KR20230076441A - 8종 유산균의 종 특이적인 실시간 pcr 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 8종 유산균의 종 특이적인 실시간 PCR 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에서는 Genetic marker를 발굴하기 위해 총 354개의 유산균 게놈에 대하여 pan-genome 분석을 수행하였고, pan-genome 분석 결과를 바탕으로 종특이 프라이머 8쌍을 개발하였다. 100개의 표준균주를 사용하여 특이성을 확인한 결과 개발된 프라이머 모두 100% 특이성을 갖는 것으로 확인되었고, 이후 하나의 real-time PCR plate로 8종 유산균을 동시 검출할 수 있는 real-time PCR법을 개발하였다. 개발된 분석법으로 39개의 프로바이오틱 및 유제품에 적용하여 표기된 라벨의 종 확인이 가능하였고 LAB로 표기된 제품에 사용된 균주의 종 및 아종 수준까지 식별 가능하였다. 따라서 본 발명은 시간 및 비용이 효율적인 프로바이오틱 및 유제품 모니터링이 가능할 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 8종 유산균의 종 특이적인 실시간 PCR 프라이머 세트 및 이의 용도에 대한 것이다.
프로바이오틱스는 숙주에게 건강상 이로움을 주는 살아있는 미생물로 사람에게는 면역 체계 강화, 혈액 내 콜레스테롤 감소, 장내 균총 균형화, 항암작용 등의 효능을 나타내는 것으로 보고되었다. 최근 몇 년 동안 건강에 대한 관심이 증가하면서 건강 증진에 도움이 되는 프로바이오틱 시장이 급속도로 확장되었고, 프로바이오틱 시장이 확장됨에 따라 프로바이오틱 제품의 기능성과 안전성에 관련하여 소비자들의 우려가 증가되고 있다. 따라서 소비자들에게 안전한 프로바이오틱 제품을 제공하기 위해 라벨에 표기된 유산균의 정보를 정확하게 제공하여 소비자들에게 신뢰성을 부여하는 것은 매우 중요한 일이다. 그러나 프로바이오틱 제품에 실제로 함유된 유산균은 라벨에 표시된 성분과 일치하지 않는 경우가 빈번하다고 보고되고 있다.
또한, 시중에 판매되는 프로바이오틱 혹은 유제품에서 유사도가 높은 균주의 부정확한 식별로 인하여 원료명 표기에 대한 문제가 종종 보고되고 있다. 따라서 프로바이오틱으로 주로 사용되는 유산균에 대한 균주의 구별을 위해 정확도와 신뢰도가 높은 분석법 개발이 필요하며, 부정확한 정보로 등록된 게놈으로 인하여 특이 마커를 발굴하는데 어려움이 보고된 바 있어 게놈 평가의 중요성이 대두되고 있다.
본 발명의 목적은 8종 유산균 검출용 바이오마커 조성물, 상기 바이오마커의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 유산균 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 유산균 검출용 키트 및 이를 이용한 유산균 검출 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엑소뉴클레이즈 SbcC(Exonuclease SbcC; NCBI Accession number AAO82393.1), V-타입 ATP 합성효소 서브유닛 I(V-type ATP synthase subunit I; NCBI Accession number AFK59719.1), 점액 결합 단백질 전구체 Mub(Mucus binding protein precursor Mub; NCBI Accession number AAV43521.1), 부착 외부단백질(Adhesion exoprotein; NCBI Accession number ABJ59459.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number BAG25716.1), 추정 단백질(Hypothetical protein; NCBI Accession number ABD99146.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number AAK05215.1) 및 베타-갈락토시데이즈(Beta-galactosidase; NCBI Accession number AAV61011.1)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 유산균 검출용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 엑소뉴클레이즈 SbcC(Exonuclease SbcC; NCBI Accession number AAO82393.1), V-타입 ATP 합성효소 서브유닛 I(V-type ATP synthase subunit I; NCBI Accession number AFK59719.1), 점액 결합 단백질 전구체 Mub(Mucus binding protein precursor Mub; NCBI Accession number AAV43521.1), 부착 외부단백질(Adhesion exoprotein; NCBI Accession number ABJ59459.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number BAG25716.1), 추정 단백질(Hypothetical protein; NCBI Accession number ABD99146.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number AAK05215.1) 및 베타-갈락토시데이즈(Beta-galactosidase; NCBI Accession number AAV61011.1)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 유산균 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 유산균 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 유산균 균주가 포함된 시료에서 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 유산균 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 8종 유산균의 종 특이적인 실시간 PCR 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에서는 Genetic marker를 발굴하기 위해 총 354개의 유산균 게놈에 대하여 pan-genome 분석을 수행하였고, pan-genome 분석 결과를 바탕으로 종특이 프라이머 8쌍을 개발하였다. 100개의 표준균주를 사용하여 특이성을 확인한 결과 개발된 프라이머 모두 100% 특이성을 갖는 것으로 확인되었고, 이후 하나의 real-time PCR plate로 8종 유산균을 동시 검출할 수 있는 real-time PCR법을 개발하였다. 개발된 분석법으로 39개의 프로바이오틱 및 유제품에 적용하여 표기된 라벨의 종 확인이 가능하였고 LAB로 표기된 제품에 사용된 균주의 종 및 아종 수준까지 식별 가능하였다. 따라서 본 발명은 시간 및 비용이 효율적인 프로바이오틱 및 유제품 모니터링이 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 Pan-genome을 기반으로 하여 354개 whole-genome sequences의 phylogenetic tree를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 개발된 8개의 종 특이 프라이머에 대한 특이성 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 개발된 8개의 종 특이 프라이머에 대한 특이성 결과를 나타낸다.
