KR20230067637A - 근이영양증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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레이첼 에이치. 크로스비
신시아 슈
바게스 존
지저스 캄파냐
바바라 자고진스카
리우보프 파르페노바
에카테리나 모코노바
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Abstract

본 개시 내용은 사르코스판 발현을 증가시키는 화합물에 관한 것이다. 본 개시 내용은 추가로 디스트로핀-관련 복합체의 감소 또는 기능 부전과 관련된 질병의 치료가 필요한 대상체에서 이를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

근이영양증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원
본 출원은 2020년 9월 11일에 제출된 미국 임시 출원 제63/077,329호와 2021년 2월 12일에 제출된 미국 임시 출원 제63/148,823호에 대해 우선권의 이익을 주장하며, 상기 문헌 각각의 전체 내용은 전문이 참조로서 포함된다.
정부 보조
본 출원은 미국 식품의약청에서 수여한 승인 번호(Grant Number) HL126204, AR048179, 및 AR065972 하에 정부 보조를 받아 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
근이영양증(muscular dystrophy)은 신경 조직의 파괴가 있거나 없는 상태의 근육 조직의 약화 및 쇠약을 특징으로 하는 대략 30개의 유전적 장애를 포괄한다. 9 가지 주요 유형의 근이영양증이 있는데, 이들 각각은 영구적인 힘의 손실, 장애 (disability) 증가 및 가능한 물리적 변형을 수반한다. 뒤센 근이영양증 (Duchenne muscular dystrophy, DMD)은 가장 잘-알려진 유형의 근이영양증으로, 전세계적으로 대략 5700명의 출생 남성당 1명 꼴로 발생한다. DMD는 세포외 기질에 대한 근형질막 (sarcolemma)의 접착 손실에 의해 유발된다.
DMD에 대한 치료제의 개발은 최근 2016 년의 에테플리르센 (eteplirsen)의 빠른 승인과, 희귀 질병 프로그램의 민간 부문 자금 (private sector funding)의 증가로 인해 동력을 얻고 있다. 그러나, DMD에 대한 기존의 FDA 승인 약물은 실질적으로 질병의 진행을 늦추는데 충분하지 않다. 이는 코르티코스테로이드가 염증을 약화시켜 보행을 수 년 연장시키기는 하나, 접착 복합체와 막 안정성의 결핍을 해결하지는 않는다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 엑손 스키핑 (exon skipping) 치료제인 에테플리르센은 절단된 디스트로핀 단백질의 생산을 증가시키지만, 엑손 51 스키핑에 순응하는 돌연변이를 갖는 DMD 환자의 대략 14%에 대해서만 적용가능하다. 근이영양증과 기타 근소모성 질병에 대한 보다 확고한 치료법을 찾아낼 필요가 있다.
본 발명의 개요
특정 구현예에서, 본 개시 내용은 화학식 (I)로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하며:
Figure pct00001
(I)
식 중
X는 CR7 또는 N이고;
Y는 S, O 또는 SO2이고;
Z는 N 또는 CR6이고;
R1, R2, R3, R4, R5 및 R7은 각각 독립적으로 H, 알킬, 알콕시, 할로, 니트릴, 아미노 또는 아미노알킬이고;
R6은 H 또는 알킬이고;
Q는 C=O, SO 또는 SO2이고;
Cy는 아릴 또는 헤테로아릴이고;
m은 1-3이다.
특정 구현예에서, 본 개시 내용은 화학식 (II)로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하며:
Figure pct00002
(II)
식 중
X은 O, N 또는 NR9이고;
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 H, 알킬, 알콕시, 할로, 니트릴, 아미노 또는 아미노알킬이고;
R6은 H, =O 또는 알킬이고;
Cy는 아릴 또는 헤테로아릴이고;
R7 및 R8은 각각 독립적으로 H 또는 알킬이거나, 또는 이들이 부착된 N 원자와 함께 헤테로사이클릴을 형성하고;
R9은 H 또는 알킬이다.
특정 구현예에서, 본 개시 내용은 디스트로핀-관련 복합체의 기능 부전과 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
도 1. 사르코스판(SSPN) 조절자에 대한 고처리량 스크리닝 (high-throughput screening)의 파이프라인. (a) hSSPN-EGFP C2C12 리포터 세포주 (n=1)를 사용하여, 거대 화학적 라이브러리를 스크리닝하였다. 상위 1000 개의 히트 (hit)를 hSSPN-EGFP 및 hSSPN-루시퍼라제 C2C12 리포터 세포주 (각각 n=3)에 대해 재스크리닝하였다. 1000 개의 화합물 중 63 개가 두 세포주 모두에서 리포터 발현을 증가시켜서, 이를 확정된 히트 (confirmed hit)로 간주하였다. 확정된 히트는 공통적인 구조적 특성에 기초하여 3개의 그룹으로 분류하였다: 약물작용발생단 1 (PC1), 약물작용발생단 2 (PC2), 및 통일된 구조적 테마가 없는 기타. 디스트로핀-결핍성 H2K mdx 세포에, 5.5 μM의 (b) 약물작용발생단 1 (PC1) 또는 (c) 기타 화합물을 48 시간 동안 처리하였다. 모든 세포는 분화 2 일차에 처리되고, 처리 48 시간 후에 수확되었다. 유전자 발현을 하우스키핑 유전자 β-액틴과 비히클-처리된 세포 (0.5% DMSO)에 대해 정규화하였다. 데이터는 개별 복제물(replicate) 및 평균값을 나타낸다. n=3-8.SSPN, 사르코스판; R.U., 상대적 단위. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 2. 확정된 히트는 mdx 근관 세포에서 사르코스판 유전자 및 단백질 발현을 증가시킨다. (a) 48 시간 동안 0.5 내지 50 μM의 약물작용발생단 1 또는 기타 화합물을 처리한 디스트로핀-결핍성 H2K mdx 세포에서의 상대적인 사르코스판 유전자 발현. 유전자 발현을 하우스키핑 유전자 β-액틴과 비히클-처리된 세포 (0.2% DMSO)에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SEM으로 나타나 있다. n=3-6. (b-c) 48 시간 동안 2.5 내지 10 μM의 화합물을 처리한 디스트로핀-결핍성 H2K mdx 세포의 사르코스판 면역 블롯. 모든 세포는 분화 2 일차에 처리되고, 처리 48 시간 후에 수확되었다. 사르코스판 단백질 수준을 ImageJ에서 정량화하여, GAPDH 및 비히클-처리된 세포 (0.2% DMSO)에 대해 정규화하였다. 세포 용해물을 개별 웨스턴 블롯에서 2-4 회 조사하였다. 대표적인 블롯이 나타난다. 이하의 면역블롯에 나타난 정량화는 모든 실험을 포함한다. 데이터는 개별 복제물 및 평균값을 나타낸다. 농도당 n=3. SSPN, 사르코스판; R.U., 상대적 단위. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 3. OT-9는 마우스 WT 근관 세포에서 사르코스판 유전자 발현을 증가시킨다. 48 시간 동안 5 μM의 OT-9 및 PC1-36을 처리한 C2C12 근관 세포는, 사르코스판 유전자 발현을 증가시킨 것으로 나타났다. 유전자 발현을 β-액틴 및 비히클-처리된 세포 (0.1% DMSO)에 대해 정규화하였다. 데이터는 개별 복제물 및 평균값을 나타낸다. n=3-27. SSPN, 사르코스판; R.U., 상대적 단위. ****p<0.0001.
도 4. OT-9는 세포 표면에서 라미닌 (laminin)-결합 단백질 복합체를 증가시킨다. 비히클 또는 5 μM의 OT-9를 48 시간 동안 처리한 C2C12 근관 세포를 아민-반응성 비오틴 중에 배양하여, 세포 표면 단백질을 표지하였다. 아비딘을 사용하여 상기 표지된 단백질을 친화성 정제한 후, (a) 알파-디스트로글리칸 (α-DG (글리칸)) 또는 코어 알파-디스트로글리칸의 라미닌-결합 글리코에피토프 (glycoepitope)를 인식하는 항원에 의해 면역블롯 분석을 실시하였다. (b) OT-9를 처리한 세포에서는, 세포 표면에서 당화 알파-디스트로글리칸 및 코어 알파-디스트로글리칸이 둘 다 증가하였다. (c-d) 면역블롯들의 정량화. (e) 비히클 또는 5 μM의 OT-9를 48 시간 동안 처리한 mdx 근관 세포를 비오틴 중에 배양하여 세포 표면 단백질을 표지하고, 아비딘에 의해 친화성 정제하였다. 면역블롯 분석에서, 비오틴-표지된 세포 표면 단백질과 연관된 우트로핀 (utrophin)의 상향 조절이 나타났다. (f) 우트로핀 면역블롯의 정량화. 데이터는 개별 복제물 및 평균값을 나타낸다. n=3. α-DG, 알파-디스트로글리칸; UTRN, 우트로핀; R.U., 상대적 단위. *p<0.05.
도 5. OT-9는 부분적으로 사르코스판의 상향 조절을 통해 디스트로핀-결핍성 근관 세포의 막 안정성을 개선시킨다. (a) 크레아틴 키나제 (CK) 방출 검정에서는 근관 세포에 삼투압 쇼크를 가하여, 세포 팽창과 막 손상을 유발하고, 세포내 CK가 세포로부터 주변 배지로 방출된다. CK 방출은 CK세포외/(CK세포외 + CK세포내)의 비를 취하여 계산한다. 2 일차, 처리된 (b) mdx에 48 시간 동안 5 μM의 OT-9를 처리하고, 28.5-224.5 밀리오스몰 (mosmol) 범위의 용액에 의해 삼투압 쇼크를 가하였다. (c) mdx 근관 세포를 24 또는 48 nM의 스크램블 siRNA 또는 siRNA 표적화 사르코스판에 의해 형질감염시켰다. 48 시간 후, 45 mosmol 용액에 의해 근관 세포에 삼투압 쇼크를 가하였다. 24 nM의 SSPN siRNA 형질 감염은, 스크램블 대조군에 비해 CK 방출에 영향을 주지 않았다. 48 nM 농도의 사르코스판 siRNA는 스크램블 대조군에 비해 CK 방출을 증가시키는데, 이는 사르코스판이 처리와는 무관하게 막 안정성에 기여한다는 것을 지칭하며, (d) 24 nM의 사르코스판 siRNA와 10 μM의 OT-9가 함께 처리된 mdx 근관 세포에서는, 사르코스판의 고갈이 OT-9의 막 안정성 개선 능력을 감소시키는 것으로 나타낸다. 데이터는 평균 + SEM을 의미한다. n=3. SSPN, 사르코스판; R.U., 상대적 단위. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 6. OT-9 및 OT-9m은 mdx 근육에서 사르코스판 mRNA를 시험관내 및 생체 내에서 증가시킨다. (a) 시험관내 사르코스판 mRNA의 안정성을 시험하기 위한 실험 환경의 도식적 개요. 분화 2일 차에, C2C12 근관 세포에 5 μM의 OT-9를 처리하였다. 4 시간 후, OT-9를 함유한 배지를 제거하고, 화합물이 없는 새로운 배지로 교체하였다. 배지 교체 직후 (0 h)와, 4 시간, 24 시간 및 48 시간 후에 유전자 발현 분석을 위해 세포를 수확하였다. (b) 4 시간의 처리 후 (0 h), OT-9는 사르코스판 유전자 발현을 유도하였다. 화합물의 연장된 제거 후 (4-48 시간), 사르코스판 mRNA 수준은 비히클 및 OT-9를 처리한 세포에서와 동일하였다. (c) 20-주령의 수컷 mdx 한배 새끼들 (littermates)의 양쪽 전경골근 (tibialis anterior muscle)에, 비히클 (5% DMSO, 95% PBS) 또는 3 mg/kg μg의 OT-9를 주사하였다. 4 시간 후, 근육을 수확하여 유전자 발현 분석을 위해 가공하였다. (d) 19-22-주령 수컷의 양쪽 전경골근에, 비히클 (5% DMSO, 95% PBS), 또는 3 mg/kg 및 10mg/kg의 OT-9m을 주사하였다. 4 시간 후, 근육을 수확하여 유전자 발현 분석을 위해 가공하였다. (e) 13-주령 mdx 수컷에, 비히클 (하이드록시프로필-b-사이클로덱스트린 중 4% PEG-200) 또는 20 mg/kg/일의 OT-9m을 피하 주사하였다. 13 일 간의 처리 후, 근육을 수확하여 유전자 발현 분석을 위해 가공하였다. 세포 발현을 β-액틴 및 비히클-처리된 세포에 대해 정규화하였다. 데이터는 개별 복제물 및 평균값을 나타낸다. 시험관내 연구에서는 n=3이고, 생체 내 연구에서는 n=2이다. SSPN, 사르코스판; R.U., 상대적 단위. **p < 0.01.
도 7. 플레이트 품질. 확고한 엄격하게 표준화된 평균차 (Robust strictly standardized mean difference) (SSMD*)를 사용하여, 플레이트 품질과 히트 선별을 평가하였다.
도 8. OT-9는 mdx 근관 세포들에서 분화를 증가시킨다. 분화 2일 차에 mdx 근관 세포에 1, 5 및 10 μM의 OT-9를 처리하고, 분화 4일 차에 이를 검정하였다. (a-b) OT-9는 융합 지수에 의해 측정할 때 H2K mdx 근관 세포 분화, 및 (c) 미오게닌 (myogenin) 유전자 발현을 약간 증가시킨다. 데이터는 개별 복제물 및 평균값을 나타낸다. n=3. 축적자 = 200 μm. MYOG, 미오게닌; R.U., 상대적 단위. *p<0.05, **p<0.01.
도 9. OT-9는 여러가지 근원세포주에 효과적이다. (a) C2C12, (b) H2K WT, 및 (c) H2K mdx 근원세포는 OT-9에는 반응하나, PC1-36에는 반응하지 않는다. 근원세포에 1, 5 및 10 μM의 OT-9 또는 PC1-36을 24 시간 동안 처리하였다. 유전자 발현을 β-액틴 및 비히클-처리된 세포(0.1% DMSO)에 대해 정규화하였다. 데이터는 개별 복제물 및 평균값을 나타낸다. n=3-6. SSPN, 사르코스판; R.U., 상대적 단위. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 10. C2C12 SSPN-HiBiT 단백질 리포터 검정의 생성 및 검정.
10(a) 사르코스판의 N-말단에 융합된 11-아미노산의 HiBiT를 갖는 근형질막에서, 사르코스판의 토폴로지(topology)의 개요. 10(b) 분화함에 따라 SSPN-HiBiT 단백질 수준이 증가한다. 10(c) SSPN-HiBiT 근관 세포는 양성 대조군인 GW5074, c-raf 저해제에 대해 반응한다. 양성 대조군으로서 GW5074를 사용한, 확고한 엄격하게 표준화된 평균차 (SSMD*)를 사용한 플레이트 품질의 계산에서는, SSMD*가 2.48로 나타나서, 이것이 우수한 일반 대조군(moderate control)이라는 것을 나타낸다. 10(d) SSPN-HiBiT 12-웰 및 384-웰 형식의 검정은, OT-9 처리 후 리포터 발현의 증가를 검출한다. SSPN-HiBiT 세포는 분화 2일 차에 처리되고, 분화 4일 차에 수확되었다. R.U.= 비히클 대조군 (DMSO), 12-웰 검정을 위한 단백질 농도, 또는 384-웰 검정을 위한 핵의 수에 대해 정규화된 상대적 단위. 나타낸 데이터는 평균± SEM 값을 나타낸다. n=6. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 11. OT-9는 총 용해물 중 라미닌-결합 단백질을 증가시켰다. 면역블롯 분석 전에 48 시간 동안 비히클 또는 5 μM의 OT-9를 처리한 C2C12 근관 세포. (a) OT-9를 처리한 세포에서는 완전 당화된 라미닌 결합 알파-디스트로글리칸 (α-DG (글리칸))이 증가하지 않았으나, 코어 알파-디스트로글리칸은 증가하였다. GAPDH는 로딩 대조군을 나타낸다. (b-c) 면역블롯들의 정량화. 데이터는 개별 복제물 및 평균값을 나타낸다. n=3. R.U., GAPDH 및 비히클 대조군에 대해 정규화된 상대적 단위.
도 12. SSPN의 siRNA-매개 녹다운은 76%의 녹다운 효율을 나타낸다. mdx 근관 세포에 1, 5 및 10 μM의 OT-9와, 24 nM의 스크램블 대조군 siRNA 또는 siRNA 표적화 SSPN mRNA를 함께 처리하였다. 유전자 발현을 β-액틴 및 비히클 siRNA 처리 세포 및 스크램블 siRNA 처리 세포에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SEM을 의미한다. n=3. SSPN, 사르코스판; R.U., 상대적 단위. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001.
도 13.　CD-1 마우스 혈장 중 1 μM의 OT-9 및 PC1-36의 반감기.
도 14.　PBS pH 7.4 중 1 μM의 OT-9 및 PC1-36의 반감기.
돌연변이의 불균일성(heterogeneity) 및 근육으로의 전달의 어려움은, DMD를 치료하기 위한 치료법을 개발하는데 대한 주요 난제이다. 이러한 어려움을 극복할 수 있는 개선된 치료가 긴급히 필요하다. 사르코스판 (SSPN)은 우트로핀-당단백질 복합체 (UGC)와 α7β1D-인테그린 접착 복합체의 막 국재화를 증가시킴으로써 DMD 뮤린 모델에서 근이영양증의 병리를 감소시켜서, 라미닌 결합을 효과적으로 증가시켜 디스트로핀의 손실을 보상한다.
SSPN 발현을 증가시키는 소분자 치료의 개발은, DMD 및 막 단백질의 결핍에 의해 유발된 다른 형태의 근이영양증을 치료하기 위한 단독 또는 조합 치료로 이어질 수 있다. 소분자 치료는 전달의 제한과 바이러스 및 세포-기반의 방법에서 보이는 면역 반응을 우회하는 능력 때문에 이상적이다.
특정 구현예에서, 본 개시 내용은 화학식 (I)로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하며:
Figure pct00003
(I)
식 중
X는 CR7 또는 N이고;
Y는 S, O 또는 SO2이고;
Z는 N 또는 CR6이고;
R1, R2, R3, R4, R5 및 R7은 각각 독립적으로 H, 알킬, 알콕시, 할로, 니트릴, 아미노 또는 아미노알킬이고;
R6은 H 또는 알킬이고;
Q는 C=O, SO 또는 SO2이고;
Cy는 아릴 또는 헤테로아릴이고;
m은 1-3이다.
특정 구현예에서, 본 개시 내용은 화학식 (II)로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하며:
Figure pct00004
(II)
식 중
X은 O, N 또는 NR9이고;
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 H, 알킬, 알콕시, 할로, 니트릴, 아미노 또는 아미노알킬이고;
R6은 H, =O 또는 알킬이고;
Cy는 아릴 또는 헤테로아릴이고;
R7 및 R8은 각각 독립적으로 H 또는 알킬이거나, 또는 이들이 부착된 N 원자와 함께 헤테로사이클릴을 형성하고;
R9은 H 또는 알킬이다.
특정 구현예에서, 화합물은 이하의 것들로부터 선택된다:
Figure pct00005
또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
다른 양태에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 화합물과 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 디스트로핀-관련 복합체의 기능 부전에 관한 질병의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 이는 본 개시 내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 디스트로핀-관련 복합체의 기능 부전과 관련된 질병은 근이영양증이다.
약학적 조성물
본 발명의 조성물 및 방법은 치료를 필요로 하는 개체를 치료하는데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 개체는 포유류, 예컨대 인간 또는 비-인간 포유류이다. 동물, 예컨대 인간에 투여될 때, 본 조성물 또는 화합물은 바람직하게는 예를 들어 본 발명의 화합물과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물로서 투여된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 당업계에 잘 알려져 있는데, 예를 들어 수용액, 예컨대 물 또는 생리적 완충 식염수 또는 다른 용매 또는 비히클, 예컨대 글리콜, 글리세롤, 오일, 예컨대 올리브유, 또는 주사용 유기 에스테르를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 약학적 조성물이 특히 침습적 경로의 투여(즉, 표피 장벽을 통한 전달 또는 확산을 피하는, 주사 또는 이식과 같은 경로)를 위한 인간 투여용인 경우, 수용액은 발열원이 없거나, 실질적으로 발열원이 없다. 부형제는 예를 들어 제제의 지연 방출에 영향을 주거나, 또는 하나 이상의 세포, 조직 또는 장기를 선택적으로 표적화하도록 선택될 수 있다. 약학적 조성물은 투여 단위 형태, 예컨대 정제, 캡슐 (스프링클 캡슐 및 젤라틴 캡슐 포함), 과립, 재구성용 동결건조체 (lyophile), 분말, 용액, 시럽, 좌약, 주사 등일 수 있다. 조성물은 또한 경피 전달 시스템, 예를 들어 피부 패치 내에 존재할 수 있다. 조성물은 또한 국소 투여에 적합한 용액, 예컨대 로션, 크림 또는 연고 중에 존재할 수 있다
약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어 본 발명의 화합물과 같은 화합물을 안정시키거나, 용해도를 증가시키거나, 흡수를 증가시키는 역할을 하는 생리적으로 허용가능한 제제를 함유할 수 있다. 이러한 생리적으로 허용가능한 제제는 예를 들어 탄수화물, 예컨대 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란, 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이트제, 저분자량 단백질 또는 다른 안정화제 또는 부형제를 포함한다. 생리적으로 허용가능한 제제를 포함한 약학적으로 허용가능한 담체의 선택은, 예를 들어 조성물의 투여 경로에 따라 달라진다. 제제 또는 약학적 조성물은 자가-연화 약물 전달 시스템 또는 자가-미세-연화 약물 전달 시스템일 수 있다. 약학적 조성물(제제)는 또한 리포좀 또는 이에 포함될 수 있는 다른 중합체 기질, 예를 들어 본 발명의 화합물일 수도 있다. 예를 들어, 인지질 또는 다른 지질을 포함하는 리포좀은 비교적 제조 및 투여가 간단하고 독성이 없는, 생리적으로 허용가능하고 대사가능한 담체이다.
