KR20230067064A - 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물 - Google Patents
신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신이 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 신이 추출물은 DPPH 라디칼 소거능이 높아 우수한 항산화 효과를 가지며, NO 생성을 감소시키고, iNOS, COX-2, 및 p-NF-κB 단백질 발현을 감소시키며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6, 및 IL-1β의 생성을 현저히 감소시키는 우수한 항염증 효과를 나타내므로, 항염증용 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 신이(magnolia flower) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.
염증(inflammation)은 감염으로 인한 인체 조직손상을 막는 방어기전으로 발진, 발열, 통증과 같은 증상을 수반하며, 병원성 물질을 제거하고 조직의 재생을 통해 정상적인 구조와 기능을 회복시킨다.
그러나, 항원이 제거되지 않거나, 내부 물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하게 혹은 지속적으로 야기되면 점막 손상이 촉진되고, 신경퇴행성질환과 같은 각종 만성질환 및 암 등을 유발할 수 있다.
인체 내 면역 반응에서 대식세포(macrophage)는 일산화질소(nitric oxide; NO), 프로스타글란딘(prostaglandin; PG), 전 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 등과 같은 염증 매개 물질의 생성에 관여하고 조절하며, 염증 매개 물질은 염증 반응을 유도하여 인체 방어기전으로 작용하게 되나, 숙주의 면역 반응이 적절하게 대응하지 못할 경우 염증성 질환을 유발할 수 있다.
한편, 염증을 소실시키기 위해 염증원의 제거, 생체 반응 및 증상을 감소시키는 작용을 하는 것을 항염제라 한다.
현재까지 항염의 목적으로 이용되고 있는 물질로는 비스테로이드계로 플루페나믹산(flufenamic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신(indomethacin) 등이 있고, 스테로이드계로 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손(dexamethasone) 등이 있다. 또한, 알란토인, 아즈엔, 하이드로코티손 등이 항염증 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 피부에 대한 안전성의 문제로 사용량이 제한되거나, 효과가 미미하여 실질적으로 염증 완화 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다. 이에, 천연물 유래의 항염증 활성을 가진 성분을 찾고자 하는 노력이 계속되어 왔다.
신이(Magnolia flower)는 목련과(Magnoliaceae)에 속하는 목련꽃의 봉우리를 이르는 말로, 꽃봉우리가 약간 매운 맛이 나기 때문에 신이(辛夷)라고 한다. 한국에서는 목련과의 백목련(Magnolia denudata Desrousseaux) 또는 동속식물의 꽃봉우리를 말려서 사용하며, 일본에서는 백목련(M. denudata Desr.), 망춘화(M. flower Pamp., 望春花), 일본신이(M. kobus DC., 日本辛夷), 향신이(M. salicifolia Maxim.:香辛夷) 및 무당 옥란(M. sprengeri Pamp.: 武當玉蘭)을 사용하며, 중국에서는 백목련(M. denudata Desr), 망춘화(M. flower Pamp., 望春花) 및 무당옥란(M. sprengeri Pamp., 武當玉蘭)을 사용한다. 신이에 대해 한방에서는 그 성질을 따뜻하다고 보며 두통, 요통 및 비염에 효능이 있고 또한 축농증을 치료해주고 진통제의 약성이 있다고 보고되어 있다.
이에, 본 발명자들은 신이에 대해 연구하던 중, 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 NO 생성을 억제하고, iNOS, COX-2, 및 p-NF-κB 단백질 발현을 감소시키며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6, 및 IL-1β의 생성을 현저히 감소시키는 우수한 항염증 효과를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명의 신이 추출물은 DPPH 라디칼 소거능이 높아 우수한 항산화 효과를 가지며, NO 생성을 감소시키고, iNOS, COX-2, 및 p-NF-κB 단백질 발현을 감소시키며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6, 및 IL-1β의 생성을 현저히 감소시키는 우수한 항염증 효과를 나타내므로, 항염증 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 신이 추출물의 DPPH 라디칼 소거능의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 신이 추출물의 세포내 독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 3은 신이 추출물의 NO 생성 억제를 나타낸 그래프이다.
도 4는 신이 추출물의 iNOS, COX-2, 및 p-NF-κB 단백질 발현을 감소시키는 것을 나타낸 그래프이다.
도 5는 신이 추출물을 투여한 후, LPS를 투여하는 동물 실험 모식도를 나타내는 것이다.
도 6은 신이 추출물의 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6, 및 IL-1β 생성을 억제하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 2는 신이 추출물의 세포내 독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 3은 신이 추출물의 NO 생성 억제를 나타낸 그래프이다.
도 4는 신이 추출물의 iNOS, COX-2, 및 p-NF-κB 단백질 발현을 감소시키는 것을 나타낸 그래프이다.
