KR20230028509A

KR20230028509A - 안구 병리의 치료를 위한 dna 구조물

Info

Publication number: KR20230028509A
Application number: KR1020237002892A
Authority: KR
Inventors: 티에리 보르데; 엘리제 오르앙; 까린 비고; 로날드 뷔가쥬
Original assignee: 아이벤시스
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2023-02-28
Also published as: AU2021298865A1; CA3182197A1; EP4171636A1; JP2023531289A; WO2022003063A1; FR3111913A1; CN115768486A; IL299487A

Abstract

본 발명은 주로 안구 병리의 치료에서 사용, 및 안구 병리를 앓는 환자의 안구 근육 세포로 핵산의 비-바이러스적 전달을 위한 DNA 구조체에 관한 것으로서, 이것은 특히 제1 치료 단백질을 코딩하는 제1 서열 및 제1 치료 단백질과 상이한 제2 치료 단백질을 코딩하는 제2 서열을 포함하는 것을 특징으로 하고, DNA 구조체는 모양체근으로 주사에 이어서 모양체근의 세포로 전기전달을 통해 환자에게 투여된다.

Description

안구 병리의 치료를 위한 DNA 구조물

본 발명은 신규한 DNA 구성체를 비롯하여, 비바이러스적 유전자 요법에 의한 안구 병리의 치료에서 이의 적용에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 보다 특히 최대 7개월 동안 지속될 수 있는 기간 동안 2종 치료 단백질의 표적화된 안구내 생산을 가능하게 만드는 상기 DNA 구성체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 DNA 구성체 및 이의 용도는 관심 치료 단백질의 장기간 안구내 생산을 위해 모양체근으로 DNA 구성체의 주사에 이어서 전기전달을 통해서 망막의 병리를 치료하는데 보다 특히 적합하다.

물질대사 및 염증성 질환 또는 나이와 관련된 실명이 상당히 증가하고 있고 공중 보건 측면에서 유럽 및 전세계적으로 점점 더 중요한 사회적 문제를 제기한다. 실명의 주요 원인은 나이-관련 황반 변성 (ARMD), 당뇨병성 망막병증 (DR), 포도막염, 녹내장, 색소성 망막염, 눈 손상 후 출혈 및 망막 박리를 포함하는 망막의 병리와 관련된다. 실명을 초래하는 나이-관련 황반 변성 (ARMD)은 대략 8.7%의 유병률을 갖고, 50세 이상 인구의 거의 26%에서 발생된다. ARMD는 인구의 고령화로 인해서 공중 및 사회 건강의 주요 문제가 되고 있다. 당뇨병 발병률의 지속적인 주요한 증가가 당뇨병성 망막병증 (DR)의 주요 원인이어서, 그들은 공중 보건 및 과학 연구의 우선 순위가 되고 있다. 통계는 2형 당뇨병이 지금부터 2030년까지, 인구의 4.5% 초과에서 발병될 수 있고, 그들 중 거의 30%는 당뇨병성 망막병증을 앓게 될 것임을 보여준다. 마지막으로, 포도막염은 그의 유병률이 1/1000로 추정되고, 발생률은 0.5/1000로 추정되는 염증성 안질환군을 대표한다. 포도막염은 실명 사례의 10%를 차지하므로, 상기 언급된 질환에 비해서 드물지만, 노동 연령의 젊은 환자에서 주요한 사회적 및 경제적 영향을 미친다. 녹내장은 전세계적으로 비가역적 실명의 2번째 원인이다. 전세계적으로 녹내장 환자의 수는 2020년에 7600만명에서 2040년에는 1억 1100만명으로 증가될 것으로 예상된다. 녹내장은 망막 신경절 세포의 변성 및 시야 상실을 특징으로 하는 진행성 시신경병증을 유도하는 비정상적인 안내압을 특징으로 한다. 안내압은 현재 치료가 존재하는 유일한 위험 인자이다. 그러나, 녹내장 손상은 안내압의 감소에도 불구하고 환자의 거의 50%에서 지속된다. 색소성 망막염은 이후 황반으로 진행되는, 망막 주변에서 광수용체의 점진적인 손실을 특징으로 하는 망막의 유전적 장애의 임상 및 유전적으로 이질적인 군을 나타낸다. 시각 장애는 일반적으로 야맹증 및 점진적 시약 상실로 나타난다. 이의 유병률은 1/3000 내지 1/5000이다. 색소성 망막염의 원인이 되는 50개 초과의 유전자가 지금까지 확인되었다.

이들 병리 중 일부의 치료를 위해서, 치료제의 안구내, 또는 심지어 유리체내 주사가 개발되었다. 2006년에, 최초의 항-VEGF 유형 (VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor)의 치료 단백질이 ARMD에서 맥락막 신생혈관생성을 치료하기 위해 안구내 경로를 통해 투여되었다. 항-VEGF 유형 단백질의 예로서, ARMD에서 맥락막 신생혈관생성 및 당뇨병성 황반 부종의 치료를 위해 판매 허가된, Lucentis® (라니비주맙)를 언급할 수 있다. 치료 단백질, 특히 재조합 단백질의 안구내 주사는 이후 ARMD의 황반 부종, 당뇨병성 망막병증 및 정맥 폐색의 치료에 일반적이게 되었다.

안구 병리에 대한 지속적인 효과를 보장하기 위해서, 상기 기술된 항-VEGF는 환자에 따라서 1개월에 1회 또는 기껏해야 2개월에 1회 투여된다. 그러므로, 치료가 완전하게 효과적이도록 항-VEGF의 투여 빈도를 결정하기 위해서 각 환자를 모니터링하는 것이 필요하다. 이러한 모니터링은 환자, 간병인 및 간호 직원에게 상당한 스트레스를 유발하여서, 가장 흔하게 장기간 동안 최적이하이고 효율적이지 않은 치료를 야기하게 된다 (Ciulla 2020, Ophthalmology Retina 2020;4: 19-30). 게다가 이러한 치료 방법은 환자 안구체 내 치료 단백질 수준의 변화, 즉 주사 시점에 고농도 (피크)이고, 점진적으로 감소하여 다음 주사까지 0에 가까워지는 경향이 있는 농도를 유도한다. 그러므로, 치료 단백질의 농도가 불규칙하고 전체 치료 지속기간 동안 최적이 아니다. 게다가, 유리체내 투여와 연관된 부작용 위험성이 반복 투여에 따라 증가된다 (Schargus 2020, Clinical Ophthalmology 2020: 14　897-904).

안구 병리 중에서, 포도막염은 환자 눈의 홍채, 모양체 또는 맥락막에 영향을 미치는 염증 과정으로 정의되고, 이들 3개 구성요소가 포도막을 형성한다. 이것은 그 원인이 아직 알려지지 않은 몇몇 상이한 병리를 포괄하는 일반 용어이지만 일반적으로 감염성 포도막염과 비감염성 포도막염의 2개 유형이 존재한다. 홍채 또는 모양체에 영향을 미치고 서방 국가에서 가장 흔한 포도막염인 앞포도막염; 전방 유리체에 영향을 미치는 중간 포도막염; 및 맥락막 및 망막에 영향을 미치는 후포도막염으로 구분된다. 비감염성 포도막염은 종종 자가면역 성분을 갖는다. HLA-B27 항원과 연관된 급성 앞포도막염은 포도막염의 주요 원인을 나타낸다 (Rothova et al., Br J Ophthalmol. 1992; 76:137-41). 또한, 앞포도막염은 많은 류마티스 질환 예컨대 사르코이드증과 연관된 것으로 확인된다. 비감염성 원인의 후포도막염은 베체트병, 보그트 코야나기 하라다병, 버드샷 맥락망막병증 등과 가장 흔하게 연관된다.

경구 및/또는 국소 경로에 의한 코르티코이드 치료가 비감염성 후포도막염의 치료에서 널리 사용된다. 또한, 대부분의 난치성 병리 경우에, 코르티코스테로이드의 항-염증성 효과를 증가시키기 위해서 면억억제제가 치료에 첨가될 수 있다. 이것은 특히 시클로스포린, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 마이코페놀레이트, 타크롤리무스 및 클로람부실과 관련되지만 이에 제한되지 않는다. 지난 10여년간, 눈 뒤쪽 염증이 존재하는 비감염성 포도막염의 치료를 위해 최근에 승인된 Humira® (아달리무맙)을 포함하여, 항-TNF 알파 항체를 사용하는 치료가 또한 사용될 수 있었다.

하기 치료 화합물: 시클로스포린 A, 라파마이신, 타크롤리무스, 및 항-TNF 알파의 사용에 대한 임상 시험이 이들 화합물의 효능 및 안전성을 평가하기 위해 수행되었고 따라서 자가면역 안구 병리 예컨대 베체트병을 치료할 수 있다. 그러나, 이들 치료 화합물의 전신 투여가 장기간 동안 많은 부작용을 초래하고, 그들 중 일부 경우, 그들 국소 투여는 환자에게 불량한 내약성을 제공하거나 또는 효능이 거의 없는 것으로 확인되었다.

그러므로, 상기 기술된 치료 방법은 몇가지 단점을 갖는다. 전신 및 국소 경로로 투여된 치료 화합물은 수많은 부작용을 초래한다. 유리체내 주사로 투여되는 재조합 단백질은 빈번하게 투여되어야 하지만, 각 투여 사이에 큰 농도 변동이 존재한다. 이들 주사의 반복은 환자에게 여전히 매우 번거롭고 스트레스가 되며 또한 부작용 (안내압 증가, 안구내 염증, 안내염, 백내장 등)을 야기할 수도 있다. 따라서, 결국 많은 환자들이 이들 치료를 포기한다.

이러한 문제를 극복하기 위해서, 본 발명자는 특히 출원 FR3031112에 예시된 바와 같이, 외과적 중재술의 횟수 및/또는 빈도를 감소시키고, 따라서, 안구내 주사의 침습적 측면을 감소시키면서, 환자의 안구체의 근육 세포로 핵산을 비바이러스적으로 전달하고자 하는 DNA 구성체의 적용을 통해 수개월 동안 치료 단백질의 안정하고 일정한 생산을 보장하는 것을 이전에 제안하였다. 이러한 구성체는 복제 기원, 환자의 안구체에서 DNA의 발현을 허용하는 프로모터, 환자의 안구체에서 DNA의 발현을 촉진하는 하나 이상의 서열, 및 안구 병리의 치료에서 이의 활성에 대해 선택된 치료 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 구성체는 모양체근으로 직접 주사에 이어서 전기전달을 통해 안구체에 전달된다.

그러나, 상기 언급된 안구 병리의 치료는 활성 치료 성분의 효능을 강화시키기 위한 제2 화합물, 또는 2개 펩티드 서브유닛으로 이루어진 화합물의, 2종의 활성 치료 성분의 적용을 요구한다.

따라서, 상기 언급된 방법의 문맥에서, 제1 유형은 제1 관심 분자의 발현을 허용하는 반면 제2 유형은 제2 관심 분자의 발현을 허용한다는 점에서 상이한, 2개 유형의 DNA 구성체를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 고려할 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 (i) 2종 생산물의 개발을 요구하여서, 개발 및 제조 비용 상승과, 개별적으로 그리고 조합하여 선택된 생산물 각각의 활성 및 안전성을 평가할 필요가 있다는 점, (ii) 투여될 수 있는 2종 활성 치료 성분 각각의 최대 용량을 절반으로 줄여, 용량 관점에서 상당한 제약을 가하게 된다는 점, 및 마지막으로 (iii) 표적 세포를 침투하는 이들 구성체 각각의 분량의 완전한 제어를 허용하지 않아서, 결과적으로 눈 수준에서 발현되는 이들 관심 분자의 비율에 대한 불확실성을 초래하게 된다는 점에서 이상적이지 않다. 이러한 제약 및 불확실성은 병리 치료의 맥락에서 바람직하지 않다.

결론적으로 본 발명자들은 본 발명의 맥락에서, 2종의 관심 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 구성체를 적용하는 것을 제안한다.

그러므로, 본 발명은 먼저 안구 병리의 치료에서 이의 사용을 위한 DNA 구성체에 관한 것으로서, 상기 DNA 구성체는 상기 안구 병리를 갖는 환자의 안구체의 근육 세포로 핵산의 비바이러스적 전달을 위해 의도되고;

상기 DNA 구성체는

(a) 박테리아 또는 원핵생물 복제 기원, 특히 박테리아 복제 기원;

(b) 환자의 안구체에서 DNA의 발현을 촉진하는 하나 이상의 서열;

(c) - 제1 치료 단백질, 및

- 이러한 제1 치료 단백질의 분비를 허용하는 신호 펩티드로서, 이러한 신호 펩티드는 상기 제1 치료 단백질의 N-말단에서 제1 치료 단백질의 서열과 인접하는 것인 신호 펩티드

를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열;

(d) 환자의 안구체에서 이러한 제1 치료 단백질의 발현을 허용하는 프로모터;

(e) 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열;

(f) - 제1 치료 단백질과 상이한, 제2 치료 단백질, 및

- 이러한 제2 치료 단백질의 분비를 허용하는 신호 펩티드로서, 신호 펩티드는 상기 제2 치료 단백질의 N-말단에서, 제2 치료 단백질의 서열과 인접하는 것인 신호 펩티드

를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열;

(g) 환자의 안구체에서 이러한 제2 치료 단백질의 발현을 허용하는 프로모터; 및

(h) 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열

을 포함하는 것을 특징으로 하고,

상기 DNA 구성체는 모양체근으로 주사 및 이어서 모양체근의 세포로 전기전달을 통해서 환자에게 투여된다.

사실, 모든 예상과 반대로, 관심 분자를 코딩하는 하나가 아닌 2개 서열을 도입시키는 결과로서, DNA 구성체 크기의 상당한 증가는, 모양체근으로 상기 구성체의 직접 주사뿐만 아니라, 전기전달 단계를 포함하는, 상기 표시된 바와 같은, 방법의 문맥에서 표적 세포를 침투하는 이의 능력에 부정적인 효과를 갖지 않는다.

