KR20230059725A - 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체 및 구형 구조체의 제조 방법 - Google Patents

3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체 및 구형 구조체의 제조 방법 Download PDF

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KR20230059725A
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유영수
박장호
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(의료)길의료재단
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Abstract

본 발명은, 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체에 있어서, 수직 축상으로 신장된 로드부와, 상기 로드부의 중앙부에 형성되어 세포가 배양되는 구 형상의 스캐폴드를 포함하고, 상기 스캐폴드는 세포 배양액의 영양분과 산소가 내부로 투과될 수 있도록 나노 섬유로 구성된 것을 일 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체의 제조 방법에 있어서, 제1 축 방향으로 전기방사용 로드가 통과되는 로드 홀과, 상기 로드 홀의 중앙부에 구 형상의 내부공간이 형성되고, 상기 구 형상의 내부 공간으로 하이드로겔이 주입되는 인렛 홀이 제2 축 방향으로 형성된 몰드에 상기 인렛 홀을 통해 하이드로겔을 주입하여 경화시키는 제1 단계; 상기 제1 단계를 통해 상기 전기방사용 로드 상에 구 형상의 하이드로겔이 경화되고, 상기 전기방사용 로드가 회전되며 나노 섬유가 상기 경화된 하이드로겔의 외주면에 전기방사되는 제2 단계; 및 상기 제2 단계의 수행으로 나노 섬유가 구 형상으로 증착된 상기 하이드로겔을 물에 넣어 하이드로겔이 제거되는 제3 단계를 포함하여, 수직 축상으로 신장된 로드부와, 상기 로드부의 중앙부에 형성되어 세포가 배양되는 구 형상의 스캐폴드가 나노 섬유로 구성된 구형 구조체가 제조되는 것을 다른 특징으로 한다.

