KR20230065784A - 헬리시움 에리나세우스(Hericium erinaceus) 유래의 단백질분해효소 칵테일 및 이의 활용 - Google Patents

헬리시움 에리나세우스(Hericium erinaceus) 유래의 단백질분해효소 칵테일 및 이의 활용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 노루궁뎅이 버섯(헬리시움 에리나세우스, Hericium erinaceus) 배양 후 남는 폐배지로부터 유래한 단백질분해효소 칵테일 및 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 식용 가능한 버섯 유래의 효소를 이용한 단백질분해효소 칵테일로, 인체에 무해한 단백질로서, 폴리펩타이드 형태의 동물 혈액, 유제품, 단백질 등의 다양한 단백질 유래의 기질을 가수분해하여 유리 필수 아미노산과 저분자 펩타이드 등을 조제하는데 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

Description

헬리시움 에리나세우스(Hericium erinaceus) 유래의 단백질분해효소 칵테일 및 이의 활용 {Protease cocktail derived from Hericium erinaceus, and their application}
본 발명은 노루궁뎅이 버섯(헬리시움 에리나세우스, Hericium erinaceus) 배양 후 남는 폐배지로부터 유래한 단백질분해효소 칵테일 및 제조방법에 관한 것이다.
노루궁뎅이버섯(헬리시움 에리나세우스, Hericium erinaceus)는 오래 전부터 쓴맛이 강해 식용보다는 약용으로 사용된 버섯으로 항암효과, 소화기 질환에 좋고, 최근에 치매예방과 당뇨병 개선에 좋다는 연구결과로 다양한 식용 방법이 개발되고 있다. 특히 낮은 칼로리와 풍부한 수분이 포만감을 주면서 다이어트 식품으로 각광받고 있다.
식품 가공 공정에서 단백질 소재의 가수분해를 통한 아미노산 또는 펩타이드의 저분자화는 산처리를 통한 화학적 가수분해를 일반적으로 사용하고 있으나, 산처리에서 유해가스의 발생, 산용액의 안전성, 단백질의 변성으로 인한 물성변화 등으로 인해 최근에는 환경친화적 공정으로 단백질분해효소를 사용한 효소가공 방법으로 전환하는 추세에 있다.
특히, 단백질분해효소는 단백질 성분으로 구성된 식품 소재의 전처리, 가공, 물성, 품질 개량, 미생물 발효 효율 증대를 위한 전처리 등 다양한 목적과 공정에 사용된다. 식품소재의 단백질 성분의 경우 20개 아미노산의 펩타이드 결합 이외에도 탄수화물 또는 지방산 등의 다른 생체 고분자와 결합되어 있어, 단일 펩타이드 결합을 가수분해하는 단일 효소가 아닌 다양한 펩타이드 결합을 분해할 수 있는 효소의 활성이 요구되기 때문에, 다양한 단백질효소가 함께 들어있는 칵테일 형태의 효소가 필요하다. 이러한 문제로 인하여, 균체 자체에서 생산된 효소를 사용하기 위해 미생물 균체 자체를 이용하거나, 여러 개의 개별 효소를 혼합하는 칵테일 형태로 단백질분해효소가 사용되고 있다.
또한, 식품소재의 가공 공정에 단백질분해효소를 사용하기 위해서는 식품첨가안전물질 승인인 Generally recognized as safe (GRAS) 기준에 부합하는 효소가 필요하다. 비록 많은 미생물이 단백질분해효소를 생산하지만, GRAS 기준에 부합하는 세균인 고초균(Bacillus subtilis)나 곰팡이인 황국균(Aspergillus oryzae) 등 만이 제한적으로 식품공정에 사용되고 있다.
균류에 속하는 버섯은 다양한 단백질분해효소를 생산하는 미생물 종으로 알려져 있으며, 특히 식용 버섯의 경우 오랫동안 식재료로 사용되어 버섯유래의 단백질 및 대사산물의 안전성이 검증되었을 뿐 아니라, 이미 재배 가능한 식용 버섯의 경우 인공재배 기술이 기확립되어 버섯균체를 대량 획득이 가능하다. (J. Mushrooms 2019 December, 17(4):235-240)
더욱이 최근 목재 톱밥 및 농업 바이오매스 부산물을 이용한 병 또는 봉지재배를 통한 식용버섯 재배 기술은 버섯 수확 후 남게 되는 폐배지를 용이하게 회수하여 사용할 수 있다. 수확 후 남게 되는 폐배지는 버섯의 균사가 자실체로 성장하면서 목재의 분해 및 균사의 성장시 세포 외로 분비하는 단백질과 효소군들을 포함하고 있는데, 현재까지 폐배지 내에 존재하는 효소군의 탐색, 회수 방법, 효소군의 활용 등은 보고되어 있지 않다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 노루궁뎅이버섯(헬리시움 에리나세우스, Hericium erinaceus) 배양 후 남는 폐배지로부터 조단백질을 획득 및 확인하였고, 주효소가 아스파틱 프로테아제(aspartic protease)인 단백질분해효소 칵테일을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 헬리시움 에리나세우스(Hericium erinaceus) 배양물을 포함하는, 단백질분해효소 칵테일을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 헬리시움 에리나세우스를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 단백질분해효소 칵테일의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 8 내지 40 중 하나의 아미노산 서열로 표시되는 단백질 분해효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 단백질분해효소를 생산하는 재조합 대장균(Escherichia coli)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 단백질분해효소 칵테일을 기질과 반응시키는 단계를 포함하는, 단백질 분해방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 따른 하나의 목적은 상기 단백질 분해효소 칵테일을 포함하는 효소제제를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 헬리시움 에리나세우스(Hericium erinaceus) 배양물을 포함하는, 단백질분해효소 칵테일을 제공한다.
본 발명의 "헬리시움 에리나세우스(Hericium erinaceus)"는 "노루궁뎅이 버섯"으로도 불리는 진균류의 일종을 의미한다.
본 발명의 "배양물"은 상기 헬리시움 에리나세우스를 배지에서 배양하여 수득한 산물을 의미한다. 그 예로 본 발명의 배양물은 헬리시움 에리나세우스의 배양배지에서 헬리시움 에리나세우스를 수확한 후 남은 배지에 잔존한 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "단백질분해효소(Protease)"는 단백질을 가수분해하는 효소를 통틀어 이르는 말로, 고분자 폴리펩타이드를 가수분해하여 올리고머 형태의 펩타이드나 아미노산으로 전환하는 가수분해 효소이다. 상기 단백질분해효소는 펩타이드를 구성하는 아미노산 간의 펩타이드 결합의 절단 부위에 따라 아스파틱(aspartic). 세린(serine), 시스테인(cysteine), 메티오닌(methionine), 루이신(leucine) 단백질분해효소, 가수분해 시 인지하는 펩타이드의 길이에 따라 디펩티딜(dipeptidyl-), 트리펩티딜(tripeptidyl-) 펩티데이즈(peptidase), 또는 전통적으로 불리던 이름에 따라 펩신(pepsin), 트립신(trypsin), 아오신(aorsin), 아미노펩티데이즈(aminopeptidase) 등으로 분류될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "효소 칵테일(enzyme cocktail)"이란 서로 다른 효소의 조합 혹은 혼합물을 의미한다.
