2°, 8.3±0.2°, 12.4±0.2 °, 13.6±0.2°, 14.5±0.2°, 14.9±0.2°, 15.2±0.2°, 17.2±0.2°, 19.3±0.2°, 21.2±0.2°, 22.4±0.2°, 22.9±0.2° 및 23.3±0.2 °중 하나 이상에서 2θ 값으로 표시되는 하나 이상의 반사를 추가로 나타낸다. 여전히 더 바람직하게는, '형태 3' 측면에서, 화합물 (I)의 결정형은, X선 분말 회절 패턴에서, 4.1±0.1°, 8.3±0.1°, 12.4±0.1°, 13.6±0.1°, 14.5±0.1°, 14.9±0.1°, 15.2±0.1°, 17.2±0.1°, 19.3±0.1°, 21.2±0.1°, 22.4±0.1°, 22.9±0.1° 및 23.3±0.1°중 하나 이상에서 2θ 값으로 표시되는 하나 이상의 반사를 추가로 나타낸다.
분말 X선 회절 스펙트럼의 피크 위치는 실험 세부 사항에 상대적으로 덜 민감하다. 따라서, 본 발명의 결정성 화합물은 특정 피크 위치를 갖는 분말 X선 회절 패턴을 특징으로 할 수 있다. 따라서, '형태 3' 측면에서, 화합물 (I)의 결정형은, X선 분말 회절 패턴에서, 바람직하게는 17.2±0.2°, 17.8±0.2°, 21.2±0.2° 및 22.4±0.2°에서 2θ 값으로 표시되는 반사를 특징으로 한다. 더 바람직하게는, '형태 3' 측면에서, 화합물 (I)의 결정형은, X선 분말 회절 패턴에서, 4.1±0.2°, 8.3±0.2°, 12.4±0.2°, 13.6±0.2, 14.5±0.2°, 14.9±0.1°, 15.2±0.2°, 17.2±0.2°, 17.8±0.2°, 19.3±0.2°, 21.2±0.2°, 22.4±0.2°, 22.9±0.2° 및 23.3±0.2 °에서 2θ 값으로 표시되는 반사를 특징으로 한다. 여전히 더 바람직하게는, '형태 3' 측면에서, 화합물 (I)의 결정형은, X선 분말 회절 패턴에서, 17.2±0.1°, 17.8±0.1°, 21.2±0.1° 및 22.4 ±0.1°에서 2θ 값으로 표시되는 반사를 특징으로 한다. 가장 바람직하게는, '형태 3' 측면에서, 화합물(I)의 결정형은 X선 분말 회절 패턴에서, 4.1±0.1°, 8.3±0.1°, 12.4±0.1°, 13.6±0.1°, 14.5±0.1°, 14.9±0.1°, 15.2±0.1°, 17.2±0.1°, 17.8±0.1°, 19.3±0.1°, 21.2±0.1°, 22.4±0.1°, 22.9±0.1° 및 23.3±0.1 °에서 2θ 값으로 표시되는 반사를 특징으로 한다.
화합물의 결정형은 시차 주사 열량계(DSC) 써모그램으로 특성화할 수 있다. 따라서, '형태 3' 측면에서, 화합물 (I)의 결정형은, 도 8c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 바람직하게는 약 87℃에서 흡열 열 흐름의 개시 및/또는 약 92.4℃의 융점을 나타내는 DSC 서모그래프를 특징으로 한다. 따라서, 바람직하게는, '형태 3' 측면에서, 화합물 (I)의 결정형은 DSC에 의해 결정될 때 89℃ 내지 96℃의 융점을 갖는다. 바람직하게는, '형태 3' 측면에서 결정형은 DSC에 의해 결정된 바와 같이 90℃ 내지 95℃의 융점을 갖는다. 여전히 더 바람직하게는 '형태 3' 측면에서 화합물 (I)의 결정형은 DSC에 의해 측정된 바와 같이 91℃ 내지 94℃의 융점을 갖는다. 가장 바람직하게는 화합물 (I)의 결정형은 '형태 3' 측면에서 DSC에 의해 측정된 바와 같이 92℃ 내지 93℃의 융점을 갖는다.
화합물의 결정형은 흡습성을 특징으로 할 수 있다. 생성물의 흡습성은 특정 온도에서 상대 습도의 함수로 수분 함량의 증가 또는 감소를 나타낸다. 실질적으로 비흡습성 생성물은 상대 습도 변화의 결과로 수분 함량이 전혀 또는 약간만 변화한다. 흡습성이 강한 생성물의 경우 수분 함량이 크게 다를 수 있다. 따라서, 바람직하게는 화합물 (I)의 결정형은 실질적으로 비흡습성이다.
화합물의 결정형은 열중량 흔적(thermogravimetric trace)을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 바람직하게는 화합물 (I)의 결정형은 이의 열중량 흔적을 특징으로 할 수 있다. 한 실시양태에서, 화합물 (I)의 결정형은 도 8a 또는 도 8b에 도시된 열중량 흔적을 특징으로 한다.
화합물의 결정형은 또한 동적 증기 흡착(DVS) 프로파일을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 화합물 (I)의 결정형은 바람직하게는 도 9a 및 9b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 이의 DVS 프로필을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 화합물 (I)의 결정형은 가역적 수착/탈착 프로파일을 갖는다. 바람직하게는, DVS 프로파일은 결정형의 실질적으로 비흡습성을 나타낸다.
실질적으로 비흡습성 물질은 약 25℃의 온도에서 측정된 약 95%의 상대 습도에서 약 2% 미만의 수분 흡수를 나타낸다. 바람직하게는, 수분 흡수율은 약 25℃의 온도에서 측정된 약 95%의 상대 습도에서 약 1% 미만이다. 수분 흡수 값은 초기 질량에 비해 약 95%의 상대 습도 및 약 25℃의 온도에서 시험된 결정형의 질량 증가를 측정하여 얻는다.
따라서, 화합물 (I)의 결정형은 바람직하게는 약 25℃의 온도 및 약 95%의 상대 습도에서 0% 내지 2%의 물을 흡수한다. 더욱 바람직하게는 화합물 (I)의 결정형은 약 25℃의 온도 및 약 95%의 상대 습도에서 0% 내지 1.5%의 물을 흡수한다. 가장 바람직하게는 화합물 (I)의 결정형은 약 25℃의 온도에서 약 95%의 상대 습도에서 0% 내지 1%의 물을 흡수한다.
또한, 본 발명의 결정형은 바람직하게는 안정하다. 예를 들어, 약 25℃에서 에틸 아세테이트(1주)에서 장기간 인큐베이션하면, 도 5에 나타낸 바와 같이, 양질의 화합물 (I)의 결정형이 생성된다.
'형태 2' 측면에서, 본 발명은 화합물 (I)의 추가 결정형을 제공한다. 이 결정형(형태 2)은 X선 분말 회절 패턴에서 16.9±0.2°에서 2θ 값으로 표시되는 반사를 나타내며, 여기서 16.9±0.2°에서의 반사는 X선 분말 회절 패턴에서 4개의 가장 강한 반사 중 하나이다. 바람직하게는, 16.9±0.2°에서의 반사는 X-선 분말 회절 패턴에서 3개의 가장 강한 반사 중 하나이거나, 또는 16.9±0.2°에서의 반사는 X-선 분말 회절 패턴에서 2개의 가장 강한 반사 중 하나이다. 보다 바람직하게는 16.9±0.2°에서의 반사는 X선 분말 회절 패턴에서 가장 강한 반사이다. 더 바람직하게는, '형태 2' 측면에서 결정형은 X선 분말 회절 패턴에서 16.9±0.1°에서 2θ 값으로 표시되는 반사를 나타내고, 여기서 16.9±0.1°에서의 반사는 X선 분말 회절 패턴에서 4개의 가장 강한 반사 중 하나이다. 바람직하게는, 16.9±0.1°에서의 반사는 X-선 분말 회절 패턴에서 3개의 가장 강한 반사 중 하나이거나, 또는 16.9±0.1°에서의 반사는 X-선 분말 회절 패턴에서 2개의 가장 강한 반사 중 하나이다. 보다 바람직하게는, 16.9±0.1°에서의 반사는 X선 분말 회절 패턴에서 가장 강한 반사이다.
바람직하게는, '형태 2' 측면에서 화합물 (I)의 결정형은 X선 분말 회절 패턴에서 15.2±0.2°, 16.1±0.2°, 16.5±0.2 °, 18.9±0.2°, 23.1±0.2°, 25.5±0.2°, 27.7±0.2° 및 28.5±0.2°중 하나 이상에서 2θ 값으로 표시되는 하나 이상의 반사를 나타낸다. 추가로 더욱 바람직하게는, '형태 2' 측면에서, 화합물 (I)의 결정형은 15.2±0.1°, 16.1±0.1°, 16.5±0.1°, 18.9±0.1°, 23.1±0.1°, 25.5±0.1°, 27.7±0.1° 및 28.5±0.1°중 하나 이상에서 2θ 값으로 표시되는 하나 이상의 반사를 나타낸다.
'형태 2' 측면에서, 화합물 (I)의 이 결정형은, X선 분말 회절 패턴에서 16.1±0.2°, 16.5±0.2°, 16.9±0.2°, 18.9±0.2° 및 23.1±0.2°에서 2θ 값으로 표시되는 반사를 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, '형태 2' 측면에서, 화합물 (I)의 결정형은 또한 X선 분말 회절 패턴에서 16.1±0.1°, 16.5±0.1°, 16.9±0.1°, 18.9°±0.1° 및 23.1±0.1°에서 2θ 값으로 표시되는 반사를 특징으로 할 수 있다.
'형태 2' 측면에서 화합물 (I)의 결정 형태는, 도 3b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 약 58℃에서 흡열 열 흐름의 개시 및 약 70℃의 융점을 나타내는 DSC 서모그래프를 특징으로 할 수 있다. 따라서, '형태 2' 측면에서, 화합물 (I)의 결정형은 67℃ 내지 74℃의 융점을 갖는다. 바람직하게는, '형태 2' 측면에서 화합물 (I)의 결정형은 68℃ 내지 73℃의 융점을 갖는다. 여전히 더 바람직하게는 '형태 2' 측면에서 화합물 (I)의 결정형은 69℃ 내지 72℃의 융점을 갖는다. 가장 바람직하게는 '형태 2' 측면에서 화합물 (I)의 결정형은 69℃ 내지 71℃의 융점을 갖는다.
본 출원의 발명자들은 놀랍게도 '형태 2' 측면에서 화합물 (I)의 결정형이 특히 물에 가용성이라는 것을 발견했다. 따라서, 바람직하게는 '형태 2' 측면에서 화합물 (I)의 결정형은 약 25℃에서 측정될 때 약 75 mg/mL 내지 약 85 mg/mL의 수용해도를 갖는다. 보다 바람직하게는 결정형은 ,'형태 2' 측면에서, 약 25℃에서 측정된 수용해도가 약 78 mg/mL 내지 약 82 mg/mL이다. 가장 바람직하게는, 화합물 (I)의 결정형은, '형태 2' 측면에서, 약 25℃에서 측정된 수용해도가 약 80 mg/mL이다.
용해도를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며; 예를 들어, 쉐이크 플라스크 방법, 초음파 처리, 컬럼 용출 방법 및 자외선 또는 가시 분광법이 있다. 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 수 용해도는 쉐이크 플라스크 방법 및/또는 초음파 처리를 사용하여 결정된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물 (I)의 결정형을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
전형적으로, 화합물 (I)의 결정형은 약제학적 조성물 또는 제형의 형태로 환자에게 투여된다. 이러한 약제학적 조성물은 경구, 국소(경피 포함) 및 비경구 투여 방식을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 허용되는 투여 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 전형적으로 약제학적으로 허용되는 담체 및 하나 이상의 선택적 성분에 의해 제조된다. 필요하거나 원한다면, 생성된 균일하게 블렌딩된 혼합물은 종래의 절차 및 장비를 사용하여 정제, 캡슐, 알약, 캐니스터, 카트리지, 디스펜서 등에 성형되거나 로딩될 수 있다.
