BR112022018020B1 - Formas cristalinas de um composto farmacêutico - Google Patents
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Abstract
formas cristalinas de um composto farmacêutico. a presente invenção se refere a uma forma cristalina do composto (i) e a um método de elaboração da forma cristalina do composto (i). a invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem a forma cristalina do composto (i). além disso, a invenção se refere a métodos de uso desta forma cristalina do composto (i) como um medicamento e no tratamento de uma doença que envolve níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios.
Description
[001] A invenção se refere a uma forma cristalina do composto (I),
[002] A invenção também se refere a um método de elaboração da forma cristalina do composto (I), bem como composições farmacêuticas que compreende a forma cristalina do composto (I). Além disso, a invenção se refere a métodos de uso desta forma cristalina do composto (I) como medicamento e no tratamento de uma doença que envolve níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios.
[003] Um estado cristalino de um composto pode ser importante quando o composto é usado para fins farmacêuticos. Isso ocorre porque a morfologia, o tamanho de partícula, o polimorfismo, a solvatação ou a hidratação do estado cristalino de um composto podem afetar a filtração, o fluxo,
[004] Derivados de desoxinojirimicina são uma importante classe de moléculas em química medicinal e revelação de fármacos. N-(hidroxietil)-desoxinojirimicina é comercializado como Miglitol como um agente antidiabético para diabetes tipo 2. O miglitol também atua como um inibidor de amplo espectro de várias glicosidases intestinais (maltase, sacarose e lactase) (Hillebrand et al., Diabetes, 1986, Vol. 35, A93-A93) (Scott e Spencer, Drugs, 2000, Vol. 59, 521-549).
[005] A N-butil-desoxinojirimicina (miglustat, Zavesca®) foi desenvolvida como um inibidor da glicosilceramida sintase (também denominada de ceramida glicosiltransferase, EC 2.4.1.80, código UniProt: Q16739) e é usado em clínicas para tratar pacientes com o distúrbio de armazenamento lisossomal, doença de Gaucher (Platt et al., J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, 8362-8365) (Cox et al., Lancet, 2000, Vol. 355, 1481-1485) e doença de Niemann-Pick tipo C (Pineda et al. Orphanet J. Rare Dis., 2018, Vol. 13, 140).
[006] O documento WO2015/147639 A1 descreve novos derivados de deoxinojirimicina, incluindo composto (I),
[007] que são eficazes no tratamento de doenças que estão associadas a níveis anormais de glicosilceramida citosólica ou lisossomal e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios. O Composto (I) é um potente inibidor duplo da glicosilceramida sintase e da glicosilceramidase não lisossomal (GBA2, código UniProt: Q9HCG7).
[008] Os compostos terapêuticos úteis no tratamento dos níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolípidos são frequentemente administrados na forma de comprimidos. Ao preparar composições farmacêuticas e formulações para uso em tais comprimidos, é altamente desejável ter uma forma cristalina do composto terapêutico com baixos níveis de higroscopicidade e/ou baixos níveis de deliquescência, permitindo-se, assim, que o composto seja comprimido em um formato ou tamanho desejado.
[009] Além disso, um ponto de fusão relativamente alto (tipicamente superior a cerca de 80 °C) de um composto terapêutico favorece a resistência à decomposição, facilitando-se, assim, o armazenamento e aumentando-se a
[0010] Também é particularmente benéfico que um composto terapêutico seja não higroscópico ou substancialmente não higroscópico, quando se considera o manuseio, fabricação e armazenamento do agente farmacêutico. Se um agente farmacêutico apresentar propriedades higroscópicas, muitos problemas podem surgir, por exemplo: • dificuldade com a redução de material em pequenas partículas ou pó por esmagamento; • umidificação indesejada que dificulta reações apropriadas e que forma produtos finais indesejados, o que resulta em qualidade mínima e vida útil reduzida; • produção de comprimidos macios durante a fabricação ou penetração de umidificação no interior do acondicionamento; • pós aderidos ao transportador, o que pode influenciar no processo de enchimento.
[0011] Assim, é desejável ter uma forma cristalina do composto terapêutico que seja não higroscópico ou substancialmente não higroscópico.
[0012] Nenhuma forma cristalina do composto (I) foi relatada anteriormente. Consequentemente, existe uma necessidade de formas cristalinas estáveis e/ou não deliquescentes do composto (I), que são preferencialmente
[0013] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma forma cristalina do composto (I),
[0014] Cada aspecto ou modalidade conforme definida no presente documento, pode ser combinado com qualquer outro aspecto (ou aspectos) ou modalidade (ou modalidades), a menos que seja claramente indicado o contrário. Em particular, qualquer recurso indicado como sendo preferencial ou vantajoso pode ser combinado com qualquer outro recurso ou recursos indicados como sendo preferenciais ou vantajosos.
[0015] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende a forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento.
[0016] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece a forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento, para uso em terapia.
[0017] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece a forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento, para uso com um medicamento.
[0018] Outro aspecto da presente invenção se refere à forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento, para uso no tratamento de uma doença que envolve níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios.
[0019] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece a forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento, para uso no tratamento da doença de Niemann-Pick tipo C.
[0020] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma doença que envolve níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios em pacientes humanos ou animais, que compreende a administração a um paciente com necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento.
[0021] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método de tratamento da doença de Niemann-Pick tipo C em pacientes humanos ou animais, que compreende a administração a um paciente com necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento.
[0022] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um processo de preparação da forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento, que compreende colocar uma amostra do composto (I) em contato com um solvente.
[0023] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma forma cristalina do composto (I) obtida realizando-se o processo conforme descrito no presente documento.
[0024] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um uso da base livre do composto (I) para preparar a forma cristalina do composto (I).
[0025] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um processo de preparação da forma cristalina do composto (I) que compreende a cristalização da base livre do composto (I).
[0026] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma forma cristalina do composto (I) obtida pelo
[0027] Outras modalidades preferenciais dos compostos de acordo com a invenção aparecem através de todo o relatório descritivo e, em particular, nos exemplos.
[0028] Os presentes inventores constataram surpreendentemente uma forma cristalina do composto (I) que é estável e não deliquescente. A presente invenção tem propriedades vantajosas adicionais, como uma substancial falta de higroscopicidade e um ponto de fusão relativamente alto.
[0029] Inesperadamente, os presentes inventores constataram, adicionalmente, uma forma cristalina do composto (I) que mostra boa solubilidade em água. Essas propriedades tornam as formas cristalinas da presente invenção particularmente adequadas para uso em uma composição farmacêutica.
[0030] A cristalização de compostos terapêuticos geralmente envolve o uso de diferentes sais. Normalmente, os sais sofrem cristalização prontamente e o material resultante facilita a cristalização subsequente dos compostos terapêuticos. Por esta razão, o uso de um sal é frequentemente o método preferencial para cristalizar um composto terapêutico. É, portanto, surpreendente que os
[0031] Visto que a forma de base livre cristalina de qualquer composto terapêutico não requer a presença de um contraíon, a concentração de um composto terapêutico em um pó de forma cristalina de base livre é geralmente maior do que na forma de sal correspondente, o que é altamente benéfico, pois reduz a custo de fabricação do composto terapêutico.
[0032] Sem desejar ater-se a nenhuma teoria, pensa-se que as formas cristalinas da presente invenção tendem a mostrar os efeitos vantajosos discutidos acima devido à sua estrutura cristalina.
[0033] Estes e outros aspectos da invenção serão agora descritos com referência às Figuras anexas, nas quais: A Figura 1 mostra imagens exemplificativas obtidas com o uso de microscopia de luz polarizada de uma forma cristalina do composto (I), denominada Forma 2, que é obtida por equilíbrio com acetonitrila; esquerda: como pó seco, direita: disperso em óleo de parafina. A Figura 2 mostra o padrão de difração de pó de raio X da Forma 2, obtido por equilíbrio com acetonitrila. A Figura 3A mostra o termograma TG-FTIR da Forma 2, obtido por equilíbrio com acetonitrila. A Figura 4A mostra a isoterma de sorção dinâmica de vapor (DVS) da Forma 2, obtida por equilíbrio com acetonitrila: a mudança do teor de água (curva vermelha) e umidade relativa (curva azul) em função do tempo. A Figura 4B mostra a isoterma DVS da Forma 2, obtida por equilíbrio com acetonitrila: a mudança do teor de água em função da umidade relativa. A Figura 5 mostra imagens exemplificativas obtidas com o uso de microscopia de luz polarizada de uma forma cristalina do composto (I), denominada Forma 3, obtida por equilíbrio com acetonitrila, anisol ou acetato de etila, respectivamente. A Figura 6A mostra o padrão de difração de pó de raio X da Forma 3, obtido por equilíbrio com acetonitrila. A Figura 6B mostra uma sobreposição dos padrões de difração de pó de raio X da Forma 3, obtidos por equilíbrio com TBME, água, isopropanol, acetato de etila, acetonitrila ou anisol, respectivamente. A Figura 7 mostra uma sobreposição dos padrões de difração de pó de raio X de duas formas cristalinas do composto (I) obtido por equilíbrio com acetonitrila: 1) Forma 3 (Exemplo 3), e 2) Forma 2 (Exemplo 2). A Figura 8A mostra o termograma TG-FTIR da Forma 3, obtido por equilíbrio com acetato de etila. A Figura 8B mostra o termograma TG-FTIR da Forma 3, obtido por equilíbrio com isopropanol. A Figura 8C mostra o termograma DSC da Forma 3, obtido por equilíbrio com acetato de etila. A Figura 9A mostra a isoterma DVS da Forma 3, obtida por equilíbrio com acetato de etila: a mudança do teor de água (curva vermelha) e umidade relativa (curva azul) em função do tempo. A Figura 9B mostra a isoterma DVS da Forma 3, obtida por equilíbrio com acetato de etila: a mudança do teor de água em função da umidade relativa. A Figura 10 mostra os níveis medio-sagitais aproximados obtidos seguindo o protocolo de secção com base em Paxinos & Franklin “The Mouse Brain Atlas, 2a edição”, que mostram as coordenadas estereotáxicas. A Figura 11 mostra uma alteração percentual no peso corporal dos camundongos entre o dia pós-natal (PND) 11 e a semana 9. A Figura 12 mostra os níveis de glicosilceramida C16:0 e C18:0 após administração oral repetida de PND 11-70. A Figura 13 mostra a pontuação de sinais clínicos de PND 56-70 em veículo NPC (-/-) e camundongos tratados com AZ-3102. A Figura 14 mostra o escore de tremor de PND 56-70 em veículo NPC (-/-) e camundongos tratados com AZ-3102. A Figura 15 mostra a definição das áreas de interesse (ROIs). A imagem mostra o contorno das ROIs do cerebelo, formação hipocampal, corpo caloso e corpo estriado (caudado- putâmen). A Figura 16 mostra a imuno-histoquímica do cérebro: marcação de calbindina-D28k em camundongos tratados com veículo NCP(-/-) e NPC(+/-) em comparação com camundongos tratados com NPC (+/+, camundongos de tipo selvagem) e NPC (-/-). A Figura 17 resume o modo de ação da forma cristalina do composto (I) (AZ-3102).
[0034] A menos que definido de outro modo no presente documento, os termos científicos e técnicos usados em combinação com a presente invenção devem ter os significados que são comumente compreendidos por aqueles de habilidade comum na técnica. O significado e escopo dos termos devem ser claros, no entanto, no caso de qualquer ambiguidade latente, as definições fornecidas no presente documento tem prioridade sobre qualquer dicionário ou definição extrínseca.
[0035] Deve ser entendido que preposições singulares como “um”, “uma” e “o”, “a” são frequentemente usadas por conveniência, no entanto, todas as instâncias do singular destinam-se a abranger o plural, a menos que indicado de outra forma explicitamente ou a partir do contexto. Os termos “que compreende”, “que inclui” e “que tem” são destinados a serem inclusivos e significam que podem existir elementos adicionais além dos elementos listados. Além disso, deve ser entendido que todas as referências, incluindo artigos de periódicos, livros, patentes, documentos técnicos e similares, mencionados nesta revelação são incorporados a título de referência em sua totalidade e para todos os fins.
[0036] O termo "cerca de" conforme usado no presente documento para dados numéricos se refere a um valor dentro de 10 % do parâmetro subjacente (isto é, mais ou menos 10 %), e o uso do termo "cerca de" no início de uma sequência de valores modifica cada dos valores (isto é, "cerca de 1, 2 e 3" se refere a cerca de 1, cerca de 2 e cerca de 3). Por exemplo, uma temperatura de “cerca de 85 °C” pode incluir temperaturas entre 75 °C e 95 °C.
