KR20230059846A - 원형탈모증의 진단 또는 예후 평가를 위한 정보 제공 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 두피의 미생물 군집 분포를 이용한 원형탈모증의 진단 또는 예후 평가를 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로, (A) 피험자로부터 획득된 두피시료로부터 Staphylococcus caprae 균주의 비율, 또는 Corynebacterium 속에 속하는 균주의 비율을 측정하는 단계; 및 (B) 정상 대조군으로부터 획득된 두피시료에서의 상기 균주의 비율과 비교하는 단계;를 포함한다.
이상과 같이 본 발명에 의하면 두피의 미생물 군집 특성을 분석하는 것만으로 원형탈모증 여부 뿐 아니라 원형탈모증의 상태 및 예후를 포함하여 원형탈모증을 진단할 수 있는 정보를 제공할 수 있으므로, 원형탈모증의 효과적인 치료에 이용될 수 있다.
이상과 같이 본 발명에 의하면 두피의 미생물 군집 특성을 분석하는 것만으로 원형탈모증 여부 뿐 아니라 원형탈모증의 상태 및 예후를 포함하여 원형탈모증을 진단할 수 있는 정보를 제공할 수 있으므로, 원형탈모증의 효과적인 치료에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 두피의 미생물 군집 분포를 이용한 원형탈모증의 진단 또는 예후 평가를 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
원형탈모증(alopecia areata)은 인간에게 두 번째로 흔한 유형의 탈모 장애로 발병율이 2% 이상이며, 흉터가 없는 탈모를 특징으로 한다. 원형탈모증의 원인은 아직 완전히 이해되지 않았으나 면역 특권 상실/면역 조절 장애, 유전적 소인, 호르몬 불균형, 심리적 스트레스, 유전적 경향, 기타 국소 피부질환 및 영양 결핍과 같은 몇몇 요인들이 영향을 미치는 것으로 보인다. 최근에는 신체가 자신의 모낭을 공격하여 모발의 성장을 억제하거나 멈추게 하는 전신 자가면역질환의 일종으로 분류하고 있다. 원형탈모증 자체가 신체적인 고통을 야기하지는 않으나, 신체 이미지 형성이나 자존감에 부정적인 영향을 미쳐서, 많은 경우 사회적 환경에서 비효율적으로 작용하고 결과적으로 삶의 질을 저하시킬 수 있다.
원형탈모증은 별도의 전구증상이나 자각증상이 없는 채로 갑자기 경계가 선명한 탈모반이 출현한다. 원형탈모증에 의해 영향을 받는 대상의 경우, 통상 두피에 하나 이상의 환상 또는 반점상의 대머리 병변이 있으며, 남성과 여성의 발병율이 유사하다. 환자의 60% 이하는 20대 전에 최초의 탈모를 경험하며, 소아 환자가 약 20%를 차지한다. 처음 시작되는 작은 원형의 탈모반의 경우에는 별도의 치료가 없어도 1년 이내에 회복한다. 그러나 질환의 활성도나 중증도에 따라 장기간의 치료가 필요한 경우도 흔히 있으며, 완치된 후에도 재발이 빈번하여 대부분의 환자는 1회 이상의 탈모를 겪는다. 약 5% 정도의 사례에서는 전체 두피(전두 탈모증) 또는 신체 전체 털이 있는 영역으로 확장되는 전신 탈모증으로 발전하며, 전신탈모증 환자 중 회복되는 사람은 10% 미만이다.
원형탈모증의 치료는 주로 염증반응과 이에 수반되는 성장인자 억제가 주치료 목표이며 먹는 약과 바르는 약, 주사치료, 냉동치료, 광선치료 등이 있다. 생물학적 제제를 사용하기도 하지만 고가의 약값이 부담이 된다. 치료에 대한 반응은 질환의 중증도에 따라 다양하게 나타나기 때문에 정확하게 예측하기 어렵다. 현재 치료들의 초기 효능은 10% 미만에서 최대 약 60%의 범위이나, 장기적인 측면에서는 위약과 비교하여 현재의 어떤 치료도 이점을 나타내지 못한다. 게다가 현재의 치료들은 예를 들어 피부염이나 모낭염, 두피 피부의 위축과 같은 가벼운 부작용과 함께 피부암이나 쿠싱 증후군의 위험도 증가와 같이 심각한 부작용이 보고되어 있다.