본 발명의 "단백질분해효소 칵테일"은 카복시펩티다아제 Y(Carboxypeptidase Y), 류신 아미노펩티다아제(Leucine aminopeptidase), 아스파틱 프로테아제(Aspartic protease), 세린 카복시펩티다아제(Serine carboxypeptidase), 트리펩타이딜-펩티다아제 Sed2(Tripeptidyl-peptidase Sed2), 펩신 A(Pepsin A), 아스파티 타입 엔도펩티다아제(Aspartic type endopeptidase), 아오신(Aorsin), 메타이오닌 아미노펩티다아제(Methionine aminopeptidase), 카복실펩티다제 S1(Carboxypeptidase S1), 세포외 세린 카복실펩티다제(Extracellular serine carboxypeptidase), 마이너 세포외 프로테아제 vpr(Minor extracellular protease vpr) 및 큐티클-디그래딩 프로테아제(Cuticle-degrading protease) 등 중 1이상을 포함하거나, 상기 효소의 조합으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 큐티클-디그래딩 프로테아제는 서열번호 8로, 카복시펩티다아제 Y는 서열번호 9, 10 또는 34로, 류신 아미노펩티다아제는 서열번호 12로, 아스파틱 프로테아제는 서열번호 11, 13, 15, 16 또는 35로, 세린 카복시펩티다아제는 서열번호 14, 24, 36 또는 37로, 트리펩타이딜-펩티다아제 Sed2는 서열번호 17, 21, 22, 29, 30, 39 또는 40으로, 펩신 A는 서열번호 18, 19, 23 또는 38로, 아스파티 타입 엔도펩티다아제는 서열번호 20으로, 카복실펩티다제 S1는 서열번호 25로, 아오신은 서열번호 26으로, 메타이오닌 아미노펩티다아제는 서열번호 27로, 세포외 세린 카복실펩티다제는 서열번호 28 또는 31으로, 마이너 세포외 프로테아제 vpr은 서열번호 32 또는 33 로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
일 예로 본 발명의 단백질분해효소 칵테일은 서열번호 8 내지 40으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들과 60%이상 상동성 또는 동일성을 가지고 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드 중 1이상을 포함하거나, 상기 폴리펩티드의 조합으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로 본 발명의 서열번호 8 내지 40의 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열은 본 발명의 서열번호 8 내지 40의 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 97.5% 이상, 97.7% 이상, 97.8% 이상, 98% 이상, 98.5% 이상, 98.7% 이상, 98.8% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 100% 의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 아미노산 서열에 상응하는 효능을 나타내는 폴리펩티드라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 폴리펩티드도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명의 용어 "주효소(abundant enzyme)"는 효소 칵테일의 주요성분(main component)이 되는 효소를 지칭한다.
본 발명에서 칵테일의 주효소는 아스파틱 프로테아제(aspartic protease)일 수 있으며, 상기 아스파틱 프로테아제는 서열번호 11로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
본 발명에서 주효소의 세포 내 위치를 기준으로 배큐럴 프로테아제 A(Vacuolar protease A)라고 지칭할 수 있으며, 단백질의 활성 잔기를 기준으로는 아스파틱 프로테아제(aspartic protease)라고 지칭할 수 있다. 즉, 본 발명의 주효소는 배큐럴 프로테아제 A일 수 있다.
또한, 상기 아스파틱 프로테아제는 서열번호 11와 60% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일 예로 본 발명의 서열번호 11의 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열은 본 발명의 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 97.5% 이상, 97.7% 이상, 97.8% 이상, 98% 이상, 98.5% 이상, 98.7% 이상, 98.8% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 100% 의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 아미노산 서열에 상응하는 효능을 나타내는 폴리펩티드라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 폴리펩티드도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 그 예로 서열번호 11와 동일한 활성을 가지고 대장균에서 발현을 위해 일부 서열이 변형된 서열번호 7의 폴리펩티드도 본 발명의 아스파틱 프로테아제 범위에 포함된다.
본 발명의 용어 "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 단백질분해효소 칵테일은 20-50℃, pH 3.0-7.0에서 최적 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는, 효소의 기질로서 아조카제인(Azocasein)을 반응 후 원심분리하였으며, 상등액을 분광광도계에서 흡광도를 측정하였다. 측정결과 재조합 단백질분해효소는 최적 온도 20-50℃(도 3a)와 최적 pH 3.0-7.0 (도 3b)가장 높은 활성을 확인하였다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 분해효소 칵테일을 포함하는 단백질 분해용 조성물을 제공한다.
본 발명의 단백질 분해용 조성물에 포함될 수 있는 성분은, 헬리시움 에리나세우스를 배양하여 수득한 단백질분해효소를 포함하기만 하면 통상의 단백질 분해용 조성물에 포함될 수 있는 성분도 제한없이 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태로 헬리시움 에리나세우스를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 단백질분해효소 칵테일의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "배지"는 균, 세포 또는 식물체 배양에 필요한 영양소를 충분히 주고 적당한 삼투압, pH를 맞추어 준 것을 의미하며, 버섯 배지로서 감자한천배지(PDA), 퇴비출배지, 참나무톱밥추출배지, HBA배지(벌꿀바나나배지, 꽃송이버섯배지), 버섯완전배지(MCM), 버섯최소배지(MMM), 영지완전배지(GCM), YM배지, 맥아배지, 차펙스배지, Hanmada배지(송이배지), MMN배지, 물한천배지, YPSA(왕송이배지)등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 일 예로 고상 배지(고체상태의 배지)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서는, 헬리시움 에리나세우스를 바이오매스의 톱밥에 질소원과 무기원소를 공급하여 봉지 또는 병 형태로 배양 후, 버섯 수확 남게 되는 배지에서 단백질을 회수 하였다.
본 발명의 용어 "배양"이란 생물체(미생물 및 발생중인 동식물의 배 등)나 생물체의 일부(기관 ·조직 ·세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.
본 발명의 용어 "조단백질(Crude protein)"은 순 단백질과 아마이드가 들어 있는 물질을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서는, 고상 폐배지에 PBS를 첨가하여 배지에 포함되어 있는 단백질을 원심분리를 통해 고상과 액상을 분리하였으며, 상기 액상로부터 MWCO(Molecular Weight Cut Off) 3-100 kDa의 공극을 갖는 멤브레인으로 농축 및 한외여과를 하여 액상 상태의 조단백질 용액을 제작하거나, 액상을 액체질소를 사용하여 급속 냉동시킨 후 동결시료를 동결건조하여 고상 분말 상태의 조단백질을 제작하였다.
상기 "단백질분해효소", "단백질분해효소 칵테일", "주효소"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 8 내지 40의 아미노산 서열로 표시되는 단백질 분해효소를 제공한다.
구체적으로 본 발명은 다음 표에 개시된 단백질 분해효소를 제공한다.