도 5는 신이 추출물을 투여한 후, LPS를 투여하는 동물 실험 모식도를 나타내는 것이다.
도 6은 신이 추출물의 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6, 및 IL-1β 생성을 억제하는 것을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 신이 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 신이는 Magnolia flower 의 학명을 가지며, 목련과(Magnoliaceae)에 속하는 목련꽃의 봉우리를 이르는 말이다. 신이에 대해 한방에서는 그 성질을 따뜻하다고 하며 두통, 요통 및 비염에 효능이 있고 축농증을 치료해주고 진통제의 약성이 있다고 한다.
본 발명의 신이 추출물은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출하여 제조될 수 있다.
상기 알코올은 C1-3의 저급 알코올일 수 있고, 바람직하게는 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 알코올은 30 내지 99% 에탄올일 수 있고, 40 내지 90% 에탄올일 수 있고, 50 내지 80% 에탄올일 수 있으며, 60 내지 75% 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 추출방법은 침지, 진탕추출, 속실렛(Soxhlet) 추출, 환류 추출 또는 초음파 추출일 수 있다. 이 때, 추출 시간은 1 내지 10일, 2 내지 8일, 3 내지 7일일 수 있다. 상기 추출은 1회 내지 5회 반복하여 추출할 수 있다.
본 발명의 신이 추출물은 강력한 항산화 활성을 갖는다.
본 발명의 항산화 활성이란 사람의 호흡을 통해 체내로 들어온 산소는 인체에 필요한 에너지를 만드는 등 이로운 작용도 하지만, 이 과정에서 몸에 좋지 않은 여분의 산소인 활성산소(Free Radical)가 생성되는데, 활성산소는 체내의 정상 세포를 공격하여 노화나 각종 질병의 원인으로 작용한다. 이 활성산소를 제거하는 것이 세포의 산화(노화)를 막는 방법이며, 이러한 세포의 산화를 억제하는 것이 항산화 활성이다.
본 발명에서는 항산화 활성을 확인하기 위하여 신이 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 확인하였다.
상기 DPPH 라디칼 소거능 측정은 항산화능을 측정하는데 사용되는 보편적인 실험 방법으로, DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼은 보라색을 띠고 있으나 이것이 항산화 물질과 반응하면 옅은 노랑색을 띠게 되는 것을 이용하는 방법이다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 신이 추출물의 항산화 활성을 확인하기 위하여 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, 신이 추출물의 DPPH 라디칼 소거능이 우수한 것을 확인하였다(도 1).
본 발명의 신이 추출물은 항염증 효과를 갖는다.
본 발명의 항염증은 염증성 질환의 개선(증상의 경감), 치료, 그러한 질환의 발병의 억제 또는 지연을 포함하는 의미이다.
본 발명에서는 항염증 활성을 확인하기 위해 신이 추출물의 산화질소(NO)의 생성 억제 활성, 염증 관련 단백질의 발현 억제와 염증성 사이토카인의 억제 활성을 평가 하였다.
상기 신이 추출물은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출하여 제조된 추출물일 수 있고, 바람직하게는 신이 에탄올 추출물 또는 물 추출물 일 수 있다. 상기 에탄올 추출물은 30 내지 99% 에탄올, 40 내지 90% 에탄올, 50 내지 80% 에탄올, 또는 60 내지 75% 에탄올을 이용한 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 신이 추출물의 세포 독성 여부를 확인한 결과, 세포 독성이 없음을 확인하였다(도 2).
본 발명의 신이 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위하여 신이 추출물의 산화질소(NO) 생성량을 분석한 결과, 농도 의존적으로 산화질소 생성량이 감소함을 확인하였고, 높은 산화질소 생성 억제 효과를 나타냄을 확인하였다(도 3).
또한, 신이 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위하여 신이 추출물의 염증 관련 단백질의 발현을 분석한 결과, iNOS, COX-2, 및 p-NF-κB 단백질 발현을 감소시키는 것을 확인하였다(도 4).
또한, 신이 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위하여 염증성 사이토카인의 생성량을 분석한 결과, 시료 처리 농도에 따라 사이토카인이 유의적으로 감소함을 확인하였고, 상기 염증성 사이토카인은 TNF-α, IL-6, 및 IL-1β로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명의 신이 추출물은 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 염증 질환은 염증성 장질환, 사구체신염, 염증성 피부질환, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 건강기능식품은, 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 또는 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분 (기능성 원료)을 사용하여 제조하는 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리 기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 NO 생성을 감소시키고, iNOS, COX-2, 및 p-NF-κB 단백질 발현을 감소시키며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6, 및 IL-1β의 생성이 현저히 감소시키는 우수한 항염증 효과를 나타내므로, 염증 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효 성분인 신이 추출물을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 첨가물을 추가로 포함할 수 있다.