Description

3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체 및 구형 구조체의 제조 방법{A SPHERICAL STRUCTURE FOR 3-DIMENSIONAL CELL CULTURE AND A METHOD FOR MANUFACTURING THE SPHERICAL STRUCTURE}
본 발명은 3차원 세포 배양체가 일정 규격 조건으로 자랄 수 있도록 구성된 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체 및 구형 구조체의 제조 방법에 관한 것이다.
세포의 배양은 바이오 분야 연구에서 가장 기본이 되는 연구 방법으로서 생명체의 기능 연구뿐만 아니라 인체질환을 연구하는 데에도 매우 광범위하게 이용되고 있다. 일반적인 진핵세포의 세포 배양 방법이 개발 및 확립된지도 40 여년이 경과되었지만, 부착성 세포의 성장을 지지하기 위해 현재까지 가장 흔히 사용되고 있는 방법은 폴리계열의 합성 폴리머 수지 혹은 유리(glass)로 된 기질로 이루어진 2차원 표면에서 세포를 배양하는 것이다.
그러나, 단층 세포 배양 방법인 2차원적 세포 배양법에 의해 성장하는 세포는 세포가 잘 부착될 수 있도록 처리된 배양 용기 표면에 부착되어 자라므로 3차원적 생체조직 환경에서 성장하는 세포와 많은 차이점을 나타낸다. 따라서, 2차원적 및 3차원적 세포 배양은 전반적인 형태학적 차이를 나타내며, 또한 통상적인 2차원적 세포 배양을 통하여 일어나는 수용체의 발현, 유전자의 전사조절, 세포의 이동 및 세포자멸사(apoptosis) 등 많은 복잡한 생명 현상이 실제 생체 조직환경에서 일어나는 현상과 크게 다르기 때문에, 2차원적 세포 배양 방법은 3차원 상에서 세포가 성장하는 생체의 생리적 환경을 정확히 반영할 수 없다는 문제점을 가지고 있다.
이를 위해, 최근에는 3차원 상의 세포 배양을 위한 스캐폴드 및 용기 관련 선행문헌이 제시되고 있다. 관련 선행문헌으로, 한국등록특허 제10-2115787호(이하 ‘선행특허’라 약칭한다)는 3차원 세포 배양을 위한 배양용기 및 이를 이요한 세포 공배양 방법을 개시하고 있다. 상기의 선행특허는 바닥면과 이격된 위치에서 세포가 배양되도록 하고, 3차원 구조체를 별도로 지지하는 지지부 구조로 내부 공간에 돌출되거나 안으로 파인 형태의 구조를 해결수단으로 제시하고 있다.
그러나, 종래의 경우 3차원 세포 배양의 방법이 많이 개발되고는 있으나 아직까지 다수의 배양에 프로토콜의 표준화가 정립이 되지 않았다. 3차원 세포 배양은 2차원 배양에 비해 덩어리로 존재해서 투과도가 낮고 3차원 배양마다 시약 확산이 다르며, 세포 배양시 크기가 균일하게 만들기 어려운 한계점이 있다. 종래의 3차원 배양에는 세포 배양의 크기를 크게 만들 경우 내부에서 괴사가 발생되며, 스캐폴드의 기법 중 하이드로겔의 경우에도 미디어(media)의 교체과정 중 하이드로겔이 무너지는 문제도 존재한다.
한국등록특허 제10-2115878호
본 발명은 스캐폴드 내에 세포를 파종하여 3차원의 세포 배양을 수행함에 있어서 3차원의 세포 배양체가 일정 규격 조건으로 성장될 수 있는 구조체 및 이의 제조 방법을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체에 있어서, 수직 축상으로 신장된 로드부와, 상기 로드부의 중앙부에 형성되어 세포가 배양되는 구 형상의 스캐폴드를 포함하고, 상기 스캐폴드는 세포 배양액의 영양분과 산소가 내부로 투과될 수 있도록 나노 섬유로 구성된 것을 일 특징으로 한다.
바람직하게, 상기 스캐폴드는, 상기 나노 섬유의 두께가 4㎛(오차범위 ±10%)로 형성될 수 있다.
바람직하게, 상기 스캐폴드는, 상기 나노 섬유가 600㎛(오차범위 ±10%)의 전기 방사로 증착 형성될 수 있다.
바람직하게, 상기 스캐폴드는, 구 형상의 내측에 제1 세포의 배양과, 구 형상의 외측에 제2 세포의 배양이 가능할 수 있다.
또한, 본 발명은 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체의 제조 방법에 있어서, 제1 축 방향으로 전기방사용 로드가 통과되는 로드 홀과, 상기 로드 홀의 중앙부에 구 형상의 내부공간이 형성되고, 상기 구 형상의 내부 공간으로 하이드로겔이 주입되는 인렛 홀이 제2 축 방향으로 형성된 몰드에 상기 인렛 홀을 통해 하이드로겔을 주입하여 경화시키는 제1 단계; 상기 제1 단계를 통해 상기 전기방사용 로드 상에 구 형상의 하이드로겔이 경화되고, 상기 전기방사용 로드가 회전되며 나노 섬유가 상기 경화된 하이드로겔의 외주면에 전기방사되는 제2 단계; 및 상기 제2 단계의 수행으로 나노 섬유가 구 형상으로 증착된 상기 하이드로겔을 물에 넣어 하이드로겔이 제거되는 제3 단계를 포함하여, 수직 축상으로 신장된 로드부와, 상기 로드부의 중앙부에 형성되어 세포가 배양되는 구 형상의 스캐폴드가 나노 섬유로 구성된 구형 구조체가 제조되는 것을 다른 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 스캐폴드가 나노 섬유의 전기방사 증착으로 제작되어, 직조된 나노 섬유의 미세한 틈 사이로 세포 배양액이 충분히 투과될 수 있으며, 산소 공급 또한 용이하여 세포의 괴사가 방지될 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 3차원의 구 형상으로 스캐폴드가 구성되어 구의 크기와 나노 섬유의 조건을 통해 3차원의 일정한 크기로 규격화된 배양조건을 만족시킬 수 있는 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체를 제작하기 위한 몰드를 나타낸다.