서열번호 Identified protein
8 Cuticle-degrading protease
9 Carboxypeptidase Y
10 Carboxypeptidase Y
11 Aspartic protease
12 Leucine aminopeptidase
13 Aspartic protease
14 Serine carboxypeptidase
15 Aspartic protease
16 Aspartic protease
17 Tripeptidyl-peptidase Sed2
18 Pepsin A
19 Pepsin A
20 Aspartic type endopeptidase
21 Tripeptidyl-peptidase Sed2
22 Tripeptidyl-peptidase Sed2
23 Pepsin A
24 Serine carboxypeptidase
25 Carboxypeptidase S1
26 Aorsin
27 Methionine aminopeptidase
28 Extracellular serine carboxypeptidase
29 Tripeptidyl-peptidase Sed2
30 Tripeptidyl-peptidase Sed2
31 Extracellular serine carboxypeptidase
32 Minor extracellular protease vpr
33 Minor extracellular protease vpr
34 Carboxypeptidase Y
35 Aspartic protease
36 Serine carboxypeptidase
37 Serine carboxypeptidase
38 Pepsin A
39 Tripeptidyl-peptidase Sed2
40 Tripeptidyl-peptidase Sed2
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 단백질분해효소를 생산하는 재조합 미생물을 제공한다. 그 예로 상기 미생물은 대장균일 수 있다.
본 발명의 "대장균(Escherichia coli)"은 예를 들어, DH5α, HST08, HST04 dam－/dcm－, HB101, JM109, DH5α, CJ236, BMH71-18 mutS, MV1184, TH2, HST02, Top10, XL1-Blue, XL10-Gold 등을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 제공하는 효소를 생산할 수 있는 미생물은 제한 없이 포함된다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 단백질분해효소 칵테일을 기질과 반응시키는 단계를 포함하는, 단백질 분해방법을 제공한다.
상기 기질은 본 발명의 단백질분해효소 칵테일에 의해 분해될 수 있는 성분을 모두 포함한다. 그 예로 카제인(casein), 아조카제인(Azocasein), 실크단백질 또는 전혈을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공하는 단백질분해효소 칵테일을 이용한 단백질 분해 방법은 유리 아미노산, 저분자 펩타이드 등의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 동물 전혈과 실크단백질을 분해하여 필수 아미노산을 생산하였다.
또 다른 하나의 양태는 단백질 분해효소 칵테일을 포함하는 효소제제를 제공한다.
본 발명의 "효소제제"는 세제용, 섬유처리용, 단백질성 물질, 울, 피혁, 털(hair) 또는 실크처리용, 식품 또는 사료 처리용 또는 단백질성 물질의 변성, 분해 또는 제거와 관련된 용도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "단백질분해효소", "단백질분해효소 칵테일"은 전술한 바와 같다.
본 발명은 식용 가능한 버섯 유래의 효소를 이용한 단백질분해효소 칵테일로, 인체에 무해한 단백질로서, 폴리펩타이드 형태의 동물 혈액, 유제품, 단백질 등의 다양한 단백질 유래의 기질을 가수분해하여 유리 필수 아미노산과 저분자 펩타이드 등을 조제하는데 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
도 1은 버섯 폐배지에서 회수된 조단백질에서 부분정제된 단백질분해효소의 Tricine-PAGE로 분석한 결과이다. (Lane 1, 조단백질; lane 2, ConA column에서 회수된 단백질 분획; lane 3, 부분 정제된 단백질분해효소)
도 2는 대장균에서 분리 정제된 재조합 단백질분해효소를 Tricine-PAGE로 분석한 결과이다.
도 3은 재조합 단백질분해효소의 아조카제인 기질에 대한 최적온도(a)와 최적 pH(b)에서의 활성을 분석한 결과이다.
도 4는 버섯 폐배지에서 부분 정제된 분획에서 단백질분해효소의 활성을 포함한 분획(a)과 분리 정제된 단백질(b)에서 카제인의 응집 효능을 분석한 결과이다.
도 5는 단백질분해효소 칵테일을 사용하여 동물(소(Bovine), 돼지(porcine), 토끼(Rabbit)) 전혈의 효소 가수분해 후, 수득한 주된 유리 아미노산의 농도를 HPLC로 분석하여 정량 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 단백질분해효소 칵테일과 상업적 효소인 노보자임(Novozyme) 단백질분해효소 칵테일을 사용하여, 동일 조건에서 돼지 혈액을 효소 가수분해 후, 주된 유리 아미노산의 상대적 함량 차이를 비교한 결과이다.
도 7은 실크단백질(누에고치)을 본 발명의 단백질분해효소 칵테일을 통해 가수분해 시킨 후, 주된 유리 아미노산의 상대적 함량(a)과 질량분석기로 측정한 펩타이드의 분포(b)를 분석한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 갖는 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 헬리시움 에리나세우스 고상 폐배지로부터 단백질 성분 회수
본 발명에서는 봉지, 병 형태로 배양되는 버섯 수확 후 남게 되는 폐배지를 이용하였다. PBS를 고상과 액상비 1:2로 하여 단백질을 음파처리 또는 볼텍스를 하여 단백질을 회수하고, 원심분리를 통해 액상을 회수하여 0.45um 멤브레인 필터 또는 다공성 컬럼을 통해 목질 또는 버섯 입자성분을 제거하였다.
그 후, 상기 액상을 MWCO(Molecular Weight Cut Off) 3-100 kDa의 공극을 갖는 멤브레인으로 농축하고, 한외여과를 하여 액상 상태의 조단백질 용액 또는 액상을 액체질소를 사용하여 급속 냉동시킨 후 동결시료를 동결건조하여 고상 분말 상태의 조단백질을 제작하였다.
실시예 2. 회수된 조단백질에 포함된 단백질체의 분석
액상 상태의 농축 조단백질에 동일 부피 아세톤을 넣어 원심분리를 통해 침전물을 회수하였고, 다시 PBS로 단백질을 용해 시킨 후, 원심분리를 통해 상등액을 회수하였다. PD10 de-salting column (GE healthcare)을 통해 잔류 염을 제거한 후 MWCO 3-100 kDa 멤브레인으로 1 mg/ml 이상의 농도로 농축하고, 트립신 및 PNGase F 또는 EndoH 처리하였다. 염을 제거한 후 컬럼으로부터 탈착시켰고, 회수된 펩타이드는 감압건조를 통해 최종적으로 건조된 상태의 펩타이드를 질량분석기를 통한 단백질 확인에 사용하였다.
배지 성분에 따라 대조군으로 사용한 PDB(Potato dextrose broth)와 실험군으로 사용한 배지 중에서 탄소원으로 사용되는 바이오매스인 목재톱밥(wood sawdust), 팜열매껍질 섬유질(empty palm brunch fiber, EFB) 돼지감자 지상부(Jerusalem artichoke stem, JA), 옥수수대(Corn stove)를 사용한 각각의 고상 배지에서 추출된 조단백질에서 86개, 106개, 151개, 435개, 252개의 단백질이 확인되었다.
