KR20230073566A - 등심단면적 연관 myh1 유전자 분석용 변형 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 등심단면적 연관 MYH1 유전자를 돼지의 등심단면적 수준 판별용 분자마커로 이용하기 위한 변형된 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 돼지의 등심단면적 수준 판별용 프라이머 세트를 이용하여 염기서열이 유사한 MYH1 유전자와 MYH2 유전자를 구분하여, MYH1 유전자내 등심단면적 수준을 결정하는 SNP를 특이적으로 증폭 또는 검출할 수 있으며, 적색근이 비율을 증가하도록 축소되도록 SNP를 고정하여 돼지의 육질을 고육질형으로 개량할 수 있다.
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Description
본 발명은 등심단면적 연관 MYH1 유전자를 돼지의 등심단면적 수준 판별용 분자마커로 이용하기 위한 변형된 프라이머 세트에 관한 것이다.
돈육의 품질을 제고하기 위하여, 돼지를 일정한 규격에서 사육하고 과학적으로 관리하고, 이로부터 얻어진 돈육을 브랜드화하고 있으며, 이미 다양한 브랜드의 돈육이 상업적으로 판매되고 있다. 그러나, 이처럼 일반 돈육과 브랜드육은 일반인이 육안으로 식별하기 어렵기 때문에, 이러한 점을 악용하여 브랜드육으로 속여서 판매하는 방식으로 돈육의 유통질서를 교란시키는 사건이 빈번하게 발생하고 있다. 실제로, 일반 돈육과 브랜드육을 구별하 는 것은 전문가의 수준에서도 매우 어려운 일이기 때문에, 정품 브랜드의 돼지육을 판단하는 객관적인 기준을 마련하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 연구의 일환으로서, 돈육의 유전자를 분석하여 브랜드육을 판단하는 방법이 개발되었는데, 이처럼 유전자를 분석하는 방법은 PCR 기술을 이용하는 RAPD(random amplified polymorphic DNA), SSCP(single strand conformation polymorphisms) 기법 등의 다양한 DNA 분석기법을 이용하여 돼지육의 품종을 판별하는 방법을 개발 및 발전시키려는 방향으로 활발한 연구가 이루어지고 있다. 이러한 연구의 일환으로, 본 발명자들은 돼지의 등심단면적을 기준으로 하여 돈육의 품질을 판단할 수 있는 방법을 개발하여 특허등록을 하였다(특허등록 제10-1418402호). 돼지의 등심단면적에 관여하는 MYH1 유전자에 포함된 SNP를 이용할 경우, 유전적으로 결정되는 돼지의 등심단면적의 수준을 판별하여, 돼지의 품질을 판단할 수 있는 방법에 관한 것이다. 그러나, MYH1 유전자를 검출할 수 있는 QTL 영역에서 MYH2 및 MYH4 유전자의 mRNA 염기서열과 MYH1 유전자의 mRNA 염기서열이 거의 유사하여 MYH1의 변이를 정확히 검출하는 것에 한계가 있으며 고가의 장비가 필요하다. 이에 정확하면서 간편하게 MYH1의 변이를 검출할 수 있는 방법을 개발하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 서열을 포함하는, 돼지의 등심단면적 수준 판별용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 돼지의 등심단면적 수준 판별용 조성물 및 SNP 분석 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 서열을 포함하는, 돼지의 등심단면적 수준 판별용 프라이머 세트이다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트에 의해 MYH1 유전자의 mRNA 염기서열 기준으로 개시코돈(ATG)로부터 4980번째 염기 또는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 77번째 염기가 특이적으로 증폭 또는 검출되는, 돼지의 등심단면적 수준 판별용 SNP 마커이다.
또한, 본 발명은 돼지의 등심단면적 수준 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 등심단면적 수준 판별용 조성물이다.
상기 제제는 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 세트 및 BspHI 제한효소를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 돼지의 등심단면적 수준 판별용 조성물을 포함하는 돼지의 등심단면적 수준 판별용 키트이다.
또한, 본 발명은 돼지로부터 분리된 시료의 게놈 DNA로부터 상기 돼지의 등심단면적 수준 판별용 SNP 마커가 포함된 MYH1 유전자를 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭시키는 단계; 상기 증폭된 MYH1 유전자를 제한효소 BspHI로 처리하는 단계; 및 상기 제한효소 BspHI에 의해 생성된 밴드의 양상을 비교하는 단계;를 포함하는, 돼지의 등심단면적 수준 판별 방법이다.
