KR20230040025A - 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품조성물에 관한 것으로, 상세하게는, 인체지방에서 유래한 줄기세포의 막을 제거하고 유효성분을 추출한 펩타이드를 이용하여 인지능력 또는 기억능력을 개선에 도움을 줄 수 있고, 관련 질환의 발생위험 감소에 도움을 줄 수 있는 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
인지능력은 상황이나 상태를 인지하고 분별하는 능력을 말하며, 이는 지식을 획득하고 사용하는 방식에 관한 능력으로도 정의된다. 인지능력은 기억한 경험을 유지하고 재현하는 것으로, 지식, 이해력, 사고력, 문제 해결력, 비판력 및 창의력 등으로 구성된다.
기억은 의식적 또는 무의식적인 상태에서 과거의 일을 생각해내는 능력을 말하는데, 특히 학습과 기억은 상호 밀접하게 연관되어 있어 항상 동시에 고려되어야 한다. 기억은 세 가지 단계로 이루어질 수 있는데, 첫 번째로 새로운 정보 또는 지식을 외워서 뇌에 입력하는 입력단계, 두 번째는 상기 뇌에 입력된 정보 또는 지식을 뇌에 저장하는 저장단계, 세 번째는 상기 저장된 정보 또는 지식을 다시 생각하는 회상단계가 그것이다. 상기 세 단계 중에 어느 하나라도 이상이 생기면 정보 또는 지식을 정확하게 기억할 수 없게 되는 현상 즉, 기억력 저하 내지 감퇴가 일어날 수 있다. 이러한 인지능력 또는 기억능력의 저하로 나타나는 가장 대표적인 질환은 치매이다. 치매는 뇌의 위축과, 신경세포의 감소 및 노인반(senile plaque) 등으로 인해 뇌신경의 파괴가 원인이 되어 기억력 장애, 판단력 상실 등 인지기능 장애 증상을 나타내는 것이다.
상세하게는, 치매는 알츠하이머(Alzheimer's disease), 혈관성 치매, 퇴행성 질환 및 뇌질환 등으로 분류된다. 치매의 종류 중 가장 큰 부분을 차지하고 있는 알츠하이머는, 발병 원인이 아직까지 명확히 밝혀지지 않았으나, 뇌 중 아세틸콜린(acetylcholine)의 결핍과 베타절단효소(β-secretase)에 의해 생성되는 아밀로이드 베타 단백질(
-amyloid protein)에 의한 독성이 주요 병인일 것으로 추정되고 있다.
최근, 노인인구의 증가로 노인성 질환에 대한 관심은 높아지고 있으며, 그 중 치매는 개인과 가족 및 사회에 높은 경제적 부담을 주는 질환으로 이에 대한 예방과 치료에 대한 수요가 나날이 증가하고 있다. 이에, 선행기술1 (대한민국 등록특허 제10-2136586호) 및 선행기술2 (대한민국 등록특허 제10-1319829호)와 같이, 치매를 유발할 수 있는 인지능 개선을 위한 다양한 조성물들이 개발되고 있다.
한편, 줄기세포(stem cell)는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로, 다양한 조직 세포로 분화할 수 있는 능력 때문에 이를 이용한 연구가 많이 행해지고 있다. 이러한 줄기세포는 자가 이식을 위한 수확의 용이성과, 높은 증식 속도 및 신경 세포를 비롯한 여러 세포 유형으로 분화하는 능력을 가지고 있어 다양한 질병 치료에 사용되고 있다.
특히, 줄기세포에서 분비되는 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine) 및 성장인자를 비롯한 수많은 생리활성 단백질은 여러가지 생리학적 과정을 조절한다. 따라서 줄기세포를 다양한 질병모델에 적용하였을 때 위의 생리활성 단백질을 통하여 항산화, 항염증 및 조직 재생 등의 작용을 통하여 치료 효능을 나타낸다는 연구결과가 보고되고 있다. 특히 최근 알츠하이머를 포함한 치매에서도 이러한 작용을 통하여 치료 효능이 나타난다는 보고가 늘어나고 있으며, 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나, 줄기세포는 체내에서 장기간 생존하지 못하며 종래의 성체줄기세포를 바로 주입하는 방법은 면역 거부 반응, 알레르기 반응 및 건강한 장기의 손상 등 잠재적인 부작용을 일으킬 수 있어, 줄기세포를 이용한 인지능 또는 기억능력 개선용 조성물에 대한 기술개발이 원활하게 이뤄지지 않고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 선행기술3(대한민국 등록특허 제10-1178032호) 및 선행기술4(대한민국 등록특허 제10-1561672호)에 따라 제조된 인체지방 유래 무막줄기세포추출물을 포함하는 기능성 식품 조성물을 이용하여 인지능 또는 기억능력 개선 및 인지능 또는 기억능력 관련 질환의 예방 효과를 확인하고자 한다.
상술한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은, 무막줄기세포추출물을 이용하여 인지능력 및 기억능력을 효과적으로 개선할 수 있는, 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명은, 무막줄기세포추출물을 이용하여 아밀로이드 베타 단백질의 발현에 따른 신경 독성으로부터 신경세포를 보호할 수 있는, 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물을 제공하는 데에 있다.
아울러, 본 발명은, 무막줄기세포추출물을 이용하여 신경세포 등의 성장과 작용을 도울 수 있는 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명은 무막줄기세포추출물을 이용하여 퇴행성 뇌질환 또는 치매, 특히, 알츠하이머 치매에 효과적인, 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 관련 질환의 예방용 기능성 식품 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 과제를 이루기 위해 본 발명의 일 측면은 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 무막줄기세포추출물은 인체 지방에서 유래한 줄기세포의 막을 제거하고 유효성분을 추출한 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 베타카로틴(β-carotene), 엽산(folic acid), 피리독신(pyridoxine), 코발라민(cobalamin) 및 아스코르브산(ascorbic acid)에서 선택되는 어느 하나 이상의 비타민첨가제가 혼합된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 아밀로이드 베타 단백질(amyloid beta protein, Aβ)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 측면은 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 관련 질환의 예방용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 아밀로이드 베타 단백질(amyloid beta protein)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 인지능 또는 기억능력 관련 질환은 퇴행성 뇌질환 또는 치매인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 인지능 또는 기억능력 관련 질환은 알츠하이머형 치매인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물은 인지능력 및 기억능력과 관련된 질환인 퇴행성 뇌질환 또는 치매를 효과적으로 예방할 수 있다.
또한, 본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물은 무막줄기세포추출물의 생리활성 기능에 의해 아밀로이드 베타 단백질의 발현을 억제할 수 있어 아밀로이드 베타 단백질에 의해 유발되는 신경독성으로 인한 신경세포의 염증과 사멸을 약화시킬 수 있다.
아울러, 본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물은 무막줄기세포추출물에 비타민을 첨가하여 무막줄기세포추출물의 인지능력 및 기억능력 개선 효율을 더욱 높일 수 있다.
또한, 본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 관련 질환의 예방용 기능성 식품 조성물은 무막줄기세포추출물을 통해 퇴행성 뇌질환 또는 치매, 특히, 알츠하이머 치매의 예방 효능을 나타내는 것일 수 있다. 다만, 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들을 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 Aβ에 의해 유도된 신경세포 사멸이 무막줄기세포추출물에 의해 농도 의존적으로 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 2는 Aβ에 의해 증가한 신경세포의 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 생성이 무막줄기세포추출물에 의해 농도 의존적으로 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 3(A) 내지 도 3(B)는 Aβ에 의해 증가한 신경세포의 활성산소종 생성이 무막줄기세포추출물에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 4는 Aβ에 의해 증가한 염증 매개인자(iNOS, COX-2)의 발현이 무막줄기세포추출물에 의해 농도 의존적으로 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 5는 Aβ 유도 세포사멸 유발인자(Bax) 발현 증가 및 세포사멸 억제인자 (Bcl-2) 발현 억제가 무막줄기세포추출물에 의해 농도 의존적으로 조절되는 결과를 나타낸 도표.
도 6은 Aβ 유도 Aβ 생성 관련 단백질 (APP, amyloid precursor protein; BACE, β-secretase; PS, preselin) 발현 증가가 무막줄기세포추출물에 의해 농도 의존적으로 억제되는 결과를 나타낸 도표.
도 7은 Aβ에 의해 유도된 신경세포 사멸이 무막줄기세포추출물, pyridoxal phosphate(PLP) 및 무막줄기세포추출물과 PLP 혼합물 (MP)에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 8은 Aβ에 의해 유도된 신경세포의 LDH 생성이 무막줄기세포추출물, PLP, MP에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 9(A) 내지 도 9(B)는 Aβ에 의해 증가한 신경세포의 활성산소종 생성이 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 10(A) 내지 도 10(B)는 Aβ 유도 Aβ 생성 관련 단백질(APP, BACE, PS) 발현 증가가 무막줄기세포추출물 단독 처리 및 PLP 혼합물 처리에 의해 억제되는 결과를 나타낸 도표.
도 11은 Aβ에 의해 유도된 신경세포의 acetylcholine esterase(AChE) 발현 증가가 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 12는 Aβ 유도 세포사멸 유발인자(Bax) 발현 증가 및 세포사멸 억제인자(Bcl-2) 발현 억제가 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 조절되는 결과를 나타낸 도표.
도 13은 Aβ에 의해 증가한 염증 매개인자(iNOS, COX-2) 및 염증성 cytokine(interleukin-1β IL-1β)의 발현이 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 14(A) 내지 도 14(B)는 마우스에서 Aβ로 유도된 인지능 및 기억력 저하가 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 개선된 T-maze 및 물체인지실험 결과를 나타낸 도표.
도 15(A) 내지 도 15(C)는 마우스에서 Aβ로 유도된 인지능 및 기억력 저하가 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 개선된 Morris water maze test 결과를 나타낸 도표.
도 16(A) 내지 도 16(B)은 Aβ로 유도된 인지능 및 기억력 저하 마우스에서 증가한 Aβ 생성 관련 단백질(APP, BACE, PS) 발현이 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 억제되는 결과를 나타낸 도표.
도 17은 Aβ로 유도된 인지능 및 기억력 저하 마우스에서 감소한 brain derived neurotrophic factor(BDNF) 발현이 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 억제되는 결과를 나타낸 도표.