결론적으로, 본 발명에 따른 방법 및 구성체는 유리하게, 모든 예상과 달리,

- 2종 활성 성분 또는 1종 활성 성분 및 활성 성분의 활성/효능을 강화시키기 위해 적합한 화합물의 제자리 생산을 허용하여, 안구 병리의 치료 가능성을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라,

- 수개월 동안 치료 단백질의 안정하고, 계속적인 생산을 보장하면서, 외과적 중재술의 감소된 횟수/빈도, 및 결론적으로 안구내 주사의 침습성 측면의 감소 관점에서, 그들을 줄이지 않고, 상기 표시된 방법의 장점을 유지할 수 있다.

일 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제1 치료 단백질은 S-Flt1, 애플리버셉트, 콘버셉트, 브롤루시주맙, 및 특히 펩티드 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항-VEGF 유형의 단백질이고, 이 단백질은 보다 특히 애플리버셉트이다.

일 구현예에 따라서, 제1 치료 단백질은 서열 SEQ ID NO: 1과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 보다 특히 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 2에 의해 코딩된다.

일 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제2 치료 단백질은 서열 SEQ ID NO: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질이고, 이 단백질은 보다 특히 디코린이다.

일 구현예에 따라서, 제2 치료 단백질은 서열 SEQ ID NO: 6과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 특히 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어지고, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 7 및 서열 SEQ ID NO: 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 11에 의해 코딩된다.

일 구현예에 따라서, 본 발명에 따라서 이의 사용을 위한 DNA 구성체는

(c) 제1 뉴클레오티드 서열이

- 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질로서, 이 단백질은 보다 특히 애플리버셉트인 단백질; 및

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 4의 신호 펩티드

를 코딩하고;

(f) 제2 뉴클레오티드 서열이

- 서열 SEQ ID NO: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질로서, 이 단백질은 보다 특히 디코린인 단백질; 및

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 13의 신호 펩티드

를 코딩한다.

일 구현예에 따라서, 상기 언급된 바와 같은 DNA 구성체의 복제 기원은 박테리아 복제 기원이고, 특히 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli)의 천연 플라스미드 R6K로부터 유래되는 복제 기원, 특히 에스케리치아 콜라이의 천연 플라스미드 R6k의 복제 기원 R6K 감마, 특히 서열 SEQ ID NO: 31의 복제 기원이다.

본 발명에 따른 DNA 구성체는 선형 또는 원형 형태, 특히 원형 형태일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 원형 플라스미드이다.

특정 구현예에서, DNA 구성체는 나형 DNA 구성체이다.

일 구현예에 따라서, 상기 언급된 바와 같이 이의 사용을 위한 DNA 구성체는 안구 병리가 망막 변성, 특히 습성 또는 건성 나이-관련 황반 변성 (ARMD); 당뇨병성 망막병증 (DR); 망막 정맥 폐색, 특히 중심 망막 정맥 폐색 (CRVO) 또는 분지 망막 정맥 폐색 (BRVO); 근시성 맥락막 신생혈관생성 (CNV); 포도막염, 특히 비감염성 포도막염; 색소성 망막염 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 망막 변성이고, 보다 특히 망막 변성은 나이-관련 황반 변성 (ARMD), 특히 ARMD의 (습성) 신생혈관 형태; 당뇨병성 황반 부종 (DME)으로 인한 시력 저하; 망막 정맥 폐색, 특히 중심 망막 정맥 폐색 (CRVO) 또는 분지 망막 정맥 폐색 (BRVO); 및 근시성 맥락막 신생혈관생성 (CNV)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 안구 병리의 치료를 위한 환자의 안구체의 근육 세포로 핵산의 비바이러스적 전달을 위한 DNA 구성체에 관한 것으로서,

(a) 박테리아 또는 원핵생물 복제 기원, 특히 박테리아 복제 기원,

(b) 환자의 안구체에서 DNA의 발현을 촉진하는 하나 이상의 서열,

(c) - 제1 치료 단백질로서, 상기 제1 치료 단백질은 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질이고, 이러한 단백질은 보다 특히 애플리버셉트인 제1 치료 단백질, 및

- 이러한 제1 치료 단백질의 분비를 허용하는 신호 펩티드로서, 펩티드 서열 SEQ ID NO: 4의 신호 펩티드이고, 이러한 신호 펩티드는 상기 제1 치료 단백질의 N-말단에서 제1 치료 단백질의 서열과 인접하는 것인 신호 펩티드

를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열;

(e) 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열;

(f) - 제2 치료 단백질로서, 상기 제2 치료 단백질은 서열 SEQ ID NO: 8와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질이고, 이러한 단백질은 보다 특히 디코린인 제2 치료 단백질, 및

- 이러한 제1 치료 단백질의 분비를 허용하는 신호 펩티드로서, 특히 펩티드 서열 SEQ ID NO: 13의 신호 펩티드이고, 이러한 신호 펩티드는 상기 제2 치료 단백질의 N-말단에서, 제2 치료 단백질의 서열과 인접하는 것인 신호 펩티드

를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열;

(h) 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열

을 포함하는 것을 특징으로 한다.

특히, 본 발명에 따른 DNA 구성체는

c) 제1 뉴클레오티드 서열이

- 애플리버셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 1과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 2인 뉴클레오티드 서열; 및

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 5

를 포함하고;

(f) 제2 뉴클레오티드 서열이

- 디코린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 6과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 7 또는 서열 SEQ ID NO: 11인 뉴클레오티드 서열; 및

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 14

를 포함한다.

도 1은 본 발명에 따른 DNA 구성체 (플라스미드 A)를 도시한다.
도 2는 단일 치료 단백질 (트랜스페린 - 플라스미드 A에서 사용된 것과 동일한 서열)만을 코딩하므로 본 발명에 따르지 않은 DNA 구성체를 도시하고, 후자는 플라스미드 A에서 처럼, CMV 유형의 프로모터 제어 하에 있다 (플라스미드 a').
도 3은 래트의 양쪽 눈의 모양체근에서, 본 발명에 따른 구성체 (플라스미드 A) 또는 플라스미드 A와 동일한 프로모터의 제어 하에 있고, 단지 트랜스페린만을 코딩하여 본 발명에 따르지 않은 구성체 (플라스미드 a')를 투여한 후, 3일에서 30일까지 (가로 좌표: 전기전달 후 일수 (D0)) 래트의 안액 중 서열 SEQ ID NO: 17의 트랜스페린의 농도의 변동 (세로 좌표: pg/mL)을 도시한다. 따라서 래트의 각 그룹은 언급된 2개의 특별한 구성체가 투여되었다.
도 4는 래트의 양쪽 눈의 모양체근에서 본 발명에 따른 구성체 (플라스미드 A)의 투여 후, 3일에서 30일까지 (가로 좌표: 전기전달 후 일수 (D0)) 래트의 안액 중 서열 SEQ ID NO: 22의 항-TNF-알파 융합 단백질의 농도의 변동 (세로 좌표: pg/mL)을 도시한다.
도 5는 본 발명에 따른 DNA 구성체 (플라스미드 B)를 도시한다.
도 6은 단일 치료 단백질 (애플리버셉트 - 플라스미드 B에서 사용된 것과 동일한 서열, 즉 서열 SEQ ID NO: 2)만을 코딩하고, 플라스미드 B에서 처럼 CAG 유형의 프로모터의 제어 하에 있는 본 발명에 따르지 않은 DNA 구성체 (플라스미드 b')를 도시한다.
도 7은 래트의 양쪽 눈의 모양체근에서, 본 발명에 따른 구성체 (플라스미드 B) 또는 애플리버셉트만을 코딩하고, 플라스미드 B에서와 동일한 프로모터의 제어 하에 있는 본 발명에 따르지 않은 구성체 (플라스미드 b')의 투여 후 3일에서 21일까지 (가로 좌표: 전기전달 후 일수 (D0)) 래트의 안액 중 서열 SEQ ID NO: 3의 애플리버셉트의 농도의 변동 (세로 좌표: pg/mL)을 도시한다. 따라서 래트의 각 그룹은 언급된 2개의 특별한 구성체가 투여되었다.
도 8은 래트의 양쪽 눈의 모양체근에서, 본 발명에 따른 구성체 (플라스미드 B)의 투여 후 3일에서 21일까지 (가로 좌표: 전기전달 후 일수 (D0)) 래트의 안액 중 서열 SEQ ID NO: 8의 디코린의 농도의 변동 (세로 좌표: pg/mL)을 도시한다.
도 9는 본 발명에 따른 DNA 구성체 (플라스미드 C)를 도시한다.
도 10은 처치 함수 (가로 좌표)에 따른 심각한 누출 (등급 3)을 제공하는 효과의 백분율 (세로 좌표: % 3등급 CNV 병변)을 도시한다. 좌측: 비히클 (대조군). 우측: 플라스미드 C.

정의

본 명세서의 문맥에서, 안구 병리와 연관된 용어 "치료하다" 및 "치료"는 상기 병리의 감소, 또는 심지어 중단을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "환자"는 바람직하게, 비인간 포유동물을 포함힌 포유동물, 보다 특히 인간을 의미한다.

용어 "제1 뉴클레오티드 서열" 및 "제2 뉴클레오티드 서열"은 후자를 읽는 동안, 이들 2개 서열 및 그들이 코딩하는 단백질을 명확하게 구별할 수 있도록 본 명세서에서 사용된다.

상기 뉴클레오티드 서열은 발현 카세트에 상응하고, 이들 카세트의 각각은 하기에 정의되는 바와 같다.

그러나, 이들 용어 "제1 뉴클레오티드 서열" 및 "제2 뉴클레오티드 서열"은 이들 서열/발현 카세트가 본 발명에 따른 구성체에 존재하는 순서를 나타내는 것을 목적으로 하지 않는다. 따라서, 일 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 구성체를 판독하는 의미에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 제2 뉴클레오티드 서열 앞에 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 구성체를 판독하는 의미에서, 제2 뉴클레오티드 서열이 제1 뉴클레오티드 서열 앞에 존재할 수도 있다.

상기에 표시된 것에 따라서, "제1 뉴클레오티드 서열"은 제1 치료 단백질을 코딩하는 서열 및 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하고, 이들 서열은 "제1 뉴클레오티드 서열" 내에서, 서로에 대해 특별히 표시된 바와 같은 순서로 존재하고, 다시 말해서, 신호 펩티드를 코딩하는 서열은 신호 펩티드가 제1 치료 단백질의 N-말단에 존재하도록 하고, 즉, 신호 펩티드를 코딩하는 서열은 제1 치료 단백질을 코딩하는 서열의 5'에 존재한다.

또한, 상기에 표시된 바에 따라서, "제2 뉴클레오티드 서열"은 제2 치료 단백질을 코딩하는 서열 및 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하고, 이들 서열은 "제2 뉴클레오티드 서열" 내에서, 서로에 대해 특별히 표시된 바와 같은 순서로 존재하고, 다시 말해서, 신호 펩티드를 코딩하는 서열은 제2 치료 단백질의 N-말단에 존재하고, 즉, 신호 펩티드를 코딩하는 서열은 제2 치료 단백질을 코딩하는 서열의 5'에 존재한다.

본 발명의 의미에서, 2개 아미노산 또는 핵산 서열 간 "퍼센트 동일성"은 비교창을 통해서, 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정된다.

따라서, 비교창에서 뉴클레오티드 서열의 일부는 2개 서열 간 최적 정렬을 수득하기 위해서 기준 서열 (이들 첨가 또는 이들 결실을 포함하지 않음)과 비교해 첨가 또는 결실 (예를 들어, "갭")을 포함할 수 있다.

퍼센트 동일성은 비교되는 2개 서열에 대해서 동일한 아미노산 (또는 동일한 핵산)이 관찰되는 위치의 개수를 결정한 다음에, 2개 아미노산 간 (또는 2개 핵산 염기 간)에 동일성이 존재하는 위치의 개수를 비교창 내 위치의 총 개수로 나누고, 그들 사이의 2개 서열의 아미노산 동일성 (또는 뉴클레오티드 동일성)의 백분율을 얻기 위해서 백분율 결과를 곱해서 계산된다.

비교를 위한 서열의 최적 정렬은 기지의 알고리즘을 사용해 컴퓨터를 통해서 수행될 수 있다.

완전히 바람직하게, 백분율 서열 동일성은 CLUSTAL W 소프트웨어 (버전 1.82)를 사용해 결정되고, 매개변수는 다음과 같이 고정된다: (1) CPU 방식 = ClustalW mp; (2) 정렬 = "전체"; (3) 출력 형식 = "aln w/숫자"; (4) 출력 순서 = "정렬됨"; (5) 색상 정렬 = "아니오"; (6) KTUP (단어 크기) = "디폴트"; (7) 창 길이 = "디폴트"; (8) 점수 유형 = "퍼센트"; (9) TOPDIAG = "디폴트"; (10) PAIRGAP = "디폴트"; (1　1) 계통수/수종 = "없음"; (12) 매트릭스 = "디폴트"; (13) 갭 개방 = "디폴트"; (14) 말단 갭 = "디폴트"; (15) 갭 확장 = "디폴트"; (16) 갭 거리 = "디폴트"; (17) 수종 = "분기도" 및 (18) 계통수 갭 거리 = "숨김".

본 발명의 의미에서, 예를 들어, 기준 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 의미에서, 예를 들어, 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 뉴클레오티드 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열은 상기 기준 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 뉴클레오티드 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

DNA 구성체

상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 먼저 안구 병리의 치료에서 이의 사용을 위한 DNA 구성체에 관한 것이다.

이러한 구성체는 상기 안구 병리를 갖는 환자의 안 구체의 근육 세포로 핵산의 비바이러스적 전달을 위해 의도된다.

또한, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 (a) 박테리아 또는 원핵생물 복제 기원을 포함하는 것을 특징으로 한다.

특정 구현예에 따라서, 상기 복제 기원은 특히 박테리아이고, 예를 들어 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 유형의 복제 기원일 수 있고, 보다 특히 에스케리치아 콜라이의 천연 플라스미드 R6K로부터 유래되는 복제 기원, 특히 에스케리치아 콜라이의 천연 플라스미드 R6k의 복제 기원 R6K 감마; 및 복제 기원 pUC OriC로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

에스케리치아 콜라이의 천연 플라스미드 R6K로부터 유래되는 복제 기원은 특히 특허 EP1366176B2에 정의되어 있다.