본원에서 "약학적으로 허용가능한"이라는 어구는, 건전한 의학적 판단의 범주 내에서 과다 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제나, 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 합리적인 이점/위험 비율에 맞는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하며 이용된다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"라는 어구는, 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제제의 다른 성분과 양립가능하고, 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능해야" 한다. 약학적으로 허용가능한 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 예는, 이하의 것들을 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 ?? 좌약 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 아가; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원-불포함수; (17) 등장성 식염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알콜; (20) 인산염 완충 용액; 및 (21) 약학적 제제에 이용되는 다른 무-독성 양립가능 물질.
약학적 조성물 (제제)는 예를 들어 경구 (예를 들어, 수용액 또는 비-수용액 또는 현탁액으로서의 드렌치(drench), 정제, 캡슐 (스프링클 캡슐 및 젤라틴 캡슐 포함), 볼러스, 분말, 과립, 혀에 적용하기 위한 페이스트); 구강 점막을 통한 흡수 (예를 들어, 설하); 피하; 경피 (예를 들어, 피부에 적용되는 패치로서); 및 국소 (예를 들어, 피부에 적용되는 크림, 연고 또는 스프레이)를 포함한 임의의 여러가지 투여 경로에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 화합물은 또한 흡입용으로 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 화합물은 멸균수에 단순히 용해되거나, 또는 현탁될 수 있다. 적합한 투여 경로 및 이에 적합한 조성물에 대한 상세 사항은, 예를 들어, 미국 특허 제6,110,973호, 제5,763,493호, 제5,731,000호, 제5,541,231호, 제5,427,798호, 제5,358,970호 및 제4,172,896호, 뿐만 아니라 여기에 인용된 특허들에서 찾아볼 수 있다.
제형은 편리하게는 단위 투여 형태 내에 존재할 수 있고, 제약 업계에 잘 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생산할 수 있는 활성 성분의 양은, 치료 중인 숙주, 특정 투여 모드에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생산할 수 있는 활성 성분의 양은, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 것이다. 일반적으로, 그 양은 100 퍼센트 중에 약 1 퍼센트 내지 약 99 퍼센트의 활성 성분, 바람직하게는 약 5 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 약 10 퍼센트 내지 약 30 퍼센트의 범위일 것이다.
이러한 제형 또는 조성물을 제조하는 방법은, 활성 화합물, 예컨대 본 발명의 화합물을 담체, 및 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 함께 모아주는 (bring into association) 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 본 발명의 화합물과 액체 담체, 또는 미분된 고체 담체, 또는 둘 다를 한데 밀접하게 모은 후, 필요한 경우 생성물을 성형함으로써 제조된다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제형은, 캡슐 (스프링클 캡슐 및 젤라틴 캡슐 포함), 카세(cachets), 필(pills), 정제, 로젠지 (착향 주성분(basis), 통상 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트 사용), 동결건조물, 분말, 과립, 또는 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액, 또는 수-중 유 또는 유-중 수 액체 에멀전, 또는 엘릭시르 또는 시럽, 또는 향정 (pastilles)(불활성 베이스, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아 사용) 및/또는 구강 세정제 등의 형태일 수 있고, 이들 각각은 활성 성분으로서의 본 발명의 화합물을 사전 결정된 양으로 함유한다. 조성물 또는 화합물은 또한 볼러스, 연약 (electuary) 또는 페이스트로서 투여될 수도 있다.
경구 투여용 고체 투여 형태 (캡슐 (스프링클 캡슐 및 젤라틴 캡슐 포함), 정제, 필, 당의정, 분말, 과립 등)를 제조하기 위해, 활성 성분을 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트, 및/또는 이하의 것들 중 어느 것과 혼합한다: (1) 충전제 또는 증량제 (extender), 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및/또는 실릭산; (2) 결합제, 예컨대, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스 및/또는 아카시아; (3) 보습제, 예컨대 글리세롤; (4) 붕해제, 예컨대 아가-아가, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 탄산소듐; (5) 용액 지연제 (solution retarding agent), 예컨대 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예컨대 4차 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 예컨대, 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 클레이; (9) 윤활제, 예컨대 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 및 이들의 혼합물; (10) 착화제 (complexing agent), 예컨대, 변형 및 비변형된 사이클로덱스트린; 및 (11) 착색제. 캡슐 (스프링클 캡슐 및 젤라틴 캡슐 포함), 정제 및 필의 경우, 약학적 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 비슷한 유형의 고체 조성물은 또한 락토스 또는 유당, 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하는 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐 내의 충전제로서도 사용될 수 있다.
정제는 압축 또는 성형에 의해, 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 함께 제조될 수 있다. 압축 정제는 결합제 (예를 들어, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 붕해제 (예를 들어, 소듐 전분 글리콜레이트 또는 가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로스), 표면-활성제 또는 분산제를 사용하여 제조될 수 있다. 성형된 정제는 보습된 분말 화합물과 불활성 액체 희석제의 혼합물을 적합한 기계에서 성형하여 제조될 수 있다.
정제 및 약학적 조성물의 다른 고체 투여 형태, 예컨대 당의정, 캡슐 (스프링클 캡슐 및 젤라틴 캡슐 포함), 필 및 과립은, 선택적으로 선이 그어지거나(scored), 또는 코팅 또는 껍질, 예컨대 장용 코팅 및 제약 업계에 잘 알려진 다른 코팅을 갖도록 제조될 수 있다. 이들은 또한 예를 들어 하이드록시프로필메틸 셀룰로스를 다양한 비율로 사용하여 내부의 활성 성분이 지연 또는 조절 방출되도록 제형화되어, 원하는 방출 특성, 다른 중합체 매트릭스, 리포좀 및/또는 미소구체를 제공할 수 있다. 이들은 사용 직전에 예를 들어 박테리아-함유 필터를 통한 여과에 의해, 또는 멸균수에 용해될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태의 멸균제, 또는 일부 다른 멸균 주사 매체에 의해 멸균될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 선택적으로 불투명화제를 함유할 수도 있으며, 이들이 활성 성분(들)을 단독으로 또는 우선적으로, 단지 위장관의 특정 부위에서만 선택적으로 지연 방출시키는 조성물일 수 있다. 사용할 수 있는 포매 (embedding) 조성물의 예는, 중합성 물질과 왁스를 포함한다. 활성 성분은 또한 적합한 경우 하나 이상의 상기-기재된 부형제를 갖는 미세-캡슐화 제형일 수도 있다.
경구 제형에 유용한 액체 투여 형태는 약학적으로 허용가능한 에멀전, 재구성용 동결건조물, 미세에멀전, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 액체 투여 형태는 활성 성분 외에, 당업계에서 통상 사용되는 불활성 희석제, 예컨대, 물 또는 다른 용매, 사이클로덱스트린 및 이의 유도체, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참깨유), 글리세롤, 테트라하이드로퓨릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
경구 조성물은 또한 불활성 희석제 외에, 어주번트, 예컨대 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 착향제, 착색제, 향료 및 방부제를 포함할 수 있다.
현탁제는 활성 화합물 외에, 예를 들어 에톡시화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트 및 이들의 혼합물과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.
국소 또는 경피 투여용 투여 형태는, 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 또는 흡입제를 포함한다. 활성 화합물은 멸균 조건 하에서 약학적으로 허용가능한 담체, 및 필요할 수 있는 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 혼합될 수 있다.
연고, 페이스트, 크림 및 겔은 활성 화합물 외에, 부형제, 예컨대 동물 및 식물 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실릭산, 탈크 및 산화아연, 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
분말 및 스프레이는 활성 화합물 이외에, 부형제, 예컨대 락토스, 탈크, 실릭산, 수산화알루미늄, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 분말, 또는 이 물질들의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 추가로 통상의 추진제, 예컨대 염소불소탄화수소 및 휘발성 비치환 탄화수소, 예컨대 부탄 및 프로판을 함유할 수 있다.
경피 패치는 신체 내로의 본 발명의 화합물의 전달을 조절한다는 추가 장점을 갖는다. 이러한 투여 형태는 활성 화합물을 적당한 매체에 용해 또는 분산시켜 제조될 수 있다. 흡수 개선제는 또한 피부에 대한 화합물의 흐름을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 흐름의 속도는 속도 조절 막을 제공하거나 중합체 매트릭스 또는 겔에 화합물을 분산시킴으로써 조절될 수 있다.
본원에 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"이라는 어구는, 장 및 국소 투여가 아니되 통상 주사에 의한 투여 모드를 의미하며, 제한없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관경유, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 비경구 투여에 적합한 약학적 조성물은 하나 이상의 화합물과 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 멸균 등장성 수용액 또는 비수용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀전, 또는 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 현탁액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말을 조합하여 포함하는데, 이는 항산화제, 완충제, 정균제, 제제가 의도된 수여자의 혈액과 등장성을 이루게 하는 용질, 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 이용할 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는, 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물유, 예컨대 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적당한 유동성은 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이러한 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 어주번트도 함유할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 첨가에 의해 보장될 수 있다. 또한, 등장화제, 예컨대 당, 염화소듐 등을 조성물에 첨가하는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 주사용 약학적 형태의 흡수 연장은 흡수 지연제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함함으로써 일어날 수 있다.
일부 경우, 약물의 효과를 연장시키기 위해, 피하 또는 근육내 주사 시 약물의 흡수를 늦추는 것이 바람직하다. 이는 결정형 또는 수용성이 좋지 않은 무정형 물질의 액체 현탁액을 사용하여 달성될 수 있다. 이후, 약물의 흡수 속도는 용해 속도에 따라 달라지며, 그 다음으로 결정 크기와 결정형에 따라 달라질 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여된 약물 형태의 흡수 지연은 오일 비히클에 약물을 용해시키거나 현탁시켜 달성된다.
주사용 데포 형태는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리락티드-폴리글리콜리드 내 대상 화합물의 미세캡슐화 매트릭스를 형성하여 만들어진다. 약물 대 중합체의 비와 이용된 특정 중합체의 특성에 따라, 약물 방출 속도가 조절될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 데포 주사 제제는 또한 신체 조직과 양립가능한 리포좀 또는 미세에멀전에 약물을 가두어 제조된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위해, 활성 화합물은 그 자체로 제공되거나, 또는 약학적으로 허용가능한 담체와 조합된, 예를 들어 0.1 내지 99.5% (더욱 바람직하게는, 0.5 내지 90%)의 활성 성분을 함유한 약학적 조성물로서 제공될 수 있다.
도입 방법은 또한 재충전형 또는 생분해형 기기에 의해 제공될 수도 있다. 다양한 서방형 중합성 기기가 개발되었고, 최근 몇 년동안 단백질성 생약을 포함한 약물의 조절 전달에 대해 시험관 내에서 시험되었다. 생분해성 및 비-생분해성 중합체를 포함하는 다양한 생체적합성 중합체 (하이드로겔 포함)를 사용하여, 화합물을 특정 표적 부위에서 지속 방출하기 위한 임플란트를 형성할 수 있다.
약학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에 대한 독성이 없이 특정 환자, 조성물, 및 투여 모드에 대해 원하는 치료 반응을 얻는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 바뀔 수 있다.
선택된 투여량 수준은 특정 화합물 또는 이용된 화합물들의 조합, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용 중인 특정 화합물(들)의 분비 속도, 치료 지속 기간, 다른 약물, 이용된 특정 화합물(들)과 조합하여 사용된 화합물 및/또는 물질, 치료 중인 환자의 나이, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강 상태, 및 이전 의료 이력, 및 의료계에 잘 알려진 기타 요인에 따라 달라질 것이다.
당업계의 통상의 기술을 갖는 의사 또는 수의사는, 필요한 약학적 조성물의 치료 유효량을 쉽게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 약학적 조성물의 용량을, 원하는 치료 효과를 얻는 필요한 것보다 낮은 수준으로 시작하여 원하는 효과를 얻을 때까지 투여량을 증가시킬 수 있다. "치료 유효량"이란, 원하는 치료 효과를 유도하는데 충분한 화합물의 농도를 의미한다. 일반적으로, 화합물의 유효량은 대상체의 체중, 성별, 나이 및 의료 이력에 따라 달라질 것이다. 유효량에 영향을 주는 다른 요인은, 환자 병태의 심각성, 치료 중인 장애, 화합물의 안정성, 및 원한다면 본 발명의 화합물과 함께 투여되는 다른 유형의 치료제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 총 용량이 더 큰 경우, 제제를 다중 투여하여 전달할 수도 있다. 효능 및 투여량을 결정하는 방법은, 당업계에 잘 알려져 있다 (본원에 참조로서 포함된 문헌[Isselbacher 등 (1996) Harrison's Principles of Internal Medicine 13 ed., 1814-1882]).
일반적으로, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용된 활성 화합물의 적합한 일일 용량은, 치료 효과를 내는데 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 상기 기재된 요인에 따라 달라질 것이다.
원한다면, 활성 화합물의 유효 일일 용량은 하루 종일 적절한 간격으로 1 회, 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회 또는 그 이상의 하위-용량으로 개별 투여될 수 있으며, 선택적으로 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 활성 화합물은 매일 2 회 또는 3 회 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 활성 화합물은 매일 1 회 투여될 것이다.
이러한 치료를 받는 환자는 영장류, 특히 인간; 및 말, 소, 돼지, 양, 고양이 및 개와 같은 다른 포유류; 가금류; 및 전반적인 애완 동물을 포함한, 이를 필요로 하는 임의의 동물이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 화합물은 단독으로 사용되거나, 또는 다른 유형의 치료제와 함께 투여될 수 있다.
본 개시 내용은 본 발명의 조성물과 방법에 대한 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염의 사용을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 고려된 염은 알킬, 디알킬, 트리알킬 또는 테트라-알킬 암모늄 염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명에서 고려된 염은 L-아르기닌, 베넨타민, 벤자틴, 베타인, 수산화칼슘, 콜린, 데아놀, 디에탄올아민, 디에틸아민, 2-(디에틸아미노)에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 하이드라바민, 1H-이미다졸, 리튬, L-리신, 마그네슘, 4-(2-하이드록시에틸)모르폴린, 피페라진, 칼륨, 1-(2-하이드록시에틸l)피롤리딘, 소듐, 트리에탄올아민, 트로메타민, 및 아연 염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 고려된 염은 Na, Ca, K, Mg, Zn 또는 다른 금속 염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 고려된 염은 1-하이드록시-2-나프토산, 2,2-디클로로아세트산, 2-하이드록시에탄술폰산, 2-옥소글루타르산, 4-아세트아미도벤조산, 4-아미노살리실산, 아세트산, 아디프산, l-아스코르브산, l-아스파르트산, 벤젠술폰산, 벤조산, (+)-캄포산, (+)-캄포-10-술폰산, 카프르산 (데칸산), 카프로산 (헥산산), 카프릴산 (옥탄산), 카르본산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-디술폰산, 에탄술폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티스산, d-글루코헵톤산, d-글루콘산, d-글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 힙푸르산, 브롬수소화산, 염산, 이소부티르산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, l-말산, 말론산, 만델산, 메탄술폰산, 나프탈렌-1,5-디술폰산, 나프탈렌-2-술폰산, 니코틴산, 질산, 올레산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 인산, 프로프리온산, l-피로글루탐산, 살리실산, 세바크산, 스테아르산, 숙신산, 황산, l-타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔술폰산, 트리플루오로아세트산, 및 운데실렌산의 산 염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
약학적으로 허용가능한 산 첨가염은, 또한 물, 메탄올, 에탄올, 디메틸포름아미드 등과의 다양한 용매화물로서 존재할 수 있다. 또한, 이러한 용매화물들의 혼합물도 제조될 수 있다. 이러한 용매화물의 공급원은 결정화 용매로부터 유래하거나, 제조 또는 결정화의 용매에 내재되거나, 또는 이러한 용매에 대해 우발적으로 제공될 수 있다.
습윤제, 유화제 및 윤활제, 예컨대 소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트, 뿐만 아니라 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 착향제 및 향료, 보존제 및 항산화제도 또한 조성물 내에 존재할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 항산화제의 예는, 이하의 것들을 포함한다: (1) 수-용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 하이드로콜로라이드, 소듐 비설페이트, 소듐 메타비설파이트, 소듐 설파이트 등; (2) 지-용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔 (BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; (3) 금속-킬레이트제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등.
정의
본 출원에 사용된 과학 및 기술 용어들은, 본원에서 달리 정의된 바 없는 경우, 당업계의 통상의 숙련자들이 공통적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 화학, 세포 및 조직 배양, 분자생물학, 세포 및 암 생물학, 신경생물학, 신경화학, 바이러스학, 면역학, 미생물학, 약학, 유전학, 및 단백질 및 핵산 화학과 함께 사용된 명명법 및 이들 기술은, 당업계에 잘 알려져 있고 공통적으로 사용된 것들이다.
본 개시 내용의 방법과 기술은 달리 기재된 바 없는 경우 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있는 종래의 방법에 따라, 본 명세서 전체에서 인용되고 논의된 다양한 일반적인 그리고 더욱 구체적인 참조 문헌들에 기재된 바와 같이 실시된다. 예를 들어, 문헌["Principles of Neural Science", McGraw-Hill Medical, New York, N.Y. (2000)]; 문헌[Motulsky, "Intuitive Biostatistics", Oxford University Press, Inc. (1995)]; 문헌[Lodish 등, "Molecular Cell Biology, 4판", W. H. Freeman & Co., New York (2000)]; 문헌[Griffiths 등, "Introduction to Genetic Analysis, 7판", W. H. Freeman & Co., N.Y. (1999)]; 및 문헌[Gilbert 등, "Developmental Biology, 6판", Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (2000)]를 참고한다.
본원에 사용된 화학 용어는, 달리 정의된 바 없는 경우, 문헌["The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms", Parker S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco, C.A. (1985)]에서 예시된 바와 같이 당업계의 종래의 용법에 따라 사용된다.
본 출원에 언급된 상기 모든 임의의 다른 간행물, 특허 및 공개된 특허 출원은 본원에 구체적으로 참조로서 포함된다. 서로 모순되는 경우, 특정 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.
본원에서 "제제"라는 용어는, 화학적 화합물 (예컨대, 유기 또는 무기 화합물, 화학적 화합물들의 혼합물), 생물학적 거대분자 (예컨대, 핵산, 항체 및 이의 일부, 뿐만 아니라 인간화, 키메라 및 인간 항체 및 단일클론 항체, 단백질 또는 이의 일부, 예를 들어 펩티드, 지질, 탄수화물), 또는 생물학적 물질로부터 얻은 추출물, 예컨대 박테리아, 진균 또는 동물 (특히 포유류)의 세포 또는 조직을 나타내는데 사용된다. 제제는 예를 들어 구조가 알려진 제제와 구조가 알려지지 않는 제제를 포함한다. 이러한 제제는 AR을 억제하거나 AR 분해를 촉진하는 능력으로 인해, 본 개시 내용의 방법 및 조성물에서 "치료제"로서 적합하다.
"환자", "대상체" 또는 "개체"는 상호 교환적으로 사용되며, 인간 또는 비-인간 동물을 지칭한다. 이러한 용어는 포유류, 예컨대 인간, 영장류, 가축 동물(소, 돼지 등 포함), 반려 동물 (예를 들어, 개, 고양이 등) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한다.
병태 또는 환자를 "치료하는"이라는 것은, 임상 결과를 포함한 유리하거나 원하는 결과를 얻기 위해 조치를 취하는 것을 지칭한다. 당업계에 잘 이해되어 있는 것은 물론 본원에 사용된 "치료"는, 임상 결과를 포함한 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 유익하거나 원하는 결과는 검출 가능하든 검출 불가능하든, 하나 이상의 증상 또는 병태의 경감 또는 개선, 질병 정도의 감소, 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 질병 상태, 질병의 전파 방지, 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 (palliation), 및 (부분적이든 전체적이든 간에) 차도를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받았을 때의 기대 생존율에 비해 연장된 생존율을 의미한다.