상기 첨가물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성, 환자의 골 손실 정도와 같은 요인들에 따라 다르며, 당 업자에 의하여 적절하게 선택될 수 있고, 구체적으로 0.001 mg/kg 내지 500 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 갑셀제 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 투여 대상은 인간, 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 닭, 고양이, 개, 마우스, 토끼 등을 포함하지만, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명의 사료 첨가제는 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 의미한다.
상기 사료 첨가제를 공급하는 경우, 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 공급하거나 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
상기 사료 첨가제를 공급하는 경우, 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 공급하거나 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
또한, 본 발명의 사료 첨가제는 당업계에 공지된 다양한 사료 제조방법에 따라 적절한 유효 농도 범위에서 신이 추출물을 첨가하여 제조 가능하다.
상기 첨가제는 어떠한 개체에도 적용 가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비 인간동물, 조류, 또는 어류 등 어떠한 개체에도 적용 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다.
단, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명을 일 측면에서 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 신이 추출물의 제조
본 발명에서는, 신이 꽃봉오리를 이의 중량 8배에 해당하는 물을 첨가하여 95℃에서 2시간 추출하였다. 이후, 추출액을 감압 농축기를 이용하여 농축한 후 농축된 추출액을 분무건조하여 고상의 신이 추출물 5 kg을 수득하였다.
실시예 2. 신이 추출물을 포함하는 건강기능식품 조성물
신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품 조성물은 하기와 같다. 1정(800mg) 당 포함된 원료명 및 배합비율은 하기 표 1과 같다.
| 원료명 | 조성 1 함량(mg) | 조성 2 함량(mg) |
| 신이추출물 | 200.0000 | 400.0000 |
| 결정셀룰로스 | 554.188 | 354.188 |
| 히드록시프로필메틸셀룰로스 | 17.344 | 17.344 |
| 글리세린지방산에스테르 | 1.732 | 1.732 |
| 이산화규소 | 12.8 | 12.8 |
| 스테아린산마그네슘 | 9.6 | 9.6 |
| 이산화티타늄 | 4.336 | 4.336 |
| 합계 | 800.0000 | 800.0000 |
실험예 1. 신이 추출물이 자유라디칼 소거 활성에 미치는 영향
신이 추출물의 항산화 효과를 알아보기 위하여 자유라디칼 소거활성을 평가하였다. 0.2 mM DPPH 용액 180 μL를 96-well plate에 loading 한 후 농도별로 희석한 sample 용액 20 μL를 혼합하여 30분간 반응시킨 후 microplate reader로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
한편, 자유라디칼 소거시험에서의 대조군은 시료 용액 대신에 에탄올을 넣어 동일한 방법으로 측정하였으며, DPPH 용액 대신 에탄올을 넣어 각각에 대한 색 보정값을 수득하였다.
실험은 각각 3회씩 수행하여 평균값 ± 표준편차로 나타내었다. IC50은 자유라디칼 소거율 50%를 달성하기 위해 소요되는 시료의 농도로서, 다른 성분 물질과 상대적으로 비교할 때 사용하는 수치로 값이 작을수록 소거율이 높음을 나타낸다.
그 결과, 신이 추출물은 우수한 항산화 효과를 나타냄을 확인하였다(도 1).
실험예 2. 염증 유도된 세포에서 신이 추출물이 NO 생성에 미치는 영향
2-1. RAW264.7 세포주의 배양
항염 활성 연구에 주로 사용되고 있던 RAW264.7 세포주는 일반적인 세포 배양용 배지에서 배양하였다. 배양용 배지로는 10% 우태아 혈청(FBS: Fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하였다.
2-2. 염증 유도된 RAW264.7 세포에 신이 추출물이 NO 생성에 미치는 영향
신이 추출물의 염증 유도된 RAW264.7 세포의 NO 생성에 미치는 영향을 평가하기 위해서 신이 추출물 100, 200, 400 μg/mL 농도와 LPS 100 ng/mL로 24시간 동안 배양하여 염증을 유도하였다.
RAW264.7 세포 상층액을 획득하여 96-well plate에 loading 하였다. 96-well plate에 Griess 시약을 첨가하고, 그 혼합물의 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 spectrophotometer로 570 nm에서 측정하였다. NO 생성물은 LPS 단독 처리한 세포와의 비율로 나타내었다.
그 결과, 신이 추출물 1 ~ 10 μg/mL에서 NO의 생성이 감소되는 것을 확인하였다(도 3).