고체 투여 형태(즉, 캡슐, 정제, 알약 등)로 경구 투여하려는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 전형적으로 활성 성분으로서 화합물 (I)의 결정형을 포함할 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 화합물 (I)의 결정형을 포함하고 다른 성분은 포함하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 캡슐에 함유된다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 다른 성분 없이 캡슐에 함유된다. 캡슐은 젤라틴 캡슐 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC) 캡슐일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 활성 성분으로서 화합물 (I)의 결정형 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 공지된 것일 수 있으며, 예를 들어, 지방, 물, 생리 식염수, 알코올(예를 들어, 에탄올), 글리세롤, 폴리올, 포도당 수용액, 증량제(extending agent), 붕해제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 안정화제, 유화제, 분산제, 방부제, 감미료, 착색제, 조미료 또는 방향제, 농축제, 희석제, 완충 물질, 용매 또는 가용화제, 저장 효과를 달성하기 위한 화학 물질, 삼투압 조절용 염, 코팅제 또는 산화 방지제, 유당 또는 포도당과 같은 당류; 옥수수, 밀 또는 쌀의 전분; 스테아르산과 같은 지방산; 마그네슘 메타실리케이트 알루미네이트, 무수 칼슘포스페이트와 같은 무기염; 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리알킬렌 글리콜과 같은 합성 고분자; 스테아릴알코올, 벤질알코올과 같은 알코올류; 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스와 같은 합성 셀룰로오스 유도체; 및 젤라틴, 활석, 식물성 오일 및 아라비아 고무와 같은 기타 통상적으로 사용되는 첨가제일 수 있다.
화합물 (I)의 결정형을 포함하는 약제학적 조성물은 또한 공지된 전달 시스템 및 부형제를 사용하여 경피 또는 경점막 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 모노라우레이트, 아자사이클로알칸-2-온 등과 같은 투과 증진제와 혼합될 수 있고, 패치 또는 유사한 전달 시스템에 통합될 수 있다. 겔화제, 유화제 및 완충액을 포함하는, 추가 부형제를 사용할 수도 있다.
비경구 투여용 주사제는 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유제를 포함한다. 수성 용매는, 예를 들어, 주사용 증류수 및/또는 생리식염수를 포함한다. 비수성 용매의 예는 에탄올과 같은 알코올을 포함한다.
바람직하게는 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가의 약제학적 활성제를 포함한다. 이 병용 요법은 함께 제형화(예를 들어, 단일 제형으로 함께 포장)되거나 별도로 제형화(예를 들어, 별도의 단위 제형(dosage forms)으로 포장됨)되는, 하나 이상의 추가 약학적 활성제와 조합된 화합물 (I)의 결정형을 사용하는 것을 포함한다.
건강한 개체에서, 코어 글리코스핑고지질인 글루코실세라미드는 산성 글루코실세라미다아제(글루코세레브로시다아제 또는 GBA1이라고도 함, EC 3.2.1.45, UniProt 코드: P04062)에 의해 리소좀에서 가수분해된다. 또한, 세포질에 상주하는 비리소좀성 글루코실세라미다제(GBA2, UniProt 코드: Q9HCG7)도 글루코실세라미드를 처리할 수 있다. 그 결과, GBA1 및 GBA2 둘 모두 신경병리학적 효과에 관여하여, 여러 리소좀 축적 장애가 관찰된다.
리소좀 축적 장애가 있는 환자에서, 글리코스핑고지질 생합성 또는 분해의 결함이 발생하여, 글루코실세라마이드 및/또는 다른 글리코스핑고지질의 비정상적인 수준이 초래된다.
화합물 (I)은 이전에 (WO2015/147639 A1에서) 불규칙한 수준의 세포질 또는 리소좀성 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질과 관련된 질병의 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 화합물 (I)의 결정형의 생체이용률은 무정형 화합물 (I)의 생체이용률과 유사하므로, 화합물 (I)의 결정형은 비정상적인 수준의 세포 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질과 관련된 질병을 치료하는데에도 효과적이다. 특히, 화합물 (I)의 결정형은 비정상적인 수준의 세포질 또는 리소좀 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질과 관련된 질병을 치료하는데 효과적이다.
실시예 4에 나타낸 바와 같이, 화합물 (I)의 결정형(형태 3)은 불규칙한 수준의 세포질 또는 리소좀성 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질과 관련된 질환을 치료하는데 효과적이다. 구체적으로, 형태 3은 니만-픽 질환 타입 C 마우스에서 임상 징후를 개선하는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명은 치료법에 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 의약으로 사용하기 위한 본 명세서에 기술된 결정형 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 비정상적인 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 수반하는 질병을 치료하는데 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 비정상적인 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 수반하는 질병은, 리소좀 축적병, 예컨대 고셔병(타입 1, 2 및 3), 파브리병, GM1 강글리오시드증, GM2 강글리오시드증(예를 들어, 테이-삭스병, 샌드호프병 및 AB 변종), 사이알리도시스(Sialidosis), 니만-픽병 타입 C 및 작용 근간대 신부전 증후군(Action Myoclonus Renal Failure syndrome), 대사 증후군으로 총칭되는 질병 중 하나의 증상, 예컨대 비만, 인슐린 저항증, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 다낭성 신장 질환, 제2형 당뇨병 및 만성 염증, 또는 신경퇴행성 장애, 예컨대 파킨슨병 또는 루이소체 치매, 또는 죽상동맥경화증이다. 더 바람직하게는 여전히 화합물 (I)의 결정형, 또는 화합물 (I)의 결정형을 포함하는 약제학적 조성물은 GM1 강글리오시드증 및/또는 GM2 강글리오시드증(예컨대, 테이-삭스병, 샌드호프병 및 AB 변종)을 치료하는데 유용하다.
더욱 바람직하게는, 본 발명은 니만-픽병 타입 C의 치료에 사용하기 위한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물 (I)의 결정형, 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 샌드호프병을 치료하는데 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형, 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 인간 또는 동물 환자에서 비정상 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 수반하는 질병을 치료하는 방법을 제공하며, 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형, 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 비정상적인 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 수반하는 질병의 증상을 완화시키는데 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 제공한다.
더욱 바람직하게는, 본 발명은 니만-픽병 타입 C의 증상을 완화시키는데 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 샌드호프병의 증상을 완화시키는데 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 것과 같은 화합물 (I)의 결정형 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물 환자에서 비정상적인 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 수반하는 질병의 증상을 완화시키는 방법을 제공한다.
화합물 (I)의 결정형(예를 들어, 형태 3)은, 예를 들어, 다음과 같은 다양한 임상 징후를 개선하는 데 사용될 수 있다:
1) 질병-관련 체중 감소;
2) 떨림; 및/또는
3) 운동실조 보행(ataxic gait).
실시예 4에 나타낸 바와 같이, 화합물 (I)의 결정형(예를 들어, 형태 3)은 효율적으로 뇌에 침투한다. 따라서, 화합물 (I)의 결정형(예를 들어, 형태 3)은 뇌에서 기원하는 질병 또는 질병 증상을 치료하거나 완화시키는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 화합물 (I)의 결정형(예를 들어, 형태 3)은 소뇌 푸르키니에(Purkinje) 세포 손실을 예방하거나 감소시키는 데 사용될 수 있다. 화합물 (I)의 결정형(예를 들어, 형태 3)은 신경세포 사멸을 예방하거나 감소시키는 데 사용할 수 있다. 화합물 (I)의 결정형(예를 들어, 형태 3)은 뇌 위축을 예방하거나 감소시키는 데 사용할 수 있다.
비정상 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 수반하는 질병을 치료하는데 있어서 화합물 (I)의 결정형의 높은 효능은 글루코실세라마이드 신타제(GCS) 및 비-리소좀성 글루코실세레브로시다제(GBA2)에 대한 화합물 (I)의 결정형의 높은 효능에 기인하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 기재된 방법은 시험관내(in vitro) 방법 또는 생체내(in vivo) 방법일 수 있다.
투여는 정제, 환제, 캡슐제, 과립제, 산제, 용액제 등을 통한 경구 투여 또는 비경구 투여, 예컨대 관절 내, 정맥 내 및 근육 내 주사와 같은 주사, 좌약, 점안액, 안연고, 또는 외용제, 예컨대 경피 액체 제제, 연고, 경피 패치, 경점막 액체 제제, 경점막 패치, 흡입기 등에 의해 달성될 수 있다.
경구 투여에서, 1일 투여량은 일반적으로 체중당 약 0.0001 내지 10 mg/kg, 바람직하게는 0.001 내지 1 mg/kg, 또는 0.005 내지 5 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.5 mg/kg이고, 1회 분량 또는 2 내지 4회 개별 분량으로 나누어 투여된다. 예를 들어, 70kg의 인간 환자의 경우, 경구 투여를 위한 최적의 일일 용량은 약 0.01-30mg/일이다. 정맥 투여의 경우, 1일 투여량은 체중당 약 0.00001 내지 10mg/kg이 적당하며, 1일 1회 또는 1일 2회 이상 투여된다. 또한, 경점막 작용제는 체중당 약 0.0001 내지 10 mg/kg의 용량으로 1일 1회 또는 1일 2회 이상 투여된다. 용량은 증상, 연령, 성별 등을 고려하여 개별 사례에 따라 적절하게 결정된다.
비정상적인 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질(예를 들어, 니만-픽병 타입 C)을 수반하는 질병을 치료하는 데 있어서 화합물 (I)의 결정형의 효능이 매우 높고 필요한 용량이 상대적으로 낮기 때문에, 결정형 화합물 (I)의 형태는 이러한 질병을 치료하기 위한 공지된 화합물, 예를 들어, 미그리톨(용량 1200 mg/kg/일)보다 부작용이 적다.
본 발명은 또한 화합물 (I)의 샘플을 용매와 접촉시키는 단계를 포함하는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 결정형을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 용매는 아세토니트릴, 에틸 아세테이트, 이소프로판올, 아니솔, 물 및 tert-부틸 메틸 에테르(TBME)로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는 용매는 에틸 아세테이트, 아세토니트릴 또는 이소프로판올이다. 바람직하게는, 화합물 (I)의 샘플을 용매와 접촉시키기 전에, 화합물 (I)의 샘플을 정제하여 보레이트 에스테르를 제거한다. 바람직하게는, 화합물 (I)의 샘플은 크로마토그래피를 사용하여 정제된다. 더욱 바람직하게는, 화합물 (I)의 샘플은 실리카 겔 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제된다. 추가로 및/또는 대안적으로 화합물 (I)의 샘플은 메탄올을 사용한 증류에 의해 정제된다.