"예방하는"이라는 용어는 당업계에서 인정되며, 국소적 재발과 같은 상태 (예를 들어, 통증), 암과 같은 질병, 심장 마비과 같은 증상 복합체(syndrome complex) 또는 다른 의학적 병태에 대해 사용될 때 당업계에 잘 알려져 있고, 조성물을 받지 않은 경우에 비해 대상체에서 의학적 병태의 증상의 빈도를 감소시키거나, 이의 발병을 지연시키는 조성물의 투여를 포함한다. 따라서, 암의 예방은 예를 들어, 비치료 대조군 집단에 비해 예방적 치료를 받는 환자의 집단에서 검출 가능한 암 성장의 수를 감소시키는 것, 및/또는 치료 집단 대 비치료 대조군 집단에서 예를 들어 통계적으로 및/또는 임상적으로 유의한 양으로 검출 가능한 암 성장의 외관을 지연시키는 것을 포함한다.
물질, 화합물 또는 제제를 대상체에 "투여하는", 또는 화합물 또는 제제의 "투여"는, 당업계의 숙련자들에게 알려진 다양한 방법들 중 하나를 사용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 화합물 또는 제제는 정맥내로, 동맥으로, 피내로, 근육내로, 복강내로, 피하로, 안구로, 설하로, 경구로 (소화에 의해), 비강내로 (흡입에 의해), 척추내, 뇌내 및 경피적으로 (예를 들어 피부관 (skin duct)을 통한 흡수에 의해) 투여될 수 있다. 화합물 또는 제제는 또한 재충전형 또는 생분해형 중합성 기기 또는 다른 기기, 예를 들어 패치 또는 펌프, 또는 화합물 또는 제제의 연장된 방출, 지연 방출 또는 조절된 방출을 제공하는 제제에 의해 적절히 도입될 수도 있다. 투여는 또한 예를 들어 1회, 다수 회, 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 실시할 수도 있다.
물질, 화합물 또는 제제를 대상체에게 투여하는 적절한 방법은, 또한 대상체의 나이 및/또는 물리적 조건, 및 화합물 또는 제제의 화학적 및 생물학적 특성들 (예를 들어, 용해도, 소화성, 생체 이용성, 안정성 및 독성)에 의해서도 따라 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 화합물 또는 제제는 예를 들어 섭취에 의해 대상체에 경구 투여된다. 일부 구현예에서, 경구 투여된 화합물 또는 제제는 연장 방출 또는 지연-방출 제제이거나, 또는 이러한 지연 또는 연장 방출을 위한 기기를 사용하여 투여된다.
본원에 사용된 "공동 투여 (conjoint administration)"라는 어구는, 둘 이상의 상이한 치료제들의 임의의 형태의 투여로서, 제2 제제가 투여되나 이전에 투여된 치료제도 여전히 신체에서 유효한 것을 지칭한다 (예를 들어, 두 제제는 환자에서 동시에 유효하며, 두 제제의 시너지 효과를 낼 수 있다). 예를 들어, 상이한 치료 화합물들은 동일한 제제, 또는 별개의 제제 내에 포함되어 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 치료를 받는 개체는 상이한 치료제들의 조합 효과를 보아 유리할 수 있다.
약물 또는 제제의 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 용량"은, 대상체에 투여되었을 때 의도된 치료 효과를 갖게 될 약물 또는 제제의 양이다. 전체 치료 효과가 반드시 1 회 용량의 투여에 의해 발생해야 하는 것은 아니고, 연속 용량을 투여한 후에만 발생할 수도 있다. 따라서, 치료 유효량은 1 회 이상의 투여에 의해 투여될 수 있다. 대상체에 필요한 정확한 유효량은, 예를 들어 대상체의 크기, 건강 및 나이, 및 치료받는 병태, 예컨대 암 또는 MDS의 특성과 정도에 따라 달라질 것이다. 숙련 기술자들은 통상의 실험에 의해 소정의 상황에 대해 유효한 양을 용이하게 결정할 수 있다.
본원에서 사용된 "선택적인" 또는 "선택적으로"라는 것은, 이하에 기재된 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수 있으며, 본 명세서에는 상기 사건 또는 상황이 발생한 경우는 물론 발생하지 않은 경우도 포함된다는 것을 의미한다. 예를 들어, "선택적으로 치환된 알킬"은, 알킬이 치환될 수 있는 경우는 물론 알킬이 치환되지 않은 경우도 지칭한다.
본 발명의 화합물에서 치환기 및 치환 패턴은 당업계의 통상의 숙련자에 의해 선택되며, 용이하게 이용가능한 시작 물질로부터, 당업계에 알려진 기술뿐만 아니라 이하에 제시된 방법들에 의해 용이하게 합성될 수 있는 화학적으로 안정한 화합물을 얻을 수 있다고 이해될 것이다. 치환기 자체가 하나 이상의 기로 치환된 경우, 이러한 다수의 기는 안정한 구조를 얻을 수 있는 이상, 동일한 탄소 상에 있을 수도 있고, 상이한 탄소들 상에 있을 수도 있다고 이해된다.
본원에 사용된 "선택적으로 치환된"이라는 용어는, 소정의 구조에서 1 내지 6 개의 수소 라디칼이, 이하의 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 치환기의 라디칼로 치환되는 것을 지칭한다: 하이드록실, 하이드록시알킬, 알콕시, 할로겐, 알킬, 니트로, 실릴, 아실, 아실옥시, 아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아미노, 아미노알킬, 시아노, 할로알킬, 할로알콕시, -OCO-CH2-O-알킬, -OP(O)(O-알킬)2 또는 -CH2-OP(O)(O-알킬)2. 바람직하게는, "선택적으로 치환된"이라는 것은, 소정의 구조에서 1 내지 4 개의 수소 라디칼이 상기 언급한 치환기에 의해 치환되는 것을 지칭한다. 더욱 바람직하게는, 1 내지 3 개의 수소 라디칼이 상기 언급한 치환기에 의해 치환된다. 치환기는 더 치환될 수 있다고 이해된다.
본원에 사용된 "알킬"이라는 용어는, C1-C10 직-쇄 알킬기 또는 C1-C10 분지-쇄 알킬기를 포함하나 이에 제한되지 않는 포화 지방족 기를 지칭한다. 바람직하게는 "알킬" 기라는 것은, C1-C6 직-쇄 알킬기 또는 C1-C6 분지-쇄 알킬기를 지칭한다. 가장 바람직하게는, "알킬" 기라는 것은, C1-C4 직-쇄 알킬기 또는 C1-C4 분지-쇄 알킬기를 지칭한다. "알킬"의 예는 메틸, 에틸, 1-프로필, 2-프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 1-펜틸, 2-펜틸, 3-펜틸, 네오-펜틸, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 1-헵틸, 2-헵틸, 3-헵틸, 4-헵틸, 1-옥틸, 2-옥틸, 3-옥틸 또는 4-옥틸 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. "알킬" 기는 선택적으로 치환될 수 있다.
"아실"이라는 용어는, 당업계에 인정되어 있으며, 일반식 하이드로빌C(O)-, 바람직하게는 알킬C(O)-로 나타낸 기를 지칭한다.
"아실아미노"라는 용어는, 당업계에 인정되어 있으며, 아실 기에 의해 치환된 아미노 기를 지칭하며, 예를 들어 일반식 하이드로빌C(O)NH-로 나타낼 수 있다.
"아실옥시"이라는 용어는, 당업계에 인정되어 있으며, 일반식 하이드로빌C(O)O-, 바람직하게는 알킬C(O)O-로 나타난 기를 지칭한다.
"알콕시"라는 용어는, 산소가 부착된 알킬기를 지칭한다. 대표적인 알콕시 기는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, tert-부톡시 등을 포함한다.
"알콕시알킬"라는 용어는, 알콕시 기로 치환된 알킬 기를 지칭하며, 일반식 알킬-O-알킬로 나타낼 수 있다.
"알킬"이라는 용어는, 포화 지방족 기를 지칭하며, 직-쇄형 알킬 기, 분지-쇄형 알킬 기, 사이클로알킬 (지환족) 기, 알킬-치환 사이클로알킬 기 및 사이클로알킬-치환 알킬 기를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬은 골격 내에 30 개 이하의 탄소 원자 (예를 들어, 직쇄형에 대해서는 C1-30, 분지쇄형에 대해서는 C3-30), 더욱 바람직하게는 20 개 이하의 탄소 원자를 갖는다.
게다가, 본 명세서, 실시예 및 청구 범위에 사용된 "알킬"이라는 용어는, 비치환 및 치환된 알킬 기를 둘 다 포함한다고 의도되며, 후자는 탄화수소 골격의 하나 이상의 탄소 상의 수소가 치환기에 의해 대체되는 알킬 모이어티를 지칭하며, 여기에는 할로알킬 기, 예컨대 트리플루오로메틸 및 2,2,2-트리플루오로에틸 등이 포함된다.
"Cx-y" 또는 "Cx-Cy"라는 용어는, 화학적 모이어티, 예컨대 아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 알콕시와 함께 사용된 경우, 사슬 내에 x 내지 y 개의 탄소를 함유하는 기를 포함한다는 것을 의미한다. C0알킬은 관능기가 말단 위치에 있는 경우 수소를 나타내고, 내부에 있는 경우 결합을 나타낸다. C1-6알킬 기는 예를 들어 사슬 내에 1 내지 6 개의 탄소 원자를 함유한다.
본원에 사용된 "알킬아미노"라는 용어는, 적어도 하나의 알킬 기에 의해 치환된 아미노 기를 지칭한다.
본원에 사용된 "알킬티오"라는 용어는, 알킬 기에 의해 치환된 티올 기를 지칭하며, 일반식 알킬S-에 의해 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 "아미드"라는 용어는, 이하의 기를 지칭하며:
Figure pct00006
,
식 중 R9 및 R10은 각각 독립적으로 수소 또는 하이드로카르빌 기를 나타내거나, 또는 R9 및 R10은 이들이 부착된 N 원소와 함께 고리 구조 내에 4 내지 8 개의 원자를 갖는 헤테로사이클을 완성한다.
"아민" 및 "아미노"라는 용어는, 당업계에 인정되어 있으며, 비치환 및 치환된 아민 둘 다와 이의 염, 예를 들어 이하에 의해 나타낼 수 있는 모이어티를 지칭하며:
Figure pct00007
또는
Figure pct00008
,
식 중 R9, R10 및 R10'은 각각 독립적으로 수소 또는 하이드로카르빌 기를 나타내거나, 또는 R9 및 R10은 이들이 부착된 N 원소와 함께 고리 구조 내에 4 내지 8 개의 원자를 갖는 헤테로사이클을 완성한다.
본원에 사용된 "아미노알킬"이라는 용어는, 아미노 기에 의해 치환된 알킬 기를 지칭한다.
본원에 사용된 "아랄킬"라는 용어는, 아릴 기에 의해 치환된 알킬 기를 지칭한다.
본원에 사용된 "아릴"이라는 용어는, 치환 또는 비치환된 단일-고리 방향족 기를 포함하며, 상기 고리 내의 각 원자는 탄소이다. 바람직하게는, 고리는 5-원 내지 7-원 고리, 더욱 바람직하게는 6-원 고리이다. "아릴"이라는 용어는, 또한 둘 이상의 환형 고리를 갖는 다환 고리 시스템을 포함하는데, 여기에서는 둘 이상의 탄소가 두 개의 인접 고리에 공통적이되, 상기 고리 중 적어도 하나는 방향족이고, 예를 들어 다른 하나의 환형 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴 및/또는 헤테로사이클릴일 수 있다. 아릴 기는 벤젠, 나프탈렌, 페난트렌, 페놀, 아닐린 등을 포함한다.
"카르바메이트"라는 용어는 당업계에 인정되어 있으며, 이하의 기를 지칭하며:
Figure pct00009
또는
Figure pct00010
,
식 중 R9 및 R10은 독립적으로 수소 또는 하이드로카르빌 기를 나타낸다.
본원에 사용된 "카르보사이클릴알킬"라는 용어는, 카르보사이클 기에 의해 치환된 알킬 기를 지칭한다.
"카르보사이클"이라는 용어는, 5-7 원 단환 고리와 8-12 원 이환 고리를 포함한다. 이환형 카르보사이클의 각각의 고리는 포화, 불포화 및 방향족 고리로부터 선택될 수 있다. 카르보사이클은 2 개의 고리 사이에 1 개, 2 개, 또는 3 개, 또는 그 이상의 원자가 공유된 이환형 분자를 포함한다. "융합된 카르보사이클"이라는 용어는, 각각의 고리가 다른 고리와 함께 2 개의 인접한 원자를 공유하는 이환형 카르보사이클을 지칭한다. 융합된 카르보사이클의 각각의 고리는 포화, 불포화 및 방향족 고리로부터 선택될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 방향족 고리, 예를 들어 페닐은 포화 또는 불포화 고리, 예를 들어 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 또는 사이클로헥센에 융합될 수 있다. 원자가가 허용된다면 포화, 불포화 및 방향족 이환형 고리의 임의의 조합도 카보사이클릭의 정의에 포함된다. 예시적인 "카르보사이클"은, 사이클로펜탄, 사이클로헥산, 비사이클로[2.2.1]헵탄, 1,5-사이클로옥타디엔, 1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌, 비사이클로[4.2.0]옥트-3-엔, 나프탈렌 및 아다만탄을 포함한다. 예시적인 융합된 카르보사이클은 데칼린, 나프탈렌, 1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌, 비사이클로[4.2.0]옥탄, 4,5,6,7-테트라하이드로-1H-인덴 및 비사이클로[4.1.0]헵트-3-엔을 포함한다. "카르보사이클"은 수소 원자를 포함할 수 있는 임의의 하나 이상의 위치에서 치환될 수 있다.
본원에 사용된 "카르보사이클릴알킬"라는 용어는, 카르보사이클 기에 의해 치환된 알킬 기를 지칭한다.
"카르보네이트"라는 용어는 당업계에 인정되어 있으며, -OCO2- 기를 지칭한다.
본원에 사용된 "카르복시"라는 용어는, 화학식 -CO2H로 표현되는 기를 지칭한다.
본원에 사용된 "에테르"라는 용어는, -C(O)OR9 기를 지칭하며, 상기 화학식에서 R9는 하이드로카르빌 기를 나타낸다.
본원에 사용된 "에테르"라는 용어는, 산소를 통해 다른 하이드로카르빌 기에 연결된 하이드로카르빌 기를 지칭한다. 따라서, 하이드로카르빌 기의 에테르 치환기는 하이드로카르빌-O-일 수 있다. 에테르는 대칭 또는 비대칭일 수 있다. 에테르의 예는, 헤테로사이클-O-헤테로사이클 및 아릴-O-헤테로사이클을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 에테르는 일반식 알킬-O-알킬에 의해 나타낼 수 있는 "알콕시알킬" 기를 포함한다.
본원에 사용된 "할로" 및 "할로겐"이라는 용어는, 할로겐을 의미하며, 클로로, 플루오로, 브로모 및 아이오도를 포함한다.
본원에 사용된 "헤타랄킬" 및 "헤테로아랄킬"이라는 용어는, 헤타릴 기에 의해 치환된 알킬 기를 지칭한다.
"헤테로아릴" 및 "헤타릴"이라는 용어는, 치환 또는 비치환된 방향족 단일 고리 구조, 바람직하게는 5-원 내지 7-원 고리, 더욱 바람직하게는 5-원 내지 6-원 고리를 포함하는데, 이의 고리 구조는 적어도 하나의 헤테로원자, 바람직하게는 1 내지 4 개의 헤테로원자, 더욱 바람직하게는 1 개 또는 2 개의 헤테로원자를 포함한다. "헤테로아릴" 및 "헤타릴"이라는 용어는, 또한 둘 이상의 환형 고리를 갖는 다환 고리 시스템도 포함하는데, 여기에서는 둘 이상의 탄소가 두 개의 인접 고리에 공통적이되, 고리 중 적어도 하나는 헤테로방향족이고, 예를 들어 다른 하나의 환형 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로아릴 기는 예를 들어 피롤, 퓨란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진 및 피리미딘 등을 포함한다.
본원에 사용된 "헤테로원자"라는 용어는, 탄소 또는 수소가 아닌 임의의 원소의 원자를 의미한다. 바람직한 헤테로원자는 질소, 산소 및 황이다.
본원에 사용된 "헤테로사이클릴알킬"라는 용어는, 헤테로사이클 기에 의해 치환된 알킬 기를 지칭한다.
"헤테로사이클릴" , "헤테로사이클" 및 "헤테로사이클릭"이라는 용어는, 치환 또는 비치환된 비-방향족 고리 구조, 바람직하게는 3-원 내지 10-원의 고리, 더욱 바람직하게는 3-원 내지 7-원의 고리를 지칭하며, 이의 고리 구조는 적어도 하나의 헤테로원자, 바람직하게는 1 내지 4 개의 헤테로원자, 더욱 바람직하게는 1 개 또는 2 개의 헤테로원자를 포함한다. "헤테로사이클릴" 및 "헤테로사이클릭"이라는 용어는, 또한 둘 이상의 환형 고리를 갖는 다환 고리 시스템을 포함하는데, 여기에서 둘 이상의 탄소는 두 개의 인접 고리에 공통적이되, 상기 고리 중 적어도 하나는 헤테로사이클릭이고, 예를 들어 다른 하나의 환형 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴 및/또는 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로사이클릴 기는 예를 들어 피페리딘, 피페라진, 피롤리딘, 모르폴린, 락톤, 락탐 등을 포함한다.
본원에 사용된 "하이드로카르빌"이라는 용어는, =O 또는 =S 치환기를 갖지 않고 탄소 원자를 통해 결합된 기를 지칭하며, 전형적으로 적어도 하나의 탄소-수소 결합과 주된 탄소 골격을 갖지만, 선택적으로 헤테로원자를 포함할 수 있다. 따라서, 메틸, 에톡시에틸, 2-피리딜 및 심지어 트리플루오로메틸과 같은 기도 본 출원의 목적에서 하이드로카르빌로 간주되나, (연결 탄소 상에 =O 치환기를 갖는) 아세틸 및 (탄소가 아니라 산소를 통해 연결된) 에톡시와 같은 치환기는 하이드로카르빌로 간주되지 않는다. 하이드로카르빌 기는 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클, 헤테로사이클, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "하이드록시알킬"라는 용어는, 하이드록시 기에 의해 치환된 알킬 기를 지칭한다.
"저급 (lower)"이라는 용어는, 화학적 모이어티, 예컨대 아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 알콕시와 함께 사용될 때, 치환기 내에 10 개 이하의 탄소, 바람직하게는 6 개 이하의 탄소가 포함된다는 것을 의미한다. "저급 알킬"이라는 것은, 예를 들어, 10 개 이하의 탄소, 바람직하게는 6 개 이하의 탄소를 함유한 알킬 기를 지칭한다. 특정 구현예에서, 본원에서 정의된 아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 알콕시 치환기는 각각 저급 아실, 저급 아실옥시, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐 또는 저급 알콕시인데, 이들이 단독으로 나타나든, 나열되어 다른 치환기, 예컨대 하이드록시알킬 및 아랄킬과 조합되어 나타나든 무관하다 (상기한 경우, 예를 들어, 아릴 기 내의 원자는 알킬 치환기 내의 탄소 원자를 셀 때 계수되지 않는다).
"폴리사이클릴", "폴리사이클", 및 "폴리사이클릭"이라는 용어는, 2 개의 인접한 고리에서 둘 이상의 원자가 공통적인, 예를 들어 고리가 "융합된 고리"인 2 개의 고리(예를 들어, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로사이클릴)를 지칭한다. 폴리사이클의 각각의 고리는 치환되거나 비치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리사이클의 각각의 고리는 고리 내에 3 내지 10 개의 원자, 바람직하게는 5 내지 7 개의 원자를 함유한다.
"설페이트"라는 용어는, 당업계에 인정되어 있으며, -OSO3H 기 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 지칭한다.
"설폰아미드"이라는 용어는, 당업계에 인정되어 있으며, 이하의 일반식으로 나타낸 기를 지칭하며:
Figure pct00011
또는
Figure pct00012
,
식 중 R9 및 R10은 독립적으로 수소 또는 하이드로카르빌을 나타낸다.
"술폭시드"라는 용어는 당업계에 인정되어 있으며, -S(O)- 기를 지칭한다.
"술포네이트"라는 용어는 당업계에 인정되어 있으며, SO3H 기, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 지칭한다.
"술폰"라는 용어는 당업계에 인정되어 있으며, -S(O)2- 기를 지칭한다.