또한, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 (b) 환자의 안구체에서 DNA의 발현을 촉진하는 하나 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. DNA의 발현을 촉진하는 이러한 서열, 예컨대 예를 들어 증폭자 또는 활성인자 서열이라고 불리는, 인핸서 유형의 서열은 당업자에게 친숙하다. 우리는 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 및/또는 유인원 DNA SV40을 갖는 종양 바이러스로부터 유래되는 인핸서 서열을 언급할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 또한 (c) 특히 제1 치료 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 비롯하여, (f) 제1 치료 단백질과 상이한, 특히 제2 치료 단백질을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

특정 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 오직 치료 단백질에 대한 2개 코딩 서열만을 포함하고, 다시 말해서, 오직 2개 발현 카세트만을 포함하며, 이들 발현 카세트의 각각은 치료 단백질에 대한 2개 코딩 서열 중 하나를 포함한다.

이들 제1 및 제2 치료 단백질은 특히 안구 병리에 대한 그들 효과에 대해 알려진 단백질로부터 선택될 수 있다.

이들 2종 단백질의 효과는 추가적일 수 있거나 또는 보완적일 수 있다. 또한, 이들 2개 단백질 중 하나는 본 발명에 따른 DNA 구성체로부터 출발하여 생산되는 다른 단백질의 치료적 활성에 대해 강화 효과를 가질 수 있다.

특히, 서로 상이한, 제1 및 제2 치료 단백질은 예를 들어, 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:

(i) 서열 SEQ ID NO: 17과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질로서, 보다 특히 트랜스페린인 이러한 단백질;

(ii) 항섬유화 성질을 갖는 단백질, 예컨대 단백질 BMP7 (골 형성 단백질 7), 항 TGF-베타 유형의 단백질, 항 FGF2 유형의 단백질, 항 CTGF 유형의 단백질 (결합 조직 성장 인자), 및 특히 서열 SEQ ID NO: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 보다 특히 디코린인 이러한 단백질;

(iii) 항-염증 성질을 갖는 단백질, 특히 항-TNF 유형의 단백질, 예컨대 예를 들어 hTNFR-Is, hTNFR-Is/mlgG1, 레너셉트, 또는 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해서 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질, 보다 특히 항 TNF-알파 유형의 단백질, 특히 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해서 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질 (Peppel et al., J Exp Med, 174: 1483-1489 - Murphy et al., Arch Ophthalmol, 22: 845-851), 및 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 22와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질;

(iv) 항-VEGF 유형의 단백질로서, 특히 S-Flt1, 애플리버셉트, 콘버셉트, 브롤루시주맙으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 특히 펩티드 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 보다 특히 애플리버셉트인 이러한 단백질;

(v) 항혈관생성 성질을 갖는 단백질, 예컨대 안지오스타틴, 엔도스타틴, 트롬보스폰딘, 항 안지오포이어틴-2 유형의 단백질, 항 FGF2 유형의 단백질, 항 PLGF 유형의 단백질, 항 PDGF 유형의 단백질; 및

(vi) 보체, 예컨대 보체 인자 I (CFI)의 활성화를 조절하는 단백질, 및 서열 SEQ ID NO: 26과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 보다 특히 보체 인자 H인 이러한 단백질.

특히, (i) 서열 SEQ ID NO: 17과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질은 서열 SEQ ID NO: 17과 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 및 100% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 특히, 이러한 단백질은 보다 특히 트랜스페린 (즉, 서열 SEQ ID NO: 17과 100% 서열 동일성을 갖는 단백질)이다.

특히, (ii) 서열 SEQ ID NO: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질은 서열 SEQ ID NO: 8과 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 및 100% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 특히, 이러한 단백질은 보다 특히 디코린 (즉, 서열 SEQ ID NO: 8과 100% 서열 동일성을 갖는 단백질)이다.

특히, (iii) 서열 SEQ ID NO: 22의 융합 단백질과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질은 서열 SEQ ID NO: 22와 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 및 100% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 특히, 이러한 단백질은 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 22의 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해서 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.

특히, (iv) 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질은 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 및 100% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 특히, 이러한 단백질은 보다 특히 애플리버셉트 (즉, 서열 SEQ ID NO: 3과 100% 서열 동일성을 갖는 단백질)이다.

특히, (vi) 서열 SEQ ID NO: 26과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질은 서열 SEQ ID NO: 26과 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 및 100% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 특히, 이러한 단백질은 보다 특히 보체 인자 H (즉, 서열 SEQ ID NO: 26과 100% 서열 동일성을 갖는 단백질)이다.

특히, 서로 상이한, 제1 및 제2 치료 단백질에 대한 코딩 서열은 예를 들어, 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:

(i) 트랜스페린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 특히 서열 SEQ ID NO: 15와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 16;

(ii) 항섬유화 성질을 갖는 단백질, 예컨대 단백질 BMP7 (골 형성 단백질 7), 항 TGF-베타 유형의 단백질, 항 FGF2 유형의 단백질, 항 CTGF 유형의 단백질 (CTGF: 결합 조직 성장 인자), 및 특히 디코린 코딩 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 6과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 7 또는 서열 SEQ ID NO: 11, 및 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 11;

(iii) 항-염증 성질을 갖는 단백질, 특히 항-TNF 유형의 단백질, 예컨대 예를 들어 hTNFR-Is, hTNFR-Is/mlgG1, 레너셉트, 또는 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해서 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 항 TNF-알파 유형의 단백질, 특히 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해서 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열, 및 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 21과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열;

(iv) 항-VEGF 유형의 단백질, 예컨대 S-Flt1, 애플리버셉트, 콘버셉트, 브롤루시주맙을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 특히 애플리버셉트를 코딩하는 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 1과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열, 특히 서열 SEQ ID NO: 2;

(v) 항혈관생성 성질을 갖는 단백질, 예컨대 안지오스타틴, 엔도스타틴, 트롬보스폰딘, 항 안지오포이어틴-2 유형의 단백질, 항 FGF2 유형의 단백질, 항 PLGF 유형의 단백질, 항 PDGF 유형의 단백질을 코딩하는 서열; 및

(vi) 보체, 예컨대 보체 인자 I (CFI), 및 보체 인자 H의 활성화를 조절하는 단백질을 코딩하는 서열, 및 특히 보체 인자 H를 코딩하는 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 25와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열.

"제1 및 제2 치료 단백질을 코딩하는 서열"은 이전에 표시된 바와 같이 "제1 뉴클레오티드 서열" 및 "제2 뉴클레오티드 서열"로서 이해되지 않고, 오히려 본 발명에 따른 제1 뉴클레오티드 서열 내 및 제2 뉴클레오티드 서열 내에 존재하고, 제1 및 제2 치료 단백질을 특이적으로 코딩하는 서열로서 이해된다.

일 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제1 또는 제2 치료 단백질은 서열 SEQ ID NO: 17과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질이고, 이러한 단백질은 보다 특히 트랜스페린이다.

특히, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 제1 뉴클레오티드 서열 또는 제2 뉴클레오티드 서열이

- 서열 SEQ ID NO: 17과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질로서, 보다 특히 트랜스페린인 이러한 단백질; 및

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 18의 신호 펩티드

를 코딩하는 것을 특징으로 할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제1 및 제2 치료 단백질을 코딩하는 서열 중 하나는 특히 트랜스페린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 15와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열일 수 있고, 특히 서열 SEQ ID NO: 16이다.

- 트랜스페린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 15와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 16; 및

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 20

을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

일 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체에 의해 코딩되는 제1 및 제2 치료 단백질은 각각 하기 단백질이다:

- 서열 SEQ ID NO: 17과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 보다 특히 트랜스페린인 이러한 단백질; 및

- 항-TNF-알파 유형의 단백질, 특히 서열 SEQ ID NO: 22와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 및 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 22의 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해서 커플링된 TNF 알펴에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질.

따라서, 일 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제1 및 제2 치료 단백질을 코딩하는 서열은 각각 하기와 같다:

- 항-TNF-알파 유형의 단백질을 코딩하는 서열, 특히 펩티드 서열 SEQ ID NO: 22의, 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해서 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 21과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열.

염증 및 산화 스트레스는 녹내장에 의해 야기된 안내압의 상승에 따른 망막 변성 예컨대 ARMD 또는 녹내장의 중요한 성분이다. 특히, TNF 알파의 안구내 농도의 증가는 녹내장성 눈에서 관찰되고 (Tezel et al., 2001, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Jul; 42(8): 1787-94), 설치류의 눈에 TNF-알파의 주사는 시신경의 축삭 변성 및 망막의 신경절 세포의 프로그램된 사멸을 유도한다 (Kitaoka 2006, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006; 47: 1448-1457). 철 수준을 조절하는 유전자의 발현 증가가 또한 녹내장성 눈에서 관찰되어서, 철에 의해 유도되는 산화 스트레스가 녹내장의 발병기전에서 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다 (Farkas et al., 2004). 항-TNF 및 철 킬레이팅제, 예컨대 트랜스페린의 투여는 철에 의해 매개되는 산화 스트레스 및 염증 둘 모두를 유리하게 감소시키는 것을 가능하게 만든다.

특히, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 하기를 특징으로 할 수 있다:

(c) 제1 뉴클레오티드 서열은

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 20

을 포함하고;

(f) 제2 뉴클레오티드 서열은

- 항-TNF-알파 유형의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 특히 펩티드 서열 SEQ ID NO: 22의, 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해서 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 21과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 21; 및

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 23

을 포함한다.

(c) 제1 뉴클레오티드 서열은

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 18의 신호 펩티드

를 코딩하고;

(f) 제2 뉴클레오티드 서열은

- 서열 SEQ ID NO: 22와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 22의 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해서 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질인 이러한 단백질; 및

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 23의 신호 펩티드

를 코딩한다.

다른 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체에 의해 코딩되는 제1 및 제2 치료 단백질은 각각 하기와 같다:

- 항섬유화 성질을 갖는 단백질로서, 특히 서열 SEQ ID NO: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 보다 특히 디코린인 이러한 단백질.

- 항섬유화 성질을 갖는 단백질, 예컨대 단백질 BMP7 (골 형성 단백질 7), 항 TGF-베타 유형의 단백질, 항 FGF2 유형의 단백질, 항 CTGF 유형의 단백질 (결합 조직 성장 인자), 및 특히 디코린 코딩 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 6과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 7 또는 서열 SEQ ID NO: 11, 및 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 11.

녹내장, 특히 원발성 개방각 녹내장은 섬유주 그물망의 섬유화 후 안내압 상승, 및 망막의 신경절 세포의 손실 및 시신경의 변성을 특징으로 한다. 녹내장에 대한 현재 치료는 안내압을 저하시키지만 신경퇴행의 진행을 중단시킬 수는 없다. 신경보호 작용제, 예컨대 항-TNF 또는 트랜스페린의 투여는 유리하게 항섬유화제 예컨대 디코린의 효과를 강화시키고, 또한 안내압을 저하시키고, 변성으로부터 망막 및 시신경을 보호하는 것을 가능하게 한다.

(c) 제1 뉴클레오티드 서열은

- 트랜스페린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 특히 서열 SEQ ID NO: 15와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 16; 및

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 20

을 포함하고;

(f) 제2 뉴클레오티드 서열은

- 디코린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 6과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 7 또는 서열 SEQ ID NO: 11, 및 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 11; 및

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 14

를 포함한다.

(c) 제1 뉴클레오티드 서열은

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 18의 신호 펩티드

를 코딩하고;

(f) 제2 뉴클레오티드 서열은

- 서열 SEQ ID NO: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질로서, 보다 특히 디코린인 이러한 단백질; 및

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 13의 신호 펩티드

를 코딩한다.

일 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제1 또는 제2 치료 단백질은 항-VEGF 유형의 단백질, 특히 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질이고, 이러한 단백질은 보다 특히 애플리버셉트이다.

- 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질로서, 보다 특히 애플리버셉트인 이러한 단백질; 및

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 4의 신호 펩티드

를 코딩하는 것을 특징으로 할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제1 및 제2 치료 단백질을 코딩하는 서열 중 하나는 특히 항-VEGF 유형의 단백질, 예컨대 S-Flt1, 애플리버셉트, 콘버셉트, 브롤루시주맙을 코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있고, 특히 애플리버셉트를 코딩하는 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 1과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열일 수 있고, 특히 서열 SEQ ID NO: 2이다.

- 애플리버셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 1과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 2; 및

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 5

를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

다른 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제1 및 제2 치료 단백질은 각각

- 항섬유화 성질을 갖는 단백질, 특히 서열 SEQ ID NO: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 보다 특히 디코린인 이러한 단백질; 및

- 항-VEGF 유형의 단백질, 특히 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 보다 특히 애플리버셉트인 단백질이다.

따라서, 일 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제1 및 제2 치료 단백질을 코딩하는 서열은 각각

- 항섬유화 성질을 갖는 단백질, 예컨대 단백질 BMP7 (골 형성 단백질 7), 항 TGF-베타 유형의 단백질, 항 FGF2 유형의 단백질, 항 CTGF 유형의 단백질 (결합 조직 성장 인자), 및 특히 디코린 코딩 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 6과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 7 또는 서열 SEQ ID NO: 11; 및

- 항-VEGF 유형의 단백질, 예컨대 S-Flt1, 애플리버셉트, 콘버셉트, 브롤루시주맙을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 특히 애플리버셉트를 코딩하는 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 1과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열, 특히 서열 SEQ ID NO: 2이다.

항섬유화제 활성 성분의 존재는 유리하게 항-VEGF의 효과를 강화시켜서, 표적 안구 병리의 치료에서 이러한 화합물의 효능을 개선시키는 것을 가능하게 한다. 특히, 최적 간격으로 항-VEGF의 주사를 받은 환자에서도, 망막하 섬유증의 발생이 절반이 넘는 환자에서 시간 경과에 따라 나타나서, 시간이 지남에 따라 항-VEGF의 효능을 감소시키는 것으로 관찰되었다 (Daniel et al. 2014, Ophthalmology 121, 656-666). 게다가, 망막하 섬유증의 발생은 항-VEGF에 비반응성인 ARMD 환자에서 항-VEGF에 대한 불량한 치료적 반응의 원인으로 확인되었다 (Cohen et al. 2012, Retina 32, 1480-1485).