이에, 본 발명에서는 식품의약품안전처에 고시된 프로바이오틱 유산균 중 프로바이오틱 제품에 주로 사용되는 8종의 유산균(E. faecalis, E. faecium, L. acidophilus, L. gasseri, L. reuteri, L. salivarius, Lc. lactis, S. thermophilus)을 신속 및 정확하게 식별하기 위해 대규모 게놈 분석을 하여 게놈을 평가하였고, 탐색된 genetic 마커들을 통해 특이 프라이머를 디자인하였다. 디자인된 프라이머를 통해 프로바이오틱 제품의 품질 검사가 가능하고, sequencing 방법보다 비용 및 시간을 단축할 수 있는 real-time PCR plate를 사용한 real-time PCR법을 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 엑소뉴클레이즈 SbcC(Exonuclease SbcC; NCBI Accession number AAO82393.1), V-타입 ATP 합성효소 서브유닛 I(V-type ATP synthase subunit I; NCBI Accession number AFK59719.1), 점액 결합 단백질 전구체 Mub(Mucus binding protein precursor Mub; NCBI Accession number AAV43521.1), 부착 외부단백질(Adhesion exoprotein; NCBI Accession number ABJ59459.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number BAG25716.1), 추정 단백질(Hypothetical protein; NCBI Accession number ABD99146.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number AAK05215.1) 및 베타-갈락토시데이즈(Beta-galactosidase; NCBI Accession number AAV61011.1)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 유산균 검출용 바이오마커 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 유산균은 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri), 리기락토바실러스 살리바리우스(Ligilactobacillus salivarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 또는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자 마커(molecular marker)의 유전자 지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.
또한, 본 발명은 엑소뉴클레이즈 SbcC(Exonuclease SbcC; NCBI Accession number AAO82393.1), V-타입 ATP 합성효소 서브유닛 I(V-type ATP synthase subunit I; NCBI Accession number AFK59719.1), 점액 결합 단백질 전구체 Mub(Mucus binding protein precursor Mub; NCBI Accession number AAV43521.1), 부착 외부단백질(Adhesion exoprotein; NCBI Accession number ABJ59459.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number BAG25716.1), 추정 단백질(Hypothetical protein; NCBI Accession number ABD99146.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number AAK05215.1) 및 베타-갈락토시데이즈(Beta-galactosidase; NCBI Accession number AAV61011.1)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 유산균 검출용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 엑소뉴클레이즈 SbcC(Exonuclease SbcC; NCBI Accession number AAO82393.1), V-타입 ATP 합성효소 서브유닛 I(V-type ATP synthase subunit I; NCBI Accession number AFK59719.1), 점액 결합 단백질 전구체 Mub(Mucus binding protein precursor Mub; NCBI Accession number AAV43521.1), 부착 외부단백질(Adhesion exoprotein; NCBI Accession number ABJ59459.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number BAG25716.1), 추정 단백질(Hypothetical protein; NCBI Accession number ABD99146.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number AAK05215.1) 및 베타-갈락토시데이즈(Beta-galactosidase; NCBI Accession number AAV61011.1)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
보다 바람직하게는, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
바람직하게는, 상기 유산균은 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri), 리기락토바실러스 살리바리우스(Ligilactobacillus salivarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 또는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "프로브"는 DNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 DNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. 본 발명에 있어서, 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 유산균 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 프라이머 세트 이외에, PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 Mg2 +와 같은 보조인자(cofactor) 등일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 유산균 균주가 포함된 시료에서 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 유산균 검출 방을 제공한다.