도 18은 Aβ로 유도된 인지능 및 기억력 저하 마우스에서 세포사멸 유발인자 (Bax) 발현 증가 및 세포사멸 억제인자(Bcl-2) 발현 억제가 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 조절되는 결과를 나타낸 도표.
도 19는 Aβ로 유도된 인지능 및 기억력 저하 마우스에서 AChE의 발현 증가가 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 20(A) 내지 도 20(C)는 Aβ로 유도된 인지능 및 기억력 저하 마우스에서 활성산소종 증가가 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 2는 Aβ에 의해 증가한 신경세포의 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 생성이 무막줄기세포추출물에 의해 농도 의존적으로 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 3(A) 내지 도 3(B)는 Aβ에 의해 증가한 신경세포의 활성산소종 생성이 무막줄기세포추출물에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 4는 Aβ에 의해 증가한 염증 매개인자(iNOS, COX-2)의 발현이 무막줄기세포추출물에 의해 농도 의존적으로 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 5는 Aβ 유도 세포사멸 유발인자(Bax) 발현 증가 및 세포사멸 억제인자 (Bcl-2) 발현 억제가 무막줄기세포추출물에 의해 농도 의존적으로 조절되는 결과를 나타낸 도표.
도 6은 Aβ 유도 Aβ 생성 관련 단백질 (APP, amyloid precursor protein; BACE, β-secretase; PS, preselin) 발현 증가가 무막줄기세포추출물에 의해 농도 의존적으로 억제되는 결과를 나타낸 도표.
도 7은 Aβ에 의해 유도된 신경세포 사멸이 무막줄기세포추출물, pyridoxal phosphate(PLP) 및 무막줄기세포추출물과 PLP 혼합물 (MP)에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 8은 Aβ에 의해 유도된 신경세포의 LDH 생성이 무막줄기세포추출물, PLP, MP에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 9(A) 내지 도 9(B)는 Aβ에 의해 증가한 신경세포의 활성산소종 생성이 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 10(A) 내지 도 10(B)는 Aβ 유도 Aβ 생성 관련 단백질(APP, BACE, PS) 발현 증가가 무막줄기세포추출물 단독 처리 및 PLP 혼합물 처리에 의해 억제되는 결과를 나타낸 도표.
도 11은 Aβ에 의해 유도된 신경세포의 acetylcholine esterase(AChE) 발현 증가가 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 12는 Aβ 유도 세포사멸 유발인자(Bax) 발현 증가 및 세포사멸 억제인자(Bcl-2) 발현 억제가 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 조절되는 결과를 나타낸 도표.
도 13은 Aβ에 의해 증가한 염증 매개인자(iNOS, COX-2) 및 염증성 cytokine(interleukin-1β IL-1β)의 발현이 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 14(A) 내지 도 14(B)는 마우스에서 Aβ로 유도된 인지능 및 기억력 저하가 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 개선된 T-maze 및 물체인지실험 결과를 나타낸 도표.
도 15(A) 내지 도 15(C)는 마우스에서 Aβ로 유도된 인지능 및 기억력 저하가 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 개선된 Morris water maze test 결과를 나타낸 도표.
도 16(A) 내지 도 16(B)은 Aβ로 유도된 인지능 및 기억력 저하 마우스에서 증가한 Aβ 생성 관련 단백질(APP, BACE, PS) 발현이 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 억제되는 결과를 나타낸 도표.
도 17은 Aβ로 유도된 인지능 및 기억력 저하 마우스에서 감소한 brain derived neurotrophic factor(BDNF) 발현이 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 억제되는 결과를 나타낸 도표.
도 18은 Aβ로 유도된 인지능 및 기억력 저하 마우스에서 세포사멸 유발인자 (Bax) 발현 증가 및 세포사멸 억제인자(Bcl-2) 발현 억제가 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 조절되는 결과를 나타낸 도표.
도 19는 Aβ로 유도된 인지능 및 기억력 저하 마우스에서 AChE의 발현 증가가 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
도 20(A) 내지 도 20(C)는 Aβ로 유도된 인지능 및 기억력 저하 마우스에서 활성산소종 증가가 무막줄기세포추출물, PLP 및 MP 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 도표.
이하, 본 발명에 의한 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물의 바람직한 실시예 및 도면을 참고하여 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다. 상기 무막줄기세포추출물은 인체지방에서 유래한 줄기세포의 막을 제거하고 유효성분을 추출한 것이다. 즉, 본 발명은 무막줄기세포추출물을 이용하여 상기 추출물 내 유효성분을 통해 인지능력 또는 기억능력을 개선할 수 있는 기능성 식품 조성물일 수 있다.
상기 인지능(인지능력 또는 인지력)은 사물을 분별하여 인지할 수 있는 능력으로서, 공간인지능력, 사고력, 이해력, 계산능력, 학습능력, 판단능력 또는 집중력 등을 포함하는 개념이다. 상기 기억능력(기억력)은 이전의 인상이나 경험을 의식 속에 간직해두는 능력을 말한다.
본 명세서에 있어서, 상기 "개선"은 인지능 또는 기억능력이 질적 또는 양적으로 증강되거나, 인지능력 또는 기억 능력과 관련된 질환들이 질적 또는 양적으로 예방되는 모든 효과를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 무막줄기세포추출물은 인체 지방에서 유래한 줄기세포의 막을 제거하고 유효성분을 추출한 펩타이드를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 무막줄기세포추출물은 인체 지방조직에서 줄기세포를 분리하여 정제한 후, 37℃ 5%의 CO2 조건의 인큐베이터 (incubator)에서 초기 배양한다. 이후, 계대배양을 5 내지 10회 반복 수행하여 배지를 제거한 후, 줄기세포의 세포막을 제거하고 추출물을 획득하는 것일 수 있다.
상기 계대배양은 주기적으로 새로운 배지에 이식시키는 세포증식의 한 방법이다. 구체적으로, 대상세포를 새로운 배지에 이식시킴에 따라 세포주를 보존하고 세포의 대를 이어가는 방식으로 대상세포를 배양 및 증식시킬 수 있다. 즉, 배지가 담긴 플레이트에 줄기세포가 성장하여 80 내지 90%의 밀도를 가지면 플레이트에서 줄기세포를 수득하여 다른 배지가 담긴 다수의 플레이트로 옮겨서 다시 줄기세포의 성장이 이루어지게 한다. 또한, 초대배양시 완전히 제거되지 않은 혈액을 계대배양을 통해 제거할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함된, 상기 무막줄기세포추출물은 신경독성을 유발하는 아밀로이드 베타 단백질의 침착 또는 비정상적인 축적을 감소시켜 아밀로이드 베타 단백질로 인한 신경 염증 및 신경 세포의 사멸을 억제시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물에 포함된, 상기 무막줄기세포추출물은 β-secretase, preselin-1 및 preselin-2와 같은 아밀로이드 생성 경로 관련 단백질의 발현을 억제할 수 있어 인지능력 및 기억능력 개선 효율을 높일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물은 건강기능식품에 적용할 수 있다. 구체적으로 예를 들어 상기 식품의 종류로는 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품의 종류일 수 있다.
본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물은 상기 무막줄기세포추출물을 기능성 식품에 그대로 첨가하거나 다른 기능성 식품 또는 기능성 식품 원료와 함께 사용될 수 있으며, 구체적으로 통상적인 방법으로 기능성 식품 형태에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물에 있어서, 상기 무막줄기세포추출물의 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 중의 상기 무막줄기세포추출물의 양은 전체 기능성 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 또한, 예를 들어, 본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물을 건강 기능성 음료에 적용하는 경우 앞서 상술한 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 화합물을 함유하는 것 외에는 다른 성분에 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다. 상기 외에 본 발명의 조성물에 있어서, 상기 무막줄기세포추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 무막줄기세포추출물은 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 무막줄기세포추출물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물에는 비타민 첨가제가 혼합된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 비타민 첨가제는 베타카로틴(β-carotene), 피리독신(pyridoxine), 엽산(folic acid) 코발라민(cobalamin) 및 아스코르브산 (ascorbic acid) 등에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 즉, 상기 조성물은 무막줄기세포추출물에 상기 상술한 비타민첨가제를 하나 이상 혼합함으로써 신경세포의 성장 및 작용을 도와 상기 무막줄기세포추출물의 효능을 높여 인지능력 및 기억능력 개선 효율을 증가시킬 수 있다.
상기 베타카로틴(β-carotene)은 비타민A로 항산화 효능을 통해 신경세포 보호 작용을 나타낼 수 있다.
상기 피리독신(pyridoxine)은 비타민B6로 단백질과 아미노산의 대사를 촉진하고 신경전달물질 합성에 있어 보조효소로 작용할 수 있다.
상기 엽산(folic acid)은 비타민B9로 DNA합성과정과 아미노산 대사에 필요한 성분이며, 부족시 정상적인 세포 분열이 이뤄지지 않아 신경 세포 형성에 이상이 생길 수 있다.
상기 코발라민(cobalamin)은 비타민B12로, 세포를 구성하는 핵심 물질인 핵산 합성과 조혈 작용에 관여하며, 세로토닌-도파민(serotonin-dopamine) 등의 신경전달물질의 생성이 원활하도록 도울 수 있다.
상기 아스코르브산(ascorbic acid)은 비타민C로 항산화 효능 및 아밀로이드 베타 단백질 침착 억제를 통해 신경세포 보호 작용을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물은 아밀로이드 베타 단백질(amyloid beta protein)의 생성을 억제하는 것일 수 있다.
상기 아밀로이드 베타 단백질은 아밀로이드 생성 경로에서 β- 및 γ-secretase의 활성화를 통해 아밀로이드 전구체 단백질이 절단되면서 생성되는 것으로 알려져 있다. 아밀로이드 베타 단백질은 세포외 영역에 비정상적으로 축적되어 아밀로이드 플라크 (amyloid plaque)를 형성하여 신경 독성을 유발한다. 또한, 아밀로이드 베타 단백질은 신경 염증, 산화 스트레스 및 신경세포 사멸과 같은 여러가지 부정적인 영향을 유발한다.