(c) 제1 뉴클레오티드 서열은

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 5

를 포함하고;

(f) 제2 뉴클레오티드 서열은

- 디코린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 6과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 7 또는 서열 SEQ ID NO: 11; 및

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 14

를 포함한다.

(c) 제1 뉴클레오티드 서열은

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 5

를 포함하고;

(f) 제2 뉴클레오티드 서열은

- 디코린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 7; 및

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 14

를 포함한다.

(c) 제1 뉴클레오티드 서열은

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 5

를 포함하고;

(f) 제2 뉴클레오티드 서열은

- 디코린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 11; 및

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 14

를 포함한다.

(c) 제1 뉴클레오티드 서열은

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 4의 신호 펩티드

를 코딩하고;

(f) 제2 뉴클레오티드 서열은

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 13의 신호 펩티드

를 코딩한다.

다른 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제1 및 제2 치료 단백질은 각각,

- 항-TNF-알파 유형의 단백질, 특히 서열 SEQ ID NO: 22와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 및 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 22의 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질;

- 항-VEGF 유형의 단백질, 특히 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 보다 특히 애플리버셉트인 이러한 단백질이다.

따라서, 일 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제1 및 제2 치료 단백질을 코딩하는 서열은 각각,

- 항-TNF-알파 유형의 단백질을 코딩하는 서열, 특히 펩티드 서열 SEQ ID NO: 22의 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 21과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및

- 항-VEGF 유형의 단백질, 예컨대 S-Flt1, 애플리버셉트, 콘버셉트, 브롤루시주맙을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 특히 애플리버셉트를 코딩하는 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 1과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 2이다.

항-TNF-알파 활성 성분의 존재는 유리하게 항-VEGF의 효과를 강화시켜서, 표적 안구 병리의 치료에서 이러한 화합물의 효능을 개선시키는 것을 가능하게 한다. 특히, VEGF는 망막 투과성을 유도하지만, 당뇨병성 망막병증 환자에서 관찰될 수 있는 것과 같이, 염증제, 예컨대 TNF-알파는 또한 특히 항-VEGF 치료에 반응하지 않는 환자에서, 혈관 투과성을 초래할 수 있다는 것은 충분히 알려져 있다 (Arias L. et al.; Retina 2010, 30: 1601e1608 and Sfikakis et al.; Diabetes Care 2010, 33: 1523e1528). 최근 시험은 VEGF 및 TNF-알파가 상이한 기전을 통해 투과성을 유도한다고 시사한다.

(c) 제1 뉴클레오티드 서열은

- 항-TNF-알파 유형의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 특히 펩티드 서열 SEQ ID NO: 22의 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 당백질을 코딩하는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 21과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 21; 및

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 23

을 포함하고;

(f) 제2 뉴클레오티드 서열은

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 5

를 포함한다.

(c) 제1 뉴클레오티드 서열은

- 서열 SEQ ID NO: 22와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 22의 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질인 이러한 단백질; 및

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 23의 신호 펩티드

를 코딩하고;

(f) 제2 뉴클레오티드 서열은

- 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 보다 특히 애플리버셉트인 이러한 단백질; 및

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 4의 신호 펩티드

를 코딩한다.

- 보체의 활성화를 조절하는 단백질, 특히 서열 SEQ ID NO: 26과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 보다 특히 보체 인자 H인 이러한 단백질;

- 보체의 활성화를 조절하는 단백질, 예컨대 보체 인자 I (CFI), 및 보체 인자 H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 특히 보체 인자 H를 코딩하는 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 25와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열; 및

보체 대체 경로의 활성화는 ARMD의 중요한 성분이다. 이러한 활성화는 막 공격 복합체의 형성, 마크로파지의 동원, 및 인플라마솜에 관여되는 사이토카인의 생산에 의한 염증의 유도를 초래한다. 보체 인자 H는 보체의 자가활성화의 조절에 관여한다. 단백질의 기능에 영향을 미치는, CFH를 코딩하는 유전자 내 몇몇 다형성 변이체는 습성 및 건성의 ARMD의 2개 형태의 발생에 대해 강력한 감수성을 부여한다. 반대로, CFH의 안구내 주사를 통한 대체 경로의 억제는 맥락막 신생혈관생성의 동물 모델에서 신생혈관생성을 감소시킨다. 따라서, 보체의 활성화를 조절하는 활성 성분 및 항-VEGF제, 예컨대 애플리버셉트의 투여는 유리하게 ARMD와 연관된 염증 및 신생혈관생성 둘 모두를 감소시키는 것을 가능하게 한다.

(c) 제1 뉴클레오티드 서열은

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 28

을 포함하고;

(f) 제2 뉴클레오티드 서열은

- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 5

를 포함한다.

(c) 제1 뉴클레오티드 서열은

- 보체의 활성화를 조절하는 단백질, 특히 서열 SEQ ID NO: 26과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질, 보다 특히 보체 인자 H인 이러한 단백질; 및

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 27의 신호 펩티드

를 코딩하고;

(f) 제2 뉴클레오티드 서열은

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 4의 신호 펩티드

를 코딩한다.

또한, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 제1 뉴클레오티드 서열이 또한 제1 치료 단백질의 분비를 허용하는 신호 펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 한다.

이러한 종류의 신호 펩티드는 당업자에게 친숙하다. 이러한 신호 펩티드는 예를 들어, 펩티드 서열 SEQ ID NO: 4의 인간 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA) (예를 들어, 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 5에 의해 코딩될 수 있음) 또는 펩티드 서열 SEQ ID NO: 29의 HTLV-1 Env의 신호 펩티드 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 30에 의해 코딩될 수 있음)일 수 있다. 또한 대상 치료 단백질의 천연 펩티드 신호일 수 있고, 예컨대, 예를 들어, 하기와 같을 수 있다:

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 13의 디코린의 천연 펩티드 신호 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 14에 의해 코딩될 수 있음);

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 18의 트랜스페린의 천연 펩티드 신호 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 19 또는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 20에 의해 코딩될 수 있음);

- 항-TNF-알파 유형의 단백질의 신호 펩티드, 특히 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 천연 펩티드 신호 융합 단백질로서, 펩티드 서열 SEQ ID NO: 23을 갖는 이러한 신호 펩티드 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 24에 의해 코딩될 수 있음); 또는

- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 27의 인자 H의 천연 펩티드 신호 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 28에 의해 코딩될 수 있음).

상기 언급된 바와 같이, 이러한 신호 펩티드는 제1 치료 단백질과 인접하고, 즉, 제1 치료 단백질의 N-말단에서 직접 융합되며, 그러므로 신호 펩티드를 코딩하는 서열은 제1 치료 단백질을 코딩하는 서열의 5'에 존재한다.

또한, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 제2 뉴클레오티드 서열이 또한 제2 치료 단백질의 분비를 허용하는 신호 펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 한다.

이러한 신호 펩티드는 예를 들어, 펩티드 서열 SEQ ID NO: 4의 인간 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA) (예를 들어, 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 5에 의해 코딩될 수 있음) 또는 펩티드 서열 SEQ ID NO: 29의 HTLV-1 Env의 신호 펩티드 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 30에 의해 코딩될 수 있음)일 수 있다. 또한 대상 치료 단백질의 천연 펩티드 신호일 수 있고, 예컨대 예를 들어 하기와 같을 수 있다:

이러한 신호 펩티드는 제1 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 신호 펩티드와 동일할 수 있거나, 또는 상이할 수 있고, 바람직하게, 제1 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 신호 펩티드와 상이하다.

상기 언급된 바와 같이, 이러한 신호 펩티드는 제2 치료 단백질과 인접하고, 즉, 제2 치료 단백질의 N-말단에서 직접 융합되며, 그러므로 신호 펩티드를 코딩하는 서열은 제2 치료 단백질을 코딩하는 서열의 5'에 존재한다.

특정 구현예에 따라서, 제1 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 신호 펩티드 및 제2 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 신호 펩티드는 서로 독립적으로, 펩티드 서열 SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27 및 SEQ ID NO: 29로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 구현예에 따라서, 제1 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 신호 펩티드를 코딩하는 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 신호 펩티드를 코딩하는 서열은 서로 독립적으로, 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28 및 SEQ ID NO: 30으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또한, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 또한 (d) 본 발명에 따른 구성체의 제1 치료 단백질의 발현을 허용하는 프로모터를 비롯하여, (g) 본 발명에 따른 구성체의 제2 치료 단백질의 발현을 허용하는 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 한다.

이들 프로모터는 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 특정 구현예에 따라서, 이들 2개 프로모터는 서로 상이하다.

상기 프로모터는 예를 들어, CAG 또는 CMV 유형의 프로모터일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 (e) 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열 및 (h) 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

폴리아데닐화 서열은 특히 당업자에게 친숙한, 서열 AATAAA의 보존된 모티프를 함유한다.

이들 2개 폴리아데닐화 서열은 서로 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 일 구현예에 따라서, 그들은 서로 상이하다.

이들 폴리아데닐화 서열은 예를 들어, RBG (Rabbit Beta Globin), 또는 BGH (Bovine Growth Hormone) 유형의 폴리아데닐화 서열일 수 있다.

마지막으로, 상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 모양체근으로 주사 및 이어서 모양체근의 세포로 전기전달을 통해 환자에게 투여된다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 원형 형태이다.

본 발명의 일 구현예에서, DNA 구성체는 나형 DNA 구성체이다.

본 발명의 일 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 원형 형태의 나형 DNA 구성체이다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제1 및 제2 치료 단백질을 코딩하는 서열이 각각 하기와 같은 원형 형태의 나형 DNA 구성체이다:

- 항-TNF-알파 유형의 단백질을 코딩하는 서열, 특히 펩티드 서열 SEQ ID NO: 22의 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해서 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 21과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제1 및 제2 치료 단백질을 코딩하는 서열이 하기와 같은 원형 형태의 나형 DNA 구성체이다:

- 항섬유화 성질을 갖는 단백질, 예컨대 단백질 BMP7 (골 형성 단백질 7), 항 TGF-베타 유형의 단백질, 항 FGF2 유형의 단백질, 항 CTGF 유형의 단백질 (결합 조직 성장 인자), 및 특히 디코린 코딩 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 6과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 7 또는 서열 SEQ ID NO: 11, 및 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 11; 및

- 항-VEGF 유형의 단백질, 예컨대 S-Flt1, 애플리버셉트, 콘버셉트, 브롤루시주맙을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 특히 애플리버셉트를 코딩하는 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 1과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 2.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제1 및 제2 치료 단백질을 코딩하는 서열이 각각 하기와 같은 원형 형상의 나형 DNA 구성체이다:

본 발명에 따른 일 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 본 발명에 따른 DNA 구성체의 제1 및 제2 치료 단백질을 코딩하는 서열이 각각 하기와 같은 원형 형태의 나형 DNA 구성체이다:

- 항-TNF-알파 유형의 단백질을 코딩하는 서열, 특히 단백질 서열 SEQ ID NO: 22의 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 21과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및

본 발명은 또한 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 안구 병리를 치료하기 위한 환자의 안구체의 근육 세포로 핵산의 비바이러스적 전달을 위해 의도된 DNA 구성체에 관한 것이다:

(c) - 제1 치료 단백질로서, 애플리버셉트인 상기 제1 치료 단백질; 및

- 이러한 제1 치료 단백질의 분비를 허용하는 신호 펩티드로서, 이러한 신호 펩티드는 상기 제1 치료 단백질의 N-말단에서, 제1 치료 단백질의 서열과 인접하는 것인 신호 펩티드

를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열,

(e) 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열;

(f) - 제2 치료 단백질로서, 디코린인 상기 제2 치료 단백질, 및

를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및

(h) 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열.

상기 기술된 DNA 구성체의 적용

상기 정의된 바와 같은 DNA 구성체는 특히 안구 병리의 치료를 위해 의도된다.

본 발명에 따른 안구 병리는 망막 변성이다.

이러한 망막 변성은 특히 습성 또는 건성 나이-관련 황반 변성 (ARMD); 당뇨병성 망막병증 (DR); 망막 정맥 폐색, 특히 중심 망막 정맥 폐색 (CRVO) 또는 분지 망막 정맥 폐색 (BRVO); 근시성 맥락막 신생혈관생성 (CNV); 포도막염, 특히 비감염성 포도막염; 색소성 망막염 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

당뇨병성 망막병증은 특히 당뇨병성 황반 부종 (DME), 유리체내 출혈, 망막 박리, 또는 신생혈관 녹내장으로 인한 시력 저하를 의미하는 것으로 의도된다.

특정 구현예에 따라서, 특히 안구 병리를 치료하기 위해 사용되는 본 발명에 따른 구성체가 제1 및 제2 치료 단백질로서, 상기 정의된 바와 같은 애플리버셉트 및 디코린을 포함할 때, 상기 안구 병리는 나이-관련 황반 변성 (ARMD), 특히 습성 형태; 당뇨병성 망막병증 (DR); 망막 정맥 폐색, 특히 중심 망막 정맥 폐색 (CRVO) 또는 분지 망막 정맥 폐색 (BRVO); 및 근시성 맥락막 신생혈관생성 (CNV)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 망막 변성이고;

보다 특히 나이-관련 황반 변성 (ARMD), 특히 ARMD의 (습성) 신생혈관 형태; 당뇨병성 황반 부종 (DME)으로 인한 시력 저하; 망막 정맥 폐색, 특히 중심 망막 정맥 폐색 (CRVO) 또는 분지 망막 정맥 폐색 (BRVO); 및 근시성 맥락막 신생혈관생성 (CNV)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 망막 변성이다.

당뇨병성 망막병증은 특히 당뇨병성 황반 부종 (DME)으로 인한 시력 저하 및 당뇨병성 망막병증의 증식 형태에서 관찰되는 신생혈관의 형성을 의미하고자 의도된다.