단백질 분해효소는 카복시펩티다아제 Y(Carboxypeptidase Y), 류신 아미노펩티다아제(Leucine aminopeptidase), 아스파틱 프로테아제(Aspartic protease), 세린 카복시펩티다아제(Serine carboxypeptidase), 트리펩타이딜-펩티다아제 Sed2(Tripeptidyl-peptidase Sed2), 펩신 A(Pepsin A), 아스파티 타입 엔도펩티다아제(Aspartic type endopeptidase), 아오신(Aorsin), 메타이오닌 아미노펩티다아제(Methionine aminopeptidase), 카복실펩티다제 S1(Carboxypeptidase S1), 세포외 세린 카복실펩티다제(Extracellular serine carboxypeptidase), 마이너 세포외 프로테아제 vpr(Minor extracellular protease vpr) 및 큐티클-디그래딩 프로테아제(Cuticle-degrading protease) 등으로 확인되었으며, 각각의 단백질분해효소는 탄소원으로 사용되는 배지 성분에 따라 각각 다르게 검출되었다(표 2).
서열 번호 Protein ID Identified protein MW
(kDa) 		Biomass
Wood
sawdust		 JA Corn stove EFB PDA
8 000600-RA Cuticle-degrading protease 35.7 V V V V V
9 001339-RA Carboxypeptidase Y 46.4 V V
10 001344-RA Carboxypeptidase Y 56.1 V V
11 001723-RA Aspartic protease 44.5 V V V V
12 001954-RA Leucine aminopeptidase 35.9 V V
13 001967-RA Aspartic protease 41.8 V V V V V
14 002326-RA Serine carboxypeptidase 55.3 V V
15 003824-RA Aspartic protease 43.5 V V V V
16 004698-RA Aspartic protease 59.5 V
17 006125-RE Tripeptidyl-peptidase Sed2 85.1 V V V
18 007300-RA Pepsin A 61.8 V
19 007322-RA Pepsin A 16.8 V V
20 008486-RA Aspartic type endopeptidase 62.3 V V
21 008507-RA Tripeptidyl-peptidase Sed2 62.3 V V
22 008529-RA Tripeptidyl-peptidase Sed2 29.4 V V
23 008677-RA Pepsin A 57.4 V V
24 009259-RA Serine carboxypeptidase 53.8 V V V V
25 009664-RA Carboxypeptidase S1 52.2 V V V
26 010789-RC Aorsin 65.8 V
27 010989-RA Methionine aminopeptidase 46.6 V
28 011134-RD Extracellular serine carboxypeptidase 59.9 V V
29 011703-RA Tripeptidyl-peptidase Sed2 59.9 V V V
30 011710-RA Tripeptidyl-peptidase Sed2 70.8 V V V
31 011734-RA Extracellular serine carboxypeptidase 59.7 V V V V
32 012108-RA Minor extracellular protease vpr 44.4 V V
33 013375-RB Minor extracellular protease vpr 46.2 V V
34 014509-RA Carboxypeptidase Y 52.1 V V
35 014979-RA Aspartic protease 43.3 V V
36 015422-RA Serine carboxypeptidase 54.5 V V V V
37 015881-RA Serine carboxypeptidase 69.4 V V
38 016864-RA Pepsin A 46.5 V V V
39 017227-RA Tripeptidyl-peptidase Sed2 58.2 V V
40 018452-RA Tripeptidyl-peptidase Sed2 79.8 V V
실시예 3. 버섯 폐배지에서 회수한 조단백질에서 주효소 확인
실시예 3-1. 버섯 폐배지에서 회수한 조단백질에서 주효소의 분리 정제
폐배지에서 회수된 조단백질을 Concanavalin A(ConA)가 고정화된 칼럼(1.0 x 10cm)에 Pump P-1 튜브연동식 펌프(Peristatic pump, GE-healthcare, USA)를 이용하여 주입하고, 세척 후 0.25 M 메틸-알파-만노사이드(methyl-alpha-mannoside)로 용출시켰으며, 분획을 다시 이온교환수지 칼럼 HiTrap Q FF에 주입 후 단백질을 1 M NaCl 농도 구배를 통해 단백질을 분리하였다.
다시 아미콘 울트라 센트리푸갈 필터(Amicon　Ultra Centrifugal filter 10K)을 이용하여 농축시킨 후, size exclusion column Superose 12 칼럼을 사용해 분리한 후, 효소의 활성을 나타내는 분획을 회수하여 농축하였다.
실시예 3-2. SDS-PAGE 분석을 통한 주효소 단백질 확인
SDS-PAGE를 이용하여Precision Plus ProteinTM Standards(Bio-Rad, USA) 단백질을 표준 단백질로 사용하여 정제된 단백질의 순도 및 크기를 분석하였다. 주효소 단백질은 약 50 kDa로 확인되었다. (도 1)
실시예 3-3. 주효소의 N-말단 서열 분석
실시예 3-1을 통하여 분리된 주효소를 SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 전개한 후, PVDF 멤브레인으로 이동시켰다. 염색 후 멤브레인을 분석하였으며, 단백질의 N-말단서열 분석을 수행하여, 실시예 3-2의 50kDa 단백질은 서열번호 1의 N-말단 단백질 서열을 갖는 것을 확인하였다.
실시예 3-4. 주효소의 클로닝을 통한 염기서열 확인
N-말단 서열을 기초로 하여 degenerated primer(서열번호 2, 서열번호 3)을 제작하여 헬리시움 에리나세우스의 cDNA으로부터 RACE Kit방법을 통해 유전자를 확보하였다.
주효소 단백질을 PCR로 증폭하고 이를 분리 정제 후, 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. DNA 시퀀싱, 유전자 어셈블링을 통해 유전자서열을 확인하였다.
그 결과 주효소 단백질을 코딩하는 cDNA는 1,245 bp의 Open Reading frame (ORF)을 갖는 서열번호 4와 cDNA로부터 번역되는 아미노산 서열번호 11의 아스파틱 프로테아제로 확인되었다.
동일한 방법으로 시퀀싱을 통해 표 2의 카복시펩티다아제 Y, 류신 아미노펩티다아제 아스파틱 프로테아제, 세린 카복시펩티다아제, 트리펩타이딜-펩티다아제 Sed2, 펩신 A, 아스파티 타입 엔도펩티다아제, 아오신, 메타이오닌 아미노펩티다아제, 세린 카복시펩티다아제 또는 큐티클-디그래딩 프로테아제 서열을 확인하였다.
상기 서열번호 11의 아스파틱 프로테아제는 액포(Vacuolar)에 존재는 프로테아제(Vacuolar protease A)임을 확인하였다.
이하 실시예 4에서는 주효소인 아스파틱 프로테아제를 발현하는 재조합 균주를 제작하였다.
실시예 4. 아스파틱 프로테아제의 생산
실시예 4-1. 아스파틱 프로테아제의 생산을 위한 클로닝 및 형질전환 균주의 제작
서열번호 5를 주형으로 하여, 프라이머(서열번호 41, 42)을 이용하여 PCR을 수행하였고, 증폭된 DNA를 정제 후 pET28-10xHis 클로닝 벡터와 접합시킨 후, 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. (형질전환된 대장균 내에서 생산되는 재조합 단백질분해효소: 서열번호 6, 7)
최종 재조합 플라스미드는 pET-10xHis-rASP로 명명하였고, 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에 형질전환시켰다.