화합물 (I)의 형태 3 결정형은 하기 예시적인 방법 중 어느 하나에 의해 수득될 수 있다:
1) 약 74 mg의 화합물 (I)과 2.0 ml의 아세토니트릴의 혼합물을 20℃ 내지 30℃ 범위의 온도, 예를 들어, 약 25℃에서 3일 동안 교반한 다음, 여과하여 화합물 (I)의 결정형을 얻음;
2) 약 74 mg의 화합물 (I)과 2.0 ml의 아니솔의 혼합물을 20℃ 내지 30℃ 범위의 온도, 예를 들어 약 25℃에서 3일 동안 교반한 다음, 여과하여 화합물 (I)의 결정형을 얻음;
3) 약 82 mg의 화합물 (I)과 1.0 ml의 에틸 아세테이트의 혼합물을 20℃ 내지 30℃ 범위의 온도, 예를 들어 25℃에서 3일 동안 교반한 다음, 여과하여 화합물 (I)의 결정형을 얻음;
4) 약 82 mg의 화합물 (I)과 1.0 ml의 이소프로판올의 혼합물을 20℃ 내지 30℃ 범위의 온도, 예를 들어 25℃에서 3일 동안 교반한 다음, 여과하여 화합물 (I)의 결정형을 얻음;
5) 약 45 mg의 화합물 (I)과 1.0 ml의 물의 혼합물을 20℃ 내지 30℃ 범위의 온도, 예를 들어 25℃에서 3일 동안 교반한 다음, 여과하여 화합물 (I)의 결정형을 얻음;
6) 약 100 mg의 화합물 (I) 및 3.0 ml TBME의 혼합물을 20℃ 내지 30℃ 범위의 온도, 예를 들어 25℃에서 3일 동안 교반한 다음, 여과하여 화합물 (I)의 결정형을 얻음.
바람직하게는, 화합물 (I)을 용매와 혼합하기 전에, 화합물 (I)의 샘플을 정제하여 보레이트 에스테르를 제거한다. 바람직하게는, 화합물 (I)의 샘플은 크로마토그래피를 사용하여 정제된다. 더욱 바람직하게는, 화합물 (I)의 샘플은 실리카 겔 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제된다. 추가적으로 및/또는 대안적으로 화합물 (I)의 샘플은 메탄올을 사용한 증류에 의해 정제된다.
여과 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 페이퍼 여과 및 소결 유리 여과를 포함하지만 이로만 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 화합물 (I)의 형태 3의 생산 방법은 사용된 시약의 유사한 비율을 유지하면서 더 큰 규모로 수행될 수 있다. 예를 들어, 화합물 (I)의 형태 3 결정형은 화합물 (I)과 에틸 아세테이트의 혼합물을 0.05 내지 1g 대 1 mL[화합물 (I) 대 에틸 아세테이트]의 비율로 20℃ 내지 30℃ 범위의 온도, 예를 들어, 약 25℃에서 3일 동안 교반한 다음, 여과하여 화합물 (I)의 결정형을 얻을 수 있다.
본 명세서에 기술된 화합물 (I)의 형태 3을 얻는 방법은 매우 효율적이다. 본 명세서에 기재된 방법의 수율은 전형적으로 (처음에 사용된 화합물 (I)의 양에 대한 수득된 형태 3의 양의 중량비로서) 70% 초과이다. 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 방법의 수율은 75% 초과이다.
바람직하게는, 형태 2 결정형은 형태 3 결정형이 형성되기 전에 중간체로서 형성된다.
바람직하게는 X-선 분말 회절 패턴에서, 16.1±0.2°, 16.5±0.2°, 16.9±0.2°, 18.9±0.2° 및 23.1±0.2°에서 2θ값으로 표시되는 반사를 특징으로 하는 형태 2 결정형은, X선 분말 회절 패턴에서, 17.2±0.2°, 17.8±0.2°, 21.2±0.2° 및 22.4±0.2°에서 2θ 값으로 표시되는 반사를 특징으로 하는 형태 3 결정형의 형성 전에 중간체로 형성된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 공정을 수행하여 얻은 화합물 (I)의 결정형을 제공한다.
본 발명은 또한 화합물 (I)의 결정형을 제조하기 위한 화합물 (I)의 유리 염기의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 화합물 (I)의 유리 염기를 결정화하는 것을 포함하는 화합물 (I)의 결정형을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 화합물 (I)의 유리 염기를 결정화하는 것을 포함하는 결정형 화합물 (I)의 제조 방법에 의해 얻어진 화합물 (I)의 결정형을 제공한다.
다른 이점 중에서, 화합물 (I)의 결정형을 형성하는 것은 화합물 (I)을 정제하는데 유용한 것으로 생각된다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 수득된 화합물 (I)의 결정형은 90% 초과, 전형적으로 95% 초과의 순도를 갖는다.
전술한 상세한 설명은 설명 및 예시의 방식으로 제공되었으며 첨부된 청구범위를 제한하려는 의도가 아니다. 본 명세서에 예시된 현재 바람직한 실시형태의 많은 변형은 당업자에게 명백할 것이며, 첨부된 청구범위 및 그 등가물의 범위 내에 존재한다.
본 발명은 하기 항목(clauses)에서 추가로 개시된다:
1. 하기 화합물 (I)의 결정형:
2. 항목 1에 있어서, 상기 결정형이 결정성 유리 염기인, 결정형.
3. 항목 1 또는 항목 2에 있어서, 상기 결정형이 X-선 분말 회절 패턴에서, 17.8±0.2°에서 2θ값으로 표시되는 반사를 나타내고, 여기서 17.8±0.2°에서의 반사는 X선 분말 회절 패턴에서 4개의 가장 강한 반사 중 하나인, 결정형.
4. 항목 3에 있어서, X선 분말 회절 패턴에서, 4.1±0.2°, 8.3±0.2°, 12.4±0.2°, 13.6±0.2°, 14.5±0.2°, 14.9±0.2°, 15.2±0.2°, 17.2±0.2°, 19.3±0.2°, 21.2±0.2°, 22.4±0.2°, 22.9±0.2°, 및 23.3±0.2°중 하나 이상에서, 2θ값으로 표시되는, 하나 이상의 반사를 추가로 나타내는, 결정형.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, X-선 분말 회절 패턴에서, 17.2±0.2°, 17.8±0.2°, 21.2±0.2° 및 22.4±0.2°에서 2θ값으로 표시되는 반사를 특징으로 하는, 결정형.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 융점이 89℃ 내지 96℃인, 결정형.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, 융점이 92℃ 내지 93℃인, 결정형.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 결정형이 실질적으로 비흡습성인, 결정형.
9. 항목 1 또는 항목 2에 있어서, 상기 결정형이 X-선 분말 회절 패턴에서 16.9±0.2°에서 2θ 값으로 표시되는 반사를 나타내고, 여기서 16.9±0.2°에서의 반사는 X선 분말 회절 패턴에서 4개의 가장 강한 반사 중 하나인, 결정형.
10. 항목 9에 있어서, X선 분말 회절 패턴에서 15.2±0.2°, 16.1±0.2°, 16.5±0.2°, 18.9±0.2°, 23.1±0.2°, 25.5±0.2°, 27.7±0.2° 및 28.5±0.2°중 하나 이상에서 2θ값으로 표시되는, 하나 이상의 반사를 추가로 나타내는, 결정형.
11. 항목 1, 2, 9 또는 10 중 어느 한 항목에 있어서, X선 분말 회절 패턴에서 16.1±0.2°, 16.5±0.2°, 16.9±0.2°, 18.9±0.2° 및 23.1± 0.2°에서 2θ 값으로 표시되는 반사를 특징으로 하는, 결정형.
12. 항목 9 내지 11 중 어느 한 항목에 있어서, 융점이 67℃ 내지 74℃인, 결정형.
13. 항목 9 내지 12 중 어느 한 항목에 있어서, 융점이 69℃ 내지 71℃인, 결정형.
14. 항목 9 내지 13 중 어느 한 항목에 있어서, 수용해도가 75 mg/mL 내지 85 mg/mL인, 결정형.
15. 항목 1-14 중 어느 한 항목의 결정형을 포함하는 약제학적 조성물.
16. 항목 15에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 캡슐에 포함되는, 약제학적 조성물.
17. 항목 16에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 임의의 다른 성분 없이 캡슐에 포함되는, 약제학적 조성물.
18. 항목 15 또는 항목 16에 있어서, 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
19. 치료에 사용하기 위한, 항목 1 내지 14 중 어느 한 항목의 결정형, 또는 항 15 내지 18 중 어느 한 항목의 약제학적 조성물.
20. 약제로서 사용하기 위한, 항목 1 내지 14 중 어느 한 항목의 결정형 또는 항목 15 내지 18 중 어느 한 항목의 약제학적 조성물.
21. 비정상적인 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 수반하는 질병을 치료하는데 사용하기 위한, 항목 1 내지 14 중 어느 한 항목의 결정형 또는 항목 15 내지 18 중 어느 한 항목의 약제학적 조성물.
22. 항목 21에 있어서, 상기 비정상적인 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 수반하는 질병이 리소좀 축적병, 예컨대 고셔병, 파브리병, GM1 강글리오시드증, GM2 강글리오시드증(예컨대, 테이-삭스병, 샌드호프병 또는 AB 변종), 사이알리도시스, 니만-픽병 타입 C 및 작용 근간대성 신부전 증후군, 또는 대사 증후군으로 집합적으로 분류되는 질병 중 하나의 증상, 예컨대 비만, 인슐린저항성, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 다낭성신장질환, 제2형 당뇨 및 만성염증, 또는 신경퇴행성 장애, 예컨대 파킨슨병 또는 루이소체 치매, 또는 죽상동맥경화증인, 결정형 또는 약제학적 조성물.
23. 항목 21 또는 항목 22에 있어서, 상기 질병이 GM1 강글리오시드증 또는 GM2 강글리오시드증(예컨대, 테이-삭스병, 샌드호프병 또는 AB 변이체)인, 결정형 또는 약제학적 조성물.
24. 인간 또는 동물 환자에서 비정상 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 수반하는 질병을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 항목 1 내지 14 중 어느 한 항목의 결정형, 또는 항목 15 내지 18 중 어느 한 항목의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
25. 화합물 (I)의 샘플을 용매와 접촉시키는 것을 포함하는, 항목 1 내지 8 중 어느 한 항목의 결정형태을 제조하는 방법.
26. 항목 25에 있어서, 상기 용매가 아세토니트릴, 에틸 아세테이트, 이소프로판올, 아니솔, 물 및 tert-부틸 메틸 에테르(TBME)로부터 선택되는, 방법.
27. 항목 25 또는 항목 26에 있어서, 상기 화합물 (I)의 샘플을 용매와 접촉시키기 전에, 화합물 (I)의 샘플이 정제되는, 방법.
28. 항목 27에 있어서, 상기 화합물 (I)의 샘플이 크로마토그래피를 사용하여 정제되는, 방법.
29. 항목 28에 있어서, 상기 화합물 (I)의 샘플이 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제되는, 방법.
30. 항목 27 내지 29 중 어느 한 항목에 있어서, 정제 후, 상기 화합물 (I)의 샘플은 보레이트 에스테르가 없는, 방법.
31. 항목 25 내지 30 중 어느 한 항목에 있어서, 항목 9 내지 14 중 어느 한 항목의 결정형이, 항목 1 내지 8 중 어느 하나의 결정형의 형성 전에, 중간체로서 형성되는, 방법.
32. 항목 25 내지 31 중 어느 하나의 방법을 수행함으로써 얻어지는 화합물 (I)의 결정형.
33. 결정형을 제조하기 위한 화합물 (I)의 유리 염기의 용도.
34. 화합물 (I)의 유리 염기를 결정화하는 것을 포함하는 화합물 (I)의 결정형을 제조하는 방법.
35. 항목 34의 방법에 의해 얻어진 화합물 (I)의 결정형.
36. 화합물 (I)의 결정형을 제조하는 방법으로서,
i. 정제 컬럼에 화합물 (I)을 첨가하여 화합물 (I)의 정제된 샘플을 생성하는 단계;
ii. 화합물 (I)의 정제된 샘플에 용매를 첨가하여 용매 중의 화합물 (I)의 현탁액을 생성하는 단계;
iii. 상기 용매 중의 화합물 (I)의 현탁액을 교반하여 화합물 (I)의 결정형을 생성하는 단계; 및
iv. 상기 화합물 (I)의 결정형을 분리하여 화합물 (I)의 결정형의 순수한 샘플을 생성하는 단계,
를 포함하는 방법.