바람직하게는, 상기 유산균 균주가 포함된 시료는 유산균 균주가 포함된 프로바이오틱스 또는 유제품일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 유산균은 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri), 리기락토바실러스 살리바리우스(Ligilactobacillus salivarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 또는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "프로바이오틱스"는 체내에 들어가서 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 락토바실러스 등의 유산균을 이용하여 만들어진 발효유 제품으로 섭취되어 왔으나 최근에는 락토바실러스 이외에 비피도박테리움, 엔티로코커스와 같은 일부 균주 등을 포함한 발효유, 과립, 분말 등의 형태로 판매되고 있다.
유산균 균주가 포함된 시료에서 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 또한, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<
실험예
>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. Bacterial strains DNA 추출
본 발명에는 총 100개의 표준 균주가 사용되었다(표 1). 균주는 김치연구소(MGB), 한국 미생물 보존센터(KCCM), 국립 농업과학원 미생물 은행(KACC)과 한국생물자원센터(KCTC), NITE Biological Resource Center(NBRC)로부터 분양 받았다. 분양 받은 Lactococcus, Streptococcus, Lactiplantibacillus, Limosilactobacillus, Lacticaseibacillus, Ligilactobacillus, 그리고 Lactobacillus 균주는 모두 MRS 액체 배지(Difco, Becton & Dickinson, Sparks, MD)에서 배양했고, Bifidobacterium 균주는 Bifidobacterium 액체 배지 (MB Cell, Seoul, Korea)에서 배양했다. 모든 균주는 37℃, 48시간 동안 혐기적 조건으로 배양하였다. 표준 균주의 DNA 추출을 위해 균주 배양 후 16,000 × g에서 10분 동안 원심분리 하였고, 상층액을 제거한 pellet으로부터 genomic DNA를 추출하였다. 표준균주의 genomic DNA와 프로바이오틱 제품의 DNA는 DNeasy®Blood & Tissue kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 추출된 DNA의 농도와 순도는 MaestroNano®분광광도계 (Maestrogen, Las Vegas, NV, USA)를 이용하여 260 nm와 280 nm에서 측정하였다.
| Species | Strain no. |
| Bifidobacterium animalis subsp. animalis | KACC 16637 |
| Bifidobacterium animalis subsp. lactis | KACC 16638 |
| Bifidobacterium bifidum | KCTC 3418 |
| Bifidobacterium bifidum | KCTC 3440 |
| Bifidobacterium breve | KACC 16639 |
| Bifidobacterium breve | KCTC 3419 |
| Bifidobacterium longum subsp. infantis | KCTC 3249 |
| Bifidobacterium longum subsp. longum | KCCM 11953 |
| Enterococcus faecalis | KCTC 3206 |
| Enterococcus faecalis | KACC 11859 |
| Enterococcus faecium | KCTC 13225 |
| Enterococcus faecium | KACC 11954 |
| Enterococcus faecium | KACC 10782 |
| Lacticaseibacillus casei | KCTC 3109 |
| Lacticaseibacillus casei | KCTC 13086 |
| Lacticaseibacillus casei | KCTC 3110 |
| Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei | KCTC 3165 |
| Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans | KACC 12427 |
| Lacticaseibacillus rhamnosus | KCTC 3237 |
| Lacticaseibacillus rhamnosus | KCTC 13088 |
| Lactiplantibacillus paraplantarum | KACC 12373 |
| Lactiplantibacillus pentosus | KACC 12428 |
| Lactiplantibacillus plantarum | KACC 11451 |
| Lactiplantibacillus plantarum subsp . argentoratensis | KACC 12404 |
| Lactobacillus acidophilus | KACC 12419 |
| Lactobacillus acidophilus | KCTC 3164 |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | KACC 12420 |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii | KACC 13439 |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis | KACC 12417 |
| Lactobacillus gasseri | KACC 12424 |
| Lactobacillus gasseri | KCTC 3163 |
| Lactobacillus helveticus | KACC 12418 |
| Lactococcus lactis subsp. lactis | KCTC 3769 |
| Lactococcus lactis subsp. lactis | KCTC 2013 |
| Ligilactobacillus salivarius | KCTC 3600 |
| Limosilactobacillus fermentum | KACC 11441 |
| Limosilactobacillus fermentum | KCTC 3112 |
| Limosilactobacillus fermentum | KCTC 5049 |