도 3은 도 2의 몰드에 하이드로겔을 주입하여 경화된 하이드로겔이 전기방사용 로드에 형성된 모습을 나타낸다.
도 4a는 도 3의 전기방사용 로드에 하이드로겔이 다수 형성된 모습을 나타내며, 도 4b는 도 4a의 전기방사용 로드에 전기방사를 통해 나노 섬유를 증착한 모습을 나타낸다.
도 5는 린스과정을 통해 하이드로겔을 제거하여 구형 구조체를 제조한 모습을 나타낸다.
도 6은 도 2 내지 5의 과정을 통해 제조된 구형 구조체를 나타낸다.
도 7은 도 6의 구형 구조체에 3차원의 세포 배양을 수행한 모습을 나타낸다.
도 8은 도 6의 구형 구조체를 서큘레이션 상태에서 배양하는 모습을 나타낸다.
이하, 첨부된 도면들에 기재된 내용들을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 다만, 본 발명이 예시적 실시 예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 각 도면에 제시된 동일 참조부호는 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 부재를 나타낸다.
본 발명의 목적 및 효과는 하기의 설명에 의해서 자연스럽게 이해되거나 보다 분명해 질 수 있으며, 하기의 기재만으로 본 발명의 목적 및 효과가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서 본 발명과 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체(1)를 나타낸다. 도 1을 참조하면, 본 실시예에 따른 구형 구조체(1)는 수직 축상으로 신장된 로드부(10)와, 로드부(10)의 중앙부에 형성되어 세포가 배양되는 구 형상의 스캐폴드(30)를 포함하고, 스캐폴드(30)는 세포 배양액의 영양분과 산소가 내부로 투과될 수 있도록 나노 섬유로 구성될 수 있다.
3차원 세포 배양은 생체와 유사한 환경을 체외에서 인공적으로 조성하여 세포가 모든 차원에서 성장하거나 주변 환경과 상호작용할 수 있도록 허용하는 배양모델이다. 3차원 세포 배양은 세포가 모든 차원에서 성장함에 따라 크기가 불균일하게 배양되는 것이 단점으로 지적된다.
본 실시예에 따른 구형 구조체(1)는 3차원 배양 방법 중 Solid-Scaffold-in-well 방식으로 미세구조가 있는 폴리머 위에 세포를 놓으면, 세포가 미세 구조로 침투하여 3차원 구조물 내에서 증식하여 자라도록 한다. 여기서, 3차원 배양의 균일하게 배양된 세포를 얻기 위해서, 본 실시예에 따른 구조체(1)는 구형의 폐쇄된 구조의 스캐폴드를 구성한다.
구조체(1)의 구형 스캐폴드는 3차원 전방위로 세포의 배양 크기와 모양을 제한하여 세포는 스캐폴드의 형상으로 균일하게 배양될 수 있다. 여기서, 본 실시예에 따른 스캐폴드(30)는 폐쇄된 구형 구조로 제시됨에 따라 폐쇄된 스캐폴드의 내부로 배양액의 미디어와 산소의 공급이 충분히 제공되어야 하는 기술적 이슈가 생긴다. 이를 위해서, 본 실시예에 따른 스캐폴드(30)는 나노 섬유의 전기방사를 통해 증착하여 형성한다. 스캐폴드(30)의 지지체는 나노 섬유의 무작위로 전기방사 증착된 직조의 형태를 갖고, 세포는 나노 섬유의 구조물에 지지되어 세포 배양이 이루어질 수 있으며, 나노 섬유의 사이사이 공간으로 미디어와 산소의 투과가 가능하다.
본 실시예로, 스캐폴드(30)는 나노 섬유의 두께가 4㎛(오차범위 ±10%)로 형성된 것이 바람직하다. 본 실시예로, 스캐폴드(30)는 상기 나노 섬유가 600㎛(오차범위 ±10%)의 전기 방사로 증착 형성된 것이 바람직하다. 이에 따라, 스캐폴드(30)의 두께는 600㎛(오차범위 ±10%)로 형성될 수 있다. 스캐폴드(30)는 600㎛의 두께를 구성하는 4㎛의 나노 섬유가 무작위로 직조된 몸체를 갖는다.
도 1을 참조하면, 스캐폴드(30)의 단면을 확대 촬영한 모습이 함께 도시되었으며, 스캐폴드(30)의 구체가 직경 3.72㎛ 내지 4.19㎛의 두께를 갖는 나노 섬유가 무작위로 직조되어 내부에 미디어 또는 산소가 투과될 수 있는 유격 공간을 형성함을 확인할 수 있다.