상기 명시된 바와 같이, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 안구 근육, 모양체근으로 주사되고, 여기서 전기전달이 수행된다. 본 발명에서 사용되는 비바이러스적 유전자 요법의 공지된 기술은 안구 근육으로 DNA 구성체의 주사 및 이어서 전기전달하여 모양체근의 세포의 일시적 투과 및 DNA 구성체의 형질감염을 최적화하도록 DNA의 이동을 유도시킨다. DNA의 전기전달의 이러한 기술 (또한 전기천공 또는 전기투과라고도 함)은 환자에게 적용하기 쉽고, 신뢰할만하며 안전하다. 바이러스 벡터와 대조적으로, DNA의 전기전달은 면역 반응을 유도하지 않고 이렇게 도입된 유전자의 장기간 발현을 허용한다. 또한, 렌티바이러스 및 레트로바이러스에 대해 수행된 연구들은 숙주 게놈에서 그들 통합 동안 삽입 돌연변이를 유도하기 쉽다는 것을 보여준다. 본 명세서에 기술된 DNA 구성체는 이러한 유형의 단점을 갖지 않고, 제조 및 조작이 용이하며, 면역 반응을 유도하지 않으므로, 환자, 특히 인간 환자의 유전자 요법에 완벽하게 적합하게 만든다.

본 발명에 따라서, DNA 구성체는 휴자가 단백질을 균질하고 계속적으로 생산할 수 있으므로 모양체근에 주사되고, 이의 위치 덕분에, 전체 안구체에서 이들 단백질의 확산을 촉진한다 (Blocquel et al. "Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis", FASEB J. 2006 Feb; 20(2): 389-91). 평활근 세포는 낮은 재생 속도를 갖고, 수정체의 양쪽 면에 충분히 분포된다. 생산하려는 단백질의 분량은 형질감염된 근육의 표면적에 비례한다 (Touchard "The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potential for sustained intraocular production of therapeutic proteins", J Gene Med. 2010 Nov; 12(11): 904-19). 따라서, 본 발명에 따른 관심 단백질, 특히 상기 기술된 바와 같은 치료 단백질의 생산은 전체 안구체에서 균질하고 일정할 것이고, 이러한 안구체에 제한될 것이다. 예로서, 모양체의 조직 및/또는 외안근 조직 수준에서 DNA를 함유할 수 있는 조성물을 주사하는 방법에 관한, 특허 출원 EP2266656에 기술된 전기전달 방법을 언급할 수 있다.

모양체근은 윤부 근처 및 공막 바로 뒤에서, 모양체의 일부를 형성한다. 그러므로, 후자에 본 발명에 따른 DNA 구성체의 주사는 망막하 주사와 대조적으로 매우 약간 침습적이고, 그러므로 유리하게 본 발명에 따른 DNA 구성체의 주사 부위를 구성한다.

다른 양태에 따라서, 본 발명은 또한 안구 병리를 치료하기 위한 DNA 구성체의 용도에 관한 것이고, 상기 DNA 구성체는 상기 안구 병리를 갖는 환자의 안구체의 근육 세포로 핵산의 비바이러스적 전달이 의도되고;

상기 DNA 구성체는

(c) - 제1 치료 단백질, 및

를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열,

(e) 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열;

(f) - 제1 치료 단백질과 상이한, 제2 치료 단백질, 및

를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열;

(g) 환자의 안구체에서 이러한 제2 치료 단백질의 발현을 허용하는 프로모터, 및

(h) 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열

을 포함하는 것을 특징으로 하고,

상기 DNA 구성체는 모양체근에 주사 및 이어서 모양체근의 세포로 전기전달을 통해서 환자에게 투여된다.

다른 양태에 따라서, 본 발명은 또한 모양체근에 주사 및 이어서 모양체근의 세포로 전기전달을 통해서 환자에게 DNA 구성체의 투여 단계를 포함하는, 안구 병리를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 DNA 구성체는 상기 안구 병리를 갖는 환자의 안구체의 근육 세포로 핵산의 비바이러스적 전달을 위해 의도되고;

상기 DNA 구성체는 하기를 포함하는 것을 특징으로 한다:

(c) - 제1 치료 단백질, 및

를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열;

(e) 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열;

(f) - 제1 치료 단백질과 상이한, 제2 치료 단백질, 및

를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열;

(h) 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열.

본 발명은 단지 예시의 목적으로 제공하는, 하기 실시예를 통해서 보다 상세하게 하기에 기술된다.

실시예 1

본 발명자는 모양체근에서 이러한 DNA 구성체의 전기전달 이후에 래트 눈의 유리체에서 본 발명에 따른 DNA 구성체 (플라스미드)에서 코딩되는 2종 치료 단백질의 발현을 입증하였다.

플라스미드

- 서열 SEQ ID NO: 17의 인간 트랜스페린을 코딩하는 서열 SEQ ID NO: 16 (서열 SEQ ID NO: 20의 이의 신호 펩티드를 코딩하는 서열);

- 뿐만 아니라, 서열 SEQ ID NO: 22의 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해서 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질 (hTNFR-Is/hIgG1)을 코딩하는 서열 SEQ ID NO: 21 (서열 SEQ ID NO: 24의 이의 신호 펩티드를 코딩하는 서열);

- CMV 유형의 프로모터의 제어 하에 있는 것인 이들 2종 서열

을 포함하는 플라스미드 A로 지정된 본 발명에 따른 DNA 구성체는 먼저 통상의 방법으로 제조되었고 도 1에 도시된다. 상기 언급된 관심 단백질 중 하나, 즉, 서열 SEQ ID NO: 17의 인간 트랜스페린을 코딩하는 서열 SEQ ID NO: 16만을 코딩하므로, 단순하다고 하는 비교 구성체는 또한 유사한 방법으로 제조되었는데, 플라스미드 골격은 플라스미드 A 구성체와 유사하고, 관심 단백질을 코딩하는 유일한 서열도 역시 CMV 유형의 프로모터의 제어 하에 있다. 이러한 비교 플라스미드 (플라스미드 a'라고 함)는 도 2에 도시된다.

동물

7주령 롱 에반스 래트는 ARVO (Association for Research in Vision and Ophthalmology) 프로토콜 규정에 따라 사용된다. 래트는 0일 (D0)에 플라스미드 (30　㎍/눈)의 양측 주사 및 전기전달 이전에 케타민 (40　mg/kg) 및 크실라진 (4　mg/kg)의 용량의 근육내 주사를 통해서 마취된다. 6마리 래트가 각 분석 시점 (D3, D7, D14, D21, 및 D30)에 사용된다.

각 분석 시점에, 래트는 치사량의 펜토바비탈 (400　mg/kg)의 투여로 안락사된 다음에, 동물을 적출하고, 안구액 (유리체액 및 방수)을 채취하고 분석까지 -80℃에 저장한다.

래트의 모양체근의 수준에서 전기전달

전기 전달은 경공막 접근법 (Touchard "The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potential for sustained intraocular production of therapeutic proteins", J Gene Med. 2010 Nov; 12(11): 904-19)을 통한 주사 경로로 수정하여, 하기 문헌에 기술된 대로 수행된다: Blocquel et al. "Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis" (FASEB J 2006; 20:389-391). 플라스미드는 10 ㎕의 Tris-EDTA NaCl 용액 중 30 ㎍의 속도로, 적합한 시린지를 사용하여 동물의 모양체근에 주사된다.

전기 임펄스는 250　㎛ 직경의 특수 이리듐/백금 전극을 통해서 투여된다. 이러한 내부 전극은 존재하는 경공막 터널에 도입된다. 외부 전극은 눈의 형상에 부합하게 구부러진 스테인레스강의 얇은 시트이고 내부 전극 반대쪽 윤부 수준에 위치된다. 전기전달은 Touchard 등 (J Gene Med. 2010 Nov; 12(11): 904-19)이 기술한 것과 유사한 전기천공기를 통해서 발생된 8 단극 사각 전기 임펄스 (200 V/cm, 10 ms, 5 Hz)의 속도로 수행된다.

시험 결과

안구액의 샘플은 플라스미드의 주사에 이어서 전기전달 (D0) 이후에 3일 (D+3), 7일 (D+7), 14일 (D+14), 21일 (D+21) 및 30일 (D+30)에 채취된다. 이들 샘플 각각에 대해서, 샘플에 존재하는 서열 SEQ ID NO: 22의 항-TNF-알파 융합 단백질 및/또는 인간 트랜스페린의 양을 측정하기 위해 ELISA 어세이가 수행된다.

따라서 평균 농도는 시간 경과에 따라서 그룹 각각에 대해 계산된다.

수득된 결과는 하기에 표시된다:

- 도 3은, 특히 본 발명에 따르지 않은 구성체와 비교하여 본 발명에 따른 구성체에 의해 D+3 내지 D+30에 채취된 안구액에서 생산된 인간 트랜스페린의 농도 (pg/mL)를 도시하고;

- 도 4는, D+3 내지 D+30에 채취된 안구액에서 생산된 서열 SEQ ID NO: 22의 항-TNF-알파 융합 단백질의 농도 (pg/mL)를 도시한다.

이들 도면의 조사는 항-TNF-알파 융합 단백질 및 인간 트랜스페린의 농도가 본 발명에 따른 구성체를 받은 래트에서 시간 경과에 따라서 일정하다는 것을 보여준다.

따라서, 이들 실험은 관심 단백질들을 코딩하는 하나가 아닌 2개 코딩 서열의 존재 덕분에 매우 크기가 큰 본 발명에 따른 구성체의 적용이 효과적으로 표적 세포를 투과하고 관심 부위 수준에서 상기 구성체에 의해 코딩되는 2종 단백질의 발현을 허용한다는 사실을 입증한다.

게다가, 그들은 또한 이들 단백질 중 오직 하나만을 코딩하는 구성체와 비교하여 코딩하는 단백질을 시간 경과에 따라 보다 안정하게 생산하는 본 발명에 따른 구성체의 능력을, 매우 예상치 않게, 설명한다 (도 3).

실시예 2

본 발명자는 실시예 1에서 사용된 것과 상이한 본 발명에 따른 플라스미드를 사용하여 제2 실험 프로토콜로 실시예 1에서의 관찰을 확증하였다 .

플라스미드

- 서열 SEQ ID NO: 8의 디코린을 코딩하는 서열 SEQ ID NO: 7;

- 뿐만아니라, 서열 SEQ ID NO: 3의 애플리버셉트를 코딩하는 서열 SEQ ID NO: 2;

- 각각 CMV 유형 및 CAG 유형의 프로모터의 제어 하에 있는 것인 이들 2개 서열을 포함하는, 플라스미드 B로 지정된, 본 발명에 따른 DNA 구성체는 먼저 통상의 방법으로 제조되었고, 도 5에 도시된다. 상기 언급된 관심 단백질 중 오직 하나, 즉 서열 SEQ ID NO: 3의 애플리버셉트를 코딩하는 서열 SEQ ID NO: 2만을 코딩하므로, 단순하다고 하는, 비교 구성체는 또한 유사한 방식으로 제조되었고, 플라스미드 골격은 구성체 플라스미드 B와 유사하고, 관심 단백질을 코딩하는 단일 서열은 또한 CAG 유형의 프로모터의 제어 하에 있다. 따라서 이러한 관심 단백질의 발현 카세트는 2개 구성체에서 동일하다. 이러한 비교 플라스미드 (플라스미드 b'라고 함)는 도 6에 도시된다.

이러한 프로토콜에서 사용되는 동물은 실시예 1에 기술된 바와 같다. 6마리 래트가 분석 시간 각각 (D3, D7, D14 및 D21)에 사용된다.

각 분석 시점에, 래트는 치사량의 펜토바비탈 (400　mg/kg)의 투여로 안락사시킨 다음에 동물을 적출하고 안구액 (유리체액 및 방수)을 채취하여 분석까지 -80℃에 저장한다.

전기전달은 실시예 1에 기술된 대로 수행된다.

시험 결과

안구액의 샘플은 플라스미드의 주사에 이어서 전기전달 (D0) 후 3일 (D+3), 7일 (D+7), 14일 (D+14) 및 21일 (D+21)에 채취된다. 이들 샘플 각각에 대해, 샘플에 존재하는 디코린 및/또는 애플리버셉트의 양을 측정하기 위해서 ELISA 어세이가 수행된다.

따라서 시간 경과에 따라서 그룹 각각에 대해 평균 농도가 계산된다.

수득된 결과는 하기에 표시된다:

- 도 7은, 특히 본 발명에 따르지 않은 구성체와 비교하여 본 발명에 따른 구성체에 의해서 D+3 내지 D+21에 채취된 안구액에서 생산되는 애플리버셉트의 농도 (pg/mL)를 도시하고;

- 도 8은, D+3 내지 D+21에 채취된 안구액에서 생산된 디코린의 농도 (pg/mL)를 도시한다.

이들 도면의 조사는 본 발명에 따른 플라스미드는 2종의 관심 치료 단백질의 발현을 허용한다는 것을 보여준다.

따라서, 이들 실험은 관심 단백질을 코딩하는 하나가 아닌 2개 코딩 서열의 존재 덕분에 크기가 매우 큰 본 발명에 따른 구성체의 적용은 표적 세포를 효과적으로 투과하고, 관심 부위의 수준에서 상기 구성체에 의해 코딩되는 2종 단백질의 발현을 허용한다는 사실을 입증한다.

게다가, 상기 실시예 1에 표시된 바와 같이, 그들은 또한 이들 단백질 중 하나만을 코딩하는 구성체와 비교하여 코딩되는 단백질을, 시간 경과에 따라 보다 안정하게 생산하는 본 발명에 따른 구성체의 능력을 매우 예상치 않게 설명한다 (도 7).

실시예 3

본 발명자는 또한, 실시예 1 및 2에서 사용된 것과 상이한 본 발명에 따른 플라스미드를 사용하는 실험 프로토콜로 상기 관찰을 확증하였다.

플라스미드

- CMV 유형의 프로모터의 제어 하에 있는 서열 SEQ ID NO: 8의 디코린을 코딩하는 서열 SEQ ID NO: 11;

- 뿐만 아니라, CAG 유형의 프로모터의 제어 하에 있는 서열 SEQ ID NO: 3의 애플리버셉트를 코딩하는 서열 SEQ ID NO: 2

를 포함하는, 플라스미드 C로 지정된 본 발명에 따른 DNA 구성체는 먼저 통상의 방법으로 제조되었고 도 9에 도시된다.