| Limosilactobacillus reuteri | KCTC 3594 |
| Streptococcus thermophilus | KACC 11857 |
| Amylolactobacillus amylophilus | KACC 11430 |
| Apilactobacillus kunkeei | KACC 19371 |
| Companilactobacillus crustorum | KACC 16344 |
| Companilactobacillus farciminis | KACC 12423 |
| Companilactobacillus heilongjiangensis | KACC 18741 |
| Enterococcus avium | NCCP 10761 |
| Enterococcus avium | KACC 10788 |
| Enterococcus casseliflavus | KCTC 3638 |
| Enterococcus cecorum | KACC 13884 |
| Enterococcus durans | KCTC 13289 |
| Enterococcus durans | KACC 10787 |
| Enterococcus gilvus | KACC 13847 |
| Enterococcus malodoratus | KACC 13883 |
| Enterococcus mundtii | KCTC 3630 |
| Enterococcus mundtii | KACC 13824 |
| Enterococcus saccharolyticus | KACC 10783 |
| Enterococcus thailandicus | KCTC 13134 |
| Fructilactobacillus lindneri | KACC 12445 |
| Lacticaesibacillus chiayiensis | NBRC 112906 |
| Lactobacillus acetotolerans | KACC 12447 |
| Lactobacillus amylolyticus | KACC 12374 |
| Lactobacillus amylovorus | KACC 12435 |
| Lactobacillus gallinarum | KACC 12370 |
| Lactobacillus jensenii | KCTC 5194 |
| Lactobacillus johnsonii | KCTC 3801 |
| Latilactobacillus curvatus | KACC 12415 |
| Latilactobacillus sakei | KCTC 3603 |
| Lentilactobacillus buchneri | KACC 12416 |
| Lentilactobacillus parabuchneri | KACC 12363 |
| Leuconostoc carnosum | KCTC 3525 |
| Leuconostoc citreum | KCTC 3526 |
| Leuconostoc fallax | KACC 12303 |
| Leuconostoc gasicomitatum | KACC 13854 |
| Leuconostoc gelidum | KCTC 3527 |
| Leuconostoc gelidum | KACC 12256 |
| Leuconostoc gelidum subsp. aenigmaticum | MGB 1000TE |
| Leuconostoc holzapfelii | KACC 17729 |
| Leuconostoc lactis | KCTC 3528 |
| Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum | KACC 12315 |
| Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides | KCTC 3505 |
| Leuconostoc pseudomesenteroides | KACC 12304 |
| Levilactobacillus brevis | KCTC 3498 |
| Levilactobacillus zymae | KACC 16349 |
| Ligilactobacillus acidipiscis | KACC 12394 |
| Ligilactobacillus agilis | KACC 12433 |
| Ligilactobacillus ruminis | KACC 12429 |
| Limosilactobacillus mucosae | KACC 12381 |
| Loigolactobacillus coryniformis | KACC 12411 |
| Weissella beninensis | KACC 18586 |
| Weissella cibaria | KCTC 3746 |
| Weissella confusa | KACC 11841 |
| Weissella halotolerans | KACC 11843 |
| Weissella hellenica | KACC 11842 |
| Weissella kandleri | KACC 11844 |
| Weissella koreensis | KACC 11853 |
| Weissella minor | KCTC 3604 |
| Weissella paramesenteroides | KACC 11847 |
| Weissella soli | KACC 11848 |
| Weissella thailandensis | KACC 11849 |
| Weissella viridescens | KACC 11850 |
2. 8종 유산균의 종 특이 유전자 발굴 및
프라이머
디자인
8종 유산균(E. faecalis, E. faecium, L. acidophilus, L. gasseri, L. reuteri, L. salivarius, Lc. lactis, S. thermophilus)을 신속 및 정확하게 검출할 수 있는 특이 프라이머를 개발하기 위해 354개의 whole-genome sequence를 미국 국립생물공학정보 센터(NCBI; National Center for Biotechnology Information)으로부터 다운받았다. Anvi'o software version 7.0을 이용해 pan-genome 분석을 수행하여 genome sequence를 검증하였다. 8종 유산균의 각 species에 대한 특이 유전자는 Bacterial Pan Genome Analysis (BPGA) pipeline 분석으로 추출되었다. 최종 특이 유전자는 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)를 이용하여 타깃 종에는 모두 존재하지만, 타깃이 아닌 종에는 존재하지 않는 것으로 확인되었다(표 2). 선별된 특이 유전자로부터 프라이머를 개발하였다(표 3). 프라이머는 Primer Designer (Scientific and Education Software, Durham, NC, USA)를 이용하여 디자인되었다.
