KR20230042744A - 항-코넥신 항체 제제 - Google Patents

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KR20230042744A
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옌펑 장
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알라맵 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시 내용은 성상세포 또는 골세포에서 Cx43 반채널(hemichannel)의 개방과 관련된 질환 또는 병태를 치료하기 위한, 바람직하게는 염증성 질환 또는 병태 또는 척수 손상과 같은 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 약학 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

항-코넥신 항체 제제
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 7월 31일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/059,502호의 우선권 및 이익을 주장하며, 그 전체 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
2021년 7월 30일자로 생성된 "020602 SequenceListing.txt"라는 명칭의 EFS-Web을 통해 본원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일은 크기가 41,780바이트이며, 이로써 그 전체가 참고로 포함된다.
기술분야
본 개시 내용은 전반적으로 항-코넥신(Cx) 43 항체를 포함하는 안정한 수성 약학 조성물에 관한 것이다.
항체(Ab)는 표적 인식의 특이성으로 인해 다양한 질환 및 병태의 치료에 사용되어 전신 투여 후 매우 선택적인 결과를 가져왔다. 항체가 효과를 유지하려면 생산, 정제, 운송 및 보관 중에 생물학적 활성을 유지해야 한다. 다량의 고도로 정제된 단클론 항체를 생산하기 위해 새로운 생산 및 정제 기술이 개발되었다. 그러나 수송 및 보관을 위해 이들 항체를 안정화시키는 데는 여전히 문제가 존재하며, 투여에 적합한 제형으로 항체를 제공하는 데에는 훨씬 더 많은 문제가 존재한다.
변성, 응집, 오염, 및 입자 형성은 항체의 제제화 및 보관에 있어 심각한 장애물이 될 수 있다. 다양한 항체로 인해 모든 항체의 보관에 적합한 보편적인 제제나 조건은 없다. 한 항체의 보관에 적합한 최적의 제제화 및 조건은 종종 해당 항체에 특이적이다. 따라서 항체 보관 제제화 및 방법은 종종 상용 항체에 대한 연구 및 개발 과정의 중요한 부분이다.
항체 안정성과 관련된 문제를 극복하기 위해 다양한 방법이 제안되었다. 예를 들어, 일부 경우에, 항체는 종종 동결건조된 다음 투여 직전에 재구성된다. 그러나 재구성은 투여 과정에 추가 단계를 더하고 제제에 오염 물질을 도입할 수 있기 때문에 일반적으로 이상적이지 않다. 또한, 재구성된 항체라도 응집 및 입자 형성을 겪을 수 있다. 따라서, 안정한 수성 항체 제제, 특히 수송 및 보관과 관련된 문제를 극복할 수 있는 항-Cx43 항체 제제를 제공할 필요성이 존재한다.
요약
본 개시 내용은 한 측면에서
항-Cx43 항체(Ab) 또는 이의 항원 결합 단편;
완충액;
계면활성제; 및
안정제
를 포함하는 약학 제제로서,
약학 제제는 약 5 내지 약 6의 pH를 가지며;
항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
각각 서열 번호 1, 2, 및 3의 아미노산 서열을 갖는 제1, 제2, 및 제3 중쇄 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region) 서열; 및
각각 서열 번호 4, 5, 및 6의 아미노산 서열을 갖는 제1, 제2, 및 제3 경쇄 CDR 서열
을 포함하는 것인 약학 제제를 제공한다.
일부 실시 양태에서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 9-17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 FLSRPTEKTI(서열 번호 19)의 아미노산 서열 내에 위치한 에피토프에 결합한다. 일부 실시 양태에서, 에피토프는 서열 번호 19의 R4, P5, E7, K8 및 I10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 에피토프는 서열 번호 19의 R4, P5, E7, K8 및 I10 으로 이루어진다. 일부 실시 양태에서, 에피토프는 서열 번호 19의 10개의 모든 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 에피토프는 서열 번호 19의 10개의 모든 아미노산으로 이루어진다.
일부 실시 양태에서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 5 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 바람직하게는 20 mg/mL 내지 80 mg/mL, 보다 바람직하게는 약 40 mg/mL 내지 60 mg/mL의 농도로 존재한다.
일부 특정 실시 양태에서, 완충액은 아세테이트/아세트산나트륨, 히스티딘/아스파르트산, 시트르산/시트르산나트륨, 제2인산나트륨/인산이수소나트륨, 및 히스티딘/히스티딘 염산염으로부터 선택된다. 특정 실시 양태에서, 완충액은 히스티딘/아스파르트산 또는 히스티딘/히스티딘 염산염이다. 특정 실시 양태에서, 완충액은 히스티딘/히스티딘 염산염이다.
일부 실시 양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80(PS80)이다.
특정 실시 양태에서, 안정제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 염화나트륨, 소르비톨, 글리신 및 수크로오스로부터 선택된다. 특정 실시 양태에서, 안정제는 수크로오스이다.
특정 실시 양태에서, 제제의 pH는 약 5.4 내지 약 5.6이다.
일부 실시 양태에서, 제제는 수성 제제다. 일부 실시 양태에서, 제제는 안정한 수성 제제다.
또 다른 측면은
약 40-60 mg/mL, 바람직하게는 약 50 mg/mL의 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
약 10-40 mM, 바람직하게는 약 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 완충액;
약 0.005%-0.05%, 바람직하게는 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및
약 1%-20% w/v, 바람직하게는 약 8% w/v 수크로오스
를 포함하는 약학 제제로서,
약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는, 약학 제제에 관한 것이다.
추가 측면은
서열 번호 9-17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하고, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 약 50 mg/mL 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
약 20 mM 히스티딘/아스파르트산 완충액;
약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및
약 8% w/v 수크로오스
를 포함하는 약학 제제로서,
약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는, 약학 제제에 관한 것이다.
본원에 개시된 약학 제제 중 어느 하나를 포함하는 키트 및/또는 단위 투여량이 또한 제공된다.
또한, 본원은 성상세포 또는 골세포에서 Cx43 반채널(hemichannel)의 개방을 억제하기 위한, 바람직하게는 염증성 질환 또는 병태 또는 척수 손상과 같은 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한, 본원에 개시된 약학 제제 중 어느 하나의 용도를 제공한다.
추가로 세포에서 Cx43 반채널의 개방을 억제하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 개시된 약학 제제 중 어느 하나를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, 방법은 염증성 질환 또는 병태 또는 척수 손상과 같은 신경퇴행성 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
특허 또는 출원 파일에는 컬러로 작성된 하나 이상의 도면이 포함되어 있다. 컬러 도면(들)이 포함된 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불 시 특허청에서 제공될 것이다.
도 1: 항-Cx43 Ab pH/완충액 스크리닝 연구의 MicroCal DSC 써모그램 오버레이.
도 2: pH/완충액 스크리닝 연구의 25±2℃(좌측) 및 40±2℃(우측)에서의 SEC-주요 피크 % 비교.
도 3: pH/완충액 스크리닝 연구의 25±2℃(좌측) 및 40±2℃(우측)에서의 cIEF 주요 피크 % 비교.
도 4: pH/완충액 스크리닝 연구의 25±2℃(좌측) 및 40±2℃(우측)에서의 비환원 SDS-Caliper 순도 % 비교.
도 5: pH/완충액 스크리닝 연구의 25±2℃(좌측) 및 40±2℃(우측)에서의 환원 SDS-Caliper 순도 % 비교.
도 6: 동결/해동 연구의 SEC-HPLC 주요 피크 % 비교.
도 7: 동결/해동 연구의 cIEF 주요 피크 %의 비교.
도 8: 동결/해동 연구의 비환원 SDS-Caliper(좌측) 및 환원 SDS-Caliper(우측)에서의 순도 % 비교.
도 9: 교반 연구의 SEC-HPLC 주요 피크 % 비교.
도 10: 교반 연구의 cIEF 주요 피크 %의 비교.
도 11: 교반 연구의 비환원 SDS-Caliper(좌측) 및 환원 SDS-Caliper(우측)에서의 순도 % 비교.
도 12: 2~8℃(좌측), 25±2℃(중간) 및 40±2℃(우측)에서의 SEC-주요 피크 % 비교.
도 13: 2~8℃(좌측), 25±2℃(중간) 및 40±2℃(우측)에서의 cIEF 주요 피크 % 비교.
도 14: 2~8℃(좌측), 25±2℃(중간) 및 40±2℃(우측)에서의 비환원 SDS-Caliper 순도 % 비교.
도 15: 2~8℃(좌측), 25±2℃(중간) 및 40±2℃(우측)에서의 환원 SDS-Caliper 순도 % 비교.
도 16: 항-Cx43 Ab 제제 확인 연구의 MicroCal DSC 써모그램 오버레이.
일부 실시 양태에서, 항-Cx43 항체의 안정한 수성 약학 제제가 본원에 개시된다. 이러한 제제는 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 완충액, 계면활성제, 및 안정제를 포함할 수 있다. 약학 제제는 약 5 내지 약 6, 또는 약 5.4-5.6, 또는 약 5.5의 pH를 가질 수 있다.
일부 실시 양태에서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 1, 2, 및 3의 아미노산 서열을 갖는 제1, 제2, 및 제3 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 서열; 및/또는 각각 서열 번호 4, 5, 및 6의 아미노산 서열을 갖는 제1, 제2, 및 제3 경쇄 CDR 서열을 가질 수 있다.
일부 실시 양태에서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 가질 수 있다.
특정 실시 양태에서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 9-17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 FLSRPTEKTI(서열 번호 19)의 아미노산 서열 내에 위치한 에피토프에 결합한다.
다양한 실시 양태에서, 본원에 개시된 제제는 예정된 온도(예를 들어, -40℃ 또는 -20℃ 또는 2-8℃의 냉장 온도)에서 일정 기간, 예를 들어 최소 3개월, 최소 6개월, 최소 1년, 또는 최대 3년 동안 관찰된 유의한 변화(예컨대, 외관, 항체 농도, pH, 항체 응집, 및 항체 순도)를 나타내지 않도록 개선된 안정성을 가질 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 하기 참고 문헌은 본 개시 내용에서 사용된 많은 용어의 일반적인 정의를 숙련자에게 제공한다: Academic Press Dictionary of Science and Technology, Morris (Ed.), Academic Press (1st ed., 1992); Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (Eds.), Oxford University Press (개정판, 2000); Encyclopaedic Dictionary of Chemistry, Kumar (Ed.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley & Sons (3rd ed., 2002); Dictionary of Chemistry, Hunt (Ed.), Routledge (1st ed., 1999); Dictionary of Pharmaceutical Medicine, Nahler (Ed.), Springer-Verlag Telos (1994); Dictionary of Organic Chemistry, Kumar and Anandand (Eds.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002); 및 A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4th ed., 2000). 본 개시 내용에 구체적으로 적용되는 이들 용어 중 일부에 대한 추가적인 설명이 본원에 제공된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 이상, 예를 들어 적어도 하나를 지칭한다. 본원에서 "포함하는(comprising)"이라는 용어와 함께 사용될 때 "a" 또는 "an"이라는 단어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와도 일치한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 특성 또는 정밀도를 고려할 때 측정된 양에 대해 허용 가능한 오차 정도를 의미한다. 예시적인 오류 정도는 주어진 값 범위의 20 퍼센트(%) 이내, 일반적으로 10% 이내, 보다 일반적으로 5% 이내이다. 용어 "실질적으로"는 50% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 가장 바람직하게는 90% 또는 95% 초과를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 주어진 실시 양태에 존재하지만 불특정 요소를 포함할 수 있는 조성물, 방법, 및 이들의 각각의 구성요소(들)와 관련하여 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "본질적으로 이루어진"이라는 용어는 주어진 실시 양태에 필요한 요소를 나타낸다. 이 용어는 본 개시 내용의 해당 실시 양태의 기본적이고 새로운 또는 기능적 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 요소의 존재를 허용한다.
용어 "이루어진"은 본원에 기술된 조성물, 방법, 및 이들의 각각의 구성요소를 나타내며, 이는 실시 양태의 기술에 언급되지 않은 임의의 요소를 배제한다.
"항-Cx43 항체"는 Cx43(예를 들어, 이의 세포 외 도메인)에 면역특이적으로 결합하는 항체이다. 항체는 단리된 항체일 수 있다. Cx43에 대한 이러한 결합은 예를 들어 1 μM 이하, 100 nM 이하 또는 50 nM 이하의 값을 갖는 KD를 나타낸다. KD는 표면 플라스몬 공명 분석 또는 세포 결합 분석과 같은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 항-Cx43 항체는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 항체는 2020년 2월 4일자로 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US2020/016606에 개시된 것일 수 있으며, 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "항체"는 표적 에피토프에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 단백질이다. 용어 항체는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 분자, 단일 중쇄 가변 도메인 항체, 및 단클론 및 단일 중쇄 가변 도메인 항체의 키메라 변이체를 포함하는 이들의 변이체 및 유도체를 포함하는 단클론 항체를 포함한다. 결합 도메인은 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 실질적으로 코딩되며, 여기서 단백질은 항원에 면역특이적으로 결합한다. 인식되는 면역글로불린 유전자에는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자, 뿐만 아니라 수많은 면역글로불린 가변 영역 유전자가 포함된다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 차례로 각각 면역글로불린 클래스인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다. 인간과 쥐과 종을 포함한 대부분의 척추동물의 경우, 전형적인 면역글로불린 구조 단위는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성된 테트라머를 포함하며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kD)와 하나의 "중쇄"(약 50-70 kD)을 갖는다. "VL" 및 VH"는 각각 이들 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. "CL" 및 CH"는 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인을 지칭한다. VL 및 VH에 각각 3개가 있는 β-가닥의 루프는 항원에 대한 결합을 담당하며, "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭된다. "Fab"(단편, 항원 결합) 영역은 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄, 즉 VL, CL, VH 및 CH1로부터의 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인을 포함한다.
항체에는 온전한 면역글로불린뿐만 아니라 이의 항원 결합 단편을 포함된다. 용어 "항원 결합 단편"은 항원에 결합하거나 항원 결합(즉, 특이적 결합)을 위해 온전한 항체(즉, 이들이 유래된 온전한 항체)와 경쟁하는 항체의 폴리펩티드 단편을 지칭한다. 항원 결합 단편은 당 업계에 잘 알려진 재조합 또는 생화학적 방법에 의해 생성될 수 있다. 예시적인 항원 결합 단편은 Fv, Fab, Fab', (Fab')2, CDR, 파라토프, 및 단일 사슬 Fv 항체(scFv)를 포함하며, 여기서 VH 및 VL 사슬은 (직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해) 서로 연결되어 연속적인 폴리펩티드를 형성한다.