따라서 초기에 빠른 진단을 통해 치료를 받는 것이 바람직하나, 일단 진단이 된다면 예후를 예측하고, 예측된 예후별로 약물의 부작용과 치료효과를 함께 고려하여 더 나은 효과를 갖도록 치료 계획을 수립하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 예후가 좋을 것으로 예측되는 경우에는 자연치유를 기대하거나 혹은 최소한의 치료를 실시하는 한편, 예후가 좋지 않은 경우에는 보다 적극적인 치료로 병세의 악화나 재발을 방지할 수 있다.
원형탈모증은 대부분 임상적 특징에 근거하여 육안으로 진단한다. 특히 모발 당기기 검사를 통해 채취한 모발의 뿌리를 육안이나 현미경으로 관측하면 정확하게 진단할 수 있다. 간혹 다른 종류의 탈모와 구분이 어렵다면, 두피 조직검사를 시행한다. 그러나 이러한 병변의 양상으로 쉽게 일반적인 진단이 가능하지만, 향후 경과에서 전두 혹은 전신탈모증으로 악화될 가능성이 있는 지 여부를 확인하는 방법은 알려져 있지 않다. 악화되는 환자라면 예를 들면, 전신적인 면역억제제 스테로이드 요법이 필요한데 이런 치료 지침을 적용할 만한 예후 예측인자가 현재까지 알려져 있지 않은 것이다.
즉, 종래 이러한 검사법들은 원형탈모증에 해당하는 지에 대한 판단만이 가능할 뿐, 치료의 난이도와 재발의 위험성을 판단하는 예후에 대한 정보는 제공하지 못한다. 공개특허 제10-2018-0036788호는 원형탈모증 치료 및 치료의 예후를 추적할 수 있는 바이오마커를 통해 효과적인 치료를 제공하고자 하고 있으나, 아직까지 이에 대한 연구는 부진한 상태이다.
본 발명은 원형탈모증의 효과적인 치료가 가능하도록, 비침습적인 방법에 의해 원형탈모증의 여부 뿐 아니라 상태, 예후를 포함한 진단이 가능하도록 하는 원형탈모증 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은
(A) 피험자로부터 획득된 두피시료로부터 Staphylococcus caprae 균주의 비율, 또는 Corynebacterium 속에 속하는 균주의 비율을 측정하는 단계; 및 (B) 정상 대조군으로부터 획득된 두피시료에서의 상기 균주의 비율과 비교하는 단계;를 포함하는 원형탈모증의 진단 또는 예후 평가를 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
이상과 같이 본 발명에 의하면 두피의 미생물 군집 중 S. caprae 균주의 비율 또는 Corynebacterium 속에 속하는 균주의 비율을 분석하는 것만으로 원형탈모증 여부 뿐 아니라 원형탈모증의 상태 및 예후를 포함하여 원형탈모증을 진단할 수 있는 정보를 제공할 수 있으므로, 원형탈모증의 효과적인 치료에 이용될 수 있다.
도 1은 정상군과 환자군의 두피시료에서 S. caprae의 비율 차이를 보여주는 그래프.
도 2는 정상군과 환자군의 두피시료에서 Staphylococcus 속 미생물 중 S. caprae의 비율 차이를 보여주는 그래프.
도 3은 정상군과 환자군의 두피시료에서 Corynebacterium 속에 속하는 균주의 비율 차이를 보여주는 그래프.
도 2는 정상군과 환자군의 두피시료에서 Staphylococcus 속 미생물 중 S. caprae의 비율 차이를 보여주는 그래프.
도 3은 정상군과 환자군의 두피시료에서 Corynebacterium 속에 속하는 균주의 비율 차이를 보여주는 그래프.
이하 도면과 실시예를 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.
발명을 설명함에 있어서 발명과 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에 그 상세한 설명을 생략하기로 한다.
본 발명에서 '진단'이란 원형탈모증의 유무 뿐 아니라 원형탈모증의 상태와 그 예후를 판단하는 것을 포함하며, 이러한 판단을 위해 주어진 정보를 분석하는 것을 의미한다. 본 발명에서 '예후 평가'란 원형탈모증이 앞으로 어떻게 진행될 것인가에 대한 판단 또는 소정의 치료과정을 진행했을 때 원형탈모증의 증상변화를 평가하는 것을 포함하며, 이러한 판단을 위해 주어진 정보를 분석하는 것을 의미한다.