37. 항목 36에 있어서, 상기 화합물 (I)의 정제된 샘플은 보레이트 에스테르가 없는, 방법.
38. 항목 36 또는 항목 37에 있어서, 상기 용매가 아세토니트릴, 에틸 아세테이트, 이소프로판올, 아니솔, 물 및 tert-부틸 메틸 에테르(TBME)로부터 선택되는, 방법.
39. 항목 36 내지 항목 38 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 ii가 25 내지 35℃의 온도에서 수행되는, 방법.
40. 항목 36 내지 39 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (iii)에서의 교반이 20-35℃의 온도에서 수행되는, 방법.
41. 항목 36 내지 40 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (iii)에서의 교반이 적어도 1시간 동안 수행되는, 방법.
42. 항목 41에 있어서, 단계 (iii)에서의 교반이 적어도 16시간 동안 수행되는, 방법.
실험 섹션
시차 주사 열량계(DSC)를 TA Instruments Q2000 기기(닫힌 알루미늄 샘플 팬 또는 뚜껑에 핀홀이 있는 알루미늄 샘플 팬, 가열 속도 20K/분)로 수행했다. 융점은 피크 최대값으로 이해된다.
동적 증기 수착(DVS) 측정을 독일 아우구스트-나겔-슈트라쎄(August-Nagel-Str). 23, 울름(Ulm) 89079에 소재한 ProUmid(이전의 "Projekt Messtechnik")의 SPS11-100n "Sorptions Pr
fsystem"으로 수행했다. 약 5mg 내지 20mg의 샘플을 알루미늄 샘플 팬에 넣었다. 시간당 5%의 습도 변화율을 이용했다. 적용된 측정 프로그램은 아래와 같이 설명할 수 있다.
샘플을 마이크로 저울 위에 있는 알루미늄 또는 백금 홀더에 놓고 미리 정의된 습도 프로그램을 시작하기 전에 50%의 상대 습도(RH)에서 평형을 이루도록 했다:
(1) 50% RH에서 2시간
(2) 50 → 0% RH(5%/h); 0% RH에서 5시간
(3) 0 → 95% RH(5%/h); 95% RH에서 5시간
(4) 95 → 0% RH (5%/h); 0% RH에서 5시간
(5) 0 → 95% RH (5%/h); 95% RH에서 5시간
(6) 95 → 50% RH (5%/h); 50% RH에서 2시간
분말 X-선 회절을 Cu-Kα1 방사선으로 작동하는 Mythen1K 검출기가 장착된 Stoe Stadi P 회절계로 수행했다. 이 장비를 이용한 측정을 40kV의 튜브 전압 및 40mA 튜브 전력으로 전송을 통해 수행했다. 곡선형 Ge 모노크로메이터를 사용하면 Cu-K α1 방사선으로 시험할 수 있다. 다음 파라미터를 설정했다: 0.02° 2θ 단계 크기, 12s 단계 시간, 1.5-50.5° 2θ 스캔 범위, 및 1°2θ 검출기 단계(단계 스캔에서 검출기 모드). 일반적인 샘플 준비를 위해 약 10mg의 샘플을 두 개의 아세테이트 호일 사이에 놓고 Stoe 전송 샘플 홀더에 장착했다. 측정하는 동안 샘플을 회전시켰다. 모든 샘플 준비 및 측정을 주위 공기 분위기(약 25℃)에서 수행했다.
대략적인 용해도는 약 10 mg의 화합물에 대한 용매의 증분 첨가 및 후속 진탕 및/또는 짧은 시간 기간 동안 초음파 처리에 의해 결정되었다. 총 10 ml 이상의 용매를 추가해도 물질이 용해되지 않으면, 용해도를 <1mg/ml로 표시한다. 실험을 약 25℃에서 수행했다.
열중량 측정(TG-FTIR)을 Bruker FTIR Spectrometer Vector 22(핀홀이 있는 샘플 팬, N2 분위기, 가열 속도 10℃/분)에 연결된 Netzsch Thermo-Microbalance TG 209로 수행했다.
실시예
하기 비제한적 실시예는 본 발명을 추가로 설명한다.
실시예 1 - 결정성 염 형성
화합물 (I)에 대한 고처리량 염 스크리닝 프로그램은 화합물 (I)의 결정형을 얻기 위한 시도에서 6가지 다른 조건 하에서 표 1에서 확인된 16가지 다른 염 형성제(formers)를 사용하여 수행했다.
초기 스크리닝 실험은 아세톤 중의 화합물 (I)의 0.05M 용액을 석영 96 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 첨가하고 이어서 0.1M 농도의 염 형성제 원액을 첨가하여 수행했다. 실온에서 질소 흐름 하에서 각 웰로부터 용매를 증발시켰다. 웰 내의 고체 잔류물을 편광 현미경으로 조사했다.
[표 1]
염 스크리닝 프로그램을 위해 선택된 산
이 초기 실험의 목적은 화합물 (I) 대 염 형성제의 1:1 비율을 얻는 것이었지만, 광학 현미경 조사는 결정형 형성에 적합한 몇 가지 실험 조건을 밝혀냈다. 예를 들어, 벤젠설폰산, 염산, DL-만델산, L-타르타르산, 인산 및 황산과 혼합된 화합물 (I)은 결정성 잔류물을 형성했다.
추가 스크리닝 실험에서, 6개의 용매 시스템, 즉 아세톤, 아세토니트릴, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올-물(3:1) 혼합물 및 아세톤/물(9:1) 혼합물이 선택되었다. 슬러리 평형을 위해 각 웰의 잔류물에 200 μL의 용매를 첨가했다. 이렇게 준비된 마이크로타이터 플레이트를 실온(약 25℃)에서 하루 동안 400rpm으로 교반했다. 그 다음, 질소 흐름 하에서 용매를 증발시키고 얻어진 고체 잔류물을 편광 현미경으로 조사했다.
광학 현미경 조사에 기초하여, 벤젠술폰산, 겐티스산, 염산, L-락트산, D-만델산, 인산, L-타르타르산 및 톨루엔술폰산에 대해 가능한 염의 후보(leads)를 찾았다. 50 내지 200mg 규모의 후속 실험(스케일업 실험)을 위해 가장 유망한 후보 중 일부를 선택했다.
시험된 모든 조건에 대한 스케일 업 실험은 화합물 (I)의 무정형 형태 또는 화합물 (I)의 액체 결정성 염을 형성을 초래했다. 현미경 검사에서 종종 복굴절이 나타났지만, 얻어진 혼합물의 여과는 불가능했고 어떤 실험에서도 고체 물질을 회수할 수 없었다.
요약하면, 염 형성제를 사용한 모든 실험은 화합물 (I)의 결정형을 생성하는 데 실패했다.
실시예 2 - 형태 2 결정형
실시예 1의 실험에서 유용한 결정질 물질이 생성되지 않았기 때문에, 화합물 (I)의 유리 염기 형태를 조사했다.
화합물 (I)을 실리카 겔 컬럼을 사용하여 정제하여 보레이트 에스테르를 제거하고 이어서 아세토니트릴에서 짧은 평형화(약 1-5분)를 진행했다. 아세토니트릴에서 정제된 화합물 (I)의 용해도는 5mg/mL 내지 8mg/mL인 것으로 결정되었다. 다른 용매에서 정제된 화합물 (I)의 용해도도 조사했으며 표 2에 제시되어 있다. 이들 값은 ~10 mg의 고체 화합물 (I)에 소량의 용매를 첨가하고 실온(약 25℃)에서 짧은 시간 기간 동안 진탕/초음파 처리하여 결정되었다.
[표 2]
아세토니트릴에서 짧은(약 1-5분) 평형화로부터 생성된 화합물 (I)의 형태 2 결정형을 편광 현미경, 분말 X선 회절(PXRD) 실험, TG-FTIR, 시차주사열량계(DSC) 및 동적 증기 수착(DVS)로 검사했다.
편광 현미경 조사의 결과는 도 1에 제시되어 있으며, 반면 PXRD 패턴은 도 2에 나와 있다. 이 형태 2 결정형의 화합물 (I)은 16.1±0.2°, 16.5±0.2°, 16.9±0.2°, 18.9±0.2° 및 23.1±0.2°의 2θ값에서 가장 강한 반사를 나타냈다.
아세토니트릴에서의 짧은 평형에서 얻은 화합물 (I)의 형태 2 결정형의 열분석 특성화 결과(TG-FTIR 써모그램)는 도 3a에 시각화되어 있는 반면, DSC의 결과는 도 3b에 제시되어 있다. 결과는 샘플이 약 120℃로 가열시 방출되는 약 0.5%의 물을 함유했음을 나타낸다. 더 높은 온도에서는 열분해가 관찰된다. DSC로 2가지 중요한 흡열 현상이 밝혀졌다. 최고 온도가 약 70℃이고 엔탈피가 약 54J/g인 첫 번째 강한 흡열 다음에 81℃에서의 약한 신호와 약 3J/g의 엔탈피가 뒤따른다.
또한, 결정성 유리 염기 샘플의 거동을 다양한 수증기압 하에서 조사했다. 높은 상대 습도에서 샘플은 약 18%의 물을 흡수했으며; 그러나 상대습도를 50% RH로 되돌렸을 때 흡수된 수분의 대부분이 방출되었다. DVS 측정으로부터의 결과는 도 4A 및 4B에 제시되어 있다.
실시예 2의 일부로서 얻어진 화합물 (I)의 결정형의 특성 요약이 표 3에 제공되어 있다.
[표 3]
화합물 (I)의 형태 2 결정형의 특성 요약.
얻어진 화합물 (I)의 형태 2 결정형은 낮은 안정성을 나타냈고 약 1-5분 동안 증가된 온도(약 30℃ 이상)에 노출시 화합물 (I)의 추가 형태 3 결정형으로 전이되었다. 또는, 대략 25℃에서 5분 이상 동안 용매(예를 들어, 아세톤)에서 평형을 이루면 형태 2가 형태 3으로 전환되었다. 이 화합물 (I)의 추가 유리 염기 형태 3 결정형은 더 나은 안정성 및 독특한 일련의 물리화학적 특성을 나타냈다.
실시예 3 - 형태 3
독립적으로, 화합물 (I)의 안정한 결정형을 실온(대략 25℃)에서 다양한 각각의 용매, 예를 들어, 각각 아세토니트릴, 에틸 아세테이트, 이소프로판올, 아니솔, 물, 또는 TBME에서 정제된 화합물 (I)의 현탁 평형 실험으로부터 얻었다.
특히 화합물 (I)의 형태 3 결정형을 하기 실험 방법으로 얻었다:
1) 약 74 mg의 화합물 (I)을 2.0 ml의 아세토니트릴에 첨가하고 현탁액을 실온(약 25℃)에서 3일 동안 교반한 다음, 여과했음;
2) 약 74 mg의 화합물 (I)을 2.0 ml의 아니솔에 첨가하고 현탁액을 실온(약 25℃)에서 3일 동안 교반한 다음, 여과했음;
3) 약 82mg의 화합물 (I)을 1.0ml의 에틸 아세테이트에 첨가하고 현탁액을 실온(약 25℃)에서 3일 동안 교반한 다음, 여과했음;
4) 약 82mg의 화합물 (I)을 1.0ml의 이소프로판올에 첨가하고 현탁액을 실온(약 25℃)에서 3일 동안 교반한 다음, 여과했음;
5) 약 45mg의 화합물 (I)을 1.0ml의 물에 첨가하고 현탁액을 실온(약 25℃)에서 3일 동안 교반한 다음, 여과했음;
6) 약 100 mg의 화합물 (I)을 3.0 ml TBME에 첨가하고 현탁액을 실온(약 25℃)에서 3일 동안 교반한 다음, 여과했음.