상기 제한효소 BspHI에 의해 생성된 밴드의 양상을 비교하는 단계는, 제한효소 BspHI에 의해 절단되지 않은 밴드를 생성할 경우, 돼지의 적색근이 증가하고 등심단면적 수준이 축소된 고육질형인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에 따른 돼지의 등심단면적 수준 판별용 프라이머 세트를 이용하여 염기서열이 유사한 MYH1 유전자와 MYH2 유전자를 구분하여, MYH1 유전자내 등심단면적 수준을 결정하는 SNP를 특이적으로 증폭 또는 검출할 수 있으며, 적색근의 비율이 증가하도록 SNP를 고정하여 돼지의 육질을 고육질형으로 개량할 수 있다.
도 1은 돼지 등심단면적을 측정하는 방법을 나타낸 사진이다.
도 2는 LK축군에서 등심단면적에 대한 GWAS 분석(a), 유전자영역(b) 및 후보군 유전자의 SNP 변이와 등심단면적 연관성 분석결과(c)를 나타낸 것이다.
도 3은 MYH1, MYH2 및 MYH4 유전자에 대한 염기서열 유사도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 MYH1 유전자의 SNP 주변 염기서열(서열번호 1) 및 A/G 변이위치를 나타낸 것이다.
도 5는 파이로시퀀싱(Pyro-sequencing)을 이용한 MYH1 유전자의 SNP(c.4980A>G) 변이를 검출한 그래프를 나타낸 것이다.
도 6은 변형 프라이머로 증폭한 염기서열(a) 및 이를 해독한 결과그래프(b)를 나타낸 것이다.
도 7은 MYH1 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다. (a)는 고육질형(QQ)과 저육질형(qq)의 밴드양상, (b)는 대요크셔(Y), 랜드레이스(L), 두록(D) 및 버크셔(B), 제주재래돼지(K) 및 난축맛돈(N)의 밴드양상이다.
도 2는 LK축군에서 등심단면적에 대한 GWAS 분석(a), 유전자영역(b) 및 후보군 유전자의 SNP 변이와 등심단면적 연관성 분석결과(c)를 나타낸 것이다.
도 3은 MYH1, MYH2 및 MYH4 유전자에 대한 염기서열 유사도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 MYH1 유전자의 SNP 주변 염기서열(서열번호 1) 및 A/G 변이위치를 나타낸 것이다.
도 5는 파이로시퀀싱(Pyro-sequencing)을 이용한 MYH1 유전자의 SNP(c.4980A>G) 변이를 검출한 그래프를 나타낸 것이다.
도 6은 변형 프라이머로 증폭한 염기서열(a) 및 이를 해독한 결과그래프(b)를 나타낸 것이다.
도 7은 MYH1 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다. (a)는 고육질형(QQ)과 저육질형(qq)의 밴드양상, (b)는 대요크셔(Y), 랜드레이스(L), 두록(D) 및 버크셔(B), 제주재래돼지(K) 및 난축맛돈(N)의 밴드양상이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 서열을 포함하는, 돼지의 등심단면적 수준 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3'-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형이 가능하다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 당업계에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제작하여 사용할 수 있다.
프라이머는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 상기 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 10 내지 500bp의 길이로 사용할 수 있다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 의하면, MYH1 유전자의 염기서열과 MYH2 유전자의 염기서열이 거의 유사하여 MYH1 유전자의 다형성(SNP) 부위를 정확하게 검출해내는 것에 한계가 있고, 고가의 장비가 필요하므로, MYH1 유전자의 SNP를 인위적으로 인지할 수 있도록 상기와 같이 변형된 프라이머를 이용할 수 있다.
상기 변형된 프라이머는 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 서열번호 6의 프라이머는 후술하는 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 19번째 G 염기를 T 염기로 치환한 서열을 포함한 것이다.
즉, 본 발명의 서열번호 6 및 7로 표시되는 프라이머를 포함함으로써, 염기서열이 유사한 MYH2 유전자와 구분하여 MYH1 유전자의 SNP가 증폭되고, BspHI 제한효소를 처리하여 등심단면적 수준을 결정하는 대립유전자를 식별할 수 있다.