[0037] O termo “ponto de fusão” na técnica. O termo "ponto de fusão relativamente alto", conforme usado no presente documento, destina-se a abranger formas cristalinas que são estáveis o suficiente para serem formuladas como composições farmacêuticas. De preferência, o termo "ponto de fusão relativamente alto" descreve um ponto de fusão que é
[0038] O termo "composição", conforme usado no presente documento, destina-se a abranger um produto que compreende os ingredientes especificados nas quantidades especificadas, bem como qualquer produto que resulte, direta ou indiretamente, da combinação dos ingredientes especificados nas quantidades especificadas. Tal termo em relação à composição farmacêutica, destina-se a abranger um produto que compreende a forma cristalina do composto (I), e opcionalmente, os ingredientes adicionais que compõem o carreador, bem como qualquer produto que resulte, direta ou indiretamente, da combinação, complexação ou agregação de quaisquer dois ou mais dos ingredientes, ou da dissociação de um ou mais dos ingredientes, ou de outros tipos de reações ou interações de um ou mais dos ingredientes. Consequentemente, as composições farmacêuticas da presente invenção abrangem qualquer composição que compreende uma forma cristalina da presente invenção e, opcionalmente, um carreador farmaceuticamente aceitável. Por "farmaceuticamente aceitável" entende-se que o carreador, diluente ou excipiente deve ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial ao recipiente do mesmo.
[0039] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quantidade de uma forma cristalina ou uma composição farmacêutica que, quando administrada a um paciente para o tratamento de uma doença, é suficiente para efetuar tal tratamento para a doença. A “quantidade terapeuticamente eficaz” irá variar dependendo da doença e sua gravidade e da idade e peso do paciente a ser tratado. O termo "paciente" (ou "sujeito") inclui, porém sem limitação, animais como, por exemplo, mamíferos. De preferência, o paciente é um ser humano.
[0040] A presente invenção fornece uma forma cristalina do composto (I),
[0041] A forma cristalina do composto (I) pode estar em qualquer estado cristalino. A forma cristalina do composto (I) pode ser um sal cristalino ou uma base livre cristalina (forma não ionizada). De preferência, a forma cristalina do composto (I) é uma base livre cristalina. Além disso, o composto (I) pode formar um cocristal.
[0042] Se a forma cristalina do composto (I) for um sal cristalino, a estrutura molecular do composto (I) acima,
[0043] A presente invenção não está limitada a uma única forma cristalina do composto (I). Materiais sólidos podem existir em mais de uma forma cristalina. Estas formas cristalinas alternativas são denominadas polimorfos. Cada polimorfo tem diferentes orientações e/ou conformações de moléculas na rede cristalina. Cada estado cristalino, ou “polimorfo”, exibe um conjunto único de propriedades físico- químicas devido a diferenças na estrutura de cristalina.
[0044] As formas polimórficas podem apresentar diferentes propriedades mecânicas, como fluidez e compressibilidade, que afetam as propriedades tecnológicas do composto. A estabilidade e a duração de armazenamento do composto também podem depender do polimorfo.
[0045] Os polimorfos podem ser distinguidos entre si de maneiras diferentes. Os polimorfos exibem claramente propriedades espectroscópicas e podem ser determinados com o uso de, por exemplo, espectroscopia de infravermelho, espectroscopia Raman e espectroscopia de 13C-NMR. Tendo em vista que cada forma cristalina refrata os raios X de maneiras diferentes, a difração de pó de raio X (XPD) também pode ser usada para caracterizar polimorfos. Além disso, métodos térmicos como calorimetria de varredura diferencial (DSC) e análise termogravimétrica (TTA) podem fornecer informações exclusivas sobre um determinado polimorfo.
[0046] Como é bem conhecido no campo da difração de pó de raio X, as alturas de pico relativas dos espectros de difração de raios-X em pó podem ser usadas para descrever diferentes formas cristalinas. Consequentemente, em um aspecto de ‘Forma 3’, a presente invenção fornece uma forma cristalina do composto (I) que exibe um reflexo, indicado como um valor 2θ, a 17,8 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X, em que o reflexo a 17,8 ± 0,2° é um dos quatro reflexos mais fortes no padrão de difração de pó de raio X. De preferência, o reflexo a 17,8 ± 0,2° é um dos três reflexos mais fortes no padrão de difração de pó de raio X ou em que o reflexo a 17,8 ± 0,2° é um dos dois reflexos mais fortes no padrão de difração de pó de raio X. Mais preferencialmente, o reflexo a 17,8 ± 0,2° é o reflexo mais forte no padrão de difração de pó de raio X. Mais preferencialmente ainda, no aspecto ‘Forma 3’, a forma cristalina do composto (I) exibe um reflexo, indicado como um valor 2θ, a 17,8 ± 0,1°, em um padrão de difração de pó de raio X, em que o reflexo em 17,8 ± 0,1° é um dos quatro reflexos mais fortes no padrão de difração de pó de raio X. De preferência, o reflexo a 17,8 ± 0,1° é um dos três reflexos mais fortes no padrão de difração de pó de raio X ou em que o reflexo a 17,8 ± 0,1° é um dos dois reflexos mais fortes no padrão de difração de pó de raio X. Mais preferencialmente, o reflexo a 17,8 ± 0,1° é o reflexo mais
[0047] O termo “reflexo mais forte” descreve o pico mais alto de um padrão de difração de pó de raio X. A altura de um pico de um padrão de difração de pó de raio X é determinada com base na intensidade de raio X (em contagens ou unidades de contagens/s). Assim, o reflexo mais forte é um reflexo que mostra a maior intensidade de raio X no padrão de difração de pó de raio X. Por exemplo, o reflexo mais forte do padrão de difração de raio X mostrado na Figura 6A é o reflexo, indicada como um valor 2D, a 17,8 ± 0,2°.
[0048] Salvo indicação explícita em contrário, todos os padrões de difração de pó de raio X são determinados com o uso de radiação K-alfa de cobre a cerca de 25 °C.
[0049] De preferência, no aspecto ‘Forma 3’, a forma cristalina do composto (I) exibe ainda um ou mais reflexos, indicados como um valor 2, em um ou mais dentre 4,1 ± 0,2°, 8,3 ± 0,2°, 12,4 ± 0,2°, 13,6 ± 0,2°, 14,5 ± 0,2°, 14,9 ± 0,2°, 15,2 ± 0,2°, 17,2 ± 0,2°, 19,3 ± 0,2°, 21,2 ± 0,2°, 22,4 ± 0,2°, 22,9 ± 0,2° e 23,3 ± 0,2° em um padrão de difração de pó de raio X. Mais preferencialmente ainda, no aspecto ‘Forma 3’, a forma cristalina do composto (I) exibe ainda um ou mais reflexos, indicados como um valor 2, em um ou mais dentre 4,1 ± 0,1°, 8,3 ± 0,1°, 12,4 ± 0,1°, 13,6 ± 0,1°, 14,5 ± 0,1°, 14,9 ± 0,1°, 15,2 ± 0,1°, 17,2 ± 0,1°, 19,3 ± 0,1°, 21,2 ± 0,1°, 22,4 ± 0,1°, 22,9 ± 0,1° e 23,3 ±
[0050] As posições dos picos dos espectros de difração de pó de raio X são relativamente insensíveis aos detalhes experimentais. Assim, os compostos cristalinos da invenção podem ser caracterizados por um padrão de difração de pó de raio X com certas posições de pico. Consequentemente, no aspecto ‘Forma 3’, a forma cristalina do composto (I) é preferencialmente caracterizada por reflexos, indicados como um valor 2, a 17,2 ± 0,2°, 17,8 ± 0,2°, 21,2 ± 0,2° e 22,4 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X. Mais preferencialmente, no aspecto ‘Forma 3’, a forma cristalina do composto (I) é caracterizada por reflexos, indicados como um valor 2θ, a 4,1 ± 0,2°, 8,3 ± 0,2°, 12,4 ± 0,2°, 13,6 ± 0,2° 14,5 ± 0,2°, 14,9 ± 0,1°, 15,2 ± 0,2°, 17,2 ± 0,2°, 17,8 ± 0,2°, 19,3 ± 0,2°, 21,2 ± 0,2°, 22,4 ± 0,2°, 22,9 ± 0,2° e 23,3 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X. Mais preferencialmente ainda, no aspecto ‘Forma 3’, a forma cristalina do composto (I) é caracterizada por reflexos, indicados como um valor 2, a 17,2 ± 0,1°, 17,8 ± 0,1°, 21,2 ± 0,1° e 22,4 ± 0,1°, em um padrão de difração de pó de raio X. Com a maior preferência, no aspecto ‘Forma 3’, a forma cristalina do composto (I) é caracterizada por reflexos, indicados como um valor 2θ, a 4,1 ± 0,1°, 8,3 ± 0,1°, 12,4 ± 0,1°, 13,6 ± 0,1°, 14,5 ± 0,1°, 14,9 ± 0,1°, 15,2 ± 0,1°, 17,2 ± 0,1°, 17,8 ± 0,1°, 19,3 ± 0,1°, 21,2 ±
[0051] As formas cristalinas de um composto podem ser caracterizadas por um termograma de calorimetria de varredura diferencial (DSC). Assim, a forma cristalina do composto (I), no aspecto ‘Forma 3’, é preferencialmente caracterizada por um termógrafo DSC, que mostra um início de fluxo de calor endotérmico a cerca de 87 °C e/ou um ponto de fusão de cerca de 92,4 °C, conforme observado na Figura 8C. Consequentemente, preferencialmente, no aspecto ‘Forma 3’, a forma cristalina do composto (I) tem um ponto de fusão de 89 °C a 96 °C, conforme determinado por DSC. De preferência, a forma cristalina, no aspecto ‘Forma 3’, tem um ponto de fusão de 90 °C a 95 °C, conforme determinado por DSC. Mais preferencialmente ainda, a forma cristalina do composto (I), no aspecto ‘Forma 3’, tem um ponto de fusão de 91 °C a 94 °C, conforme determinado por DSC. Com a maior preferência, a forma cristalina do composto (I), no aspecto ‘Forma 3’, tem um ponto de fusão de 92 °C a 93 °C, conforme determinado por DSC.
[0052] As formas cristalinas de um composto podem ser caracterizadas por sua higroscopicidade. A higroscopicidade de um produto expressa o aumento ou diminuição do seu teor de água em função da umidade relativa a uma determinada temperatura. Produtos substancialmente não higroscópicos não exibem nenhuma ou apenas uma pequena alteração em seu teor de água como consequência de variações na umidade relativa. Em produtos fortemente higroscópicos, o teor de água pode variar muito. Consequentemente, de preferência a forma cristalina do composto (I) é substancialmente não higroscópica.
[0053] As formas cristalinas de um composto podem ser caracterizadas pelo seu traço termogravimétrico. Assim, de preferência, a forma cristalina do composto (I) pode ser caracterizada pelo seu traço termogravimétrico. Em uma modalidade, o cristalino do composto (I) é caracterizado pelo traço termogravimétrico representado na Figura 8A ou na Figura 8B.
[0054] As formas cristalinas de um composto também podem ser caracterizadas por seu perfil de sorção dinâmica de vapor (Dynamic Vapour Sorption - DVS). Consequentemente, a forma cristalina do composto (I) pode ser preferencialmente caracterizada pelo seu perfil de DVS, como visto nas Figuras 9A e 9B. De preferência, a forma cristalina do composto (I) tem um perfil reversível de sorção/dessorção. De preferência, o perfil DVS mostra a natureza substancialmente não higroscópica da forma cristalina.
[0055] Substâncias substancialmente não higroscópicas apresentam uma absorção de água inferior a cerca de 2 % a uma umidade relativa de cerca de 95 % medida a uma temperatura de cerca de 25 °C. Preferencialmente, absorção de água é menos que cerca de 1 % a uma umidade relativa de cerca de 95 % medida a uma temperatura de cerca de 25 °C. Os valores de absorção de água são obtidos medindo-se o ganho em massa da forma cristalina testada a uma umidade relativa de cerca de 95 % e uma temperatura de cerca de 25 °C em relação à massa inicial.
[0056] Consequentemente, a forma cristalina do composto (I) absorve preferencialmente 0 % a 2 % de água a uma umidade relativa de cerca de 95 % a uma temperatura de cerca de 25 °C. Mais preferencialmente ainda, a forma cristalina do composto (I) absorve 0 % a 1,5 % de água a uma umidade relativa de cerca de 95 % a uma temperatura de cerca de 25 °C. Com a maior preferência, a forma cristalina do composto (I) absorve 0 % a 1 % de água a uma umidade relativa de cerca de 95 % a uma temperatura de cerca de 25 °C.