항체에는 또한 변이체, 키메라 항체 및 인간화 항체가 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "항체 변이체"는 중쇄 및/또는 경쇄에서 단일 또는 다중 돌연변이를 갖는 항체를 지칭한다. 일부 실시 양태에서, 돌연변이는 가변 영역에 존재한다. 일부 실시 양태에서, 돌연변이는 불변 영역에 존재한다. "키메라 항체"는 중쇄 및 경쇄 각각의 아미노산 서열의 한 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 상동인 반면, 사슬의 나머지 세그먼트는 또 다른 것에서 상응하는 서열과 상동이다. 전형적으로, 이들 키메라 항체에서, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은 포유동물의 한 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 부분은 또 다른 종으로부터 유래된 항체의 서열과 상동이다. 이러한 키메라 형태에 대한 하나의 명백한 이점은, 예를 들어 가변 영역이 예를 들어 인간 세포 제제로부터 유래된 불변 영역과 조합된 비인간 숙주 유기체로부터의 쉽게 이용 가능한 하이브리도마 또는 B 세포를 사용하여 현재 공지된 공급원으로부터 편리하게 유래될 수 있다는 것이다. 가변 영역은 제조가 용이하다는 장점이 있고, 특이성이 그 공급원에 의해 영향을 받지 않는 반면, 인간인 불변 영역은 항체를 주입할 때 비-인간 공급원으로부터의 불변 영역보다 인간 대상체로부터 면역 반응을 유도할 가능성이 적다. 그러나 정의는 이 특정 예에 제한되지는 않는다. "인간화" 항체는 비-인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래된 항원 결합 부위 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한 분자의 나머지 면역글로불린 구조를 갖는 분자를 지칭한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인에 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인의 적절한 프레임워크 영역에 이식된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형이거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있으며, 예를 들어 인간 면역글로불린과 더 유사하게 변형될 수 있다. 일부 형태의 인간화 항체는 모든 CDR 서열을 보존한다(예를 들어, 마우스 항체의 6개 CDR을 모두 포함하는 인간화 마우스 항체). 다른 형태의 인간화 항체는 원래 항체와 관련하여 변경된 하나 이상의 CDR(1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)을 가지며, 이는 하나 이상의 CDR로부터 "유래된" 하나 이상의 CDR이라고도 한다.
본원에 기술된 바와 같이, 항체의 아미노산 잔기는 Kabat의 일반 넘버링 (Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition. Public Health Service, NIH, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재)에 따라 넘버링될 수 있다.
항체와 표적으로서 Cx43의 에피토프 사이의 결합과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "결합"은 분자 사이의 비공유적 상호작용의 과정을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 결합은 특이적이다. 항체의 특이성은 친화도에 기초하여 결정될 수 있다. 특이적 항체는 10-7M 미만, 바람직하게는 10-8M 미만의 에피토프에 대한 결합 친화도 또는 해리 상수 KD를 가질 수 있다.
용어 "항원"은 항체와 같은 선택적 결합제에 의해 결합될 수 있고 추가로 동물에서 해당 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정인자, 바람직하게는 폴리펩티드 결정인자를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹화를 포함하고, 특정 실시 양태에서 특정 3차원 구조적 특성, 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 한 실시 양태에서, 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 특정 실시 양태에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 그의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. 에피토프 맵핑을 위한 방법은 X선 공결정학, 어레이 기반 올리고-펩티드 스캐닝, 부위 지정 돌연변이유발, 고처리량 돌연변이유발 맵핑 및 수소-중수소 교환과 같이 당 업계에 잘 알려져 있다. 에피토프는 인접한 아미노산 또는 단백질의 3차 폴딩(folding)에 의해 병치되는 비연속적인 아미노산 모두로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매에 노출 시 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매로 처리하면 소실된다. 에피토프는 전형적으로 고유한 공간 형태로 적어도 3개, 더 일반적으로는 적어도 5개 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.
용어 "대상체" 또는 "환자"는 예방적 또는 치료적 조치를 받는 인간 또는 다른 포유동물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"라는 용어는 본원에 기재된 것과 같은 치료적 또는 예방적 조치를 지칭한다. "치료"의 방법은 염증성 질환 또는 병태 또는 신경퇴행성 질환을 예방, 치유, 지연시키거나, 그의 중증도를 감소시키거나, 그의 하나 이상의 증상을 개선하기 위해서, 또는 그러한 치료가 없을 때 예상되는 것 이상으로 환자의 생존을 연장하기 위해 본원에 제공된 Cx43 리간드를 환자, 예를 들어 염증성 질환 또는 병태 또는 신경퇴행성 질환을 앓는 환자에게 투여하는 것을 이용한다. "치료"의 방법은 또한 그러한 치료가 없을 때 예상되는 것 이상으로 환자에게 요법을 제공하기 위해서 본원에 제공된 Cx43 리간드(예를 들어, 항체)를 환자에게 투여하는 것을 이용한다.
"염증성 질환"이라는 용어는 염증을 특징으로 하는 다양한 장애 및 병태를 지칭한다. 예로는 관절염, 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 복강 질환, 사구체신염, 간염, 염증성 장 질환(크론병 및 궤양성 대장염 포함), 재관류 손상 및 이식 거부가 포함된다.
"자가면역 질환"이라는 용어는 면역계가 자신의 단백질, 세포, 및 조직을 공격하거나, 면역 이펙터 T 세포가 내인성 자가 펩티드에 자가 반응하여 조직 파괴를 일으키는 질환을 광범위하게 지칭한다. 자가면역 질환에는 류마티스성 관절염, 크론병, 제1형 당뇨병, 탈모증, 다발성 경화증, 루푸스, 전신성 홍반성 루푸스(SLE: systemic lupus erythematosus), 자가면역 뇌척수염, 중증 근무력증(MG: myasthenia gr), 하시모토 갑상선염, 굿파스처 증후군, 천포창(예를 들어, 심상성 천포창), 그레이브스병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소성 자반병, 항콜라겐 항체 동반 경피증, 혼합 결합 조직병, 다발성근염, 악성 빈혈, 특발성 애디슨병, 자가면역 관련 불임, 사구체신염(예를 들어, 초승달 사구체신염, 증식성 사구체신염), 수포성 유천포창, 쇼그렌 증후군, 인슐린 저항성, 및 자가면역 당뇨병이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
용어 "신경퇴행성 질환"은 뉴런의 구조 및/또는 기능의 점진적 손실을 특징으로 하는 질환을 광범위하게 지칭한다. 신경퇴행성 질환에는 알츠하이머병(AD: Alzheimer's disease), 리소좀 축적 장애, 세균성 수막염, 근위축성 측삭 경화증, 저산소증, 허혈, 녹내장, 정신분열증, 주요 우울증, 양극성 장애, 간질, 외상성 뇌 손상, 외상 후 스트레스 장애, 파킨슨병, 다운 증후군, 척수소뇌 운동실조증, 헌팅턴병, 방사선 요법 유발 신경변성, 만성 스트레스 유발 신경변성, 및 정상적인 노화 또는 신경활성 약물(예컨대, 알코올, 아편류, 메스암페타민, 펜시클리딘, 코카인 등)의 남용과 관련된 신경변성이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 Cx43 리간드, 예를 들어 항-Cx43 항체와 같은 작용제의 양으로서 환자에게 투여하였을 때 질환의 치료, 예후 또는 진단을 수행하기에 충분한 양을 지칭한다. 치료 유효량은 치료되는 환자 및 질환 상태, 환자의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등에 따라 달라질 것이며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여를 위한 투여량은 예를 들어 약 1 ng 내지 약 10,000 mg, 약 5 ng 내지 약 9,500 mg, 약 10 ng 내지 약 9,000 mg, 약 20 ng 내지 약 8,500 mg, 약 30 ng 내지 약 7,500 mg, 약 40 ng 내지 약 7,000 mg, 약 50 ng 내지 약 6,500 mg, 약 100 ng 내지 약 6,000 mg, 약 200 ng 내지 약 5,500 mg, 약 300 ng 내지 약 5,000 mg, 약 400 ng 내지 약 4,500 mg, 약 500 ng 내지 약 4,000 mg, 약 1 μg 내지 약 3,500 mg, 약 5 μg 내지 약 3,000 mg, 약 10 μg 내지 약 2,600 mg, 약 20 μg 내지 약 2,575 mg, 약 30 μg 내지 약 2,550 mg, 약 40 μg 내지 약 2,500 mg, 약 50 μg 내지 약 2,475 mg, 약 100 μg 내지 약 2,450 mg, 약 200 μg 내지 약 2,425 mg, 약 300 μg 내지 약 2,000, 약 400 μg 내지 약 1,175 mg, 약 500 μg 내지 약 1,150 mg, 약 0.5 mg 내지 약 1,125 mg, 약 1 mg 내지 약 1,100 mg, 약 1.25 mg 내지 약 1,075 mg, 약 1.5 mg 내지 약 1,050 mg, 약 2.0 mg 내지 약 1,025 mg, 약 2.5 mg 내지 약 1,000 mg, 약 3.0 mg 내지 약 975 mg, 약 3.5 mg 내지 약 950 mg, 약 4.0 mg 내지 약 925 mg, 약 4.5 mg 내지 약 900 mg, 약 5 mg 내지 약 875 mg, 약 10 mg 내지 약 850 mg, 약 20 mg 내지 약 825 mg, 약 30 mg 내지 약 800 mg, 약 40 mg 내지 약 775 mg, 약 50 mg 내지 약 750 mg, 약 100 mg 내지 약 725 mg, 약 200 mg 내지 약 700 mg, 약 300 mg 내지 약 675 mg, 약 400 mg 내지 약 650 mg, 약 500 mg, 또는 약 525 mg 내지 약 625 mg의 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 범위일 수 있다. 투여는 예를 들어 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다 또는 6주마다 이루어질 수 있다. 투여 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 유효량은 또한 작용제의 임의의 독성 또는 해로운 효과(부작용)가 최소화되고/거나 유익한 효과에 의해 능가되는 양이다. 투여는 정확히 또는 매주 약 6 mg/kg 또는 12 mg/kg, 또는 격주 12 mg/kg 또는 24 mg/kg으로 정맥 내 투여될 수 있다. 추가 투여 요법은 아래에 설명되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "제제"는 이를 필요로 하는 환자에게 비경구 투여(정맥 내, 근육 내, 또는 피하를 포함하지만 이에 제한되지 않음)에 적합한 생물학적 활성 단백질(예를 들어, 항체)과 같은 약학 활성 약물의 조성물이며 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제, 및 연방 의약청 또는 기타 외국 국가 기관에서 안전하다고 간주하는 기타 첨가제만을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "액체 제제" 및 "수성 제제"라는 어구는 적합한 용매에 용해된 하나 이상의 부형제(예를 들어, 화학 첨가제)와 함께 생물약제를 함유하는 용액 또는 액체 제제를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
"안정한" 제제는 일정 기간 동안, 예를 들어 최소 3개월, 최소 6개월, 최소 1년, 또는 최대 3년 동안 예정된 온도(예를 들어, 40℃또는 -20℃ 또는 2-8℃의 냉장 온도)에서 관찰되는 유의한 변화가 없는 약학 제제이다. 본원에 개시된 제제의 안정성은 하기 기준 중 하나 이상을 사용하여 평가할 수 있다: 1) 수성 제제는 육안 분석에 의해 무색이거나 투명 내지 약간 유백색이다; 2) 단백질 함량이 초기 농도로부터 +/- 5 mg/mL 이내로 유지된다; 3) pH는 목표 pH로부터 +/- 0.5 pH 단위 내에서 유지된다; 4) SEC에 의한 단량체의 퍼센트는 ≥95%이고; 5) CE-SDS에 의해 측정된 순도는 ≥90%이고 ELISA에 기초한 상대 효력은 60-150% 이내이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부형제"는 치료적으로 불활성인 물질을 의미하는 것으로 의도된다. 부형제는 예를 들어 완충액, 안정제, 긴장성 작용제, 계면활성제, 항산화제, 동결 방지제 또는 희석제와 같이 다양한 목적을 위해 제제에 포함된다.
적합한 부형제는 만니톨 또는 소르비톨과 같은 폴리올(당 알코올로도 알려짐), 수크로오스, 락토오스 또는 덱스트로오스와 같은 당, NaCl, KCl 또는 인산칼슘과 같은 염, 예를 들어 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 또는 글루탐산과 같은 아미노산, 계면활성제 및 물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 부형제의 순도는 공정서 표준(예를 들어, USP, EP, JP)을 충족해야 하며 인간에 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주사하기에 충분한 순도여야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "완충액" 또는 "완충제"는 약학 제제의 pH를 안정화시키는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 지칭한다. 적합한 완충액은 당업계에 잘 알려져 있으며 문헌에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 시트레이트 염, 아세테이트 염, 히스티딘 염, 숙시네이트 염, 말레이트 염, 포스페이트 염 또는 락테이트 염, 및/또는 이들 각각의 유리 산 또는 염기, 뿐만 아니라 이들의 다양한 염 및/또는 산 및 염기의 혼합물이 사용될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 약학적으로 허용 가능한 완충액은 히스티딘 완충액, 시트레이트 완충액, 숙시네이트 완충액, 아세테이트 완충액 및 포스페이트 완충액을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시 양태에서, 완충액은 아세테이트 완충액, 예를 들어 아세트산나트륨 완충액이다. 다른 특정 완충액은 히스티딘 완충액, 즉 완충제로서 히스티딘, 일반적으로 L-히스티딘을 갖는 완충액이다. 특정 완충액은 L-히스티딘 또는 L-히스티딘과 L-히스티딘 히드로클로라이드의 혼합물을 포함하고 염산으로 pH 조정을 달성하는 L-히스티딘/HCl 완충액이다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 완충제를 기술하기 위해 사용될 때 용어 "L-히스티딘"은 L-히스티딘/HCl 완충액을 지칭한다. L-히스티딘/HCl 완충액은 적당량의 L-히스티딘 및 L-히스티딘 염산염을 물에 용해시키거나, 적당량의 L-히스티딘을 물에 용해시키고 염산을 첨가하여 pH를 원하는 값으로 조정함으로써 제조될 수 있다. 상기 완충액은 일반적으로 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 15 내지 30 mM 또는 20 mM의 농도로 사용된다. 사용된 완충액에 상관없이, 당 업계에 공지된 산 또는 염기, 예를 들어, 염산, 아세트산, 인산, 황산 및 시트르산, 수산화나트륨 및 수산화칼륨을 사용하여 pH를 약 4.0 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 6.0, 약 5.4 내지 약 5.6, 또는 약 5.5 범위의 값으로 조정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "계면활성제"는 약학적으로 허용 가능한 표면 활성제를 의미한다. 특정 실시 양태에서, 비이온성 계면활성제가 사용된다. 약학적으로 허용 가능한 계면활성제의 예는 폴리옥시에틸렌-소르비탄 지방산 에스테르(Tween), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(Brij), 알킬페닐폴리옥시에틸렌 에테르(Triton X), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(Poloxamer, Pluronic), 및 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시 양태에서, 폴리옥시에틸렌-소르비탄 지방산 에스테르는 폴리소르베이트 20(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 상표 Tween 20™으로 판매됨) 및 폴리소르베이트 80(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 상표 Tween 80™으로 판매됨)이다. 특정 실시 양태에서, 폴리에틸렌-폴리프로필렌 공중합체는 Pluronic® F68 또는 Poloxamer 188™이라는 이름으로 판매되는 것들이다. 특정 실시 양태에서, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 Brij™ 상표로 판매되는 것들이다. 특정 실시 양태에서, 알킬페닐폴리옥시에틸렌 에테르는 상표명 Triton X, 예를 들어 p-tert-옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올(상표명 Triton X-100™으로 판매됨)으로 판매된다. 폴리소르베이트 20(Tween 20™) 및 폴리소르베이트 80(Tween 80™)이 사용될 때, 이들은 일반적으로 약 0.001 내지 약 1%, 약 0.01 내지 약 0.1% 또는 약 0.02% 내지 약 0.05%의 농도 범위로 사용된다. 본 개시 내용의 제제에서, 계면활성제의 농도는 중량/부피(w/v)로 표현되는 백분율로 기술된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "안정제"는 제조, 보관 및 적용 동안 화학적 및/또는 물리적 분해로부터 활성 약학 성분 및/또는 제제를 보호하는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 나타낸다. 안정제는 당류, 아미노산, 폴리올, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 덱스트란, 글리세롤, 아라비톨, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 시클로덱스트린, 예를 들어 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 설포부틸에틸-β-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, 폴리에틸렌글리콜, 예를 들어 PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000, PEG 6000, 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민(HSA), 소 혈청 알부민(BSA), 염, 예를 들어 염화나트륨, 염화마그네슘, 염화칼슘, 킬레이트제, 예를 들어 이하 정의되는 EDTA를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 상기에서 언급한 바와 같이, 안정제는 약 1 내지 약 500 mM의 양으로, 약 10 내지 약 300 mM의 양으로 또는 약 120 mM 내지 약 300 mM의 양으로 제제에 존재할 수 있다. 동일 군 또는 상이한 군으로부터 선택된 하나 이상의 안정제가 제제에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "당류"는 단당류 및 올리고당류를 포함한다. 단당류는 산에 의해 가수분해되지 않는 단순 당 및 그의 유도체, 예를 들어 아미노당을 포함하는 단량체 탄수화물이다. 당류는 일반적으로 D 형태이다. 단당류의 예는 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 만노오스, 소르보오스, 리보오스, 데옥시리보오스, 뉴라민산을 포함한다. 올리고당류는 분지형 또는 선형 사슬의 글리코시드 결합(들)을 통해 연결된 하나 초과의 단량체 당류 단위로 이루어진 탄수화물이다. 올리고당류 내의 단량체 당류 단위는 동일하거나 상이할 수 있다. 단량체 당류 단위의 수에 따라 올리고당류는 디-, 트리-, 테트라-, 펜타- 등의 당류이다. 다당류와 대조적으로 단당류와 올리고당류는 수용성이다. 올리고당류의 예는 수크로오스, 트레할로오스, 락토오스, 말토오스 및 라피노오스를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 당류는 수크로오스 및 트레할로오스(즉, α,α-D-트레할로스), 예를 들어 수크로오스이다. 트레할로오스는 트레할로오스 이수화물로 입수할 수 있다. 당류는 약 100 내지 약 500 mM의 양으로, 약 200 내지 약 300 mM의 양으로 또는 약 240 mM의 양으로 제제에 존재할 수 있다.