실험예 3. 신이 추출물의 세포 독성 평가
신이 추출물의 세포 내 독성을 평가하기 위해서, RAW264.7 세포에 신이 추출물을 처리하여 MTT 방법을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. MTT 분석법은 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 생성된 blue formazan 결정을 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 녹여서 발색시켜 그 흡광도를 측정하는 방법이다.
본 발명에 따른 신이 추출물은 RAW264.7 세포를 96-well 기준으로 2 Х 105cells/mL로 seeding 하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 안정화하였다. 신이 추출물을 100, 200, 400 μg/mL 농도로 처리하고, 24시간 동안 배양한 후 MTT solution을 이용하여 세포생존력을 측정하였다. Formazan 생성물은 DMSO로 용해하였다. Spectrophotometer를 이용하여 540 nm에 흡수되는 양을 측정하였다. 세포의 생존율은 어떠한 처리도 가하지 않은 세포와의 비율로 나타내었다.
신이 추출물의 세포 생존율을 측정한 결과, 독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 2).
실험예 4. 염증 유도된 세포에서 신이 추출물이 iNOS, COX-2 및 p-NF-κB 단백질 발현에 미치는 영향
iNOS, COX-2 및 p-NF-κB의 세포 내 발현은 Western blot을 이용하여 측정하였다. RAW264.7 세포를 6-well 기준으로 2 Х 105cells/mL로 seeding 하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 안정화하였다. 신이추출물 100, 200, 400 μg/mL 농도와 LPS 100 ng/mL로 24시간 동안 배양하여 염증을 유도하였다.
세포들을 ice-cold PBS로 두 번 세척하고, RIPA buffer (DYNE Bio, Seongnam, Korea)에서 리서스펜션하였다. 단백질 농도는 BCA protein assay kit (Thermo, Waltham, USA)를 이용하여 결정되었다.
단백질은 10% sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis로 분리되었고, 분리된 단백질은 전기영동으로 PVDF membrane으로 이동시켰다. 각 멤브레인은 18시간 primary antibody (4℃), 1시간 secondary antibody (RT) 조건에서 인큐베이션 되었다. 단백질 밴드는 chemiluminescent reagents를 이용하여 가시화했다. 밀도는 image J program을 이용하여 측정하였다.
측정결과 iNOS, COX-2, 및 p-NF-κB 단백질 발현은 대조군에 비하여 감소하였다. 따라서 신이추출물은 염증 관련 단백질 발현을 억제함으로써, 항염증 효능을 확인하였다(도 4).
실험예 5. 염증반응을 유도한 동물의 혈청에서 염증성 사이토카인 분비량 확인
RAW264.7 세포에서 추출물들의 실험 결과를 바탕으로 신이 추출물을 이용하여 LPS로 염증을 유발한 동물 모델에서 항염증 효과를 확인하였다.
실험의 protocol은 mouse에 LPS를 주입한 후 실험 동물의 혈장에서 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성을 분석하였다.
8주령의 mouse 12마리를 ㈜오리엔트바이오로부터 분양받아 온도 23±1℃, 습도 50±5%, 조도 150-300 lux 환경에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 사육 기간 동안 일반 고형 사료와 물은 제한없이 공급하였고, 동물 실험 전과 후에 실험 동물의 체중을 측정하였다.
실험 동물은 군당 3마리씩 정상 대조군 (PBS 군), LPS 투여군, 실험군으로 분류하여 실험하였다. 정상 대조군과 LPS 투여군에는 멸균한 PBS를 각각 100 μL/mouse 투여아였고, 시험군에는 신이 추출물을 각각 체중 kg 당 50, 100 mg의 농도로 PBS에 녹여 100 μL/mouse 씩 7일 간 경구 투여하였다.
경구 투여 후 12 시간 절식시킨 실험 동물에 정상대조군에는 PBS를, LPS 군과 실험군에는 LPS를 체중 kg 당 5mg 농도로 복강 주사한 8시간 후에 희생하였다.
실험동물의 하대정맥으로부터 채혈한 혈액은 4℃, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청은 -70℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
LPS 유도된 쥐의 경우, IL-1β, TNF-α, IL-6의 함량이 급격하게 증가한 반면에, 신이 추출물 투여군에서는 LPS 유도군에 비하여 IL-1β, TNF-α, IL-6의 생성이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다(도 6).
이를 통해, 신이 추출물이 항염증 효과가 우수함을 보여준다.
Claims (11)
- 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 신이 추출물은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 신이 추출물은 NO(nitric oxide)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 신이 추출물은 염증 관련 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 염증 관련 단백질은 iNOS, COX-2, 및 p-NF-κB로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 신이 추출물은 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 염증성 사이토카인은 IL-1β, TNF-α, 및 IL-6으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 염증 질환은 염증성 장질환, 사구체신염, 염증성 피부질환, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 신이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물.
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