본 발명은 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물을 통해 상술한 아밀로이드 베타 단백질의 생성(및 발현)을 억제하여 아밀로이드 베타 단백질에 의해 유발되는 신경세포의 손상을 억제하고, 이를 통해 인지능력을 개선시킬 수 있다. 이에, 본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물은 알츠하이머병과 같은 인지능력 및 기억능력 관련 질환의 예방이 가능할 수 있다.
본 발명은 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 관련 질환의 예방용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
상기 인지능 또는 기억능력 관련 질환은 해당 질환의 증상으로 인지능 또는 기억능력이 저하 내지 감퇴가 나타날 수 있는 모든 질환을 포함하는 개념일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 인지능 또는 기억능력 관련 질환은 퇴행성 뇌질환 또는 치매인 것을 특징으로 한다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 인지능 또는 기억능력 관련 질환은 알츠하이머 치매일 수 있다.
상기 퇴행성 뇌질환은 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중 뇌에 발생하는 질환을 의미한다. 구체적으로 예를 들어, 상기 퇴행성 뇌질환은 뇌경색, 뇌졸중, 알츠하이머, 전두측두엽변성증(frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 픽병(Pick's disease), 피질기조퇴행(Corticobasal degeneration, CBD), 퇴행성 핵상마비 (progressive supranuclear palsy, PSP), 파킨슨병 또는 헌팅턴병 등 인지능력 또는 기억능력 저하 내지 감퇴를 증상으로 나타낼 수 있는 질환을 포함할 수 있다.
상기 치매는 퇴행성 뇌질환, 뇌혈관성 치매증, 에이즈(AIDS) 유발성 치매, 뇌신경염증성 치매, 루이소체치매(Dementia with Lewy Bodies, DLB), 다발성 경색치매(Multi-Infarct Dementia, MID), 척수손상 또는 두부손상 등 다양한 원인에 의하여 발생하는 치매를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물의 인지능력 및 기억능력 개선 관련 효력에 관한 실험을 상세하게 설명한다.
실험예1: 무막줄기세포추출물의 농도에 따른 신경세포 보호 효력 평가
후술하는 모든 실험 결과 (데이터)는 평균값 ± 표준편차 (mean ± SD)로 표시하였다.
Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 데이터의 정규분포를 조사하였으며, 데이터의 그룹 평균이 정규 분포를 보일 때 결과는 일원 분산 분석(one-way analysis of variance, ANOVA)에 이어 Duncan의 다중 범위 검정으로 분석되었다. 데이터의 그룹 평균이 정규 분포를 나타내지 않으면 Mann-Whitney U-test를 사용하여 그룹 간의 차이를 분석하였다. 데이터 그룹 간의 a-f 표시는 Duncan의 다중 범위 (multiple range)(P <0.05)에 의한 유의한 차이를 나타낸 것이며, 각 실험은 삼중으로 수행되었다 (n=3).
1.1. 무막줄기세포추출물 제조
본 시험에 사용된 무막줄기세포추출물(MFSCE)은 본 출원인이 직접 제조하여 사용하였다. 구체적으로, 상기 무막줄기세포추출물은 줄기세포 성분 추출물로, 인체지방조직에서 줄기세포를 분리, 배양한 후 세포막을 제거하여 획득하였다. 원재료인 지방조직은 혈액검사를 통해 이상이 없는 20대 여성 중 BMI 25 내지 29.9에 해당하는 사람을 대상으로 지방공여동의서를 받고 확보하였다. 공여자를 대상으로 시행한 혈액검사 항목은 B형간염바이러스, C형간염바이러스, 인체면역결핍바이러스, 인체T림프영양성바이러스, 파보바이러스B19, 사이토메가로바이러스, 앱스타인바바이러스 및 매독크레포네마 등이다. 최종제인 무막줄기세포추출물은 Good Laboratory Practice 인정기관에서 안전성 검사를 완료하여 독성이 없는 물질임을 확인하였다.
위의 과정을 거쳐 획득한 지방조직에서 줄기세포를 분리하여, 37℃, 5% CO2 조건의 incubator에서 초기배양을 실시하였으며, 세포의 성장에 따라 계대배양을 5 내지 10회 반복하였다. 배지를 제거하고 줄기세포를 일정량 수득하여 초음파 등의 물리적 방법을 사용하여 세포막을 벗기고, 연속 여과 후 세포의 파편을 800 내지 1500 g에서 원심 분리시켜 세포막 조각을 제거하여 무막줄기세포추출물을 획득하였다.
1.2. 실험재료의 준비
실험에 사용되는 재료의 준비내용은 하기와 같다.
1) 아밀로이드 베타 단백질(Aβ25-35)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했으며 식염수에서 37℃에서 72시간 동안 반응하였다. Aβ25-35를 집계한 후, 이를 실험에 사용하였다.
2) 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, MTT) 및 디클로로플루오레세인 디아세테이트(dichlorofluorescein diacetate, DCF-DA)는 Bio Pure(Ontario, Canada) 와 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
3) 둘베코수정이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)는 Welgene(대구, 한국)에서 구입하였다.
4) 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 세포독성 검출 키트는 Takara Bio(Shiga, Japan)에서 구입하였다.
5) 웨스턴블로트법(Western blotting)을 위한 RIPA(radioimmunoprecipitation assay)용액은 Elpics Biotech(대전, 한국)에서 구입했으며, Enhanced chemiluminescence(ECL)기질용액은 Bio-Rad Laboratories(Clarity Western ECL Substrate kit, Bio-Rad Laboratories, Inc Hercules, CA, USA)에서 구입하였다.
6) 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인(Polyvinylidene fluoride membrane)은 Millipore Co.(Billerica, MA, USA)로부터 입수하였다.
7) 1차 및 2차 항체인, β-액틴(β-actin, 1:1000), 프레세닐린1(presenilin1, PS1, 1:1000), 프레세닐린2(PS2, 1:1000), β-secretase(BACE, 1:100), Bcl-2 결합 X(Bax, 1:1000) 및 anti-rabbit IgG, HRP 결합 항체(1:500)는 Cell signaling Tech.(Beverly, USA)에서 구입하였다.
8) 시클로옥시게나아제(Cyclooxygenase, COX-2, 1:500) 및 유도성 산화질소 합성효소(inducible Nitric Oxide synthase, iNOS, 1:1000)는 Calbiochem Co.(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
9) APP (1:1000) 및 B세포림프종2 (Bcl-2, 1:1000)는 각각 Sigma Aldrich (St.Louis, MO, USA) 및 Abcam (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였다.
1.3. 신경세포 배양
사람의 신경 세포종인 SH-SY5Y세포는 ATCC(Manassas, USA)사에서 구매하였다.
구입한 신경세포를 10%의 FBS와 1%의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하고 37℃, 5%의 CO2가 있는 인큐베이터에서 유지시켰다. 이 후, 상기 신경세포가 일정량 이상이 되었을 때, 0.05%의 트립신-EDTA(trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid)로 계대배양하여 실험에 사용하였다.
1.4. 시료의 처리 및 시료별 신경세포 손상 유도
배양된 SH-SY5Y세포를 96웰(well) 마이크로플레이트(microplate)에 2.5x105 cells/well의 밀도로 접종하고(seeded) 24시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다.
무막줄기세포추출물(이하, MFSCE로 표기)를 각기 다른 농도(0.5 μg/mL, 1 μg/mL, 2.5 μg/mL 및 5 μg/mL)로 각 웰에 첨가하고 4시간 동안 인큐베이터에서 반응하였다. 이후, 각 웰에 25 μM Aβ25-35를 처리한 후 24시간 동안 반응하였다.
무막줄기세포추출물 또는 25 μM Aβ25-35이 처리되지 않은 대조군 (control)을 준비하였다.
실험대상인 시료별 특징을 요약하면, 하기 표 1과 같다.
| 군 명칭 | 시료의 처리 | 신경세포 손상 유도 | |
| MFSCE | Aβ25-35 | ||
| Control | 처리하지 않음. | 처리하지 않음. | 유도시키지 않음. |
| Aβ25-35 | 처리하지 않음. | 처리함. | 유도시킴. |
| MFSCE 0.5 | 0.5 μg/mL 처리 | 처리함. | 유도시킴. |
| MFSCE 1 | 1 μg/mL 처리 | 처리함. | 유도시킴. |
| MFSCE 2.5 | 2.5 μg/mL 처리 | 처리함. | 유도시킴. |
| MFSCE 5 | 5 μg/mL 처리 | 처리함. | 유도시킴. |
1.5.1. 세포생존율 측정을 통한 무막줄기세포추출물의 신경세포 보호 효력 평가
테트라졸륨 검사(tetrazolium bromide (MTT) assay)을 수행하여 세포 생존율 (cell viability)을 측정하였다.
구체적으로, 준비된 MTT(5 mg/mL)를 각 시료가 처리된 세포에 첨가하였다. 그 다음, 세포를 4시간 동안 인큐베이터에서 반응하였다. 혼입된 포르마잔 (formazan) 결정을 가용화하기 위해, 시료와 MTT가 처리된 세포의 배양 배지를 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)로 교체하였다. 마이크로플레이트 리더(Thermo Fisher Scientific Inc., Vantaa, Finland)를 사용하여 540nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
1.5.2. 세포생존율 측정을 통한 무막줄기세포추출물의 신경세포 보호 효력 평가 결과
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 무막줄기세포추출물 농도별 처리군들의 세포생존율 측정결과를 나타낸 도표이다.
도 1과 같이, Aβ25-35 처리된 군에서 세포 생존율이 63.76%로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있다. 그러나 무막줄기세포추출물 농도가 0.5μg/mL, 1μg/mL, 2.5μg/mL 및 5μg/mL 처리된 군들에서는 세포생존율이 각각 80.46%, 85.48%, 86.80% 및 87.02%로 유의하게 증가된 것을 알 수 있다.
이를 통해, 신경 세포에서 무막줄기세포추출물이 Aβ25-35에 의해 유도된 세포 사멸을 억제시켰음을 확인할 수 있다.
1.6.1. LDH 측정을 통한 무막줄기세포추출물의 신경세포 보호 효력 평가
시료별로 젖산탈수소효소(Lactase dehydrogenase (LDH)) 측정 키트 (kit)를 이용하여 세포 사멸시 분비되는 LDH 분비량을 측정하였다. LDH는 세포 내 효소이며 LDH의 방출은 Aβ25-35로 처리된 SH-SY5Y신경세포에서 세포 사멸의 지표로 사용된다.