안정제 내의 하위군은 동결건조 보호제이다. 용어 "동결건조 보호제"는 동결건조 공정, 후속 보관 및 재구성 동안 불안정한 활성 성분(예를 들어, 단백질)을 불안정한 조건으로부터 보호하는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 나타낸다. 동결건조 보호제는 당류, 폴리올(예를 들어, 당 알코올) 및 아미노산으로 이루어진 군을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시 양태에서, 동결건조 보호제는 수크로오스, 트레할로오스, 락토오스, 글루코오스, 만노오스, 말토오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 소르보오스, 라피노오스, 뉴라민산과 같은 당류, 글루코사민, 갈락토사민, N-메틸글루코사민("메글루민")과 같은 아미노당, 만니톨 및 소르비톨과 같은 폴리올, 및 아르기닌 및 글리신과 같은 아미노산 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 동결건조 보호제는 일반적으로 약 10 내지 500 mM의 양으로, 약 10 내지 약 300 mM의 양으로 또는 약 100 내지 약 300 mM의 양으로 사용된다.
안정제 내의 또 다른 하위군은 항산화제이다. 용어 "항산화제"는 활성 약학 성분의 산화를 방지하는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 나타낸다. 항산화제는 아스코르브산, 글루타티온, 시스테인, 메티오닌, 시트르산, EDTA를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 항산화제는 약 0.01 내지 약 100 mM의 양으로, 약 5 내지 약 50 mM의 양으로 또는 약 5 내지 약 25 mM의 양으로 사용될 수 있다.
본 개시 내용에 따른 제제는 또한 하나 이상의 긴장성 작용제를 포함할 수 있다. 용어 "긴장성 작용제"는 제제의 긴장성을 조절하기 위해 사용되는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 나타낸다. 제제는 저장성, 등장성 또는 고장성일 수 있다. 등장성은 일반적으로 용액의 삼투압과 관련이 있으며, 일반적으로 인간 혈청의 삼투압과 관련이 있다(약 250-350 mOsmol/kg). 본 발명에 따른 제제는 저장성, 등장성 또는 고장성일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 제제는 등장성이다. 등장성 제제는 액체 또는 고체 형태, 예를 들어 동결건조된 형태로부터 재구성된 액체이며, 생리식염수 및 혈청과 같이 비교 대상이 되는 어떤 다른 용액과 동일한 긴장성을 갖는 용액을 나타낸다. 적합한 긴장성 작용제는 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린 및 아미노산 또는 당의 군으로부터의 임의의 성분, 특히 글루코오스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다는. 긴장성 작용제는 일반적으로 약 5 mM 내지 약 500 mM의 양으로 사용된다.
안정제와 긴장성 작용제 내에는 두 가지 방식으로 기능을 할 수 있는 화합물 군이 있다. 즉, 동시에 안정제와 긴장성 작용제가 될 수 있다. 그 예는 당, 아미노산, 폴리올, 시클로덱스트린, 폴리에틸렌글리콜 및 염의 군에서 찾을 수 있다. 동시에 안정제 및 긴장성 작용제가 될 수 있는 당의 예는 트레할로오스이다.
단백질의 "등전점" 또는 "pI"는 단백질의 전체 순 전하가 0인 pH, 즉 단백질이 동일한 수의 양전하와 음전하를 갖는 pH이다. 임의의 주어진 단백질에 대한 pI는 예를 들어 등전점 전기영동과 같은 잘 확립된 기술에 따라 결정될 수 있다. 등전점 전기영동은 등전점(pI)의 차이로 서로 다른 분자를 분리하는 기술이다. 이는 관심 분자의 전체 전하가 주변 pH의 함수라는 사실을 이용하는 겔에서 단백질에 일반적으로 수행되는 영역 전기영동의 한 유형이다.
본 발명의 다양한 측면이 아래에서 더 상세히 설명된다. 추가 정의는 명세서 전반에 걸쳐 제시된다.
약학 제제
일부 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 바와 같은 항-Cx43 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 항-Cx43 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 1, 2, 및 3의 아미노산 서열을 갖는 제1, 제2, 및 제3 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 서열; 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 6의 아미노산 서열을 갖는 제1, 제2, 및 제3 경쇄 CDR 서열을 가질 수 있다.
일부 실시 양태에서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 9-17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 FLSRPTEKTI(서열 번호 19)의 아미노산 서열 내에 위치한 에피토프에 결합한다.
다양한 실시 양태에서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약학적으로 허용 가능한 양으로 및 약학적으로 허용 가능한 조성물로 제제화될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한"은 일반적으로 안전하고, 비독성이며, 생물학적으로나 달리 바람직하지 않지 않은 약학 조성물을 제조하는 데 유용한 것을 지칭하며, 수의학적 용도 및 인간의 약학 용도에 허용되는 것을 포함한다. "약학으로 허용 가능한 액체 담체"의 예는 물 및 유기 용매를 포함한다. 바람직한 약학적으로 허용 가능한 수성 액체는 PBS, 식염수, 및 덱스트로스 용액 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 본원에 개시된 화합물의 임의의 약학적으로 허용 가능한 염을 의미한다. 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 타당한 의학적 판단의 범위 내에 있고 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 것을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 염은 당 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 염은 문헌[Berge et al., J. Pharmaceutical Sciences 66:1-19, 1977 ㅁ및 Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, (Eds. P. H. Stahl and C. G. Wermuth), Wiley-VCH, 2008]에 기술되어 있다. 염은 본원에 기술된 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 제자리에서 또는 유리 염기 기를 적합한 유기산과 반응시켜 별도로 제조할 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제의 선택을 용이하게 하기 위해 다양한 참고 문헌이 이용 가능하다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984); Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner, Wang, W., Int. J. Pharm. 185:129-188 (1999) and Wang, W., Int. J. Pharm. 203:1-60 (2000), 및 Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.]을 참조한다.
일부 실시 양태에서, 항체 제제는 완충액(예를 들어, 히스티딘, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충액), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트) 및/또는 안정제(예를 들어, 수크로오스) 등을 포함할 수 있다. 일부 특정 실시 양태에서, 완충액은 아세테이트/아세트산나트륨, 히스티딘/아스파르트산, 시트르산/시트르산나트륨, 제2인산나트륨/인산이수소나트륨, 및 히스티딘/히스티딘 염산염으로부터 선택할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 완충액은 히스티딘/아스파르트산 또는 히스티딘/히스티딘 염산염이다. 특정 실시 양태에서, 완충액은 히스티딘/히스티딘 염산염이다. 일부 실시 양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80(PS80)이다. 특정 실시 양태에서, 안정제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 염화나트륨, 소르비톨, 글리신 및 수크로오스로부터 선택된다. 특정 실시 양태에서, 안정제는 수크로오스다.
일부 실시 양태에서, 항체 제제는 예를 들어 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 포스페이트와 같은 완충 물질, 수크로오스, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이드 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 항체 제제는 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트, 소듐 도데실 설페이트, 및 비이온성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시 내용에 따른 제제는 액체 형태, 동결건조 형태 또는 동결건조 형태로부터 재구성된 액체 형태일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 제제는 액체 형태이다. 본 개시 내용에 따른 제제와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "액체"는 대기압하에 적어도 약 2 내지 약 8℃의 온도에서 액체인 제제를 나타낸다. 본 개시 내용에 따른 제제와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "동결건조된"은 그 자체로 당 업계에 공지된 동결 건조 방법에 의해 제조되는 제제를 나타낸다. 용매(예를 들어, 물)는 진공 하에서 동결한 후 얼음을 승화시킨 다음 고온에서 잔류 수분을 탈착시켜 제거한다. 동결건조물은 일반적으로 약 0.1 내지 5%(w/w)의 잔류 수분을 가지며 분말 또는 물리적으로 안정한 케이크로 존재한다. 동결건조물은 재구성 매질을 첨가한 후 빠른 용해가 특징이다.
본 개시 내용에 따른 제제와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "재구성된 형태"는 동결건조되고 재구성 매질의 첨가에 의해 재용해되는 제제를 나타낸다. 적합한 재구성 매질은 주사용수(WFI), 정균 주사용수(BWFI), 염화나트륨 용액(예를 들어, 0.9%(w/v) NaCl), 포도당 용액(예를 들어, 5% 포도당), 계면활성제 함유 용액(예를 들어, 0.02% 폴리소르베이트 80), pH 완충 용액(예를 들어, 포스페이트 완충 용액)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 개시 내용에 따른 제제는 생리학적으로 잘 견디고, 용이하게 제조될 수 있고, 정확하게 분배될 수 있고, 보관 기간에 걸쳐, 반복된 동결 및 해동 주기 동안, 및 기계적 스트레스에 대해 분해 생성물 및 응집체에 대해 안정하다. 1년 이상의 기간 동안에 걸쳐 온도(예를 들어, -40℃ 또는 -20℃ 또는 2-8℃)에서 안정적이다.
본 개시 내용의 항체 제제는 수용액일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 항체 제제는 동결 온도에 노출되지 않았거나 및/또는 동결되지 않았으며, 즉 액체 상태로 유지되었다. 일부 실시 양태에서, 항체 제제 중의 항체는 동결건조되지 않았다.
일부 실시 양태에서, 항체 제제는 개선된 안정성을 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안정성"은 일반적으로 무결성 유지 또는 단백질, 펩티드 또는 다른 생체활성 거대분자와 같은 생물학적 활성제의 분해, 변성, 응집 또는 언폴딩(unfolding)을 최소화하는 것과 관련된다. 본원에 사용되는 바와 같이, "개선된 안정성"은 일반적으로 분해, 변성, 응집 또는 언폴딩을 초래하는 것으로 알려진 조건하에서 단백질(예를 들어, 항-Cx43 Ab와 같은 항체), 펩티드 또는 관심의 또 다른 생체활성 거대분자가 대조군 단백질, 펩티드 또는 다른 생리활성 거대분자와 비교하여 더 큰 안정성을 유지함을 의미한다.
일부 실시 양태에서, 안정성은 입자 형성이 낮은 수준 내지 검출할 수 없는 수준인 항체 제제를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "입자 형성이 낮은 수준 내지 검출할 수 없는 수준"이라는 어구는 HIAC 분석 또는 육안 분석에 의해 결정되는 바와 같이 샘플이 30개 미만의 입자/mL, 20개 미만의 입자/mL, 20개 미만의 입자/mL, 15개 미만의 입자/mL, 10개 미만의 입자/mL, 5개 미만 입자/mL, 2개 미만 입자/mL 또는 1개 미만 입자/mL를 포함함을 의미한다. 일부 실시 양태에서, HIAC 분석 또는 육안 분석에 의해 항체 제제에서 입자가 검출되지 않는다.
일부 실시 양태에서, 안정성은 항체의 감소된 단편화를 의미한다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "낮은 수준 내지 검출할 수 없는 수준의 단편화"는 예를 들어 비분해 항체 또는 이의 비분해 단편을 나타내는 HPSEC에 의해 결정되는 단일 피크에서, 또는 환원 모세관 겔 전기영동(rCGE)에 의해 2개의 피크(예를 들어, 중쇄 및 경쇄)(또는 서브유닛이 있는 만큼의 피크)에서 전체 단백질의 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상을 포함하고, 각각에 총 단백질의 5% 초과, 4% 초과, 3% 초과, 2% 초과, 1% 초과 또는 0.5% 초과를 갖는 다른 단일 피크를 포함하지 않는 샘플을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "환원 모세관 겔 전기영동"은 항체에서 이황화 결합을 환원시키기에 충분한 환원 조건 하에서의 모세관 겔 전기영동을 지칭한다.
당업자는 단백질의 안정성이 제제의 조성 이외에 다른 특징에 의존한다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 안정성은 온도, 압력, 습도, pH, 및 외부 방사선 형태에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 언급된 안정성은 -20℃, 1기압, 50% 상대 습도, pH 5.5, 및 정상적인 방사선 배경 수준에서 측정된 것으로 간주된다. 항체 제제에서 항체의 안정성은 다양한 수단에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 항체 안정성은 크기 배제 크로마토그래피(SEC: size exclusion chromatography)에 의해 결정된다. SEC는 유체역학적 크기, 확산 계수, 및 표면 특성의 조합을 기준으로 분석물(예를 들어, 단백질 및 항체와 같은 거대분자)을 분리한다. 따라서, 예를 들어, SEC는 다양한 변성 상태의 항체 및/또는 분해된 항체로부터 천연의 3차원 형태의 항체를 분리할 수 있다. SEC에서, 고정상은 일반적으로 유리 또는 강철 컬럼 내의 조밀한 3차원 매트릭스에 채워진 불활성 입자로 구성된다. 이동상은 순수한 물, 수성 완충액, 유기 용매, 이들의 혼합물, 또는 기타 용매일 수 있다. 고정상 입자는 특정 크기 이하의 종만 들어갈 수 있는 작은 기공 및/또는 통로를 가지고 있다. 따라서 큰 입자는 이러한 구멍과 통로에서 제외되지만, 더 작은 입자는 흐르는 이동상에서 제거된다. 입자가 고정상 공극에서 고정되어 보내는 시간은 부분적으로 입자가 침투할 수 있는 공극 속으로 얼마나 멀리 가느냐에 달려 있다. 이동상 흐름에서 이들을 제거하면 컬럼에서 용리하는 데 더 오래 걸리고 크기 차이에 따라 입자 사이에 분리가 일어난다.