| Target species | Specific molecular marker genes (Accession number) | Length |
| E. faecalis | Exonuclease SbcC (AAO82393.1) | 1,045 |
| E. faecium | V-type ATP synthase subunit I (AFK59719.1) | 667 |
| L. acidophilus | Mucus binding protein precursor Mub (AAV43521.1) | 1,208 |
| L. gasseri | Adhesion exoprotein (ABJ59459.1) | 873 |
| L. reuteri | Conserved hypothetical protein (BAG25716.1) | 830 |
| L. salivarius | Hypothetical protein (ABD99146.1) | 871 |
| Lc . lactis | Conserved hypothetical protein (AAK05215.1) | 921 |
| S. thermophilus | Beta-galactosidase (AAV61011.1) | 1,026 |
| Target species | Primer name | Sequence (5'-3') | Size (bp) |
| E. faecalis | E_faecalis-F | GAC CGC CTG ACC AAT AGT CG (서열번호 1) | 137 |
| E_faecalis-R | CCG CCT GAT AAC GTG TGA GC (서열번호 2) | ||
| E. faecium | E_faecium-F | GGA AGT ATT GGC GCG GCA TT (서열번호 3) | 144 |
| E_faecium-R | TCG TGC ACC ATG GAC ATA GG (서열번호 4) | ||
| L. acidophilus | L_acidophilus-F | GGC GGT AGC AAT GTC ATT GT (서열번호 5) | 129 |
| L_acidophilus-R | TGC GGA ATA ATC ACC ACG AG (서열번호 6) | ||
| L. gasseri | L_gasseri-F | GCT GAA CCG ATG CCG TTA CT (서열번호 7) | 180 |
| L_gasseri-R | AAT AAC CGG CGT AGG TGT TG (서열번호 8) | ||
| L. reuteri | L_reuteri-F | TGC CAG CGC CAT TAA CCT CA (서열번호 9) | 133 |
| L_reuteri-R | CCG CCG ACA ATT CCG ATC AT (서열번호 10) | ||
| L. salivarius | L_salivarius-F | GAT AGC AGT TCG CGA TGT TG (서열번호 11) | 135 |
| L_salivarius-R | CAT GCT GCA GAT GCA GTT AC (서열번호 12) | ||
| Lc . lactis | Lc_lactis-F | GGA TTG TCG GCT GGT TGA TG (서열번호 13) | 134 |
| Lc_lactis-R | CCG GTG TCG AAT TGA GCT TG (서열번호 14) | ||
| S. thermophilus | S_thermophilus-F | GTT CCA ACG CGA TAA GAA CC (서열번호 15) | 99 |
| S_thermophilus-R | CGG AAG TAA TCA GCC ATG TC (서열번호 16) |
3. Real-time
PCR법의
특이성 및 정확성 평가
각각의 개발된 유산균 8종 특이 프라이머의 특이성을 확인하기 위해 CFX96 Deep Well Real-time System(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 real-time PCR을 수행하였다. Real-time PCR은 14개의 8종 유산균과 86개의 다른 표준 균주를 대조군으로 사용하였다(표 4). 반응액 조성은 10 μL의 2× Thunderbird SYBR®qPCR Mix(Toyobo, Osaka, Japan), 20 ng의 DNA template, 0.5 μM의 프라이머 세트 그리고 총 용량 20 μL를 채우기 위한 D.W로 구성하였다. 각각의 타깃은 다음과 같은 조건에서 증폭되었다: 95℃에서 5분 동안 변성(denaturation) 한 후 95℃에서 5초, 60℃에서 30초 반응을 30회 반복 수행하였다. Melt curve는 65℃에서 95℃까지 온도를 올려가면서 수행하였다. Real-time PCR의 정확성을 평가하기 위해 104~108 CFU/ml로 연속 희석한 DNA를 사용하여 표준 곡선 실험을 진행하였다.
| Primer name | Detected species | Specificity (Ct) |
| E.faecalis-F,R | E. faecalis KCTC 3206 | 11.43 |
| E.faecalis-F,R | E. faecalis KACC 11859 | 11.85 |
| E.faecium-F,R | E. faecium KCTC 13225 | 12.98 |
| E.faecium-F,R | E. faecium KACC 11954 | 11.73 |
| E.faecium-F,R | E. faecium KACC 10782 | 12.85 |
| L.acidophilus-F,R | L. acidophilus KACC 12419 | 14.13 |
| L.acidophilus-F,R | L. acidophilus KCTC 3164 | 12.95 |
| L.gasseri-F,R | L. gasseri KCTC 3163 | 12.85 |
| L.gasseri-F,R | L. gasseri KACC 12424 | 11.49 |
| L.reuteri-F,R | L. reuteri KCTC 3594 | 11.69 |
| L.salivarius-F,R | L. salivarius KCTC 3600 | 14.1 |
| Lc.lactis-F,R | Lc . lactis subsp. lactis KCTC 3769 | 12.01 |
| Lc.lactis-F,R | Lc . lactis subsp. lactis KCTC 2013 | 11.88 |
| S.thermophilus-F,R | S. thermophilus KACC 11857 | 12.2 |
4.