[0057] Adicionalmente, a forma cristalina da presente invenção é preferencialmente estável. Por exemplo, a incubação prolongada em acetato de etila (1 semana) a cerca de 25 0C produziu formas cristalinas do composto (I) de boa qualidade, conforme mostrado na Figura 5.
[0058] Em um aspecto de ‘Forma 2’, a presente invenção fornece uma outra forma cristalina do composto (I). Esta forma cristalina (Forma 2) exibe um reflexo, indicado como um valor 2θ, em 16,9 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X, em que o reflexo em 16,9 ± 0,2° é um dos quatro reflexos mais fortes no padrão de difração de pó de raio X. De preferência, o reflexo a 16,9 ± 0,2° é um dos três reflexos mais fortes no padrão de difração de pó de raio X ou em que o reflexo a 16,9 ± 0,2° é um dos dois reflexos mais fortes no padrão de difração de pó de raio X. Mais preferencialmente, o reflexo a 16,9 ± 0,2° é o reflexo mais forte no padrão de difração de pó de raio X. Mais preferencialmente ainda, a forma cristalina, no aspecto ‘Forma 2’, exibe um reflexo, indicado como um valor de 2θ, a 16,9 ± 0,1°, em um padrão de difração de pó de raio X, em que o reflexo em 16,9 ± 0,1° é um dos quatro reflexos mais fortes no padrão de difração de pó de raio X. De preferência, o reflexo a 16,9 ± 0,1° é um dos três reflexos mais fortes no padrão de difração de pó de raio X ou em que o reflexo a 16,9 ± 0,1° é um dos dois reflexos mais fortes no padrão de difração de pó de raio X. Mais preferencialmente, o reflexo a 16,9 ± 0,1° é o reflexo mais forte no padrão de difração de pó de raio X.
[0059] De preferência, a forma cristalina do composto (I), no aspecto ‘Forma 2’, exibe um ou mais reflexos, indicados como um valor 2θ, em um ou mais dentre 15,2 ± 0,2°, 16,1 ± 0,2°, 16,5 ± 0,2°, 18,9 ± 0,2°, 23,1 ± 0,2°, 25,5 ± 0,2°, 27,7 ± 0,2° e 28,5 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X. Mais preferencialmente ainda, no aspecto ‘Forma
[0060] Esta forma cristalina do composto (I), no aspecto ‘Forma 2’, também pode ser caracterizada por reflexos, indicados como um valor 2θ, a 16,1 ± 0,2°, 16,5 ± 0,2°, 16,9 ± 0,2°, 18,9 ± 0,2° e 23,1 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X. Preferencialmente, a forma cristalina do composto (I), no aspecto ‘Forma 2’, também pode ser caracterizada por reflexos, indicados como um valor 2θ, a 16,1 ± 0,1°, 16,5 ± 0,1°, 16,9 ± 0,1°, 18,9 ± 0,1° e 23,1 ± 0,1°, em um padrão de difração de pó de raio X.
[0061] A forma cristalina do composto (I), no aspecto ‘Forma 2’, pode ser caracterizada por um termógrafo DSC que mostra um início de fluxo de calor endotérmico em cerca de 58 °C e um ponto de fusão de cerca de 70 °C, conforme observado na Figura 3B. Consequentemente, a forma cristalina do composto (I), no aspecto ‘Forma 2’, tem um ponto de fusão de 67 °C a 74 °C. De preferência, a forma cristalina do composto (I), no aspecto ‘Forma 2’, tem um ponto de fusão de 68 °C a 73 °C. Mais preferencialmente ainda a forma cristalina do composto (I), no aspecto ‘Forma 2’, tem um ponto de fusão de 69 °C a 72 °C. Com a maior preferência, a forma cristalina do composto (I), no aspecto ‘Forma 2’, tem um ponto de fusão de 69 °C a 71 °C.
[0062] Os inventores do presente pedido constataram surpreendentemente que a forma cristalina do composto (I), no aspecto ‘Forma 2’, é particularmente solúvel em água. Consequentemente, preferencialmente a forma cristalina do composto (I), no aspecto ‘Forma 2’, tem solubilidade em água de cerca de 75 mg/ml a cerca de 85 mg/ml, medida a cerca de 25 °C. Mais preferencialmente, a forma cristalina, no aspecto ‘Forma 2’, tem solubilidade em água de cerca de 78 mg/ml a cerca de 82 mg/ml, medida a cerca de 25 °C. Com a maior preferência, a forma cristalina do composto (I), no aspecto ‘Forma 2’, tem solubilidade em água de cerca de 80 mg/ml, medida a cerca de 25 °C.
[0063] Os métodos para medir a solubilidade são conhecidos na técnica; por exemplo, método de frasco agitado, sonicação, método de eluição em coluna e método de espectroscopia ultravioleta ou visível. Salvo indicação explícita em contrário, a solubilidade em água é determinada com o uso do método do frasco agitado e/ou sonicação.
[0064] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende a forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento.
[0065] Tipicamente, a forma cristalina do composto (I) é administrada a um paciente na forma de uma composição ou formulação farmacêutica. Tais composições farmacêuticas
[0066] As composições farmacêuticas da invenção são tipicamente preparadas por carreadores farmaceuticamente aceitáveis e um ou mais ingredientes opcionais. Se necessário ou desejado, a mistura uniformemente misturada resultante pode então ser conformada ou carregada em comprimidos, cápsulas, pílulas, vasilhas, cartuchos, dispensadores e similares com o uso de procedimentos e equipamentos convencionais.
[0067] Quando destinadas à administração oral em uma forma de dosagem sólida (isto é, como cápsulas, comprimidos, pílulas e semelhantes), as composições farmacêuticas da invenção compreenderão tipicamente uma forma cristalina do composto (I) como ingrediente ativo. De preferência, a composição farmacêutica da invenção compreende uma forma cristalina do composto (I) e nenhum outro ingrediente. De preferência, a composição farmacêutica da invenção está contida em uma cápsula. De preferência, a composição farmacêutica da invenção está contida na cápsula sem qualquer outro ingrediente. A cápsula pode ser uma cápsula de gelatina ou uma cápsula de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). Alternativamente, a composição farmacêutica da invenção pode compreender uma forma cristalina do composto (I) como ingrediente ativo e um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados seriam conhecidos pelos especialistas no assunto da técnica, por exemplo, gorduras, água, soro fisiológico, álcool (por exemplo, etanol), glicerol, polióis, solução aquosa de glicose, agente de extensão, agente desintegrante, aglutinante, lubrificante, agente umectante, estabilizante, emulsificante, dispersante, conservante, adoçante, corante, agente de tempero ou aromatizador, agente de concentração, diluente, substância tampão, solvente ou agente de solubilização, produto químico para alcançar o efeito de armazenamento, sal para modificar a pressão osmótica, agente de revestimento ou antioxidante, sacarídeos como lactose ou glicose; amido de milho, trigo ou arroz; ácidos graxos tais como ácido esteárico; sais inorgânicos tais como aluminato metassilicato de magnésio ou fosfato de cálcio anidro; polímeros sintéticos tais como polivinilpirrolidona ou polialquilenoglicol; álcoois como álcool estearílico ou álcool benzílico; derivados de celulose sintéticos tais como metilcelulose, carboximetilcelulose, etilcelulose ou hidroxipropilmetilcelulose; e outros aditivos usados convencionalmente, como gelatina, talco, óleo vegetal e goma arábica.
[0068] A composição farmacêutica que compreende as formas cristalinas do composto (I) também pode ser administrada por via transdérmica ou transmucosa usando sistemas de distribuição e excipientes conhecidos. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser misturada com intensificadores de permeação, tais como propilenoglicol, monolaurato de polietilenoglicol, azacicloalcan-2-onas e semelhantes, e incorporada em um emplastro ou sistema de distribuição similar. Excipientes adicionais, incluindo agentes gelificantes, emulsificantes e tampões, também podem ser usados.
[0069] As injeções para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Solventes aquosos incluem, por exemplo, água destilada para injeção e/ou soro fisiológico. Exemplos de solventes não aquosos incluem álcoois, como etanol.
[0070] De preferência, a composição farmacêutica compreende um ou mais agentes farmaceuticamente ativos adicionais. Esta terapia de combinação envolve o uso de uma forma cristalina do composto (I) combinado com um ou mais dos agentes farmaceuticamente ativos adicionais, formulados em conjunto (por exemplo, acondicionados juntos em uma única formulação) ou formulados separadamente (por exemplo, acondicionados como formas de dosagem unitária separadas).
[0071] Em um indivíduo saudável, o núcleo glicoesfingolipídio, glicosilceramida, é hidrolisado nos lisossomos pela glicosilceramidase ácida (também denominada de glicocerebrosidase ou GBA1, EC 3.2.1.45, código UniProt: P04062). Além disso, a glicosilceramidase não lisossomal (GBA2, código UniProt: Q9HCG7) que reside no citoplasma também é capaz de processar a glicosilceramida. Como resultado, tanto GBA1 quanto GBA2 estão envolvidos em efeitos neuropatológicos observados em vários distúrbios de armazenamento lisossômico.
[0072] Em pacientes com distúrbio de armazenamento lisossomal, ocorrem defeitos na biossíntese ou degradação de glicoesfingolipídios, resultando em níveis anormais de glicosilceramida e/ou outros glicoesfingolipídios.
[0073] O composto (I) foi mostrado anteriormente (no documento WO2015/147639 A1) para ser eficaz no tratamento de doenças que estão associadas a níveis irregulares de glicosilceramida citosólica ou lisossomal e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídio. Como a biodisponibilidade das formas cristalinas do composto (I) é comparável à biodisponibilidade do composto amorfo (I), as formas cristalinas do composto (I) também são eficazes no tratamento de doenças associadas a níveis anormais de glicosilceramida celular e/ou superior níveis de glicoesfingolipídios. Em particular, as formas cristalinas do composto (I) são eficazes no tratamento de doenças que estão associadas a níveis anormais de glicosilceramida citosólica ou lisossomal e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídio.
[0074] Conforme mostrado no Exemplo 4, a forma cristalina do composto (I) (Forma 3) é eficaz no tratamento de doenças que estão associadas a níveis irregulares de glicosilceramida citosólica ou lisossomal e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídio. Especificamente, a Forma 3 demonstrou melhorar os sinais clínicos em camundongos tipo C da doença de Niemann-Pick.
[0075] Consequentemente, a presente invenção fornece a forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento, para uso em terapia.
[0076] A presente invenção também fornece a forma cristalina conforme descrito no presente documento, ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento, para uso como um medicamento.
[0077] De preferência, a presente invenção fornece a forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento, para uso no tratamento de uma doença que envolve níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios. De preferência, a doença que envolve níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios é uma doença de armazenamento lisossomal, como a doença de Gaucher (tipo 1, 2 e 3), doença de Fabry, gangliosidoses GM1, gangliosidoses GM2 (como doença de Tay-Sachs, doença de Sandhoff e variante AB), sialidose, doença de Niemann-Pick tipo C e síndrome de insuficiência renal de mioclonia de ação, ou um sintoma de uma das doenças coletivamente classificadas como síndrome metabólica, como obesidade, resistência à insulina, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, doença renal policística, diabetes tipo II e inflamação crônica ou um distúrbio neurodegenerativo, como doença de Parkinson ou demência por corpos de Lewy ou aterosclerose. Mais preferencialmente ainda, a forma cristalina do composto (I), ou a composição farmacêutica que compreende a forma cristalina do composto (I) são úteis no tratamento de gangliosidoses GM1 e/ou gangliosidoses GM2 (tais como doença de Tay-Sachs, doença de Sandhoff e a variante AB).
[0078] Mais preferencialmente ainda, a presente invenção fornece a forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento, para uso no tratamento da doença de Niemann-Pick tipo C.
[0079] A presente invenção fornece a forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento, para uso no tratamento da doença de Sandhoff.
[0080] A presente invenção fornece um método de tratamento de uma doença que envolve níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios em pacientes humanos ou animais, que compreende a administração a um paciente com necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento.
[0081] A presente invenção fornece a forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento, para uso no alívio dos sintomas de uma doença que envolve níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios.
[0082] Mais preferencialmente ainda, a presente invenção fornece a forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento, para uso no alívio dos sintomas da doença de Niemann-Pick tipo C.
[0083] A presente invenção fornece a forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento, para uso no alívio dos sintomas da doença de Sandhoff.
[0084] A presente invenção fornece um método para aliviar os sintomas de uma doença que envolve níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios em pacientes humanos ou animais, que compreende a administração a um paciente com necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da forma cristalina do composto (I) conforme descrito no presente documento ou a composição farmacêutica conforme descrita no presente documento.