동물

7주령 내지 8주령 브라운 노르웨이 래트가 ARVO (Association for Research in Vision and Ophthalmology) 프로토콜 규정에 따라 사용된다. 래트는 0일 (D0)에 플라스미드 (30　㎍/눈) 또는 비히클 (10　㎕)의 양측 주사 및 전기전달 전에 케타민 (40　mg/kg) 및 크실라진 (4　mg/kg)의 용량의 근육내 주사에 의해 마취된다. 6마리 래트가 처치 각각에 사용된다. 전기전달은 실시예 1에 기술된 대로 수행된다.

D3에, 맥락막 신생혈관생성이 망막의 몇몇 위치에서 레이저 광응고 (눈 당 4 내지 5 레이저 충격)에 의하여 모든 동물에서 유도된다.

시험 결과

병변 후 14일 (D17)에, 신생혈관의 혈관 누출은 형광 혈관조영술 및 하기 표에 따른 혈관 누출의 중증도 함수에 따른 점수 귀속을 통해서 평가된다.

관찰 등급

과형광 없음 0

강도 또는 크기 증가없는 약간의 과형광 1

크기 증가없이 후기에 강도가 증가되는 과형광 (중간 누출) 2

초기 누출과 후기 크기 및 강도 증가의 과형광 (심각한 누출) 3

수득된 결과는 도 10에 도시되어 있고, 특히 처치 함수에 따른 심각한 누출 (등급 3)에 대한 백분율 영향을 나타낸다.

이 도면을 검토 시, 본 발명에 따른 플라스미드는 비히클을 받은 동물과 비교하여 심각한 신생혈관 누출을 보이는 다수 영향에서 38% 감소를 제공한다는 것을 보여준다.

서열목록

SEQ ID NO: 1: 애플리버셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 2: 애플리버셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 3: 애플리버셉트의 펩티드 서열

SEQ ID NO: 4: TPA 신호 펩티드의 펩티드 서열

SEQ ID NO: 5: TPA 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 6: 디코린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 7: 디코린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 8: 디코린의 펩티드 서열

SEQ ID NO: 9: 디코린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 10: 디코린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 11: 디코린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 12: 디코린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 13: 디코린의 천연 신호 펩티드의 펩티드 서열

SEQ ID NO: 14: 디코린의 천연 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 15: 트랜스페린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 16: 트랜스페린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 17: 인간 트랜스페린의 펩티드 서열

SEQ ID NO: 18: 인간 트랜스페린의 천연 신호 펩티드의 펩티드 서열

SEQ ID NO: 19: 트랜스페린의 천연 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 20: 트랜스페린의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 21: 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해서 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (Peppel et al., J Exp Med, 174: 1483-1489 - Murphy et al., Arch Ophthalmol, 22: 845-851)

SEQ ID NO: 22: 인간 면역글로불린 IgG1의 불변 단편에 힌지를 통해서 커플링된 TNF 알파에 대한 인간 수용체 p55의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질의 펩티드 서열 (Peppel et al., J Exp Med, 174: 1483-1489 - Murphy et al., Arch Ophthalmol, 22: 845-851)

SEQ ID NO: 23: 서열 SEQ ID NO: 22의 단백질의 천연 신호 펩티드의 펩티드 서열

SEQ ID NO: 24: 서열 SEQ ID NO: 23의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 25: 보체 인자 H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 26: 보체 인자 H의 펩티드 서열

SEQ ID NO: 27: 인자 H의 천연 신호 펩티드의 펩티드 서열

SEQ ID NO: 28: 인자 H의 천연 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 29: HTLV-1 Env의 신호 펩티드의 펩티드 서열

SEQ ID NO: 30: HTLV-1 Env의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 31: 이. 콜라이 R6K 플라스미드의 복제 기원 감마의 서열