본 발명에서 '(특정)균주의 비율'이란 모집단이 되는 미생물 군집 전체의 수에 대한 (특정)균주 수의 비율을 의미한다.
본 발명은 정상군과 대비하여 원형탈모증 환자의 두피의 미생물 군집이 상이하며, 더 나아가 예후에 따라 특징적인 미생물 분포를 갖는 것을 확인하고, 이를 원형탈모증의 진단 및 예후 판단에 이용하고자 하는 것이다. 따라서 본 발명은 두피시료에서 특정 미생물 비율을 검출하여 다른 검출 대상과 비교함으로써 원형탈모증의 여부는 물론 예후를 판단할 수 있도록 하는 것에 의해 효과적인 치료가 가능하도록 하는 것이다.
전술하였듯이, 본 발명은 피험자가 현재 원형탈모증이 있는지, 원형탈모증이 발생할 가능성이 있는지를 진단하기 위한 정보제공 방법과, 원형탈모증 환자의 향후 진행상태 예상 또는 치료가 효과를 발휘하고 있는지에 대한 예후 평가를 위한 정보 제공방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 (A) 피험자로부터 획득된 두피시료로부터 ⓐ Staphylococcus caprae 균주의 비율 및 ⓑ Corynebacterium 속에 속하는 균주의 비율 중 적어도 하나의 비율을 측정하는 단계; 및 (B) 정상 대조군으로부터 획득된 두피시료에서의 상기 균주의 비율과 비교하는 단계;를 포함한다.
본 발명은 시간차를 두고 분석 균주의 종류, 분석기법, 정보의 추출 등을 동일하게 한 상태에서 반복적인 분석을 하는 것도 포함한다.
본 발명에서 상기 S. caprae 균주의 비율은 하기 실시예에 예시된 것처럼, ① 전체 미생물 군집 중 S. caprae 균주의 비율 및 ② Staphylococcus 속 미생물 중에서 S. caprae 균주의 비율 중 적어도 하나의 비율일 수 있다. 본 발명에서 상기 Corynebacterium 속에 속하는 균주의 비율은, 전체 미생물 군집 중 Corynebacterium 속에 속하는 균주의 비율을 의미한다.
상기 균주의 비율은, 시료를 채취하고 배양한 다음 전체 미생물 수 또는 특정 속(genus) 미생물과, 상기 특정 균주의 수를 비교하는 원시적인 방법으로 결정할 수 있을 것이다. 그러나 바람직하기로는, 모든 미생물에 공통으로 존재하는 물질 중 상기 S. caprae 균주, 또는 상기 Corynebacterium 속에 속하는 균주에 특이적 변이가 있는 단백질, 핵산, 지질, 당지질 및 당단백질과 같은 유기 생체 분자를 검출하는 것에 의해 이루어질 수 있다. 특정 균주에 특이적 변이가 있는 상기 유기 생체 분자들은 공지되어 있는 것을 사용할 수 있을 것이다. 본 발명은 상기 균주의 신규한 검체량 측정 방법을 제공하려는 것이 아니라, 종래 기술을 이용하여 상기 균주의 검체량을 측정하고 비교하는 것에 의해 원형탈모증의 진단 또는 예후 평가를 위한 정보를 제공하고자 하는 것이다. 따라서 상기 균주(S. caprae 균주, 또는 상기 Corynebacterium 속에 속하는 균주)에 특이적인 유기 생체 분자는 종래기술에 알려져 있는 것을 사용할 수 있으며, 이후 새로이 특정 유기 생체 분자가 해당 균주에 특이적임이 알려진다고 하더라도 역시 본 발명에 이용될 수 있음은 당연하다. 상기 유기 생체 분자는 이를 특이적으로 검출하는 프라이머, 프로브, 안티센스 올르고뉴클레오티드, 압타머 또는 항체 등에 의해 검출할 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명에서는, 하기 실시예에 기재된 것처럼, S. caprae 균주, 또는 상기 Corynebacterium 속에 속하는 균주에 특이적인 DNA 서열 부분의 증폭산물의 양, 보다 구체적으로는, 16S rRNA 유전자의 증폭산물을 측정하는 것에 의해 이루어질 수 있다. 16S rRNA란 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rRNA로, 모든 종에 공통적인 보존 영역(conserved region)과 특정 종을 분류할 수 있는 초가변 영역(hypervariable region)이 존재하므로 염기서열분석을 통하여 미생물을 동정할 수 있다. 16S rRNA를 이용한 해당 균주의 비율은 시료내 전체 미생물 군집의 16s rRNA 유전자 증폭산물 중 해당 균주의 16s rRNA 유전자 증폭량이 차지하는 중량% 또는 카피 수(copy number)로 측정될 수 있다.