구체적으로, 세포의 상등액을 LDH 반응 혼합물과 1:1 비율로 혼합하였다. 이 혼합물을 25℃에서 30분간 반응하고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
1.6.2. LDH 측정을 통한 무막줄기세포추출물의 신경세포 보호 효력 평가결과
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 무막줄기세포추출물 농도별 처리군들의 LDH 측정결과를 나타낸 도표이다.
도 2를 참조하면, LDH 활성은 대조군의 100.00%에 비해 Aβ25-35 처리군에서 137.30%였다. 반면, MFSCE가 처리된 군들에서는 Aβ25-35 처리군과 비교하여 농도 의존적으로 LDH 활성을 억제한 것을 알 수 있다. 구체적으로, MFSCE 0.5 군, MFSCE 1 군, MFSCE 2.5 군 및 MFSCE 5 군에서 LDH는 각각 126.82%, 119.48%, 109.76% 및 100.90%였다. 이를 통해, 신경 세포에서 무막줄기세포추출물이 Aβ25-35에 의해 유도된 LDH 생성을 억제했음을 확인할 수 있다.
1.7.1. 무막줄기세포추출물의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성 억제능 평가
시료별로 2',7'-dichloroflurescein(DCF-DA)를 처리하여 ROS 생성량을 측정하여 항산화 효력을 평가하였다.
구체적으로, 세포에 80μM DCF-DA를 처리하여, 37℃, 30분 동안 인큐베이터에서 반응하였다. 이후, FLUO star OPTIMA(BMG Labtech, Ortenberg, Germany)를 사용하여 여기파장 480 nm 및 방출파장 535 nm에서 형광을 측정하였다.
1.7.2. 무막줄기세포추출물의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성 억제능 평가결과
일반적으로 산화 스트레스는 ROS 양과 항산화 시스템 간의 불균형으로 인해 발생한다. Aβ25-35는 뇌의 ROS 양을 증가시켜 산화 스트레스를 유발하여 지질 과산화, 신경 염증 및 인지 장애를 일으키는 것으로 알려져 있으며, 알츠하이머병 환자의 뇌에서 아밀로이드 플라크의 축적과 ROS의 과잉이 모두 관찰된 바 있다.
도 3(A) 내지 도 3(B)는 본 발명의 일 실시예에 따른 무막줄기세포추출물 농도별 처리군들의 ROS 생성량 측정 결과를 나타낸 도표이다. 구체적으로, 도 3(A)는 60분 동안의 DCF형광 강도 변화의 시간 경과에 따른 결과를 나타낸 도표이며, 도 3(B)는 60분에서의 ROS 생성량을 나타낸 도표이다.
도 3(A) 내지 도 3(B)에서, ROS 생성량은 Aβ25-35 군 (121.24%)이 대조군 (control, 100.00%)보다 높았다. 그러나 MFSCE 0.5군, MFSCE 1군, MFSCE 2.5군 및 MFSCE 5군에서는, Aβ25-35 군에 비해 ROS 생성량이 각각 103.89%, 102.29%, 102.99%, 102.46%로 유의하게 감소하였다. 이를 통해, 신경 세포에서 무막줄기세포추출물이 Aβ25-35에 의한 ROS 생성을 억제하여 신경 보호 활성을 나타내는 것을 알 수 있다.
1.8.1. 염증 매개인자(iNOS, COX-2)의 발현 변화 측정을 통한 무막줄기세포추출물의 염증 관련 단백질 생성 억제능 평가
iNOS와 COX-2는 모두 알츠하이머병에서 염증 반응의 핵심 조절자인 핵 인자-κB(NF-κB)신호를 활성화한다. 염증 매개체는 상기 경로의 활성화을 통해 인터루킨(IL)-6, 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 및 IL-1β를 포함한 염증성 사이토카인의 방출을 촉진한다.
이에, 본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함한 인지능 개선용 약학적 조성물이 신경염증에 미치는 영양에 대한 분자 메커니즘을 조사하기 위해 iNOS 및 COX-2를 포함한 염증 매개체의 단백질 수준을 측정하였다. 구체적으로, Western blot analysis를 통해 무막줄기세포추출물에 의한 염증 매개인자(iNOS, COX-2)의 발현 변화를 측정하였다.
구체적으로, 평가를 위하여 SH-SY5Y 세포를 긁어내어 RIPA 용액에 용해시켰다. Bio-Rad 분석 키트를 사용하여 단백질을 정량화 하였다. 동일한 단백질 샘플을 10% 또는 13% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드겔(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel, SDS-PAGE)로 분리하고 전기영동을 통해 멤브레인으로 옮겼다. 막을 5% 탈지유로 실온에서 1시간 동안 반응한 다음, 1차 항체와 함께 4
에서 12시간 이상 반응하였다. 막을 PBS-T로 10분 동안 3회 세척한 후, 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 반응하였다.
이후, PBS-T로 10분간 3회 세척한 후 ECL 용액과 반응시켰다. 화학발광이미징시스템(chemiluminescence imaging system, Davinch-ChemiTM, Davinch-K, Seoul, Korea)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다. ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 단백질 밀도를 분석하였다. 단백질 수준은 밴드 강도를 하우스키핑(housekeeping) 단백질인 β-액틴 (β-actin)의 강도로 나눈 비율로 표현하였다.
1.8.2. 염증 매개인자 (iNOS, COX-2)의 발현 변화 측정을 통한 무막줄기세포추출물의 염증 관련 단백질 생성 억제능 평가 결과
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 무막줄기세포추출물 농도별 처리군들의 염증 매개인자(iNOS, COX-2)의 발현 변화 측정결과를 나타낸 도표이다.
도 4에서, Aβ25-35 군은 대조군 (control) 대비 SH-SY5Y세포에서 iNOS 및 COX-2의 발현이 증가하였다. 반면에 MFSCE 0.5 군, MFSCE 1 군, MFSCE 2.5 군 및 MFSCE 5 군에서는 iNOS와 COX-2의 발현이 농도 의존적으로 억제되었다.
이를 통해, 신경 세포에서 무막줄기세포추출물이 Aβ25-35에 의한 iNOS 및 COX-2 억제를 통하여 항염증 효력을 나타내는 것을 알 수 있다.
1.9.1. 세포사멸 유발인자(Bax) 및 세포사멸 억제인자(Bcl-2)의 발현 변화 측정을 통한 무막줄기세포추출물의 세포사멸 억제 기전 평가
Western blot analysis를 통해 MFSCE에 의한 세포사멸 유발 인자(Bax) 및 세포사멸 억제인자(Bcl-2)의 발현 변화를 측정하였다.
1.9.2. 세포사멸 유발인자(Bax) 및 세포사멸 억제인자(Bcl-2)의 발현 변화 측정을 통한 무막줄기세포추출물의 세포사멸 억제 기전 평가결과
알츠하이머병 환자는 과도한 Aβ 축적으로 신경독성이 유발되면 Bax의 발현은 증가하고 Bcl-2의 발현은 감소된다. 따라서 Bax는 세포사멸 유발인자(pro-apoptotic factor)로 간주되고 Bcl-2는 세포사멸 억제인자(anti-apoptotic factor)로 간주된다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 무막줄기세포추출물 농도별 처리군들의 세포사멸 유발인자(Bax) 및 세포사멸 억제인자(Bcl-2)의 발현 변화 측정 결과를 나타낸 도표이다.
도 5에서, 세포사멸 유발인자인 Bax의 발현은 대조군(control)과 비교하여 Aβ25-35군에서 증가하였다.
그러나, 무막줄기세포추출물 농도별 처리군들은 Bax 단백질 발현이 억제된 것을 알 수 있다. 또한, Aβ25-35군에서는 세포사멸 억제인자인 Bcl-2의 발현이 유의하게 감소된 반면, 무막줄기세포추출물 농도별 처리군들은 Bcl-2의 발현이 증가하였다. 또한, 무막줄기세포추출물 농도별 처리군들은 Aβ25-35군과 비교하여 Bax/Bcl-2 값이 농도적 감소를 보였다.
상기와 같이, 신경세포에서 무막줄기세포추출물이 Aβ25-35에 의한 Bax의 발현 증가와 Bcl-2 발현 감소를 조절하여 세포 사멸에 대한 보호 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
1.10.1. 무막줄기세포추출물의 아밀로이드 베타(Aβ) 단백질 생성 관련 인자 발현 조절 효력 평가
Western blot analysis를 통해 무막줄기세포추출물 농도별 처리군들에서 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP), APP 절단 효소인 beta-secretase(BACE), presenilin/gamma-secretase(PS1, PS2) 등의 단백질 발현 변화를 측정하였다.
1.10.2. 무막줄기세포추출물의 아밀로이드 베타(Aβ) 단백질 생성 관련 인자 발현 조절 효력 평가결과
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 무막줄기세포추출물 농도별 처리군들에서 아밀로이드 생성 관련 단백질들의 발현 정도를 나타낸 도표이다.
상세하게는, Aβ는 APP가 beta-secretase, gamma-secretase에 의해 분해되면서 생성되며, Aβ의 침착은 신경세포의 사멸을 유도하여 인지능력 손상을 유발한다. 이러한 Aβ 생성을 억제하기 위하여 아밀로이드 생성 경로 관련 단백질을 유의하게 감소시킴으로 알츠하이머병 등의 인지능력 관련 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
도 6을 참조하면, 아밀로이드 생성 단백질, 즉 APP, BACE, PS1 및 PS2의 발현은 대조군 (control) 대비 Aβ25-35 군에서 유의하게 증가하였다.
그러나 무막줄기세포추출물 농도별 처리군들에서는 APP, BACE, PS1 및 PS2의 단백질량이 낮아지는 것을 확인할 수 있다.
이 결과를 통해 무막줄기세포추출물이 신경세포에서 Aβ25-35에 의한 APP, BACE, PS1 및 PS2 단백질 증가를 억제하여 아밀로이드 생성에 대한 보호 효과가 있음을 알 수 있다.