[0085] A forma cristalina do composto (I) (por exemplo, Forma 3) pode ser usada para melhorar diferentes sinais clínicos, por exemplo: 1) perda de peso associada à doença; 2) tremor; e/ou 3) marcha atáxica.
[0086] Conforme mostrado no Exemplo 4, a forma cristalina do composto (I) (por exemplo, Forma 3) penetra eficientemente no cérebro. Assim, a forma cristalina do composto (I) (por exemplo, Forma 3) pode ser usada para tratar ou aliviar uma doença ou sintomas de doença que se originam no cérebro. Por exemplo, a forma cristalina do composto (I) (por exemplo, Forma 3) pode ser usada para prevenir ou reduzir a perda de células de Purkinje cerebelar. A forma cristalina do composto (I) (por exemplo, Forma 3) pode ser usada para prevenir ou reduzir a morte neuronal. A
[0087] A alta eficácia da forma cristalina do composto (I) no tratamento de doenças que envolvem níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios é entendida como resultado da alta potência da forma cristalina do composto (I) em relação à glicosilceramida sintase (GCS) e a glicosilcerebrosidase não lisossomal (GBA2).
[0088] Os métodos descritos no presente documento podem ser métodos in vitro ou métodos in vivo.
[0089] A administração pode ser alcançada por administração oral por meio de comprimidos, pílulas, cápsulas, grânulos, pós, soluções e semelhantes, ou administração parenteral, como injeções, como injeções intra-articulares, intravenosas e intramusculares, supositórios, soluções oftálmicas, pomadas ou agentes para uso externo, tais como preparações líquidas transdérmicas, pomadas, emplastros transdérmicos, preparações líquidas transmucosas, emplastros transmucosos, inaladores e semelhantes.
[0090] Na administração oral, a dose diária é geralmente de cerca de 0,0001 a 10 mg/kg, preferencialmente de 0,001 a 1 mg/kg, ou de 0,005 a 5 mg/kg, e mais preferencialmente de 0,01 a 0,5 mg/kg, por peso corporal, administrado em uma porção ou em 2 a 4 porções separadas. Por exemplo, para um paciente humano de 70 kg, a dose diária ideal para administração oral é de cerca de 0,01-30 mg/dia. No caso de administração intravenosa, a dose diária é adequadamente administrada de cerca de 0,00001 a 10 mg/kg por peso corporal, uma vez ao dia ou duas ou mais vezes ao dia. Além disso, um agente transmucoso é administrado em uma dose de cerca de 0,0001 a 10 mg/kg por peso corporal, uma vez ao dia ou duas ou mais vezes ao dia. A dose é apropriadamente decidida em resposta ao caso individual, levando em consideração os sintomas, a idade, o sexo e similares.
[0091] Visto que a potência da forma cristalina do composto (I) no tratamento de uma doença que envolve níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios (por exemplo, doença de Niemann-Pick tipo C) é muito alta e a dose necessária relativamente baixa, a forma cristalina do composto (I) produz menos efeitos colaterais do que compostos conhecidos para o tratamento de tais doenças, por exemplo Miglitol (dose 1200 mg/kg/dia).
[0092] A presente invenção também fornece um processo de preparação da forma cristalina conforme descrito no presente documento, que compreende colocar uma amostra do composto (I) em contato com um solvente. De preferência, o solvente é selecionado a partir de acetonitrila, acetato de etila, isopropanol, anisol, água e éter terc-butilmetílico (TBME). Mais preferencialmente ainda, o solvente é acetato de etila, acetonitrila ou isopropanol. De preferência, antes de contactar a amostra do composto (I) com o solvente, a amostra do composto (I) é purificada para remover os ésteres de borato. De preferência, a amostra do composto (I) é purificada com o uso de cromatografia. Mais preferencialmente ainda, a amostra do composto (I) é purificada com o uso de uma coluna de cromatografia em sílica gel. Adicionalmente, e/ou alternativamente a amostra do composto (I) é purificada por destilação com metanol.
[0093] A forma cristalina da Forma 3 do composto (I) pode ser obtida por qualquer um dentre os seguintes métodos exemplificativos:
[0094] 1)Agitar uma mistura de cerca de 74 mg do composto (I) e 2,0 ml de acetonitrila durante três dias a uma temperatura na faixa de 20 °C a 30 °C, por exemplo, cerca de 25 °C, depois filtrar para obter a forma cristalina do composto (I); 2) Agitar uma mistura de cerca de 74 mg do composto (I) e 2,0 ml de anisol durante três dias a uma temperatura na faixa de 20 °C a 30 °C, por exemplo, cerca de 25 °C, em seguida filtrar para obter a forma cristalina do composto (I); 3) Agitar uma mistura de cerca de 82 mg do composto (I) e 4) Agitar uma mistura de cerca de 82 mg do composto (I) e 1,0 ml de isopropanol durante três dias a uma temperatura na faixa de 20 °C a 30 °C, por exemplo, cerca de 25 °, em seguida filtrar para obter a forma cristalina do composto (I); 5) Agitar uma mistura de cerca de 45 mg do composto (I) e 1,0 ml de água durante três dias a uma temperatura na faixa de 20 °C a 30 °C, por exemplo, cerca de 25 °, em seguida filtrar para obter a forma cristalina do composto (I); 6) Agitar uma mistura de cerca de 100 mg do composto (I) e 3,0 ml de TBME durante três dias a uma temperatura na faixa de 20 °C a 30 °C, por exemplo, cerca de 25 °, em seguida filtrar para obter a forma cristalina do composto (I).
[0095] De preferência, antes de misturar o composto (I) com o solvente, a amostra do composto (I) é purificada para remover os ésteres de borato. De preferência, a amostra do composto (I) é purificada com o uso de cromatografia. Mais preferencialmente ainda, a amostra do composto (I) é purificada com o uso de uma coluna de cromatografia em sílica
[0096] Os métodos de filtragem são conhecidos pelos especialistas no assunto da técnica e incluem, porém sem limitação, filtragem de papel e filtragem de vidro sinterizado.
[0097] Os métodos de produção da Forma 3 do composto (I) descritos no presente documento podem ser realizados em larga escala mantendo uma razão semelhante de reagentes usados. Por exemplo, a forma cristalina da Forma 3 do composto (I) pode ser obtida agitando-se uma mistura do composto (I) com acetato de etila em uma razão entre 0,05-1 g a 1 ml [composto (I) para acetato de etila] para três dias a uma temperatura na faixa de 20 °C a 30 °C, por exemplo, cerca de 25 °C, em seguida filtrar para obter a forma cristalina do composto (I).
[0098] Os métodos para obter a Forma 3 do composto (I) descritos no presente documento são muito eficientes. O rendimento dos métodos descritos no presente documento é tipicamente maior que 70 % (como uma razão em peso da quantidade de Forma 3 obtida para a quantidade do composto (I) inicialmente usada). De preferência, o rendimento dos métodos descritos no presente documento é maior que 75 %.
[0099] De preferência, a forma cristalina da Forma 2 é formada como um intermediário, antes da formação da forma cristalina da Forma 3.
[00100] De preferência a forma cristalina da Forma 2 caracterizada por reflexos, indicados como um valor 2θ, em 16,1 ± 0,2°, 16,5 ± 0,2°, 16,9 ± 0,2°, 18,9 ± 0,2° e 23,1 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X é formado como um intermediário, antes da formação da forma cristalina da Forma 3 caracterizada por reflexos, indicados como um valor 2θ, em 17,2 ± 0,2°, 17,8 ± 0,2°, 21,2 ± 0,2° e 22,4 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X.
[00101] A presente invenção também fornece uma forma cristalina do composto (I) obtido realizando-se o processo conforme descrito no presente documento.
[00102] A presente invenção também fornece o uso da base livre do composto (I) para preparar uma forma cristalina do composto (I).
[00103] A presente invenção também fornece um processo de preparação da forma cristalina do composto (I) que compreende a cristalização da base livre do composto (I).
[00104] A presente invenção também fornece uma forma cristalina do composto (I) obtida pelo processo de preparação da forma cristalina do composto (I) que compreende a cristalização da base livre do composto (I).
[00105] Dentre outras vantagens, pensa-se que formar uma forma cristalina do composto (I) é útil para purificar
[00106] A descrição detalhada anterior foi fornecida a título de explicação e ilustração e não se destina a limitar o escopo das reivindicações anexas. Muitas variações nas modalidades presentemente preferenciais ilustradas no presente documento serão evidentes para uma pessoa de habilidade comum na técnica e permanecerão dentro do escopo das reivindicações anexas e seus equivalentes.
[00107] A invenção é ainda revelada nas seguintes cláusulas: 1. Uma forma cristalina do composto (I), 2. A forma cristalina, da cláusula 1, em que a forma cristalina é uma base livre cristalina. 3. A forma cristalina, da cláusula 1 ou cláusula 2, em que a forma cristalina exibe um reflexo, indicado como um valor de 2θ, a 17,8 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X, em que o reflexo a 17,8 ± 0,2° é um dos quatro 4. A forma cristalina, da cláusula 3, em que exibe ainda um ou mais reflexos, indicados como um valor 2θ, em um ou mais dentre 4,1 ± 0,2°, 8,3 ± 0,2°, 12,4 ± 0,2°, 13,6 ± 0,2°, 14,5 ± 0,2°, 14,9 ± 0,2°, 15,2 ± 0,2°, 17,2 ± 0,2°, 19,3 ± 0,2°, 21,2 ± 0,2°, 22,4 ± 0,2°, 22,9 ± 0,2° e 23,3 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X. 5. A forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 1 a 4, caracterizada por reflexos, indicados como um valor 2θ, a 17,2 ± 0,2°, 17,8 ± 0,2°, 21,2 ± 0,2° e 22,4 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X. 6. A forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 1 a 5, que tem um ponto de fusão de 89 °C a 96 °C. 7. A forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 1 a 6, que tem um ponto de fusão de 92 °C a 93 °C. 8. A forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 1 a 7, em que a forma cristalina é substancialmente não higroscópica. 9. A forma cristalina, da cláusula 1 ou cláusula 2, em que a forma cristalina exibe um reflexo, indicado como um valor de 2θ, a 16,9 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X, em que o reflexo a 16,9 ± 0,2° é um dos quatro reflexos mais fortes no padrão de difração de pó de raio X. 10. A forma cristalina da cláusula 9, que exibe ainda um ou mais reflexos, indicados como um valor 2θ, em um ou 11. A forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 1, 2, 9 ou 10 caracterizada por reflexos, indicados como um valor 2θ, a 16,1 ± 0,2°, 16,5 ± 0,2°, 16,9 ± 0,2°, 18,9 ± 0,2° e 23,1 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X. 12. A forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 9 a 11, que tem um ponto de fusão de 67 °C a 74 °C. 13. A forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 9 a 12, que tem um ponto de fusão de 69 °C a 71 °C. 14. A forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 9 a 13, que tem solubilidade em água de 75 mg/ml a 85 mg/ml. 15. Uma composição farmacêutica que compreende a forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 1 a 14. 16. A composição farmacêutica da cláusula 15, em que a composição farmacêutica está contida em uma cápsula. 17. A composição farmacêutica da cláusula 16, em que a composição farmacêutica está contida na cápsula sem qualquer outro ingrediente. 18. A composição farmacêutica da cláusula 15 ou cláusula 16, que compreende pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável. 19. A forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 1 20. A forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 1 a 14 ou a composição farmacêutica de qualquer uma das cláusulas 15 a 18, para uso como um medicamento. 21. A forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 1 a 14 ou a composição farmacêutica de qualquer uma das cláusulas 15 a 18, para uso no tratamento de uma doença que envolve níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios. 22. A forma cristalina ou a composição farmacêutica para uso da cláusula 21, em que a doença que envolve níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios, é uma doença de armazenamento lisossomal, tal como doença de Gaucher, doença de Fabry, Gangliosidoses GM1, gangliosidoses GM2 (como doença de Tay- Sachs, doença de Sandhoff e variante AB), sialidose, doença de Niemann-Pick tipo C e síndrome de insuficiência renal de mioclonia de ação, ou um sintoma de uma das doenças coletivamente classificadas como síndrome metabólica, tais como obesidade, resistência à insulina, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, doença renal policística, diabetes tipo II e inflamação crônica, ou um distúrbio neurodegenerativo, como doença de Parkinson ou demência por corpos de Lewy ou aterosclerose. 24. Um método de tratamento de uma doença que envolve níveis anormais de glicosilceramida e/ou níveis mais elevados de glicoesfingolipídios em pacientes humanos ou animais, que compreende a administração a um paciente com necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 1 a 14 ou a composição farmacêutica de qualquer uma das cláusulas 15 a 18. 25. Um processo de preparação da forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 1 a 8, que compreende colocar uma amostra do composto (I) em contato com um solvente. 26. O processo da cláusula 25, em que o solvente é selecionado a partir de acetonitrila, acetato de etila, isopropanol, anisol, água e éter terc-butil metílico (TBME). 27. O processo da cláusula 25 ou cláusula 26, em que, antes de colocar a amostra do composto (I) em contato com o solvente, a amostra do composto (I) é purificada. 28. O processo da cláusula 27, em que a amostra do composto (I) é purificada com o uso de cromatografia. 29. O processo da cláusula 28, em que a amostra do composto (I) é purificada com o uso de cromatografia em coluna de sílica gel. 30. O processo de qualquer uma das cláusulas 27 a 29, em que, após purificação, a amostra do composto (I) está livre de ésteres de borato. 31. O processo de qualquer uma das cláusulas 25 a 30, em que a forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 9 a 14 é formada como um intermediário, antes da formação da forma cristalina de qualquer uma das cláusulas 1 a 8. 32. Uma forma cristalina do composto (I) obtida realizando-se o processo de qualquer uma das cláusulas 25 a 31. 33. Uso da base livre do composto (I) para preparar uma forma cristalina. 34. Um processo de preparação de uma forma cristalina do composto (I) que compreende a cristalização da base livre do composto (I). 35. Uma forma cristalina do composto (I) obtida pelo processo da cláusula 34. 36. Um processo de preparação de uma forma cristalina do composto (I) que compreende as etapas de: i. adicionar composto (I) a uma coluna de purificação para produzir uma amostra purificada do composto (I); ii. adicionar um solvente à amostra purificada do composto (I) para produzir uma suspensão do composto (I) no solvente; 1. . separar a forma cristalina do composto (I) para produzir uma amostra pura da forma cristalina do composto (I). 37. O processo da cláusula 36, em que a amostra purificada do composto (I) está livre de ésteres de borato. 38. O processo da cláusula 36 ou 37, em que o solvente é selecionado a partir de acetonitrila, acetato de etila, isopropanol, anisol, água e éter terc-butil metílico (TBME). 39. O processo de qualquer uma das cláusulas 36 a 38, em que a etapa ii é realizada a uma temperatura entre 25 a 35 °C. 40. O processo de qualquer uma das cláusulas 36 a 39, em que a agitação na etapa (iii) é realizada a uma temperatura entre 20 a 35 °C. 41. O processo de qualquer uma das cláusulas 36 a 40, em que a agitação na etapa (iii) é realizada por pelo menos 1 hora. 42. O processo da cláusula 41, em que a agitação na etapa (iii) é realizada por pelo menos 16 horas.