"치환된"이라는 용어는, 골격의 하나 이상의 탄소 상의 수소가 치환기에 의해 대체된 모이어티를 지칭한다. "치환" 또는 "~로 치환된"이라는 것은, 이러한 치환 시 치환된 원자 및 치환기의 허용된 원자가에 따르며, 예를 들어 재배열, 고리화, 제거 등에 의해 자발적으로 변환되지 않는 안정한 화합물이 그 치환으로 인해 생성된다는 단서를 은연 중에 포함한다고 이해될 것이다. 본원에 사용된 "치환된"이라는 용어는, 유기 화합물의 모든 허용되는 치환기를 포함하는 것으로 고려될 것이다. 넓은 양태에서, 허용되는 치환기는 유기 화합물의 비환형 및 환형, 분지형 및 비분지형, 카보사이클릭 및 헤테로사이클릭, 방향족 및 비-방향족 치환기를 포함한다. 허용되는 치환기들은 하나 이상일 수 있고, 적당한 유기 화합물에 대해서는 동일 또는 상이한 것일 수 있다. 본 발명의 목적에서, 질소와 같은 헤테로원자는 수소 치환기 및/또는 헤테로원자의 원자가를 만족하는, 본원에 기재된 유기 화합물의 임의의 허용되는 치환기를 가질 수 있다. 치환기는 본원에 기재된 임의의 치환기, 예를 들어 할로겐, 하이드록실, 카르보닐 (예컨대, 카르복실, 알콕시카르보닐, 포르밀, 또는 아실), 티오카르보닐 (예컨대, 티오에스테르, 티오아세테이트, 또는 티오포르메이트), 알콕실, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설프하이드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 헤테로사이클릴, 아랄킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다. 당업계의 숙련자들은 적당한 경우 탄화수소 사슬 상의 치환된 모이어티가 그 자체로 치환될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에 사용된 "티오알킬"라는 용어는, 티올 기에 의해 치환된 알킬 기를 지칭한다.
본원에 사용된 "티오에테르"라는 용어는, -C(O)SR9 또는 -SC(O)R9 기를 지칭하며
식 중 R9는 하이드로카르빌을 나타낸다.
본원에 사용된 "티오에테르"라는 용어는, 에테르와 동등하되, 산소가 황에 의해 대체된다.
"우레아"이라는 용어는, 당업계에 인정되어 있으며, 이하의 일반식로 표현되는 기를 지칭하며:
Figure pct00013
,
식 중 R9 및 R10은 독립적으로 수소 또는 하이드로카르빌을 나타낸다.
본원에 사용된 "조정하다 (modulate)"라는 용어는, 기능 또는 활성 (예컨대, 세포 증식)의 저해 또는 억제뿐만 아니라 기능 또는 활성의 향상도 포함한다.
"약학적으로 허용가능한"이라는 어구는, 당업계에 인정되어 있다. 특정 구현예에서, 상기 용어는 건전한 의학적 판단의 범주 내에서 과다 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제점이나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 합리적인 이점/위험 비율에 적합한 조성물, 부형제, 어주번트, 중합체 및 다른 물질, 및/또는 투여 형태를 포함한다.
"약학적으로 허용가능한 염" 또는 "염"은, 본원에서 환자의 치료에 적합하거나 이와 양립가능한 산 첨가염 또는 염기 첨가염을 지칭하기 위해 사용된다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용가능한 산 첨가염"이라는 용어는, 화학식 I에 의해 나타낸 임의의 염기 화합물의 임의의 무-독성 유기 또는 무기 염을 의미한다. 적합한 염을 형성하는 예시적인 무기산은, 염산, 수소화브롬산, 황산 및 인산, 뿐만 아니라 금속염, 예컨대 소듐 일수소 오르토포스페이트 및 포타슘 수소 설페이트도 포함한다. 적합한 염을 형성하는 예시적인 유기산은, 모노-, 디- 및 트리카르복실산, 예컨대 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 벤조산, 페닐아세트산, 신남산 및 살리실산, 뿐만 아니라 술폰산, 예컨대 p-톨루엔 술폰산 및 메탄술폰산도 포함한다. 모노 또는 디-산의 염 중 하나가 형성될 수 있고, 이러한 염은 수화, 용매화 또는 실질적인 무수 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 화학식 I의 화합물의 산 첨가염은 물 및 다양한 친수성 유기 용매에서 용해성이 더 크고, 일반적으로 이들의 자유 염기 형태에 비해 더욱 용융점이 높은 것으로 나타난다. 적절한 염의 선택은 당업계의 숙련자에게 알려져 있을 것이다. 다른 비-약학적으로 허용가능한, 예를 들어 옥살레이트는 예를 들어 실험 용도로는 화학식 I의 화합물을 분리하는데 사용되거나, 또는 추후 약학적으로 허용가능한 산 첨가염으로의 전환에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용가능한 염기 첨가염"이라는 용어는, 화학식 I로 표현되는 임의의 산 화합물 또는 이의 임의의 중간 생성물의 임의의 무-독성 유기 또는 무기 염기 첨가염을 의미한다. 적합한 염을 형성하는 예시적인 무기 염기는, 수산화리튬, 수산화소듐, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘 또는 수산화바륨을 포함한다. 적합한 염을 형성하는 예시적인 유기 염기는, 지방족, 지환족, 또는 방향족 유기 아민, 예컨대 메틸아민, 트리메틸아민 및 피콜린 또는 암모니아를 포함한다. 적절한 염의 선택은 당업계의 숙련자에게 알려져 있을 것이다.
본 개시 내용의 방법 및 조성물에 유용한 많은 화합물들은, 그 구조 내에 적어도 하나의 입체 중심을 갖는다. 이러한 입체 중심은 R 또는 S 배치로 존재할 수 있는데, 상기 R 및 S 개념은 문헌[Pure Appl. Chem. (1976), 45, 11-30]에 기재된 규칙에 따라 사용된다. 본 개시 내용은 화합물, 염, 전구 약물 또는 이들의 혼합물 (입체이성질체의 모든 가능한 혼합물 포함)의 모든 입체이성질체 형태, 예컨대 거울상 이성질체 및 부분입체이성질체 형태를 고려한다. 예를 들어, WO 01/062726를 참고한다.
게다가, 알케닐 기를 함유하는 특정 화합물은 Z (동일 방향(zusammen)) 또는 E (반대 방향(entgegen)) 동형체로 존재할 수 있다. 각각의 경우, 본 개시 내용은 혼합물과 각각의 개별 동형체를 둘 다 포함할 수 있다.
일부 화합물은 또한 토토머 형태로도 존재할 수 있다. 이러한 형태는 비록 본원에 기재된 화합식에는 명확히 나타나지 않았지만, 본 개시 내용의 범주 내에 포함될 것이다.
"전구 약물" 또는 "약학적으로 허용가능한 전구 약물"이라는 것은, 투여 후 숙주에서 대사되어, 예를 들어 가수분해되거나 산화되어, 본 개시 내용의 화합물 (예를 들어, 화학식 I의 화합물)을 형성하는 화합물을 지칭한다. 전구 약물의 전형적인 예는, 활성 화합물의 기능성 모이어티에 생물학적으로 취약하거나 절단가능한 (보호) 기를 갖는 화합물을 포함한다. 전구 약물은 산화, 환원, 아민화, 탈아민화, 수산화, 탈수산화, 가수분해, 탈가수분해, 알킬화, 탈알킬화, 아실화, 탈아실화, 인산화, 탈인산화되어 활성 화합물을 생산할 수 있는 화합물을 포함한다. 생물학적으로 취약하거나 절단가능한 (보호) 기로서 에스테르 또는 포스포라미데이트를 사용하는 전구 약물의 예는, 미국 특허 제6,875,751호, 제7,585,851호, 및 제7,964,580호에 개시되어 있으며, 상기 문헌들은 전문에 본원에 참조로서 포함된다. 본 개시 내용의 전구 약물은 대사되어, 화학식 I의 화합물을 생산한다. 본 개시 내용은 그 범주 내에 본원에 기재된 화합물의 전구 약물을 포함한다. 적합한 전구 약물의 선택과 제조를 위한 종래의 과정은 예를 들어 문헌["Design of Prodrugs" Ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985]에 기재되어 있다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"라는 어구는, 의학적 또는 치료 적 사용을 위한 약물을 제형화하는 데 유용한 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다.
본원에 사용된 "용해도의 Log", "LogS" 또는 "logS"라는 용어는, 당업계에서 화합물의 수성 용해도를 정량화하는데 사용한다. 화합물의 수성 용해도는 이의 흡수성 및 분배 특징에 유의하게 영향을 준다. 용해도가 낮은 경우, 종종 흡수성 불량과 함께 나타난다. LogS 값은 몰/리터로 측정된 용해도의 단위 제거 로그 (unit stripped logarithm)(밑(base) 10)이다.
실시예
이하에 전반적으로 기재되어 있는 본 발명은 이하의 실시예를 참고하여 더욱 용이하게 설명될 것이며, 상기 실시예는 본 발명의 특정 양태와 구현예를 설명할 목적으로만 포함되어 본 발명을 제한하지 않는다.
방법
리포터 세포주
인간 사르코스판 EGFP 리포터 C2C12 세포주 (hSSPN-EGFP)는, 문헌[Shu 등, Skelet Muscle. 2019; 9(1):32]에 기재된 바와 같이 사용하였다. 동일한 접근법을 사용하여 인간 사르코스판 루시퍼라제 (hSSPN-luc) C2C12 세포주를 생성하고, 이를 2차 스크리닝에 사용하였다.
소 분자
스크리닝 라이브러리는 캘리포니아 로스엔젤레스 대학의 Molecular Screen Shared Resource에서 제공받았다. 후속 연구에 사용된 시판용 화합물은 Asinex 및 Life Chemicals Inc.에서 구입하였다.
고처리량 스크리닝
Multidrop 384 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여, hSSPN-EGFP 근원세포를 384-웰의 흑색, 투명 바닥 마이크로플레이트 (Greiner) 내의 50 μl의 성장 배지에 웰당 500 개 세포로 분주하고, 3일 동안 배양하여, 세포가 컨플루언시 (confluency)에 도달하도록 두었다. 컨플루언시에 도달하면, EL406 콤비네이션 세척제 분배기 (Biotek)를 사용하여 성장 배지를, 2% 말 혈청을 갖는 DMEM (Sigma-Aldrich)로 이루어진 분화 배지 50 μl로 교체하였다. 분화 2일 차에, 잔여 부피 10 μl를 남기고 세포 상의 배지를 흡입해내고, 30 μl의 새로운 분화 배지로 교체하였다. Biomek Fx (Beckman)을 사용하여, DMSO 중 0.5 μl의 소분자 또는 (비히클 및 양성 대조군 웰에 대해서는) 단독 DMSO을 각 웰에 첨가하였다. DMSO의 적절한 혼합을 보장하기 위해, 양성 대조군이 처리된 웰을 제외한 모든 웰에 50 μl의 추가 분화 배지를 첨가하고, 양성 대조군이 처리된 웰에는 그 대신 인슐린 트랜스페린 셀레늄 (ITS) (Gibco)을 함유한 50 μl의 배지를 첨가하여, 최종 농도가 1% ITS에 이르렀다. 처리된 각 웰 내의 화합물의 최종 농도는 0.55% DMSO에서 5.5 μM이었고, 비히클 및 양성 대조군이 처리된 웰에 대해서는 0.55%의 DMSO이었다. 48 시간 동안 배양한 후, 배지를 Fluorobrite DMEM (Gibco)로 교체하고, ImageXpress Micro Confocal High Content 영상화 시스템 (Molecular Devices)을 사용하여 각각의 플레이트를 영상화하였다. 영상화 세포의 형광 강도는, MetaXpress 분석 소프트웨어 (Molecular Devices)에서 커스텀 모듈 분석을 사용하여 결정하였다. 분석 설정은 이하와 같았다: 탑 해트(top hat) (크기: 12, 필터 모양: 원형), 적응 역치 (공급원: 탑 해트, 최소 너비: 10, 최대 너비: 800, 국재적 백그라운드 이상의 강도: 500), 필터 마스크 (필터 유형: 최소 영역 필터, 최소 값: 500).
루시퍼라제 검정
hSSPN-루시퍼라제 근원세포는 상기에 기재한 바와 같이 배양하였다. 48 시간 동안 처리한 후, 플레이트를 RT까지 평형 상태가 되도록 두었다. EL406 콤비네이션 세척제 분배기를 사용하여, 각 웰의 세포 배양 배지를 흡입해내었다. Multidrop 384를 사용하여, 1:2로 희석된 Bright-Glo 루시퍼라제 검정 시스템 시약 (Promega)과 분화 배지를 세포에 첨가하였다. RT에서 3 분간 배양한 후, Envision 플레이트 판독기 (PerkinElmer)를 사용하여 발광 신호를 정량화하였다. 상대적인 발광 단위를 분석하여, 비히클 처리 세포 대비 처리 세포의 변화 배수를 결정하였다.
세포 배양
37℃, 5% CO2에서, C2C12 세포 (American Type Culture Collection)를 DMEM (Gibco)와 20% FBS (Sigma-Aldrich)가 함유된 성장 배지에서 성장시켰다. 90-100% 컨플루언시에 도달할 때, 배지를 DMEM 및 2%의 말 혈청으로 이루어진 분화 배지 (Sigma-Aldrich)로 교체하여, 근원세포가 분화되도록 유도하였다. 조건부 불멸화된 H2K WT와 디스트로핀의 엑손 23에 넌센스 돌연변이를 갖는 mdx 근원세포는, Terrance Partridge, Ph.D. (Children's National Medical Center, 워싱턴, D.C. 소재)로부터 받은 선물이었다. 문헌[Morgan 등, Dev Biol. 1994;162(2):486-98]을 참고한다. 33℃, 5% CO2에서, DMEM, 20% HI-FBS (Invitrogen), 2% L-글루타민 (Sigma-Aldrich), 2% 닭 배아 추출물 (Accurate Chemical), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich), 및 20 U/ml의 신선한 인터페론 감마 (Gibco)를 함유한 성장 배지가 담긴 0.01% 젤라틴 (Sigma-Aldrich) 코팅 플레이트에서 근원세포를 증식시켰다. 분화를 위해, H2K 근원세포를 DMEM에 희석된 0.1 mg/ml 마트리겔 (Corning)로 코팅된 플레이트에 분주하고, 증식 조건 하에서 성장시켰다. 90-100% 컨플루언시에 도달할 때, 확립된 프로토콜을 사용하여, 37℃, 5% CO2에서 5% 말 혈청 (Sigma-Aldrich), 2% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 갖는 DMEM을 함유한 분화 배지에서 세포를 성장시켰다.
세포 발현 분석
트리졸-기반의 (Thermo Fisher Scientific) 상 분리를 사용하여, 48 시간 동안 처리된 근관 세포의 RNA를 세포로부터 추출하였다, 문헌[Chomczynski 등, Biotechniques. 1993;15(3):532-4, 6-7]. NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 RNA 농도를 결정하고, iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad)를 사용하고 이하의 순환 조건에 의해, 20 μl 반응물에서 750 ng의 RNA를 역전사하였다: 5 분 동안 25℃, 30 분 동안 42℃, 5 분 동안 85℃. 마우스 qPCR에서는, SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad), 각각 400 nM의 최적화 정방향 및 역방향 프라이머 (SSPN F:5' TGCTAGTCAGAGATACTCCGTTC 3', SSPN R:5' GTCCTCTCGTCAACTTGGTATG 3', BACT F:5' GAGCACCCTGTGCTGCTCACCG 3', BACT R:5' CAATGCCTGTGGTACGACCA 3'), 그리고 37.5 ng RNA에 상응하는 cDNA를 사용하여 이하의 조건에 의해 cDNA를 증폭시키고, QuantStudio 5 Real-Time PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific)에 의해 측정하였다: 2 분 동안 55℃, 2 분 동안 95℃, 10 초 동안 95℃의 40회 순환, 및 30 초 동안 62℃, 및 해리 단계. 인간 샘플의 qPCR에서는, TaqMan 검정을 사용하여 이하의 조건에 의해 SSPN (검정 ID Hs01025520m_1) 및 ACTB (검정 ID Hs01060665_g1)를 정량화하였다: 2 분 동안 50℃, 10 분 동안 95℃, 15 초 동안 95℃의 40 회 순환, 및 1 분간 62℃. 각 샘플에 대해 3회 실시하였다. ddCT 방법을 사용하여 데이터를 분석하여, 참고 유전자 ACTB에 대해 정규화하였고, 비히클-처리된 샘플은 보정기(calibrator)의 역할을 한다 (비히클 대조군의 상대적 발현=1).
면역블롯
48 시간 동안 처리한 근관 세포를, Halt 프로테아제 저해제 칵테일 (Thermo Fisher Scientific)을 함유한 RIPA 완충액 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 용해시켰다. RIPA 완충액 내의 세포 용해물을 4℃에서 1 시간 동안 흔들어주고, 4℃에서 30 분 동안 1,000 RPM로 원심분리하였다. 상청액을 모아서, DC 단백질 검정 (Bio-Rad)을 사용하여 단백질 농도를 정량화하고, 물과, 최종 농도 10%의 글리세롤 (Sigma-Aldrich), 5% 베타-머캅토에탄올 (Sigma-Aldrich), 3% 소듐 도데실 설페이트 (Sigma-Aldrich) 및 0.05% 브로모페놀 블루 (Sigma-Aldrich)를 갖는 Laemmli 샘플 완충액에서 2 mg/ml로 정규화하였다. SDS-PAGE에서, 샘플을 2 분 동안 95℃로 가열한 후, 40 μg을 4-12% 트리스-글리신 또는 비스-트리스 폴리아크릴아미드 겔 (Novex)에 로딩하고, 실온에서 2 시간 동안 100 볼트로 전기영동하여, 4℃에서 100 볼트로 2 시간 동안 니트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 폰세우 (Ponceau) S 염색을 실시하여, 단백질 로딩물을 시각화하고, 단백질 전달을 증명하였다. 실온에서 1 시간 동안 0.1% 트윈-20 (Sigma-Aldrich) (TBST)을 갖는 트리스-완충 식염수 pH 7.4 중 5% 탈지 분유에 의해 막을 차단시키고, 달리 기재된 바 없는 경우 5% 탈지 분유 (Carnation)를 함유한 차단 완충액에 희석된 이하의 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 락커 상에서 배양하였다. SSPN (sc-393187, Santa Cruz Biotechnology, 1:200), 당화 알파-디스트로글리칸 (IIH6 C4, Developmental Studies Hybridoma Bank, 1% 우유 중 1:100, 코어 알파-디스트로글리칸 (Beadle Lab, 1% 우유 중 1:1000), UTRN (MANCHO3, Developmental Studies Hybridoma Bank, 1:100), 및 GAPDH (Mab374, Millipore, 1:10,000). 10-분 동안 TBST로 3회 세척한 후, RT에서 1 시간 동안 막을 염소 항-마우스 IgG HRP (ab6789, Abcam, 5% 우유 중 모두 다 1:5000, GAPDH에 대해서는 1:10,000) 또는 염소 항-토끼 IgG HRP (ab6721, Abcam, 1% 우유 중 1:10,000)에서 항온 처리하였다. 이후, 막을 각각 10 분 동안 TBST에 의해 3회 씻어내고, RT에서 오비탈 진탕기 상의 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) 중에 5 분간 배양하여, 이를 방사선촬영 필름(Agfa)에 노출하였다. 방사선촬영 필름을 SRX-101A 테이블탑 처리기 (Konica Minolta)에서 현상하고, 디지털 파일로 스캔하여, ImageJ 버전 1.51s을 사용한 밴드의 밀도 측정에 의해 분석하였다. 표적 단백질의 밴드를 로딩 대조군 GAPDH에 대해 정규화하였고, 비히클-처리된 세포는 보정 샘플로 작용한다 (비히클 대조군의 상대적 단백질 수준 =1).
12-웰 플레이트 형식에서의 C2C12 SSPN-HiBiT 검정
12 웰-플레이트 내의 2 ml의 성장 배지에 C2C12 SSPN-HiBiT 근원세포를 웰당 25,000 개 세포로 분주하고, 3 일간 배양하였다. 컨플루언시에 도달하면, 성장 배지를 2 ml의 분화 배지로 교체하였다. 분화 2 일차에, 세포 상의 배지를 0.06% DMSO 중에 최종 농도 5.5 μM로 화합물을 함유하는 2 ml의 분화 배지로 교체하였다. 비히클 대조군-처리 세포에는, 0.06% DMSO를 세포에 첨가하였다. 48 시간 후, 세포를 PBS로 씻어내고, 2-24 시간 동안 동결시켰다. 세포가 담긴 플레이트를 얼음 상에서 해동하고, 1% 트리톤 X-100, 0.05% DOC, 0.05% SDS, 및 Halt 프로테아제 저해제가 함유된 빙-냉 변형 RIPA 완충액 100 μl를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 긁어내어, 1.5 ml 튜브에 옮기고, 20 분 동안 4℃에서 16,000×g로 원심분리하였다. 세포 용해물을 새로운 튜브로 옮겼다. 세포 용해물에 DC 검정을 실시하여, 단백질 농도를 결정하였다. 사전에 백색 벽, 백색 바닥의 384-웰 마이크로플레이트 (Greiner)에 15 μl의 PBS를 채우고, 15 μl의 세포 용해물을 각 웰에 첨가하기를 3회 하였다. 이후, 30 μl의 Nano-Glo HiBiT 용해 검출 유효 용액을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 진탕하면서 30 분 동안 배양하였다. EnVision 플레이트 판독기에서 발광을 측정하여, 그 신호를 단백질 농도와 비히클-처리 대조군의 신호에 대해 정규화하였다.