일부 실시 양태에서, SEC는 단백질 또는 이의 단편을 식별하거나 특성화하기 위한 식별 기술과 조합된다. 단백질 식별 및 특성화는 크로마토그래피 기술, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC: high-performance liquid chromatography), 면역분석법, 전기영동, 자외선/가시/적외선 분광법, 라만 분광법, 표면 강화 라만 분광법, 질량 분광법, 가스 크로마토그래피, 정적 광 산란(SLS: static light scattering), 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR: Fourier Transform Infrared Spectroscopy), 원이색법(CD: circular dichroism), 우레아 유도 단백질 전개 기술, 고유 트립토판 형광, 시차 주사 열량 측정법 및/또는 ANS 단백질 결합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 단백질 식별은 고압 액체 크로마토그래피에 의해 달성된다. HPLC를 수행하기 위한 다양한 기기 및 장치는 당업자에게 알려져 있다. 일반적으로 HPLC는 관심 단백질을 포함하는 액체 용매를 분리가 일어나는 분리 컬럼에 로딩하는 단계를 포함한다. HPLC 분리 컬럼은 고체 입자(예를 들어, 실리카, 폴리머 또는 흡착제)로 채워지고, 샘플 혼합물은 컬럼 입자와 상호 작용하면서 화합물로 분리된다. HPLC 분리는 액체 용매의 조건(예를 들어, 압력, 온도), 샘플 혼합물과 액체 용매 간의 화학적 상호 작용(예를 들어, 소수성, 양성자화 등), 및 샘플 혼합물과 분리 컬럼 내부에 채워진 고체 입자 간의 화학적 상호 작용(예를 들어, 리간드 친화성, 이온 교환 등)에 의해 영향을 받는다.
일부 실시 양태에서, SEC 및 단백질 식별은 동일한 장치 내에서, 또는 동시에 발생한다. 예를 들어, SEC와 HPLC를 결합할 수 있으며 종종 SE-HPLC라고 한다.
일부 실시 양태에서, 수성 제제는 약 2 mg/mL 내지 약 100 mg/mL 항체를 포함하며, 여기서 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1-3의 Kabat-정의된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4-6의 Kabat-정의된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고, 여기서 상기 제제는 약 40℃에서 최소 1개월 동안 보관 시 안정하다. 일부 실시 양태에서, 제제는 약 25℃에서 최소 3개월 동안 보관 시 안정하다. 일부 실시 양태에서, 제제는 약 5℃에서 최소 6개월 동안 보관 시 안정하다. 일부 실시 양태에서, 제제는 약 5℃에서 최소 12개월 동안 보관 시 안정하다. 일부 실시 양태에서, 제제는 약 5℃에서 최소 18개월 동안 보관 시 안정하다. 일부 실시 양태에서, 제제는 약 5℃에서 최소 24개월 또는 36개월 동안 보관 시 안정하다.
"안정적"이라는 용어는 상대적이며 절대적인 것이 아니다. 따라서, 일부 실시 양태에서 항체를 -20℃에서 6개월 동안 보관할 때 항체는 SEC HPLC에 의해 결정된 바와 같이 항체의 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 2% 미만이 분해, 변성, 응집 또는 언폴딩되는 경우 안정하다. 일부 실시 양태에서, 항체를 -20℃에서 12개월 동안 보관할 때 항체는 SEC HPLC에 의해 결정된 바와 같이 항체의 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 2% 미만이 분해, 변성, 응집 또는 언폴딩되는 경우 안정하다. 일부 실시 양태에서, 항체를 -20℃에서 18개월 동안 보관할 때 항체 제제 중의 항체는 SEC HPLC에 의해 결정된 바와 같이 항체의 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 2% 미만이 변성, 응집 또는 언폴딩되는 경우 안정하다. 일부 실시 양태에서, 항체를 -20℃에서 24개월 동안 보관할 때 항체 제제 중의 항체는 SEC HPLC에 의해 결정된 바와 같이 항체의 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 2% 미만이 변성, 응집 또는 언폴딩되는 경우 안정하다.
일부 실시 양태에서, 항체를 23℃ 내지 27℃에서 3개월 동안 보관할 때 항체는 SEC HPLC에 의해 결정된 바와 같이 항체의 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 2% 미만이 분해, 변성, 응집 또는 언폴딩되는 경우 안정하다. 일부 실시 양태에서, 항체를 23℃ 내지 27℃에서 6개월 동안 보관할 때 항체는 SEC HPLC에 의해 결정된 바와 같이 항체의 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 2% 미만이 분해, 변성, 응집 또는 언폴딩되는 경우 안정하다. 일부 실시 양태에서, 항체를 23℃ 내지 27℃에서 12개월 동안 보관할 때 항체는 SEC HPLC에 의해 결정된 바와 같이 항체의 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 2% 미만이 분해, 변성, 응집 또는 언폴딩되는 경우 안정하다. 일부 실시 양태에서, 항체를 23℃ 내지 27℃에서 24개월 동안 보관할 때 항체는 SEC HPLC에 의해 결정된 바와 같이 항체의 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 2% 미만이 분해, 변성, 응집 또는 언폴딩되는 경우 안정하다.
일부 실시 양태에서, 항체를 40℃에서 보관할 때 항체는 SEC HPLC에 의해 결정된 바와 같이 매달 항체의 6% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만이 분해, 변성, 응집 또는 언폴딩되는 경우 안정하다. 일부 실시 양태에서, 항체를 5℃에서 보관할 때 항체는 SEC HPLC에 의해 결정된 바와 같이 매달 항체의 6% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만이 분해, 변성, 응집 또는 언폴딩되는 경우 안정하다.
일부 실시 양태에서, 8주, 4개월, 6개월, 9개월, 12개월 또는 24개월의 기간에 걸쳐 예를 들어 ELISA 등과 같이 당업자에게 공지된 항체 결합 분석에 의해 측정되는 바와 같이 기준 항체와 비교하여 항체가 제제의 항체(이의 항체 단편 포함)의 결합 활성의 손실을 거의 또는 전혀 나타내지 않는 경우, 본 개시 내용의 항체 제제는 안정한 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 약 40℃에서 최소 1개월 동안 보관된 항체는 보관되지 않은 기준 항체와 비교하여 Cx43에 대한 결합 능력의 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%를 유지한다. 일부 실시 양태에서, 약 5℃에서 최소 6개월 동안 보관된 항체는 보관되지 않은 기준 항체와 비교하여 Cx43에 대한 결합 능력의 적어도 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%를 유지한다. 일부 실시 양태에서, 약 40℃에서 최소 1개월 동안 보관된 항체는 보관되지 않은 기준 항체와 비교하여 Cx43에 대한 결합 능력의 적어도 95%를 유지한다. 일부 실시 양태에서, 약 5℃에서 최소 6개월 동안 보관된 항체는 보관되지 않은 기준 항체와 비교하여 Cx43에 대한 결합 능력의 적어도 95%를 유지한다.
항체 제제는 낮은 수준 내지 검출 불가능한 수준의 항체 응집을 제공할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "낮은 수준 내지 검출할 수 없는 수준의 응집"이라는 어구는 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC) 또는 정적 광 산란(SLS) 기술에 의해 측정되는 바와 같이 단백질 중량을 기준으로 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 및 약 0.5% 이하의 응집을 포함하는 샘플을 지칭한다. 일부 실시 양태에서, HPSEC에 의해 결정된 바와 같이 약 40℃에서 최소 4주 동안 보관 시 항체의 2% 미만이 응집체를 형성한다. 일부 실시 양태에서, HPSEC에 의해 결정된 바와 같이 약 5℃에서 최소 3개월, 최소 6개월, 최소 9개월, 최소 12개월, 최소 15개월, 최소 18개월, 최소 24개월, 또는 최소 36개월 동안 보관 시 항체의 2% 미만이 응집체를 형성한다.
본원에서 제공된 항체 제제는 육안 검사, 미세유동 영상법(MFI: Microflowing Imaging) 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정된 바와 같이 입자 형성을 크게 감소시키는 것으로 본원에서 밝혀졌다. 일부 실시 양태에서, 제제는 육안 검사에 의해 결정되는 바와 같이 약 40℃에서 최소 1개월 동안 저장 시 실질적으로 입자가 없다. 일부 실시 양태에서, 제제는 육안 검사로 결정되는 바와 같이 약 5℃에서 최소 6개월, 최소 9개월, 최소 12개월, 최소 15개월, 최소 18개월, 최소 24개월, 또는 최소 36개월 동안 보관 시 실질적으로 입자가 없다.
제제는 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 예방은 살균 절차 및 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산 등의 포함 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 방부제는 일반적으로 약 0.001 내지 약 2%(w/v)의 양으로 사용된다. 방부제는 에탄올, 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, p-클로르-m-크레졸, 메틸 또는 프로필 파라벤, 벤즈알코늄 클로라이드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 항체 제제는 다양한 점도를 가질 수 있다. 항체 제제의 점도를 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 레오미터(예를 들어, 50 mm, 40 mm 또는 20 mm 플레이트 부속품이 구비된 Anton Paar MCR301 레오미터)를 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 일부 실시 양태에서, 점도는 1000/초 전단 속도의 고전단 한계에서 보고되었다. 일부 실시 양태에서, 항체 제제는 20 센티푸아즈(cP) 미만, 18 cP 미만, 15 cP 미만, 13 cP 미만, 또는 11 cP 미만의 점도를 갖는다. 일부 실시 양태에서, 항체 제제는 13 cP 미만의 점도를 갖는다. 당업자는 점도가 온도에 따라 달라지며, 따라서 달리 명시되지 않는 한 본원에 제공된 점도는 25℃에서 측정된다는 것을 이해할 것이다.
항체 제제는 상이한 삼투압 농도를 가질 수 있다. 항체 제제의 삼투압 농도를 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 삼투압계(예를 들어 Advanced Instrument Inc 2020 어는점 강하 삼투압계)를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제제는 200 내지 600 mosm/kg, 260 내지 500 mosm/kg, 또는 300 내지 450 mosm/kg의 삼투압 농도를 갖는다.
본 개시 내용의 항체 제제는 다양한 pH 수준을 가질 수 있다. 일부 실시 양태에서, 항체 제제의 pH는 4 내지 7, 4.5 내지 6.5, 5 내지 6, 또는 5.4 내지 5.6이다. 일부 실시 양태에서, 항체 제제의 pH는 5.5이다. 일부 실시 양태에서, 항체 제제의 pH는 6.0이다. 일부 실시 양태에서, 항체 제제의 pH는 ≥7.0이다. 원하는 pH 수준을 달성하기 위해 적절한 완충액의 추가를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 수단을 사용할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 항체 제제는 약 40-60 mg/mL, 바람직하게는 약 50 mg/mL의 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 약 10-40 mM, 바람직하게는 약 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 완충액; 약 0.005%-0.05%, 바람직하게는 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및 약 1%-20% w/v, 바람직하게는 약 8% w/v 수크로오스를 포함할 수 있으며, 여기서 제제는 약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는다.
일부 실시 양태에서, 항체 제제는 서열 번호 9-17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하고, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 약 50 mg/mL의 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 약 20 mM 히스티딘/아스파르트산 완충액; 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및 약 8% w/v 수크로오스를 포함할 수 있으며, 여기서 제제는 약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는다.
한 실시 양태에서, 항체 제제는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 약 50 mg/mL의 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 약 20 mM 히스티딘/아스파르트산 완충액; 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및 약 8% w/v 수크로오스를 포함할 수 있으며, 여기서 제제는 약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는다.
한 실시 양태에서, 항체 제제는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 약 50 mg/mL의 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 약 20 mM 히스티딘/아스파르트산 완충액; 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및 약 8% w/v 수크로오스를 포함할 수 있으며, 여기서 제제는 약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는다.
한 실시 양태에서, 항체 제제는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 약 50 mg/mL의 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 약 20 mM 히스티딘/아스파르트산 완충액; 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및 약 8% w/v 수크로오스를 포함할 수 있으며, 여기서 제제는 약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는다.
한 실시 양태에서, 항체 제제는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 약 50 mg/mL의 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 약 20 mM 히스티딘/아스파르트산 완충액; 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및 약 8% w/v 수크로오스를 포함할 수 있으며, 여기서 제제는 약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는다.
한 실시 양태에서, 항체 제제는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 약 50 mg/mL의 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 약 20 mM 히스티딘/아스파르트산 완충액; 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및 약 8% w/v 수크로오스를 포함할 수 있으며, 여기서 제제는 약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는다.
한 실시 양태에서, 항체 제제는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 약 50 mg/mL의 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 약 20 mM 히스티딘/아스파르트산 완충액; 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및 약 8% w/v 수크로오스를 포함할 수 있으며, 여기서 제제는 약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는다.
한 실시 양태에서, 항체 제제는 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 약 50 mg/mL의 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 약 20 mM 히스티딘/아스파르트산 완충액; 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및 약 8% w/v 수크로오스를 포함할 수 있으며, 여기서 제제는 약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는다.
한 실시 양태에서, 항체 제제는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 약 50 mg/mL의 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 약 20 mM 히스티딘/아스파르트산 완충액; 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및 약 8% w/v 수크로오스를 포함할 수 있으며, 여기서 제제는 약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는다.
한 실시 양태에서, 항체 제제는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 약 50 mg/mL의 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 약 20 mM 히스티딘/아스파르트산 완충액; 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및 약 8% w/v 수크로오스를 포함할 수 있으며, 여기서 제제는 약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는다.
일부 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 항체 제제, 본원에 기재된 용기, 본원에 기재된 단위 제형, 또는 본원에 기재된 사전 충전형 주사기를 포함하는 키트를 제공한다.
치료 용도
일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 항체 제제는 약학 목적으로 사용될 수 있다. 약학 분야에 사용되는 항체는 일반적으로 높은 수준의 순도를 가져야 하며, 특히 세포 단백질 오염물, 세포 DNA 오염물, 바이러스 및 기타 전염성 인자를 포함하여 세포 배양물의 오염물과 관련하여 특히 그러하다. ""WHO Requirements for the use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals: Requirements for Biological Substances No. 50." 878호. 부록 1(1998)을 참조한다. 세계 보건 기구(WHO)는 오염물에 대한 우려에 대응하여 다양한 오염물의 수준에 대한 한계를 설정하였다. 예를 들어, WHO는 단백질 제품에 대해 용량당 10 ng 미만의 DNA 한계를 권장하였다. 마찬가지로, 미국 식품의약국(FDA)은 DNA 한계를 0.5 pg/mg 단백질 이하로 설정하였다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 정부 기관, 예를 들어 미국 식품의약국 및/또는 세계 보건 기구에 의해 정의된 오염물 한계를 충족하거나 초과하는 항체 제제에 관한 것이다.
본 개시 내용의 항체 제제는 다양한 수단을 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 항체 제제는 비경구 투여, 예를 들어 흡입(예를 들어, 분말 또는 에어로졸 스프레이), 경점막, 정맥 내, 피하, 또는 근육 내 투여에 적합하다. 일부 실시 양태에서, 제제는 주사용 제제다. 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항체 제제를 포함하는 밀봉된 용기에 관한 것이다.
일부 측면에서, 본 개시 내용은 다양한 약학 제형에 관한 것이다. 다양한 제형이 본원에 제공된 제제에 적용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Pharmaceutical Dosage Form: Parenteral Medications, Volume 1, 2nd Edition]을 참조한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 약학 단위 투여량은 적합한 용기, 예를 들어 바이알 또는 주사기 내 항체 제제를 구성한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 약학 단위 투여량은 정맥 내, 피하, 또는 근육 내 전달 항체 제제를 구성한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 약학 단위 투여량은 에어로졸 전달 항체 제제를 구성한다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용의 약학 단위 투여량은 피하 전달 항체 제제를 구성한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 약학 단위 투여량은 에어로졸 전달 항체 제제를 구성한다. 추가 실시 양태에서, 본 개시 내용의 약학 단위 투여량은 비강 내 투여 항체 제제를 구성한다.
본 개시 내용의 조성물은 당 업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 숙련된 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다.