프로바이오틱
및 유제품 적용 실험
개발된 real-time PCR법은 39개의 프로바이오틱 및 유제품에 적용되었다. 제품의 total genomic DNA를 추출하기 위해 DNeasy®Blood & Tissue kit (Qiagen, Hilden, Germany)의 lysis buffer를 첨가하고, 제조사의 protocol에 따라 추출하였다. 위의 방법에 따라 real-time PCR을 수행하여 제품 내 검출된 균주를 확인하였다. 종 검출은 라벨 표기와 비교되었다.
<
실시예
>
1. Pan-genome 분석 및 8종 유산균의 종 특이 유전자 획득
354개의 유산균 genome sequence로 pan-genome 분석을 수행했다(도 1). Pan-genome 분석으로 얻어진 종 특이 유전자를 모두 BLAST로 확인한 결과 타겟으로 하는 균주의 종에는 모두 존재하는 유전자이면서 타겟이 아닌 종이나 다른 속에는 모두 존재하지 않는 유전자임을 확인하였다(표 2). 확인된 유전자로부터 표 3과 같이 8종 유산균의 종 특이 프라이머를 디자인하였다.
2. 개발된 특이
프라이머의
특이성 및 정확성
종 특이 프라이머의 특이성 및 정확성을 확인하기 위해 타깃을 포함한 100개의 표준 균주를 사용하여 특이성 확인을 진행하였다. 8종 유산균의 종 특이 프라이머 세트를 반응시켰을 때, 해당하는 타깃 균주에는 Ct값 11.43에서 14.13 범위 내에서 증폭하고, 타깃이 아닌 균주에는 어떠한 증폭도 일어나지 않았다(표 4, 도 2). 따라서 본 발명에서 개발된 8쌍의 종 특이 프라이머 세트는 모두 특이성이 있다고 판단하였다. 개발된 8종 특이 프라이머의 정확성을 평가하기 위해 타깃 표준 균주를 104~108 CFU/ml로 연속 희석하여 표준 곡선을 얻었다. 본 발명에서 개발된 8쌍의 프라이머에 대한 표준 곡선은 CODEX 가이드라인에 따라 slope 값은 -3.1~-3.6, R2 값은 0.98이상, 효율은 90-110%의 값을 만족하여 본 발명에서 개발된 real-time PCR은 정확하고 신뢰성이 우수하다고 판단할 수 있다(표 5).
| Species | Slope | R2 | Eff% |
| E. faecalis KCTC 3206 | -3.522 | 0.999 | 92.3 |
| E. faecium KCTC 13225 | -3.561 | 0.998 | 90.9 |
| L. acidophilus KCTC 3164 | -3.576 | 0.997 | 90.4 |
| L. gasseri KCTC 3163 | -3.588 | 0.999 | 90.0 |
| L. reuteri KCTC 3594 | -3.584 | 0.999 | 90.1 |
| L. salivarius KCTC 3600 | -3.378 | 0.999 | 97.7 |
| Lc . lactis subsp. lactis KCTC 2013 | -3.237 | 0.999 | 103.6 |
| S. thermophilus KACC 11857 | -3.139 | 0.996 | 108.2 |
3.
프로바이오틱
및 유제품 적용 실험
특이성과 정확성이 검증된 real-time PCR을 이용하여 하나의 96-well plate로 8개의 유산균을 검출할 수 있도록 실험을 설계하였고, 39개 프로바이오틱 및 유제품 모니터링에 적용하였다.
Real-time PCR로 검출된 종을 라벨에 표기된 균주와 비교하였다. 개발된 방법으로 제품 내 8종 유산균에 대해 모니터링한 결과는 표 6에 나타냈다. 39개 제품 중 29개 제품은 모두 라벨과 PCR 검출 결과가 일치하였다. 39개 제품 중 2개의 제품에서 라벨에 표기된 L. acidophilus가 검출되지 않았다. 정확한 종 표기가 되어있지 않고 Lactic acid bacteria mix로 표기된 8개 제품에서 L. acidophilus와 S. thermophilus가 검출되었다. 본 발명에서 개발된 real-time PCR을 이용하여 제품 내 정확한 유산균 검출이 가능하다.