384-웰 마이크로플레이트 형식에서의 C2C12 SSPN-HiBiT 검정
384-웰의 백색 투명 바닥 마이크로플레이트 (Greiner)에 담긴 50 μl의 성장 배지에 C2C12 SSPN-HiBiT 근원세포를 웰당 500 개 세포로 분주하고, 3 일간 배양하였다. 플루언시에 도달하면, EL406 콤비네이션 세척제 분배기 (Biotek)를 사용하여 성장 배지를, 2% 말 혈청이 포함된 페놀-레드 비함유 DMEM (Sigma-Aldrich)로 이루어진 50 μl의 분화 배지로 대체하였다. 분화 2일 차에, 잔여 부피 10 μl를 남기고 세포 상의 배지를 흡입해내고, 30 μl의 새로운 분화 배지로 교체하였다. Biomek Fx (Beckman)을 사용하여, DMSO 중 0.5 μl의 소분자 또는 (비히클 및 양성 대조군 웰에 대해서는) 단독 DMSO을 각 웰에 첨가하였다. DMSO의 적절한 혼합을 보장하기 위해, 양성 대조군이 처리된 웰을 제외한 모든 웰에 50 μl의 추가 분화 배지를 첨가하였다. 처리된 각 웰 내의 화합물의 최종 농도는 0.55% DMSO 중 0.5-10 μM이고, 비히클에 대해서만 0.55%의 DMSO이었다. 48 시간의 배양 후, EL406 콤비네이션 세척제 분배기를 사용하여 플레이트를 페놀-레드 비함유 DMEM로 씻어내고, 5 μl의 잔여 부피를 남기고 흡입하였다. 세척 후, 12 μM DRAQ5 핵 염색제를 함유한 25 μl의 분화 배지를 첨가하고, 각 웰에서 최종 농도가 10 μM에 이르면, 이를 15 분 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 세포를 ImageXpress Micro Confocal High Content 영상화 시스템 (Molecular Devices)을 사용하여 영상화하였다. 영상화된 세포의 핵의 수는, MetaXpress 분석 소프트웨어 (Molecular Devices)에서 커스텀 모듈 분석을 사용하여 결정하였다. 영상화 및 분석 후, 5 μl를 남기고 플레이트를 흡입해내고, -80℃에 2-24 시간 동안 두었다. 플레이트를 RT에서 해동하고, 25 μl의 PBS를 첨가한 후, 제조사 지침에 따라 30 μl의 Nano-Glo HiBiT 용해 검출 유효 용액을 첨가하였다. EnVision 플레이트 판독기에서 발광을 측정하고, 각 웰의 신호를 핵의 수 및 비히클-처리 대조군의 신호에 대해 정규화하였다.
세포 표면 단백질의 분석
48 시간의 처리 후, 0.1g/L의 CaCl2 (0.9 mM) 및 MgCl2 (1.05 mM)(Corning)를 둘 다 함유한 빙냉 PBS로 근관 세포를 3 회 씻어내고, 가볍게 회전시키면서 4℃에서 30 분 동안 0.5mg/ml의 EZ-Link 술포-NHS-SS-비오틴 (Thermo Fisher Scientific) 중에 배양하여, 세포 표면 단백질을 표지하였다. 달리 언급되지 않은 경우, 모든 단계는 4℃에서 실시하였다. 가볍게 회전시키면서 세포를 PBS 중 빙냉 100 mM 글리세린으로 5 분동안 3 회 씻어내어, 미-반응 비오틴을 제거하였다. PBS 세척 후, 세포를 50 mM Tris-HCl pH 7.8, 500 mM NaCl, 1% 디기토닌 (digitonin)(Biosynth), 및 Halt 프로테아제와 포스파타제 저해제로 구성된 가용화 완충액에 용해시켰다. 샘플을 4℃에서 10 분 동안 회전시키고, 4℃에서 14,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하여, 찌꺼기를 펠렛화하였다. DC 검정 (Bio-Rad)를 사용하여, 상청액 (총 용해물)의 단백질 농도를 결정하였다. Pierce High Capacity Neutravidin 아가로스 (Thermo Fisher Scientific) 비드를 가용화 완충액으로 씻어낸 후, 동일 농도의 총 용해물과 합치고, 이를 회전시키면서 4℃에서 밤새 배양하였다. 비드를 4℃에서 5 분동안 2,500 rpm으로 원심분리하고, 0.1% 디기토닌이 함유된 가용화 완충액으로 씻어내었다. 총 4 회의 세척 동안 이것을 반복하였다. 50 mM DTT가 포함된 2×Laemmli 샘플 완충액 (LSB)을 사용하여 비오틴-아비딘으로부터 비오틴화 세포 표면 단백질을 잘라내고, 이를 실온에서 60 분 동안 회전시키고, 5 분 동안 95℃에서 가열하였다. 샘플을 5분 동안 4℃에서 2,500 rpm으로 원심분리하고, 면역블롯 분석을 위해 상청액 (막 분획)을 모았다.
막 안정성 검정
막 안정성 검정은 이전에 기재된 방법 [32]에서 변형되었다. 삼투압 쇼크용 용액은, 5 mM HEPES, 5mM KCl, 1mM MgCl2, 5mM NaCl, 1.2 mM CaCl2 및 1 mM 글루코스를 함유한 기본 용액으로부터 제조하였다. 수크로스를 기초 용액에 첨가하여, 오스몰 농도가 50, 80, 100, 280 및 300 mosmol에 이르렀다. 실제 오스몰 농도는 VAPRO 증기압 삼투압측정기 (Wescor Inc.)를 사용하여 결정하였다. 근관 세포에 48 시간 동안 처리하고, 분화 4 일차에 28.5 내지 223.5 밀리오스몰 (mosmol)의 용액을 사용하여 37℃에서 20 분 동안 삼투압 쇼크를 가하였다. 상청액을 모으고, 원심분리하여, 세포 끼꺼기를 분리하였다. 접착 세포에 트립신을 처리하고, 펠렛화한 후, 물로 용해시키고, 3 회의 동결-해동 주기를 실시하였다. 크레아틴 키나제 검정 (Sekisui Diagnostics)를 사용하여, 상청액 및 용해물 분획 둘 다에서 크레아틴 키나제 (CK)의 수준을 측정하였다. 96-웰 플레이트에, 웰당 4 μl의 각 샘플과 140 μl의 시약을 로딩하는 것을 3번 하였다. CK의 U/L은 이하와 같이 계산하였다: (mOD/분)(총 부피 mL)(희석 인자)/(6.22M-1cm-1)(빛의 경로 cm)(샘플 부피 mL). CK 방출 퍼센트는 이하와 같이 계산하였다: CK세포외/(CK세포외 + CK세포내) * 100.
siRNA-매개 녹다운 (knockdown)
리포펙타민 (Lipofectamine) RNAiMAX 형질 감염 시약 (Life Technologies)을 사용하여, Opti-MEM 환원 혈청 배지 (Thermo Fisher Scientific)에 희석된 24 또는 48 nM의 Silencer Select SSPN siRNA (siRNA ID s68932, Life Technologies), 또는 MISSION siRNA 형광 범용 음성 대조군 #1, 시아닌 3 (Sigma Aldrich)에 의해 H2K mdx 근관 세포를 형질 감염시켰다. 형질 감염 시약과 희석된 siRNA를, 24-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 1ml로 담긴 성장 배지에 첨가하였다.
근관 세포 융합 지수
분화 2 일차부터 시작하여 72 시간 동안 처리된 96-웰 플레이트 내의 근원세포를 4% 파라포름알데히드에 의해 20 분 동안 고정시키고, 0.2% Triton X-100 (Sigma)에 의해 10 분 동안 침투시키고, 1% BSA에 의해 30 분 동안 차단하였다. 1% BSA 중 10 μg/ml MF-20 (Developmental Hybridoma Studies Bank)를 밤새 사용하고, 1% BSA 중 10 μg/ml의 염소 항-마우스 Alexa Fluor Plus 594 (Thermo Fisher Scientific)를 1 시간 동안 사용하여, 미오신 중쇄 (MHC)를 검출하였다. 상기 각 단계 사이에는 PBS 세척을 수행하였다. 영상화하기 전에, 5 μg/ml Hoechst (Thermo Fisher Scientific)에 의해 20 분 동안 핵을 염색하였다. 각 처리는 3 개의 웰에서 실시하였고, 웰당 3 개의 영역을 캡쳐하였다. ImageJ를 사용하여 총 핵과 MHC 양성 세포 내의 핵의 수를 계수하였다. 융합 지수는 MHC 양성 세포 내의 핵/총 핵으로 계산하였다.
반감기 분석
1 μM의 화합물과 최종 농도 0.5%의 DMSO를 사용하여, Eurofins Panlabs Inc.에서 반감기 분석을 실시하였다. PBS 또는 CD-1 마우스의 혈장을 37℃에서 5 분 동안 사전-가온한 후, 시험 화합물을 첨가하여, 37℃에서 계속 항온 처리하였다. 0, 30, 60, 120, 240 및 1440 분에, 화합물을 함유한 용액의 한 분획을 아세토니트릴/메탄올과 섞고, 혼합하여 원심분리하였다. 상청액을 HPLC-MS/MS 분석에 사용하였다.
시험관내 처리
OT-9의 예비 안정성 평가를 위해, 본 발명자들은 6 개월령의 C57/Bl6 수컷에 IP 주사를 실시하였다. 마우스에 100 μl의 비히클 (5% DMSO (Sigma), 95% PBS), 비히클 중 30 mg/kg의 OT-9 100 μl, 또는 비히클 중 50 mg/kg의 OT-9 100 μl (처리당 마우스 수, n=1)를 주사하였다. 마우스를 72 시간 동안 관찰한 후, 주사 부위와 내부 장기를 시각적으로 관찰하기 위해 이들을 희생시켰다 (데이터는 나타내지 않음). 활성 평가를 위해, 20-주 령의 수컷 mdx 한배 새끼의 양쪽 전경골근에, 비히클 (5% DMSO, 95% PBS) 또는 86 μg의 OT-9를 주사하였다. 두 마리의 마우스는 양쪽 TA에 비히클을 주사하고, 세 마리의 마우스는 양쪽 TA에 20 μl의 OT-9 (86 μg의 OT-9를 함유하는 9.4 mM 용액)를 주사하였다. 4 시간 후, 근육을 수확하여 유전자 발현 분석을 위해 가공하였다. 국소 투여 후 OT-9m의 활성을 평가하기 위해, 19-22-주 령의 수컷 mdx의 양쪽 전경골근에, 비히클 (5% DMSO, 95% PBS), 또는 3 mg/kg 및 10mg/kg의 OT-9m을 주사하였다. 4 시간 후, 근육을 수확하여 유전자 발현 분석을 위해 가공하였다. 전신 투여 후 OT-9m의 활성을 평가하기 위해, 13-주령 mdx 수컷에, 비히클 (하이드록시프로필-b-사이클로덱스트린 중 4% PEG-200) 또는 20 mg/kg/일의 OT-9m을 피하 주사하였다. 13일 동안 처리한 후, 근육을 수확하여 유전자 발현 분석을 위해 가공하였다.
데이터 분석
확고한 엄격하게 표준화된 평균차 (SSMD*)를 사용하여, 플레이트 품질과 히트 선별을 평가하였다.
Figure pct00014
, 상기 수식에서 XP, XN, SP 및 SN은 각각 양성 및 음성 대조군의 중앙값과 중앙값의 절대 편차이다.[33] 플레이트 품질에서, SSMD*≥1은 양호한 품질의 적당한 (moderate) 양성 대조군을 나타낸다. 초기 히트 선별 (hit selection)에서는 비히클에 비해 1.4-배 증가하며, SSMD* > 0.25를 히트로 간주하였다. 통계 분석은 Mac OS X용 Prism 버전 7.0 (GraphPad Software)을 사용하고, 양-방향 비-변수적인 콜모고로브-스미르노브 (Kolmogorov-Smirnov) 시험을 사용하여 실시하였다. 데이터는 평균 + SEM으로 기록된다. < 0.05의 P-값을 통계적으로 유의하다고 간주하였다. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001.
결과
본 발명자들은 근육 세포-기반의 고처리량 검정을 만들고 검증하여, 인간 SSPN 유전자 발현의 소분자 개선체를 식별하였다. 문헌[Shu 등, Skelet Muscle. 2019;9(1):32]. 본 발명자들은 상기 검정을 사용하여 임상 화합물들을 스크리닝하였고, 상기 검정이 야생형과 디스트로핀 결핍성 근관 세포 둘 다에서 SSPN 유전자 및 단백질 발현을 증가시키는 소분자들을 식별할 수 있다는 사실을 입증하였다. Id. 이러한 최근의 연구에서, 본 발명자들은 SSPN의 새로운 화학적 엔티티 개선제로 개발할 수 있는 화합물을 식별하려는 목적으로, 거대 화학적 라이브러리를 스크리닝하였다. 엄선된 라이브러리는 5의 리핀스키 법칙(Lipinski's rule of 5)에 기초하여 약물-유사성을 최대화하도록 개발되었으며, 상기 법칙은 인간에서 최적의 경구 생체 이용성을 예측하는데 사용할 수 있는 변수들을 정의한다.
200,000 개의 소분자의 고처리량 스크리닝
인간 SSPN 유전자 발현에 대한 세포-기반의 검정을 사용하여, 엄선된 라이브러리로부터 200,000 개가 넘는 소분자들을 고처리량 스크리닝하였다. 상기 검정에서 사용된 리포터 세포는, 인간 SSPN 프로모터 영역 뒤에 향상된 녹색 형광 단백질에 대한 암호화 서열 (hSSPN-EGFP)이 함유된 제작물에 의해 안정적으로 형질 감염된 C2C12 뮤린 근원세포였다. hSSPN-EGFP 검정을 사용하여, 본 발명자들은 5.5 μM (n=1)의 농도에서 화합물들을 스크리닝하였다 (도 1a). 플레이트 품질은 확고한 확고한 엄격하게 표준화된 평균차 (SSMD*)를 사용하여 계산하였다 (도 7). 검정-특이적인 가짜 양성을 배제하기 위해, 본 발명자들은 인간 SSPN 프로모터 활성을 갖는 루시퍼라제 리포터 (hSSPN-luc)가 함유된, 안정적으로 형질 감염된 리포터 세포주를 사용하여 역스크리닝을 하였다(counterscreened). 상위 1000 개의 히트를, hSSPN-EGFP (n=3) 및 hSSPN-루시퍼라제 프로모터 리포터 근관 세포 (각각 n=3)에 대해 재스크리닝하였다. 1000 개의 히트 중에 63 개의 화합물이 두 개의 리포터 세포주 모두에서 리포터 발현을 증가시켜서, 이를 확정된 히트로 간주하였다. 확정된 히트는 공통된 구조적 특성에 기초하여 이하의 3 개의 그룹으로 분류되었다: 약물작용발생단 1, 약물작용발생단 2, 및 통일된 구조적 특성이 없는 기타 카테고리. 약물작용발생단 2의 화합물은 골칫거리로 간주되는, DNA에 삽입되는 것으로 알려진 평평한 다중-고리 구조들로 이루어진다. 따라서, 본 발명자들은 약물작용발생단 1과 기타 부류의 화합물에 중점을 두었다.
디스트로핀 결핍성 뮤린의 근육 세포를 사용한 히트-대-선도 화합물 선별 (hit-to-lead selection)
초기의 히트-대-선도 화합물 선별에서, 5.5 μM 농도의 모든 시판용 확정된 히트를 디스트로핀-결핍성 mdx 근관 세포에서 시험하여, 화합물이 관련 질병 모델에서 활성을 갖는지를 결정하였다. 약물작용발생단 1의 그룹 내에서는, 16 개의 히트 중 9 개가 SSPN 유전자 발현을 비히클 대조군에 비해 1.1 내지 1.8 배 증가시켰다 (도 1b). 다른 그룹에서는, 23개의 다른 히트 중 8 개가 SSPN 유전자 발현을 1.2 내지 2.0 배 증가시켰다 (도 1c). 초기의 히트-대-선도 화합물 선별에서는, 두 개의 개별 리포터 세포주에 의한 순차적인 스크리닝에 의해, 야생형 및 디스트로핀-결핍성 뮤린의 근육 세포 둘 다에서 SSPN mRNA 수준을 증가시키는 화합물을 식별할 수 있다는 사실이 입증되었다.
용액에서 불안정한 화합물이나 결과가 매우 달라지는 화합물들을 배제한 후, 9 개의 화합물이 남았다. 이러한 9 개의 화합물을 mdx 근관 세포에서 0.5 내지 50 μM 범위의 6 가지 상이한 농도로 시험하여, 넓은 농도 범위에 걸친 활성을 결정하였다. PC1-41를 제외한 모든 화합물은 적어도 하나의 농도에서 활성을 나타내었다 (도 2a). PC1-36, PC1-42 및 OT-9는 농도-의존성 반응을 유도하며, 그 반응은 5.5 μM에서 정점에 달한다. SSPN mRNA의 증가가 단백질 수준에서도 명백한 지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 mdx 근관 세포에 2.5 내지 10 μM의 OT-9, PC1-36 및 PC1-42를 처리하고, SSPN 항체에 의한 면역블롯에 의해 총 단백질 용해물을 분석하였다. 본 발명자들은 PC1-42가 SSPN 단백질의 증가를 유도하지 않는다는 것을을 발견하였다 (데이터는 나타내지 않음). 본 발명의 화합물 OT-9 및 PC1-36은 mdx 근관 세포에서 SSPN 단백질의 수준을 1.5-배 증가시켜, 이 화합물들이 디스트로핀-결핍성 근육 세포에서 SSPN의 유전자 및 단백질 풍부도를 둘 다 증가시켰다는 사실이 입증되었다 (도 2b-c).
이전에, 본 발명자들은 분화하는 근관 세포에서 SSPN 유전자의 발현 특성을 살펴보았는데, SSPN mRNA는 분화 3 일차에 증가하기 시작하여, 분화 5 일차에는 증가 수준이 10-배에 이른다는 사실을 발견하였고, 이는 세포가 분화함에 따라 SSPN 수준이 증가한다는 것을 나타낸다 [26]. 화합물-유도성 SSPN 발현의 증가가 분화 개선에 기인하는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 mdx 근관 세포에 OT-9를 처리하여, 융합 지수와 분화 마커인 미오겐 전사 인자 MYOG의 발현을 평가하였다. OT-9는 mdx 근관 세포에서 융합 지수와 MYOG 유전자 발현을 약간 증가시켰는데, 이는 SSPN의 증가가 분화 속도를 증가시킬 수 있거나, 또는 OT-9가 분화 경로에서 부분적으로 작용할 수 있다는 것을 시사한다 (도 8).
확정된 히트가 이영양증(dystrophic) 세포주에서만 세포주-특이적인 방식으로 작용하지 않는지를 검증하기 위해, 본 발명자들은 야생형 C2C12 근관 세포에서 OT-9 및 PC1-36을 시험하였다. 본 발명자들은 두 화합물 다 C2C12 근관 세포에서 SSPN mRNA 수준을 높인다는 사실을 발견하였다 (도 3). C2C12, H2K WT 및 H2K mdx 뮤린 근원세포의 처리에서는, PC1-36가 아닌 OT-9가 모든 근원세포주에서 SSPN mRNA 수준을 높인다는 것이 밝혀졌다. 근원세포에서 SSPN를 증가시키는 OT-9의 고유한 능력은, OT-9 및 PC1-36이 상이한 생물학적 표적을 가질 수 있다는 것을 시사한다 (도 9).
새로운 유사체를 효과적으로 시험하기 위해, 본 발명자들은 세포에서 SSPN 단백질, 예를 들어 SSPN-HiBiT를 검출하기 위한 방법을 만들어 내었다. 뮤린의 C2C12 세포주에 기초한 SSPN-HiBiT는, 루시퍼라제 효소의 11 개 아미노산 서브유닛인, HiBiT라고 불리는 N-말단 융합 단백질을 갖는 내인성 SSPN 단백질을 발현한다 (도 10a). SSPN-HiBiT 단백질은 기질과 발광 신호 형성을 촉매화하는 루시퍼라제 효소의 큰 서브유닛을 첨가함으로써 정량화된다. C2C12 SSPN-HiBiT 세포는 분화 내내 리포터 단백질을 점점 더 많은 수준으로 발현시키는데, 이는 분화함에 따라 SSPN mRNA이 증가한다는 본 발명자들의 이전 발견에 의해 뒷받침된다 (도 10b). 본 발명자들은 c-raf 저해제인 GW5074를 검정에 대한 양성 대조군으로 확정하였다. 5 μM의 GW5074를 처리한 SSPN-HiBiT C2C12 근관 세포에서는, SSPN-HiBiT 수준이 1.35-배 증가한 것으로 나타났다 (도 10c). 본 발명자들의 선도 화합물을 처리한 후 SSPN 단백질 수준의 변화를 검출하는 리포터의 능력을 검증하기 위해, 본 발명자들은 0.5-10 μM의 OT-9가 담긴 12-웰 및 384-웰 플레이트 형식 둘 다에 SSPN-HiBiT 세포를 처리하였다. 검정에서 용량-민감성 SSPN의 증가를 검출하였다 (도 10d). 이러한 결과에서는, SSPN-HiBiT C2C12 검정이 본 발명자들의 선도 화합물의 SAR 분석에 유용한 수단이라는 것을 말해준다.