실시예 4-2. 대장균에서 재조합 단백질분해 효소의 정제
재조합 대장균 균주 배양(TB, 18℃, 24시간 전배양, TB, 12℃, 600nm에서 흡광도가 1.0 내지 1.5이 될 때까지 본배양, IPTG 첨가 후 12℃, 12시간 추가 배양)후 원심분리하여 세포를 수득하였다. HisTrapTM FF칼럼 크로마토그래피를 이용하여 재조합 단백질분해효소를 분리하였다. 순도를 높이기 위하여 Superose 12 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 재조합 단백질분해효소를 분리하였다. 재조합 단백질을 확인하기 위하여 Tricine-PAGE 분석을 하였다. 대장균에서 분리 정제된 재조합 단백질분해효소의 단백질의 크기는 약 50 kDa으로 확인되었다. (도 2)
분리 정제한 아스파틱 프로테아제를 실시예 5에서 사용하였다.
실시예 5. 재조합 단백질분해효소의 생화학적 특성 분석
아조카제인(Azocasein)을 효소의 기질로 반응 후 원심분리하였고, 상등액을 분광광도계에서 흡광도를 측정하였다. 측정결과 재조합 단백질분해효소는 최적 온도 20-50℃(도 3a)와 최적 pH 3.0-7.0 (도 3b)가장 높은 활성을 확인하였다.
실시예 5-1. 카제인 단백질의 분해에 의한 응고 활성
카제인과 단백질분해효소를 반응시켰고, 단백질분해효소 활성을 갖는 경우 응고에 의해 침전물이 형상되었고(투명 상등액), 효소의 활성이 없는 경우 침전물 없이 불투명 상태로 유지되었다. (도 4a, b)
실시예 5-2. 동물혈액의 단백질분해효소의 분해 효능
소(Bovine), 돼지(Porcine), 토끼(Rabbit)의 전혈를 기질로 하여 단백질분해효소를 30℃에서 24시간 800rpm으로 반응 후, 원심분리를 통해 상등액을 회수하였다. 아미노산 칼럼 분석을 통해 처리 전과 후에 20개의 필수아미노산이 모두 검출되었으며, Glu, Arg, Gln, Leu, Ile 등의 특정 아미노산의 증가가 확인되어(도 5), 유리 아미노산 생산이 가능하다는 것을 보여준다.
또한 본 발명의 단백질분해효소 칵테일 및 상업적으로 이용되고 있는 노보자임(Novozyme) 단백질분해효소 칵테일과 돼지 전혈을 기질로 하여 동일한 반응 조건에서 반응 후, 주된 유리 아미노산을 함량을 비교 분석한 결과이다. (도 6)
본 발명의 단백질분해효소 칵테일의 경우 Leu>> Ile> Ala> Ser> Asp 순으로 유리아미노산이 검출되는 반면, 노보자임단백질 분해효소는 Leu>> Ala> Ser> Asp>> Ile 순으로 유리 아미노산이 검출되었으며, 특히 본 발명에서 Leu과 Ile과 같은 branched amino acid 생산이 월등히 뛰어남을 확인할 수 있었다. (도 6)
실시예 5-3. 실크단백질의 단백질분해효소의 분해 효능
실크단백질이 포함된 용액(10 mg/mL)에 단백질분해효소를 첨가하여 30℃에서 24시간 800rpm으로 반응 후, 원심분리를 통해 유리되는 아미노산(실시예 5-2 분석방법)과 펩타이드(LC-MS)를 분석하였다.
단백질분해효소 칵테일로 처리된 실크단백질은 Arg>> Leu> Asp>> Ala> Ser > Gly 아미노산이 주로 검출되었으며(도 7a), 가수분해된 펩타이드는 700 m/z 이하의 펩타이드가 주 성분(도 7b)으로 확인되었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해하여야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Protease cocktail derived from Hericium erinaceus, and their application <130> KPA211543-KR <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aspartic protease N-terminal <400> 1 Gly Gly His Ser Val Pro Leu Thr Asn Phe Met Asn Ala Gln Tyr Phe 1 5 10 15 Thr Glu Ile Ser Leu Gly Ser Pro Pro Gln Thr Phe Lys Val 20 25 30 <210> 2 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> degenerated primer_HAP-5F <400> 2 ggnggncayw sngtnccnyt nwynaaytty atgaaygcnc artayttywy ngarathwsn 60 ytnggn 66 <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> degenerated primer_HAP-5R <400> 3 ggnggncayw sngtnccnyt nwynaaytty atgaaygcnc artayttywy ngarathwsn 60 ytnggn 66 <210> 4 <211> 1245 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Open Reading frame <400> 4 atgatcctct cagccctcgc tcctttgttg ctcctcccct acgccgccaa tgcaggcgtc 60 cacaaactca agctgaagaa gatgccctcg gcggccagca 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tccattcagt acggatccgg ttctatggaa ggttttgttt ctagggatga tctcgtcatc 540 ggtgacttga aagtccctgg cattctgttc gccgaagcca ccaaggaacc tggtcttgcc 600 ttcgctttcg gcaagttcga tggtatctta ggcctgggtt acgatagcat tgcagtcaat 660 ggagtaccac ctccatttta tgagatgctc aaccacgggc tcttggatga gcccgtcttc 720 tctttccgtc ttggtccctc tgaggacgat ggcggtgagg ctgtctttgg aggtatcgac 780 accagtgcgt atactggcaa gatcgactat gctcccgtcc gccgcaaggc gtactgggaa 840 gtggagcttg agaaggtcaa gtttggcgat gatgttcttg agcttgagac caccggcgct 900 gctattgata ctggtacatc cttgattgcc ctgcctaccg atgttgcgga gatgctgaac 960 acccagatcg gtgccaagaa atcgtggaac ggccaataca ctgttgactg cgacaaggtt 1020 ccagacttgc ccgaccttat tttctacttc aatggcaaac cctaccccct gaagggtacc 1080 gactacatcc ttgaggtgca aggaacgtgc atgtcggcat tcactggtct tgacattaac 1140 cttcccggtg gctccctgtg gatcattggt gatgtgttcc ttcgtcgtta cttcacggtt 1200 tatgaccttg gtcgagatgc cgttggcttc gctaccgccg cctaa 1245 <210> 6 <211> 1026 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Protease <400> 6 atgggcggcc acagcgttcc tcttaccaac ttcatgaatg cccagtattt cactgagatc 60 agccttgggt ctcctccgca gactttcaaa gtcatccttg acactggact gcttgatagc 120 tcgagcaact tgtgggttcc aagcacgcag tgcacgtcaa tcgcctgctt cctccacacc 180 aagtatgatt cttcggcctc atccacctac aaggagaacg ggaccgagtt ctccattcag 240 tacggatccg gttctatgga aggttttgtt tccagagatg acctcgtcat cggtgacttg 300 aaagtccctg gcattctgtt cgccgaagcc accaaggaac ctggtcttgc cttcgctttc 360 ggcaagttcg atggtatcct aggcctgggt tacgatagca ttgcagtcaa tggagtacca 420 cctccatttt atgagatgct caaccacggg ctcttggatg agcccgtctt ctctttccgt 480 cttggtccct ctgaggacga tggcggtgag gctgtctttg gaggtatcga caccagtgcg 540 tatactggca agatcgacta tgctcccgtc cgccgcaagg