| Product no. |
Label claim | Detected species |
| 1 | L. acidophilus | L. acidophilus |
| 2 | L. acidophilus | L. acidophilus |
| 3 | S. thermophilus | S. thermophilus |
| 4 | L. acidophilus, L. gasseri | L. acidophilus, L. gasseri |
| 5 | Lc . lactis | Lc . lactis |
| 6 | Lc . lactis | Lc . lactis |
| 7 | Lc . lactis | Lc . lactis |
| 8 |
L. acidophilus, L.
reuteri
,
S. thermophilus |
L. acidophilus, L.
reuteri
,
S. thermophilus |
| 9 |
L. acidophilus, L.
reuteri
,
S. thermophilus |
L. acidophilus, L.
reuteri
,
S. thermophilus |
| 10 | L. salivarious | L. salivarious |
| 11 | L. reuteri , L. acidophilus, Lc . lactis | L. reuteri , L. acidophilus, Lc . lactis |
| 12 | L. acidophilus | L. acidophilus |
| 13 |
L. acidophilus,
Lc
.
lactis
,
S. thermophilus , E. faecium |
L. acidophilus,
Lc
.
lactis
,
S. thermophilus , E. faecium |
| 14 | E. faecium , L. acidophilus | E. faecium , L. acidophilus |
| 15 |
L. acidophilus, E.
faecium
,
L. salivarious |
L. acidophilus, E.
faecium
,
L. salivarious |
| 16 | L. acidophilus, L. gasseri | L. acidophilus, L. gasseri |
| 17 |
Lc
.
lactis
, L. acidophilus,
S. thermophilus , L. salivarious |
Lc
.
lactis
, L. acidophilus,
S. thermophilus , L. salivarious |
| 18 | L. acidophilus, L. gasseri , L. reuteri , Lc . lactis | L. acidophilus, L. gasseri , L. reuteri , Lc . lactis |
| 19 |
Lc
.
lactis
, S.
thermophilus
,
L. acidophilus, L. salivarious |
Lc
.
lactis
, S.
thermophilus
,
L. acidophilus, L. salivarious |
| 20 | L. salivarious , L. acidophilus | L. salivarious |
| 21 | S. thermophilus | S. thermophilus |
| 22 | L. salivarious , L. acidophilus | L. salivarious |
| 23 | L. acidophilus, Lc . lactis | L. acidophilus, Lc . lactis |
| 24 | E. faecium , L. acidophilus, Lc . lactis , S. thermophilus | E. faecium , L. acidophilus, Lc . lactis , S. thermophilus |
| 25 | S. thermophilus | S. thermophilus |
| 26 | L. acidophilus, S. thermophilus | L. acidophilus, S. thermophilus |
| 27 | L. acidophilus, S. thermophilus | L. acidophilus, S. thermophilus |
| 28 | S. thermophilus | S. thermophilus |
| 29 | S. thermophilus | S. thermophilus |
| 30 | S. thermophilus | S. thermophilus |
| 31 | S. thermophilus | S. thermophilus |
| 32 | Lactic acid bacteria mix | S. thermophilus |
| 33 | Lactic acid bacteria mix | L. acidophilus, S. thermophilus |
| 34 | Lactic acid bacteria mix | S. thermophilus |
| 35 | Lactic acid bacteria mix | S. thermophilus |
| 36 | Lactic acid bacteria mix | L. acidophilus, S. thermophilus |
| 37 | Lactic acid bacteria mix | S. thermophilus |
| 38 | Lactic acid bacteria mix | S. thermophilus |
| 39 | Lactic acid bacteria mix | S. thermophilus |
굵은 글씨체와 밑줄 친 부분은 각각 잘못 표기된 종과 누락된 종을 나타낸다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University
<120> Eight lactic acid bacteria species-specific real-time PCR primer
sets and uses thereof
<130> ADP-2021-0665
<160> 16
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Enterococcus faecalis
<400> 1
gaccgcctga ccaatagtcg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Enterococcus faecalis
<400> 2
ccgcctgata acgtgtgagc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Enterococcus faecium
<400> 3
ggaagtattg gcgcggcatt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Enterococcus faecium
<400> 4
tcgtgcacca tggacatagg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactobacillus acidophilus
<400> 5
ggcggtagca atgtcattgt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactobacillus acidophilus
<400> 6
tgcggaataa tcaccacgag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactobacillus gasseri
<400> 7
gctgaaccga tgccgttact 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactobacillus gasseri
<400> 8
aataaccggc gtaggtgttg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Limosilactobacillus reuteri
<400> 9
tgccagcgcc attaacctca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Limosilactobacillus reuteri
<400> 10
ccgccgacaa ttccgatcat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Ligilactobacillus salivarius
<400> 11
gatagcagtt cgcgatgttg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Ligilactobacillus salivarius
<400> 12
catgctgcag atgcagttac 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis
<400> 13
ggattgtcgg ctggttgatg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis
<400> 14
ccggtgtcga attgagcttg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 15
gttccaacgc gataagaacc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 16
cggaagtaat cagccatgtc 20
Claims (10)
- 엑소뉴클레이즈 SbcC(Exonuclease SbcC; NCBI Accession number AAO82393.1), V-타입 ATP 합성효소 서브유닛 I(V-type ATP synthase subunit I; NCBI Accession number AFK59719.1), 점액 결합 단백질 전구체 Mub(Mucus binding protein precursor Mub; NCBI Accession number AAV43521.1), 부착 외부단백질(Adhesion exoprotein; NCBI Accession number ABJ59459.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number BAG25716.1), 추정 단백질(Hypothetical protein; NCBI Accession number ABD99146.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number AAK05215.1) 및 베타-갈락토시데이즈(Beta-galactosidase; NCBI Accession number AAV61011.1)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 유산균 검출용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유산균은 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri), 리기락토바실러스 살리바리우스(Ligilactobacillus salivarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 또는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)인 것을 특징으로 하는 유산균 검출용 바이오마커 조성물.