특정 투여 경로에 의해 본 개시 내용의 조성물을 투여하기 위해, 희석제에 조성물을 희석해야 할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 희석제는 식염수, 포도당, 링거 및 수성 완충 용액을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 제제는 정맥 내(i.v.), 피하(s.c.) 또는 약학 분야에 공지된 것과 같은 임의의 다른 비경구 투여 수단에 의해 투여된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여되는"이라는 어구는 장내 및 국소 투여 이외에, 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 제한 없이 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 척수강 내, 피막 내, 안와 내, 심장 내, 피내, 복강 내, 경기관, 피하, 표피 하, 관절 내, 피막 하, 지주막하, 척수 내, 경막 외 및 흉골 내 주사 및 주입을 포함한다.
조성물은 조성물이 주사기 또는 주입 시스템에 의해 전달될 수 있는 정도로 멸균적이고 유동적이어야 한다. 물 이외에, 담체는 등장성 완충 생리 식염수, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다.
본 개시 내용에 따른 제제는 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 한외여과-투석여과, 투석, 첨가 및 혼합, 동결건조, 재구성, 및 이들의 조합에 의해 제조될 수 있다. 본 개시 내용에 따른 제제의 제조 예는 이하에서 찾아볼 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 약학 조성물은 염증성 폐질환, 골관절염 및 척수 손상과 같은 감염성 염증뿐만 아니라 무균 염증을 포함하는 염증성 질환의 치료에 사용될 수 있다.
무균성 염증은 물리적, 화학적 또는 대사성 녹시아(noxiae)에 의해 유발되는 일반적인 현상이다. 다양한 녹시아는 세포 스트레스를 유발하여 스트레스 반응을 일으킨다. 많은 유형의 스트레스 반응이 존재하며(예를 들어, 언폴딩 단백질 반응, 통합 스트레스 반응, 산화 스트레스) 종종 서로 얽혀 있다. 스트레스 반응은 염증을 유발한다. 녹시아가 지속되면, 염증이 해결되지 않아 암, 대사 및 유전 질환을 비롯한 많은 인간 장애의 병리 생리학에서 핵심 역할을 하는 악순환이 발생한다.
무균 염증으로 인한 급성 병태에는 허혈 재관류 손상(IRI: ischemia reperfusion injury), 외상(예를 들어, 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 말초 신경 손상), 결정 유발 염증, 및 독소 노출이 포함된다. 급성 심근 경색, 뇌경색, 급성 신장 손상 및 고형 장기 이식은 IRI가 발생하는 모든 병태이다. 관절 내 결정 침착은 통풍성 관절염을 유발하고 발적, 통증, 열, 부기 및 기능 상실을 포함하는 염증의 전형적인 임상 징후를 유발한다. 아세트아미노펜이나 코브라 독과 같은 독소는 각각 간 손상과 근육 손상을 유발한다. 압착 손상을 포함한 외상은 갑작스러운 염증 반응을 유발하고, 내인성 및 미생물 유발 요인(박테리아 노출)이 이러한 맥락에서 염증의 원인이 될 수 있다.
무균 염증을 유발하거나 그로부터 유발되는 만성 질환에는 석면폐증 및 규폐증과 같은 입자 유발 폐질환, 낭포성 섬유증 및 특발성 폐 섬유증과 같은 만성 폐질환, 죽상 동맥 경화증과 같은 심혈관 질환, 만성 심부전의 일부 원인, 종양의 특정 사례, 관절염(예를 들어, 골관절염 및 류마티스 관절염(RA)), 및 자가면역 병태가 포함된다.
감염성 염증은 여러 조직에서 박테리아 및 진균과 같은 다양한 병원균에 의해 유발될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 염증성 질환은 염증을 특징으로 하는 다양한 장애 및 병태를 의미한다. 예로는 관절염, 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 복강 질환, 사구체신염, 간염, 염증성 장 질환(크론병 및 궤양성 대장염 포함), 재관류 손상 및 이식 거부가 포함된다.
자가면역 질환은 면역계가 자신의 단백질, 세포, 및 조직을 공격하거나, 면역 이펙터 T 세포가 내인성 자가 펩티드에 자가 반응하여 조직 파괴를 일으키는 질환이다. 따라서, 면역 반응은 자가 항원이라고 하는 대상체 자신의 항원에 대해 시작된다. 자가면역 질환에 대한 포괄적인 목록 및 리뷰는 The Autoimmune Diseases(Rose and Mackay, 2014, Academic Press)에서 찾을 수 있다. 자가면역 질환에는 류마티스성 관절염, 크론병, 제1형 당뇨병, 탈모증, 다발성 경화증, 루푸스, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 자가면역 뇌척수염, 중증 근무력증(MG), 하시모토 갑상선염, 굿파스처 증후군, 천포창(예를 들어, 심상성 천포창), 그레이브스병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소성 자반병, 항콜라겐 항체 동반 경피증, 혼합 결합 조직병, 다발성근염, 악성 빈혈, 특발성 애디슨병, 자가면역 관련 불임, 사구체신염(예를 들어, 초승달 사구체신염, 증식성 사구체신염), 수포성 유천포창, 쇼그렌 증후군, 인슐린 저항성, 및 자가면역 당뇨병이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
신경퇴행성 질환은 알츠하이머병(AD), 리소좀 축적 장애, 세균성 수막염, 근위축성 측삭 경화증, 저산소증, 허혈, 녹내장, 정신분열증, 주요 우울증, 양극성 장애, 간질, 외상성 뇌 손상, 외상 후 스트레스 장애, 파킨슨병, 다운 증후군, 척수소뇌 운동실조증, 헌팅턴병, 방사선 요법 유발 신경변성, 만성 스트레스 유발 신경변성, 및 정상적인 노화 또는 신경 활성 약물(예컨대, 알코올, 아편류, 메스암페타민, 펜시클리딘, 및 코카인) 남용과 관련된 신경변성과 같은 질환이다.
골관절염은 관절 연골과 하부 뼈의 파괴로 인해 발생하는 관절 질환의 한 유형이다. 가장 흔한 증상은 관절 통증과 경직이며, 이는 수년에 걸쳐 천천히 진행될 수 있다. 골관절염은 관절에 대한 기계적 스트레스와 낮은 등급의 염증 과정에 의해 유발되는 것으로 여겨진다. 관절에 의한 자가 복구가 불충분한 기계적 스트레스로 인한 손상이 골관절염의 주요 원인으로 여겨진다.
척수 손상은 기능에 일시적 또는 영구적인 변화를 일으키는 척수에 대한 손상이다. 증상으로는 손상 수준 아래에서 척수가 담당하는 신체 부위의 근육 기능, 감각, 또는 자율 기능의 상실이 포함될 수 있다. 손상은 척수의 모든 수준에서 발생할 수 있으며 감각 및 근육 기능이 완전히 상실된 완전한 손상이거나 일부 신경 신호가 척수의 손상된 부위를 지나 이동할 수 있음을 의미하는 불완전한 손상일 수 있다. 손상의 위치와 중증도에 따라, 무감각에서 마비, 실금에 이르기까지 증상이 다양하다. 장기적인 결과는 완전한 회복에서 영구적인 사지마비(tetraplegia)(quadriplegia라고도 함) 또는 하반신 마비에 이르기까지 광범위하다. 합병증에는 근육 위축, 욕창, 감염, 및 호흡 문제가 포함될 수 있다.
척수 손상은 외상성 또는 비외상성일 수 있으며, 원인에 따라 기계적 힘, 독성 및 허혈성(혈류 부족으로 인한)의 세 가지 유형으로 분류할 수 있다. 손상은 또한 1차 및 2차 손상으로 나눌 수 있다: 원래 손상에서 즉시 발생하는 세포 사멸, 및 원래 손상에 의해 시작되어 추가 조직 손상을 유발하는 생화학적 캐스케이드. 이러한 2차 손상 경로에는 허혈 캐스케이드, 염증, 종창, 세포 자살, 및 신경전달물질 불균형이 포함된다. 이들은 손상 후 몇 분 또는 몇 주 동안 발생할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 조성물 및 방법을 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 내용 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자가 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
약어
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장비
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시약
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이러한 항-Cx43 Ab 제제 개발 연구는 안정한 pH/완충계에 안정제, 계면활성제 및 삼투압 농도 조절제를 포함한 항-Cx43 Ab 완제 의약품의 장기 보관을 지원하는 안정한 액체 제제를 개발하는 것을 목표로 하였다. 연구에는 pH/완충액 스크리닝, 부형제 스크리닝 및 PS80 강도 스크리닝이 포함되었다. 완충계, pH, 부형제 및 PS80이 제품 안정성에 미치는 영향을 동결/해동, 교반 및 열 스트레스 조건에서 평가하였다.
항-Cx43 Ab의 목표 농도는 50 mg/mL이었고, 이를 이러한 제제 연구에 사용하였다. pH/완충액 스크리닝 연구의 결과에 기초하여, pH 5.5의 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 완충액을 추가 제제 연구를 위한 적절한 pH/완충계로 간주하였다.
부형제 및 PS80 강도 스크리닝 연구는 수크로오스가 포함된 히스티딘 완충액에서 항-Cx43 Ab가 염화나트륨, 소르비톨 또는 글리신을 포함하는 것보다 상대적으로 더 안정한 것으로 나타났다. PS80의 첨가는 0.02%의 최적 농도에서 항-Cx43 Ab의 안정성을 상당히 개선한 반면, EDTA 및 단백질 농도 연구는 항-Cx43 Ab의 안정성에 유의한 효과를 제공하지 않는 것으로 나타났다.
제제 확인 연구를 위해 8% 수크로오스 및 0.02%(w/v) PS80을 포함하는 pH 5.5의 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 중의 50 mg/mL 항-Cx43 Ab를 선택하였다.
샘플 번호 관리 규칙
샘플 번호: PPP-YYYYMMNN-X-CC-TT
PPP는 프로젝트 명칭의 숫자 부분을 나타낸다(이 프로젝트는 2144이다). YYYY, MM 및 NN은 각각 이번 달의 샘플 제조 연도, 월 및 일련번호를 나타낸다.
X는 테스트 조건을 나타낸다. 예를 들어, FT와 A는 각각 동결-해동 및 교반을 나타낸다.
CC는 테스트 온도를 나타낸다. 예를 들어, 05, 25 및 40은 각각 2~8℃, 25℃및 40℃를 나타낸다.
TT는 테스트 시간을 나타낸다. 예를 들어, T0, 7D, 4W 및 1M은 각각 시작 시간, 7일, 4주 및 1개월을 나타낸다.
F는 제제 번호를 나타낸다. 예를 들어, F1과 F2는 각각 제제 1 및 제제 2를 나타낸다.
예: 2144-20180601-25-4W는 2018년 6월에 제조된 프로젝트 항-Cx43 Ab의 첫 번째 샘플을 나타낸다. 샘플은 25℃에서 4주 동안 수직으로 보관되었다.
분석 방법
외관
투명도, 색상, 및 불용성 이물(visible particle)을 포함한 샘플의 외관은 YB-2 라이트 박스를 사용하여 흑백 배경에 대해 조사하였다.
pH
pH는 Mettler Toledo S40 pH 측정기를 사용하여 측정하였다. pH 측정기는 사용 전에 보정하였다.
삼투압 농도
삼투압 농도는 20 μL의 샘플을 사용하여 Advanced 2020 Multi-Sample 삼투압계를 사용하여 측정하였다. 삼투압계의 테스트 정확도는 290 mOsmol/kg 기준으로 확인되었다.
MFI
불용성 미립자(sub-visible particle) 분석을 위해 미세유동 영상화(MFI) 시스템을 사용하였다. 사용 설명서에 따라, MFI 테스트는 1.3 mL 초과의 샘플로 수행하였다. MFI 데이터는 MVAS 소프트웨어로 분석하였다. 최종 데이터는 상이한 크기 범위에서 총 입자 수로 보고하였다.
단백질 농도
단백질 용액의 자외선 흡광도는 단백질 분자의 방향족 아미노산 잔기의 흡수 특성에 따라 달라진다. Beer-Lambert 법칙에 따르면, 단백질 용액의 농도는 주어진 파장에서의 흡광도, 큐벳 셀 경로 길이, 및 흡광 계수 값을 기반으로 계산할 수 있다. DropSense 96에는 0.1 mm와 0.7 mm의 두 가지 경로 길이가 있으며 적절한 경로 길이가 자동으로 선택된다. 기기는 적절한 경로 길이를 고려하여 280 nm에서 항-Cx43 Ab의 흡광도 값을 얻었다. 따라서, 흡광도 값을 항-Cx43 Ab의 흡광 계수인 1.420으로 나누어 단백질 농도를 계산하였다. 특정 자외선 파장에서 단백질 용액의 흡광도 값(A), 단백질 농도(c), 광학 경로(b) 및 흡광 계수(ε)의 관계는 다음 공식과 일치하였다. A = ε *b *c (A는 흡광도 값, ε는 흡광 계수, b는 광학 경로, c는 농도). 항-Cx43 Ab의 흡광 계수는 1.420 AU*mL*mg-1*cm-1이었다. 280 nm에서의 UV 흡수는 Nanodrop 2000 분광광도계를 사용하여 측정하였다.
DSC
시차 주사 열량계(DSC: differental scanning calorimetry)를 활용하여 열류에서 샘플의 열용량을 감지하여 단백질의 열 안정성을 측정하였다. 구체적으로, DSC를 사용하여 용액에서 단백질의 상대적 안정성의 지표인 열 전이 중간점(Tm) 및 용융 개시점(Tm개시)을 측정하였다. 샘플을 기준 완충액으로 1 mg/mL로 희석하였다. 400 μL의 분취량의 기준 완충액을 96웰 플레이트의 각 홀수 웰에 첨가한 반면, 400 μL의 분취량의 각 샘플을 상응하는 짝수 웰에 첨가하였다. 주사 온도는 200℃/hr의 주사 속도로 20℃에서 100℃ 범위였다. 데이터 분석은 MicroCal VP 모세관 DSC 자동 데이터 분석 소프트웨어 2.0을 사용하여 수행하였다.
cIEF
영상화 모세관 등전점 전기 영동(iCIEF: Imaged Capillary Isoelectric Focusing) 방법은 pH 구배에서 전하 차이를 기반으로 단백질을 분리한다. 외부 전기장하에서, 단클론 항체의 전하 변이체는 양쪽성 전해질 첨가제에 의해 형성된 연속적인 pH 구배를 따라 이동한다. 전하 변이체는 pH가 pI와 같을 때 멈춘다. 분석된 피크의 pI 값과 상대적 존재비를 확인하고 소프트웨어로 정량화한다. 마스터 믹스는 다음 비율로 제조하였다(1개의 샘플 양에 대해): 0.5 μL pI 7.40 마커; 0.5 μL pI 9.46 마커; 1 μL Pharmalyte 3-10; 3 μL Pharmalyte 8-10; 35 μL 1% 메틸셀룰로오스; 40 μL H2O. 1회 샘플 주입용 용액은 1.0 mg/mL 희석 샘플 20 μL와 마스터 믹스 80 μL로 구성하였다.
SDS-Caliper(환원 및 비환원)
SDS-Caliper는 주로 분자 크기에 따라 단백질을 분리하는 고처리량 칩 기반 방법이다. 각 샘플을 테스트하기 전에, 샘플 완충액, SDS 및 N-에틸말레이미드(비환원의 경우) 또는 디티오트레이톨(환원의 경우)과 함께 70℃에서 10분 동안 인큐베이션과 같은 전처리가 필요하였다. 그 후 최소 부피 42 μL(최종 단백질 농도 0.045 mg/mL)의 로딩 믹스를 LabChip GXII Touch로 635 및 700nm의 여기/방출 파장에서 테스트하였다. 최종 결과는 Empower 소프트웨어로 분석하였다.