상술한 실험예1의 결과, 본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 개선용 약학적 조성물 중 무막줄기세포추출물 농도별 처리군들은(MFSCE 0.5 군, MFSCE 1 군, MFSCE 2.5 군 및 MFSCE 5 군) Aβ로 유도한 신경세포 사멸모델에서 ROS생성 억제, Aβ 생성 억제, Bax/Bcl-2 비율 억제 및 염증 매개 인자 억제를 통하여 신경세포 보호 효력을 나타낸 것을 확인할 수 있다.
실험예2: 무막줄기세포추출물을 포함하는 조성물의 신경세포 보호 효력 평가 및 기전 규명
후술하는 모든 실험 결과(데이터)는 평균값 ± 표준편차(mean ± SD)로 표시하였다.
Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 데이터의 정규분포를 조사하였으며, 데이터의 그룹 평균이 정규 분포를 보일 때 결과는 일원 분산 분석(one-way analysis of variance, ANOVA)에 이어 Duncan의 다중 범위 검정으로 분석되었다. 데이터의 그룹 평균이 정규 분포를 나타내지 않으면 Mann-Whitney U-test를 사용하여 그룹 간의 차이를 분석하였다. 데이터 그룹 간의 a-f 표시는 Duncan의 다중 범위(multiple range)(P <0.05)에 의한 유의한 차이를 나타낸 것이며, 각 실험은 삼중으로 수행되었다 (n=3).
2.1. 무막줄기세포추출물 제조
본 시험에 사용된 무막줄기세포추출물(MFSCE)은 본 출원인이 직접 제조하여 사용하였다. 구체적으로, 상기 무막줄기세포추출물은 줄기세포 성분 추출물로, 인체지방조직에서 줄기세포를 분리, 배양한 후 세포막을 제거하여 획득하였다. 원재료인 지방조직은 혈액검사를 통해 이상이 없는 20대 여성 중 BMI 25 내지 29.9에 해당하는 사람을 대상으로 지방공여동의서를 받고 확보하였다. 공여자를 대상으로 시행한 혈액검사 항목은 B형간염바이러스, C형간염바이러스, 인체면역결핍바이러스, 인체T림프영양성바이러스, 파보바이러스B19, 사이토메가로바이러스, 앱스타인바바이러스 및 매독크레포네마 등이다. 최종제인 무막줄기세포추출물은 Good Laboratory Practice 인정기관에서 안전성 검사를 완료하여 독성이 없는 물질임을 확인하였다.
위의 과정을 거쳐 획득한 지방조직에서 줄기세포를 분리하여, 37℃, 5% CO2 조건의 incubator에서 초기배양을 실시하였으며, 세포의 성장에 따라 계대배양을 6 내지 10회 반복하였다. 배지를 제거하고 줄기세포를 일정량 수득하여 초음파 등의 물리적 방법을 사용하여 세포막을 벗기고, 연속 여과 후 세포의 파편을 800 내지 1500 g에서 원심 분리시켜 세포막 조각을 제거하여 무막줄기세포추출물을 획득하였다.
2.2. 실험재료의 준비
실험에 사용되는 재료의 준비내용은 하기와 같다.
1) 아밀로이드 베타 단백질(Aβ25-35)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했으며 식염수에서 37℃에서 72시간 동안 반응하였다. Aβ25-35를 집계한 후, 이를 실험에 사용하였다.
2) 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, MTT) 및 디클로로플루오레세인 디아세테이트(dichlorofluorescein diacetate, DCF-DA)는 Bio Pure(Ontario, Canada) 와 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
3) 둘베코수정이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)는 Welgene(대구, 한국)에서 구입하였다.
4) 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 세포독성 검출 키트는 Takara Bio(Shiga, Japan)에서 구입하였다.
5) 웨스턴블로트법(Western blotting)을 위한 RIPA(radioimmunoprecipitation assay)용액은 Elpics Biotech(대전, 한국)에서 구입했으며, Enhanced chemiluminescence(ECL)기질용액은 Bio-Rad Laboratories(Clarity Western ECL Substrate kit, Bio-Rad Laboratories, Inc Hercules, CA, USA)에서 구입하였다.
6) 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인(Polyvinylidene fluoride membrane)은 Millipore Co.(Billerica, MA, USA)로부터 입수하였다.
7) 1차 및 2차 항체인, β-액틴(β-actin, 1:1000), 프레세닐린1 (presenilin1, PS1, 1:1000), 프레세닐린2 (PS2, 1:1000), β-secretase (BACE, 1:100), Bcl-2 결합 X(Bax, 1:1000) 및 anti-rabbit IgG, HRP 결합 항체(1:500)는 Cell signaling Tech.(Beverly, USA)에서 구입하였다.
8) 시클로옥시게나아제(Cyclooxygenase, COX-2, 1:500) 및 유도성 산화질소 합성효소(inducible Nitric Oxide synthase, iNOS, 1:1000)는 Calbiochem Co.(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
9) APP (1:1000) 및 B세포림프종2(Bcl-2, 1:1000)는 각각 Sigma Aldrich(St.Louis, MO, USA) 및 Abcam(Cambridge, MA, USA)에서 구입하였다.
2.3. 신경세포 배양
사람의 신경 세포종인 SH-SY5Y세포는 ATCC(Manassas, USA)사에서 구매하였다.
구입한 신경세포를 10%의 FBS와 1%의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하고 37℃, 5%의 CO2가 있는 인큐베이터에서 유지시켰다. 이 후, 상기 신경세포가 일정량 이상이 되었을 때, 0.05%의 트립신-EDTA(trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid)로 계대배양하여 실험에 사용하였다.
2.4. 시료의 처리 및 시료별 신경세포 손상 유도
배양된 SH-SY5Y세포를 96웰(well) 마이크로플레이트(microplate)에 2.5x105 cells/well의 밀도로 접종하고 (seeded) 24시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다.
배양된 SH-SY5Y세포를 시료별로 동일한 양으로 나누어 준비한 후, 무막줄기세포추출물 (membrane free stem cell extract, MFSCE), 피리독신 (pyridoxal phosphate, PLP) 및 무막줄기세포추출물과 피리독신 혼합물 (MP)을 각 웰에 첨가하여 4시간 동안 인큐베이터에서 반응하였다.
아무것도 처리되지 않은 시료를 대조군 (control)으로 준비하였다.
이 후, 대조군을 포함한 모든 시료에 아밀로이드 베타 단백질 (amyloid beta 25-35, Aβ25-35)을 25μM 농도로 처리한 후, 24시간 동안 인큐베이터에서 반응하여 세포 손상을 유도하였다.
비교를 위하여, 시료처리 또는 Aβ25-35가 처리되지 않은 normal군을 준비하여 실험을 진행하였다.
실험대상인 시료별 특징을 요약하면, 하기 표 2와 같다.
| 군 명칭 | 시료의 처리 | 신경세포 손상 유도 | |
| 시료 | Aβ25-35 | ||
| Normal | 처리하지 않음 | 처리하지 않음 | 유도시키지 않음 |
| Control | 처리하지 않음 | 처리함 | 유도시킴 |
| MFSCE | 무막줄기세포추출물 5 ㎍/㎖주입 | 처리함 | 유도시킴 |
| PLP50 | 피리독신 50 ㎍/㎖주입 | 처리함 | 유도시킴 |
| PLP100 | 피리독신 100 ㎍/㎖주입 | 처리함 | 유도시킴 |
| MP50 | 무막줄기세포추출물 5 ㎍/㎖과 피리독신 50 ㎍/㎖의 혼합물 주입 | 처리함 | 유도시킴 |
| MP100 | 무막줄기세포추출물 5 ㎍/㎖과 피리독신 100 ㎍/㎖의 혼합물 주입 | 처리함 | 유도시킴 |
2.5.1. 세포생존율 측정을 통한 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 신경세포 보호 효력 평가
시료별로 테트라졸륨 검사 (tetrazolium bromide (MTT) assay)을 수행하여 세포 생존율(cell viability)을 측정하였다.
구체적으로, 준비된 MTT(5mg/mL)를 각 시료가 처리된 세포에 첨가하였다. 그 다음, 세포를 4시간 동안 인큐베이터에서 반응하였다. 혼입된 포르마잔(formazan) 결정을 가용화하기 위해, 시료와 MMT가 처리된 세포의 배양 배지를 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)로 교체하였다. 마이크로플레이트 리더 (Thermo Fisher Scientific Inc., Vantaa, Finland)를 사용하여 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
2.5.2. 세포생존율 측정을 통한 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 신경세포 보호 효력 평가 결과
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 MFSCE, PLP 및 MP 처리군의 세포생존율 측정결과를 나타낸 도표이다.
도 7과 같이, MFSCE, PLP50 및 PLP100 처리군에서 control군 대비 세포 생존율이 유의성 있게 증가한 것을 알 수 있다.
또한, MP50 처리군 및 MP100 처리군도 control군 대비 유의성 있게 세포생존율이 증가하였으며, 특히 MP100 처리군에서 가장 높은 세포생존율이 나타나, MFSCE와 PLP의 상승효과를 확인하였다.
2.6.1. LDH 측정을 통한 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 신경세포 보호 효력 평가
시료별로 젖산탈수소효소(Lactase dehydrogenase (LDH) 측정 키트(kit))를 이용하여 세포 사멸시 분비되는 LDH 분비량을 측정하였다. LDH는 세포 내 효소이며 LDH의 방출은 Aβ25-35로 처리된 SH-SY5Y신경세포에서 세포 사멸의 지표로 사용된다.
구체적으로, 세포의 상등액을 LDH 반응 혼합물과 1:1 비율로 혼합하였다. 이 혼합물을 25℃에서 30분간 반응하고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2.6.2. LDH 측정을 통한 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 신경세포 보호 효력 평가결과
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 MFSCE, PLP 및 MP 처리군의 LDH 측정결과를 나타낸 도표이다.
도 8을 참조하면, Aβ25-35에 의한 LDH 증가는 MFSCE, PLP50 및 PLP100 처리군에서 control군 대비 유의성 있게 억제된 것을 알 수 있다. 또한, MP50, MP100 처리군에서 역시 control군 대비 유의성 있게 억제되었으며, MFSCE, PLP50 및 PLP100 대비 높은 LDH 생성 억제 효력이 나타나고 있어, MFSCE와 PLP의 상승효과를 확인하였다. 즉, MFSCE와 PLP는 Aβ25-35에 의한 세포 사멸을 억제시킬 수 있음을 알 수 있다.
