KR20110101782A - 미강 펩톤을 포함하는 미생물 배양용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미강 펩톤을 포함하는 미생물 배양용 조성물에 관한 것이다.

Description

미강 펩톤을 포함하는 미생물 배양용 조성물{Composition comprising rice bran protein hydrolysate for use in culturing of microoraganisms}

본 발명은 미강 펩톤을 포함하는 미생물 배양용 조성물에 관한 것이다.

쌀의 도정 중 발생하는 부산물인 미강은 영양학적으로 유용한 성분들을 풍부하게 함유하고 있다고 알려져 있다. 미강의 영양학적 조성은 가용성 당질 약 34 내지 52%, 조지방 약 15 내지 20%, 조단백질 약 11 내지 15%, 조섬유 약 7 내지 11%, 회분 약 7 내지 10%, 및 녹말 약 14%로 구성된다. 특히, 미강의 단백질 함량은 우유보다 더 높고, 미강의 단백질은 식물성이며, 다른 단백질에 비해 저알레르기성(hypoallergenic)으로 알려져 있다.

그러나, 높은 영양학적 가치에도 불구하고 미강은 영양 공급원으로서 효율적으로 이용되지 못했다. 미강 단백질은 복잡한 구조를 가지며, 강하게 응집된 상태로 존재하고(Hamada, J. Protease solubilization of proteins in rice bran, Presented at the IFT Annual Meeting, Anaheim, CA, 1995; Astract No. 68A-55) 특히 황화결합(disulfide bond crosslink)을 포함하고 있어서 개체에 의한 단백질의 흡수 및 이용이 어렵다. 또한, 미강 단백질과 강하게 결합하고 있는 파이테이트(phytate)(1.7%) 및 섬유질 (12%) 등 고분자 탄수화물 성분도 미강 단백질의 이용을 어렵게 하는 요인 중 하나이다.

미강을 영양 공급원으로서 미생물 배양을 위해 배지에 첨가하여 이용하였으나(대한민국 특허출원공개 제2004-0041883호, WO 2009/094199 A1, 및 Krishna Suresh Babu Naidu et al, African Journal of Biotechnology Vol. 4 (7), pp. 724-726 참조) 전술된 바와 같이 영양 성분들이 이용하기 어려운 형태로 존재하여 효율적으로 이용되지 못했고 배양을 위해 장시간이 소요되었다. 또한, 미강은 불용성이므로 배지 제조시 어려움이 있고 발효 후에 유용물질의 회수 및 정제 등을 어렵게 하였다.

따라서, 미강의 우수한 영양 성분을 산업적으로 활용할 수 있는 방안에 대한 요구가 여전히 존재한다.

이에, 본 발명자들은 미강의 풍부한 영양 성분, 특히, 단백질을 미생물 배양을 위해 효율적으로 이용할 수 있는 방법에 대한 연구를 지속하여, 미강으로부터 분리된 단백질의 분해에 의해 수득된 미강 펩톤을 유효성분으로 포함하는 미생물 배양용 배지에서 미생물 성장 및 발효 생산성의 개선을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 미강 펩톤을 포함하는 미생물 배양용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 미강 펩톤을 포함하는 미생물 배양용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "미생물 배양용 조성물"은 미생물의 생육에 필요한 영양소를 포함하여, 미생물의 성장을 위한 환경을 제공하는 배지를 의미한다. 일반적으로 미생물 배양용 조성물은 탄소원, 질소원 및 각종 무기 염류를 포함한다. 미생물 중에는 탄소원으로 탄산가스, 질소원으로 공기 중의 질소를 이용할 수 있는 것이 있으나, 일반적으로 탄소원으로 당류나 유기산을 요구하고, 질소원으로 무기 질소 화합물 또는 유기 질소화합물을 요구하며, 동시에 각종 무기염류를 필요로 한다. 그 외에 일부 미생물은 비타민이나 미량의 요소를 필요로 한다. 질소원은 단백질 합성에 이용된다. 미생물은 암모늄염이나 질산염 등의 무기 질소를 이용할 수 있으나, 미생물의 종류에 따라 아미노산이나 펩톤 등의 유기 질소를 요구하는 것도 있다. 배양되는 미생물의 종류 및 배양 목적에 따라 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적인 기술을 가진 자가 적합한 미생물 배양용 조성물을 선택하여 이용할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "미강 펩톤"은 미강으로부터 분리된 단백질의 분해 산물을 의미한다. 미강 단백질의 분해는 산 처리, 염기 처리, 효소 처리, 고압 처리, 열 처리, 미분쇄(pulverization)와 같은 물리적 처리를 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법을 통해 수행될 수 있으며, 부분적 분해일 수 있다. 미강 펩톤은 미강 단백질의 부분적 분해에 의해 수득되며, 유리 아미노산, 수개 내지 수십 개의 아미노산으로 구성된 펩티드, 또는 분해되지 않은 수용성 단백질을 포함하는 혼합물이다.