OT-9 화합물은 세포 표면에서 라미닌-결합 접착 복합체를 증가시킨다
횡문근(striated muscle)에서, SSPN은 세포막 (근형질막)을 세포외 기질에 연결하는 3 개의 주요한 라미닌-결합 접착 복합체: DGC, UGC 및 α7β1D-인테그린에 대한 뼈대 (scaffold)이다. mdx 근육에서의 SSPN의 과다 발현은 UGC 및 α7β1D-인테그린 복합체의 국재화를 증가시킨다. OT-9가 근관 세포의 세포 막에서 SSPN 국재화에 영향을 주는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 세포 표면 단백질을 아민-반응성 비오틴으로 표지하였다. OT-9가 처리된 C2C12 근관 세포를 세포 비침투성 비오틴에서 배양하고, 용해하여 단백질을 가용화시키고, 아비딘에 의해 친화성 정제를 실시하고, LSB에 의해 용출하여, 세포 표면 단백질을 얻었다. α-DG (글리칸) 및 코어 α-DG 단백질 (도 4a)의 라미닌-결합 글리코에피토프를 인식하는 항체를 사용하여, 본 발명자들은 비오틴화 세포 표면 단백질과 총 용해물의 면역블롯 분석을 실시하였다. OT-9는 세포 표면에서 당화 α-DG를 1.8-배 증가시키고, 코어 α-DG를 1.6-배 증가시켰다 (도 4b-d). 총 단백질 용해물의 면역블롯 분석에서는, OT-9가 당화 α-DG의 수준을 증가시키지는 않으나, 코어 α-DG를 1.5-배 증가시킨다는 것이 밝혀졌다 (도 11). 세포 표면의 차이와 당화 α-DG의 총 용해물 수준은, OT-9가 라미닌-결합성 α-DG의 막 국재화를 증가시킨다는 것을 시사한다.
SSPN를 과다 발현하는 mdx 마우스에서, 디스트로핀의 파라로그 (paralogue)인 우트로핀은 근형질막에서 상향조절되어, ECM에 대한 막의 접착을 증가시키는데 기여한다. 동일한 비오틴화 실험 접근법을 사용하여, 본 발명자들은 OT-9가 세포 표면 막에서 우트로핀의 발현에 영향을 주는지를 평가하였다. 우트로핀은 세포 내에 있으므로 직접 비오틴화되지 않으나, 가용화 완충액은 약한 계면활성제를 함유하여, 우트로핀, β-디스트로글리칸 및 세포 표면 α-DG를 포함한 접착 복합체 내에서 상호작용을 보존한다. OT-9를 처리한 mdx 근관 세포에서는, 막-연결 우트로핀 단백질이 1.6-배 증가한 것으로 나타났다 (도 4e-f). 종합하면, 본 발명자들의 발견에서 OT-9가 α-DG 및 우트로핀 둘 다의 근형질막 국재화를 증가시킨다는 사실이 나타났는데, 이는 라미닌-결합성 우트로핀 당단백질 복합체의 상향 조절을 시사한다.
OT-9는 사르코스판의 상향 조절을 통해 디스트로핀-결핍성 근관 세포의 막 안정성을 개선시킨다
세포막에서 우트로핀 및 디스트로글리칸의 증가가 막 안정성을 기능적으로 개선시키는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 시험관내 크레아틴 키나제 (CK) 방출 검정에 대한 변형 프로토콜을 사용하였다 [32]. 상기 검정에서는, 근관 세포에 삼투압 쇼크를 가하여 세포 팽창과 막 손상을 유발하며, 세포내 CK가 세포로부터 주변 배지로 방출된다 (도 5a). CK 방출을 검출할 수 있을 정도로 변화시키는 삼투압 쇼크에 대한 최적 조건을 결정하기 위해, 본 발명자들은 mdx에 48 시간 동안 비히클 또는 5 μM의 OT-9을 처리한 후, 28.5 내지 223.5 밀리오스몰 (mosmol) 범위의 용액을 사용하여 삼투압 쇼크를 유발하였고, 223.5 mosmol이 생리적 오스몰 농도 (280 mosmol)에 가장 가까웠다. mdx 근관 세포는 더 낮은, 더 많은 손상 오스몰 농도들에서도 더 높은 CK 방출을 나타내었다 (도 5b). 28.5 mosmol 용액에 의한 삼투압 쇼크는 30-40%의 CK를 방출시켰으나, 45 및 63 mosmol 용액은 10-15%의 CK 방출을 유발하여, 막 손상이 상대적으로 적다는 것을 나타낸다. 45, 63 및 223.5 mosmol 용액에 의한 삼투압 쇼크를 받은 세포에서는, OT-9가 CK 방출을 유의하게 감소시켜, OT-9가 막을 안정시키고, 삼투압 쇼크-유발성 손상으로부터 막을 보호한다는 것을 시사한다. 28.5 mosmol 용액에 의한 삼투압 쇼크를 받은 세포에서 OT-9의 처리는 CK 방출을 감소시키지 않는데, 이는 극히 낮은 오스몰 농도에 의해 유발된 심각한 막 손상 때문에 OT-9가 막을 안정화시킬 수 없을 가능성이 크다는 것을 나타낸다.
OT-9에 의해 유도된 막 안정화 효과가 SSPN에 의존하는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 화합물 처리와 함께 SSPN의 siRNA-매개 녹다운을 실시하였다. 녹다운 효율을 평가하기 위해, 본 발명자들은 먼저 mdx 근관 세포에 1, 5 또는 10 μM의 OT-9와, 24 nM의 스크램블 siRNA 또는 siRNA 표적화 SSPN mRNA (SSPN siRNA)를 처리하였다. 비히클 대조군을 처리한 세포에서, SSPN siRNA는 SSPN mRNA를 스크램블 대조군에 비해 76% 감소시켰다 (도 12). 스크램블 siRNA 및 OT-9를 처리한 세포에서는, SSPN mRNA가 비히클 대조군에 비해 최대 1.4-배 증가하였다. SSPN siRNA 및 OT-9를 처리한 세포에서는, SSPN 수준이 이들 각각의 스크램블 siRNA 대조군에 비해 감소하였다. 그러나, 불완전 녹다운 때문에, OT-9가 SSPN siRNA와 함께 할 때에도 SSPN mRNA 수준이 증가하여, 본 발명자들의 이후의 실험에서는 더 높은 siRNA 농도를 사용하게 되었다.
어떠한 화합물도 처리하지 않았을 때 막 안정화에 대한 SSPN 녹다운의 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 mdx 근관 세포를 24 및 48 nM의 스크램블 및 SSPN siRNA에 의해 형질 감염시키고, 45 mosmol 용액으로 세포에 삼투압 쇼크를 가하였다. 24 nM의 siRNA에 의해 형질감염된 세포에서는, SSPN의 녹아웃이 CK 방출에 영향을 주지 않았다 (도 5c). 그러나, 48 nM의 siRNA에 의해 형질감염된 세포에서는, SSPN의 녹아웃이 CK 방출을 9% 내지 13% 증가시켰는데, 이는 SSPN 자체의 손실이 근형질막을 막 손상에 더욱 취약하게 만든다는 것을 나타낸다. SSPN 녹아웃에 의해 유도된 기준선 CK 방출의 변화로 인해 데이터가 교란되는 것을 막기 위해, 본 발명자들은 24 nM siRNA 농도를 이후의 연구를 위해 선택하였는데, 그 이유는 이것이 기준선 CK 방출에 영향을 주지 않기 때문이다. 본 발명자들은 mdx 근관 세포에 10 μM의 OT-9와 24 nM의 스크램블 또는 SSPN siRNA를 48 시간 동안 처리한 후 삼투압 쇼크를 주었고, SSPN의 고갈이 CK 방출을 6.5% 내지 8% 증가시킨다는 사실을 발견하였다 (도 5d). 그 결과 SSPN의 녹아웃에 의해 OT-9가 근형질막을 안정시키는 능력이 감소된다고 나타났는데, 이는 SSPN 발현이 OT-9의 전체 막 안정화 효과에 필요하다는 것을 가리킨다.
OT-9 및 OT-9m은 mdx 마우스에서 SSPN 유전자 발현을 증가시킨다
OT-9가 막에서 SSPN 단백질 및 라미닌-결합 접착 복합체를 증가시켜 디스트로핀-결핍성 근관 세포에서 막 안정성을 개선시키는 능력을 입증한 후, 본 발명자들은 다음으로 OT-9가 생체 내에서 SSPN 유전자 발현을 증가시키는 능력을 조사하였다. OT-9 안정성을 평가할 때, 마우스 혈장 (7.7 시간) 대 PBS (49 분)에서의 내 화합물의 반감기 차이가 크다고 나타났다 (도 13 & 14). 세포 배양 배지는 두 용액과 구별되므로, 본 발명자들은 4 시간 동안 5 μM의 OT-9를 처리한 C2C12 근관 세포에서 SSPN mRNA 안정성을 정량화하여, 단기 처리가 SSPN 발현을 유도할 수 있는지 결정하였다. OT-9를 4 시간 처리한 후, 상기 화합물을 함유한 배지를 제거하고, 새로운 배지로 교체하였다. 화합물을 제거한 지 0, 4, 24 및 48 시간 후에, 세포를 수확하였다 (도 6a). 화합물을 제거한 직후 (0 시간), SSPN mRNA 수준이 비히클 대조군에 비해 1.5-배 증가하여, 단 4 시간만 처리한 후에도, OT-9가 SSPN 유전자 발현을 유도한다는 사실을 입증하였다 (도 6b). 그러나, 화합물을 제거한 지 4, 24 및 48 시간 후, SSPN mRNA 수준은 기준선 수준으로 돌아갔는데, 이는 SSPN mRNA가 OT-9에 의해 유도된 후 최대 4 시간 동안 상향 조절된다는 것을 시사한다.
OT-9의 생체 내 안전성과 활성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 야생형 C57/Bl6 및 mdx 마우스에서 두 가지 파일럿 연구를 실시하였다. OT-9의 예비 안정성 평가를 위해, 본 발명자들은 6 개월령의 C57/Bl6 수컷에 IP 주사를 놓았다. 마우스에 비히클, 30 mg/kg의 OT-9, 또는 50 mg/kg의 OT-9를 주사하였다 (n=1). 주사 부위에 염증, 괴사 또는 화합물 축적의 징후는 관찰되지 않았다. 간, 신장, 췌장 및 장은 정상적인 중량과 크기로 보였다. 일부 불용성 입자들이 OT-9의 50 mg/kg 용액에서 관찰되었기 때문에, 30 mg/kg의 농도를 생체 내 활성의 평가를 위해 선택하였다.
예비 안정성 평가 이후, 본 발명자들은 생체 내에서 SSPN 유전자 발현을 증가시키는 OT-9의 능력을 평가하였다. 본 발명자들은 도 8b에 제시된 발견에 기초하여 4 시간의 처리 후의 활성을 평가용으로 선택하였는데, 도 8b는 4 시간 동안의 OT-9의 처리로도 시험관 내에서 SSPN mRNA 수준을 유의하게 증가시키기에 충분하다는 것을 나타낸다. 5 마리의 20-주령 수컷 mdx 한배 새끼들에게, 양쪽 전경골 (TA) 근육에 근육내 주사를 놓았다. 두 마리의 마우스에는 양쪽 TA에 비히클을 주사하고, 두 마리의 마우스에는 3 mg/kg의 OT-9 (안전성 평가에 사용된 9.4 mM의 몰 당량)을 주사하였다. 4 시간 동안 처리한 후, TA를 수확하여 유전자 발현 분석을 위해 가공하였다. 마우스에서 국소 OT-9 주사 후에 유해 효과는 관찰되지 않았다. OT-9는 비히클 대조군-처리군에 비해 SSPN 유전자 발현을 1.7-배 증가시키는데, 이는 OT-9가 mdx 마우스에서 SSPN 유전자 발현을 증가시킬 수 있다는 사실을 입증한다 (도 6c). 본 발명자들은 OT-9가 생체 내에서 SSPN 유전자 발현을 증가시킬 수 있다고 결정한 후, 이의 유도체들 중 하나인 OT-9m을, mdx 마우스에서 SSPN 발현을 증가시키는 능력에 대해 평가하였다. OT-9에 비해 개선된 시험관내 활성에 기초하여, OT-9m을 선택하였다 (도 1, 엔트리 1 & 14 비교). 국소 투여 후 생체 내 OT-9m 활성을 평가하기 위해, 11 마리의 19-22 주령 mdx 마우스의 양쪽 전경골 (TA) 근육에 근육내 주사를 놓았다. 4 마리의 마우스의 양쪽 TA에 비히클을 주사하고, 3 마리의 마우스에는 3 mg/kg의 OT-9m을 주사하고, 4 마리의 마우스에는 10 mg/kg의 OT-9m을 주사하였다. 4 시간 동안 처리한 후, TA를 수확하여 유전자 발현 분석을 위해 가공하였다. 마우스에서, 국소 OT-9m를 주사한 후 유해 효과는 관찰되지 않았다. OT-9와 유사하게, mdx 마우스에서의 OT-9m의 근육내 주사로 인해, 3mg/kg 및 10mg/kg 용량의 OT-9m이 짧은 4 시간 내에 SSPN 유전자 발현을 증가시킨다는 것이 입증되었다 (도 6d).
국소 투여 후, 본 발명자들은 전신 처리 후 mdx 마우스에서 OT-9m이 SSPN 발현을 향상시키는 능력을 평가하였다. 13-주령 mdx 수컷에, 비히클 (하이드록시프로필-b-사이클로덱스트린 중 4% PEG-200) 또는 매일 20 mg/kg의 OT-9m을 피하 주사하였다. 13 일 동안 처리한 후, 사두근(quadreceps), TA 및 심장 근육을 수확하여 사두근을 유전자 발현 분석을 위해 가공하였다. OT-9m의 전신 처리에 의해, SSPN 전사체가 2-배 증가하였다 (도 6e). 본 발명자들은 이전에 다양한 수준의 사르코스판을 발현하는 마우스 세포주의 이용가능성을 통해 mdx 마우스에서 질병 병리를 피하는데 필요한 사르코스판의 수준을 조사하였다. 본 발명자들은 사르코스판을 1.5-배로 과다 발현하는 마우스는 구제되지 않으나, 사르코스판을 3-배 과다발현하는 마우스는 구제되는 것으로 결정하였다. 이것은 mdx 마우스를 구제하는데 필요한 사르코스판 과다 발현의 수준이 대략 1.5 내지 3-배라는 것을 입증하였다. mdx 마우스에 OT-9 및 OT-9m를 처리함으로써, 두 화합물이 mdx 마우스에서 SSPN 유전자 발현을 원하는 1.5 내지 3-배 증가에 근접한 수준까지 증가시킬 수 있다는 사실을 입증하였다.
실시예 1 : 예시 화합물의 제조
합성 반응식 A
Figure pct00015
합성 반응식 B
Figure pct00016
1.1 2-클로로-6,7-디메틸퀴놀린-3-카르바알데히드. 단계 1. 0℃에서 POCl3 (13.7 mL, 147 mmol, 6 당량)를 DMF (5.7 mL, 73.5 mmol, 3 당량)에 점적하고, 30 분간 실온에서 교반하였다. 이후, N-(3,4-디메틸페닐)아세트아미드 (4 g, 24.5 mmol, 1.0 당량)를 실온에서 첨가한 다음, 반응물을 80℃로 가열하고, 16 시간 동안 교반하였다. 완료 후, 혼합물을 실온으로 냉각시킨 다음, 냉수에 부었다. 이후, 수층을 EtOAc으로 추출하고, 유기층을 염수로 씻어내고, 여과하고, 소듐 설페이트에서 건조시킨 후, 농축하였다. 이후, 컬럼 크로마토그래피 (2% EtOAc:클로로포름)을 사용하여 조 생성물을 정제하여, 백색 고체 (2.85 g, 52%)로서의 순수한 생성물을 얻었다.
1.2 (E)-2-클로로-6,7-디메틸퀴놀린-3-카르바알데히드 옥심. 단계 2. 0℃에서 하이드록실아민 하이드로클로라이드 (609 mg, 8.77 mmol, 1.2 당량) 및 메탄올 (15 mL)의 용액에 수산화소듐 용액 (5.37 mL의 물 중 409 mg, 10.23 mmol, 1.4 당량)을 첨가한 후, 10 분 동안 화합물 2 (1.605 g, 7.31 mmol, 1 당량)를 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 65℃에서 1 시간 동안 환류시켰다. TLC에 의해 시작 물질이 소모된 것을 확인했을 때, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여과하고, 빙냉수 및 헥산으로 씻어내었다. 진공 하에 헥산 층을 증발시켜, 오프-화이트색 고체 (1.6 g, 94%)로서의 원하는 화합물을 얻었다. 남은 1.2 g의 시작 물질에 조건들을 지속하여 (push forward through conditions), 생성물 (1.19 g, 94%)을 얻었다.
1.3 2-클로로-6,7-디메틸퀴놀린-3-카보니트릴. 단계 3. 아세트산 무수물 (17 mL) 중 화합물 3을 130℃에서 3 시간 동안 환류시켰다. TLC (10% EtOAc:헥산)에 의해 반응의 완료가 확인되면, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 과잉 용매를 증발시켰다. 잔여 고체를 EtOAc에서 1 시간 동안 교반시킨 후, 고체를 여과하고, EtOAc (2×20 mL)에 의해 추출하였다. 이후, 상기 고체를 컬럼 크로마토그래피 (0-100% DCM:헥산)를 사용하여 정제하여, 백색 고체로서의 순수한 생성물을 얻었다. 또한, 여과물을 40 mL의 빙냉수로 씻어내고, 소듐 설페이트에서 건조시키고, 증발시켜, 조 물질을 얻었다. 이후, 이 물질을 컬럼 크로마토그래피 (0-100% DCM:헥산)에 의해 정제하여, 백색 고체로서의 순수한 생성물을 얻었다. 두 고체를 합쳤다 (461 mg, 31%). 추가 1.19 g의 화합물 3에 대해 반응을 지속하여 (push forward through reaction), 백색 고체 (620 mg, 56%)로서의 생성물을 얻었다.
1.4 6,7-디메틸-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카보니트릴. 단계 4. 메탄올 (12.6 mL) 중 화합물 4 (274 mg, 1.27 mmol, 1 당량)와 진한 염산 (25.4 mL)의 혼합물을, 4 시간 동안 환류시켰다. 반응 완료 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 생성물을 반응물에서 빼내었다. 생성물을 여과하고, 아세톤 (2×20 mL)으로 씻어내어, 오프-화이트색 고체 (100 mg, 40%)로서의 생성물을 얻었다. 추가 620 mg의 화합물 4에 대해 반응을 지속하여, 솜털같은 오프-화이트색 고체 (267 mg, 47%)로서의 생성물을 얻었다.
1.5 2-(2-(4-메톡시페닐)-2-옥소에톡시)-7-메틸퀴놀린-3-카보니트릴에 접근하는 과정. 단계 5. DMF (0.5 mL) 중 화합물 5 (50 mg, 0.25 mmol, 1.0 당량)의 용액에 무수 탄산칼륨 (52.3 mg, 0.375 mmol, 1.5 당량)을 첨가한 후, 케톤 (58 mg, 0.25 mmol, 1.0 당량)을 첨가하였다. 이후, 생성된 혼합물을 60℃에서 밤새 교반하였다. TLC (5% MeOH:DCM)에 의해 반응의 완료를 확인한 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물로 희석하였다. 이후, 수층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이후, 유기층을 냉수와 염수로 세척하였다. 이후, 유기층을 여과하고, 소듐 설페이트에서 건조시켜, 농축하였다. 이후, 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (40% EtOAc:헥산)에 의해 정제하여, 순수한 생성물을 얻었다.