2.7.1. 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성 억제능 평가
시료별로 2',7'-dichloroflurescein(DCF-DA)를 처리하여 ROS 생성량을 측정하여 항산화 효력을 평가하였다.
구체적으로, 세포에 80μM DCF-DA를 처리하여 37℃, 30분 동안 인큐베이터에서 반응하였다. 이 후, FLUO star OPTIMA (BMG Labtech, Ortenberg, Germany)를 사용하여 여기파장 480 nm 및 방출파장 535 nm에서 형광을 측정하였다.
2.7.2. 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 활성 산소종 (reactive oxygen species, ROS) 생성 억제능 평가결과
도 9(A) 내지 도 9(B)는 본 발명의 일 실시예에 따른 MFSCE, PLP 및 MP 처리군의 ROS 생성량 측정 결과를 나타낸 도표이다. 구체적으로, 도 9(A)는 60분 동안의 DCF형광 강도 변화의 시간 경과에 따른 결과를 나타낸 도표이며, 도 9(B)는 60분에서의 ROS 생성량을 나타낸 도표이다.
도 9(A) 내지 도 9(B)를 참조하면, Aβ25-35에 의한 ROS 증가는 MFSCE, PLP50 및 PLP100 처리군에서 control군 대비 유의성 있게 억제되었다.
또한, MP50와 MP100 처리군에서 역시 control군 대비 유의성 있게 억제되었으며, MFSCE, PLP50 및 PLP100 대비 높은 ROS 생성 억제 효력이 나타나고 있어, MFSCE와 PLP의 상승효과를 확인하였다.
상기와 같이, 본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물은 신경세포에서 Aβ25-35에 의한 ROS의 과잉 생산을 유의하게 억제시켜 산화스트레스를 줄일 수 있으며, 이를 통해 알츠하이머병의 치료를 촉진시킬 수 있을 것으로 기대된다.
2.8.1. 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 아밀로이드 베타(Aβ) 단백질 생성 관련 인자 발현 조절 효력 평가
Western blot analysis를 통해 MFSCE, PLP 및 MP에 의한 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP), APP 절단 효소인 beta-secretase(BACE), presenilin/gamma-secretase(PS1, PS2)등의 단백질 발현 변화를 측정하였다.
구체적으로, 평가를 위하여 SH-SY5Y 세포를 긁어내어 RIPA 용액에 용해시켰다. Bio-Rad 분석 키트를 사용하여 단백질을 정량화하였다. 동일한 단백질 샘플을 10% 또는 13% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드겔(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel, SDS-PAGE)로 분리하고 전기영동을 통해 멤브레인으로 옮겼다. 막을 5% 탈지유로 실온에서 1시간 동안 반응한 다음, 1차 항체와 함께 4℃에서 12시간 이상 반응하였다. 막을 PBS-T로 10분 동안 3회 세척한 후, 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 반응하였다.
이후, PBS-T로 10분간 3회 세척한 후 ECL 용액과 반응시켰다. 화학발광이미징시스템 (chemiluminescence imaging system, Davinch-ChemiTM, Davinch-K, Seoul, Korea)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다. ImageJ 소프트웨어 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 단백질 밀도를 분석하였다. 단백질 수준은 밴드 강도를 하우스키핑 (housekeeping) 단백질인 β-액틴 (β-actin)의 강도로 나눈 비율로 표현하였다.
2.8.2. 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 아밀로이드 베타(Aβ) 단백질 생성 관련 인자 발현 조절 효력 평가결과
도 10(A) 내지 도 10(B)는 본 발명의 일 실시예에 따른 MFSCE, PLP 및 MP 처리군의 아밀로이드 생성 관련 단백질들의 발현 정도를 나타낸 도표이다.
구체적으로, 도 10(A)는 APP 단백질의 발현 결과를 나타낸 도표이며, 도 10(B)는 BACE, PS1 및 PS2 단백질의 발현 결과를 나타낸 도표이다.
도 10(A)를 보면, Aβ25-35에 의한 APP의 증가는 PLP100 처리군에서 control군 대비 유의성 있게 억제된 것을 알 수 있다. 또한, MP50, MP100 처리군에서 역시 control군 대비 유의성 있게 억제되었으며, MFSCE, PLP50 및 PLP100 대비 높은 억제 효력이 나타나, MFSCE와 PLP의 상승효과를 확인하였다.
도 10(B)를 참조하면, Aβ25-35에 의한 BACE의 증가는 MFSCE 처리군에서 control군 대비 유의성 있게 억제된 것을 알 수 있다. 또한, MP100 처리군에서 역시 control군 대비 유의성 있게 억제되었으며, MFSCE, PLP100 대비 높은 억제 효력이 나타나, MFSCE와 PLP의 상승효과를 확인하였다.
또한, 도 10(B)에서 Aβ25-35에 의한 PS1 및 PS2의 증가는 MFSCE, PLP50와, PLP100 처리군에서 control군 대비 유의성 있게 억제되었다. 또한, MP50, MP100 처리군에서 역시 control군 대비 유의성 있게 억제되었으며, 특히, MP100 처리군에서 MFSCE, PLP100 대비 높은 억제 효력이 나타나, MFSCE와 PLP의 상승효과를 확인하였다.
2.9.1. AChE의 발현 변화 측정을 통한 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 신경전달물질 조절 인자 억제능 평가
Western blot analysis를 통해 MFSCE, PLP 및 MP에 의한 기억력 관련 효소인 acetylcholinesterase(AChE)의 발현 변화를 측정하였다.
2.9.2. AChE의 발현 변화 측정을 통한 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 신경전달물질 조절 인자 억제능 평가결과
도 11는 본 발명의 일 실시예에 따른 MFSCE, PLP 및 MP 처리군의 AChE 발현 변화 측정결과를 나타낸 도표이다.
도 11에서, Aβ25-35에 의한 AChE의 발현 증가는 MFSCE, PLP50, PLP100 처리군에서 control군 대비 억제되었다. 또한, MP50, MP100 처리군에서 역시 control군 대비 유의성 있게 억제되었으며, MFSCE, PLP50 및 PLP100 대비 높은 AChE 발현 억제 효력이 나타나, MFSCE 와 PLP의 상승효과를 확인하였다.
2.10.1. 세포사멸 유발인자 (Bax) 및 세포사멸 억제인자 (Bcl-2)의 발현 변화 측정을 통한 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 세포사멸 억제 기전 평가
Western blot analysis를 통해 MFSCE, PLP 및 MP에 의한 세포사멸 유발 인자 (Bax) 및 세포사멸 억제인자(Bcl-2)의 발현 변화를 측정하였다.
2.10.2. 세포사멸 유발인자(Bax) 및 세포사멸 억제인자(Bcl-2)의 발현 변화 측정을 통한 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 세포사멸 억제 기전 평가결과
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 MFSCE, PLP 및 MP 처리군의 세포사멸 유발인자(Bax) 및 세포사멸 억제인자(Bcl-2)의 발현 변화 측정결과를 나타낸 도표이다.
도 12를 참조하면, Aβ25-35에 의한 세포사멸 유발인자(Bax)의 발현 증가는 PLP50, PLP100 처리군에서 control군 대비 억제된 것을 알 수 있다. 또한, MP50, MP100 처리군에서 역시 control군 대비 유의성 있게 억제되었으나, PLP50 및 PLP100 대비 낮은 효력이 나타나 상승효과는 나타나지 않았다.
또한, Aβ25-35에 의한 세포사멸 억제인자(Bcl-2)의 발현 감소는 MFSCE, PLP50와 PLP100 처리군에서 변화되지 않았다. 그러나, MP50, MP100 처리군에서 control군 대비 유의성 있게 증가되어 상승효과를 확인하였다.
아울러, Aβ25-35에 의한 세포사멸 억제인자 대비 세포사멸 유발인자(Bax/Bcl-2)의 발현 증가는 MFSCE, PLP100 처리군에서 control군 대비 억제되었다. 또한, MP50, MP100 처리군도 역시 control군 대비 유의성 있게 억제되었으며, MFSCE, PLP50 및 PLP100 대비 높은 Bax/Bcl-2 발현 억제 효력이 나타나, MFSCE와 PLP의 상승효과를 확인하였다.
즉, 본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물은 Aβ25-35에 의해 유도된 신경세포에서 Bax/Bcl-2의 비율을 감소시키며 이를 통해 신경 세포 사멸을 약화시켜 신경 보호 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
2.11.1. 염증 매개인자(iNOS, COX-2) 및 염증성 cytokine(IL-1
)의 발현 변화 측정을 통한 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 염증 관련 단백질 생성 억제능 평가
본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함한 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물이 신경염증에 미치는 영양에 대한 분자 메커니즘을 조사하기 위해 iNOS 및 COX-2를 포함한 염증 매개체의 단백질 수준을 측정하였다. 구체적으로, Western blot analysis를 통해 MFSCE, PLP 및 MP에 의한 염증 매개인자(iNOS, COX-2) 및 염증성 cytokine (IL-1β)의 발현 변화를 측정하였다.
2.11.2. 염증 매개인자(iNOS, COX-2) 및 염증성 cytokine(IL-1
)의 발현 변화 측정을 통한 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 염증 관련 단백질 생성 억제능 평가 결과
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 MFSCE, PLP 및 MP 처리군의 염증 매개인자(iNOS, COX-2) 및 염증성 cytokine(IL-1β)의 발현 변화 측정결과를 나타낸 도표이다.
도 13을 참조하면, Aβ25-35에 의한 iNOS의 발현 증가는 MFSCE, PLP50 및 PLP100 처리군에서 control군 대비 억제되었다. 또한, MP50와 MP100처리군에서 역시 control군 대비 유의성 있게 억제되었으며, MFSCE, PLP50 및 PLP100 대비 높은 억제 효력이 나타나 상승효과를 확인하였다.
또한, Aβ25-35에 의한 COX-2의 발현 증가는 MFSCE처리군에서 control군 대비 억제되었다. 아울러, MP50와 MP100 처리군에서 역시 control군 대비 유의성 있게 억제되었으며, MFSCE, PLP50 및 PLP100 대비 높은 억제 효력이 나타나 상승효과를 확인하였다.