본 실시예에 따른 스캐폴드(30)는 구 형상의 내측에 제1 세포의 배양과, 구 형상의 외측에 제2 세포의 배양이 가능할 수 있다. 스캐폴드(30)는 폐쇄된 구 형상의 구조로 내측과 외측을 분획한다. 스캐폴드(30)의 내측은 정형화된 규격의 세포 배양이 가능하며, 스캐폴드(30)의 외측은 일정한 크기의 배양은 어려울 수 있으나 내측과 다른 종류의 세포를 배양할 수 있다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체를 제작하기 위한 몰드(5)를 나타낸다. 도 2를 참조하면, 몰드(5)는 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체(1)의 제조를 위해 제1 축 방향으로 전기방사용 로드(510)가 통과되는 로드 홀(51)과, 로드 홀(51)의 중앙부에 구 형상의 내부공간(53)이 형성되고, 구 형상의 내부 공간(53)으로 하이드로겔이 주입되는 인렛 홀(55)이 제2 축 방향으로 형성된다.
몰드(5)를 이용한 본 실시예에 따른 구형 구조체(1)의 제조 방법 실시예는 다음과 같다.
구형 구조체(1)의 제조 방법은 구형 구조체(1)의 제조는 몰드(5)에 하이드로겔 주입기(550)를 인렛 홀(55)에 연결하여 인렛 홀(55)을 통해 하이드로겔을 주입하여 경화시키는 제1 단계; 제1 단계를 통해 전기방사용 로드(510) 상에 구 형상의 하이드로겔(7)이 경화되고, 전기방사용 로드(510)가 회전되며 나노 섬유가 경화된 하이드로겔(7)의 외주면에 전기방사되는 제2 단계; 및 제2 단계의 수행으로 나노 섬유가 구 형상으로 증착된 하이드로겔(7)을 물에 넣어 하이드로겔이 제거되는 제3 단계를 포함하여, 길이방향의 축상으로 신장된 로드부(10)와, 로드부(10)의 중앙부에 형성되어 세포가 배양되는 구 형상의 스캐폴드(30)가 나노 섬유로 구성된 구형 구조체(1)가 제조된다.
도 3은 몰드(5)에 하이드로겔을 주입하여 경화된 하이드로겔(7)이 전기방사용 로드(510)에 형성된 모습을 나타낸다. 도 3을 참조하면, 몰드(5)는 약 3cm의 길이를 갖는 규격으로 형성될 수 있다. 도 3의 몰드(5)는 횡단면으로 분할된 일 조립체를 도시하였으며, 몰드(5)는 투피스로 제작하여 전기방사용 로드(510)에 결합될 수 있다. 몰드(5)의 인렛 홀(55)을 통해 하이드로겔이 주입되며 하이드로겔(7)이 경화되면 몰드(5)를 제거하여 구 형상의 경화된 하이드로겔(7)이 전기방사용 로드(510)에 형성된다. 본 실시예에 따른 몰드(5)는 전기방사용 로드(510)에 연속적으로 다수개를 결합하여 전기방사용 로드(510)에 다수의 하이드로겔(7) 볼을 형성하여 대량 제조에 어려움이 없다.
도 4a는 도 3의 전기방사용 로드(510)에 하이드로겔(7)이 다수 형성된 모습을 나타내며, 도 4b는 도 4a의 전기방사용 로드(510)에 전기방사를 통해 나노 섬유를 증착하여 스캐폴드(30)가 형성된 모습을 나타낸다.
도 4를 참조하면, 전기방사용 로드(510)를 회전하면서 나노 섬유를 경화된 하이드로겔(7)의 외주면에 전기방사로 증착한다. 나노 섬유가 증착되면 로드(510)의 외주로 나노 섬유가 증착된 로드부(10)와, 하이드로겔(7)의 외주면으로 나노 섬유가 증착된 스캐폴드(30)가 형성된다. 증착이 완료되면, 로드부(10)를 분획하여 다수개의 구조체(1)를 획득할 수 있다. 이후, 구조체(1) 내부에 잔존된 하이드로겔(7)을 제거한다.
도 5는 린스과정을 통해 하이드로겔을 제거하여 구형 구조체(1)를 제조한 모습을 나타낸다. 구형 구조체(1)는 배양액이 담긴 별도의 배양용기에 담겨져 세포 배양을 수행할 수 있다.
도 6은 도 2 내지 5의 과정을 통해 제조된 구형 구조체(1)를 나타낸다. 세포 배양시 구형 구조체(1)의 스캐폴드(30)에 세포를 수용시킨 뒤 로드부(10)는 묶어서 폐쇄시킬 수 있다.
도 7은 도 6의 구형 구조체(1)에 3차원의 세포 배양을 수행한 모습을 나타낸다. 본 실시예에 따른 구형 구조체(1)의 스캐폴드(30) 영역에서 세포 배양이 무리없이 수행될 수 있는 것을 확인할 수 있다.
도 8은 도 6의 구형 구조체(1)를 서큘레이션 상태에서 배양하는 모습을 나타낸다. 세포 배양 모델에 따라 static 환경에서 배양이 가능할 뿐만 아니라, 로드부(10)에 서큘레이션을 연결하여 순환 환경에서도 3차원의 세포 배양이 모두 가능한 것을 확인할 수 있다.
이상에서 대표적인 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상술한 실시예에 대하여 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도 내에서 다양한 변형이 가능함을 이해할 것이다. 그러므로 본 발명의 권리 범위는 설명한 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 특허청구범위와 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태에 의하여 정해져야 한다.
1: 구형 구조체
10: 로드부
30: 스캐폴드
5: 몰드
51: 로드 홀
510: 전기방사용 로드
53: 구 형상의 내부공간
55: 인렛 홀
550: 겔 주입기
7: 하이드로겔