1.6 2-(2-(4-(디메틸아미노)페닐)-2-옥소에톡시)-6,7-메틸퀴놀린-3-카보니트릴에 접근하는 과정. 단계 5. DMF (0.5 mL) 중 화합물 5 (75 mg, 0.38 mmol, 1.0 당량)의 용액에 무수 탄산칼륨 (78.4 mg, 0.568 mmol, 1.5 당량)을 첨가한 후, 케톤 (91.6 mg, 0.38 mmol, 1.0 당량)을 첨가하였다. 이후, 생성된 혼합물을 60℃에서 밤새 교반하였다. TLC (5% MeOH:DCM)에 의해 반응 완료를 확인한 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물로 희석하였다. 이후, 수층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이후, 유기층을 냉수와 염수로 세척하였다. 이후, 유기층을 여과하고, 소듐 설페이트에서 건조시켜, 농축하였다. 이후, 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (40% EtOAc:헥산) 및 조제용-HPLC에 의해 정제하여, 순수한 생성물을 얻었다.
Figure pct00017
1.7 2-((2-(4-플루오로페닐)-2-옥소에틸)티오)-6,7-디메틸퀴놀린-3-카보니트릴에 접근하는 과정. 단계 5. 화합물 5 (169 mg, 0.79 mmol, 1.0 당량)를 60℃에서 무수 DMF (6.76 mL)에 용해시킨 후, 실온으로 냉각시켰다. 이후, 포타슘 아세테이트 (155 mg, 1.58 mmol, 2.0 당량)와 2-브로모-1-(4-플루오로페닐)에탄-1-온 (342 mg, 1.58 mmol, 2.0 당량)을 첨가하고, 반응을 실온에서 밤새 교반하였다. TLC (100% DCM)에 의해 반응의 완료를 확인한 후, 20 mL의 물을 반응에 첨가하였다. 이후, 빼낸 담황색 고체를 여과하였다. 이후, 상기 고체를 DCM:MeOH (10%)에 재용해시키고, 무수 소듐 설페이트에서 건조시켰다. 이후, 상기 고체를 40 mL의 DCM:MeOH (5%)에 용해시키고, DCM을 사용하여 플러그를 통과시켜, 담황색 고체 (185 mg, 69%)로서의 생성물을 얻었다. [M+H]+= 351.4. 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ = 8.23 (s, 1H), 8.20 - 8.12 (m, 2H), 7.48 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.23 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.75 (s, 2H), 2.39 (d, J = 2.3 Hz, 6H).
합성 반응식 C:
Figure pct00018
2.1 디메틸 2-(2,4-디니트로벤질리덴)말로네이트. 단계 1. 아세트산 무수물 (1.09 mL) 중 2.4-디니트로벤즈알데히드 (500 mg, 2.55 mmol, 1.0 당량)의 혼합물에 디메틸 말로네이트 (336.8 mg, 2.55 mmol, 1.0 당량)을 첨가한 후, 무수 탄산칼륨 (528.5 mg, 3.82 mmol, 1.5 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃로 가열하고, 4 시간 동안 교반하였다. TLC (100% DCM)에 의해 반응의 완료를 확인한 후, 상기 혼합물에 냉수를 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이후, 유기층을 염수 용액으로 씻어내고, 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜, 조 생성물을 얻었다. 이후, 생성물을 컬럼 크로마토그래피 (90% DCM:헥산)에 의해 정제하여, 순수한 생성물(575 mg, 73%)을 얻었다.
2.2 메틸 7-아미노-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실레이트. 단계 2. 실온에서 AcOH (5.8 mL) 중 화합물 2 (540 mg,1.74 mmol, 1.0 당량)에 철 분말 (1.94 g, 34.81 mmol, 20 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃로 가열하고, 4 시간 동안 교반하였다. TLC (5% MeOH:DCM)에 의해 반응의 완료를 확인한 후, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 에틸 아세테이트로 씻어내었다. 중탄산소듐을 사용하여 여과물을 염기화하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염수 용액으로 씻어내고, 무수 소듐 설페이트에서 건조하고, 여과하고, 감압 하에 증발시켜, 생성물 (207 mg, 54%)을 얻고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
2.3 메틸 7-(디에틸아미노)-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카보니트릴. 단계 3. 실온에서 메탄올 (2.37 mL) 중 화합물 3 (200 mg, 0.95 mmol, 1.0 당량)에 아세트알데히드 (0.46 mL, 8.3 mmol, 8.75 당량)를 첨가한 후, 아세트산 (0.46 mL)과 소듐 시아노보로하이드라이드 (46.5 mg, 0.73 mmol, 0.78 당량)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC (10% MeOH:DCM)에 의해 반응의 종료를 확인한 후, 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고, 냉수와 염수 용액으로 씻어내었다. 유기층을 여과하고, 소듐 설페이트에서 건조시키고, 증발시켜, 조 생성물을 얻은 후, 이를 컬럼 크로마토그래피 (30% EtOAc:DCM)에 의해 정제하여, 생성물 (30 mg, 13%)을 얻었다.
2.4 7-(디에틸아미노)-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산. 단계 4. 0℃에서 EtOH (0.9 mL) 중 화합물 4 (30 mg, 0.109 mmol, 1.0 당량)에 NaOH 용액 (0.6 mL의 물 중 21.9 mg, 0.547 mmol, 5.0 당량)을 첨가하였다. 이후, 반응물을 80℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 혼합물을 냉수에 붓고, 5% 시트르산 용액을 사용하여 pH를 5로 조절하였다. 형성된 고체를 여과에 의해 모으고, 물과 디에틸 에테르로 씻어내어, 생성물 (18 mg, 48%)을 얻었다.
2.5 최종 생성물에 접근하기 위한 과정. 단계 5. 10℃에서 무수 DMF (0.54 mL) 중 시작 물질 (18 mg, 0.069 mmol, 1.0 당량) 및 (4-아미노페닐)(1,4-옥사제판-4-일)메타논 (18.3 mg, 0.083 mmol, 1.2 당량)에, HATU (39.4 mg, 0.104 mmol, 1.5 당량)와 트리에틸 아민 (0.115 mL, 0.083 mmol, 1.2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 시작 물질이 소모된 후, 반응 혼합물을 냉수에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이후, 유기층을 소듐 설페이트에서 건조시켜, 농축하였다. 조제용-HPLC를 사용하여 조 물질을 정제하여, 순수한 화합물 (17.9 mg, 56%)을 얻었다. [M+H]+= 463.5. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 12.33 (s, 1H), 11.96 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 7.72 (dd, J = 8.8, 11.1 Hz, 3H), 7.38 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.79 (dd, J = 2.3, 8.8 Hz, 1H), 6.54 (s, 1H), 3.66 (br s, 6H), 3.51 - 3.36 (m, 6H), 1.72 (br s, 2H), 1.14 (t, J = 6.7 Hz, 6H).
합성 반응식 D:
Figure pct00019
3.1 에틸 7-브로모퀴놀린-3-카르복실레이트. 단계 1. 에탄올 (80.8 mL) 중 4-브로모-3-디니트로벤즈알데히드 (2.42 g, 10.51 mmol, 1.0 당량)의 혼합물에 에틸 3,3-디에톡시프로파노에이트 (4 g, 21.02 mmol, 2.0 당량)를 첨가한 후, 염화주석 무수물 (10.68 g, 47.3 mmol, 4.5 당량)을 첨가하였다. 반응을 80℃에서 12 시간 동안 환류시켰다. 반응이 완료된 후, 에탄올을 압력 하에 농축시켰다. 이후, 혼합물을 EtOAc 및 중탄산소듐에 의해 희석하고, 30 분 동안 교반하였다. 이후, 혼합물을 셀라이트에서 여과하여, 용해되지 않은 염을 제거하였다. 유기층을 분리한 후, 수층을 EtOAc (2×)에 의해 추출하였다. 합친 유기층을 여과하고, 소듐 설페이트에서 건조시켜, 농축하였다. 이후, 조 생성물을 헥산으로 씻어내고, 여과하고, 감압 하에 건조시켜, 순수한 생성물 (1.5 g, 51%)을 얻었다.
3.2 에틸 7-(디에틸아미노)퀴놀린-3-카르복실레이트. 단계 2. 톨루엔 (139 mL) 중 화합물 2 (1.4 g,4.998 mmol, 1.0 당량)의 용액에, 디에틸아민 (1.8 mL, 17.5 mmol, 3.5 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 아르곤에 의해 15 분 동안 정화시킨 후, Pd2(dba)3 (458 mg, 0.4998 mmol, 0.1 당량), RuPhos (466 mg, 0.9996 mmol, 0.2 당량), 및 탄산세슘 (5.94 g, 18.24 mmol, 3.65 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 가열하여 환류시키고, 2 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하여, 여과하였다. 여과물을 물과 염수로 씻어내었다. 이후, 유기층을 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켜, 조 물질을 얻었다. 이후, 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (0-20% EtOAc:헥산)에 의해 정제하여, 순수한 생성물을 얻었다 (779 mg, 57%).
3.3 7-(디에틸아미노)퀴놀린-3-카르복실산. 단계 3. 실온에서 THF (7.6 mL) 중 화합물 3 (779 mg, 2.86 mmol, 1 당량)의 용액에, NaOH 용액 (7.6 mL의 물 중 629 mg, 15.7 mmol, 5.5 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 4 시간 동안 환류 하에서 교반하였다. TLC (10% MeOH:DCM)에 의해 반응의 완료를 확인한 후, 남아있는 잔여물에서 과잉 THF를 증발시키고, 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 씻어내었다. 10% 시트르산 용액을 사용하여 수층 pH를 5로 조절하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염수 용액으로 씻어내고, 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜, 노란색 고체(431 mg, 62% 수율)로서의 생성물을 얻었다.
3.4 최종 생성물에 접근하기 위한 전반적인 과정. 단계 4. DCM (2.1 mL) 중 화합물 4 (50 mg, 0.205 mmol, 1.0 당량)의 용액에 아민 (0.184 mmol, 0.9 당량)을 첨가한 후, DIPEA (0.071 mL, 0.409 mmol, 2.0 당량), HOBt (34.5 mg, 0.225 mmol, 1.1 당량) 및 EDCI (43.2 mg, 0.225 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. TLC (5% MeOH:DCM)에 의해 반응의 완료를 확인한 후, 혼합물을 DCM에 의해 희석하고, 냉수, 염수 용액으로 씻어내고, 여과하고, 소듐 설페이트에서 건조시키고, 증발시켜 조 화합물을 얻었다. 생성물을 컬럼 크로마토그래피 (2% MeOH:EtOAc)에 의해 정제하였다.
Figure pct00020
반응식 1. N-(4-(디에틸카바모일)페닐)-4-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복사미드의 합성 반응식
Figure pct00021
N-(4-(디에틸카바모일)페닐)-4-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복사미드: 20℃에서 무수 디클로로메탄 (2 mL) 중 화합물-1.1 (50.0 mg, 0.246 mmol)의 용액에 화합물-1.2 (42.6 mg, 0.221 mmol)를 첨가한 후, EDCI (51.9 mg, 0.271 mmol), HOBt (36.6 mg, 0.271 mmol) 및 DIPEA (0.0857 mL, 0.492 mmol)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 물로 씻어내었다. 수층을 에틸 아세테이트에 의해 추출하고, 합친 유기층을 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켰다. 생성된 조 화합물을 12 g의 실리카 플래쉬 컬럼을 사용하여 정제하고, MeOH: DCM (0 내지 10%)로 용출하여, 백색 고체(63 mg, 67.8%)로서의 원하는 생성물을 얻었다. (+esi)[M+H]+ = 378.2. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 12.00 (s, 1H), 10.55 (s, 1H), 7.82 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.73 (d, J= 8.2 Hz, 2H), 7.62-7.52 (m, 1H), 7.39-7.15 (m, 4H), 3.42-3.14 (m, 4H), 2.43 (s, 3H), 1.09 (br s, 6H).
반응식 2. N-(4-(디에틸카바모일)페닐)-7-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복사미드의 합성 반응식
Figure pct00022
N-(4-(디에틸카바모일)페닐)-7-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복사미드: 20℃에서 무수 디클로로메탄 (2 mL) 중 화합물-2.1 (50 mg, 0.241 mmol)의 용액에 화합물-1.2 (41.8 mg, 0.217 mmol)를 첨가한 후, EDCI (50.9 mg, 0.265 mmol), HOBt (35.9 mg, 0.265 mmol) 및 DIPEA (0.0841 mL, 0.483 mmol)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 물로 씻어내었다. 수층을 에틸 아세테이트에 의해 추출하고, 합친 유기층을 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켰다. 생성된 조 화합물을 12 g의 실리카 플래쉬 컬럼을 사용하여 정제하고, MeOH: DCM (0 내지 10%)로 용출하여, 약간의 불순물과 함께 원하는 생성물을 얻었다. 최종적으로, 화합물을 DCM 중 30% 헥산에 의해 연마하여, 오프 화이트색 고체 (32 mg, 35%)로서의 원하는 생성물을 얻었다. (+esi)[M+H]+=382.2.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 12.74 (s, 1H), 12.11 (s, 1H), 8.99 (s, 1H), 8.12 (dd, J= 6.4, 8.8 Hz, 1H), 7.76 (d, J= 8.2 Hz, 2H), 7.36 (d, J= 8.2 Hz, 2H), 7.28-7.11 (m, 2H), 3.47-3.16 (m, 4H), 1.09 (br s, 6H).
반응식-3. 화합물 N-(4-(1,4-옥사제판-4-카보닐)페닐)-6-메톡시-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복사미드의 합성 반응식
Figure pct00023
N-(4-(1,4-옥사제판-4-카르보닐)페닐)-6-메톡시-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복사미드: 20℃에서 무수 디클로로메탄 (2 mL) 중 화합물-3.1 (50 mg, 0.228 mmol)의 용액에 화합물-3.2 (45.2 mg, 0.205 mmol)를 첨가한 후, EDCI (48.1 mg, 0.251 mmol), HOBt (33.9 mg, 0.251 mmol) 및 DIPEA (0.0795 mL, 0.456 mmol)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응의 완료 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 물로 씻어내었다. 수층을 에틸 아세테이트에 의해 추출하고, 합친 유기층을 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 생성된 조 화합물을 12 g의 실리카 플래쉬 컬럼을 사용하여 정제하고, MeOH: DCM (0 내지 5%)로 용출하여, 약간의 아닐린과 함께 원하는 생성물을 얻었다 (3.2). 최종적으로, DCM: 아세톤:헥산 (40:40:20)을 사용하여 PLC에 의해 정제하고, 건조하여, 담황색 고체 (49 mg, 51%)로서의 원하는 생성물을 얻었다, (+esi)[M+H]+=422.2. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 12.64 (s, 1H), 12.42 (s, 1H), 8.95 (s, 1H), 7.77 (br d, J= 8.2 Hz, 2H), 7.57 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 7.46-7.28 (m, 4H), 3.81 (s, 3H), 3.73-3.41 (m, 8H), 1.92-1.66 (m, 2H).
반응식 4. 화합물 N-(4-(1,4-옥사제판-4-카보닐)페닐)-6-메톡시-2-메틸퀴놀린-3-카르복사미드의 합성 반응식
Figure pct00024
N-(4-(1,4-옥사제판-4-카르보닐)페닐)-6-메톡시-2-메틸퀴놀린-3-카르복사미드: 20℃에서 무수 디클로로메탄 (2.12 mL) 중 화합물-4.1 (53.0 mg, 0.244 mmol)의 용액에 화합물-3.2 (48.4 mg, 0.220 mmol)를 첨가한 후, EDCI (51.4 mg, 0.268 mmol), HOBt (36.3 mg, 0.268 mmol) 및 DIPEA (0.085 mL, 0.488 mmol)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. TLC 및 LCMS에서는 생성물 형성의 징조가 나타나지 않았다. 이에 따라, HATU (139 mg, 0.366 mmol, 1.5 당량)를 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 물로 씻어내었다. 수층을 에틸 아세테이트에 의해 추출하고, 합친 유기층을 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 생성된 조 화합물을 12 g의 실리카 플래쉬 컬럼을 사용하여 정제하고, MeOH: DCM (0 내지 30%)으로 용출하였다, 원하는 분획을 농축하고, DCM에 용해시켜, 포화 NaHCO3 용액으로 씻어내고, 유기층을 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하여, 농축시켰다. 화합물을 12 g의 실리카 플래쉬 컬럼을 사용하여 정제하고, MeOH: DCM (0 내지 10%)로 용출하여, 담황색 고체(37 mg, 36%)로서의 원하는 생성물을 얻었다. (+esi)[M+H]+= 420.2. 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ = 8.14 (s, 1H), 7.95 (d, J= 9.4 Hz, 1H), 8.04 - 7.83 (m, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.52-7.28 (m, 3H), 7.03 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.87 - 3.53 (m, 9H), 2.84 (s, 3H), 1.94 - 1.55 (m, 2H).
반응식 5. 화합물 7-아미노-N-(4-(디에틸카바모일)페닐)퀴놀린-3-카르복사미드의 합성 반응식
Figure pct00025
에틸 7-((tert-부톡시카르보닐)아미노)퀴놀린-3-카르복실레이트. 단계-1: 테트라하이드로퓨란 (1 mL) 및 H2O (8.33 mg, 0.462 mmol) 중 화합물-5.1 (100 mg, 0.462 mmol)의 교반된 용액에, 탄산칼륨 세스퀴하이드레이트 (128 mg, 0.925 mmol)를 첨가하였다. 약 5 분 후, 디-tert-부틸 디카르보네이트 (118 mg, 0.541 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 3회 씻어내었다. 합친 유기층을 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켰다. 생성물을 플래쉬 크로마토그래피 (0-20% EtOAc:헥산)에 의해 정제하여, 50 mg의 미반응된 시작 물질과 함께 담황색 고체 (25 mg, 17%)로서의 화합물-5.2를 얻었다.
7-((tert-부톡시카르보닐)아미노)퀴놀린-3-카르복실산. 단계-2: 테트라하이드로퓨란 (2 mL) 중 화합물-5.2 (105 mg, 332 mmol)의 용액에 수산화소듐 (26.6 mg, 0.665 mmol)을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 56 시간 동안 교반하였다. 감압 하에서 증류에 의해 과잉 용매를 제거하고, 0.1 M HCl를 사용하여 잔여물의 pH를 4로 조절하고, 화합물을 에틸 아세테이트에 의해 추출하고, 유기층을 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켜, 화합물-5.3 (62 mg, 64%)을 얻었다. (+esi)[M+H]+=289.2.
tert-부틸 (3-((4-(디에틸카바모일)페닐)카바모일)퀴놀린-7-일)카르바메이트. 단계-3: 디메틸포름아미드 (1 mL) 중 화합물-5.3 (62 mg, 0.22 mmol)의 용액에, 화합물-1.2 (41 mg, 0.22 mmol), DIPEA (83 mg, 0.65 mmol)와 HATU (120 mg, 320 mmol)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 냉수로 씻어내고, 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켜, 조 화합물을 얻었고, 이를 콤비-플래쉬 (combi-flash)에 의해 정제하여, 노란색 고체(46 mg, 46%)로서의 순수한 화합물-5.4를 얻었다. (+esi)[M+H]+=463.3.
7-아미노-N-(4-(디에틸카바모일)페닐)퀴놀린-3-카르복사미드. 단계-4: 4M 수성 HCl (1 mL)을 화합물-5.4 (46 mg)에 첨가하고, 5-10 분 동안 실온에서 교반한 후, 20 분 동안 초음파 처리하였다. LCMS 분석에서, 미-처리된 시작 물질과 함께 생성물이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물에 메탄올 (2 mL)을 첨가하고, 초음파 처리를 한 후, 메탄올을 제거하였다. 잔여물을 동결 건조시켜, 흡습성 황색 분말 (3.2 mg, 9%)을 얻었다. (+esi)[M+H]+=363.2. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ = 9.20 (s, 1H), 9.16 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 8.04 (d, J= 9.4 Hz, 1H), 7.89 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 7.44 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 7.36 (dd, J= 2.1, 9.1 Hz, 1H), 7.00 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 3.67-3.48 (m, 2H), 3.45-3.33 (m, 2H), 1.34-1.10 (m, 6H).
반응식 6. 화합물 N-(4-(1,4-옥사제판-4-카보닐)페닐)-6-아미노퀴놀린-3-카르복사미드 하이드로클로라이드의 합성 반응식
Figure pct00026
메틸 6-((tert-부톡시카르보닐)아미노)퀴놀린-3-카르복실레이트. 단계-1: 건조 테트라하이드로퓨란 (6.0 mL) 중 화합물-6.1 (150 mg, 0.742 mmol)의 용액에, 티오우레아 (5.65 mg, 0.0742 mmol)와 DIPEA (0.0646 mL, 0.371 mmol)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 5 분간 교반한 후, Boc 무수물 (178 mg, 0.816 mmol)을 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. LCMS에 의해 반응의 진행을 모니터링하였는데, 단 25%의 변환율만 나타났다. 이 반응 혼합물을 농축하고, 추가 5 당량의 Boc 무수물과 1.5 mL의 건조 THF를 첨가하고, 반응 혼합물을 70℃로 가열하여, 3 시간 동안 교반하였고, LCMS에서 생성물로 95% 변환된 것으로 나타났다. 과잉 THF를 증발시키고; 물 (5 mL)을 상기 혼합물에 첨가하고, 에틸 아세테이트 (3×10 mL)로 추출하고, 황산 소듐에서 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 사전 패킹된 실리카 겔 컬럼 (12 g)에 의해 정제하고, 에틸 아세테이트 (0 내지 50%) 중 헥산으로 용출시켜, 백색 분말 (180 mg, 80%)로서의 원하는 화합물-6.2를 얻었다.