SEC-HPLC
크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 크기에 따라 단백질을 분리하는 순도 분석 방법이다. 분리 후, UV 검출을 통해 HMW 종, 단량체 및 LMW 종의 상대적 백분율을 정량화한다. SEC는 다음과 같이 수행하였다. 샘플이 10 mg/mL 초과인 경우, SEC 분석 전에 이동상으로 10 mg/mL로 희석하였다. 100 μg의 샘플을 TSKgel G3000SWXL 컬럼(7.8Х300 mm, 5 μm 입자 크기)과 UV 검출기(검출 파장: 280 nm)가 장착된 Agilent 1260 HPLC 시스템에 주입하였다. 이동상은 300 mM 염화나트륨(pH 6.8±0.1)을 포함하는 50 mM 포스페이트 완충액이었다. 등용매 구배를 1 mL/분의 유속으로 20분 동안 적용하였다.
mDSC
변조 시차 주사 열량계(mDSC: Modulated DSC)는 DSC-Q2000 시스템(TA instruments-Waters LLC)을 사용하여 수행하였다. Tzero 알루미늄 도가니 및 Tzero 알루미늄 뚜껑은 모두 TA instruments 것을 사용하여 측정할 샘플을 담고 Tzero 프레스로 도가니를 밀봉하였다. 빈 Tzero 도가니를 유사하게 준비하여 기준으로 사용하였다. 약 10 μL DS를 첨가하고, 평평하게 압축한 다음 Tzero 프레스에 의해 Tzero 뚜껑으로 밀봉한 Tzero 도가니로 옮겼다. 보정 주사 프로그램은 -60.00℃에서 5분 동안 평형화한 다음 5.00℃/분의 일정한 온도 속도로 10.00℃까지 실행하였다. Universal Analysis Software 패키지를 사용하여 데이터 획득 및 처리를 수행하였다.
양이온 교환 크로마토그래피(CEX: cation exchange chromatography)
CEX는 완충 용액에서 순 전하 수의 차이에 따라 단백질을 분리하여 단클론 항체 용액의 전하 이질성을 측정한다. 등전점 미만의 pH의 저염 완충액 중 샘플은 순 양전하를 가지며 음전하를 띤 크로마토그래피 수지에 흡착된다. pH 구배는 전하 이질성을 기반으로 상이한 단백질 종을 용출하는 데 사용되며, 가장 양전하를 띤 종은 가장 강하게 결합하므로 더 높은 pH가 필요하다. 280 nm에서 자외선 흡광도에 의해 용출된 상이한 하전 종을 검출한다. 피크 면적 정규화 방법에 의해 샘플의 주요 피크, 산성 피크 및 염기성 피크의 백분율을 결정한다. CEX는 Agilent 1260 시리즈 Infinity 시스템과 ProPac WCX-10 컬럼에서 수행하였다. 여기에 사용된 이동상 A는 16 mM 2-메틸피페라진, 16 mM 이미다졸, 16 mM Tris, pH 5.0±0.1이었다. 이동상 B는 16 mM 2-메틸피페라진, 16 mM 이미다졸, 16 mM Tris, 80 mM NaCl, pH=10.9±0.1이었다. 유속은 1 mL/분으로 설정하였다. 샘플을 이동상 A로 1 mg/mL로 희석하고 이동상 B의 양을 증가시키는 구배로 샘플 100 μL를 용출하였다. 검출 파장은 280 nm로 설정하였였다. 실행 시간은 60분이었다.
CE-SDS(환원)
환원 모세관 전기영동-소듐 도데실 설페이트(CE-SDS: Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate)는 더 작은 크기의 단백질은 더 빨리 움직이고 더 큰 크기의 단백질은 더 느리게 움직이는 전기영동 이동성을 기반으로 단백질을 분리하는 순도 분석 방법이다. 이 방법에서, 희석된 단백질 샘플은 먼저 SDS로 변성시킨 다음 β-메르캅토에탄올(BME)로 환원시킨 후 점성 SDS 겔 용액으로 채워진 코팅되지 않은 모세관에 주입한다. PDA 검출기로 220 nm에서 단백질 샘플 내 상이한 분자 크기의 구성 요소는 모세관을 통과할 때 검출되었다.
CE-SDS(비환원)
비환원 모세관 전기 영동-소듐 도데실 설페이트(CE-SDS)는 더 작은 크기의 단백질이 더 빨리 움직이고 더 큰 크기의 단백질이 더 느리게 움직이는 전기영동 이동성을 기반으로 단백질을 분리하는 순도 분석 방법이다. 이 방법에서, 희석된 단백질 샘플은 먼저 열 유도 단편화를 방지하기 위해 NEM(N-에틸말레이미드)에 의해 알킬화한 다음 SDS로 변성시켜 점성 SDS 겔 용액으로 채워진 코팅되지 않은 모세관에 주입한다. PDA 검출기로 220 nm에서 단백질 샘플 내 상이한 분자 크기의 구성 요소는 모세관을 통과할 때 검출되었다.
효력 결합 항원
항-Cx43 Ab ELISA 효력 분석은 항-Cx43 Ab 제품이 스트렙타비딘 코팅 96웰 플레이트에 코팅된 비오틴-펩티드에 결합하는 효소 연결 면역흡착 분석이다. 연속 희석된 항-Cx43 Ab 샘플 및 참조 표준이 플레이트의 비오틴-펩티드에 결합되도록 한다. 세척 후, HRP(horseradish peroxidase: 양고추냉이 과산화효소)-접합된 염소 항-인간 IgG를 웰에 첨가하고 이전 단계에서 포획된 항-Cx43 Ab 제품과 상호 작용하도록 두었다. 최종 세척 단계 후, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 용액을 웰에 첨가한다. TMB는 과산화효소 존재 시 과산화물과 특이적으로 반응하고 웰에 결합된 항-Cx43 Ab 제품의 양에 비례하는 비색 신호를 생성한다. 용량 반응 곡선을 4PL 모델을 사용하여 피팅하고 결과는 참조 표준(RS) 대 샘플의 EC50 값을 사용하여 상대 효력으로 보고한다.
실시예 2: pH/완충액 스크리닝
pH/완충액 스크리닝 연구는 항-Cx43 Ab 완제 의약품 제제를 위한 최적의 pH/완충계를 결정하는 것이었다. 이 연구의 목표는 추가 제제 개발 연구를 위해 항-Cx43 Ab 완제 의약품에 대한 최대 안정화 기능을 가진 하나의 pH/완충계를 선택하는 것이었다.
단백질 분자와 완충계의 적용을 기반으로 9개의 pH/완충계를 설계하였다. 항-Cx43 Ab DS(로트: 2144SD180528K01Y01D01)의 완충액 교환을 수행하기 위해 한외여과 원심분리 장치를 사용하였다. 50L 풀로부터 pH 5.5의 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 완충액에 제제화된 DS를 생성하였다. 이 연구에서 항-Cx43 Ab 농도는 50 mg/mL였다. 모든 제제를 여과한 다음 2R 바이알에 분배하였다. 각 제제의 바이알을 25±2℃ 및 40±2℃에서 최대 4주 동안 보관하였다. 샘플은 각 시점에서 적시에 회수하였고 분석 전에 2~8℃에서 보관하였다. 본 연구에서는 외관, pH, Conc-UV280, SEC-HPLC, cIEF, Caliper-SDS(환원&비환원), DSC 등의 테스트 항목을 수행하였다. 샘플링 계획은 표 1에 열거한다.
[표 1]
Figure pct00006
한외여과 원심분리 장치(30,000 MWCO PES, VIVASPIN 20)를 사용하여 항-Cx43 Ab DS의 완충액 교환을 수행하였다. 각 최종 목표 제제의 성분은 표 1에 제시한다. 교환율이 98%를 초과할 때까지 여러 라운드의 한외여과를 수행하였다. 그런 다음 해당 제제 완충액에 의해 단백질 농도를 50 mg/mL로 조정하였다. 각 제제를 0.22 ㎛ 필터(Millipore Express PES Membrane)를 통해 여과한 다음 1 mL/바이알 충전 부피로 2R 바이알에 분배하였다. 바이알은 충전 후 즉시 마개를 막고 밀봉하였다. 모든 여과, 충전 및 밀봉 작업은 생물 안전 후드에서 수행하였다. 각 제제에 대한 적절한 수의 바이알을 각각 25℃ 및 40℃ 안정성 챔버에 넣었다. 예정된 시점에 샘플을 취하여 분석하였다.
상이한 완충계에서 항-Cx43 Ab의 써모그램을 도 1에 나타낸다. Ab가 언폴딩하기 시작하는 온도인 Tm 개시 값은 제제의 전체 열 안정성에 대한 지표로 간주한다. 표 2에 나타낸 바와 같이, B8 및 B9 샘플은 다른 샘플보다 Tm 개시가 더 낮았다. 이는 항-Cx43 Ab의 열 안정성이 B8 및 B9를 제외한 다른 pH/완충계에 의해 크게 영향을 받지 않음을 나타냈다.
[표 2]
Figure pct00007
상이한 완충계에서 항-Cx43 Ab의 외관, 단백질 농도 및 pH 결과는 표 3 및 표 4에 요약한다.
9개 샘플의 농도는 약 50 mg/mL이었고, pH 값은 목표 pH 부근이었다. 모든 샘플은 T0에서 무색이고 약간 유백색이며 불용성 이물(visible particle)이 없었지만, B4, B5 및 B9 샘플의 유백색 수준은 다른 샘플보다 더 진했다. 25±2℃ 및 40±2℃에서 2주 보관 후에, PS80의 부재로 인해 모든 샘플에서 약간 불용성 이물이 발견되었다.
이 데이터는 항-Cx43 Ab가 다른 후보보다 B1, B2, B3, B6, B7 및 B8 pH/완충계에서 상대적으로 더 안정적임을 시사하였다.
[표 3]
Figure pct00008
[표 4]
Figure pct00009
모든 샘플에 대한 SEC-HPLC 결과는 표 5 및 도 2에 나타낸다. 모든 샘플은 T0에서 대략 99.0%의 주요 피크와 비슷한 SEC 순도를 보였다. 25℃에서 4주 동안 인큐베이션 후, SEC 주요 피크가 0.8%~1.9% 범위에서 약간 감소하는 것이 관찰되었다. 포스페이트 완충액을 사용한 샘플 B9는 1.9%로 약간 더 큰 감소를 보였다. 40℃에서 인큐베이션된 샘플의 경우, 보관 2주 후에 주요 피크의 상당한 감소가 관찰되었다. 40℃에서 4주 동안 인큐베이션 후, 주요 피크의 감소는 2.1%~4.2% 범위였다. B4, B5 및 B9 샘플을 제외하고는 샘플 간의 구별이 명확하지 않았다. B4, B5 및 B9 샘플의 순도 감소는 각각 2.8%, 2.7% 및 4.2%였다. SEC 데이터는 항-Cx43 Ab가 B2, B3 및 B6에서 상대적으로 더 안정함을 나타냈다.
[표 5]
Figure pct00010
cIEF를 사용하여 항-Cx43 Ab의 등전점(pI) 및 전하 변이체 분포를 결정하였다. 모든 샘플에 대한 cIEF 결과는 표 6 및 도 3에 나타낸다. 모든 샘플에 대한 pI에서 유의한 변화는 없었다. 모든 샘플의 pI 값은 8.7이었다. 25±2℃에서 4주 동안 보관 후, 샘플 B2를 제외하고 거의 모든 샘플의 주요 피크가 약간 감소하였다. 샘플 B9의 주요 피크 감소는 7.7%였다. 40±2℃에서 4주 동안 보관 후, 각 제제의 주요 피크는 상당히 감소하였고, 동시에 산성 피크는 상당히 증가하였다. 제제 B5, B8 및 B9의 주요 피크는 각각 23.0%, 22.0% 및 7.9%로 감소하였다. 대조적으로, B2, B3 및 B6의 주요 피크 감소는 다른 샘플보다 상대적으로 완만하였다. cIEF 데이터는 항-Cx43 Ab가 B2, B3 및 B6에서 상대적으로 더 안정함을 나타냈다.
[표 6]
Figure pct00011
모든 제제에 대한 SDS-Caliper 결과는 표 7, 도 4 및 도 5에 나타낸다. 25±2℃에서 4주 동안 보관 후 모든 샘플에 대한 비환원 SDS-Caliper 순도 및 환원 SDS-Caliper 순도에는 유의한 변화가 없었다. 40±2℃에서 4주간 보관 후, 샘플 B5 및 B9의 비환원 SDS-Caliper 순도는 각각 66.7% 및 60.5%로 감소하였으며, 이는 다른 제제보다 더 컸다. 샘플 B2, B3 및 B6의 주요 피크 감소는 다른 샘플보다 상대적으로 완만하였다. 모든 샘플의 환원 SDS-Caliper 순도는 B5 및 B9를 제외하고 약간 감소하였다. SDS-Caliper 데이터는 항-Cx43 Ab가 B2, B3 및 B6에서 상대적으로 더 안정적임을 나타냈다.
[표 7]
Figure pct00012
이 연구에서, 다양한 pH/완충계의 9개 샘플을 설계하고 25±2℃ 및 40±2℃에서 인큐베이션하였다. 모든 결과에 기초하여, 제제 B6(pH 5.5의 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 완충액) 및 B2(pH 5.0의 20 mM 히스티딘/아스파르트산 완충액)의 성능이 다른 제제보다 우수하였다. 결론적으로, pH 5.5의 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 완충액(B6)은 선도(lead) 제제로 사용하고 pH 5.0의 20mM 히스티딘/아스파르트산 완충액(B2)은 추가 연구를 위한 백업 제제로 사용할 것이다.
실시예 3: 부형제 및 PS80 강도 스크리닝
부형제 및 PS80 스크리닝 연구의 목적은 가장 안정한 부형제를 식별하고 후보 완충계에서 항-Cx43 Ab에 대한 PS80의 최적 강도를 평가하는 것이었다.
pH 5.5의 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 완충액(B6)을 완충계로 선택하고, 연구 계획에 따라 염화나트륨, 소르비톨, 글리신, 수크로오스, PS80 및 EDTA와 조합하였다. pH 5.0의 20 mM 히스티딘/아스파르트산 완충액(B2)을 부형제 및 PS80 강도 스크리닝 연구를 위한 백업 완충액으로 사용하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이 9개의 제제를 설계하였다.
제제를 5주기 동안 동결/해동(-40±5℃/RT)하고, 25℃에서 300rpm으로 7일 동안 교반하고, 2~8℃, 25±2℃ 및 40±2℃에서 4주 동안 보관하였다. 샘플은 각 시점에서 적시에 회수하였고 분석 전에 2~8℃에서 보관하였다. 본 연구를 위해 외관, pH, Conc-UV280, 삼투압 농도, SEC-HPLC, cIEF, Caliper-SDS(환원&비환원), MFI를 포함한 테스트 항목을 수행하였다. 표 9는 부형제 및 PS80 강도 스크리닝 연구를 위한 샘플링 조건을 보여준다.
[표 8]
Figure pct00013
[표 9]
Figure pct00014
50L 풀로부터 pH 5.5의 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 완충액에 제제화된 항-Cx43 Ab DS(로트: 2144SD180528K01Y01D01)를 생성하였다. 한외여과 원심분리 장치(30,000 MWCO PES, VIVASPIN 20)를 사용하여 항-Cx43 Ab DS의 완충액 교환을 수행하였다. 각각의 최종 목표 제제의 성분을 표 1에 기재된 바와 같이 계산하였다. 교환율이 98%를 초과할 때까지 여러 라운드의 한외여과를 수행하였다. 그런 다음 해당 제제 완충액을 사용하여 단백질 농도를 25 mg/mL(B8) 및 50 mg/mL(B8 제외)로 조정하였다. 각 제제는 0.22 μm 필터(Millipore Express PES Membrane)를 통해 여과한 다음 4 mL/바이알 충전 부피로 6R 바이알에 분배하였다. 바이알은 충전 후 즉시 마개를 막고 밀봉하였다. 모든 여과, 충전 및 밀봉 작업은 생물 안전 후드에서 수행하였다. 각 제제에 적절한 수의 바이알을 각각 2~8℃, 25℃ 및 40℃ 안정성 챔버에 넣었다. 제제를 5주기 동안 동결/해동(-40±5℃/RT)하고, 25℃에서 300rpm으로 7일 동안 교반하였다. 예정된 시점에서 샘플을 취하여 분석하였다.