본 명세서에서 용어 "미강 단백질"은 미강으로부터 분리된 단백질을 의미한다.

미강은 쌀의 도정 중에 수득되는 농업 부산물로서, 풍부한 양의 지질, 비타민, 및 단백질을 함유하고 있다. 미강은 하기의 표 1에 표시된 바와 같이, 쌀에 비해 단백질의 함량이 높고, 부산물로 수득되므로, 미생물 배양을 위해 경제적이고 우수한 질소 공급원으로 이용될 수 있다. 그러나, 미강 중의 단백질은 다른 영양성분들과 강하게 결합된 상태로 존재하여 미강을 단백질 분해효소 등으로 처리해도 유리되어 용출되는 펩티드 및 아미노산 함량은 극히 낮은 수준이다.

성분	함량			단위
	쌀	미강	미강 단백질
조단백	6.6-7.5	12.0-15.6	60-80	%N x 6.25
조지방	0.3-0.5	15.0-19.7	2.3-6.0	%
탄수화물	76.7-78.4	34.1-52.3	10.0-15.5	%
조회분	0.3-0.8	6.6-9.9	3.5-11.3	%

미강 중의 단백질 성분을 질소원으로 효율적으로 이용하기 위해, 미강으로부터 단백질을 분리하고, 분리된 단백질에 산 처리, 염기 처리, 효소 처리, 고압 처리, 열 처리, 또는 미분쇄를 수행하여 수득된 미강 펩톤을 이용할 수 있다. 미강 펩톤은 단백질 분해 산물인 펩티드와 필수 아미노산인 라이신을 비롯한 여러 종류의 아미노산 성분을 많이 함유하고 있어서 미생물 배양시 우수한 질소원으로 사용될 수 있다.