cgtactggga agtggaactt 600 gagaaggtca agtttggcga tgatgttctt gagcttgaaa ccaccggtgc tgctattgat 660 actggtacat ccttgattgc cctgcctacc gatgttgcgg agatgctgaa cacccagatc 720 ggtgccaaga aatcgtggaa cggccaatac actgttgact gcgacaaggt tccagacttg 780 cccgacctta ttttctactt caatggcaag ccctaccccc tgaagggtac cgactacatc 840 cttgaggtgc aaggaacgtg catgtcggca ttcactggtc ttgacattaa ccttcccggt 900 ggctccctgt ggatcattgg tgatgtgttc cttcgtcgtt acttcacggt ttatgacctt 960 ggtcgagatg ccgttggctt cgctaccgcc gcccatcacc atcaccatca ccatcaccat 1020 cactaa 1026 <210> 7 <211> 341 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Protease <400> 7 Met Gly Gly His Ser Val Pro Leu Thr Asn Phe Met Asn Ala Gln Tyr 1 5 10 15 Phe Thr Glu Ile Ser Leu Gly Ser Pro Pro Gln Thr Phe Lys Val Ile 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Leu Leu Asp Ser Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro Ser 35 40 45 Thr Gln Cys Thr Ser Ile Ala Cys Phe Leu His Thr Lys Tyr Asp Ser 50 55 60 Ser Ala Ser Ser Thr Tyr Lys Glu Asn Gly Thr Glu Phe Ser Ile Gln 65 70 75 80 Tyr Gly Ser Gly Ser Met Glu Gly Phe Val Ser Arg Asp Asp Leu Val 85 90 95 Ile Gly Asp Leu Lys Val Pro Gly Ile Leu Phe Ala Glu Ala Thr Lys 100 105 110 Glu Pro Gly Leu Ala Phe Ala Phe Gly Lys Phe Asp Gly Ile Leu Gly 115 120 125 Leu Gly Tyr Asp Ser Ile Ala Val Asn Gly Val Pro Pro Pro Phe Tyr 130 135 140 Glu Met Leu Asn His Gly Leu Leu 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<400> 38 Met Leu Tyr Ser Leu Leu Pro Leu Leu Phe Leu Ser Ser Ala Val Ser 1 5 10 15 Ala Ala Ser Pro Gln Thr Leu Lys Leu Thr Ala Arg Arg Gly Ser Phe 20 25 30 Val Arg His Val Arg Arg Ala Ser Pro Ile Ser Glu Pro Leu Leu Asp 35 40 45 Gln Phe Asn Gly Thr Asp Leu Gln Trp Phe Gly Asn Ile Ser Phe Gly 50 55 60 Thr Pro Pro Gln Thr Phe Gly Val Val Phe Asp Thr Gly Ser Phe Asp 65 70 75 80 Ser Glu Val Pro Gly Ile Gln Cys Gly Ala Glu Cys Ala Asn Gln Asn 85 90 95 Lys Phe Asp Phe Thr Lys Ser Ser Thr Phe Val Ser Leu Asn Lys Thr 100 105 110 Gly Glu Leu Asp Phe Ala Thr Gly Gly Gly Val Glu Pro Ser Asp Phe 115 120 125 Glu Ser Leu Gln Val Leu Glu Val Asn Asp Thr Met Thr Leu Leu Gly 130 135 140 Ile Ala Thr Pro Asn Thr Thr Phe Phe Leu Ile Thr Asn Gln Thr Ala 145 150 155 160 Gly Phe Phe Asn Asp Pro Tyr Asp Gly Ile Val Gly Met Gly Phe Gln 165 170 175 Pro Asn Gly Gly Ile Phe Pro Ser Leu Arg Gln Ala Gly Leu Pro Ala 180 185 190 Ile Phe Ser Met Phe Leu Thr Pro His Thr Val Gly Asp Ala Glu Leu 195 200 205 Thr Ile Gly 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Thr Ser Glu Glu Val Asp Gly Tyr Lys Thr Ser Lys Phe 420 425 430 <210> 39 <211> 564 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tripeptidyl-peptidase Sed2 <400> 39 Met Lys Ile Cys Phe Val Ile Thr Ala Leu Gly Ala Leu Ala Ser Ala 1 5 10 15 Leu Thr Leu Pro Tyr Pro Gln Ala Ala Arg Thr Glu Met His Val Arg 20 25 30 His Arg Arg Asp Ala Pro Pro Ser Gly Tyr Val Lys Ala Gly Ala Ala 35 40 45 Pro Asn Asn His Leu Leu Glu Leu His Leu Ser Leu Ala Gln Ser Asn 50 55 60 Phe Ala Glu Leu Glu Gln Arg Leu Leu Ala Ala Ser Thr Pro Gly Asn 65 70 75 80 Ala Ala Tyr Gly Gln Tyr Leu Ser Lys Glu Glu Val Ala Gly Leu Val 85 90 95 Ala Pro Ser Asn Asp Thr Leu Ser Ala Leu Asn Ala Trp Leu Ala Ser 100 105 110 His Asn Leu Thr Ser Thr Ala Leu Ser Pro Ala Gly Asp Leu His Val 115 120 125 Leu Arg Leu Thr Val Lys Gln Ala Asn Thr Leu Leu Asp Ala Asp Tyr 130 135 140 Ala Thr Tyr Thr Asp Gln Thr Thr Gly Thr Gln Thr Val Arg Thr Leu 145 150 155 160 Ser Tyr Ser Leu Pro Ala Gly Leu Gln His His Val His Ser Val Trp 165 170 175 Pro Thr Thr Gln Phe Ala Pro Ala Leu Ala Ser Leu Val Lys Pro Phe 180 185 190 Ser Val Ser Thr Thr Gly Leu Arg Ala Arg Ala Asn Ala Ser Cys Asp 195 200 205 Asp Thr Phe Thr Val Ser Cys Ala Ile Asp Leu Tyr Gly Ile Pro Thr 210 215 220 Asn Ile Pro Ala Gln Thr Ala Ser Gln Leu Gly Val Ala Gly Phe Thr 225 230 235 240 Gly Gln Ser Ala Asn Tyr Ala Asp Leu Lys Ser Phe Leu Asp Thr Tyr 245 250 255 Arg Pro Asp Val Pro Asp Ser Thr Asn Phe Thr Val Gln Leu Val Asp 260 265 270 Gly Ala Asn Asn Asn Gln Ser Asp Pro Gly Val Glu Ala Asn Leu Asp 275 280 285 Ile Glu Thr Thr Val Gly Ile Thr Ala Pro Thr Val Pro Ile Thr Phe 290 295 300 Ile Asp Val Gly Thr Ser Asp Ser Thr Phe Phe Asp Gln Leu Pro Leu 305 310 315 320 Leu Ala Ser Ala Leu Leu Asn Ala Ser Ser Pro Pro Asp Val Val Thr 325 330 335 Met Ser Tyr Ser Leu Pro Glu Ser Phe Ile Asp Ala Ala Thr Ala Thr 340 345 350 