보레이트 에스테르를 제거하기 위해 용매를 첨가하기 전에 실리카 겔 컬럼을 사용하여 화합물 (I)을 정제했다.
얻어진 화합물 (I)의 결정형을 편광 현미경, 분말 X-선 회절, TG-FTIR, DSC 및 DVS로 특징규명했다.
선택된 용매에 대한 편광 현미경 조사 결과는 도 5에 제시되어 있다.
아세토니트릴을 사용한 현탁액 평형 실험으로부터 얻은 화합물 (I)의 형태 3 결정형의 PXRD 패턴이 도 6a에 도시되어 있다. 다른 용매를 사용한 현탁 평형 실험으로부터 얻은 화합물 (I)의 형태 3 결정형의 PXRD 패턴의 오버레이가 도 6b에 도시되어 있다. 화합물 (I)의 이 결정형은 17.2±0.2°, 17.8±0.2°, 21.2±0.2° 및 22.4±0.2°의 2θ값에서 가장 강한 반사를 나타냈다. 이것은 화합물 (I)의 결정형을 얻기 위해 상이한 용매를 사용했음에도 불구하고 일관되었다.
비교를 위해, 도 7은 실시예 2(형태 2) 및 본 실시예(형태 3)에서 얻은 결정형의 PXRD 패턴의 오버레이를 나타낸다. 2가지 결정형은 상이한 PXRD 패턴을 나타낸다.
화합물 (I)의 형태 3 결정형의 예시적인 TG-FTIR 특성규명 실험의 결과는 도 8a(에틸 아세테이트) 및 8b(이소프로판올)에 제시되어 있다.
도 8a는 에틸 아세테이트로 평형화하여 얻은 화합물 (I)의 형태 3 결정형의 샘플이 40℃에서 수일 동안 진공 건조했음에도 불구하고 약 0.7%의 에틸 아세테이트를 함유했음을 나타낸다. 에틸 아세테이트는 약 100℃와 200℃ 사이에서 배출된다. 더 높은 온도에서 열 분해가 관찰된다.
이소프로판올 중의 화합물 (I)의 현탁액(및 실온에서 공기 중에서 건조)으로부터 생성된 형태 3 샘플은 놀랍게도 초기 이소프로판올 함량이 0.5% 미만임을 나타낸다(도 8B 참조).
에틸 아세테이트로 평형화하여 얻어진 화합물 (I)의 형태 3 결정형의 샘플에 대한 예시적인 DSC 측정은 도 8c에 도시되어 있으며 약 103 J/g의 엔탈피와 관련된 약 92℃에서의 날카로운 흡열 용융 피크를 나타낸다. 따라서, 본 실시예의 일부로서 수득된 화합물 (I)의 형태 3 결정형은 실시예 2로부터의 결정형(형태 2)보다 더 높은 융점을 갖는다.
또한, 에틸 아세테이트로 평형화하여 얻은 화합물 (I)의 형태 3 결정형 샘플의 거동을 다양한 수증기압 하에서 조사했다. 95%의 가장 높은 상대 습도에서 샘플은 상대 습도가 50% RH로 되돌려졌을 때 방출된 약 1.2%의 물을 흡수했다. DVS 측정 결과는 도 9a 및 9b에 제시되어 있다. 흡수된 물의 양이 적고, 수분 흡수는 가역적이었다. 따라서, 화합물 (I)의 형태 3 결정형은 비흡습성 또는 실질적으로 비흡습성이다.
실시예 3의 일부로서 얻어진 화합물 (I)의 형태 3 결정형의 특성 요약이 표 4에 제공되어 있다.
[표 4]
화합물 (I)의 3형 결정형의 특성 요약.
실시예 4 - 니만-픽 타입 C(NPC) 질병을 앓는 마우스에 대한 화합물 (I)의 결정형의 투여 효과
이 실시예에서, AZ-3102-00은 형태 3의 화합물 (I)의 명칭이다.
연구의 목적
이 연구의 목적은 경구 위관영양(oral gavage)을 이용하여 AZ-3102-00의 예상 약리학적 활성 용량으로 어린 NPC1(NPC(-/-) 마우스(P11-P70))에 대한 치료를 평가하고, PK 및 조직학적 마커를 평가하여 발생할 수 있는 신경병리학을 특성화하는 것이었다.
연구 설계
이 연구에 포함된 38마리의 마우스 중, 30마리는 NPC(-/-) 녹아웃(KO) 마우스, 4마리는 NPC(+/-) 이형접합 마우스 및 4마리는 NPC(+/+) 야생형(WT, Balb/c) 마우스이었다. NPC1(-/-) 마우스는 처음 2개의 막횡단 도메인을 온전하게 두고 13개 막횡단 도메인 중 11개를 결실시킨 조기 절두(truncation) 단백질을 갖고 있다. 니만 픽 타입 C1 유전자(Npc1m1N)의 열성 NIH 대립유전자에 대해 동형접합인 NPC1(-/-) 마우스는 스핑고미엘리나아제 및 글루코세레브로시다아제 활성(JAX# 003092)의 이중 결핍을 나타낸다. 동물을 BALB/c OlaHsd 백그라운드에서 사육했다.
24마리의 NPC1(-/-) 마우스를 출생 후 11일(P11)부터 출생 후 70일(P70)까지 AZ-3102-00으로 경구 위관영양으로 처치했다. 연령 일치 대조군 마우스에는 비히클로 처치한 6마리의 NPC(-/-) 및 4마리의 NPC(+/-) 마우스가 포함되었고, 4마리의 NPC(+/+) 마우스에는 AZ-3102-00을 제공했다. P70에 대한 마지막 처치 후, NPC(-/-) 마우스(시점당 n=4)를 다음 시점에서 600 mg/kg 펜토바비탈의 IP 주사로 안락사시켰다: 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 및 24시간. 대조군 마우스도 마지막 처치 후에 희생시켰다(시간 결정적이지 않음). 말단 혈액을 EDTA 코팅된 튜브에 심장 천자로 수집했다. 혈장을 원심분리(실온에서 10분 동안 3000 x g)로 수집하고 50 μL 혈장 분취량을 1.5 mL 튜브로 옮기고, 드라이아이스에서 동결하고 -80℃에 보관했다.
경심(transcardial) 관류 후, 뇌를 제거하고 반측절단(hemisection)했다. 추가 면역조직화학적 분석을 위해 우측 반뇌를 후고정하고 추가 면역 조직 화학적 분석을 위해 크라이오몰드에 포매시켰다. 추가 분석을 위해 좌측 반뇌를 드라이아이스에서 동결시켰다.
뇌를 동결-절편화했다(각각 5개 절편이 있는 12개 레벨). 그런 다음 동물당 5개의 절편을 2개의 뇌 영역에서 미세아교세포(MAC1) 및 성상세포(GFAP)의 정량적 면역형광 라벨링에 사용했다.
시험 시스템 및 시험 시스템의 적합성
니만-픽 타입 C(NPC) 질병은 NPC1 및 NPC2 유전자의 돌연변이와 관련되고 비에스테르화 콜레스테롤 및 글리코스핑고지질(GSL)의 축적을 특징으로 하는 상염색체 열성 신경퇴행성 장애이다. 니만-픽 타입 C 사례의 약 95%는 Type C1이라고 하는 NPC1 유전자의 유전적 돌연변이로 인해 발생하며; 5%는 유형 C2라고 하는 NPC2 유전자의 돌연변이로 인해 발생한다. 니만-픽 타입 C1 및 C2의 임상 증상은 각각의 유전자가 둘 다 후기 엔도좀 또는 리소좀으로부터 지질, 특히 콜레스테롤의 유출에 관여하기 때문에 유사하다. NPC1 유전자는 세포 내부의 막에 위치하는 단백질을 코딩하며, 세포 내에서 콜레스테롤과 지질의 이동에 관여한다. 이 단백질이 결핍되면 세포막 내에 지질과 콜레스테롤이 비정상적으로 축적된다. NPC2 유전자는 콜레스테롤을 결합하고 운반하는 단백질을 코딩한다. 니만-픽 타입 C1 유전자의 열성 NIH 대립유전자에 대해 동형접합인 마우스는 스핑고미엘리나아제 및 글루코세레브로시다아제 활성의 이중 결핍을 나타낸다. 돌연변이 마우스는 체중이 감소하기 시작하고 약 7주령에 떨림과 운동실조 보행을 나타낸다. 체중 감소가 계속되고 생후 약 12~14주에 사망할 때까지 떨림과 운동실조가 더욱 심해진다. 간과 비장도 비대해지고 소뇌의 푸르키니예 세포가 심하게 고갈된다. 마우스의 이러한 징후 중 일부는 인간 니만-픽 타입 C 질병 환자의 징후와 유사하다.
[표 5]
시험 항목
표 5. 시험 항목 정보
복합 제제:
투여 제형을 각각의 투약 상황에 분배되도록 요구되는 분취량으로 나누었다.
[표 6]
표 6. 제형 정보
시험 약품(item)의 필요한 양을 칭량하고 Elix 물(w/w)에 용해하고 pH를 산성 pH로 조정했다. 추가 부형제는 첨가하지 않았다.
시험 약품의 비중(specific gravity) 또는 시험 약품의 순도/조성에 대한 변경은 하지 않았다.
각각의 용량 준비 후, 연구 종료 시 분석을 위해 용액의 보유액을 동결시켰다.
방법 개발 및 검증 연구와 연계하여 앞서 수행된 안정성 분석은, 본 연구에서 사용된 괄호안에 제시된 농도(0.01 ~ 2 mg/mL)에서 냉장보관된(2-8℃) 적어도 8일 동안 그리고 냉동고에서(≤ -15℃) 적어도 3주 동안, 차광된 실온에서 적어도 24시간 동안 본 연구에서 사용된 괄호안에 제시된 농도로 동일한 조건에서 제조 및 보관했을 때 시험 약품이 비히클에서 안정적임을 입증했다.
동물 관리
동물의 수용
Rettenmaier에서 공급한 표준화된 설치류 깔짚 위의 개별 통풍 케이지에 동물을 수용했다. 각 케이지에는 최대 5마리의 마우스를 수용했다. 보관실의 온도는 20~24℃, 상대습도는 45~65%로 유지했다. 동물을 일정한 명주기(12시간 명/암) 하에 수용했다. 건조되고 펠렛화된 표준 설치류 먹이(Altromin)와 일반 수돗물을 자유롭게 동물에게 제공했다. 담당 수의사의 지침에 따라 습식 사료를 동물에게 공급했다.
식별
동물을 고전적인 귀마킹에 의해 연속적으로 번호매겼다.
각 케이지를 연구 번호, 성별, 동물의 개별 등록 번호(IRN), 출생일을 비롯하여 처치 그룹 할당을 나타내는 컬러 카드로 식별했다. 각 동물의 유전자형(트랜스제닉 또는 야생형)을 트랜스제닉 컨스트럭트에 특이적인 PCR로 결정했다. 각 마우스는 연구 시작 전에 귀 생검에서 분리한 DNA를 사용하여 유전형을 분석했다.
그룹 할당
명확하게 건강 상태가 양호한 동물만 연구에 포함시켰다. 그룹 할당의 무작위화를 케이지당 수행했다. 동물을 모든 처치 그룹의 동물을 포함하는 상이한 출발 그룹(코호트)에 할당했다. 시작 그룹의 동물 수를 동일한 연령과 균일한 취급을 보장하기 위해 제한했다.