도 13에서, Aβ25-35에 의한 IL-1β의 발현 증가는 MFSCE처리군에서 control군 대비 억제되었으며, MP50 및 MP100 처리군에서 역시 control군 대비 유의성 있게 억제되었다. 특히, MP50 처리군은 MFSCE, PLP50 및 PLP100 대비 높은 억제 효력이 나타나 상승효과를 확인하였으나, MP50와 MP100 처리군 간의 농도 의존성은 나타나지 않았다.
이를 통해 본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물은 염증반응에 대한 신경 보호 효과를 나타냄을 알 수 있다.
상술한 실험예2의 결과, 본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물 중 무막줄기세포추출물을 처리한 시료들은 Aβ로 유도한 신경세포 사멸모델에서 ROS 감소, Aβ생성 억제, AChE 억제, Bax/Bcl-2 발현 억제 및 염증인자 억제를 통하여 신경세포 보호 효력을 나타낸 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물 중 무막줄기세포추출물 및 피리독신을 혼합하여 처리한 MP 처리군은 MFSCE, PLP 단독 처리군 대비 Aβ 유도 신경세포 사멸에 대한 보호 효력에 대하여 상승효과를 나타난 것을 확인하였다.
실험예3: 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 인지능 손상 동물모델에서의 인지능 개선 효력 평가 및 기전 규명
후술하는 모든 실험 결과 (데이터)는 평균값 ± 표준편차 (mean ± SD)로 표시하였으며, Duncan's multiple range를 이용하여 유의성을 검증하였다.
3.1. 무막줄기세포추출물 제조
본 시험에 사용된 무막줄기세포추출물 (MFSCE)은 본 출원인이 직접 제조하여 사용하였다. 구체적으로, 무막줄기세포추출물은 줄기세포 성분 추출물로, 인체지방조직에서 줄기세포를 분리, 배양한 후 세포막을 제거하여 획득하였다. 원재료인 지방조직은 혈액검사를 통해 이상이 없는 20대 여성 중 BMI 25 내지 29.9에 해당하는 사람을 대상으로 지방공여동의서를 받고 확보하였다. 공여자를 대상으로 시행한 혈액검사 항목은 B형간염바이러스, C형간염바이러스, 인체면역결핍바이러스, 인체T림프영양성바이러스, 파보바이러스B19, 사이토메가로바이러스, 앱스타인바바이러스 및 매독크레포네마 등이다. 최종제인 무막줄기세포는 Good Laboratory Practice 인정기관에서 안전성 검사를 완료하여 독성이 없는 물질임을 확인하였다.
위의 과정을 거쳐 획득한 지방조직에서 줄기세포를 분리하여, 37℃, 5% CO2 조건의 incubator에서 초기배양을 실시하였으며, 세포의 성장에 따라 계대배양을 5 내지 10회 반복하였다. 배지를 제거하고 줄기세포를 일정량 수득하여 초음파 등의 물리적 방법을 사용하여 세포막을 벗기고, 필터 등의 방법을 이용하여 세포막 조각을 제거하여 무막줄기세포추출물을 획득하였다.
3.2. 인지능 및 기억능력 손상 동물모델 제작
Aβ25-35를 0.9% 생리식염수에 녹인 뒤, 72시간 동안 배양하여 응집시켰다. 실험동물을 마취시킨 후, 정위기구(stereotaxic apparatus)에 고정시켰다. 대뇌의 좌표 값에 맞추어 26-gauge 스테인리스스틸 주사바늘이 장착된 주사기를 이용하여 응집된 Aβ25-35를 뇌실내 투여(intracerebroventricular(i.c.v.) injection)하였다.
3.3. 시료의 처리
실험동물에 Aβ25-35 처리한 일주일 후, 무막줄기세포 추출물 (Membrane-Free Stem Cell Extract, MFSCE, 100 mg/kg), 피리독신 (pyridoxal phosphate, PLP, 1 mg/kg) 및 MFSCE와 PLP 혼합물 (MFSCE 100 mg/kg와 PLP 1 mg/mL의 혼합물, MP)를 존데(zoned)를 통하여 각각의 실험군의 실험동물에게 동일한 양을 14일간 경구투여하였다. 양성대조군으로는 DO(도네페질 5 mg/kg)를 존데를 통하여 각각의 실험군의 실험동물에게 동일한 양을 14일간 경구투여하였다. 경구투여 일주일 후, 인지능 측정 행동실험을 수행하였다.
또한, 모든 행동실험이 끝난 후 뇌를 적출하여 뇌조직에서 작용기전 검증 실험을 수행하였다.
MFSCE, PLP 및 MP를 처리하지 않고 Aβ25-35 처리한 실험동물은 대조군 (control)으로 준비하였다.
비교를 위하여, 시료 및 Aβ25-35가 처리되지 않은 실험동물은 normal군으로 준비하여 실험을 진행하였다.
실험대상인 시료별 특징을 요약하면, 하기 표 3과 같다.
| 군 명칭 | 시료의 처리 | 인지능 및 기억능력 손상 유도 | |
| 시료 | Aβ25-35 | ||
| Normal | 처리하지 않음 | 처리하지 않음 | 유도시키지 않음 |
| Control | 처리하지 않음 | 처리함 | 유도시킴 |
| MFSCE | 무막줄기세포추출물 100 mg/kg 투여 | 처리함 | 유도시킴 |
| PLP | 피리독신 1 mg/mL 투여 | 처리함 | 유도시킴 |
| MP | 무막줄기세포추출물 100 mg/kg와 피리독신 1 mg/mL의 혼합물 투여 | 처리함 | 유도시킴 |
| DO | 도네페질 5 mg/kg 투여 | 처리함 | 유도시킴 |
3.4.1. T-maze 및 물체인지실험에서 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 인지능력 개선 효력 평가
1) T-미로 실험(T-maze test), 2) 물체인지실험(novel object recognition test) 및 3) morris water maze 실험을 통하여 MFSCE, PLP 및 MP의 인지능 및 기억능력 개선 효력을 평가하였다.
1) T-미로 실험: T자 모양 상자를 준비하여 한쪽 끝을 차단문으로 막아 'ㄱ'형태의 길로 만들고 실험동물이 10분간 통로에 들어간 횟수를 기록하였다. 24시간 후, 차단문을 제거하여 실험동물이 10분간 자유롭게 다닐 수 있도록 한 후, 양쪽 통로에 들어간 횟수를 각각 기록하였다.
Recognition index(%) = [새로운 통로 탐색 횟수/(새로운 통로 탐색 횟수 + 이전 통로 탐색 횟수)] x 100
2) 물체인지실험: 뚜껑이 없는 박스를 사용하여 모양과 색깔이 같은 두 개의 물체(A, A')를 박스에 넣고 10분간 실험동물이 두 물체를 만진 횟수를 기록하였다. 24시간 후, 물체 A'를 제거한 후, 모양과 색깔이 다른 물체(B)를 넣고 10분간 동물이 두 물체를 만지는 횟수를 기록하였다.
Recognition index (%) = [새로운 물체 탐색 횟수/(새로운 물체 탐색 횟수 + 이전 물체 탐색 횟수)] x 100
3) Morris water maze 실험: 원형수조에 도피대의 위치가 보이지 않도록 물을 채우고, 도피대는 물 밑 약 1cm에 설치하였다. 수조를 사분면으로 나누어 각 사분면에 공간단서를 설치하였다. 3일 동안 실험동물을 도피대가 있는 사분면의 단서를 이용하여 60초 내에 숨겨진 도피대를 찾도록 훈련시켰다. 마지막 날, 도피대를 제거한 채로 60초간 수영을 하게 하고, 실험동물이 도피대가 있던 사분면에 머무른 시간을 기록하였다. 시험은 추적카메라를 이용하여 진행하였다.
3.4.2. T-maze 및 물체인지실험에서 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 인지능력 개선 효력 평가 결과
도 14(A) 내지 도 14(B)는 본 발명의 일 실시예에 따른 MFSCE, PLP 및 MP 처리군의 T-maze 및 물체인지실험 결과를 나타낸 도표이다. 구체적으로 도 14(A)는 T-maze 실험결과이며, 도 14(B)는 물체인지 실험결과이다.
도 14(A)와 같이, T-maze를 이용하여 공간인지능력을 확인한 결과, 인지능 손상 동물에서 감소한 공간인지능력이 MFSCE, PLP 및 MP 투여군에서 개선된 것을 알 수 있다. 그러나, MP에서 MFSCE, PLP 대비 상승효과는 나타나지 않았다.
도 14(B)에서 도시된 바와 같이, 물체인지실험을 이용하여 물체인지능력을 확인한 결과, 인지능 및 기억능력 손상 동물에서 감소한 물체인지능력이 MFSCE, PLP 및 MP 투여군에서 개선되었다. 그러나, MP에서 MFSCE, PLP 대비 상승효과는 나타나지 않았다.
도 15(A) 내지 도 15(C)는 본 발명의 일 실시예에 따른 MFSCE, PLP 및 MP 처리군의 Morris water maze test 결과를 나타낸 도표이다. 구체적으로 도 15(A)는 Morris 수중 미로 테스트의 탈출 대기 시간을 비교한 도표이며, 도 15(B)는 Morris 수중 미로 테스트에서 대상 사분면의 점유 시간을 비교한 도표이며, 도 15(C)는 숨겨진 플랫폼에 도달하는 지연 시간을 비교한 도표이다.
도 15(A) 내지 도 15(C)는 Morris water maze test를 이용하여 학습·기억력에 대한 효력을 확인한 결과, 인지능 및 기억능력 손상 동물에서 감소한 학습·기억력(숨겨진 도피대 탐색 시간, 도피대 존재 사분면에 머무르는 시간)이 MFSCE, PLP 및 MP 투여군에서 개선되었다. 그러나, MP에서 MFSCE, PLP 대비 상승효과는 나타나지 않았다.
3.5.1. 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 뇌조직에서 Aβ 단백질 생성 관련 인자 발현 조절 효력 평가
Western blot analysis를 통해 MFSCE, PLP 및 MP에 의한 APP, BACE, PS1, PS2 등의 단백질 발현 변화를 측정하였다.