[00108] A calorimetria de varredura diferencial (DSC) foi realizada com um instrumento TA Instruments Q2000 (panela de alumínio fechada ou panela de amostra de alumínio com um (Alemanha). Cerca de 5 mg a 20 mg de amostra foram colocados em uma panela de amostra de alumínio. Taxas de mudança de umidade de 5 % por hora foram usadas. O programa de medição aplicado pode ser descrito da seguinte forma: A amostra foi colocada em um retentor de alumínio ou platina na parte superior de uma microbalança e equilibrada a uma umidade relativa (UR) de 50 % antes de iniciar os programas de umidade predefinidos: (1) 2 h a 50 % de UR (2) 50 ^ 0 % de UR (5 %/h); 5 h a 0 % de UR (3) 0 ^ 95 % de UR (5 %/h); 5 h a 95 % de UR (4) 95 ^ 0 % de UR (5 %/h); 5 h a 0 % de UR (5) 0 ^ 95 % de UR (5 %/h); 5 h a 95 % de UR (6) 95 ^ 50 % de UR (5 %/h); 2 h a 50 % de UR
[00109] A difração de pó de raio X foi realizada com um difratômetro Stoe Stadi P equipado com um detector Mythen1K operando com radiação Cu-Kα1. As medições com este instrumento foram realizadas em transmissão a uma tensão de tubo de 40 kV e potência de tubo de 40 mA. Um monocromador Ge curvo permite testes com radiação Cu-K α1. Os seguintes parâmetros foram definidos: Tamanho da etapa de 0,02° 2θ, tempo de etapa de 12 s, faixa de varredura de 1,5-50,5° 2θ e etapa do detector de 1°2θ (modo do detector na varredura da etapa). Para uma preparação de amostra típica, cerca de 10 mg de amostra foram colocados entre duas folhas de acetato e montados em um retentor de amostra de transmissão Stoe. A amostra foi rotacionada durante a medição. Toda a preparação e medição da amostra foi feita em uma atmosfera de ar ambiente (cerca de 25 °C).
[00110] As solubilidades aproximadas foram determinadas por adição incremental de solvente a cerca de 10 mg do composto e subsequente agitação e/ou sonicação por um curto período de tempo. Se a substância não foi dissolvida pela adição de um total de pelo menos 10 ml de solvente, a solubilidade é indicada como < 1 mg/ml. Os experimentos foram conduzidos a cerca de 25 °C.
[00111] As medições termogravimétricas (TG-FTIR) foram realizadas com um Netzsch Thermo-Microbalance TG 209 acoplado a um Bruker FTIR Spectrometer Vector 22 (panelas de amostra com furo de alfinete, atmosfera de N2, taxa de aquecimento 10 °C/min).
[00112] Os seguintes exemplos não limitativos ilustram ainda mais a presente invenção.
[00113] Um programa de triagem de sal de alto rendimento para o composto (I) foi realizado com 16 formadores de sal diferentes identificados na Tabela 1 sob seis condições diferentes na tentativa de obter uma forma cristalina do composto (I).
[00114] Os experimentos iniciais de triagem foram realizados adicionando-se uma solução 0,05 M do composto (I) em acetona em cada poço de uma placa de 96 microtitulação de quartzo seguido pela adição das soluções estoque formador de sal na concentração de 0,1 M. Os solventes foram evaporados de cada poço sob um fluxo de nitrogênio à temperatura ambiente. Os resíduos sólidos nos poços foram investigados por microscopia de luz polarizada.
Tabela 1. Ácidos Selecionados para o Programa de Triagem de Sal
[00115] Embora o objetivo desses experimentos iniciais fosse obter uma razão de 1:1 do composto (I) para um formador de sal, investigações de microscopia de luz revelaram algumas condições experimentais adequadas para a formação de formas cristalinas. Por exemplo, o composto (I) misturado com ácido benzenossulfônico, ácido clorídrico, ácido DL-mandélico, ácido L-tartárico, ácido fosfórico e ácido sulfúrico formaram resíduos cristalinos.
[00116] Em outro experimento de triagem, seis sistemas de solventes foram selecionados, a saber, acetona, acetonitrila, acetato de etila, etanol, uma mistura de isopropanol-água (3:1) e uma mistura de acetona/água (9:1). 200 μL de solvente foram adicionados ao resíduo em cada poço para equilíbrios de pasta fluida. A placa de microtitulação assim preparada foi agitada a 400 rpm durante um dia à temperatura ambiente (cerca de 25 °C). Em seguida, os solventes foram evaporados sob fluxo de nitrogênio e os resíduos sólidos obtidos foram investigados por microscopia de luz polarizada.
[00117] Com base em investigações de microscopia de luz, foram encontrados indícios de possíveis sais para ácido benzenossulfônico, ácido gentísico, ácido clorídrico, ácido L-lático, ácido D-mandélico, ácido fosfórico, ácido L- tartárico e ácido toluenossulfônico. Alguns dos protótipos mais promissores foram selecionados para experimentos de acompanhamento em uma escala de 50 a 200 mg (experimentos de aumento de escala).
[00118] As experiências de aumento de escala para todas as condições testadas resultaram na formação de formas amorfas do composto (I) ou sais cristalinos líquidos do composto (I). Embora o exame microscópico muitas vezes tenha revelado birrefringência, a filtração das misturas obtidas não foi possível e nenhum material sólido pôde ser recuperado em nenhum dos experimentos.
[00119] Para sumarizar, todos os experimentos com formadores de sal falharam em produzir uma forma cristalina do composto (I).
[00120] Como os experimentos no Exemplo 1 não levaram a um material cristalino útil, uma forma de base livre do composto (I) foi investigada.
[00121] O composto (I) foi purificado com o uso de uma coluna de gel de sílica para remover ésteres de borato seguido por um equilíbrio curto em acetonitrila (cerca de 1 a 5 min). A solubilidade do composto purificado (I) em acetonitrila foi determinada para ser entre 5 mg/ml e 8 mg/ml. A solubilidade do composto purificado (I) em outros solventes também foi examinada e é apresentada na Tabela 2. Esses valores foram determinados pela adição de pequenas alíquotas de solvente a ~10 mg de composto sólido (I) e agitação/sonicação por um curto período de tempo à temperatura ambiente (cerca de 25 °C). Tabela 2. Valores Aproximados de Solubilidade do Composto Purificado (I).
[00122] A forma cristalina da Forma 2 do composto (I) resultante de um equilíbrio curto (cerca de 1 a 5 minutos) em acetonitrila foi examinada por microscopia de luz polarizada, experimentos de difração de pó de raio X (PXRD), TG-FTIR, calorimetria de varredura diferencial (DSC) e sorção dinâmica de vapor (DVS).
[00123] Os resultados da investigação de microscopia de luz polarizada são apresentados na Figura 1, enquanto o
[00124] Os resultados da caracterização termoanalítica da forma cristalina da Forma 2 do composto (I) obtido a partir de um equilíbrio curto em acetonitrila (termograma TG-FTIR) são visualizados na Figura 3A, enquanto os resultados para DSC são mostrados na Figura 3B. Os resultados revelam que a amostra continha cerca de 0,5 % de água que é libertada após aquecimento a cerca de 120 °C. Em temperaturas mais altas, a decomposição térmica é observada. DSC revelou dois eventos endotérmicos significativos. Uma primeira endotérmica forte com um pico de temperatura em cerca de 70 °C e uma entalpia de cerca de 54 J/g é seguida por um sinal mais fraco em 81 °C e uma entalpia de cerca de 3 J/g.
[00125] Além disso, o comportamento da amostra de base livre cristalina foi investigado sob pressões de vapor de água variáveis. Em alta umidade relativa, a amostra absorveu cerca de 18 % de água; entretanto, a maior parte da água absorvida foi liberada quando a umidade relativa retornou a 50 % de UR. Os resultados da medição DVS são apresentados nas Figuras 4A e 4B.
[00126] Um resumo das características da forma fornecido na Tabela 3. Tabela 3. Um Resumo das Características da Forma Cristalina da Forma 2 do Composto (I).
[00127] A forma cristalina da Forma 2 obtida do composto (I) teve uma baixa estabilidade e transitou para uma outra forma cristalina da Forma 3 do composto (I) mediante exposição a temperatura aumentada (acima aproximadamente 30 °C) por cerca de 1 a 5 min. Alternativamente, a Forma 2 transitou para a Forma 3 mediante equilíbrio em solvente (por exemplo, acetona) por mais de 5 min aproximadamente 25 °C. Esta forma cristalina da Forma 3 de base livre adicional do composto (I) teve uma melhor estabilidade e um conjunto único de propriedades físico- químicas.
[00128] Independentemente, uma forma cristalina estável do composto (I) foi obtida a partir de experimentos de equilíbrio de suspensão do composto purificado (I) em vários solventes respectivos, por exemplo, em acetonitrila,
[00129] Em particular, uma forma cristalina da Forma 3 do composto (I) foi obtida pelos seguintes métodos experimentais: 1) cerca de 74 mg do composto (I) foram adicionados a 2,0 ml de acetonitrila e a suspensão foi agitada durante três dias à temperatura ambiente (cerca de 25 °C), em seguida, filtrada; 2) cerca de 74 mg do composto (I) foram adicionados a 2,0 ml de anisol e a suspensão foi agitada durante três dias à temperatura ambiente (cerca de 25 °C), em seguida, filtrada; 3) cerca de 82 mg do composto (I) foram adicionados a 1,0 ml de acetato de etila e a suspensão foi agitada durante três dias à temperatura ambiente (cerca de 25 °C), em seguida, filtrada; 4) cerca de 82 mg do composto (I) foram adicionados a 1,0 ml de isopropanol e a suspensão foi agitada durante três dias à temperatura ambiente (cerca de 25 °C), em seguida, filtrada; 5) cerca de 45 mg do composto (I) foram adicionados a 1,0 ml de água e a suspensão foi agitada durante três dias à temperatura ambiente (cerca de 25 °C), em seguida, filtrada; 6) cerca de 100 mg do composto (I) foram adicionados a 3,0 ml de TBME e a suspensão foi agitada durante três dias à temperatura ambiente (cerca de 25 °C), em seguida, filtrada.
[00130] O composto (I) foi purificado com o uso de uma coluna de gel de sílica antes da adição do solvente para remover ésteres de borato.