건강 상태 및 케이지-측면 관찰
연구에 등록하기 전에, 각 개별 동물의 건강 상태를 평가했다. 연구가 진행되는 동안, 일일 관찰을 실시했고 주목할만한 모든 케이지 측면 관찰을 기록했으며, 추가 조치(예를 들어, 안락사)를 결정하는 연구 책임자와 담당 수의사에게 즉시 보고되었다.
체중과 건강 상태를 첫 주 동안 매일 기록했고 이후에는 일주일에 한 번 기록했다.
조기 종료 및 인도적 종결점
어떤 동물도 조기에 안락사시킬 필요가 없었다.
재료 및 방법
동물
마우스 계통: NPC(-/-)
사육자: 오스트리아 그램바흐 소재, QPS Austria GmbH,
시작 연령: 출생 후 11일(P11) ~ 출생 후 70일(P70)
성별: 혼합
동물 수: NPC(-/-) 30마리, NPC(+/-) 4마리, NPC(+/+) 4마리
처치
24마리의 NPC1(-/-) 마우스(그룹 D 내지 I)를 출생 후 11일(P11)부터 출생 후 70일(P70)까지 경구 위관영양당 AZ-3102-00(10 mL/kg)으로 처치했다. 투약은 P11에서 P25까지 1.5mg/kg에서 시작하여, 이어서 P26에서 P70까지 3mg/kg으로 진행되었다. 대조군 마우스에는 비히클로 처치된 6마리의 NPC1(-/-) 및 4마리의 NPC(+/-) 마우스 그리고 AZ-3102-00을 제공받은 4마리의 NPC(+/+) 마우스(그룹 A 내지 C)가 포함되었다.
P70에 마지막 처치 후, NPC(-/-) 마우스(시점당 n=4; 그룹 D 내지 I)를 다음 시점에서 600 mg/kg 펜토바비탈 a의 IP 주사에 의해 안락사시켰다: 30분, 1시간, 2시간, 4시간 , 8시간 및 24시간. 대조군 마우스(그룹 A, B 및 C)도 마지막 처치 후에 희생시켰다(시간 결정적이지 않음).
[표 7]
처치 그룹 개요.
조직 샘플링
30분(그룹 D), 1h(+/- 5분. 그룹 E ), 2h(+/- 5분. 그룹 F), 4h(+/- 5분. 그룹 G), 8h(+/- 5분 최소 그룹 H), P70에 마지막 처치 후 24시간(+/- 5분 그룹 I)(모든 시점이 중요함)에, 마우스를 i.p. 주입으로 안락사시켰다.
그룹 A의 6마리 NPC1(-/-), 처치된 그룹 B의 4마리 NPC(+/-) 및 그룹 C의 4마리 NPC(+/+) 마우스가 대조군으로 사용되었고 또한 P70(마지막 처치 후 약 2시간 후)에 안락사시켰다.
마우스를 펜토바비탈(600 mg/kg, 용량 10 μL/g 체중)의 i.p. 주입으로 최종적으로 안락사시켰다.
채혈
흉부를 열고, 23게이지 바늘로 심장을 천자하여 채혈했다. 바늘을 제거하고, 혈액을 샘플 튜브(MiniCollect® K2EDTA(포타슘 에틸렌디아민테트라아세트산))로 옮겼다. 튜브를 완전히 뒤집어 EDTA의 균일한 분포를 촉진하고 혈전생성(clotting)을 방지했다. 혈액 샘플을 실온(22℃)에서 3000 x g에서 10분간 원심분리했다. 50μL 혈장 분취량을 사전 라벨링된 1.5ml LoBind 에펜도르프 튜브로 옮기고, 드라이아이스에서 동결하고 -80℃에 보관했다.
관류
이어서 동물을 0.9% 식염수로 경심관류시켰다. 이를 위해, 0.9% 식염수가 있는 병에 연결된 23-게이지 바늘을 좌심실에 삽입했다. 폐와 간 사이의 흉부 대동맥을 지혈 겸자로 고정하여 심장에서 복부로의 혈류를 차단하되 뇌로의 혈류는 가능하도록 했다. 가위로 우심실을 열었다. 용액 병을 마노미터로 제어되는 공기 압축기에 연결하여 관류 용액에 100 내지 120mmHg의 일정한 압력이 유지되도록 했다. 두개골 표면이 창백해지고 우심실에서 혈액 대신 관류액만 나올 때까지 관류를 지속했다.
뇌 샘플링
관류 후 두개골을 열고, 뇌를 조심스럽게 제거하고 냉각된 표면에서 반측절단했다. 좌측 반구의 무게를 측정하고, 드라이아이스에서 급속 냉동하여 -80℃에 보관했다. 우측 반구는 실온에서 2시간 동안 인산염 완충액(pH 7.4) 중의 4% 파라포름알데히드에 침지하여 고정시켰다.
조직학
조직 준비
마우스 우측 반뇌를 실온에서 2시간 동안 PB(pH 7.4)에 새로 준비한 4% 파라포름알데히드에 담가 고정시켰다. 그 후, 반구를 15% 수크로스/PBS로 옮기고 동결보호를 보장하기위해 가라앉을 때까지 4℃에서 보관했다. 그런 다음 조직 블록을 필요에 따라 트리밍하고, 동결몰드(cryomolds)로 옮기고 OCT 매체에 포매시키고, 드라이아이스로 냉각된 이소펜탄에서 동결한 다음 초저온 냉동고(-80℃ 목표 온도로 설정)에 보관했다.
절편화
5개의 연속 동결절편을 Leica 냉동조직절편기(cryotome)에서 10 μm 두께로 시상적으로 절단했다. 레벨당 다음(next) 25개 절편을 폐기했다. 이 수집 체계를 12가지 레벨에 대해 반복했고 정확한 레벨에서 수집이 이루어지도록, 예를 들어, 어린 나이 또는 유전자형으로 인해 뇌가 더 작은 경우, 변경적용되었을 수 있다. 총 12 x 5 = 60개 절편을 수집했다. 절편화 레벨을 Paxinos와 Franklin의 뇌 지도("The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates", 2nd edition, 2001)에 따라 선택했다. 절편 수집을 정중선에서 측면 ~0.2mm 레벨에서 시작하여 반구를 통해 확대하여 대상 영역을 통해 체계적인 무작위 샘플링이 보장되도록 했다(도 10 및 15). 절편을 -20℃에서 보관했다. 거의 전체 뇌가 절단되었으므로, 모든 절편이 수집되었을 때 잔여 조직 블록은 폐기되었다.
면역형광 Exp3531(칼빈딘-D28k)
각 인큐베이션에 대해, 마우스당 5개 절편의 균일하고 체계적인 무작위 세트를 선택했고(레벨 2, 4, 6, 8, 10에서 각각 절편 1개); 체계적인 무작위 샘플링에 대한 정보는 다음 링크를 참조: http://www.stereology.info/sampling/
모든 단계를 달리 명시되지 않는 한 실온에서 둘베코(Dulbecco)의 인산염 완충 식염수 pH 7.2-7.8(PBS)에서 실시했다.
1. 동결절편을 45분 동안 공기 건조하고 PBS에서 10분 동안 세척했다
2. 댐프 챔버에서 60분 동안 0.1% TritonX-100/PBS 중의 10% 정상 당나귀 혈청(Jackson Immuno Research)으로 비특이적 결합 부위를 차단했다
3. 절편을 PBS에서 각각 3 x 5분 세척했다
4. 절편을 댐프 챔버에서 4℃로 밤새 1% 정상 당나귀 혈청/PBS에서 1차 항체와 함께 인큐베이션했다
· 기니피그 다클론 항체 대 칼빈딘-D28k(Synaptic Systems, 214005) 1:1000
5. 절편을 PBS에서 각각 3 x 5분 세척했다
6. 절편을 댐프 챔버(광 차단)에서 60분 동안 1% 정상 당나귀 혈청/PBS에서 2차 항체와 함께 인큐베이션했다
· 당나귀 항-기니피그(H+L), Cy3-접합(Jackson ImmunoResearch, 706-165-148), 1:500
7. 절편을 PBS(광 차단)에서 각각 3 x 5분 세척했다
8. 절편을 DAPI 작업 용액과 함께 15분 동안 인큐베이션했다(광 차단)
9. 절편을 PBS에서 2 x 5분 동안 세척했다(광 차단)
10. 절편을 ddH2O에서 5분 동안 세척했다(광 차단)
11. 절편을 Mowiol 및 커버슬립으로 덮었다(광 차단)
이미지화
염색된 절편의 전체 슬라이드 스캔을 Zeiss Axiocam 506 mono 및 Hitachi 3CCD HV-F202SCL 카메라와 Zeiss ZEN 2.3 소프트웨어가 장착된, 고구경 렌즈가 장착된 Zeiss 자동 현미경 AxioScan Z1에 기록했다.
정량화
이미지 분석을 Image Pro 10(Media Cybernetics)으로 수행했다. 처음에는 이미지에 관심 영역(ROI)을 그려 대상 영역(소뇌 및 해마, 또는 뇌량 및 선조체)을 식별했다. 추가 ROI로 주름, 기포, 또는 측정을 방해하는 임의의 기타 인공물을 제외했다. 그 후, 식별된 영역 내에서 면역형광을 정량적으로 평가했다.
정량화를 위해 필요한 경우 백그라운드 보정을 사용하고 적절한 임계값 및 형태학적 필터링(크기, 형상)을 통해 면역반응 대상체(objects)를 감지했다. 그런 다음 다른 대상체 특징을 정량화했으며; 이러한 특징들 중에는 ROI 크기(면역반응성 면적; 이것은 면역반응성에 차이가 있는지 여부를 나타내는 가장 포괄적인 파라미터임)를 기반으로 한 누적 대상체 면적의 백분율, ROI 크기(대상체 밀도)로 정규화된 대상체의 수, 확인된 대상체의 평균 신호 강도(평균 강도; 이것은 표적 단백질의 세포 발현 수준에 차이가 있는지 여부를 나타냄) 및 임계값 이상의 물체의 크기가 있다. 표적 대상체의 파라미터가 시험 실행에서 정의되면, 정량적 이미지 분석이 자동으로 실행되어 결과가 운영자 독립적이고 완전히 재현가능하다.
원시 데이터를 Excel에서 구조화하고 정렬한 다음, 통계 분석 및 그래프 준비를 위해 GraphPad Prism으로 전송했다. 프리즘 그래프는 연구 보고서의 일부이며 정렬된 원시 데이터가 있는 표는 품질 검사가 실행된 후 최종 보고서에 첨부된다.
마우스 혈장 및 뇌 조직에서 AZ-3102 및 글루코실세라마이드 측정
먼저, 혈장 샘플에서 500 nM의 내부 표준 글루코실세라마이드 C17:0(GlcCer C17:0) 및 0.1% 포름산을 함유하는 아세토니트릴/초순수/메탄올(90:5:5) 용액으로 단백질 침전시켰다. 실온에서 5분 동안 혼합한 후, 샘플을 5분 동안 원심분리(13,000rpm, 20℃)하고 상층액 50μL를 실리콘 처치된 MTP 96-웰 플레이트로 옮겼다.
FastPrep 24™ Microtube 균질화기를 사용하여 0.1% 포름산(조직 1g당 4mL)이 포함된 초순수:메탄올(1:1) 용액에서 뇌 조직을 균질화했다. 그런 다음 조직 균질물을 500nM의 GlcCer C17:0 및 0.1% 포름산을 함유하는 아세토니트릴:초순수:메탄올(90:5:5) 용액과 단백질 침전을 위해 혼합했다. 실온에서 5분간 인큐베이션한 후, 샘플을 5분간 원심분리(13000rpm, 20℃)하고 상청액 50μL를 실리콘 처치된 MTP 96웰 플레이트로 옮겼다.