예를 들어 상기 16S rRNA 유전자 증폭산물은 16S rRNA 서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 검출할 수 있다. 각 균주들에 특이적인 프라이머들은 이미 공지되어 있거나, 혹은 공지의 기술을 통해 용이하게 도출될 수 있다. 이러한 프라이머를 이용한 서열 증폭 방법 역시 당업계에 알려진 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR), 멀티플렉스 PCR, 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR, 부스터(booster) PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스(inverse) 중합효소 연쇄반응, 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR), 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭 등의 반응을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예에서는 16S rRNA 유전자를 목적물질로 하여 본 발명이 속한 분야에서 널리 알려진 기술인 '피이로시퀀싱' 기법을 적용하였다. 16S rRNA 유전자 대신 다른 특이성 있는 DNA 서열을 목적물질로 하더라도 동일한 결과를 얻을 수 있을 것임은 자명하다.
S. caprae와 Corynebacterium 속 균주의 16S rRNA 유전자 서열 및 서열의 특이부분에 관한 정보는 Genbank database에서 확인할 수 있다.
이외에도, 상기 균주 비율의 측정의 다른 예로는 항원-항체 반응을 기반으로 한 면역학적 방법 등이 있을 수 있다. 이를 위하여 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter), 또는 단백질 칩(protein chip) 등을 사용할 수 있으며, 마찬가지로 이에 한정되는 것은 아니다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 설명한다.
[실시예]
1. 실험군의 분류 및 시료의 수집
총 32명의 원형탈모증 환자(AA) 와 13명의 건강한 대조군(HC)을 코호트 모집하여 분석하였다. 원형탈모증 환자(AA)는 의사의 진단에 따라 선정하였으며, 다음 표와 같은 기준에 따라 예후를 추가적으로 구분하였다.
Science 2009, 324(5931): 1190-1192에 기재된 방법에 따라 실험군 및 대조군의 두피 표면으로부터 스왑 방법으로 시료를 수집하였다. 살균된 면봉을 0.9% NaCl 및 0.1% Tween 20을 포함하는 용액에 30초간 담근 후 사용하였으며, 시료의 수집 후 면봉의 머리를 잘라 상기 용액에 저장하였다. 동일 대상으로부터 얻은 시료는 함께 수집하였으며, DNA를 추출하기 전까지 -80℃에 보관하였다.
2. DNA 추출 및 파이로시퀀싱
DNesy Blood & Tissue kit(QiAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 실시예 1의 두피 스왑 시료로부터 박테리아 DNA를 추출하였다. DNA 시료는 16S 리보솜 유전자의 V3~V4 영역(모든 미생물이 공통으로 가진 서열 영역)을 표적으로 하는 16S universal primer를 사용하여 증폭하였다. 시퀀싱 조각은 ILLumina MiSeq technology를 이용하여 검출하였다. 이상의 과정은 마크로젠(서울, 한국)을 통해 수행되었다.
시퀀싱 파일은 CLC Genomic Workbench v.10.1.1과 CLC Microbial Genomic Module v.2.5(Qiagen, Hilden, Germay) 소프트웨어를 사용하여 조작분류단위(OTU, operational taxonomic unit)로 분류하였다. 서열의 분류군 할당은 NCBI 분류 데이터베이스(NCBI taxonomy database)에 기반하여 OTU 컷오프 3%로 수행하였다. 가장 풍부한 서열을 각 클러스터의 대표서열로 간주하였으며, CLC Microbial Genomics defalut value를 근거로 분류 수준을 결정하였다. OTU 표를 얻기 위하여, 먼저 SILVA v132 database로부터 미리 정렬된 16S 데이터와 함께 MUSCLE v.3.8.31을 사용하여 다중 서열 정렬(multiple sequence alignment)을 수행하였다.
3. 미생물 군집의 계층적 군집 분석
Bray-Curtis 메트릭스와 완전연결법(complete linkage method)을 사용하여 계층적 군집 분석을 실시하고, GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 2-tailed student's test와 χ2 test로 미생물 군집의 표현형 특성 차이를 검정하였다.