[00131] A forma cristalina do composto (I) obtida foi caracterizada por microscopia de luz polarizada, difração de pó de raio X, TG-FTIR, DSC e DVS.
[00132] Os resultados da investigação de microscopia de luz polarizada para solventes selecionados, são apresentados na Figura 5.
[00133] O padrão de PXRD da forma cristalina da Forma 3 do composto (I) obtido a partir de experimentos de equilíbrio de suspensão com acetonitrila é mostrado na Figura 6A. Uma sobreposição dos padrões PXRD da forma cristalina da Forma 3 do composto (I) obtida a partir de experimentos de equilíbrio de suspensão com outros solventes é mostrada na Figura 6B. Esta forma cristalina do composto (I) mostra reflexos mais fortes em um valor de 2θ de 17,2 ± 0,2°, 17,8 ± 0,2°, 21,2 ± 0,2° e 22,4 ± 0,2°. Isso é consistente apesar de diferentes solventes serem usados para obter a forma cristalina do composto (I).
[00134] Para comparação, a Figura 7 mostra uma sobreposição do padrão de PXRD da forma cristalina obtida no Exemplo 2 (Forma 2) e no presente exemplo (Forma 3). As duas formas cristalinas têm um padrão de PXRD diferente.
[00135] Os resultados de experimentos de caracterização TG-FTIR exemplificativos da forma cristalina da Forma 3 do composto (I) são mostrados nas Figuras 8A (acetato de etila) e 8B (isopropanol).
[00136] A Figura 8A revela que a amostra da forma cristalina da Forma 3 do composto (I) obtida por equilíbrio com acetato de etila continha cerca de 0,7 % de acetato de etila apesar da secagem sob vácuo a 40 °C por vários dias. O acetato de etila é liberado entre cerca de 100 °C e 200 °C. Em temperaturas mais altas, a decomposição térmica é observada.
[00137] A amostra da Forma 3 que resultou a partir de uma suspensão do composto (I) em isopropanol (e secagem ao ar à temperatura ambiente) mostra surpreendentemente que o teor inicial de isopropanol estava abaixo de 0,5 % (consultar a Figura 8B).
[00138] Medições de DSC exemplificativas para a amostra da forma cristalina da Forma 3 do composto (I) obtida por equilíbrio com acetato de etila estão representadas na Figura 8C e mostram um pico de fusão endotérmico acentuado a cerca de 92 °C associado a uma entalpia de cerca de 103
[00139] Além disso, o comportamento da amostra da forma cristalina da Forma 3 do composto (I), obtida por equilíbrio com acetato de etila, foi investigado sob pressões de vapor de água variáveis. Na umidade relativa mais alta de 95 %, a amostra absorveu cerca de 1,2 % de água que foi liberada quando a umidade relativa retornou a 50 % de UR. Os resultados da medição DVS são mostrados nas Figuras 9A e 9B. A quantidade de água absorvida é pequena e a sorção de água é reversível. Assim, esta forma cristalina da Forma 3 do composto (I) não é higroscópica ou substancialmente não higroscópica.
[00140] Um resumo das características da forma cristalina da Forma 3 do composto (I) obtido como parte do Exemplo 3 é fornecido na Tabela 4. Tabela 4. Um Resumo das Características de uma Forma Cristalina da Forma 3 do Composto (I).
[00141] No Exemplo, AZ-3102-00 é um nome para o composto (I) em Forma 3.
[00142] O objetivo do estudo foi avaliar o tratamento de camundongos jovens NPC1 (NPC (-/-) (P11-P70) com uma dose farmacologicamente ativa prevista de AZ-3102-00 com o uso de gavagem oral e avaliar PK e marcadores histológicos para caracterizar neuropatologia que pode ocorrer.
[00143] Dos 38 camundongos a serem incluídos neste estudo, havia 30 camundongos knock-out (KO) NPC (-/-), 4 camundongos heterozigotos NPC (+/-) e 4 camundongos NPC (+/+) de tipo selvagem (WT, Balb/c). Os camundongos NPC1(-/-) têm um truncamento prematuro da proteína deletando 11 dos 13 domínios transmembranares deixando os dois primeiros domínios transmembranares intactos. Camundongos NPC1(-/-) homozigotos para o alelo NIH recessivo do gene Niemann Pick tipo C1 (Npc1m1N) mostram uma deficiência dupla de atividade de esfingomielinase e glicocerebrosidase (JAX n° 003092). Os animais foram criados em um fundo BALB/c OlaHsd.
[00144] 24 camundongos NPC1 (-/-) foram tratados por sonda oral com AZ-3102-00 do dia 11 pós-natal (P11) ao dia 70 pós-natal (P70). Camundongos de controle pareados por idade incluíram 6 camundongos NPC (-/-) e 4 NPC (+/-) tratados com veículo e 4 camundongos NPC (+/+) receberam AZ- 3102-00. Após o último tratamento em P70, camundongos NPC (- /-) (n = 4 por ponto de tempo) foram submetidos à eutanásia por injeção IP de 600 mg/kg de pentobarbital nos seguintes pontos de tempo: 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h e 24 h. Os camundongos de controle também foram sacrificados após o último tratamento (não crítico em termos de tempo). O sangue terminal foi coletado por punção cardíaca em tubos revestidos com EDTA. O plasma sanguíneo foi coletado por centrifugação (3000 x g por 10 minutos em temperatura ambiente) e alíquotas de 50 ul de plasma foram transferidas para tubos de 1,5 ml, congeladas em gelo seco e armazenadas a -80 °C.
[00145] Após perfusão transcardial, os cérebros foram removidos e hemisseccionados. Os hemicérebros direitos foram pós-fixados e incorporados em moldes criogênicos para posterior análise imuno-histoquímica. Hemicérebros esquerdos foram congelados em gelo seco para análise posterior.
[00146] Os cérebros foram criosseccionados (12 níveis com 5 seções cada). 5 Seções por animal foram então usadas para marcação imunofluorescente quantitativa de microglia (MAC1) e astrócitos (GFAP) em duas regiões do cérebro.
[00147] A doença de Niemann-Pick tipo C (NPC) é uma doença neurodegenerativa autossômica recessiva associada a mutações nos genes NPC1 e NPC2 e caracterizada pelo acúmulo de colesterol não esterificado e glicoesfingolipídios (GSLs). Aproximadamente 95 % dos casos de Niemann-Pick Tipo C são causados por mutações genéticas no gene NPC1, denominado de tipo C1; 5 % são causados por mutações no gene NPC2, denominado de tipo C2. As manifestações clínicas de Niemann-Pick tipo C1 e C2 são semelhantes porque os respectivos genes estão envolvidos na saída de lipídios, particularmente colesterol, de endossomos tardios ou lisossomos. O gene NPC1 codifica uma proteína que está localizada nas membranas dentro da célula e está envolvida no movimento de colesterol e lipídios dentro das células. A deficiência dessa proteína leva ao acúmulo anormal de lipídios e colesterol nas membranas celulares. O gene NPC2 codifica uma proteína que se liga e transporta o colesterol. Camundongos homozigotos para o alelo NIH recessivo do gene Niemann Pick tipo C1 mostram uma deficiência dupla de atividade de esfingomielinase e glicocerebrosidase. Camundongos mutantes começam a perder peso e a apresentar tremores e marcha atáxica por volta das 7 semanas de idade. A perda de peso continua e o tremor e a ataxia tornam-se mais graves até a morte por volta de 12 a 14 semanas de idade. O fígado e o baço também estão aumentados e as células de Purkinje no cerebelo estão severamente esgotadas. Alguns Item de Teste Tabela 5. Informações de Item de Teste.
[00148] As formulações de dose foram divididas em alíquotas quando necessário para permitir a dispensa em cada ocasião de dosagem. Tabela 6. Informações de formulação.
[00149] A quantidade necessária de item de teste foi pesada e dissolvida em água Elix (p/p) e o pH ajustado para um pH ácido. Nenhum outro excipiente foi adicionado.
[00150] Nenhuma correção foi feita para a gravidade específica do item de teste ou pureza/composição do item de teste.
[00151] Após cada preparação de dose, um retentor da solução foi congelado para análise no final do estudo.
[00152] As análises de estabilidade realizadas anteriormente em conjunto com o estudo de desenvolvimento e validação do método, demonstraram que o item de teste é estável no veículo quando preparado e armazenado nas mesmas condições em concentrações entre as utilizadas neste estudo
[00153] Os animais foram alojados em gaiolas individuais ventiladas em cama padronizada para roedores fornecida por Rettenmaier. Cada gaiola continha no máximo cinco camundongos. A temperatura na sala de detenção foi mantida entre 20 a 24 °C e a umidade relativa foi mantida entre 45 e 65 %. Os animais foram alojados sob um ciclo de luz constante (12 horas claro/escuro). Ração padrão para roedores seca e peletizada (Altromin), bem como água da torneira normal, estava disponível à vontade para os animais. A ração úmida foi fornecida aos animais mediante orientação do Médico Veterinário.
[00154] Os animais foram numerados consecutivamente por marcação clássica.
[00155] Cada gaiola foi identificada por um cartão colorido indicando o número do estudo, sexo, número de registro individual (NRI) dos animais, data de nascimento, bem como a alocação do grupo de tratamento. O genótipo (transgênico ou tipo selvagem) de cada animal foi determinado
[00156] Apenas animais aparentemente em boas condições de saúde foram incluídos no estudo. A randomização da alocação de grupos foi feita por gaiola. Os animais foram atribuídos a diferentes grupos iniciais (coortes) que compreendem animais de todos os grupos de tratamento. O número de animais em um grupo inicial foi limitado para garantir a mesma idade e manipulação uniforme.
[00157] Antes da inscrição no estudo, a situação de saúde de cada animal individual foi avaliada. Durante o estudo, foram feitas observações diárias e quaisquer observações notáveis em gaiola foram registradas e imediatamente relatadas ao diretor do estudo e ao veterinário responsável, que decidiu ações adicionais (por exemplo, eutanásia).
[00158] Os pesos corporais e a situação de saúde foram registrados diariamente na primeira semana e, posteriormente, uma vez por semana.
[00159] Nenhum animal teve que ser submetido à eutanásia prematuramente. Materiais e Métodos Animais
[00160] 24 camundongos NPC1 (-/-) (grupos D a I) foram tratados por gavagem oral (10 ml/kg) com AZ-3102-00 do dia 11 pós-natal (P11) ao dia 70 pós-natal (P70). A dosagem começará em 1,5 mg/kg de P11 a P25, seguido por 3 mg/kg de P26 a P70. Os camundongos de controle incluíram 6 camundongos NPC1 (-/-) e 4 NPC (+/-) tratados com veículo e 4 camundongos NPC (+/+) receberam AZ-3102-00 (grupos A C).
[00161] Após o último tratamento em P70, camundongos NPC (-/-) (n = 4 por ponto de tempo; grupos D a I) foram submetidos à eutanásia por injeção IP de 600 mg/kg de pentobarbital nos seguintes pontos de tempo: 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h e 24 h. Os camundongos de controle (grupos A, B e C) também foram sacrificados após o último tratamento (não crítico em termos de tempo).
Tabela 7: Visão geral de grupo de tratamento.
[00162] Aos 30 min (Grupo D), 1 h (+/- 5 min. Grupo E), 2 h (+/- 5 min. Grupo F), 4 h (+/- 5 min. Grupo G), 8 h (+/- 5 min. Grupo H) e 24 h (+/- 5 min. Grupo I) (tempo crítico) após o último tratamento em P70, os camundongos foram submetidos à eutanásia por injeção i.p.
[00163] 6 NPC1 (-/-) do grupo A, 4 NPC (+/-) do grupo B tratado e 4 NPC (+/+) camundongos do grupo C serviram como controles e também foram submetidos à eutanásia em P70 (aproximadamente 2 h após o último tratamento).
[00164] Os camundongos foram anestesiados terminalmente injeção i.p. de Pentobarbital (600 mg/kg, dose 10 µl/grama de peso corporal).
[00165] O tórax foi aberto e o sangue foi coletado por punção cardíaca com agulha de calibre 23. A agulha foi removida e o sangue foi transferido para o tubo de amostra (MiniCollect® K2EDTA (ácido etilenodiaminotetracético de potássio). O tubo foi completamente invertido para facilitar a distribuição homogênea do EDTA e evitar a coagulação. As amostras de sangue foram centrifugadas a 3000 x g por 10 minutos em temperatura ambiente (22 °C). Alíquotas de plasma de 50 μl foram transferidas para tubos LoBind Eppendorf de 1,5 ml pré-marcados, congelados em gelo seco e armazenados a -80 °C.