Claims (5)

  1. 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체에 있어서,
    수직 축상으로 신장된 로드부와, 상기 로드부의 중앙부에 형성되어 세포가 배양되는 구 형상의 스캐폴드를 포함하고,
    상기 스캐폴드는 세포 배양액의 영양분과 산소가 내부로 투과될 수 있도록 나노 섬유로 구성된 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는,
    상기 나노 섬유의 두께가 4㎛(오차범위 ±10%)로 형성된 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는,
    상기 나노 섬유가 600㎛(오차범위 ±10%)의 전기 방사로 증착 형성된 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐폴드는,
    구 형상의 내측에 제1 세포의 배양과, 구 형상의 외측에 제2 세포의 배양이 가능한 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체.
  5. 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체의 제조 방법에 있어서,
    제1 축 방향으로 전기방사용 로드가 통과되는 로드 홀과, 상기 로드 홀의 중앙부에 구 형상의 내부공간이 형성되고, 상기 구 형상의 내부 공간으로 하이드로겔이 주입되는 인렛 홀이 제2 축 방향으로 형성된 몰드에 상기 인렛 홀을 통해 하이드로겔을 주입하여 경화시키는 제1 단계;
    상기 제1 단계를 통해 상기 전기방사용 로드 상에 구 형상의 하이드로겔이 경화되고, 상기 전기방사용 로드가 회전되며 나노 섬유가 상기 경화된 하이드로겔의 외주면에 전기방사되는 제2 단계; 및
    상기 제2 단계의 수행으로 나노 섬유가 구 형상으로 증착된 상기 하이드로겔을 물에 넣어 하이드로겔이 제거되는 제3 단계를 포함하여,
    수직 축상으로 신장된 로드부와, 상기 로드부의 중앙부에 형성되어 세포가 배양되는 구 형상의 스캐폴드가 나노 섬유로 구성된 구형 구조체가 제조되는 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체의 제조 방법.

KR1020220128034A 2021-10-26 2022-10-06 3차원 세포 배양을 위한 구형 구조체 및 구형 구조체의 제조 방법 KR20230059725A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102115878B1 (ko) 2017-08-22 2020-05-27 한국생산기술연구원 3차원 세포배양을 위한 배양용기 및 이를 이용한 3차원 세포 공배양 방법

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102115878B1 (ko) 2017-08-22 2020-05-27 한국생산기술연구원 3차원 세포배양을 위한 배양용기 및 이를 이용한 3차원 세포 공배양 방법

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