구체적으로, 평가를 위하여 실험동물의 뇌를 적출하여 RIPA 용액에 넣은 후 homogenize 시킨 후 Bio-Rad 분석 키트를 사용하여 단백질을 정량화하였다. 동일한 단백질 샘플을 10% 또는 13% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드겔 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel, SDS-PAGE)로 분리하고 전기영동을 통해 멤브레인으로 옮겼다. 막을 5% 탈지유로 실온에서 1시간 동안 반응한 다음, 1차 항체와 함께 4℃에서 12시간 이상 반응하였다. 막을 PBS-T로 10분 동안 3회 세척한 후, 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 반응하였다.
이후, PBS-T로 10분간 3회 세척한 후 ECL 용액과 반응시켰다. 화학발광이미징시스템 (chemiluminescence imaging system, Davinch-ChemiTM, Davinch-K, Seoul, Korea)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다. ImageJ 소프트웨어 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 단백질 밀도를 분석하였다. 단백질 수준은 밴드 강도를 하우스키핑 (housekeeping) 단백질인 β-액틴 (β-actin)의 강도로 나눈 비율로 표현하였다.
3.5.2. 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 뇌조직에서 Aβ 단백질 생성 관련 인자 발현 조절 효력 평가결과
도 16(A) 내지 도 16(B)는 본 발명의 일 실시예에 따른 MFSCE, PLP 및 MP 처리군의 Aβ 단백질 생성 관련 인자인 APP, BACE, PS1 및 PS2의 단백질 발현 변화 측정결과를 나타낸 도표이다. 구체적으로 도 16(A)는 APP, PS1 및 PS2의 단백질 발현 변화결과를 나타낸 도표이며, 도 16(B)는 BACE의 단백질 발현 변화결과를 나타낸 도표이다.
도 16(A)를 참조하면, Aβ25-35투여에 의한 뇌조직에서의 APP 및 PS1의 증가는 MFSCE, PLP 및 MP 처리군에서 control군 대비 유의성 있게 억제되었다. 그러나, MP에서 MFSCE, PLP 대비 상승효과는 나타나지 않았다.
아울러, Aβ25-35투여에 의한 뇌조직에서의 PS2의 증가는 MFSCE, PLP 및 MP 처리군에서 control군 대비 유의성 있게 억제되었다. 특히 MP에서 MFSCE 및 PLP 대비 높은 억제 효력이 나타나, MFSCE, PLP 대비 상승효과를 확인하였다.
도 16(B)와 같이, Aβ25-35투여에 의한 뇌조직에서의 BACE의 증가는 MFSCE, PLP 및 MP 처리군에서 control군 대비 유의성 있게 억제되었다. 그러나, MP에서 MFSCE와 PLP 대비 상승효과는 나타나지 않았다.
3.6.1. 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 뇌조직에서 시냅스 가소성 조절 효력 평가
Western blot analysis를 통해 MFSCE, PLP 및 MP에 의한 BDNF 발현 변화를 측정하였다.
3.6.2. 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 뇌조직에서 시냅스 가소성 조절 효력 평가결과
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 MFSCE, PLP 및 MP 처리군의 BDNF 발현 변화 측정 결과를 나타낸 도표이다.
도 17을 참조하면, Aβ25-35투여에 의한 뇌조직에서의 BDNF의 감소는 MFSCE, PLP 및 MP 처리군에서 control군 대비 유의성 있게 증가되었다. 특히 MP에서 MFSCE, PLP 대비 높은 억제 효력이 나타나, MFSCE, PLP 대비 상승효과를 확인하였다.
3.7.1. 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 뇌조직에서 세포사멸 억제 기전 평가
Western blot analysis를 통해 MFSCE, PLP 및 MP에 의한 세포사멸 유발인자 (Bax, cleaved caspase-3 및 cleaved poly ADP-ribose polymerase (PARP)) 및 세포사멸 억제인자 (Bcl-2)의 발현 변화를 측정하였다.
3.7.2. 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 뇌조직에서 세포사멸 억제 기전 평가결과
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 MFSCE, PLP 및 MP 처리군의 세포사멸 유발인자 (Bax) 및 세포사멸 억제인자 (Bcl-2)의 발현 변화 측정 결과를 나타낸 도표이다.
도 18을 참조하면, Aβ25-35투여에 의한 뇌조직에서의 Bax/Bcl-2의 발현 증가는 MFSCE, PLP 및 MP 처리군에서 control군 대비 유의성 있게 억제되었다. 특히 MP에서 MFSCE와 PLP 대비 높은 억제 효력이 나타나, MFSCE, PLP 대비 상승효과를 확인하였다.
또한, Aβ25-35투여에 의한 뇌조직에서의 cleaved caspase-3 및 cleaved PARP의 발현 증가(세포사멸 인자)는 MFSCE, PLP 및 MP 처리군에서 control군 대비 유의성있게 억제되었다. 특히 MP에서 cleaved caspase-3의 발현은 MFSCE, PLP 대비 높은 억제 효력이 나타나, MFSCE, PLP 대비 상승효과를 확인하였다.
3.8.1. 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 뇌조직에서 신경전달물질 조절 인자 억제능 평가
Western blot analysis를 통해 MFSCE, PLP 및 MP에 의한 기억력 관련 효소인 AChE의 발현 변화를 측정하였다.
3.8.2. 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 뇌조직에서 신경전달물질 조절 인자 억제능 평가결과
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 MFSCE, PLP 및 MP 처리군의 AChE의 발현 변화 측정 결과를 나타낸 도표이다.
도 19를 참조하면, Aβ25-35투여에 의한 뇌조직에서의 AChE의 발현 증가는 MFSCE, PLP 및 MP 처리군에서 control군 대비 유의성 있게 억제되었다. 그러나, MP에서 MFSCE와 PLP 대비 상승효과는 나타나지 않았다.
3.9.1. 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 뇌조직에서 산화적 스트레스 개선 효력 평가
1) Malondialdehyde(MDA) 측정은 뇌 조직 균질액을 이용하여 지질과산화 지표인 MDA 측정을 통해 산화적 스트레스 개선 효력을 평가하였다.
2) Nitric oxide(NO) 생성량 측정은 Griess reagent 반응을 통해 뇌 조직 내 NO 생성량을 측정하여 산화적 스트레스 개선 효력을 평가하였다.
3) ROS 생성량 측정은 DCF-DA를 이용해 ROS 생성량을 측정하여 항산화 효력을 평가하였다.
3.9.2. 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 약학적 조성물의 뇌조직에서 산화적 스트레스 개선 효력 평가 결과
도 20(A) 내지 도 20(C)는 본 발명의 일 실시예에 따른 MFSCE, PLP 및 MP 처리군의 산화적 스트레스 생성 변화 측정 결과를 나타낸 도표이다. 구체적으로, 도 20(A)는 MDA인 지질과산화 (lipid peroxidation) 측정결과이며, 도 20(B)는 NO측정결과이고, 도 20(C)는 ROS측정결과를 나타낸 도표이다.
도 20(A) 내지 도 20(C)를 참조하면, 산화 스트레스 개선 효력을 확인하기 위하여 MDA, NO 및 ROS 생성량을 측정한 결과, Aβ25-35투여에 의해 뇌조직에서 증가한 MDA, NaNO2 및 ROS 생성량은 MFSCE, PLP 및 MP 처리군에서 control군 대비 유의성 있게 억제되었다. 그러나, MP에서 MFSCE 및 PLP 대비 상승 효과는 나타나지 않았다.
이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[제조예]
1. 산제의 제조
본 발명의 추출물
10.0 중량%
유당
90.0 중량%
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
본 발명의 추출물
10.0 중량%
옥수수전분
40.0 중량%
유당
40.0 중량%
스테아린산 마그네슘 10.0 중량%
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
본 발명의 추출물
10.0 중량%
옥수수전분
40.0 중량%
유당
40.0 중량%
스테아린산 마그네슘 10.0 중량%
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
4. 환의 제조
본 발명의 추출물
5.0 중량%
유당
50.0 중량%
글리세린
40.0 중량%
자일리톨
5.0 중량%
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 환을 제조하였다.
5. 과립의 제조
본 발명의 추출물
20.0 중량%
포도당
20.0 중량%
전분
60.0 중량%
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 mg을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
6. 주사제의 제조
본 발명의 추출물
10.0 중량%
젤라틴
70.0 중량%
트레할로스
20.0 중량%
상기의 성분을 혼합한 후, 동결 건조하여 바이알에 충진하였다.
Claims (8)
- 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 무막줄기세포추출물은,
인체 지방에서 유래한 줄기세포의 막을 제거하고 유효성분을 추출한 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은,
베타카로틴(β-carotene), 엽산(folic acid), 피리독신(pyridoxine), 코발라민(cobalamin) 및 아스코르브산 (ascorbic acid)에서 선택되는 어느 하나 이상의 비타민첨가제가 혼합된 것을 특징으로 하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은,
아밀로이드 베타 단백질(amyloid beta protein)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물. - 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 관련 질환의 예방용 기능성 식품 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 조성물은,
아밀로이드 베타 단백질(amyloid beta protein)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 인지능 또는 기억능력 관련 질환의 예방용 기능성 식품 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 인지능 또는 기억능력 관련 질환은,
퇴행성 뇌질환 또는 치매인 것을 특징으로 하는 인지능 또는 기억능력 관련 질환의 예방용 기능성 식품 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 인지능 또는 기억능력 관련 질환은,
알츠하이머 치매인 것을 특징으로 하는 인지능 또는 기억능력 관련 질환의 예방용 기능성 식품 조성물.
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| KR1020210123108A KR20230040025A (ko) | 2021-09-15 | 2021-09-15 | 무막줄기세포추출물을 포함하는 인지능 또는 기억능력 개선용 기능성 식품 조성물 |
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| KR101319829B1 (ko) | 2011-08-11 | 2013-10-17 | 한림대학교 산학협력단 | 생더덕과 찐더덕의 추출물 및 분획물을 포함하는 치매 예방 또는 치료 및 인지능 개선용 약학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물 |
| KR101561672B1 (ko) | 2012-12-21 | 2015-10-20 | 김영실 | 줄기세포 성장인자 및 세포활성물질의 성분추출물 제조방법 |
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-
2021
- 2021-09-15 KR KR1020210123108A patent/KR20230040025A/ko not_active Application Discontinuation
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