Ser Ile Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Val Ala Ala Arg Gly Ile Ala Val 355 360 365 Leu Val Ser Ser Gly Asp Tyr Gly Val Ser Gly Gly Glu Asp Pro Asp 370 375 380 Met Cys Lys Ala Phe Gln Pro Gly Phe Pro Ser Ser Cys Pro Tyr Val 385 390 395 400 Thr Ser Val Gly Gly Thr Ile Asn Val Ser Pro Glu Ile Gly Trp Asn 405 410 415 Asn Ser Gly Ser Gly Phe Ser Asn Tyr Phe Pro Ala Pro Ala Trp Gln 420 425 430 Thr Ala Ala Thr Asp Ala Tyr Lys Ala Thr Leu Pro Ala Ala Val Tyr 435 440 445 Ala Gly Arg Tyr Asn Ala Ser Gly Arg Gly Phe Pro Asp Leu Ser Ala 450 455 460 Asn Ala Asn Phe Val Glu Val Ser Gly Gly Ala Val Ala Ser Gly Thr 465 470 475 480 Gly Thr Ser Met Ser Ala Pro Val Val Ala Gly Val Phe Ala Leu Leu 485 490 495 Asn Ala Glu Leu Arg Ala Ala Gly Lys Pro Ala Leu Gly Phe Leu Asn 500 505 510 Pro Phe Ile Tyr Ala Asn Ala Gly Ala Phe Thr Asp Val Leu Val Gly 515 520 525 Gly Gly Ala Asp Cys Gly Gly Leu Gly Phe Ser Ala Thr Leu Gly Trp 530 535 540 Asp Ala Leu Thr Gly Val Gly Thr Pro Val Tyr Ser Lys Leu Arg Ala 545 550 555 560 Ala Ala Gly Leu <210> 40 <211> 758 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tripeptidyl-peptidase Sed2 <400> 40 Met Leu His Asp Leu Arg Arg Phe Asp Val Pro Val Leu Ser Gly Leu 1 5 10 15 His Arg Asp Leu Met Ser Asn Thr Asp Ser Arg Thr Asp Ala Arg Glu 20 25 30 Cys Arg Arg Glu Leu Glu Val Phe Ser Gln Ser Phe Arg Ala Ala Ala 35 40 45 Cys Asn Val Arg Val Asn Ala Leu Arg Val Ile Ile Gly Cys Ser Ile 50 55 60 Ala Arg Ile Ile Leu Ala Arg Arg Asp Val Pro Thr Glu Arg Thr Ser 65 70 75 80 Val Ile Gly Glu Tyr Met Trp Val Thr Ala Phe Val Leu Thr Ser Pro 85 90 95 Asp Leu Leu Asp Met His His Gly Glu Phe Ser Ser Tyr Arg Glu Glu 100 105 110 Asn Ser His Arg Asp His Ser Arg Leu Thr Pro Gly Val Lys His Ile 115 120 125 Ala Arg Gly Trp Ser Tyr Ser Ser Val Lys Gln Pro Tyr Arg Ser Phe 130 135 140 Val Pro Cys Pro Ser Leu Phe Leu Asp Val Val Asp Leu Ser Arg Ser 145 150 155 160 Pro Ala Arg Thr Ala Ser Gly Arg Ile Lys Arg Ala Pro Asn Asn Ser 165 170 175 Asn Pro Gln Arg Arg Ala Thr Arg Ser Pro Val Pro Ala His Pro Thr 180 185 190 Met Arg Ser Ile Leu Ala Leu Phe Ser Leu Ala Ala Leu Ala His Ala 195 200 205 Thr Pro Leu Gly Ala Arg Asp Met Arg Val His Glu Arg Arg Asp Ala 210 215 220 Pro Pro Pro Gly Phe Val Gln Asn Gly Pro Ala Pro Ala Ala Gln Lys 225 230 235 240 Ile Asn Leu Arg Leu Ala Leu Val Pro Ser Asp Pro Gln Gly Leu Glu 245 250 255 Asp Ala Leu Tyr Ala Val Ser Thr Pro Ser Ser Ala Gln Tyr Gly Gln 260 265 270 Phe Leu Thr Lys Asp Glu Ala Ser Ala Phe Val Ala Pro Lys Gln Glu 275 280 285 Ser Leu Asp Ala Val His Ala Phe Leu Ala Ala Gln Gly Leu Ser Ala 290 295 300 Thr Pro Leu Ser Pro Ala Gly Asp Trp Leu Ser Val Asp Leu Thr Val 305 310 315 320 Ala Gln Ala Asn Arg Ala Phe Asp Ala Gln Phe Ser Thr Phe Thr His 325 330 335 Glu Ala Thr Gly Lys Ala Ala Val Arg Thr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro 340 345 350 Ala Ala Leu Gln Gly His Leu Asp Phe Val His Pro Thr Thr Thr Phe 355 360 365 Pro Leu His Leu Ser Arg Gln Pro Leu Val Thr Ile Pro Leu Pro Lys 370 375 380 Gly Val Ala Pro Ala Val Asn Leu Thr Ser Asp Ala Val Pro Ala Ser 385 390 395 400 Cys Ser Ser Val Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Gly Ile 405 410 415 Pro Thr Ser Ser Ser Asn Pro Ser Gly Asn Glu Leu Gly Val Ser Gly 420 425 430 Phe Ile Asp Gln Phe Ala Asn Gln Asn Asp Leu Arg Thr Phe Leu Ser 435 440 445 Asn Leu Ala Thr Asn Val Pro Ala Ser Thr Gly Phe Thr Leu Gln Thr 450 455 460 Leu Asp Gly Gly Ser Asn Ser Gln Ser Gln Ser Gln Ala Gly Ile Glu 465 470 475 480 Ala Asp Leu Asp Thr Gln Tyr Thr Ile Gly Val Ala Ala Asp Val Pro 485 490 495 Val Val Phe Ile Ser Val Gly Asp Asn Thr Arg Asp Gly Val Phe Gly 500 505 510 Phe Leu Asp Ile Ile Asn Phe Leu Leu Gly Glu Ser Ser Pro Pro Gln 515 520 525 Val Leu Thr Thr Ser Tyr Gly Ser Asn Glu Asn Glu Ile Ser Ser Ser 530 535 540 Leu Ala Asn Asn Leu Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Ala Arg Gly 545 550 555 560 Thr Ser Ile Leu Phe Ser Ser Gly Asp Gly Gly Val Ser Gly Ser Gln 565 570 575 Ser Gly Ser Cys Ser Thr Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly Cys Pro 580 585 590 Phe Leu Thr Ser Val Gly Ala Thr Thr Gly Val Pro Glu Thr Ser Ala 595 600 605 Ser Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe Ala Thr Pro Ser Tyr 610 615 620 Gln Ala Ser Ala Val Ser Ala Tyr Leu Ser Ala Leu Gly Ser Thr Asn 625 630 635 640 Ser Gly Arg Phe