6-((tert-부톡시카르보닐)아미노)퀴놀린-3-카르복실산. 단계-2: 밀봉된 튜브에 테트라하이드로퓨란 (1.80 mL) 및 물 (1.80 mL) 중 화합물-6.2 (180 mg, 0.595 mmol)과 수산화소듐 (131 mg, 3.27 mmol)을 채우고, 70℃에서 3 시간 동안 교반하였다. LCMS에서는, 51%의 원하는 생성물과 45%의 탈-boc 생성물이 있다고 나타났다. 이후, THF를 감압 하에서 제거하고, 조 생성물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 씻어내었다 (2×5 mL). 10% 시트르산 용액에 의해 수층 pH를 5로 조절한 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염수로 씻어내고, 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 화합물을 사전 패킹된 실리카 겔 컬럼 (12 g)에 의해 정제하고, MeOH (0 내지 10%) 중 DCM에 의해 용출하여, 원하는 화합물-6.3 (132 mg, 39%)을 얻었다.
tert-부틸 (3-((4-(1,4-옥사제판-4-카보닐)페닐)카바모일)퀴놀린-6-일)카르바메이트. 단계-3: 화염 건조된 밀봉 튜브에 무수 디메틸포름아미드 (1.95 mL) 중 화합물-6.3 (65 mg, 0.225 mmol) 및 화합물-3.2 (59.6 mg, 0.271 mmol)를 채웠다. 이후, HATU (129 mg, 0.338 mmol)와 DIPEA (0.0471 mL, 0.271 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트에 의해 추출한 후, 유기층을 물로 씻어내고, 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 생성된 조 화합물을 24 g의 실리카 플래쉬 컬럼을 사용하여 정제하고, MeOH: CHCl3로 용출하여, 원하는 화합물-6.4을 얻고, 이를 다음 단계에 사용하였다.
N-(4-(1,4-옥사제판-4-카보닐)페닐)-6-아미노퀴놀린-3-카르복사미드 하이드로클로라이드. 단계-4: 4M 수성 HCl (1 mL)을 단계-3에서 얻은 화합물-6.4에 첨가하고, 20 분 동안 초음파 처리한 후, 동결 건조에 의해 노란색 고체 (46 mg; 두 단계에서 48%)로서의 원하는 생성물의 HCl 염을 얻었다. (+esi)[M+H]+=391.2. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 9.27 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 9.17 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 8.03 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 7.92 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.71 (dd, J= 9.1, 2.4 Hz, 1H), 7.52 (d, J= 7.9 Hz, 2H), 7.31 (d, J= 2.5 Hz, 1H), 3.88-3.63 (m, 8H), 2.05-2.00 (m, 1H), 1.88-1.83 (m, 1H).
반응식 7. 화합물 6-아미노-N-(4-(디에틸카바모일)페닐)퀴놀린-3-카르복사미드 HCl 염의 합성 반응식
Figure pct00027
메틸 6-((tert-부톡시카르보닐)아미노)퀴놀린-3-카르복실레이트. 단계-1: 테트라하이드로-퓨란 (4 mL) 중 화합물-7.1 (150 mg, 0.742 mmol)의 용액에, 티오우레아 (5.6 mg, 0.074 mmol), DIPEA (47.9 mg, 0.371 mmol) 및 boc 무수물 (177 mg, 0.816 mmol)을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS에 의해 반응의 진행을 모니터링하였고, 25%의 생성물이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물로부터 용매를 제거하고, 추가 5 당량의 boc 무수물과 1.5 mL의 THF를 첨가하고, 반응 혼합물을 70℃로 가열하고, 3 시간 동안 교반하였고, LCMS 분석에서 생성물이 95% 형성된 것으로 나타났다. 이후, 갑압 하에 용매를 제거하고, 잔여물을 에틸 아세테이트에 용해하여, 물로 씻어내고, 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켜, 조 화합물을 얻었고, 이를 0-50% EA: 헥산을 갖는 12 g의 플래쉬 컬럼에 의해 정제하여, 생성물을 용출시킨 후, 100% EA에 의해 미-반응된 시작 물질을 용출하였다. 생성물의 분획을 감압 하에 증류시켜, 백색 화합물-7.2 (180 mg, 80%)로서의 순수한 화합물을 얻었다. (+esi)[M+H]+=303.2.
6-((tert-부톡시카르보닐)아미노)퀴놀린-3-카르복실산. 단계-2: 테트라하이드로퓨란 (1.8 mL) 중 화합물-7.2 (180 mg, 0.595 mmol)의 용액에, 수산화소듐 (130 mg, 3.27 mmol)과 물 (1.8 mL)을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 70℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 LCMS에 의해 모니터링하였더니, 51%의 원하는 생성물과 45%의 탈-boc 생성물이 형성된 것으로 나타났다. 이 단계에서, 반응을 중단시키고, 과잉 테트라하이드로퓨란을 감압 하에서 제거하고, 조 잔여물을 물에 용해시키고, 물로 씻어내었다. 이후, 10% 시트르산 용액에 의해 수층을 pH 5로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염수 용액으로 씻어내고, 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켜, 화합물-7.3 (132 mg, 39.2%; 51% 순도)을 얻었다. (+esi)[M+H]+=289.2.
tert-부틸 (3-((4-(디에틸카바모일)페닐)카바모일)퀴놀린-6-일)카르바메이트. 단계-3: 무수 DMF (1.95 mL) 중 화합물-7.3 (65 mg, 0.225 mmol)의 용액에, 화합물-1.2 (52 mg, 0.271 mmol), DIPEA (0.047 mL, 0.271 mmol) 및 HATU (129 mg, 0.338 mmol)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트에 의해 추출하였다. 유기층을 물로 씻어내고, 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켜 조 화합물을 얻고, 이를 24 g의 실리카 겔 컬럼에 의해 정제하고, 클로로포름과 메탄올로 용출시켜, 화합물-7.4를 얻고, 이를 다음 단계에 사용하였다. (+esi) [M+H]+=463.4.
6-아미노-N-(4-(디에틸카바모일)페닐)퀴놀린-3-카르복사미드 HCl 염. 단계-4: 4M 수성 HCl (1 mL)을 단계-3으로부터 얻은 화합물-7.4에 첨가하고, 20 분 동안 초음파 처리하였다. LCMS에서 반응이 종결된 것으로 나타난다. 과잉 시약은 동결 건조에 의해 제거하고, 얻은 고체를 에테르로 씻어내고, 건조시켜, 노란색 고체(18 mg, 두 단계로부터 25%)로서의 원하는 화합물을 얻었다. (+esi)[M+H]+= 363.3 (-HCl). 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ = 9.28 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.03 (d, J= 9.3 Hz, 1H), 7.91 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 7.71 (dd, J= 2.1, 9.1 Hz, 1H), 7.45 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.33 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 3.57 (br s, 2H), 3.37 (br s, 2H), 1.27 (br s, 3H), 1.18 (br s, 3H).
반응식 8. 화합물 N-(4-(디에틸카바모일)페닐)-2-메틸퀴놀린-3-카르복사미드의 합성 반응식
Figure pct00028
2-메틸퀴놀린-3-카르복실산. 단계-1: 밀봉 튜브에 테트라하이드로퓨란 (1 mL) 및 물 (1 mL) 중 화합물-8.1 (100 mg, 0.465 mmol)과 수산화소듐 (102 mg, 2.56 mmol)을 채우고, 100℃에서 4 시간 동안 교반하였다. TLC에서는, SM이 생성물로 완전히 변환된 것으로 나타났다. 이후, 테트라하이드로퓨란을 감압 하에서 제거하고, 조 생성물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트에 의해 씻어내었다 (2×5 mL). 10% 시트르산 용액에 의해 수층 pH를 5로 조절한 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염수로 씻어내고, 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 화합물-8.2를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
N-(4-(디에틸카바모일)페닐)2-메틸퀴놀린-3-카르복사미드. 단계-2: 20℃에서 무수 디클로로메탄 (2.8 mL) 중 화합물-8.2 (70.0 mg, 0.374 mmol)의 용액에 화합물-2 (64.7 mg, 0.337 mmol)를 첨가한 후, EDCI (78.9 mg, 0.411 mmol), HOBt (55.6 mg, 0.411 mmol) 및 DIPEA (0.130 mL, 0.748 mmol)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. TLC 및 LCMS에서는 임의의 생성물이 형성된 징조가 나타나지 않았다. 따라서, HATU (213 mg, 0.561 mmol)를 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. LCMS에서는 단 6%의 전환율만 나타났다. 통상의 후속 처리 후, 생성된 조 화합물을 12 g의 실리카 플래쉬 컬럼을 사용하여 정제하고, MeOH: DCM (0 내지 10%)로 용출하여, 불순물과 함께 원하는 생성물을 얻었다. 이러한 불순물이 포함된 화합물을 조제용 HPLC로 다시 정제하여, 백색 고체 (6 mg, 2 개 단계에서 3.5%)로서의 순수한 화합물을 얻었다. (+esi)[M+H]+ = 362.2. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ = 8.64 (s, 1H), 8.12 - 8.03 (m, 2H), 7.90 (t, J= 7.9 Hz, 1H), 7.85 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 7.75-7.66 (m, 1H), 7.44 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 3.57 (br s, 2H), 3.37 (br s, 2H), 2.89 (s, 3H), 1.27 (br s, 3H), 1.18 (br s, 3H).
반응식 9. 화합물 N-(4-(아제핀-1-카보닐)페닐)-6-메톡시-2-메틸퀴놀린-3-카르복사미드의 합성 반응식
Figure pct00029
6-메톡시-2-메틸퀴놀린-3-카르복실산. 단계-1: 밀봉 튜브에 테트라하이드로퓨란 (2.00 mL) 및 물 (2.00 mL) 중 화합물-9.1 (200 mg, 0.815 mmol) 및 수산화소듐 (179 mg, 4.48 mmol)을 채우고, 100℃에서 5 시간 동안 교반하였다. TLC에서는, SM이 생성물로 완전히 변환된 것으로 나타났다. 이후, THF를 감압 하에서 제거하고, 조 생성물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트에 의해 씻어내었다 (2×5 mL). 10% 시트르산 용액으로 수층 pH를 5로 조절한 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염수로 씻어내고, 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 화합물-9.2 (163 mg, 92%)를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
N-(4-(아제핀-1-카르보닐)페닐)-6-메톡시-2-메틸퀴놀린-3-카르복사미드.. 단계-2: 20℃에서 무수 디클로로메탄 (2 mL) 중 화합물-9.2 (50.0 mg, 0.230 mmol)의 용액에 화합물-9.3 (45.2 mg, 0.207 mmol)을 첨가한 후, EDCI (48.5 mg, 0.253 mmol), HOBt (34.2 mg, 0.253 mmol) 및 DIPEA (0.0802 mL, 0.460 mmol)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 물로 씻어내었다. 수층을 에틸 아세테이트에 의해 추출하고, 합친 유기층을 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 생성된 조 화합물을 12 g의 실리카 플래쉬 컬럼을 사용하여 정제하고, MeOH: DCM (0 내지 10%)로 용출하여, 담황색 고체(51 mg, 53%)로서의 원하는 생성물을 얻었다. (+esi)[M+H]+=418.2. 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ 8.14 (s, 1H), 8.01-7.90 (m, 1H), 7.68 (br d, J=8.2 Hz, 2H), 7.48-7.33 (m, 4H), 7.04 (d, J=2.9 Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.68-3.58 (m, 2H), 3.40 (br s, 2H), 2.84 (s, 3H), 1.87-1.73 (m, 2H), 1.60 (br s, 6H).
반응식 10. 화합물 2-(2-(4-(디메틸아미노)페닐)-2-옥소에톡시)-4,6-디메틸니코티노니트릴의 합성 반응식
Figure pct00030
2-(2-(4-(디메틸아미노)페닐)-2-옥소에톡시)-4,6-디메틸니코티노니트릴: 화염 건조된 바이알에 무수 디메틸포름아미드 (6 mL) 중 화합물-10.1 (200 mg, 1.35 mmol)을 채우고, 탄산칼륨 (205 mg, 1.48 mmol)과 요오드화칼륨 (246 mg, 1.48 mmol)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 15 분 동안 교반하고, 화합물-10.2 (327 mg, 1.35 mmol)를 상기 반응 혼합물에 첨가하여, 150℃에서 30 분 동안 교반하고, 실온에서 밤새 교반하였다. TLC 및 LCMS에서는, 완전히 변환되어 생성물이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 물 (10 mL)에 붓고, 에틸 아세테이트 (3×10 mL)로 추출하고, 합친 유기층을 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 생성된 조 화합물을 12 g의 실리카 플래쉬 컬럼을 사용하여 정제하고, 에틸 아세테이트 (0 내지 30%) 중 헥산에 의해 용출하여, 원하는 분획을 농축하고, 디에틸 에테르와 함께 연마하였다. 최종적으로, 화합물을 조제용 HPLC에 의해 정제하여, 원하는 생성물 (70 mg, 17%)을 얻었다. (+esi)[M+H]+=310.2. 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ 7.88 (d, J=8.79 Hz, 2 H) 6.64 - 6.71 (m, 3 H) 5.59 - 5.65 (m, 2 H) 3.07 (s, 6 H) 2.45 (s, 3 H) 2.30 (s, 3 H).
반응식 11. 화합물 2-(2-(4-(디메틸아미노)페닐)-2-옥소에톡시)-6,8-디메틸퀴놀린-3-카르보니트릴의 합성 반응식
Figure pct00031
(E)-6,8-디메틸-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르바알데히드 옥심. 단계-1: 10℃에서 물 (0.15 mL) 중 하이드록실아민 하이드로클로라이드 (50 mg, 0.72 mmol)의 용액에 4M 수산화소듐 수용액 (0.2 mL)을 첨가하고, 10 분 동안 실온에서 교반하여, 이를 실온에서 에탄올 (1.16 mL) 중 화합물-11.1 (50 mg, 0.25 mmol)의 용액을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 90℃로 가열하여, 3 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 (TLC; 5% MeOH:DCM; R f ~ 0.2에 의해 확인됨) 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켜, 냉수에 부었다. 4N 염산 수용액을 사용하여, 용액의 pH를 2로 조절하였다. 분리된 고체를 여과하고, 물로 씻어내고, 감압 하에 건조시켜, 화합물-11.2 (54 mg, 100%)을 얻었다.
6,8-디메틸-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카보니트릴. 단계-2: 아세트산 무수물 (1.8 g, 18 mmol)을 화합물-11.2 (54 mg, 0.25 mmol)에 첨가하여, 140℃로 가열하고, 3 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 (TLC; 5% MeOH:DCM에 의해 확인) 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물로 희석하였다. 이후, 4 N 수산화소듐 수용액을 사용하여 혼합물을 pH=10으로 염기화하였다. 분리된 고체를 여과하고, 물로 씻어내고, 감압 하에 건조시켜, 화합물-11.3 (50 mg; 정량적 수율)을 얻었다.
2-(2-(4-(디메틸아미노)페닐)-2-옥소에톡시)-6,8-디메틸퀴놀린-3-카르보니트릴. 단계-3: 화염 건조된 바이알에 무수 디메틸포름아미드 (1mL) 중 화합물-11.3 (50 mg, 0.25 mmol)을 채우고, 탄산칼륨 (38 mg, 0.27 mmol) 및 요오드화칼륨 (42 mg, 0.27 mmol)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 15 분 동안 교반한 후, 화합물-11.4 (60 mg, 0.25 mmol)를 상기 반응 혼합물에 첨가하여, 150℃에서 30 분 동안 교반하고, 실온에서 밤새 교반하였다. TLC 및 LCMS에서는, 완전히 변환되어 생성물이 형성된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 물 (5 mL)에 붓고, 에틸 아세테이트 (3×10 mL)로 추출하고, 합친 유기층을 무수 소듐 설페이트에서 건조시키고, 여과하여, 증발시켰다. 생성된 조 화합물을 12 g의 실리카 플래쉬 컬럼을 사용하여 정제하고, 에틸 아세테이트 (0 내지 30%) 중 헥산으로 용출하고, 원하는 분획을 농축하여, 디에틸 에테르와 함께 연마하였다. 최종적으로, 화합물을 조제용 HPLC에 의해 정제하여, 고체 (40 mg, 44%)로서의 원하는 생성물을 얻었다. (+esi)[M+H]+=360.2. 1H NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 8.28 (s, 1H), 7.87-7.83 (m, 2H), 7.33-7.31 (m, 2H), 6.75-6.72 (m, 2H), 5.63 (s, 2H), 2.99 (s, 6H), 2.34 (s, 3H), 2.28 (s, 3H).
시험관내 사르코스판 단백질 수준의 증가
본 발명의 화합물을 상기 기재된 SSPN-HiBiT 검정에 의해 비히클 대비 SSPN 단백질 수준의 증가(비히클 대비 변화 배수)에 대해 검정하였다 (*p < 0.05)
표 1
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
표 2
Figure pct00035
참조에 의한 포함
본원에 언급된 모든 간행물과 특허는 마치 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참조로서 포함되었다고 적혀져 있는 것처럼 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 모순되는 경우, 본원의 임의의 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.
균등물
본 발명의 특정 구현예를 토론하였으나, 상기 명세서는 예시적인 것이며, 제한적인 것이 아니다. 본 명세서와 이하의 청구 범위를 검토할 때, 당업계의 숙련자들에게는 본 발명의 많은 변형예들이 명백할 것이다. 본 발명의 전체 범주는 청구 범위와 균등물의 전체 범주를 함께 참고하고, 명세서와 이의 변형물을 함께 고려하여 결정하여야 한다.

Claims (23)

  1. 화학식 (I)으로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서:
    Figure pct00036
    (I)
    식 중
    X는 CR7 또는 N이고;
    Y는 S, O 또는 SO2이고;
    Z는 N 또는 CR6이고;
    R1, R2, R3, R4, R5 및 R7은 각각 독립적으로 H, 알킬, 알콕시, 할로, 니트릴, 아미노 또는 아미노알킬이고;
    R6은 H 또는 알킬이고;
    Q는 C=O, SO 또는 SO2이고;
    Cy는 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    m은 1-3인, 화합물.
  2. 제1 항에 있어서, X는 N인, 화합물.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, Y는 O인, 화합물.
  4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 N인, 화합물.
  5. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, Cy는 아릴인, 화합물.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, Cy는 아미노알킬, 할로, 알콕시 또는 OH로 치환되는, 화합물.
  7. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 H 또는 알킬인, 화합물.
  8. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, R1, R4, R5 및 R7은 H인, 화합물.
  9. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, R2 및 R3은 메틸인, 화합물.
  10. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, m은 1인, 화합물.
  11. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, Q는 C=O인, 화합물.
  12. 화학식 (II)으로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서:
    Figure pct00037
    (II)
    식 중
    X은 O, N 또는 NR9이고;
    R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 H, 알킬, 알콕시, 할로, 니트릴, 아미노 또는 아미노알킬이고;
    R6은 H, =O 또는 알킬이고;
    Cy는 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    R7 및 R8은 각각 독립적으로 H 또는 알킬이거나, 또는 이들이 부착된 N 원자와 함께 헤테로사이클릴을 형성하고;
    R9은 H 또는 알킬인, 화합물.
  13. 제12 항에 있어서, Cy는 아릴인, 화합물.
  14. 제12 항 또는 제13 항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 (IIa)으로 표현되는, 화합물:
    Figure pct00038
    (IIa).
  15. 제12 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, X는 N인, 화합물.
  16. 제12 항 내지 제15 항 중 어느 한 항에 있어서, R1, R4 및 R5는 H인, 화합물.
  17. 제12 항 내지 제16 항 중 어느 한 항에 있어서, R7 및 R8은 함께 헤테로사이클릴을 형성하는, 화합물.
  18. 제12 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 (IIb)으로 표현되고:
    Figure pct00039
    (IIb)
    식 중
    Y는 O 또는 NR10이고,
    R10은 H, 알킬 또는 아실이고;
    m은 1 또는 2인, 화합물.
  19. 하기로부터 선택된 화합물:
    Figure pct00040
    , 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
  20. 하기로부터 선택된 화합물:
    Figure pct00041
    , 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
  21. 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  22. 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 디스트로핀-관련 복합체의 기능 부전과 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1 항 내지 제21 항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  23. 제22 항에 있어서, 상기 디스트로핀-관련 복합체의 기능 부전과 관련된 질병은 근이영양증인, 방법.
KR1020237011841A 2020-09-11 2021-09-08 근이영양증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 KR20230067637A (ko)

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