본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele) 가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게 는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.
본 발명의 용어 "개체"란, 등심단면적 수준을 확인하고자 하는 대상인 돼지를 의미하며, 상기 돼지로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 돼지의 등심단면적 수준을 판단할 수 있다. 상기 검체로는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.
또한, 상기 돼지는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 제주재래돼지 및 수입개량종(대요크셔, 두록, 버크셔, 랜드레이스 등) 교잡종일 수 있다.
본 발명에서 용어, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입 을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에 있어서 SNP 마커에 결합하여 인식하는 데 사용되는 프로브는 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 서열을 포함하며, 이에 제한되지 않으나 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 잡종(hybrid) 형태일 수 있다. 또한, 육안으로 인식가능하도록 하기 위해 프로브의 5' 또는 3' 말단에 형광 표지인자, 방사선 표지 인자 등을 추가로 부착할 수 있다.
본 발명의 용어 "MYH1 유전자"란, 동물의 근육을 구성하는 마이오신에 포함된 중쇄단백질의 하나인 Myosin-1을 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 MYH1 유전자는 돼지의 경우 40개의 exon으로 구성되고, mRNA 염기서열을 기준으로 5,802bp의 길이를 가지며, 아미노산 서열을 기준으로는 1,933aa의 길이를 갖는다. 상기 MYH1 유전자의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있는데, 그 예로서, GenBank Accession No. NM_005963.3로 표시되는 유전자가 될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 Myosin-1은 마이오신에 포함된 10종류의 중쇄단백질 중의 하나로서, 배아 발달과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.
제주재래흑돼지와 랜드레이스 돼지를 교배하여 얻어진 자손을 대상으로 MS 마커 또는 대용량 SNP chip을 이용하여 돼지 등심단면적 수준에 대한 QTL 분석 또는 GWAS 분석을 수행한 결과 12번 염색체에 존재하는 MYH1, MYH2, MYH4 등을 통해 등심단면적의 수준이 변화되는 연관성을 확인하였다. 그 중 MYH1 유전자의 SNP인 c.4980A>G 변이에 의한 등심단면적 수준의 변화가 가장 높은 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명은 상기 프라이머 세트에 의해 MYH1 유전자의 mRNA 염기서열 기준으로 개시코돈(ATG)로부터 4980번째 염기 또는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 77번째 염기가 특이적으로 증폭 또는 검출되는, 돼지의 등심단면적 수준 판별용 SNP 마커에 관한 것이다.
본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 SNP 마커를 특이적으로 검출하기 위해 변형된 프라이머를 이용하여 MYH1 유전자를 증폭하고, 염기서열이 유사한 MYH2 유전자와 구분하여 MYH1 유전자의 SNP 마커를 특이적으로 검출할 수 있다. 상기 변형된 프라이머는 상술한 바와 같다.
본 발명은 다른 관점에서, 돼지의 등심단면적 수준 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 등심단면적 수준 판별용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 증폭을 통해 확인하여 돼지의 등심단면적 수준을 판단할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 의미한다. 상기 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 10 내지 100 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일필 요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 하고, 바람직하게는 서열번호 6 내지 7의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 등심단면적 수준 판별용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
상기 키트는 RT-PCR 키트, 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 PCR 키트는, SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레 오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 각각의 프라이머쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 등의 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 키트는 PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism) 수행을 위한 키트일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 돼지로부터 분리된 시료의 게놈 DNA로부터 상기 돼지의 등심단면적 수준 판별용 SNP 마커가 포함된 MYH1 유전자를 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭시키는 단계; 상기 증폭된 MYH1 유전자를 제한효소 BspHI로 처리하는 단계; 및 상기 제한효소 BspHI에 의해 생성된 밴드의 양상을 비교하는 단계;를 포함하는, 돼지의 등심단면적 수준 판별 방법에 관한 것이다.
본 발명의 증폭된 산물을 분석하는 방법은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, AffymetrixGeneChip), 및 BeadArrayTechnologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.
PCR-RFLP 방법은 가축의 유전적 특성이나 능력 개량을 위한 다양한 DNA 분석기술 중, PCR 기술을 이용한 유전자 단편들의 다형성(Restriction Fragment length polymorphism)을 분석하는 기법으로, 특정 점돌연변이(point mutation) 부위에 제한효소 인지부위가 존재할 경우, 각 개체의 유전자형 차이에 따라 제한효소에 의해 절단되어 생기는 절편의 길이가 다양하게 나타나는 것을 이용하여 각 개체의 바람직한 유전자형을 보다 신속하고 정확하게 판정하는 방법이다.