미강 펩톤은 기존에 미생물 배지에서 질소원으로 이용되고 있는 미트(meat) 또는 카제인(casein) 펩톤과 같은 동물성 펩톤을 대체하고, 대두 펩톤, 밀 펩톤과 같은 식물성 펩톤에 비해 알레르기 유발성이 낮으며 GMO(genetically modified organism) 관련 문제를 갖지 않으므로 미생물 배양용 조성물의 우수한 질소원으로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 미강 펩톤은 미강에 중량 대비 2 내지 4배의 n-헥산으로 추출하여 미강유가 제거된 탈지 미강을 제조하는 단계, 및 탈지 미강에 4 내지 8배의 물을 첨가하여 수화시킨 후, 1 내지 5N의 수산화나트륨 용액으로 처리하여 단백질을 추출하는 단계에 의해 수득된 미강 단백질로부터 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 미강 펩톤은 미강으로부터 분리된 단백질을 산 또는 염기 처리에 의해 분해시켜 수득될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 미강 펩톤은 미강으로부터 분리된 단백질을 30-40%(w/w) 염산과 동량 혼합한 후 그 부피의 1/3의 물을 첨가하고 증기에 의해 105℃에서 30시간 이상 산 가수분해를 수행하는 단계, 냉각 후 50%(w/w) 가성소다를 이용하여 80℃에서 pH 10까지 알칼리화시키는 단계, 냉각 후, 30-40%(w/w) 염산으로 pH 4.9까지 역중화시키고 원심분리 및 필터프레스에 의한 여과를 통해 고형분을 제거하는 단계, 수득된 액상의 pH를 5.9 내지 6.1로 조정하고 전기투석에 의해 탈염시키는 단계, 및 한외여과막을 통한 한외여과 후 분말화하는 단계에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 미강 펩톤은 미강으로부터 분리된 단백질을 12%(w/w) 가성소다를 첨가하여 100℃에서 10시간 이상동안 알칼리 가수분해시키는 단계, 냉각 후 5%(w/w) 염산을 이용하여 중화시키고 원심분리 및 필터프레스에 의한 여과를 통해 고형분을 제거하는 단계, 수득된 액상을 전기투석에 의해 탈염시키는 단계, 및 한외여과막을 한외여과 후 분말화하는 단계에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 미강 펩톤은 미강으로부터 분리된 단백질을 효소 처리에 의해 분해하여 수득될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 미강 펩톤은 미강으로부터 분리된 단백질을 탄수화물 분해효소(carbohydrases) 또는 단백질 분해효소(protease) 또는 이들의 혼합물로 처리하여 수득될 수 있다. 사용 가능한 탄수화물 분해효소는 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase), 펙티나아제(pectinase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 비스코엔자임 엘(viscoenzyme L), 자일라아제(xylase) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 단백질 분해효소(protease)는 엔도형(endo-type) 효소 및 엑소형(exo-type)이 있으며 필요에 따라 적절히 혼합하여 사용할 수 있다. 미강 펩톤의 제조를 위한 효소 반응은 가수분해 정도에 따라 1 단계로 끝낼 수 있고 경우에 따라서는 다단계 반응을 거칠 수 있다. 효소반응이 끝나면 효소를 불활성화시킨 후 필요에 따라 미반응 고형분을 분리하고, 결과적으로 수득된 반응액을 농축시키 미강 펩톤 페이스트를 수득하거나, 또는 농축 및 건조시켜 미강 펩톤 분말을 수득할 수 있다. 단백질 가수분해도(DH %=유리아미노 형태의 질소/총질소x100)는 효소의 종류, 사용량과 반응시간 등에 따라 다양하게 할 수 있으며 가수분해도가 증가할수록 가수분해물의 평균분자량이 작아지며 가수분해 정도에 따라 다양한 발효 배지에서 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 미강 펩톤은 미강으로부터 분리된 단백질의 열처리, 고압처리, 미분쇄를 포함한 물리적 처리에 의한 분해를 통해 수득될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 미강 펩톤은 미강 단백질을 산이나 염기 처리 또는 효소 처리에 의해 분해시켜 수득된 분해 반응액을 농축, 건조하여 수득된 분말 제형 또는 상기 분해 반응액을 농축시켜 수득된 페이스트 제형으로 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 미강 펩톤을 포함하는 미생물 배양용 조성물은 미생물 성장을 위한 우수한 질소 공급원을 제공하여 미생물의 성장속도 및 발효 생산성의 개선을 가져오며, 그에 의해 수득된 배양물은 식품에 적용시 알레르기를 유발하지 않는 GMO 불포함(GMO Free)의 우수한 천연 소재로서 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 미생물 배양용 배지 및 미강을 포함하는 미생물 배양용 배지에서 사카로마이세스 세레비시애(Saccaromyces cerevisiae)의 성장 곡선을 보여준다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 미생물 배양용 배지 및 미강 분해물을 포함하는 미생물 배양용 배지에서 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 성장 곡선을 보여준다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 미생물 배양용 배지 및 쌀 펩톤을 포함하는 미생물 배양용 배지에서 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 성장 곡선을 보여준다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 미생물 배양용 배지 및 쌀 펩톤을 포함하는 미생물 배양용 배지에서 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 성장에 따른 pH 변화를 보여준다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 미생물 배양용 배지 및 박토펩톤을 포함하는 미생물 배양용 배지에서 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)의 성장 곡선을 보여준다.

실시예 1 : 미강 단백질의 분리

미강 중의 단백질을 분리하기 위해, 미강 또는 미강 펠릿(pellet)에 2배 내지 4배의 n-헥산을 첨가하여 탈지시켰다. 그 후, n-헥산을 제거하여 탈지 미강을 수득하고, 탈지 미강에 중량 대비 4 내지 8배의 물을 첨가하여 30 내지 60분 동안 교반하면서 수화시켜서 균일한 분산액을 수득하였다. 상기 분산액에 20 내지 30℃의 온도에서 1 내지 5N의 수산화나트륨 용액을 서서히 첨가하면서 최종 pH를 8 내지 10으로 유지시켜 30 내지 60분 동안 단백질을 추출시켰다. 단백질 추출 용액을 상온에서 5000 g 이상의 조건으로 원심분리시켜 여액과 침전물을 분리하였다. 분리된 여액에 10 내지 30℃에서 1 내지 3N HCl을 이용하여 pH를 3 내지 5로 맞추어 단백질을 침전시켜 분리하였다. 침전된 단백질을 회수하여 물로 세척하고, 중화시켜 이용하였다.

실시예 2 : 산 분해에 의한 미강 펩톤의 제조

실시예 1에서 수득된 미강 단백질을 35% 염산과 동량 혼합 후 그 양의 1/3만큼의 물을 첨가하여 증기로 105℃에서 30시간 이상 산 가수분해시켰다. 냉각 후 50% 가성소다를 이용하여 80℃에서 pH 10까지 알카리화시켰다. 다시 냉각 후 35% 염산으로 pH 4.9까지 역중화시키고 원심분리 및 필터프레스를 통한 여과에 의해 고형분을 제거하였다. 수득된 액상의 pH를 5.9 내지 6.1로 조정하고 전기 투석에 의해 탈염키셔 0.7 s/m에서 종료시켰다. 그 후, 한외여과막을 통한 한외여과 후에 분말화하여 미강 펩톤을 수득하였다.