<110> EYEVENSYS <120> DNA STRUCTURE FOR TREATING OCULAR PATHOLOGIES <130> PR86983 <160> 31 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 1296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding Aflibercept <400> 1 agtgatacag gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60 actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120 ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180 agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240 gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300 atcatagatg tcgttctgag tccgtctcat ggaattgaac tatctgttgg agaaaagctt 360 gtcttaaatt gtacagcaag aactgaacta aatgtgggga ttgacttcaa ctgggaatac 420 ccttcttcga agcatcagca taagaaactt gtaaaccgag acctaaaaac ccagtctggg 480 agtgagatga agaaattttt gagcacctta actatagatg gtgtaacccg gagtgaccaa 540 ggattgtaca cctgtgcagc atccagtggg ctgatgacca agaagaacag cacatttgtc 600 agggtccatg aaaaagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 660 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 720 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 780 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 840 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 900 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 960 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1020 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1080 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1140 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1200 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1260 tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaa 1296 <210> 2 <211> 1300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding Aflibercept <400> 2 cagcgacacc ggcagaccct tcgtggaaat gtacagcgag atccccgaga tcatccacat 60 gaccgagggc cgcgagctgg tgatcccttg cagagtgacc agccccaaca tcaccgtgac 120 actgaagaag ttccctctgg acacactgat ccccgacggc aagaggatca tctgggacag 180 cagaaagggc ttcatcatca gcaacgccac atacaaagag atcggactgc tgacatgcga 240 ggccaccgtg aacggccatc tgtacaagac caactatctg acccaccgcc agaccaacac 300 catcatcgac gtggtgctga gccccagcca cggcatcgag ctgagcgtgg gcgagaagct 360 ggtgctgaac tgcaccgcca gaaccgagct gaatgtgggc atcgacttca actgggagta 420 ccccagctcc aagcaccagc acaagaaact ggtgaaccgg gatctgaaaa cccagagcgg 480 cagcgagatg aagaagtttc tgagcacact gaccatcgac ggcgtgacca gaagcgacca 540 aggactgtac acatgcgccg ccagcagcgg actgatgacc aagaagaaca gcacattcgt 600 ccgggtgcac gagaaggaca agacccacac atgcccacca tgcccagccc cagagctgct 660 gggaggcccc tccgtgtttc tgttccctcc aaagcccaag gacactctga tgatcagcag 720 aacccccgaa gtgacatgcg tggtggtgga cgtgtcccac gaggacccag aagtgaagtt 780 caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca 840 gtacaacagc acatacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccaag actggctgaa 900 cggcaaagag tacaagtgca aagtctccaa caaggctctg ccagccccca tcgaaaagac 960 catcagcaag gccaagggcc agcctcgcga gccccaagtg tacacactgc ctccaagccg 1020 ggacgagctg accaagaatc aagtgtctct gacatgtctg gtgaaaggct tctaccccag 1080 cgatatcgcc gtggaatggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc 1140 tcccgtgctg gacagcgacg gcagcttctt tctgtactcc aaactgaccg tggacaagag 1200 cagatggcag caaggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggctc tgcacaacca 1260 ctacacccag aagtctctgt ctctgagccc cggcaagtga 1300 <210> 3 <211> 432 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence of Aflibercept <400> 3 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 100 105 110 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr 165 170 175 Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met 180 185 190 Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr 195 200 205 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 210 215 220 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 225 230 235 240 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 245 250 255 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 260 265 270 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 275 280 285 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 290 295 300 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 305 310 315 320 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 325 330 335 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 340 345 350 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 355 360 365 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 370 375 380 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 385 390 395 400 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 405 410 415 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420 425 430 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence of the TPA signal peptide <400> 4 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser 20 <210> 5 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding the TPA signal peptide <400> 5 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccag 68 <210> 6 <211> 1032 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caatcctctg aagtcctccg gaatcgagaa cggcgccttc 540 caaggcatga agaagctgag ctacatccgg atcgccgaca ccaacatcac cagcattcct 600 caagggctgc ctccatctct gaccgagctg catctggacg gcaacaagat ttccagagtg 660 gacgccgcct ctctgaaggg actgaacaat ctggccaaac tgggactgag cttcaacagc 720 atcagcgccg tggacaacgg ctctctggcc aacacaccac atctgcggga actccatctg 780 gataacaaca agctgaccag agttcccggc ggactggccg agcacaagta catccaagtg 840 gtgtatctcc acaacaacaa tatcagcgtc gtgggcagca gcgatttctg ccctccggga 900 cacaatacca agaaggccag ctacagcgga gtgtctctgt tcagcaatcc cgtgcagtac 960 tgggagatcc agcctagcac attcagatgc gtgtacgtgc ggagcgccat ccagctgggc 1020 aactacaagt gatga 1035 <210> 8 <211> 343 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence of Decorin <400> 8 Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu 1 5 10 15 Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro 20 25 30 Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val 35 40 45 Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro 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aactacaaat aa 1032 <210> 11 <211> 1032 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding Decorin <400> 11 ggaccgtttc aacagagagg cttatttgac tttatgctag aagacgaggc cagcggcatc 60 ggccccgagg tgcccgacga ccgcgacttc gagcccagcc tgggccccgt gtgccccttc 120 cgctgccagt gccacctgcg cgtggtgcag tgcagcgacc tgggcctgga caaggtgccc 180 aaggacctgc cccccgacac caccctgctg gacctgcaga acaacaagat caccgagatc 240 aaggacggcg acttcaagaa cctgaagaac ctgcacgccc tgatcctggt gaacaacaag 300 atcagcaagg tgagccccgg cgccttcacc cccctggtga agctggagcg cctgtacctg 360 agcaagaacc agctgaagga gctgcccgag aagatgccca agaccctgca ggagctgcgc 420 gcccacgaga acgagatcac caaggtgcgc aaggtgacct tcaacggcct gaaccagatg 480 atcgtgatcg agctgggcac caaccccctg aagagcagcg gcatcgagaa cggcgccttc 540 cagggcatga agaagctgag ctacatccgc atcgccgaca ccaacatcac cagcatcccc 600 cagggcctgc cccccagcct gaccgagctg cacctggacg gcaacaagat cagccgcgtg 660 gacgccgcca gcctgaaggg cctgaacaac ctggccaagc tgggcctgag cttcaacagc 720 atcagcgccg tggacaacgg cagcctggcc aacacccccc acctgcgcga gctgcacctg 780 gacaacaaca agctgacccg cgtgcccggc ggcctggccg agcacaagta catccaggtg 840 gtgtacctgc acaacaacaa catcagcgtg gtgggcagca gcgacttctg cccccccggc 900 cacaacacca agaaggccag ctacagcggc gtgagcctgt tcagcaaccc cgtgcagtac 960 tgggagatcc agcccagcac cttccgctgc gtgtacgtgc gcagcgccat ccagctgggc 1020 aactacaagt aa 1032 <210> 12 <211> 1032 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding Decorin <400> 12 ggaccgtttc aacagagagg cttatttgac tttatgctag aagatgaggc gagtggcatt 60 ggacctgaag tacccgatga tagagacttt gaaccatcat tgggcccagt ttgccctttt 120 aggtgtcagt gccacctccg ggtagttcaa tgcagcgatt tgggactcga taaagtaccg 180 aaagacttgc caccggacac aacattgctc gatcttcaaa acaacaagat cactgaaata 240 aaggatggag actttaaaaa tctgaagaat ttgcacgccc tcatcctggt caacaacaag 300 atcagcaagg tgtcccctgg agcattcacg cccctcgtaa agttggaacg cctctacctg 360 tctaagaacc agttgaaaga actgcccgag aagatgccta aaactctgca agagcttaga 420 gctcatgaaa atgaaattac caaggttcgg aaggtaacct ttaacggtct taaccagatg 480 atagtcattg agttgggcac gaacccattg aaatcttctg gcatagaaaa cggggctttc 540 caggggatga aaaaactctc atatatccgc atcgcggata ccaacatcac atctatacct 600 caaggtttgc ccccgagttt gaccgagctt cacctggatg gcaacaagat aagccgggtc 660 gacgctgcct cactcaaagg gctcaataat ctggcgaaac tggggttgag tttcaattca 720 atatctgctg tcgacaacgg ctcacttgcg aacacacccc atcttaggga acttcatctg 780 gacaacaaca agttgacacg ggttcctggg ggactcgctg aacataaata tatacaggtc 840 gtttatctcc ataataataa tatcagcgtt gtaggctcat ctgacttctg ccctccaggc 900 cataatacaa agaaagcgtc atacagtggc gtcagtttgt tctctaaccc ggttcagtat 960 tgggagattc aaccgtccac ttttcggtgc gtttacgtga ggagtgcgat tcagctgggt 1020 aactataagt aa 1032 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence of the native signal peptide of Decorin <400> 13 Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala 1 5 10 15 <210> 14 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the native signal peptide of Decorin <400> 14 atgaaggcca ctatcatcct ccttctgctt gcacaagttt cctgggct 48 <210> 15 <211> 2040 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding transferrin <400> 15 gtccctgata aaactgtgag atggtgtgca gtgtcggagc atgaggccac taagtgccag 60 agtttccgcg accatatgaa aagcgtcatt ccatccgatg gtcccagtgt tgcttgtgtg 120 aagaaagcct cctaccttga ttgcatcagg gccattgcgg caaacgaagc ggatgctgtg 180 acactggatg caggtttggt gtatgatgct tacctggctc ccaataacct gaagcctgtg 240 gtggcagagt tctatgggtc aaaagaggat ccacagactt tctattatgc tgttgctgtg 300 gtgaagaagg atagtggctt ccagatgaac cagcttcgag gcaagaagtc ctgccacacg 360 ggtctaggca ggtccgctgg gtggaacatc cccataggct tactttactg tgacttacct 420 gagccacgta aacctcttga gaaagcagtg gccaatttct tctcgggcag ctgtgcccct 480 tgtgcggatg ggacggactt cccccagctg tgtcaactgt gtccagggtg tggctgctcc 540 acccttaacc aatacttcgg ctactcggga gccttcaagt gtctgaagga tggtgctggg 600 gatgtggcct ttgtcaagca ctcgactata tttgagaact tggcaaacaa ggctgacagg 660 gaccagtatg agctgctttg cctggacaac acccggaagc cggtagatga atacaaggac 720 tgccacttgg cccaggtccc ttctcatacc gtcgtggccc gaagtatggg cggcaaggag 780 gacttgatct gggagcttct caaccaggcc caggaacatt ttggcaaaga caaatcaaaa 840 gaattccaac tattcagctc tcctcatggg aaggacctgc tgtttaagga ctctgcccac 900 gggtttttaa aagtcccccc caggatggat gccaagatgt acctgggcta tgagtatgtc 960 actgccatcc ggaatctacg ggaaggcaca tgcccagaag ccccaacaga tgaatgcaag 1020 cctgtgaagt ggtgtgcgct gagccaccac gagaggctca agtgtgatga gtggagtgtt 1080 aacagtgtag ggaaaataga gtgtgtatca gcagagacca ccgaagactg catcgccaag 1140 atcatgaatg gagaagctga tgccatgagc ttggatggag ggtttgtcta catagcgggc 1200 aagtgtggtc tggtgcctgt cttggcagaa aactacaata agagcgataa ttgtgaggat 1260 acaccagagg cagggtattt tgctatagca gtggtgaaga aatcagcttc tgacctcacc 1320 tgggacaatc tgaaaggcaa gaagtcctgc catacggcag ttggcagaac cgctggctgg 1380 aacatcccca tgggcctgct ctacaataag atcaaccact gcagatttga tgaatttttc 1440 agtgaaggtt gtgcccctgg gtctaagaaa gactccagtc tctgtaagct gtgtatgggc 1500 tcaggcctaa acctgtgtga acccaacaac aaagagggat actacggcta cacaggcgct 1560 ttcaggtgtc tggttgagaa gggagatgtg gcctttgtga aacaccagac tgtcccacag 1620 aacactgggg gaaaaaaccc tgatccatgg gctaagaatc tgaatgaaaa agactatgag 1680 ttgctgtgcc ttgatggtac caggaaacct gtggaggagt atgcgaactg ccacctggcc 1740 agagccccga atcacgctgt ggtcacacgg aaagataagg aagcttgcgt ccacaagata 1800 ttacgtcaac agcagcacct atttggaagc aacgtaactg actgctcggg caacttttgt 1860 ttgttccggt cggaaaccaa ggaccttctg ttcagagatg acacagtatg tttggccaaa 1920 cttcatgaca gaaacacata tgaaaaatac ttaggagaag aatatgtcaa ggctgttggt 1980 aacctgagaa aatgctccac ctcatcactc ctggaagcct gcactttccg tagaccttaa 2040 2040 <210> 16 <211> 2043 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding transferrin <400> 16 gtgccagata agacagttcg ttggtgcgcc gtgtctgagc acgaggccac aaagtgccag 60 agcttccggg accacatgaa gtctgtgatc cctagcgacg gcccttccgt ggcttgtgtg 120 aagaaggcca gctatctgga ctgcatcaga gccattgccg ccaacgaagc cgatgccgtt 180 acactggatg ccggactggt gtacgatgcc tatctggccc caaacaatct gaagcccgtg 240 gtcgccgagt tctacggctc taaagaggac cctcagacat tctactacgc cgtggccgtg 300 gtcaagaagg acagcggctt tcagatgaac cagctgcggg gcaagaagtc ttgtcacacc 360 ggacttggaa gaagcgccgg ctggaatatc cccatcggac tgctgtactg cgatctgccc 420 gagcctagaa agcctctgga aaaggccgtg gccaacttct tctctggctc ttgtgcccct 480 tgcgccgatg gcacagattt tccacagctc tgtcagctgt gtcccggctg tggctgtagc 540 acactgaacc agtactttgg ctacagcggc gccttcaagt gtctgaaaga tggtgctggc 600 gacgtggcct tcgtgaagca cagcacaatc ttcgagaatc tggccaacaa ggccgaccgg 660 gatcagtacg aactgctgtg cctcgacaac accagaaagc cagtggacga gtacaaggac 720 tgccatctgg ctcaagtgcc tagccacaca gtggttgcca gatccatggg cggcaaagag 780 gatctgatct gggagctgct gaatcaagcc caagagcact tcggcaagga caagagcaaa 840 gagttccagc tgttcagcag ccctcacggc aaggatctgc tgttcaagga tagcgcccac 900 ggatttctga aagtgcctcc tcggatggac gccaagatgt atctgggcta cgagtacgtg 960 accgccatcc ggaatctgag agaaggcaca tgcccagagg ctcccaccga tgagtgtaaa 1020 ccagtgaagt ggtgcgctct gtctcaccac gagagactga agtgtgacga gtggtccgtg 1080 aacagcgtgg gcaagattga gtgtgtgtcc gccgagacaa ccgaggactg tatcgccaag 1140 atcatgaacg gcgaggccga cgctatgtct ctggatggcg gatttgtgta cattgccgga 1200 aagtgtggac tggtgccagt gctggccgag aactacaaca agagcgacaa ctgcgaggat 1260 accccagagg ccggatattt tgccgtggca gtcgtgaaga agtccgccag cgatctgaca 1320 tgggacaatc tcaagggcaa gaaaagctgc cacaccgccg tgggaagaac agccggatgg 1380 aacattccta tggggctgct gtacaacaaa atcaaccact gccgcttcga cgagttcttc 1440 agcgaaggat gtgctcccgg cagcaagaaa gacagctctc tgtgcaagct gtgcatgggc 1500 agcggactga atctgtgcga gcccaacaac aaagagggct actacggcta caccggggcc 1560 tttagatgtc tggttgagaa gggcgacgtt gcatttgtga aacaccagac cgtgcctcag 1620 aacaccggcg gcaagaatcc cgatccttgg gccaagaatc tgaacgagaa ggactatgag 1680 ctgctctgtc tggacggcac ccggaaacca gtggaagaat acgccaactg tcatctggca 1740 agagccccaa atcacgccgt cgtgaccaga aaggacaaag aggcttgcgt ccacaagatt 1800 ctgcggcagc agcagcatct gttcggcagc aatgtgaccg actgcagcgg caacttctgt 1860 ctgttcagaa gcgagacaaa ggatctcctc ttccgcgacg ataccgtgtg tctcgccaag 1920 ctgcacgacc ggaacacata cgagaagtat ctgggagaag agtatgtgaa ggctgtgggc 1980 aatctgcgga agtgcagcac atcttctctg ctcgaggctt gcacatttcg gcggccttga 2040 tga 2043 <210> 17 <211> 679 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence of human transferrin <400> 17 Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala 1 5 10 15 Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser 20 25 30 Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys 35 40 45 Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala 50 55 60 Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val 65 70 75 80 Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr 85 90 95 Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu 100 105 110 Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp 115 120 125 Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys 130 135 140 Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro 145 150 155 160 Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly 165 170 175 Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe 180 185 190 Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser 195 200 205 Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu 210 215 220 Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp 225 230 235 240 Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met 245 250 255 Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu 260 265 270 His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro 275 280 285 His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys 290 295 300 Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val 305 310 315 320 Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr 325 330 335 Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg 340 345 350 Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys 355 360 365 Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly 370 375 380 Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly 385 390 395 400 Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Asp 405 410 415 Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val 420 425 430 Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys 435 440 445 Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met 450 455 460 Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe 465 470 475 480 Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys 485 490 495 Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu 500 505 510 Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly 515 520 525 Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly 530 535 540 Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu 545 550 555 560 Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn 565 570 575 Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp 580 585 590 Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe 595 600 605 Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser 610 615 620 Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys 625 630 635 640 Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val 645 650 655 Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu 660 665 670 Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro 675 <210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence of the native signal peptide of human transferrin <400> 18 Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ala <210> 19 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the native signal peptide of transferrin <400> 19 atgaggctcg ccgtgggagc cctgctggtc tgcgccgtcc tggggctgtg tctggct 57 <210> 20 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the signal peptide of transferrin <400> 20 atgagactgg ctgtgggagc actgcttgtg tgtgctgttc tgggactgtg tctggcc 57 <210> 21 <211> 1249 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding an anti-TNF-alpha fusion protein <400> 21 actggtccct cacctagggg acagggagaa gagagatagt gtgtgtcccc aaggaaaata 60 tatccaccct caaaataatt cgatttgctg taccaagtgc cacaaaggaa cctacttgta 120 caatgactgt ccaggcccgg ggcaggatac ggactgcagg gagtgtgaga gcggctcctt 180 caccgcttca gaaaaccacc tcagacactg cctcagctgc tccaaatgcc gaaaggaaat 240 gggtcaggtg gagatctctt cttgcacagt ggaccgggac accgtgtgtg gctgcaggaa 300 gaaccagtac cggcattatt ggagtgaaaa ccttttccag tgcttcaatt gcagcctctg 360 cctcaatggg accgtgcacc tctcctgcca ggagaaacag aacaccgtgt gcacctgcca 420 tgcaggtttc tttctaagag aaaacgagtg tgtctcctgt agtaactgta agaaaagcct 480 ggagtgcacg aagttgtgcc taccccagat tgagaatgtt aagggcactg aggactcagg 540 caccacactg gttccgcgtg gatccgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc 600 tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat 660 gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga 720 ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg 780 ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga 840 ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat 900 cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc 960 cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt 1020 ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa 1080 gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt 1140 ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc acgaggctct 1200 gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1249 <210> 22 <211> 415 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence of an anti-TNF-alpha fusion protein <400> 22 Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro 1 5 10 15 Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys 20 25 30 Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln 35 40 45 Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu 50 55 60 Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met 65 70 75 80 Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys 85 90 95 Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe 100 105 110 Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser 115 120 125 Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe 130 135 140 Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu 145 150 155 160 Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr 165 170 175 Glu Asp Ser Gly Thr Thr Leu Val Pro Arg Gly Ser Asp Lys Thr His 180 185 190 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 195 200 205 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 210 215 220 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 225 230 235 240 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 245 250 255 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 260 265 270 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 275 280 285 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 290 295 300 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 305 310 315 320 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 325 330 335 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 340 345 350 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 355 360 365 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 370 375 380 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 385 390 395 400 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 405 410 415 <210> 23 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence of a signal peptide <400> 23 Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly 20 25 <210> 24 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the signal peptide of sequence SEQ ID NO: 23 <400> 24 atgggcctct ccaccgtgcc tgacctgctg ctgccgctgg tgctcctgga gctgttggtg 60 ggaatatacc cctcaggggt tattgg 86 <210> 25 <211> 3642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding complement factor H <400> 25 gaagattgca atgaacttcc tccaagaaga aatacagaaa ttctgacagg ttcctggtct 60 gaccaaacat atccagaagg cacccaggct atctataaat gccgccctgg atatagatct 120 cttggaaata taataatggt atgcaggaag ggagaatggg ttgctcttaa tccattaagg 180 aaatgtcaga aaaggccctg tggacatcct ggagatactc cttttggtac ttttaccctt 240 acaggaggaa atgtgtttga atatggtgta aaagctgtgt atacatgtaa tgaggggtat 300 caattgctag gtgagattaa ttaccgtgaa tgtgacacag atggatggac caatgatatt 360 cctatatgtg aagttgtgaa gtgtttacca gtgacagcac cagagaatgg aaaaattgtc 420 agtagtgcaa tggaaccaga tcgggaatac cattttggac aagcagtacg gtttgtatgt 480 aactcaggct acaagattga aggagatgaa gaaatgcatt gttcagacga tggtttttgg 540 agtaaagaga aaccaaagtg tgtggaaatt tcatgcaaat ccccagatgt tataaatgga 600 tctcctatat ctcagaagat tatttataag gagaatgaac gatttcaata taaatgtaac 660 atgggttatg aatacagtga aagaggagat gctgtatgca ctgaatctgg atggcgtccg 720 ttgccttcat gtgaagaaaa atcatgtgat aatccttata ttccaaatgg tgactactca 780 cctttaagga ttaaacacag aactggagat gaaatcacgt accagtgtag aaatggtttt 840 tatcctgcaa cccggggaaa tacagcaaaa tgcacaagta ctggctggat acctgctccg 900 agatgtacct tgaaaccttg tgattatcca gacattaaac atggaggtct atatcatgag 960 aatatgcgta gaccatactt tccagtagct gtaggaaaat attactccta ttactgtgat 1020 gaacattttg agactccgtc aggaagttac tgggatcaca ttcattgcac acaagatgga 1080 tggtcgccag cagtaccatg cctcagaaaa tgttattttc cttatttgga aaatggatat 1140 aatcaaaatt atggaagaaa gtttgtacag ggtaaatcta tagacgttgc ctgccatcct 1200 ggctacgctc ttccaaaagc gcagaccaca gttacatgta tggagaatgg ctggtctcct 1260 actcccagat gcatccgtgt caaaacatgt tccaaatcaa gtatagatat tgagaatggg 1320 tttatttctg aatctcagta tacatatgcc ttaaaagaaa aagcgaaata tcaatgcaaa 1380 ctaggatatg taacagcaga tggtgaaaca tcaggatcaa ttacatgtgg gaaagatgga 1440 tggtcagctc aacccacgtg cattaaatct tgtgatatcc cagtatttat gaatgccaga 1500 actaaaaatg acttcacatg gtttaagctg aatgacacat tggactatga atgccatgat 1560 ggttatgaaa gcaatactgg aagcaccact ggttccatag tgtgtggtta caatggttgg 1620 tctgatttac ccatatgtta tgaaagagaa tgcgaacttc ctaaaataga tgtacactta 1680 gttcctgatc gcaagaaaga ccagtataaa gttggagagg tgttgaaatt ctcctgcaaa 1740 ccaggattta caatagttgg acctaattcc gttcagtgct accactttgg attgtctcct 1800 gacctcccaa tatgtaaaga gcaagtacaa tcatgtggtc cacctcctga actcctcaat 1860 gggaatgtta aggaaaaaac gaaagaagaa tatggacaca gtgaagtggt ggaatattat 1920 tgcaatccta gatttctaat gaagggacct aataaaattc aatgtgttga tggagagtgg 1980 acaactttac cagtgtgtat tgtggaggag agtacctgtg gagatatacc tgaacttgaa 2040 catggctggg cccagctttc ttcccctcct tattactatg gagattcagt ggaattcaat 2100 tgctcagaat catttacaat gattggacac agatcaatta cgtgtattca tggagtatgg 2160 acccaacttc cccagtgtgt ggcaatagat aaacttaaga agtgcaaatc atcaaattta 2220 attatacttg aggaacattt aaaaaacaag aaggaattcg atcataattc taacataagg 2280 tacagatgta gaggaaaaga aggatggata cacacagtct gcataaatgg aagatgggat 2340 ccagaagtga actgctcaat ggcacaaata caattatgcc cacctccacc tcagattccc 2400 aattctcaca atatgacaac cacactgaat tatcgggatg gagaaaaagt atctgttctt 2460 tgccaagaaa attatctaat tcaggaagga gaagaaatta catgcaaaga tggaagatgg 2520 cagtcaatac cactctgtgt tgaaaaaatt ccatgttcac aaccacctca gatagaacac 2580 ggaaccatta attcatccag gtcttcacaa gaaagttatg cacatgggac taaattgagt 2640 tatacttgtg agggtggttt caggatatct gaagaaaatg aaacaacatg ctacatggga 2700 aaatggagtt ctccacctca gtgtgaaggc cttccttgta aatctccacc tgagatttct 2760 catggtgttg tagctcacat gtcagacagt tatcagtatg gagaagaagt tacgtacaaa 2820 tgttttgaag gttttggaat tgatgggcct gcaattgcaa aatgcttagg agaaaaatgg 2880 tctcaccctc catcatgcat aaaaacagat tgtctcagtt tacctagctt tgaaaatgcc 2940 atacccatgg gagagaagaa ggatgtgtat aaggcgggtg agcaagtgac ttacacttgt 3000 gcaacatatt acaaaatgga tggagccagt aatgtaacat gcattaatag cagatggaca 3060 ggaaggccaa catgcagaga cacctcctgt gtgaatccgc ccacagtaca aaatgcttat 3120 atagtgtcga gacagatgag taaatatcca tctggtgaga gagtacgtta tcaatgtagg 3180 agcccttatg aaatgtttgg ggatgaagaa gtgatgtgtt taaatggaaa ctggacggaa 3240 ccacctcaat gcaaagattc tacaggaaaa tgtgggcccc ctccacctat tgacaatggg 3300 gacattactt cattcccgtt gtcagtatat gctccagctt catcagttga gtaccaatgc 3360 cagaacttgt atcaacttga gggtaacaag cgaataacat gtagaaatgg acaatggtca 3420 gaaccaccaa aatgcttaca tccgtgtgta atatcccgag aaattatgga aaattataac 3480 atagcattaa ggtggacagc caaacagaag ctttattcga gaacaggtga atcagttgaa 3540 tttgtgtgta aacggggata tcgtctttca tcacgttctc acacattgcg aacaacatgt 3600 tgggatggga aactggagta tccaacttgt gcaaaaagat ag 3642 <210> 26 <211> 1213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence of complement factor H <400> 26 Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala Ile Tyr 20 25 30 Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Ile Ile Met Val Cys 35 40 45 Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys Gln Lys 50 55 60 Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe Thr Leu 65 70 75 80 Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr Thr Cys 85 90 95 Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu Cys Asp 100 105 110 Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val Lys Cys 115 120 125 Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser Ala Met 130 135 140 Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe Val Cys 145 150 155 160 Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys Ser Asp 165 170 175 Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile Ser Cys 180 185 190 Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys Ile Ile 195 200 205 Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly Tyr Glu 210 215 220 Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp Arg Pro 225 230 235 240 Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile Pro Asn 245 250 255 Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp Glu Ile 260 265 270 Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly Asn Thr 275 280 285 Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys Thr Leu 290 295 300 Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr His Glu 305 310 315 320 Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr Tyr Ser 325 330 335 Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr Trp Asp 340 345 350 His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro Cys Leu 355 360 365 Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln Asn Tyr 370 375 380 Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys His Pro 385 390 395 400 Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met Glu Asn 405 410 415 Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys Ser Lys 420 425 430 Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln Tyr Thr 435 440 445 Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly Tyr Val 450 455 460 Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Thr Cys Gly Lys Asp Gly 465 470 475 480 Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro Val Phe 485 490 495 Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu Asn Asp 500 505 510 Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr Gly Ser 515 520 525 Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp Leu Pro 530 535 540 Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val His Leu 545 550 555 560 Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val Leu Lys 565 570 575 Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser Val Gln 580 585 590 Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys Glu Gln 595 600 605 Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn Val Lys 610 615 620 Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu Tyr Tyr 625 630 635 640 Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro 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His Gly Thr Ile Asn 850 855 860 Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys Leu Ser 865 870 875 880 Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu Thr Thr 885 890 895 Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly Leu Pro 900 905 910 Cys Lys Ser Pro Pro Glu Ile Ser His Gly Val Val Ala His Met Ser 915 920 925 Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Glu Glu Val Thr Tyr Lys Cys Phe Glu Gly 930 935 940 Phe Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ile Ala Lys Cys Leu Gly Glu Lys Trp 945 950 955 960 Ser His Pro Pro Ser Cys Ile Lys Thr Asp Cys Leu Ser Leu Pro Ser 965 970 975 Phe Glu Asn Ala Ile Pro Met Gly Glu Lys Lys Asp Val Tyr Lys Ala 980 985 990 Gly Glu Gln Val Thr Tyr Thr Cys Ala Thr Tyr Tyr Lys Met Asp Gly 995 1000 1005 Ala Ser Asn Val Thr Cys Ile Asn Ser Arg Trp Thr Gly Arg Pro Thr 1010 1015 1020 Cys Arg Asp Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr Val Gln Asn Ala Tyr 1025 1030 1035 1040 Ile Val Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro Ser Gly Glu Arg Val Arg 1045 1050 1055 Tyr Gln Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met Phe Gly Asp Glu Glu Val Met 1060 1065 1070 Cys Leu Asn Gly Asn Trp Thr Glu Pro Pro Gln Cys Lys Asp Ser Thr 1075 1080 1085 Gly Lys Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser 1090 1095 1100 Phe Pro Leu Ser Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr Gln Cys 1105 1110 1115 1120 Gln Asn Leu Tyr Gln Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys Arg Asn 1125 1130 1135 Gly Gln Trp Ser Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val Ile Ser 1140 1145 1150 Arg Glu Ile Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr Ala Lys 1155 1160 1165 Gln Lys Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val Cys Lys 1170 1175 1180 Arg Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr Thr Cys 1185 1190 1195 1200 Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg 1205 1210 <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence of the native signal peptide of factor H <400> 27 Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys 1 5 10 15 Val Ala <210> 28 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the native signal peptide of factor H <400> 28 atgagacttc tagcaaagat tatttgcctt atgttatggg ctatttgtgt agca 54 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence of the signal peptide of HTLV-1 Env <400> 29 Met Gly Lys Phe Leu Ala Thr Leu Ile Leu Phe Phe Gln Phe Cys Pro 1 5 10 15 Leu Ile Phe Gly 20 <210> 30 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding the signal peptide of HTLV-1 Env <400> 30 atgggtaagt ttctcgccac tttgatttta ttcttccagt tctgccccct catcttcggt 60 60 <210> 31 <211> 281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of the gamma origin of replication of the plasmid E. coli R6K <400> 31 gatcagcagt tcaacctgtt gatagtatgt actaagctct catgtttaat gtactaagct 60 ctcatgttta atgaactaaa ccctcatggc taatgtacta agctctcatg gctaatgtac 120 taagctctca tgtttcacgt actaagctct catgtttgaa caataaaatt aatataaatc 180 agcaacttaa atagcctcta aggttttaag ttttataaga aaaaaaagaa tatataaggc 240 ttttaaagct tttaaggttt aatggttgtg gacaacaagc c 281