본 발명에서는 증폭 산물 확인을 위해 겔 전기영동법을 이용하여 수행하였으나, 이에 한정되지 않고, 증폭 표적 서열에 검출 가능한 표지 물질을 표지하여 검출할 수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "제한효소"란, DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제(핵산분 해효소의 하나)로서 유전공학에서 재조합 DNA를 만들기 위해서 사용하는 특수한 효소를 의미한다. 본 발명에 있어서, 돼지의 등심단면적에 영향을 미치는 SNP를 특이적으로 절단할 수 있는 제한효소는 BspHI이 될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 의하면, MYH1 유전자의 단백질 변이를 동반한 염기변이 영역을 중심으로 분석해 본 결과, MYH4 유전자와는 서열이 많이 다르지만 MYH2 유전자와는 거의 동일하게 일치하는 것으로 확인하였다. 따라서, MYH1 유전자의 변이영역 c.4980A>G에 특이적으로 반응하고 인위적으로 제한효소를 인지할 수 있도록 프라이머 서열을 변형하여 제작하였다.
상기 변형된 프라이머에 의해 염기서열이 유사한 MYH2 유전자와 구분하여 MYH1 유전자의 SNP가 증폭되고, BspHI 제한효소를 처리하여 등심단면적 수준을 결정하는 대립유전자를 식별할 수 있다. 구체적으로, c.4980A>G의 A/G 변이 중 G 유전자형으로 고정될 경우, 적색근 비율이 증가하고 등심단면적이 축소된 고육질형인 것으로 판단할 수 있다.
상기 제한효소 BspHI에 의해 생성된 밴드의 양상을 비교하는 단계는, 상기 제한효소 BspHI에 의해 절단되지 않은 밴드를 생성할 경우, 돼지의 등심단면적 수준이 축소된 고육질형인 것으로 판단할 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1 : 등심단면적 연관 MYH1 유전자
도 1은 돼지 등심단면적을 측정하는 방법을 나타낸 사진이다. 좌측사진은 돼지 등심, 우측 사진은 등심단면적을 측정하는 모습이다. 근육을 구성하고 있는 백색근이 많으면 근육량을 많게 하고 등심단면적이 커져 저육질형이고, 적색근의 비율이 증가하면 등심단면적이 작아져 고육질품질을 나타낸다.
도 2는 LK축군에서 등심단면적에 대한 GWAS 분석(a), 유전자영역(b) 및 후보군 유전자의 SNP 변이와 등심단면적 연관성 분석결과(c)를 나타낸 것이다. 도 2를 참고하면, 돼지의 등심단면적에 대한 조절영역은 12번 염색체에서 확인되고 양적형질유전자좌위(QTL) 영역 분석에서 MYH1 유전자를 후보유전자로 선정하였다. 도 2c에서 보는 바와 같이 SNP 변이와 등심단면적 연관성을 분석한 랭킹에서 MYH1 유전자가 유의성이 매우 높게 나타나 돼지의 게놈 DNA에서 등심단면적 수준을 추정하는 데 효과적으로 활용할 수 있는 유전자 마커로 확인하였다.
도 3은 MYH1, MYH2 및 MYH4 유전자에 대한 염기서열 유사도를 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 3을 참고하면, MYH1 유전자의 단백질 변이를 동반한 염기변이 영역을 중심으로 분석해 본 결과, MYH4 유전자와는 서열이 많이 다르지만 MYH2 유전자와는 거의 동일하게 일치한다. DNA 서열상에서 거의 구분이 되지 않아 MYH1 유전자에만 특이적으로 반응할 수 있는 프라이머를 제작하였다.
실시예 2 : 프라이머 서열 변형을 통한 PCR-RFLP
2-1 파이로시퀀싱(Pyro-sequencing) 분석용 프라이머
도 4는 MYH1 유전자의 SNP 주변 염기서열(서열번호 1) 및 A/G 변이위치를 나타낸 것이다.
상기 MYH1의 SNP(c.4980A>G) 변이를 검출할 수 있는 프라이머는 하기와 같다.