[00166] Os animais foram, em seguida, perfundidos transcardialmente com solução salina a 0,9 %. Para tanto, uma agulha de calibre 23, conectada a um frasco com soro fisiológico 0,9 %, foi inserida no ventrículo esquerdo. A aorta torácica - entre os pulmões e o fígado - foi pinçada com fórceps hemostático para bloquear o fluxo sanguíneo do coração para o abdômen, mas permitindo o fluxo sanguíneo para o cérebro. O ventrículo direito foi aberto com tesoura. Uma pressão constante de 100 a 120 mm Hg foi mantida na
[00167] Após a perfusão, o crânio foi aberto e o cérebro removido cuidadosamente e hemisseccionado em uma superfície resfriada. O hemisfério esquerdo foi pesado, congelado em gelo seco e armazenado a -80 °C. O hemisfério direito foi fixado por imersão em paraformaldeído a 4 % em tampão fosfato (pH 7,4) por 2 horas à temperatura ambiente.
[00168] Hemicérebros direitos de camundongos foram fixados por imersão em paraformaldeído a 4 % recém-preparado em PB (pH 7,4) por duas horas em temperatura ambiente. Posteriormente, os hemisférios foram transferidos para sacarose a 15 %/PBS e armazenados a 4 °C até afundar para garantir a crioproteção. Os blocos de tecido foram então aparados conforme necessário, transferidos para moldes criogênicos, incorporados em meio OCT, congelados em isopentano resfriado com gelo seco e armazenados em um freezer ultra profundo (ajustado a -80 ° C de temperatura alvo).
[00169] Cinco criossecções consecutivas foram cortadas sagitalmente com 10 μm de espessura em um criótomo Leica. As próximas 25 secções por nível foram descartadas. Este esquema de coleta foi repetido por 12 níveis e pode ter sido modificado para coletar dos níveis corretos, por exemplo, se os cérebros fossem menores devido à idade ou genótipo jovem. No total 12 x 5 = 60 secções foram coletadas. Os níveis de seccionamento foram escolhidos de acordo com o atlas cerebral de Paxinos e Franklin (“The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates”, 2a edição, 2001). A coleta de secções iniciou em um nível ~0,2 mm lateral a partir da linha média e se estende através do hemisfério para garantir amostragem aleatória sistemática pelas regiões-alvo (Figuras 10 e 15). As secções foram armazenadas a -20 °C. Quase todo o cérebro foi seccionado, de modo que o bloco de tecido residual foi descartado quando todas as secções foram coletadas.
[00170] Para cada incubação, um conjunto aleatório sistemático uniforme de cinco secções por camundongo foi selecionado (uma secção cada a partir dos níveis 2, 4, 6, 8, 10); para obter informações sobre amostragem aleatória sistemática, siga este link: http://www.stereology.info/sampling/
[00171] Todas as etapas foram executadas em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco pH 7,2-7,8 (PBS) à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. 1. Criossecções foram secas ao ar por 45 minutos e lavadas em PBS por 10 minutos 2. sítios de ligação inespecíficos foram bloqueados com 10 % de soro normal de jumento (Jackson Immuno Research) em 0,1 % TritonX-100/PBS por 60 minutos em uma câmara úmida 3. secções foram lavadas 3 x 5 minutos cada em PBS 4. secções foram incubadas com anticorpos primários em 1 % de soro normal de jumento/PBS durante a noite a 4 °C em uma câmara úmida • anticorpo policlonal de cobaia para Calbindina-D28k (Synaptic Systems, 214005) 1:1000 5. secções foram lavadas 3 x 5 minutos cada em PBS 6. secções foram incubadas com anticorpos secundários em 1 % de soro normal de jumento/PBS por 60 minutos em uma câmara úmida (protegida da luz) • jumento anti-cobaia (H+L), conjugado com Cy3 (Jackson ImmunoResearch, 706-165-148), 1:500 7. as secções foram lavadas 3 x 5 minutos cada em PBS (protegido da luz) 8. as secções foram incubadas com solução de trabalho DAPI por 15 minutos (protegida da luz) 9. as secções foram lavadas 2 x 5 minutos em PBS (protegido da luz) 10. as secções foram lavadas 5 minutos em ddH2O (protegido da luz) 11. as secções foram cobertas com Mowiol e lamínulas (protegidas da luz)
[00172] As varreduras de lâminas inteiras das secções coradas foram registradas em um microscópio automático Zeiss AxioScan Z1 com lentes de alta abertura, equipado com uma câmera Zeiss Axiocam 506 mono e uma câmera Hitachi 3CCD HV- F202SCL e software Zeiss ZEN 2.3.
[00173] A análise de imagem foi feita com o Image Pro 10 (Media Cybernetics). No início, as áreas-alvo (cerebelo e hipocampo, ou corpo caloso e corpo estriado) foram identificadas desenhando-se regiões de interesse (Regions Of Interest - ROI) nas imagens. As ROIs adicionais excluem rugas, bolhas de ar ou quaisquer outros artefatos que interfiram na medição. Em seguida, a imunofluorescência foi avaliada quantitativamente dentro das áreas identificadas.
[00174] Para quantificação, foi usado correção de fundo, se necessário, e detectado objetos imunorreativos por limiarização adequada e filtragem morfológica (tamanho, formato). Diferentes recursos do objeto foram então quantificados; dentre eles a porcentagem da área cumulativa do objeto com base no tamanho da ROI (área imunorreativa; este é o parâmetro mais abrangente que indica se há diferenças na imunorreatividade), o número de objetos normalizados para o tamanho da ROI (densidade do objeto), a intensidade média do sinal dos objetos identificados (intensidade média; isso indica se há diferenças no nível de expressão celular das proteínas alvo) e o tamanho dos objetos acima do limite. Uma vez que os parâmetros dos objetos alvo foram definidos em uma execução de teste, a análise quantitativa da imagem foi executada automaticamente para que os resultados sejam independentes do operador e totalmente reproduzíveis.
[00175] Os dados brutos foram organizados e classificados em Excel e, em seguida, transferidos para o GraphPad Prism para análise estatística e elaboração de gráficos. Os gráficos de prisma fazem parte do relatório do estudo e as tabelas com dados brutos classificados são anexadas ao relatório final após a execução das verificações de qualidade.
[00176] Primeiro, as amostras de plasma foram precipitadas com uma solução de acetonitrila/água ultrapura/metanol (90:5:5) contendo 500 nM do padrão interno glicosilceramida C17:0 (GlcCer C17:0) e ácido fórmico a 0,1
[00177] Os tecidos cerebrais foram homogeneizados em uma solução de água ultrapura:metanol (1:1) com 0,1 % de ácido fórmico (4 ml para cada grama de tecido) com o uso de um homogeneizador de microtubos FastPrep 24™. Os homogeneizados de tecidos foram então misturados para precipitação de proteínas com uma solução de acetonitrila:água ultrapura:metanol (90:5:5) contendo 500 nM de GlcCer C17:0 e 0,1 % de ácido fórmico. Após uma incubação de 5 minutos à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas por 5 minutos (13.000 rpm, 20 °C) e 50 μl dos sobrenadantes foram transferidos para uma placa de 96 poços MTP siliconizada.
[00178] As amostras de plasma foram primeiro misturadas para precipitação de proteínas com uma solução de acetonitrila contendo 50 ng/ml de AZ-3101 (padrão interno). Após 5 minutos de incubação à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas por 5 minutos (13000 rpm, 4 °C) e o sobrenadante foi diluído 10 vezes em água ultrapura com 0,1 % de ácido fórmico.
[00179] Os tecidos cerebrais foram homogeneizados em uma solução de água ultrapura:metanol (1:1) com 0,1 % de ácido fórmico (4 ml para cada grama de tecido) com o uso de um homogeneizador de microtubos FastPrep 24™ (MP Biomedicals, EUA). Homogenatos de cérebro foram misturados para precipitação de proteínas com uma solução de acetonitrila contendo 10 ng/ml de AZ-3101 (padrão interno). Após 5 minutos de incubação à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas por 5 minutos (13000 rpm, 4 °C) e o sobrenadante foi diluído 10 vezes em água ultrapura com 0,1 % de ácido fórmico.
[00180] Plasma diluído e sobrenadantes de tecido cerebral foram injetados em um sistema Agilent LC (Agilent, EUA) por um injetor de amostra automatizado (SIL-30, Shimadzu, EUA). Analitos foram separados por cromatografia líquida usando um gradiente linear de fase móvel B a uma taxa de fluxo de 0,800 ml/min em uma coluna XBridge BEH C8 de fase reversa (2,1 x 50 mm, tamanho de partícula de 2,5 μm; Waters, EUA) mantida a uma temperatura de 40 °C. A fase móvel A consistia em água ultrapura com 0,1 % de ácido fórmico. A fase móvel B era acetonitrila com 0,1 % de ácido fórmico.
[00181] Aquisições foram realizadas no modo de ionização positiva usando um espectrômetro de massa triplo quadrupolo API 5500 (AB Sciex, EUA) equipado com uma interface Turbo Ion Spray. Os dados foram calibrados e
[00182] Primeiro, as amostras de plasma foram precipitadas com uma solução de acetonitrila/água ultrapura/metanol (90:5:5) contendo 500 nM do padrão interno glicosilceramida C17:0 (GlcCer C17:0) e ácido fórmico a 0,1 %. Após 5 min de mistura à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas por 5 min (13.000 rpm, 20 °C) e 50 μl dos sobrenadantes foram transferidos para uma placa de 96 poços MTP siliconizada.
[00183] Os tecidos cerebrais foram homogeneizados em uma solução de água ultrapura:metanol (1:1) com 0,1 % de ácido fórmico (4 ml para cada grama de tecido) com o uso de um homogeneizador de microtubos FastPrep 24™. Os homogeneizados de tecidos foram então misturados para precipitação de proteínas com uma solução de acetonitrila:água ultrapura:metanol (90:5:5) contendo 500 nM de GlcCer C17:0 e 0,1 % de ácido fórmico. Após uma incubação de 5 minutos à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas por 5 minutos (13.000 rpm, 20 °C) e 50 μl dos sobrenadantes foram transferidos para uma placa de 96 poços MTP siliconizada.
[00184] Concentrações de glicosilceramida C16:0 (GlcCer C16:0), glicosilceramida C18:0 (GlcCer C18:0) e glicosilceramida C24:1 (GlcCer C24:1) cérebro, as amostras foram quantificadas por detecção de HPLC-MS/MS no modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM). Sobrenadantes foram analisados por HPLC-MS/MS usando uma coluna HALO HILIC (150*4,6 mm, 2,7 μm) da Advanced Materials Technology para distinguir entre os isômeros de galactosil e glicosilceramida . As aquisições MS/MS foram alcançadas no modo de ionização positiva usando um triplo quadrupolo API 4000 (Applied Biosystems, EUA) equipado com uma interface Turbo Ion Spray. Análise de GlcCer C16:0 e GlcCer C18:0 foi realizada com o uso de um gradiente com fase móvel A: Acetato de amônio a 5 mM em 94,5 % de acetonitrila 2,5 % de metanol, 2,5 % de água ultrapura e 0,5 % de ácido fórmico e fase móvel B: água ultrapura e 0,1 % de ácido fórmico. O LLOQ em amostras de cérebro para GlcCer 16:0, GlcCer 18:0 e GlcCer 24:1 foi de 25, 1, 250 e 381,5 pmol/g de tecido, respectivamente.
[00185] Análise estatística foi realizada no GraphPad Prism 9. Dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM) ou média + erro padrão da média.
[00186] In vivo: As diferenças entre os grupos foram testadas com a ANOVA de duas vias para medições repetidas seguidas pela análise post-hoc de Bonferroni ou Dunnett.
[00187] Histologia: Devido ao baixo n, a distribuição
[00188] A Figura 11 mostra a mudança percentual nos pesos corporais entre o PND 11 e a Semana 9. O gráfico representa o progresso dos pesos corporais [g] por grupo medido diariamente durante a primeira semana de tratamento e semanalmente depois disso.
[00189] Os resultados mostram que a saúde geral dos animais, conforme indicado pela porcentagem média de ganhos de peso corporal, não foi prejudicada pelo AZ-3102 e ambos os sexos de camundongos NPC (-/-) tratados com AZ-3102 ganharam mais do que o NPC (-/ -) animais não tratados. Tabela 8. Cérebro: Taxas de Exposição ao Plasma Para AZ-3102 Seguido de Administração Oral Repetida de PND 11-70.
[00190] A Figura 12 mostra os níveis de glicosilceramida C16:0 e C18:0 após administração oral repetida de PND 11-70.
[00191] Camundongos tratados com AZ-3102 mostram níveis aumentados de glicosilceramida C16:0 e C18:0 no cérebro.