실시예 3 : 효소 분해에 의한 미강 펩톤의 제조

실시예 1에서 수득된 미강 단백질을 증류수에 용해시켜 20%(w/w) 용액을 만들고 아밀라아제(amylase, Novozymes) 1% (미강단백질 고형분 대비 질량)를 첨가한 후 90℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 60℃로 냉각시키고 단백질 분해효소 collupulin(DSM) 2%(미강단백질 고형분 대비 질량)를 첨가하고 6시간 이상 동안 반응시켰다. 반응을 종료시킨 후, 반응액을 50℃로 냉각시키고 단백질 분해효소 Falvourzyme (Novozymes) 1% (미강단백질 고형분 대비 질량)를 넣고 6시간 이상 동안 반응시켰다. 상기 반응의 완료 후에, 반응액을 90℃에서 30분 동안 가열하여 효소를 불활성화시킨 후 원신분리에 의해 미반응 고형분을 제거하였다. 미반응 고형분의 제거 후에 수득된 반응액을 농축 및 건조시켜 미강 펩톤 분말을 수득하였다.

사용되는 효소의 종류, 사용량 및 반응 시간 등을 조절하여 원하는 수준의 단백질 가수분해도(DH %=유리 아미노 형태의 질소/총 질소x100)를 갖는 미강 펩톤을 수득할 수 있다.

실시예 4 : 미강 첨가 배지와 미강 펩톤 첨가 배지에서의 미생물 배양

미강과 실시예 2에 의해 제조한 미강 펩톤을 각각 유기 질소원으로 포함하는 배지 100ml(덱스트로오스 0.4 % w/w, 미강 또는 산분해 미강 펩톤 1.0 % w/w)에 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) KCCM 11350을 접종하고 30℃에서 200rpm으로 진탕 배양하였다. 배양의 특정 시점(0, 6, 12, 18, 24시간)에 시료를 채취하고 800rpm에서 10초간 원심분리 후 상등액의 OD값(600nm)을 측정하여 성장 곡선을 작성하였다. 그 결과가 도 1에 표시된다.

도 1에 도시된 바와 같이, 미강보다 산 분해에 의해 수득된 미강 펩톤을 첨가한 배지에서의 성장이 더 우수했다. 미강을 분해하지 않고 배지에 첨가할 경우 일부 수용성 영양소만 미생물에 의해 이용되며 단단하게 결합되어 있는 고분자 영양분은 이용되지 못하기 때문에 미생물 배양에서 효율적으로 이용되지 못하는 것으로 사료된다.

실시예 5 : 미강 분해물 첨가 배지와 미강 펩톤 첨가 배지에서의 미생물 배양

미강 100g을 60℃의 온수 900g에 용해시킨 후 알파아밀라아제 1g을 첨가하고 1시간 동안 교반시켰다. 그 후, 121℃에서 30분간 고압멸균하고 55℃로 다시 냉각시킨 후 글루코아밀라아제 0.2g을 첨가하고 3시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 후에 다시 프로테아제 2g을 첨가하고 2시간 동안 반응시켜 비교실험을 위한 미강분해물을 제조하였다. 미강 펩톤은 실시예 3에 의해 제조된 것을 사용했다.

미강 분해물과 실시예 3에 의해 제조한 미강 펩톤을 각각 유기 질소원으로 함유한 배지 100ml(덱스트로오스 1.0 % w/w, 미강 또는 효소 분해에 의해 수득된 미강 펩톤 0.5 % w/w, 효모 추출물 0.3 % w/w, 맥아 추출물 0.3 % w/w)에 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) KCCM 50075을 접종하고 30℃에서 200rpm으로 진탕 배양 시켰다. 배양의 특정 시점(0, 6, 12, 18, 24시간)에 시료를 채취하고 800 rpm으로 10초간 원심분리한 후 상층액의 OD값(600nm)을 측정하여 성장 곡선을 작성하였다. 그 결과가 도 2에 표시된다.