서열번호 2: MYH1_1F(24mer): GTC-TCA-ATG-ACC-GTT-CAT-CCC-ACA
서열번호 3: MYH1_1R(25mer): biotin-GCA-AGA-ATT-TCA-CCT-TCA-GTC-CAC-T
서열번호 4: MYH1_mini(20mer): ACC-TGG-ATG-ACG-CTC-TCA-GG
서열번호 5: 입력: [A/G]GCCAAGAGGACCTGAAGGAGCA
상기 서열번호 2를 정방향 프라이머, 서열번호 3을 역방향 프라이머로 이용하는 프라이머 세트를 제작하고, 서열번호 3의 역방향 프라이머 MYH1_1R는 5'-말단에 비오틴(biotin)이 결합된 형태로 제작하였다. PCR 증폭(PCR 조건 : 96℃ 30sec, 55℃ 30sec, 72℃ 30sec / 30 cycles)을 수행하여 변이된 유전자 시료를 대상으로 파이로시퀀싱(Pyro-sequencing) 방법으로 유전자형을 분석하였다.
도 5는 파이로시퀀싱(Pyro-sequencing)을 이용한 MYH1 유전자의 SNP(c.4980A>G) 변이를 검출한 그래프를 나타낸 것이다. 도 5를 참고하면, MYH1 유전자의 SNP 변이인 AA, AG 및 GG 유전자형이 각각 다른 결과를 나타냄을 확인할 수 있다.
2-2 PCR-RFLP 분석용 변형 프라이머
MYH1 유전자 내 다형성 부위(c.4980A>G)에서 등심단면적 수준을 나타내는 대립유전자형을 보다 명확하게 식별하기 위해 PCR-RFLP 방법으로 발현을 분석하였다.
MYH1 유전자의 프로모터 영역내(c.4980A>G)에서 T/CATGA 서열의 변이를 MYH2 유전자와 구분하여 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머를 제작하기 위해, BspHI 제한효소를 인지할 수 있도록 하기와 같이 변형을 유도하였다.
- mismatch primer
~~~~~~~TCAGGA → ~~~~~~~TCATGA [G→T로 변형]
~~~~~~~TCAGGG → ~~~~~~~TCATGG [G→T로 변형]
제작된 변형 프라이머는 하기와 같다.
서열번호 6: MYH1 Primer F(43mer): 5'- CAT-CCC-ACA-GGA-CAC-CCA-GAT-CCA-CCT-GGA-TGA-CGC-TCT-CAt-G - 3'
서열번호 7: MYH1 Primer R(25mer): 5'-AGT-GGA-CTG-AAG-GTG-AAA-TTC-TTG-C - 3'
상기 서열번호 6을 정방향 프라이머, 서열번호 7을 역방향 프라이머로 이용하는 프라이머 세트를 제작하고 PCR증폭(PCR 조건 : 94℃ 30sec, 55℃ 30sec, 72℃ 30sec / 35 cycles)에 이용하였다.
PCR 조건에 따라 증폭하고, 최종 연장은 55℃에서 30초간, 전기영동은 1.5% 아가로스겔에서 20분 수행하여, PCR 산물 크기를 271bp로 증폭하고 변이된 유전자 시료를 분석하였다.
도 6은 변형 프라이머로 증폭한 염기서열(a) 및 이를 해독한 결과그래프(b)를 나타낸 것이다. 도 6b를 참고하면, 기존 TCAGG에서 TCATG로 염기서열이 바뀐 것을 확인할 수 있다.
상기 염기서열이 바뀐 증폭산물에 제한효소 BspHI 을 처리하고 2.5% 아가로스겔에서 25분간 다시 전기영동하였다.
도 7은 MYH1 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다. 도 7a를 참고하면, 등심단면적을 높은 수준으로 나타내는 고육질인자를 가진 개체(QQ)는 BspHI 제한효소에 의해 절단되지 않아 271bp의 밴드를 생성하지만, 저육질형 돼지(qq)는 절단되어 232bp의 절단된 밴드를 생성하였다. 중간육질(Qq) 개체는 절단된 밴드와 절단되지 않은 밴드 두 양상을 모두 보였다.