동결/해동 연구의 외관, 단백질 농도, 삼투압 농도 및 pH 값 결과는 표 10에 요약한다. 단백질 농도 및 삼투압 농도는 모두 T0에서 목표 값 근처에 있었다. 9개 샘플의 pH 값은 5회의 동결/해동 주기(-40±5℃/RT) 후 모두 목표 값 근처에 있었다. 샘플은 T0에서 모두 무색이고 약간 유백색이었으며 불용성 이물이 없었다. 5회의 동결/해동 주기(-40±5℃/RT) 후, F1 및 F3 샘플의 유백색 수준은 다른 샘플보다 더 진했고 PS80의 부재로 인해 F7 샘플에서 다수의 불용성 이물이 발견되었다. 이 데이터는 항-Cx43 Ab가 F2, F4, F5, F6, F8 및 F9에서 상대적으로 더 안정적임을 시사하였다.
[표 10]
Figure pct00015
동결/해동의 MFI 결과는 표 11에 요약한다. PS80이 없는 F7의 입자 수는 T0에서 다른 것보다 약간 더 많았다. 5회의 동결/해동 주기(-40±5℃/RT) 후, 모든 제제에 대해 증가 경향은 발견되지 않았다.
[표 11]
Figure pct00016
모든 제제에 대한 SEC-HPLC 결과는 표 12 및 도 6에 나열한다. T0에서, 모든 제제는 약 99.5%의 주요 피크와 유사한 SEC 순도를 보였다. 5회의 동결/해동 주기(-40±5℃/RT) 후, 모든 제제는 F3 샘플을 제외하고 99%보다 큰 비슷한 SEC 주요 피크 순도를 보였다. F3 샘플의 주요 피크 순도 감소는 2.7%로 약간 더 큰 감소를 보였다.
[표 12]
Figure pct00017
모든 제제에 대한 cIEF 결과는 표 13 및 도 7에 나열한다. pI에서 유의한 변화는 없었다. 샘플 F1, F7 및 F9의 주요 피크는 다른 제제보다 약간 낮았다. T0와 비교하여, 주요 피크, 산성 피크 및 염기성 피크의 비율도 5회의 동결/해동 주기(-40±5℃/RT)를 통해 모든 샘플에서 유의한 변화를 나타내지 않았다.
[표 13]
Figure pct00018
모든 제제에 대한 SDS-Caliper 데이터는 표 14 및 도 8에 열거한다.
모든 제제는 5회의 동결/해동 주기(-40±5℃/RT) 후 비환원 SDS-Caliper 또는 환원 SDS-Caliper에서 안정적인 순도를 나타냈다.
[표 14]
Figure pct00019
교반 연구의 외관, 단백질 농도, 삼투압 농도 및 pH 값 결과는 표 15에 요약한다. 단백질 농도 및 삼투압 농도는 모두 T0에서 목표 값 근처에 있었다. F7을 제외하고, 모든 제제는 25℃에서 7일 동안 교반 후에 pH 값과 외관이 안정적으로 유지되었다. F1 및 F3 샘플의 유백색 수준은 다른 샘플보다 더 진했고 25℃에서 7일 동안 교반 후에 F7 샘플에서 다수의 불용성 이물이 발견되었다.
[표 15]
Figure pct00020
모든 샘플에 대한 MFI 데이터는 표 16에 나열한다. F7의 입자 수는 T0에서 다른 것보다 약간 더 많았다. 25℃에서 7일 교반 후, PS80의 부재로 인해 F7에 대한 입자 수의 약간의 증가 경향이 있었다. F7을 제외하고, 다른 모든 샘플은 유사한 미립자 수를 보였고 증가 경향은 발견되지 않았다.
[표 16]
Figure pct00021
모든 제제에 대한 SEC-HPLC 결과는 표 17 및 도 9에 나열한다. 25℃에서 7일 교반 후, 모든 제제는 99% 초과의 유사한 SEC 주요 피크 순도를 보였다.
[표 17]
Figure pct00022
모든 제제에 대한 cIEF 결과는 표 18 및 도 10에 나열한다. 25℃에서 7일 교반 후 모든 샘플의 pI에서 변화는 없었다. 25℃에서 7일 교반 후, 모든 제제의 주요 피크 순도는 F7을 제외하고 안정적으로 유지되었다. 제제 F7의 주요 피크 순도는 1.2% 감소하였다.
[표 18]
Figure pct00023
모든 제제에 대한 SDS-Caliper 결과는 표 19 및 도 11에 나열한다. 모든 제제는 25℃에서 7일 교반 후 비환원 SDS-Caliper 또는 환원 SDS-Caliper에서 안정적인 순도를 보였다.
[표 19]
Figure pct00024
가속 안정성 연구에 대한 외관, 단백질 농도, 삼투압 농도 및 pH 값 결과는 표 20 및 표 21에 요약한다. 단백질 농도 및 삼투압 농도는 모두 T0에서 목표 값 근처에 있었다. 2~8℃, 25±2℃, 40±2℃에서 4주 동안 보관 후, pH 값은 변하지 않고 유지되었지만, F7에서는 PS80의 부재로 인해 약간의 불용성 이물이 발견되었다.
[표 20]
Figure pct00025
[표 21]
Figure pct00026
모든 샘플에 대한 MFI 데이터는 표 22에 나열한다. 2~8℃ 및 25±2℃에서 4주 동안 보관 후, 모든 제제에서 불용성 미립자 수에 명백한 변화가 없었다. 40±2℃에서 4주 동안 보관 후, F7에서 불용성 미립자 수(ECD ≥10 μm 및 ECD ≥ 25 μm)의 증가는 다른 제제에서보다 훨씬 높았으며, F7의 입자 수에는 약간의 증가 경향이 있었다.
[표 22]
Figure pct00027
모든 샘플에 대한 SEC-HPLC 데이터는 표 23 및 도 12에 나열한다. 2~8℃ 또는 25±2℃에서 4주 동안 보관 후, 모든 제제의 주요 피크 순도에서 뚜렷한 변화는 없었다. 40±2℃에서 2주 동안 보관 후, 주요 피크의 유의한 감소가 관찰되었다. 40±2℃에서 4주 동안 보관 후, 주요 피크의 감소는 2.2%~4.9% 범위였다. F1, F3 및 F6 샘플에서 주요 피크 순도의 감소는 각각 4.9%, 4.1% 및 4.6%였다. 대조적으로, F5 및 F8에 대한 주요 피크 감소는 다른 제제에 대한 것보다 비교적 완만하였다.
[표 23]
Figure pct00028
모든 샘플에 대한 cIEF 데이터는 표 24 및 도 13에 나열한다. 2~8℃, 25±2℃, 40±2℃에서 보관된 모든 시료의 pI에서 변화는 없었다. 2~8℃ 또는 25±2℃에서 4주 동안 보관 후, 모든 샘플의 주요 피크 순도는 약간 감소하였으며 모든 제제의 주요 피크 순도에서 유의한 변화는 없었다. 40±2℃에서 4주 동안 보관 후, 모든 샘플의 주요 피크 백분율이 크게 감소하였고, 동시에 산성 피크가 크게 증가하였다. 모든 샘플의 주요 피크 백분율에서 유의한 차이는 없었고, 주요 피크 감소는 20.6%~23.9% 범위였다.
[표 24]
Figure pct00029
모든 샘플에 대한 SDS-Caliper 데이터는 표 25, 도 14 및 도 15에 나열한다. 2~8℃ 또는 25±2℃에서 4주 동안 보관 후, 모든 제제는 비환원 SDS-Caliper와 환원 SDS-Caliper에서 안정적인 순도를 보였다. 40±2℃에서 4주 동안 보관 후, 비환원 SDS-Caliper 및 환원 SDS-Caliper에서 모든 제제의 순도가 상당히 감소하였다. F3에서 비환원 순도 감소는 23.2%로 모든 제제에서 가장 큰 감소를 보였다. F1 및 F3에서 순도 감소는 각각 6.0% 및 6.1%였다. 비환원 SDS-Caliper 데이터에 따르면 F5와 F9의 순도가 다른 것보다 약간 높았고, 환원 SDS-Caliper 데이터에 따르면 F2와 F9의 순도가 다른 것보다 약간 높았다.
[표 25]
Figure pct00030
5회의 동결/해동 주기(-40±5℃/RT) 후, 모든 제제의 항-Cx43 Ab는 단백질 농도, pH 값, 삼투압 농도 및 순도(SDS-Caliper 환원 & 비환원)에서 유의한 차이를 보이지 않았다. F1 및 F3 샘플의 유백색 수준은 다른 샘플보다 더 진했다. 계면활성제가 없는 샘플 F7에서 불용성 이물 및 불용성 미립자 수(MFI)는 다른 제제에서보다 훨씬 더 컸지만, 5회의 동결/해동 주기 후에 증가 경향은 발견되지 않았다. F3 샘플의 SEC 주요 피크는 2.7%로 약간 더 큰 감소를 보였다. cIEF 주요 피크는 모든 제제에서 거의 변하지 않았다.
25℃에서 7일 교반 후, 모든 제제의 항-Cx43 Ab는 단백질 농도, pH 값, 삼투압 농도 및 순도(SEC-HPLC, cIEF, SDS-Caliper 환원 & 비환원)에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 또한, F1 및 F3 샘플의 유백색 수준은 다른 샘플보다 더 진했다. 계면활성제가 없는 샘플 F7의 불용성 이물 및 불용성 미립자 수(MFI)는 다른 제제보다 훨씬 컸다.
2~8℃에서 4주 동안 보관 후, 모든 제제의 항-Cx43 Ab는 단백질 농도, pH 값, 삼투압 농도, 불용성 미립자 및 순도(SEC-HPLC, cIEF, SDS-Caliper 환원 & 비환원)에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 2~8℃에서 4주 동안 보관 후 F7 제제에서 약간의 불용성 이물만 발견되었다.
25±2℃에서 4주 동안 보관 후, 모든 제제의 항-Cx43 Ab는 단백질 농도, pH 값, 삼투압 농도, 불용성 미립자 및 순도(SEC-HPLC, SDS-Caliper 환원 & 비환원)에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 또한, PS80을 첨가하지 않았기 때문에 제제 F7에서 약간의 불용성 이물이 발견되었다. 모든 샘플의 cIEF 주요 피크는 크게 감소하였지만, 25±2℃에서 4주 동안 보관 후 9개의 제제에서 유의한 차이는 발견되지 않았다.
40±2℃에서 4주 동안 보관 후, 모든 제제의 항-Cx43 Ab는 단백질 농도, pH 값 및 삼투압 농도에서 유의한 차이를 보이지 않았다. PS80을 첨가하지 않았기 때문에 제제 F7에서 약간 불용성 이물이 발견되었다. F7에서 불용성 미립자 수 수(ECD ≥10 μm 및 ECD ≥ 25 μm)의 증가는 다른 제제에서보다 훨씬 더 컸다. 모든 샘플의 순도(SEC-HPLC, cIEF, SDS-Caliper 환원 & 비환원)는 크게 감소하였다. F1, F3 및 F6에 대한 SEC 주요 피크는 다른 제제보다 상당히 많이 감소하였다. 모든 샘플의 cIEF 주요 피크는 유의한 차이를 나타내지 않았다. F3의 비환원 순도 감소는 모든 제제에서 가장 컸다. F1 및 F3의 순도 감소는 다른 것보다 더 컸다.
요약하면, pH/완충액 스크리닝, 부형제 및 PS80 강도 스크리닝을 포함한 제제 개발 연구를 수행하여 선도 제제를 결정하였다.
pH/완충액 스크리닝에서, 히스티딘/히스티딘 염산염 완충계는 단백질을 안정화시키는 더 우수한 능력을 나타냈다.
부형제 및 PS80 강도 스크리닝에서, 항-Cx43 Ab의 안정성을 조사하기 위해 염화나트륨, 소르비톨, 글리신 및 수크로오스(F1, F2, F3 및 F4)를 선택하였다. 결과는 항-Cx43 Ab가 부형제로서 수크로오스를 사용한 히스티딘 완충액에서 상대적으로 더 안정적임을 시사하였다. 상이한 농도의 PS80(F4, F6 및 F7)을 이용한 샘플의 안정성 데이터는 0.02% PS80이 0% 또는 0.05% PS80보다 더 우수하게 항-Cx43 Ab를 안정화시킴을 보여주었다.
pH/완충액 스크리닝의 SDS-Caliper 데이터(표 7)는 항-Cx43 Ab가 40±2℃에서 2주 또는 4주 동안 보관 후 절두되었음(truncated)을 보여주었으며, 이는 SEC-HPLC 데이터에서 LWM 피크의 생성으로 확인되었다. 그러나 부형제 및 PS80 강도 스크리닝의 데이터는 부형제 첨가가 단백질 절두를 완화시키지 못하였음을 나타내었다. 펩티드 맵핑에 의한 분석은 단백질이 중쇄의 상보성 결정 영역(CDR)의 Asn-Pro 부위에서 절단되었음을 보여주었다. 또한, 여러 연구에서 Asn-Pro의 파손은 물의 존재로 인해 일어나는 가수분해 반응으로 염기성 환경이나 고온 조건에서 가속되는 것으로 나타났다. pH/완충액 스크리닝의 SDS-Caliper 데이터는 가장 낮은 순도의 샘플이 B9였으며 이는 또한 가장 높은 pH 값임을 보여주었다(표 7). 부형제 스크리닝을 위해 선택된 pH/완충계가 산성이었지만 단백질 절두를 방지할 수 없었다. 절두를 최소화하기 위한 해결책은 동결된 DP 형태로 Ab를 개발하는 것이었다.
F5(50 mg/mL) 및 F8(25 mg/mL)을 포함하는 단백질 농도 연구는 농도가 항-Cx43 Ab의 안정성에 거의 영향을 미치지 않았음 것을 보여주었다. 40±2℃에서 SEC-HPLC, Caliper-SDS 및 cIEF 테스트를 통해 F5(EDTA 포함)의 성능이 F4(EDTA 없음)보다 약간 우수했지만, 이 두 제제 간의 차이는 25℃±2℃ 및 2~8℃의 저온 조건에서 무시할 수 있었다.
요약하면, 8% 수크로오스와 0.02%(w/v) PS80을 포함하는 pH 5.5의 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 중 50 mg/mL의 항-Cx43 Ab를 확인 연구를 위한 선도 제제로 간주하였다.
실시예 4: 제제 확인 연구
선택된 제제의 안정성을 확인하기 위해 항-Cx43 Ab 제제 확인 연구를 수행하였다. 확인 연구에서 평가된 조건에는 보관 조건, 스트레스 조건, 동결/해동 및 교반이 포함된다. 제제 스크리닝 연구로부터 선택된 제제는 8%(w/v) 수크로오스 및 0.02%(w/v) PS80을 포함하는 pH 5.5의 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 완충액 중의 50 mg/mL 항-Cx43 Ab였다.