도 2에 도시된 바와 같이, 미강 분해물보다 효소 분해에 의해 수득된 미강 펩톤을 첨가한 배지에서의 미생물 성장이 더 우수했다. 미강 분해물의 경우 미강 펩톤에 비해 단백질 함량이 상당히 낮기 때문에(15% 이하 수준), 단백질 분해효소에 의한 처리를 하더라도 유리되어 용출되는 펩티드와 아미노산 함량이 한정될 수 밖에 없다. 반면에, 미강 펩톤은 미강에서 단백질을 분리한 후 효소로 처리했기 때문에 단백질 함량이 60%이상이므로 미강 분해물에 비해 유리 아미노산 및 펩티드 함량이 4-5배 이상 높다. 따라서 미생물이 이용할 수 있는 펩티드 및 아미노산 함량이 높은 미강 펩톤을 미생물 배양용 조성물에 첨가하여 사용했을 때 미생물의 성장에 보다 촉진된다는 것을 확인했다.

실시예 6 : 쌀 펩톤 첨가 배지와 미강 펩톤 첨가 배지에서의 미생물 배양

시중에 판매되는 쌀 펩톤(Kerry bioscience 사 제품)과 실시예 3에 의해 제조한 미강 펩톤을 각각 유기 질소원으로 포함하는 배지 100ml(쌀 펩톤 또는 효소분해 미강 펩톤 2.5 % w/w, 덱스트로오스 2 % w/w, 폴리소르베이트 80 0.1 % w/w, 암모늄 시트레이트 0.2 % w/w, 아세트산 나트륨 0.5 % w/w, 황산마그네슘 0.005 % w/w, 황산 망간 0.005 % w/w, 제2인산칼륨 0.2 % w/w)에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCCM 11322를 접종하고 30℃에서 200rpm으로 진탕 배양 시켰다. 배양의 특정 시점(0, 6, 12, 18, 24시간)에 시료를 채취하고 800 rpm으로 10초간 원심분리한 후 상층액의 OD값(640nm)을 측정하여 성장 곡선을 작성하고, pH를 측정하였다. 도 3 및 도 4는 각각 성장 곡선 및 배양 과정 중의 pH 변화를 나타낸다.

도 3에 도시된 바와 같이, 쌀 펩톤보다 미강 펩톤을 첨가한 배지에서의 미생물의 성장이 더 우수했다. 또한 도 4의 결과와 같이 쌀 펩톤 보다 효소에 의한 분해로 수득된 미강 펩톤을 첨가한 배지에서의 pH가 더 많이 감소하였다. pH의 감소가 클수록 발효 과정 중 생성된 유산(lactic acid)의 함량이 많다는 것을 의미하므로 미강 펩톤을 첨가한 배지에서 배양된 락토바실러스 플란타룸이 발효 산물인 유산(lactic acid)을 더 많이 생성한 것으로 보인다.

이와 같은 결과는 미강 펩톤은 쌀 펩톤에 비해 단백질 및 아미노산 성분을 많이 함유하고 있어 미생물 배양시 훌륭한 질소원으로 이용될 수 있다는 것을 보여준다. 또한 미강 펩톤에는 다양한 무기질 성분이 다량 함유되어 있어 이 성분들도 미생물 배양에서 성장인자로서 기여하는 것으로 보인다.

실시예 7 : 동물성 펩톤 첨가 배지와 미강 펩톤 첨가 배지에서의 미생물 배양

시중에서 판매되는 동물성 펩톤(bactopeptone, difco)과 미강 펩톤을 비교하기 위해 박토펩톤과 실시예 3 에서 제조된 미강 펩톤을 각각 유기 질소원으로 함유하는 배지 100ml(육류 추출물(Beef extract) 0.3 % w/w, 박토펩톤 또는 효소분해 미강 펩톤 0.5 % w/w)에 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) KCCM 35409를 접종하고 30℃에서 200rpm으로 진탕 배양 시켰다. 배양의 특정 시점(0, 6, 12, 18, 24시간)에 시료를 채취하고 800 rpm으로 10초간 원심분리한 후 상층액의 OD값(600nm)을 측정하여 성장 곡선을 그린 결과를 그림 5에 나타내었다.

도 5에 도시된 바와 같이, 동물성 펩톤인 박토펩톤에 비해 미강 펩톤에서의 미생물 성장이 더 우수하였다. 이 결과는 식물성 원료인 미강 펩톤이 기존의 동물성 펩톤을 대체할 수 있는 가능성을 보여준다.

Claims (4)

1. 미강 펩톤을 포함하는 미생물 배양용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 미강 펩톤은 미강으로부터 분리된 단백질을 산 또는 염기에 의한 처리로 분해시켜 수득된 것인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 미강 펩톤은 미강으로부터 분리된 단백질을 효소 처리에 의해 분해시켜 수득된 것인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 미강 펩톤은 미강으로부터 분리된 단백질을 열처리, 고압 처리, 또는 미분쇄(pulverization)에 의해 분해시켜 수득된 것인 조성물.

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