AZ-3102의 측정
단백질 침전을 위해 혈장 샘플을 먼저 50ng/mL의 AZ-3101(내부 표준)을 포함하는 아세토니트릴 용액과 함께 혼합했다. 실온에서 5분 인큐베이션 후, 샘플을 5분 동안 원심분리(13000rpm, 4℃)하고 상등액을 0.1% 포름산을 포함하는 초순수에서 10배 희석했다.
FastPrep 24™ 마이크로튜브 균질기(MP Biomedicals, USA)를 사용하여 뇌 조직을 0.1% 포름산(조직 1g당 4mL)이 포함된 초순수:메탄올(1:1) 용액에서 균질화했다. 단백질 침전을 위해 뇌 균질액을 10ng/mL의 AZ-3101(내부 표준)을 함유하는 아세토니트릴 용액과 혼합했다. 실온에서 5분 인큐베이션 후, 샘플을 5분 동안 원심분리(13000rpm, 4℃)하고 상등액을 0.1% 포름산을 포함하는 초순수에서 10배 희석했다.
희석된 혈장 및 뇌 조직 상청액을 자동 시료 주입기(SIL-30, Shimadzu, USA)에 의해 Agilent LC 시스템(Agilent, USA)에 주입했다. 40℃의 온도에서 유지된 역상 XBridge BEH C8 컬럼(2.1*50 mm, 2.5 μm 입자 크기; Waters, USA)에서 0.800 mL/분의 유속으로 이동상 B의 선형 구배를 이용하는 액체 크로마토그래피로 분석물을 분리했다. 이동상 A는 0.1% 포름산이 있는 초순수로 구성되었다. 이동상 B는 0.1% 포름산이 있는 아세토니트릴이었다. 획득(Acquisitions)은 Turbo Ion Spray 인터페이스가 장착된 API 5500 삼중 사중극자 질량 분석기(AB Sciex, USA)를 사용하여 양이온화 모드에서 달성되었다. Analyst™ 데이터 시스템(AB Sciex, 버전 1.6.3)을 이용하여 데이터를 보정하고 정량화했다. AZ-3102에 대한 LLOQ는, 각각, 혈장 샘플에서 0.2ng/mL, 뇌에서 2ng/g 조직이었다.
글루코실세라마이드 측정
먼저, 혈장 샘플을 500 nM의 내부 표준 글루코실세라마이드 C17:0(GlcCer C17:0) 및 0.1% 포름산을 함유하는 아세토니트릴/초순수/메탄올(90:5:5) 용액으로 단백질 침전시켰다. 실온에서 5분 동안 혼합한 후, 샘플을 5분 동안 원심분리(13,000rpm, 20℃)하고 상층액 50μL를 실리콘 처치된 MTP 96-웰 플레이트로 옮겼다.
FastPrep 24™ Microtube 균질화기를 사용하여 0.1% 포름산(조직 1 g당 4 mL)이 포함된 초순수:메탄올(1:1) 용액에서 뇌 조직을 균질화했다. 그런 다음 단백질 침전을 위해 조직 균질물을 500 nM의 GlcCer C17:0 및 0.1% 포름산을 함유하는 아세토니트릴:초순수:메탄올(90:5:5) 용액과 혼합했다. 실온에서 5분간 배양한 후 샘플을 5분간 원심분리(13000rpm, 20℃)하고 상청액 50 μL를 실리콘화된 MTP 96웰 플레이트로 옮겼다.
뇌 내 글루코실세라마이드 C16:0(GlcCer C16:0), 글루코실세라마이드 C18:0(GlcCer C18:0) 및 글루코실세라마이드 C24:1(GlcCer C24:1) 농도에 대해, 샘플을 다중-반응 모니터링 모드(MRM)에서 HPLC-MS/MS 검출로 정량화했다. 갈락토실- 및 글루코실-세라마이드 이성질체를 구별하기 위해 Advanced Materials Technology의 HALO HILIC 컬럼(150*4.6 mm, 2.7 μm)을 사용하여 상청액을 HPLC-MS/MS로 분석했다. Turbo Ion Spray 인터페이스가 장착된 API 4000 삼중 사중극자(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 양이온화 모드에서 MS/MS 획득이 달성되었다. GlcCer C16:0 및 GlcCer C18:0의 분석을 이동상 A: 94.5% 아세토니트릴 2.5% 메탄올, 2.5% 초순수 및 0.5% 포름산 중 5mM 아세트산암모늄 및 이동상 B: 초순수 및 0.1 % 포름산을 이용한 구배로 수행했다. GlcCer 16:0, GlcCer 18:0 및 GlcCer 24:1에 대한 뇌 샘플의 LLOQ는, 각각, 25, 1, 250 및 381.5 pmol/g 조직이었다.
통계
통계 분석을 GraphPad Prism 9에서 수행했다. 데이터는 평균±평균의 표준 오차(SEM) 또는 평균 + 평균의 표준 오차로 표시된다.
생체 내: 그룹 간의 차이를 Bonferroni 또는 Dunnett의 사후 분석에 이어 반복 측정을 위한 양방향 ANOVA로 시험했다.
조직학: 적은 n으로 인해, 데이터 분포를 시험할 수 없으므로, 정규 분포를 가정했다. 그룹 간의 차이를 일원 ANOVA와 Dunnett의 사후 분석으로 시험했다. 그룹 A(NPC-/-, 비히클 처리)를 쌍별(pairwise) 비교를 위한 참조 그룹으로 사용했다.
결과
체중
도 11은 PND 11일과 9주 사이의 체중의 백분율 변화를 나타낸다. 그래프는 첫 번째 치료 주 동안 매일 그리고 그 후 매주 측정된 그룹당 체중의 진행률[g]을 나타낸다.
결과는 평균 체중 증가 백분율로 표시되는 동물의 일반적인 건강이 AZ-3102에 의해 방해받지 않았으며 AZ-3102로 처치된 NPC(-/-) 두 성별 마우스 모두가 NPC(-/-) 처치되지 않은 동물보다 더 나았음을 나타낸다.
[표 8]
약물 동태
표 8. PND 11-70의 반복 경구 투여 후 AZ-3102에 대한 뇌:혈장 노출 비율
글루코실세라마이드 수준
도 12는 PND 11-70까지 반복 경구 투여 후 글루코실세라마이드 C16:0 및 C18:0 수준을 나타낸다.
AZ-3102로 처치된 마우스는 뇌에서 글루코실세라마이드 C16:0 및 C18:0의 증가된 수준을 나타냈다.
임상 징후
임상 점수 및 인도적 종결점의 정의
임상 징후를 P45에서 시작하여 연구가 끝날 때까지 매일 모니터링했다(아래 표 9의 템플릿에 따름). "체중 감소", "일반적인 건강", "임상 소견" 및 "계통 특이적 소견" 파라미터를 기록하고 점수 척도에 따라 등급을 매겼다. 이 점수의 합계를 평가에 사용했다.
[표 9]
[표 10]
떨림 점수
표 10. 떨림 점수
도 13은 각 NPC(-/-) 비히클 및 AZ-3102 처치된 마우스에 대한 모든 도메인에 걸쳐 및 처리 그룹에 의한 PND 56-70으로부터의 전체 임상 징후 점수의 요약을 나타낸다. 왼쪽: 기울기로 시각화된 동물 및 치료 그룹별 총 점수, 낮은 점수는 녹색, 높은 점수는 빨간색 오른쪽: 수치 임계값에 도달한 점수 요약. 7보다 큰 임계값 점수는 치료 그룹에서 드물게 발생하며; 그러나 치료되지 않은 그룹은 연구 과정 동안 총 점수가 더 높았다.
결과는 NPC(-/-) 비히클 처치된 마우스가 NPC(-/-) AZ-3102 처치된 동물에 비해 전반적인 임상 징후에서 악화(더 큰 점수)를 나타냈음을 나타낸다. 이는 도 13에 추가로 나타나 있으며: 오른쪽에서, 예를 들어, 8보다 큰 점수가 NPC(-/-) AZ-3102 처치된 동물에 비해 NPC(-/-) 비히클 처치된 그룹에서 더 자주 관찰되었다.
이러한 점수를 조사한 결과, 본 발명자들은 떨림의 시작, 지속기간뿐 아니라, 강도가 AZ-3102를 사용한 처치에 의해 감소되었음을 발견했다(도 14). NPC(-/-) 비히클 처치한 동물 한 마리를 제외한 모든 동물에서 높은 수준의 떨림이 관찰되었으며; 반면 AZ-3102는 시험한 24마리 동물 중 한 마리를 제외한 모든 동물에서 이러한 높은 수준의 떨림을 본질적으로 제거했다.
도 14는 NPC(-/-) 비히클 및 AZ-3102 처치된 마우스에서 생후 56-70일의 떨림 점수를 나타낸다. 분홍색(=밝은 회색) 막대는 높은 수준의 떨림(소어 5)의 출현(appearance)과 지속 시간을 나타내고; 반면 녹색(= 짙은 회색) 막대는 경미하거나 중간 정도의 떨림의 출현과 지속 시간을 나타낸다. 비처치된 그룹의 마우스 한 마리를 제외하고, 다른 모든 마우스는 높은 수준의 떨림을 보였다(5마리 중 4마리). 대조적으로, AZ-3102 치료 그룹에서 단 한 마리의 마우스만이 높은 수준의 떨림을 보였다(24마리 중 1마리). 가능한 떨림 점수: 0: 떨림 없음 1: 경미한 비조정, 경미한 떨림; 5: 높은 수준의 떨림, 조정되지 않은 움직임; 10: 감소된 정위 반사(어떤 동물도 이 점수를 달성하지 못함).
조직학적 결과
대상 영역의 정의
표적 영역은 형광 라벨링의 후속 정량 분석을 위해 관심 영역(ROI)을 정의하여 수작업으로 윤곽을 그렸다.
정량 분석 판독
아래 제시된 표에는 네 가지 표준 판독값이 있다.
· 영역 크기[㎟]: 이 데이터는 대상 영역에 의해 커버되는 뇌 절편당 평균 영역을 나타낸다. 이 정보는 적절한 샘플링을 확인하는 데 중요하다. 일부 동물 모델의 표현형의 일부인 뇌 위축을 확인하는 것도 도움이 된다.
· 면역반응 면적[%]: 임계값 이상의 면역 반응 대상체(예를 들어, 세포체, 신경돌기, 플라크)에 의해 커버되는 ROI의 백분율; 이것은 면역반응성에 전반적인 차이가 있는지 여부를 나타내는 가장 포괄적인 파라미터이다.
· 대상체 밀도[㎟당 개체 수]: 표적 영역의 크기로 정규화된 임계값 이상의 면역반응 대상체의 수; 이것은 신경 밀도의 변화를 감지하는 데 특히 유용하다.
· 대상체 강도[a.u.]: 임계값 이상의 면역반응 대상체 픽셀의 평균 밝기; 이는 표적 단백질의 세포 발현 수준에 차이가 있는지 여부를 나타낸다.
· 대상체 크기[㎛2]: 임계값 이상의 면역반응 대상체의 크기; 이것은 미세아교세포 활성화 또는 플라크 성장의 차이를 감지하는 데 유용하다.
칼빈딘-D28k
칼빈딘-D28k의 면역형광을 기니피그 다클론 항체로 검출하여, 소뇌와 해마 형성에서 신호를 정량했다. NCP(-/-) 마우스는 NCP(+/-) 및 NPC(+/+) 마우스에 비해 강하게 감소된 칼빈딘-D28k 라벨을 나타냈다. 시험 약물을 사용한 처치는 모든 판독값에서 소뇌의 칼빈딘-D28k를 유의하게 증가시켰다. 해마에서 유의미한 그룹 차이가 발견되지 않았기 때문에 모든 효과는 영역-특이적(region-specific)이었다.