첫 번째 15L 풀(로트: 2144SD181129K01X01D01)에서 생성된 pH 5.5의 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 완충액, 8%(w/v) 수크로오스, 0.02%(w/v) PS80인 선택된 선도 제제에 대해 안정성 연구를 수행하였다. 이 연구에서 항-Cx43 Ab 농도는 50 mg/mL였다. 제제는 각각 -40℃, -20℃, 2~8℃ 및 25℃에서 3개월 동안 보관하고 40℃에서 4주 동안 보관하였다. 제제를 5주기 동안 동결/해동(-40±5℃/RT)하고, 25℃에서 100 rpm으로 7일 동안 교반하였다. 샘플은 각 시점에서 시기 적절하게 취하여 분석 전에 2~8℃에서 보관하였다. 본 연구를 위해 외관, pH, 삼투압 농도, Conc-UV280, SEC-HPLC, CEX-HPLC, CE-SDS(환원&비환원), MFI, mDSC 및 효력을 포함하는 테스트 항목을 수행하였다. 샘플링 계획은 표 26에 나타낸다.
[표 26]
Figure pct00031
항-Cx43 Ab DS를 0.22 μm 필터(Millipore Express PVDF Membrane)를 통해 여과한 다음 3 mL/바이알 충전 부피로 6R 바이알에 분배하였다. 바이알은 충전 후 즉시 마개를 막고 밀봉하였다. 모든 여과, 충전 및 밀봉 작업은 생물 안전 후드에서 수행하였다. 적절한 수의 바이알을 -40℃, -20℃ 및 2~8℃ 냉장고에 넣고, 25℃ 및 40℃ 안정성 챔버에 각각 넣었다. 한편, 병을 -40℃ 냉동고에서 동결하고 실온에서 5주기 동안 해동하고 각각 25℃에서 100 pm 항온 진탕기에 7일 동안 고정시켰다. 예정된 시점에 샘플을 취하여 분석하였다.
8% 수크로오스 및 0.02%(w/v) PS80을 포함하는 pH 5.5의 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 중 항-Cx43 Ab의 써모그램은 표 27 및 도 16에 나타낸다. 샘플이 유리 전이를 시작하는 온도인 Tg' 개시 값은 샘플의 보관 조건에 대한 지표로 간주하였다. 항-Cx43 Ab의 Tg' 개시는 -29.22℃였다.
[표 27]
Figure pct00032
동결/해동 및 교반 연구의 외관, 단백질 농도, pH 및 삼투압 농도 결과는 표 28에 요약한다. 5회의 동결/해동 주기(-40±5℃/RT) 및 7일 교반 후 외관, 단백질 농도, pH 및 삼투압 농도에 명백한 변화는 없었다. 모든 샘플은 무색이고 약간 유백색이며 불용성 이물이 없는 것으로 나타났다. 단백질 농도에서 명백한 변화는 관찰되지 않았으며, 모든 결과는 50.0±5.0 mg/mL의 규격 내에 있었다. T0와 비교하여 pH 및 삼투압 농도에서 명백한 변화는 관찰되지 않았다. 낮은 삼투압 농도는 DS 제조 중 수크로오스 첨가가 불충분하여 발생하였다. 확인 연구에서 수크로오스의 최종 농도는 6.7%였다. 이론적으로, 8.0% 수크로오스로 제제화된 단백질은 6.7% 수크로오스로 제제화된 단백질보다 더 안정할 것이다. 수크로오스 농도의 증가에 따라 Tm이 증가하는 것으로 보고되었다. 수크로오스의 안정화 효과는 시스템에서 단백질을 제외시키고 폴딩된 단백질의 안정화로 이어지는 물과 수크로오스 사이의 강한 상호 작용으로 인한 용매의 높은 응집력의 결과이다. 따라서, 수크로오스 농도에 따른 Tm의 증가는 단백질 분자를 수용하기 위해 물-수크로오스 혼합물에서 공동을 형성하기 위해 더 높은 에너지가 필요함을 반영한다.
[표 28]
Figure pct00033
동결/해동 및 교반 연구에 대한 MFI 결과는 표 29에 요약한다. 5회의 동결/해동 주기(-40±5℃/ RT) 및 25℃에서 7일 교반 후 입자 수(ECD≥10 μm 및 ECD≥ 25 μm)의 증가 경향은 관찰되지 않았다.
[표 29]
Figure pct00034
동결/해동 및 교반 연구의 SEC-HPLC 결과는 표 30에 요약한다. 5회의 동결/해동 주기 및 7일 교반 후에 명백한 변화는 관찰되지 않았다. 모든 샘플은 99.6% 또는 99.7%에서 SEC 주요 피크 순도를 유지하였다.
[표 30]
Figure pct00035
동결/해동 및 교반 연구에 대한 CE-SDS 결과는 표 31에 요약한다. 5회의 동결/해동 주기 및 7일 교반 후 명백한 변화는 관찰되지 않았다.
[표 31]
Figure pct00036
동결/해동 및 교반 연구의 CEX-HPLC 결과는 표 32에 요약한다. T0와 비교하여, 주요 피크, 산성 피크 및 염기성 피크의 비율은 5회의 동결/해동 주기(-40±5℃/RT) 및 7일 교반 후 유의한 변화를 보이지 않았다.
[표 32]
Figure pct00037
상이한 저장 조건의 외관, 단백질 농도, pH 및 삼투압 농도 결과는 표 33에 요약한다. 25±2℃에서 1개월 동안 보관된 한 개 샘플이 뜻밖에 약간의 불용성 이물을 포함하는 것으로 나타난 것을 제외하고 모든 샘플은 무색이고 약간 유백색이었으며 불용성 이물이 없었다. T0와 비교하여 단백질 농도, pH 및 삼투압 농도에 명백한 변화는 관찰되지 않았으며 모든 결과는 규격 내에 있었다.
상이한 보관 조건의 MFI 결과는 표 34에 요약한다. -40℃, -20℃, 2~8℃ 및 25℃에서 불용성 미립자 수에는 분명한 변화가 없었다. 불용성 미립자의 양은 40±2℃에서 2주 동안 보관한 후에 상당히 증가하였지만, 40±2℃에서 4주 동안 보관 후에는 증가 경향이 발견되지 않았다. 25±2℃에서 1개월 동안의 데이터는 불용성 이물의 생성으로 인해 참고용이었다.
상이한 보관 조건에서 샘플의 SEC-HPLC 결과는 표 35에 요약한다. -40±5℃, -20±5℃ 및 2~8℃에서 3개월 동안 보관 후 뚜렷한 변화는 관찰되지 않았다. 모든 샘플은 99.6% 또는 99.7%에서 SEC 주요 피크 순도를 유지하였다. 25℃에서 인큐베이션된 샘플의 경우, 보관 3개월 후에 주요 피크의 약간의 감소(주요 피크의 감소는 2.0%이었음)가 관찰되었다. 40℃에서 인큐베이션된 샘플의 경우, 보관 4주 후에 주요 피크의 상당한 감소(주요 피크의 감소는 4.2%이었음)가 관찰되었다.
상이한 보관 조건에 대한 CE-SDS 결과는 표 36에 나타낸다. -40±5℃, -20±5℃ 및 2~8℃에서 3개월 동안 보관 후 뚜렷한 변화는 관찰되지 않았다. 모든 샘플은 각각 98.6%~99.3% 및 97.0%~98.1% 범위에서 CE-R 및 CE-NR 주요 피크 순도를 유지하였다. 25℃에서 인큐베이션된 샘플의 경우, 보관 1개월 후 주요 피크의 약간의 감소가 관찰되었으며, 3개월 보관 후 주요 피크의 상당한 감소(CE-R 주요 피크의 감소는 4.4%이었고 CE-NR 주요 피크의 감소는 10.5%이었음)가 관찰되었다. 40℃에서 인큐베이션된 샘플의 경우, 보관 4주 후 주요 피크의 상당한 감소(CE-R 주요 피크의 감소는 7.7%이었고, CE-NR 주요 피크의 감소는 22.8%이었음)가 관찰되었다.
상이한 보관 조건에 대한 CEX-HPLC 결과를 표 37에 나타낸다. -40±5℃, -20±5℃ 및 2~8℃에서 3개월 동안 보관 후 명백한 변화는 관찰되지 않았다. 모든 샘플은 70.4%~73.8% 범위에서 CEX 주요 피크를 유지하였다. 25℃에서 인큐베이션된 샘플의 경우, 보관 1개월 후에 주요 피크의 약간의 감소가 관찰되었고, 보관 3개월 후에 주요 피크의 상당한 감소(CEX 주요 피크의 감소는 10.9%이었음)가 관찰되었다. 40℃에서 인큐베이션된 샘플의 경우, 보관 4주 후에 주요 피크의 상당한 감소(CEX 주요 피크의 감소는 25.9%이었음)가 관찰되었다.
상이한 보관 조건에 대한 효력 결과는 표 38에 나타낸다. 상이한 보관 조건에 대한 효력은 60~140% 범위에서 유지되었다. -40±5℃, -20±5℃, 2~8℃ 및 25±2℃에서 3개월 동안 보관 후 연구 기간 동안 제제에 대해 효력 감소가 관찰되지 않았다. 40℃에서 4주 동안 보관 후 효력의 상당한 감소가 관찰되었다.
5회의 동결/해동 주기(-40±5℃/RT) 및 25℃에서 7일 교반 후, 선택된 제제의 항-Cx43 Ab는 외관, 단백질 농도, pH 값, 삼투압 농도 및 순도(SEC-HPLC, CEX-HPLC, CE-SDS 환원 및 비환원)에서 유의한 차이를 보이지 않았다. -40±5℃, -20±5℃ 및 2~8℃에서 3개월 동안 보관 후, 선택된 제제의 항-Cx43 Ab는 외관, 단백질 농도, pH 값, 삼투압 농도, 순도(SEC-HPLC, CEX-HPLC, CE-SDS 환원 및 비환원) 및 효력에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 25±2℃에서 3개월 동안 보관 후, 선택된 제제의 항-Cx43 Ab는 외관, 단백질 농도, pH 값, 삼투압 농도 및 효력에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 선택된 제제의 순도(SEC-HPLC, CEX-HPLC, CE-SDS 환원 및 비환원)는 25±2℃에서 1개월 동안 보관 후 약간 감소했으며 25±2℃에서 3개월 동안 보관 후 상당히 감소하였다. 40±2℃에서 4주 동안 보관 후, 선택된 제제의 항-Cx43 Ab는 외관, 단백질 농도, pH 값 및 삼투압 농도에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 불용성 미립자의 양은 40±2℃에서 2주 동안 보관 후에 상당히 증가하였지만, 40±2℃에서 4주 동안 보관 후에는 증가 경향이 발견되지 않았다. 선택된 제제의 순도(SEC-HPLC, CEX-HPLC, CE-SDS 환원 및 비환원) 및 효력이 모두 상당히 감소하였다.
요약하면, 8% 수크로오스 및 0.02%(w/v) PS80을 포함하는 pH 5.5의 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 중 50 mg/mL 항-Cx43 Ab를 확인 연구를 위한 선도 제제로 선택하였다. 테스트된 모든 항목은 -20±5℃가 장기 보관 온도일 때 유의한 변화를 나타내지 않았으며, 이는 항-Cx43 Ab가 이 제제에서 안정함을 나타냈다.
[표 33]
Figure pct00038
[표 34]
Figure pct00039
[표 35]
Figure pct00040
[표 36]
Figure pct00041
[표 37]
Figure pct00042
[표 38]
Figure pct00043
본 발명의 기술된 방법 및 조성물의 변형 및 변화는 본 개시 내용의 범위 및 취지를 벗어나지 않고 당업자에게 명백할 것이다. 본 개시 내용이 특정 실시 양태와 관련하여 설명되었지만, 청구된 개시 내용이 이러한 특정 실시 양태에 부당하게 제한되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 본 개시 내용을 수행하기 위한 설명된 방식의 다양한 변형은 본 개시 내용이 다음 청구범위에 의해 나타내는 본 개시 내용의 범위 내에 있는 관련 분야의 숙련자에 의해 의도되고 이해된다.
참고에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 각각의 독립적인 특허 및 간행물이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
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Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 18 <211> 220 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <220> <221> VariableDomain <222> (1)..(113) <220> <221> ConstantRegion <222> (114)..(220) <400> 18 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 19 Phe Leu Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile 1 5 10

Claims (20)

  1. 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    완충액;
    계면활성제; 및
    안정제
    를 포함하는 약학 제제로서,
    약학 제제는 약 5 내지 약 6의 pH를 가지며;
    항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    각각 서열 번호 1, 2, 및 3의 아미노산 서열을 갖는 제1, 제2, 및 제3 중쇄 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region) 서열; 및
    각각 서열 번호 4, 5, 및 6의 아미노산 서열을 갖는 제1, 제2, 및 제3 경쇄 CDR 서열
    을 포함하는, 약학 제제.
  2. 제1항에 있어서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 약학 제제.
  3. 제2항에 있어서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 9-17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 것인 약학 제제.
  4. 제1항에 있어서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 FLSRPTEKTI(서열 번호 19)의 아미노산 서열 내에 위치한 에피토프에 결합하는 것인 약학 제제.
  5. 제4항에 있어서, 에피토프는 서열 번호 19의 R4, P5, E7, K8 및 I10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것인 약학 제제.
  6. 제4항에 있어서, 에피토프는 서열 번호 19의 R4, P5, E7, K8 및 I10으로 이루어진 것인 약학 제제.
  7. 제4항에 있어서, 에피토프는 서열 번호 19의 10개의 모든 아미노산을 포함하는 것인 약학 제제.
  8. 제4항에 있어서, 에피토프는 서열 번호 19의 10개의 모든 아미노산으로 이루어진 것인 약학 제제.
  9. 제1항에 있어서, 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 5 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 바람직하게는 20 mg/mL 내지 80 mg/mL, 보다 바람직하게는 40 mg/mL 내지 60 mg/mL의 농도로 존재하는 것인 약학 제제.
  10. 제1항에 있어서, 완충액은 아세테이트/아세트산나트륨, 히스티딘/아스파르트산, 시트르산/시트르산나트륨, 제2인산나트륨/인산이수소나트륨, 및 히스티딘/히스티딘 염산염으로부터 선택되는 것인 약학 제제.
  11. 제10항에 있어서, 완충액은 히스티딘/아스파르트산 또는 히스티딘/히스티딘 염산염인 약학 제제.
  12. 제11항에 있어서, 완충액은 히스티딘/히스티딘 염산염인 약학 제제.
  13. 제1항에 있어서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80(PS80)인 약학 제제.
  14. 제1항에 있어서, 안정제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 염화나트륨, 소르비톨, 글리신 및 수크로오스로부터 선택되는 것인 약학 제제.
  15. 제14항에 있어서, 안정제는 수크로오스인 약학 제제.
  16. 제1항에 있어서, pH는 약 5.4 내지 약 5.6인 약학 제제.
  17. 제1항에 있어서, 제제는 수성 제제인 약학 제제.
  18. 약 40-60 mg/mL, 바람직하게는 약 50 mg/mL의 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    약 10-40 mM, 바람직하게는 약 20 mM 히스티딘/히스티딘 염산염 완충액;
    약 0.005%-0.05%, 바람직하게는 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및
    약 1%-20% w/v, 바람직하게는 약 8% w/v 수크로오스
    를 포함하는 약학 제제로서,
    약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는, 약학 제제.
  19. 서열 번호 9-17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하고, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 약 50 mg/mL 항-Cx43 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    약 20 mM 히스티딘/아스파르트산 완충액;
    약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80; 및
    약 8% w/v 수크로오스
    를 포함하는 약학 제제로서,
    약 5.4 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는, 약학 제제.
  20. 세포에서 Cx43 반채널(hemichannel)의 개방을 억제하기 위한, 바람직하게는 염증성 질환 또는 병태 또는 척수 손상과 같은 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항의 약학 제제의 용도.
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