[00192] Os Sinais Clínicos foram monitorados diariamente a partir de P45 até o final do estudo (de acordo com o modelo abaixo na Tabela 9). Os parâmetros “perda de peso”, “saúde geral”, “constatações clínicas” e “constatações específicas de linhagem” foram registrados e classificados de acordo com uma escala de escore. A soma desse escore foi usada para avaliação.
Tabela 9. Folha de Escore de Sinais Clínicos Escore de Tremor Tabela 10. Escore de Tremor.
[00193] A Figura 13 mostra um resumo dos escores totais de sinais clínicos de PND 56-70 em todos os domínios e por grupo de tratamento para cada veículo NPC (-/-) e camundongos tratados com AZ-3102. Lado esquerdo: escores totais por animal e grupo de tratamento, conforme visualizado com um gradiente, com escores mais baixos em verde e escores mais altos em vermelho. Escores de limiar superiores a 7 são ocorrências infrequentes para grupos tratados; no entanto,
[00194] Os resultados mostram que camundongos tratados com veículo NPC (-/-) tiveram uma piora (escores maiores) nos sinais clínicos gerais em comparação com animais tratados com NPC (-/-) AZ-3102. Isso é mostrado ainda na Figura 13: lado direito em que escores de, por exemplo, maiores que 8, foram observadas com mais frequência no grupo tratado com veículo NPC (-/-) em comparação com animais tratados com NPC (-/-) AZ-3102. Ao investigar esses escores, foi constatado que o início, a duração e a força do tremor também foram diminuídas pelo tratamento com AZ-3102 (Figura 14). Alto nível de tremor foi observado em todos os animais tratados com veículo NPC (-/-) exceto um; enquanto o AZ-3102 eliminou essencialmente este alto nível de tremor em todos os animais, exceto em um dos 24 animais testados.
[00195] A Figura 14 mostra o escore de tremor do pós- natal dia 56-70 em veículo NPC (-/-) e camundongos tratados com AZ-3102. As barras em rosa (=cinza claro) representam a aparência e a duração de um alto nível de tremor (escore de 5); enquanto as barras em verde (= cinza escuro) representam a aparência e a duração de um tremor leve ou moderado. Com exceção de um único camundongo no grupo não tratado, todos os outros camundongos exibiram um alto nível de tremor (4 de 5 camundongos). Em contraste, apenas um camundongo no grupo tratado com AZ-3102 teve um alto nível de tremor (1 em 24). Possíveis escores de tremor: 0: sem tremor1: Leve incoordenação, tremor leve a moderado; 5: Alto nível de Tremor, movimento descoordenado; 10: Reflexo de endireitamento reduzido (nenhum animal alcançou essa escore).
[00196] As regiões alvo foram delineadas manualmente definindo-se a região de interesse (ROI) para as análises quantitativas subsequentes de marcação fluorescente.
[00197] A tabela apresentada abaixo apresenta quatro leituras padrão. • Tamanho de região [mm2]: Esses dados mostram a área média por secção do cérebro coberta pela região alvo. Essas informações são importantes para verificar a amostragem adequada. Também é útil identificar a atrofia cerebral que faz parte do fenótipo de alguns modelos animais. • Área imunorreativa [%]: A porcentagem da ROI, que é coberta por objetos imunorreativos acima do limite (por exemplo: somata celular, neurites, placas); este é o parâmetro mais abrangente que indica se existem diferenças gerais na imunorreatividade. • Densidade de objeto [número de objetos por mm2]: O • Intensidade de objeto [a.u.]: O brilho médio de pixels de objetos imunorreativos acima do limite; isso indica se há diferenças no nível de expressão celular das proteínas alvo. • Tamanho de objeto [μm2]: O tamanho de objetos imunorreativos acima do limite; isso é útil para detectar diferenças na ativação da microglia ou no crescimento de placas.
[00198] A imunofluorescência de Calbindina-D28k foi detectada com anticorpo policlonal de cobaia e o sinal foi quantificado na formação do cerebelo e hipocampo. Camundongos NCP(-/-) apresentam marcação Calbindina-D28k fortemente diminuída em comparação com camundongos NCP(+/-) e NPC(+/+). O tratamento com o item de teste aumentou significativamente a Calbindina-D28k no cerebelo em todas as leituras. Todos os efeitos são específicos da região porque não foram detectadas diferenças significativas de grupo no hipocampo.
[00199] A Figura 16 mostra os resultados da imuno- histoquímica cerebral: marcação de calbindina-D28k em camundongos tratados com veículo NCP(-/-) e NPC(+/-) em comparação com NPC (+/+, camundongos de tipo selvagem) e camundongos tratados com NPC (-/-). Os gráficos apresentam as médias do sinal imunofluorescente medido dentro da ROI em 5 secções do cérebro por camundongo (n = 2-4 por grupo). Os dados foram analisados por ANOVA de uma via e teste post hoc de Dunnett. Os gráficos de barras representam as médias dos grupos + SEM. Os gráficos de barras representam as médias do grupo + SEM, *Adj. Valor de P: < 0,001.
[00200] Empregando-se técnicas imuno-histológicas com o uso do marcador calbindina-D28k para células de Purkinje, foi constatado que o tratamento com AZ-3102, em comparação com camundongos NPC (-/-) tratados com veículo, limitou significativamente a perda de células de Purkinje cerebelar (Figura 16).
[00201] A AZ-3102 é uma molécula oral pequena inovadora que está sendo desenvolvida para uma variedade de distúrbios de armazenamento lisossomal. O modo de ação único de AZ-3102 reside na sua alta potência na glicosilceramida sintase (GCS), na glicosilcerebrosidase não lisossomal (GbA2), bem como nas suas propriedades de penetração no cérebro. A AZ-3102 foi investigada em um modelo de camundongo da doença de Niemann-Pick tipo C [1, 2] no qual camundongos, homozigotos para o alelo recessivo NIH do gene NPC, começam a perder peso e mostram tremor e marcha atáxica em aproximadamente 7 semanas de idade [3]. A gravidade de doença está associada à perda significativa de células de Purkinje cerebelar e os sinais clínicos pioram até que um ponto final humanitário seja alcançado (normalmente entre 12 e 14 semanas de idade) [3]. Neste estudo, foi investigada a dosagem oral diária de AZ-3102 do pós-natal (PND) dia 11 a 70 para NPC (- /-), NPC (-/+) e WT (NPC (+/+); Balb/ c) camundongos para avaliar suas propriedades farmacocinéticas (PK), capacidade de modular a glicosilceramida (GlcCer C16:0, GlcCer C18:0) e melhorar os sinais clínicos. Além disso, foi examinado, também, o efeito do tratamento em um marcador imuno- histoquímico para células de Purkinje que coincide com a neuropatologia.
[00202] Seguido de repetidas doses orais diárias de PND 11-70, AZ-3102. A saúde geral dos animais, conforme indicado pelos ganhos percentuais médios de peso corporal, não foi impedida pela AZ-3102 e ambos os gêneros de camundongos NPC (-/-) tratados com AZ-3102 ganharam mais do que os animais não tratados NPC (-/-) (Figura 11). A AZ-3102 demonstrou altas exposições cérebro:plasma (Tabela 8) e consistente com o engajamento do alvo AZ-3102, aumentou as espécies de GlcCer medidas de homogenatos de cérebro inteiro em comparação com animais tratados com veículo por mais de 2 vezes para GlcCer 16:0 e aproximadamente 9 vezes para GlcCer 18:0. Essas duas espécies de GlcCer são provavelmente representativas de outras espécies de GlcCer que também são responsivas à AZ-3102.
[00203] Para avaliar se o AZ-3102 atinge concentrações cerebrais suficientes para afetar sinais mais específicos de saúde geral e neuropatologia, uma variedade de sinais clínicos foi medida (Tabela 9). Esses escores, quando somados ao longo do período de observação, fornecem uma figuração da saúde a partir de PND 56-70. A Figura 13 é uma vista gráfica de cada animal por coorte observada ao longo do tempo. Nesse gráfico, camundongos tratados com veículo NPC (-/-) tiveram uma piora (escores maiores) nos sinais clínicos gerais em comparação com animais tratados com NPC (-/-) AZ-3102. Isso é quantificado ainda na (Figura 13: lado direito) em que escores de, por exemplo, maiores que 8, foram observadas com mais frequência no grupo tratado com veículo NPC (-/-) em comparação com animais tratados com NPC (-/-) AZ-3102. Ao investigar esses escores, foi constatado que o início, a duração e a força do tremor também foram diminuídas pelo tratamento com AZ-3102 (Figura 14). Alto nível de tremor foi observado em todos os animais tratados com veículo NPC (-/-) exceto um; enquanto o AZ-3102 eliminou essencialmente este alto nível de tremor em todos os animais, exceto em um dos 24 animais testados. Empregando- se técnicas imuno-histológicas com o uso do marcador calbindina-D28k para células de Purkinje, foi constatado que o tratamento com AZ-3102, em comparação com camundongos NP- C (-/-) tratados com veículo, limitou significativamente a perda de células de Purkinje cerebelar (Figura 16). Essa constatação tem relevância para o tipo C de Niemann-Pick no homem, pois a morte neuronal, e em particular as células de Purkinje, bem como a atrofia cerebral, são características da doença [4]. Como a função cerebelar é importante para o movimento, a melhora dos sinais clínicos e a redução significativa no alto nível de tremor são provavelmente resultado da sobrevivência das células cerebelares de Purkinje.
[00204] Em sumário, a AZ-3102, um inibidor altamente potente (nM) disponível oralmente de GCS e GbA2, foi capaz de penetrar no cérebro de NPC (-/-) e animais do tipo selvagem. Além disso, a AZ-3102 inibiu essas enzimas no cérebro, como mostrado claramente através da modulação das espécies GlcCer, melhorou os sinais clínicos, reduziu significativamente o alto nível de tremor e limitou a perda de células cerebelares de Purkinje em comparação com animais tratados com veículo.
[00205] 1. Loftus, S.K., et al., Murine model of Niemann-Pick C disease: mutation in a cholesterol homeostasis gene. Science, 1997. 277(5323): pág. 232-5.
[00206] 2. Zervas, M., K. Dobrenis, e S.U. Walkley, Neurons in Niemann-Pick disease type C accumulate gangliosides as well as unesterified cholesterol and undergo
[00207] 3. Santiago-Mujica, E., et al., Hepatic and neuronal phenotype of NPC1-/- mice. Heliyon, 2019. 5(3).
[00208] 4. Vanier, M.T., Niemann-Pick disease type C. Orphanet Journal of Rare Diseases, 2010. 5(1): pág. 16.
[00209] Camundongos que sofrem da doença de Sandhoff foram administrados com uma quantidade terapeuticamente eficaz de AZ-3102. Os dados iniciais indicam que, à semelhança do tratamento com Niemann-Pick tipo C, os sinais clínicos dos animais doentes, melhoraram.
Claims (6)
1. Forma cristalina caracterizada pelo fato de que é do composto (I), em que a forma cristalina exibe um reflexo, indicado como um valor de 2θ, a 17,8 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X, em que o reflexo a 17,8 ± 0,2° é um dos quatro reflexos mais fortes no padrão de difração de pó de raio X, em que a forma cristalina ainda possui um ponto de fusão entre 89°C a 96°C, medido por calorimetria de varredura diferencial.
2. Forma cristalina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que exibe ainda um ou mais reflexos, indicados como um valor 2θ, em um ou mais dentre 4,1 ± 0,2°, 8,3 ± 0,2°, 12,4 ± 0,2°, 13,6 ± 0,2°, 14,5 ± 0,2°, 14,9 ± 0,2°, 15,2 ± 0,2°, 17,2 ± 0,2°, 19,3 ± 0,2°, 21,2 ± 0,2°, 22,4 ± 0,2°, 22,9 ± 0,2° e 23,3 ± 0,2°, em um padrão de difração de pó de raio X.
3. Forma cristalina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato ser substancialmente não higroscópica.
4. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende a forma cristalina, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a composição farmacêutica está contida em uma cápsula, e em que a composição farmacêutica está contida na cápsula: (a) sem qualquer outro ingrediente; ou (b) com pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável.
5. Processo de preparação da forma cristalina, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma amostra do composto (I) em contato com um solvente, opcionalmente em que: (a) o solvente é selecionado a partir de acetonitrila, acetato de etila, isopropanol, anisol, água e éter terc- butilmetílico (TBME); e/ou (b) antes de colocar a amostra do composto (I) em contato com o solvente, a amostra do composto (I) é purificada, opcionalmente em que a amostra do composto (I) é purificada com o uso de cromatografia.
6. Uso da base livre do composto (I) caracterizado pelo fato de ser para a preparação da forma cristalina, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, por meio do processo conforme definido na reivindicação 5.
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