(1)
S. caprae
균주의 분포 특성
분석 결과, 정상군과 원형탈모증 환자군(AA)에서 S. caprae 균주의 분포가 정상군(HC)에 비해 점유율이 크게 감소(도 1 참조)하여 원형탈모증의 진단 마커로 사용될 수 있음을 보여준다. [정상군 21.1% vs. 원형탈모증 환자군 7.7%, P=0.015]
S. caprae는 코, 손톱 및 피부에 서식하는 공생의 혈장응고효소음성 포도상구균(coagulase-negative Staphylococcus)으로, 바이오필름을 형성하는 특성 때문에 골 및 관절염을 일으킬 수 있는 것으로 보고된 바 있다. 하지만, 아직까지 그 병독성 및 임상적 특성에 대해서는 잘 알려진 바가 없다.
추가적인 분석 결과, S. caprae 비율(cut-off 10%)을 이용할 때 82.4% [95% CI, 56.57%-96.2%]의 민감도, 85.7% [95% CI, 42.13-99.64%]의 특이도, 93.3% [69.24-98.86%]의 양성예측도, 66.7% [40.68-85.37%]의 음성예측도를 나타내었다.
또 다른 분석 결과, 원형탈모증의 예후가 나빠짐에 따라 Staphylococcus 속의 미생물 중에서도 S. caprae의 분율이 유의미하게 감소하는 경향을 보였다. 즉, Staphylococcus 속 중에서 S. caprae는 정상군(HC)에서는 39.6%를 차지하였으나, 예후가 나쁜 C군에서는 10.1%로 정상군(HC)에 비해 대략 1/4 수준으로 감소하였다(도 2 참조). [Staphylococcus species 중 S. caprae가 차지하는 평균비율값 ; 정상군 39.6%, Group A 30.5%, Group B 21.3%, Group C 10.1%]
(2) Corynebacterium 속에 속하는 균주의 분포 특성
분석 결과, 예후가 나쁜 원형탈모증 환자군(그룹C)에서 Corynebacterium 속에 속하는 균주의 비율이 정상군(HC)이나 상대적으로 예후가 좋은 원형탈모증 환자군(그룹A 또는 B)에 비해 유의미하게 증가함을 나타내었다(도 3 참조). [정상군 0.3%, Group A 0.7%, Group B 0.7%, Group C 9.7%]
이상의 결과는, 두피에서 수집된 미생물 군집에서 S. caprae의 비율, 또는 Corynebacterium 속에 속하는 균주의 비율이 원형탈모증의 진단과 예후 판단에 대한 훌륭한 바이오마커가 될 수 있음을 보여주는 것이다.
Claims (4)
- (A) 피험자로부터 획득된 두피시료로부터 Staphylococcus caprae 균주의 비율 및 Corynebacterium 속에 속하는 균주의 비율 중 적어도 하나의 비율을 측정하는 단계; 및
(B) 정상 대조군으로부터 획득된 두피시료에서의 상기 균주의 비율과 비교하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 원형탈모증의 진단 또는 예후 판단을 위한 정보 제공 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 S. caprae 균주의 비율은, 전체 미생물 군집 중 S. caprae 균주의 비율 또는 Staphylococcus 속 미생물 중에서 S. caprae 균주의 비율이며,
상기 Corynebacterium 속에 속하는 균주의 비율은, 전체 미생물 군집 중 Corynebacterium 속에 속하는 균주의 비율인 것을 특징으로 하는 원형탈모증의 진단 또는 예후 판단을 위한 정보 제공 방법. - 청구항 2에 있어서,
상기 균주의 비율 측정은
모든 미생물에 존재하는 물질 중 상기 S. caprae 균주 또는 상기 Corynebacterium 속에 특이적 변이가 있는 단백질, 핵산, 지질, 당지질 및 당단백질로 이루어지는 군에서 선택된 특정 물질을 검출하는 소단계와,
상기 특정 물질과, 특정 물질 중 상기 균주에 특이적인 물질의 함량을 비교하는 소단계에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 원형탈모증의 진단 또는 예후 판단을 위한 정보 제공 방법. - 청구항 3에 있어서,
상기 특정 물질은 소정의 DNA 서열 또는 16S rRNA 유전자의 증폭산물인 것을 특징으로 하는 원형탈모증의 진단 또는 예후 판단을 위한 정보 제공 방법.
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