Claims

안구 병리의 치료에서 이의 사용을 위한 DNA 구성체로서,
상기 DNA 구성체는 상기 안구 병리를 갖는 환자의 안구체의 근육 세포로 핵산의 비바이러스적 전달을 위해 의도되고;
상기 DNA 구성체는
(a) 박테리아 또는 원핵생물 복제 기원, 특히 박테리아 기원;
(b) 환자의 안구체에서 DNA의 발현을 촉진하는 하나 이상의 서열;
(c) - 제1 치료 단백질, 및
- 이러한 제1 치료 단백질의 분비를 허용하는 신호 펩티드로서, 이러한 신호 펩티드는 상기 제1 치료 단백질의 N-말단에서, 제1 치료 단백질의 서열과 인접하는 것인 신호 펩티드
를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열;
(d) 환자의 안구체에서 이러한 제1 치료 단백질의 발현을 허용하는 프로모터;
(e) 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열;
(f) - 제1 치료 단백질과 상이한, 제2 치료 단백질, 및
- 이러한 제2 치료 단백질의 분비를 허용하는 신호 펩티드로서, 신호 펩티드는 상기 제2 치료 단백질의 N-말단에서, 제2 치료 단백질의 서열과 인접하는 것인 신호 펩티드
를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및
(g) 환자의 안구체에서 이러한 제2 치료 단백질의 발현을 허용하는 프로모터; 및
(h) 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열
을 포함하고,
상기 DNA 구성체는 모양체근에 주사 및 이어서 모양체근의 세포로 전기전달에 의해 환자에게 투여되는 것을 특징으로 하는 것인 DNA 구성체.
제1항에 있어서, 제1 치료 단백질은 항-VEGF 유형의 단백질이고, 특히 S-Flt1, 애플리버셉트, 콘버셉트, 브롤루시주맙, 및 특히 펩티드 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이러한 단백질은 보다 특히 애플리버셉트인 것을 특징으로 하는 DNA 구성체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 치료 단백질은 서열 SEQ ID NO: 1과 적어도 75% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 보다 특히 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 2에 의해 코딩되는 것인 DNA 구성체.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서,
(c) 제1 뉴클레오티드 서열은
- 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질로서, 이러한 단백질은 보다 특히 애플리버셉트인 단백질; 및
- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 4의 신호 펩티드
를 코딩하는 것인 DNA 구성체.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제2 치료 단백질은 서열 SEQ ID NO: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질이고, 이러한 단백질은 보다 특히 디코린인 DNA 구성체.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제2 치료 단백질은 서열 SEQ ID NO: 6과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 및 특히 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어지고, 특히 서열 SEQ ID NO: 7 및 서열 SEQ ID NO: 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 의해 코딩되는 것인 DNA 구성체.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서,
(c) 제1 뉴클레오티드 서열은
- 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질로서, 이러한 단백질은 보다 특히 애플리버셉트인 단백질; 및
- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 4의 신호 펩티드
를 코딩하고;
(f) 제2 뉴클레오티드 서열은
- 서열 SEQ ID NO: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질로서, 이러한 단백질은 보다 특히 디코린인 단백질; 및
- 펩티드 서열 SEQ ID NO: 13의 신호 펩티드
를 코딩하는 것인, DNA 구성체.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복제 기원은 박테리아의 것이고, 특히 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli)의 천연 플라스미드 R6K로부터 유래된 복제 기원, 특히 에스케리치아 콜라이의 천연 플라스미드 R6k의 복제 기원 R6K 감마, 특히 서열 SEQ ID NO: 31의 복제 기원인 DNA 구성체.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 원형 형태인 것을 특징으로 하는 DNA 구성체.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 구성체는 나형 DNA인 것을 특징으로 하는 DNA 구성체.
제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 안구 병리는 망막 변성, 특히 습성 또는 건성 나이-관련 황반 변성 (ARMD); 당뇨병성 망막병증 (DR); 망막 정맥 폐색, 특히 중심 망막 정맥 폐색 (CRVO) 또는 분지 망막 정맥 폐색 (BRVO); 근시성 맥락막 신생혈관생성 (CNV); 포도막염, 특히 비감염성 포도막염; 색소성 망막염 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 망막 변성이고;
보다 특히 망막 변성은 나이-관련 황반 변성 (ARMD), 특히 ARMD의 (습성) 신생혈관 형태; 당뇨병성 황반 부종 (DME)에 의한 시력 저하; 망막 정맥 폐색, 특히 중심 망막 정맥 폐색 (CRVO) 또는 분지 망막 정맥 폐색 (BRVO); 및 근시성 맥락막 신생혈관생성 (CNV)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, DNA 구성체.
안구 병리를 치료하기 위해 환자의 안구체의 근육 세포로 핵산의 비바이러스적 전달을 위해 의도되는 DNA 구성체로서,
(a) 박테리아 또는 원핵생물 복제 기원, 특히 박테리아 복제 기원;
(b) 환자의 안구체에서 DNA의 발현을 촉진하는 하나 이상의 서열;
(c) - 제1 치료 단백질로서, 상기 제1 치료 단백질은 서열 SEQ ID NO: 3과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질이고, 이러한 단백질은 보다 특히 애플리버셉트인 제1 치료 단백질, 및
- 이러한 제1 치료 단백질의 분비를 허용하는 신호 펩티드, 특히 펩티드 서열 SEQ ID NO: 4의 신호 펩티드로서, 이러한 신호 펩티드는 상기 제1 치료 단백질의 N-말단에서, 제1 치료 단백질의 서열과 인접하는 것인 신호 펩티드
를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열,
(d) 환자의 안구체에서 이러한 제1 치료 단백질의 발현을 허용하는 프로모터;
(e) 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열;
(f) - 제2 치료 단백질로서, 상기 제2 치료 단백질은 서열 SEQ ID NO: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질이고, 이러한 단백질은 보다 특히 디코린인 제2 치료 단백질, 및
- 이러한 제1 치료 단백질의 분비를 허용하는 신호 펩티드, 특히 펩티드 서열 SEQ ID NO: 13의 신호 펩티드로서, 이러한 신호 펩티드는 상기 제1 치료 단백질의 N-말단에서, 제1 치료 단백질의 서열과 인접하는 것인 신호 펩티드
를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열;
(g) 환자의 안구체에서 이러한 제2 치료 단백질의 발현을 허용하는 프로모터; 및
(h) 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 폴리아데닐화 서열
을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 DNA 구성체.
제12항에 있어서,
(c) 제1 뉴클레오티드 서열은
- 애플리버셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 1과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 2; 및
- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 5
를 포함하고;
(f) 제2 뉴클레오티드 서열은
- 디코린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 6과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 및 특히 서열 SEQ ID NO: 7 또는 서열 SEQ ID NO: 11; 및
- 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 14
를 포함하는 것인, DNA 구성체.