- 엑소뉴클레이즈 SbcC(Exonuclease SbcC; NCBI Accession number AAO82393.1), V-타입 ATP 합성효소 서브유닛 I(V-type ATP synthase subunit I; NCBI Accession number AFK59719.1), 점액 결합 단백질 전구체 Mub(Mucus binding protein precursor Mub; NCBI Accession number AAV43521.1), 부착 외부단백질(Adhesion exoprotein; NCBI Accession number ABJ59459.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number BAG25716.1), 추정 단백질(Hypothetical protein; NCBI Accession number ABD99146.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number AAK05215.1) 및 베타-갈락토시데이즈(Beta-galactosidase; NCBI Accession number AAV61011.1)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 유산균 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 엑소뉴클레이즈 SbcC(Exonuclease SbcC; NCBI Accession number AAO82393.1), V-타입 ATP 합성효소 서브유닛 I(V-type ATP synthase subunit I; NCBI Accession number AFK59719.1), 점액 결합 단백질 전구체 Mub(Mucus binding protein precursor Mub; NCBI Accession number AAV43521.1), 부착 외부단백질(Adhesion exoprotein; NCBI Accession number ABJ59459.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number BAG25716.1), 추정 단백질(Hypothetical protein; NCBI Accession number ABD99146.1), 보존된 추정 단백질(Conserved hypothetical protein; NCBI Accession number AAK05215.1) 및 베타-갈락토시데이즈(Beta-galactosidase; NCBI Accession number AAV61011.1)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 유산균 검출용 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 유산균 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 유산균은 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri), 리기락토바실러스 살리바리우스(Ligilactobacillus salivarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 또는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)인 것을 특징으로 하는 유산균 검출용 조성물.
- 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 유산균 검출용 키트.
- (1) 유산균 균주가 포함된 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
(2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및
(3) 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 유산균 검출 방법. - 제8항에 있어서, 상기 유산균 균주가 포함된 시료는 유산균 균주가 포함된 프로바이오틱스 또는 유제품인 것을 특징으로 하는 유산균 검출 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 유산균은 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri), 리기락토바실러스 살리바리우스(Ligilactobacillus salivarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 또는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)인 것을 특징으로 하는 유산균 검출 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210163369A KR20230076441A (ko) | 2021-11-24 | 2021-11-24 | 8종 유산균의 종 특이적인 실시간 pcr 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210163369A KR20230076441A (ko) | 2021-11-24 | 2021-11-24 | 8종 유산균의 종 특이적인 실시간 pcr 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20230076441A true KR20230076441A (ko) | 2023-05-31 |
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ID=86542835
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020210163369A KR20230076441A (ko) | 2021-11-24 | 2021-11-24 | 8종 유산균의 종 특이적인 실시간 pcr 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| KR (1) | KR20230076441A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102099344B1 (ko) | 2019-02-27 | 2020-04-09 | 경희대학교 산학협력단 | 락토바실러스 균주 검출용 멀티플렉스 pcr 프라이머 및 이의 용도 |
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2021
- 2021-11-24 KR KR1020210163369A patent/KR20230076441A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR102099344B1 (ko) | 2019-02-27 | 2020-04-09 | 경희대학교 산학협력단 | 락토바실러스 균주 검출용 멀티플렉스 pcr 프라이머 및 이의 용도 |
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