Asn Arg Ala Gly Arg Ala Phe Pro Asp Val Ser Ala 645 650 655 Gln Gly Asp Asn Val Glu Ile Val Phe Gln Gln Gln Phe Gly Leu Val 660 665 670 Gly Gly Thr Ser Cys Ser Ser Pro Ile Phe Ala Ser Val Val Ala Leu 675 680 685 Leu Asn Gly Glu Leu Ile Ala Ala Gly Lys Pro Pro Leu Gly Phe Leu 690 695 700 Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Thr Gly Ala Gly Ala Leu Asn Asp Val Thr 705 710 715 720 Thr Gly Ser Asn Pro Gly Cys Gly Thr Asn Gly Phe Pro Ala Arg Ala 725 730 735 Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asn Phe Ala Ala Leu 740 745 750 Arg Thr Ala Val Gly Leu 755 <210> 41 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 aaacatatgg gnggncaytc ngttcctctc accaacttc 39 <210> 42 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 42 ttgaattctt agtgatggtg atggtgatgg tgatggtgat gcgcagcagt tgcaaacc 58

Claims (17)

  1. 헬리시움 에리나세우스(Hericium erinaceus) 배양물을 포함하는, 단백질분해효소 칵테일.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양물은 헬리시움 에리나세우스(Hericium erinaceus) 유래 조효소를 포함하는, 단백질분해효소 칵테일.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질분효소 칵테일은, 카복시펩티다아제 Y(Carboxypeptidase Y), 류신 아미노펩티다아제(Leucine aminopeptidase), 아스파틱 프로테아제(Aspartic protease), 세린 카복시펩티다아제(Serine carboxypeptidase), 트리펩타이딜-펩티다아제 Sed2(Tripeptidyl-peptidase Sed2), 펩신 A(Pepsin A), 아스파티 타입 엔도펩티다아제(Aspartic type endopeptidase), 아오신(Aorsin), 메타이오닌 아미노펩티다아제(Methionine aminopeptidase), 카복실펩티다제 S1(Carboxypeptidase S1), 세포외 세린 카복실펩티다제(Extracellular serine carboxypeptidase), 마이너 세포외 프로테아제 vpr(Minor extracellular protease vpr) 및 큐티클-디그래딩 프로테아제(Cuticle-degrading protease) 중 하나 이상을 포함하는, 단백질분해효소 칵테일.
  4. 제3항에 있어서, 상기 큐티클-디그래딩 프로테아제는 서열번호 8로, 카복시펩티다아제 Y는 서열번호 9, 10 또는 34로, 류신 아미노펩티다아제는 서열번호 12로, 아스파틱 프로테아제는 서열번호 11, 13, 15, 16 또는 35로, 세린 카복시펩티다아제는 서열번호 14, 24, 36 또는 37로, 트리펩타이딜-펩티다아제 Sed2는 서열번호 17, 21, 22, 29, 30, 39 또는 40으로, 펩신 A는 서열번호 18, 19, 23 또는 38로, 아스파티 타입 엔도펩티다아제는 서열번호 20으로, 카복실펩티다제 S1는 서열번호 25로, 아오신은 서열번호 26으로, 메타이오닌 아미노펩티다아제는 서열번호 27로, 세포외 세린 카복실펩티다제는 서열번호 28 또는 31으로, 마이너 세포외 프로테아제 vpr은 서열번호 32 또는 33으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, 단백질분해효소 칵테일.
  5. 제3항에 있어서, 상기 칵테일의 주효소는 아스파틱 프로테아제(aspartic protease)인, 단백질분효소 칵테일.
  6. 헬리시움 에리나세우스를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 단백질분해효소 칵테일의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제조방법은 배지에서 헬리시움 에리나세우스 유래 조단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 단백질분해효소 칵테일의 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 단백질분효소 칵테일은 카복시펩티다아제 Y(Carboxypeptidase Y), 류신 아미노펩티다아제(Leucine aminopeptidase), 아스파틱 프로테아제(Aspartic protease), 세린 카복시펩티다아제(Serine carboxypeptidase), 트리펩타이딜-펩티다아제 Sed2(Tripeptidyl-peptidase Sed2), 펩신 A(Pepsin A), 아스파티 타입 엔도펩티다아제(Aspartic type endopeptidase), 아오신(Aorsin), 메타이오닌 아미노펩티다아제(Methionine aminopeptidase), 카복실펩티다제 S1(Carboxypeptidase S1), 세포외 세린 카복실펩티다제(Extracellular serine carboxypeptidase), 마이너 세포외 프로테아제 vpr(Minor extracellular protease vpr) 및 큐티클-디그래딩 프로테아제(Cuticle-degrading protease) 중 하나 이상을 포함하는, 단백질분해효소 칵테일의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 큐티클-디그래딩 프로테아제는 서열번호 8로, 카복시펩티다아제 Y는 서열번호 9, 10 또는 34로, 류신 아미노펩티다아제는 서열번호 12로, 아스파틱 프로테아제는 서열번호 11, 13, 15, 16 또는 35로, 세린 카복시펩티다아제는 서열번호 14, 24, 36 또는 37로, 트리펩타이딜-펩티다아제 Sed2는 서열번호 17, 21, 22, 29, 30, 39 또는 40으로, 펩신 A는 서열번호 18, 19, 23 또는 38로, 아스파티 타입 엔도펩티다아제는 서열번호 20으로, 카복실펩티다제 S1는 서열번호 25로, 아오신은 서열번호 26으로, 메타이오닌 아미노펩티다아제는 서열번호 27로, 세포외 세린 카복실펩티다제는 서열번호 28 또는 31으로, 마이너 세포외 프로테아제 vpr은 서열번호 32 또는 33 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, 단백질분해효소 칵테일.
  10. 제8항에 있어서, 상기 칵테일의 주효소는 아스파틱 프로테아제(aspartic protease)인, 단백질분해효소 칵테일의 제조방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 조단백질의 회수는 고상 폐배지로부터 단백질을 회수하는 것인, 칵테일의 제조방법.
  12. 서열번호 8 내지 40 중 하나의 아미노산 서열로 표시되는 단백질 분해효소.
  13. 제12항의 단백질분해효소를 생산하는 재조합 대장균(Escherichia coli).
  14. 제1항의 단백질분해효소 칵테일을 기질과 반응시키는 단계를 포함하는, 단백질 분해방법.
  15. 제16항에 있어서, 상기 기질은 카제인(casein), 아조카제인(Azocasein), 실크단백질 또는 전혈인, 단백질 분해방법.
  16. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 단백질 분해효소 칵테일을 포함하는 효소제제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 효소 제제는 세제용, 섬유처리용, 단백질성 물질, 울, 피혁, 털(hair) 또는 실크처리용, 식품 또는 사료 처리용 또는 단백질성 물질의 변성, 분해 또는 제거와 관련된 용도로 사용되는 것인, 효소제제.
KR1020210151712A 2021-11-05 2021-11-05 헬리시움 에리나세우스(Hericium erinaceus) 유래의 단백질분해효소 칵테일 및 이의 활용 KR20230065784A (ko)

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