도 16은 뇌 면역조직화학의 결과를 나타낸다: NCP(-/-) 및 NPC(+/-) 비히클 처리 마우스에서 칼빈딘-D28k 라벨링을 NPC(+/+, 야생형 마우스) 및 NPC(-/-) 처치된 마우스와 비교했다. 그래프는 마우스당 5개의 뇌 절편에서 ROI 내에서 측정된 면역형광 신호의 평균을 제시한다(그룹당 n = 2-4). 데이터는 일원 분산 분석 및 Dunnett의 사후 시험로 분석되었다. 막대 그래프는 그룹 평균 + SEM을 나타낸다. 막대 그래프는 그룹 평균 + SEM을 나타내고, *Adj. P-값: <0.001임.
푸르키니에 세포에 대한 칼빈딘-D28k 마커를 사용하는 면역조직학적 기술을 사용하여, 본 발명자들은 비히클 처치된 NPC(-/-) 마우스와 비교하여 AZ-3102 처치가 소뇌 푸르키니에 세포 손실을 유의하게 제한한다는 것을 발견했다(도 16).
결론
AZ-3102는 다양한 리소좀 축적 장애를 위해 개발 중인 새로운 경구 소분자이다. AZ-3102의 고유한 작용 기전은 글루코실세라마이드 합성효소(GCS), 비리소좀성 글루코실세레브로시다아제(GbA2)에 대한 높은 효능과 뇌 침투 특성에 있다. AZ-3102는 니만-픽 타입 C 질병[1, 2]의 마우스 모델에서 조사되었는데, NPC 유전자의 열성 NIH 대립유전자에 대해 동형접합성인, 이 마우스는 약 7주령에 체중이 감소하기 시작하고 떨림과 운동실조 보행을 나타낸다[3]. 질병의 중증도는 상당한 소뇌 푸르키니에 세포 손실과 관련이 있으며 임상 징후는 인도적 종말점에 도달할 때까지(일반적으로 생후 12~14주) 악화된다[3]. 이 연구에서는, 본 발명자들은 출생 후 11일부터 70일까지 NPC(-/-), NPC(-/+) 및 WT(NPC(+/+); Balb/c) 마우스의 일일 경구 투약에 따른 약동학(PK) 특성, 글루코실세라미드(GlcCer C16:0, GlcCer C18:0) 조절 능력 및 임상 징후 개선 능력을 평가했다. 또한, 본 발명자들은 신경병리와 일치하는 푸르키니에 세포의 면역 조직 화학 표지자에 대한 치료 효과도 조사했다. PND 11-70까지, AZ-3102의 일일 반복 경구 투여 후. 평균 체중 증가 백분율로 표시되는 동물의 일반적인 건강은 AZ-3102에 의해 방해받지 않았으며, AZ-3102로 처치된 NPC(-/-) 마우스의 두 성별 모두 비처치된 NPC(-/-) 동물보다 더 많이 증가했다(도 11). AZ-3102는 높은 뇌:혈장 노출(표 8)을 보여주었고 AZ-3102 표적 결합과 일치하며, 비히클 처치된 동물과 비교하여 전체 뇌 균질액으로부터 측정된 GlcCer 종을 GlcCer 16:0의 경우 2배 이상 증가시키고 GlcCer 18:0의 경우 대략 9배 증가시켰다. 이 두 GlcCer 종은 AZ-3102에도 반응할 수 있는 다른 GlcCer 종을 대표할 가능성이 높다. AZ-3102가 일반 건강 및 신경병리학의 보다 특이적인 징후에 영향을 미치기에 충분한 뇌 농도에 도달하는지 여부를 평가하기 위해, 다양한 임상 징후를 측정했다(표 9). 이 점수는 관찰 기간 동안 합산될 때 PND 56-70의 건강에 대한 그림을 제공한다. 도 13은 시간 경과에 따른 관찰된 코호트당 각 동물에 대한 그래픽 보기를 나타낸다. 이 그래픽에서, NPC(-/-) 비히클 처치된 마우스는 NPC(-/-) AZ-3102 처치된 동물에 비해 전반적인 임상 징후에서 악화(더 큰 점수)를 나타냈다. 이것은 (도 13: 오른쪽)에서 추가로 정량화되었고, 예를 들어, 8보다 큰 점수가 NPC(-/-) AZ-3102 처치된 동물에 비해 NPC(-/-) 비히클 처치된 그룹에서 더 자주 관찰되었다. 이러한 점수를 조사한 결과, 본 발명자들은 떨림의 시작, 지속 기간 및 강도가 AZ-3102를 사용한 처치로 감소되었음을 발견했다(도 14). 한마리의 NPC(-/-) 비히클 처치된 동물을 제외한 모든 동물에서 높은 수준의 떨림이 관찰되었으며; 반면 AZ-3102는 시험한 24마리 동물 중 한 마리를 제외한 모든 동물에서 이러한 높은 수준의 떨림을 본질적으로 제거했다. 푸르키니에 세포에 대한 칼빈딘-D28k 마커를 사용하는 면역조직학적 기술을 사용하여, 비히클 처치된 NP-C(-/-) 마우스와 비교하여, AZ-3102 처리가 소뇌 푸르키니에 세포 손실을 유의하게 제한한다는 것을 발견했다(도 16). 이 발견은 인간의 니만-픽 타입 C와 관련이 있는데, 이는 특히 푸르키니에 세포에서, 뉴런 사멸을 비롯한 대뇌 위축이 이 질병의 특징이기 때문이다[4]. 소뇌 기능은 움직임에 중요하기 때문에 개선된 임상 징후와 높은 수준의 떨림의 현저한 감소는 소뇌 푸르키니에 세포 생존의 결과일 가능성이 높다.
요약하면, AZ-3102는 경구용으로 사용가능한 GCS 및 GbA2 모두의 매우 강력한(nM) 억제제로 NPC(-/-) 및 야생형 동물의 뇌에 침투할 수 있었다. 또한, AZ-3102는 GlcCer 종의 조절을 통해 명확하게 나타난 바와 같이 뇌에서 이들 효소를 억제하고, 임상 징후를 개선하고, 높은 수준의 떨림을 유의하게 감소시키고, 비히클 처치된 동물에 비해 소뇌 푸르키니에 세포의 손실을 제한적으로 나타냈다.
1.
Loftus, S.K., et al., Murine model of Niemann-Pick C disease: mutation in a cholesterol homeostasis gene. Science, 1997. 277(5323): p. 232-5.
2.
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3.
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4.
Vanier, M.T., Niemann-Pick disease type C. Orphanet Journal of Rare Diseases, 2010. 5(1): p. 16.
실시예 5 - 샌드호프병(돌연변이를 통한 뮤린 Hexb 유전자의 파괴[Hexb(-/-)])을 앓는 마우스에 대한 화합물 (I)의 결정형의 투여 효과
샌드호프병을 앓고 있는 마우스에 치료 유효량의 AZ-3102를 투여했다. 초기 데이터는 니만-픽 타입 C를 치료하는 것과 유사하게 질병에 걸린 동물의 임상 징후가 개선되었음을 제시한다.
Claims (15)
- 하기 화합물 (I)의 결정형:
.
- 청구항 1에 있어서,
상기 결정형이 결정질 유리 염기인, 결정형. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 결정형은 X-선 분말 회절 패턴 내, 17.8±0.2°에서 2θ 값으로 표시되는 반사를 나타내고, 여기서 17.8±0.2°에서의 상기 반사는 X선 분말 회절 패턴에서 4개의 가장 강한 반사 중 하나인 것인, 결정형. - 청구항 3에 있어서,
상기 X선 분말 회절 패턴에서, 4.1±0.2°, 8.3±0.2°, 12.4±0.2°, 13.6±0.2°, 14.5±0.2°, 14.9±0.2°, 15.2±0.2°, 17.2±0.2°, 19.3±0.2°, 21.2±0.2°, 22.4±0.2°, 22.9±0.2°, 및 23.3±0.2°중 하나 이상에서, 2θ값으로 표시되는, 하나 이상의 반사를 추가로 나타내는 것인, 결정형. - 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 융점이 89℃ 내지 96℃이고; 및/또는
(b) 상기 결정형태이 실질적으로 비흡습성인,
결정형. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 결정형이, X선 분말 회절 패턴 내, 16.9±0.2°에서, 2θ값으로 표시되는, 반사를 나타내고, 여기서 16.9±0.2°에서의 상기 반사가 X선 분말 회절 패턴에서 4개의 가장 강한 반사 중 하나이고, 임의 선택적으로 상기 결정형이, X선 분말 회절 패턴 내, 15.2±0.2°, 16.1±0.2°, 16.5±0.2°, 18.9±0.2°, 23.1±0.2°, 25.5±0.2°, 27.7±0.2° 및 28.5±0.2°중 하나 이상에서, 2θ값으로 표시되는, 하나 이상의 반사를 추가로 나타내는 것인, 결정형. - 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 결정형을 포함하는 약제학적 조성물.
- 청구항 7에 있어서,
상기 약제학적 조성물이 캡슐에 함유되되, 임의 선택적으로 상기 약제학적 조성물이,
(a) 임의의 다른 성분 없이; 또는
(b) 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께,
캡슐에 함유되는, 약제학적 조성물. - 치료에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 결정형, 또는 청구항 7 또는 청구항 8항의 약제학적 조성물.
- 약제로서 사용하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 결정형, 또는 청구항 7 또는 청구항 8항의 약제학적 조성물.
- 비정상적인 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 수반하는 질병을 치료하는데 사용하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 결정형, 또는 청구항 7 또는 청구항 8항의 약제학적 조성물로서,
임의 선택적으로 상기 비정상적인 수준의 글루코실세라마이드 및/또는 더 높은 수준의 글리코스핑고지질을 수반하는 질병이 리소좀 축적병, 예컨대 고셔병, 파브리병, GM1 강글리오시드증, GM2 강글리오시드증(예컨대, 테이-삭스병, 샌드호프병 또는 AB 변종), 사이알리도시스, 니만-픽병 타입 C 및 작용 근간대성 신부전 증후군, 또는 대사 증후군으로 집합적으로 분류되는 질병 중 하나의 증상, 예컨대 비만, 인슐린저항성, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 다낭성신장질환, 제2형 당뇨 및 만성염증, 또는 신경퇴행성 장애, 예컨대 파킨슨병 또는 루이소체 치매, 또는 죽상동맥경화증인, 결정형 또는 약제학적 조성물. - 화합물 (I)의 샘플을 용매와 접촉시키는 단계를 포함하는, 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 결정형을 제조하는 방법으로서, 임의 선택적으로
(a) 상기 용매는 아세토니트릴, 에틸 아세테이트, 이소프로판올, 아니솔, 물 및 tert-부틸 메틸 에테르(TBME)로부터 선택되고; 및/또는
(b) 상기 화합물 (I)의 샘플을 상기 용매와 접촉시키기 전에, 상기 화합물 (I)의 샘플을 정제하고, 임의 선택적으로 상기 화합물 (I)의 샘플을 크로마토그래피를 사용하여 정제하는,
제조 방법. - 청구항 12의 방법을 수행하여 얻어지는 화합물 (I)의 결정형.
- 결정형을 제조하기 위한 화합물 (I)의 유리 염기의 용도.
- 화합물 (I)의 유리 염기를 결정화하는 단계를 포함하는 화합물 (I)의 결정형을 제조하는 방법.
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