변형된 프라이머를 이용하여 여러 품종을 PCR 증폭하였을 때, BspHI 제한효소로 절단한 밴드 양상은 확연히 달라 매우 명확하게 구분할 수 있다. 도 7b를 참고하면, 대요크셔(Y), 랜드레이스(L), 두록(D) 및 버크셔(B)는 절단되어 232bp의 밴드를 생성하였고, 제주재래돼지(K)와 난축맛돈(N)은 절단되지 않아 271bp의 밴드를 생성하였다.
따라서, 제한효소에 의한 절단 여부에 따라 고육질형과 저육질형을 구분할 수 있으며, 구체적으로, c.4980A>G의 A/G 변이 중 G 유전자형으로 고정될 경우, 적색근 비율이 증가하고 등심단면적이 축소된 고육질형인 것으로 판단할 수 있다.
상기 실시예들을 통해 제주재래돼지를 비롯하여 난축맛돈은 고육질인자를 가진 개체로 수입개량종과 확연히 차이가 있으며 완벽하게 유전자 진단에 의한 구분이 가능하였다.
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cacccaggtg agtgagtata acagaagagt aaaaactaca gtggactgaa ggtgaaattc 300
ttgctcaaa 309
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYH1_mini
<400> 4
acctggatga cgctctcagg 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYH1_INSERT
<400> 5
ngccaagagg acctgaagga gca 23
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYH1 Primer F
<400> 6
catcccacag gacacccaga tccacctgga tgacgctctc atg 43
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYH1 Primer R
<400> 7
agtggactga aggtgaaatt cttgc 25
Claims (7)
- 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 서열을 포함하는,
돼지의 등심단면적 수준 판별용 프라이머 세트. - 제 1항의 프라이머 세트에 의해 MYH1 유전자의 mRNA 염기서열 기준으로 개시코돈(ATG)로부터 4980번째 염기 또는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 77번째 염기가 특이적으로 증폭 또는 검출되는,
돼지의 등심단면적 수준 판별용 SNP 마커. - 제 2항의 돼지의 등심단면적 수준 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는,
돼지의 등심단면적 수준 판별용 조성물. - 제 3항에 있어서,
상기 제제는 제 1항의 프라이머 세트 및 BspHI 제한효소를 포함하는 것인,
돼지의 등심단면적 수준 판별용 조성물. - 제 3항 또는 제 4항의 조성물을 포함하는 돼지의 등심단면적 수준 판별용 키트.
- 돼지로부터 분리된 시료의 게놈 DNA로부터 제 2항의 SNP 마커가 포함된 MYH1 유전자를 제 1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭시키는 단계;
상기 증폭된 MYH1 유전자를 제한효소 BspHI로 처리하는 단계; 및
상기 제한효소 BspHI에 의해 생성된 밴드의 양상을 비교하는 단계;를 포함하는,
돼지의 등심단면적 수준 판별방법. - 제 6항에 있어서,
상기 제한효소 BspHI에 의해 생성된 밴드의 양상을 비교하는 단계는, 상기 제한효소 BspHI에 의해 절단되지 않은 밴드를 생성할 경우, 돼지의 적색근이 증가하고 등심단면적 수준이 축소된 고육질형으로 판단하는,
돼지의 등심단면적 수준 판별방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210160089A KR20230073566A (ko) | 2021-11-19 | 2021-11-19 | 등심단면적 연관 myh1 유전자 분석용 변형 프라이머 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020210160089A KR20230073566A (ko) | 2021-11-19 | 2021-11-19 | 등심단면적 연관 myh1 유전자 분석용 변형 프라이머 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230073566A true KR20230073566A (ko) | 2023-05-26 |
Family
ID=86536985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020210160089A KR20230073566A (ko) | 2021-11-19 | 2021-11-19 | 등심단면적 연관 myh1 유전자 분석용 변형 프라이머 및 이의 용도 |
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| Country | Link |
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| KR (1) | KR20230073566A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101418402B1 (ko) | 2012-12-31 | 2014-07-11 | 경상대학교산학협력단 | 돼지의 등심단면적 수준 판단용 ｓｎｐ 마커 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-11-19 KR KR1020210160089A patent/KR20230073566A/ko unknown
Patent Citations (1)
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| KR101418402B1 (ko) | 2012-12-31 | 2014-07-11 | 경상대학교산학협력단 | 돼지의 등심단면적 수준 판단용 ｓｎｐ 마커 및 이의 용도 |
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