JP7111924B2 - 滲出型加齢性黄斑変性の治療のための組成物 - Google Patents
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Description
出願人は、本明細書に添付する電子形態での配列表資料を、参照により本明細書に組み込む。このファイルは「UPN-16-7683PCT_ST25.txt」とラベルされる。
macular degeneration by the European Society of Retina Specialists (EURETINA) Br J Ophthalmol 98:1144-1167)。これらの治療は、最良矯正視力(BCVA)に対していくらかの効果を有するが、それらの効果は、視力の回復及び期間において限定的である(Schmidt-Erfurth、上に引用される、2014, AAO PPP (2015) Preferred Practice Patterns: Age Related Macular Degeneration. American Academy of Ophthalmology)。市場における、滲出型AMDを治療するのに使用されるいくつかの薬物は、VEGFを阻害するメカニズムに依存し、硝子体内注射する必要がある。これらの治療は、疾患の進行を防ぐ点において成功することが報告されるが、それらは、薬物の頻繁な注射を必要とする。
」型の加齢性黄斑変性(Wet AMD)の進行に寄与すると考えられている、内皮細胞増殖及び血管新生、ならびに血管漏出を阻害する。ラニビズマブ(Lucentis(登録商標))の安全性及び有効性は、確立されてきており、ラニビズマブは、血管新生AMD、及び他の網膜疾患を有する患者におけるIVT注射治療について米国(US)食品医薬品局(FDA)が承認するものである(2006年に最初にFDAが承認する)。毎月のラニビズマブまたは毎月/8週ごとのアフリベルセプトのいずれかによる長期間の治療は、視力喪失の進行を遅らせ、かつ視力を改善する場合があるが、これらの治療のいずれも血管新生の再帰を阻止しない(Brown et al (2006)N Engl J Med,355:1432-44;Rosenfeld et al.,(2006)N Engl J Med 355:1419 31;Schmidt-Erfurth,2014,上に引用される)。疾患の悪化を阻止するために、各々は再度投与する必要がある。繰り返し治療への必要性は、患者に追加リスクが発生する可能性があり、患者と臨床医との両方にとって不便である。
(a)抗VEGF Fabの発現コンストラクトに隣接する、AAVの末端逆位配列(ITR(複数可));(b)抗hVEGF Fabをコードする導入遺伝子の眼における発現を導くトリβアクチンプロモーターまたはユビキチンCプロモーターを含む制御性因子を有する発現コンストラクト;ならびに(c)抗hVEGF Fabの重鎖及び軽鎖をコードする導入遺伝子であって、各々の鎖がそのアミノ末端へと付加された異種性リーダー配列を有し、ここで重鎖及び軽鎖のコード配列が、重鎖及び軽鎖のポリペプチドの別個の産生を確かにするために、「切断可能」なペプチドリンカーのコード配列またはIRES(配列内リボソーム進入部位)によって分離されており、ポリアデニル化シグナルを有する、導入遺伝子。生じる導入遺伝子発現産物は、Fab重鎖に通常見出されるものに加えて、アミノ酸残基を含んでもよい
提示する繰り返される眼内注射の回避をもたらす点において、nAMR治療のための標準治療を超える利点をもたらす。各々の態様は、治療成績を改善し得る。
Fabは、重鎖の終端にジペプチド、アルギニン-リジン、重鎖の終端にトリペプチド、アルギニン-リジン-アルギニン、または重鎖の終端にポリペプチド、アルギニン-リジン-アルギニン-アルギニンを含み得る。ある実施形態において、ベクターが発現する抗VEGF Fabは、2つ以上のこれらのFab産物の異種性の混合物である。他のフリン切断部位(アルギニン-X-X-アルギニン、またはアルギニン-X-リジン、またはアルギニン-アルギニン)もまた使用でき、これはまたC末端の不均一性を生じ得る。換言すると、他のベクターが発現する抗VEGF Fabは、リンカー処理の結果として、重鎖がそのC末端に0、1つ、2つ、3つ、または4つのアミノ酸を有する、Fabの異質性の集合であり得る。さらに、軽鎖及び重鎖の各々は、宿主細胞の機構によって成熟タンパク質からリーダーペプチドを処理して除去する適切な細胞分画へと新生ペプチドを誘導する、異種性リーダーペプチドを含む。ある実施形態において、抗VEGF Fabは、HCまたはLCのリーダー配列をまったく含まない。例えば配列番号33を参照。
ノ酸であってよい。ある実施形態において、リーダーは、配列番号33のアミノ酸1~20の配列を有する。
配列番号37のnt2422~2742にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、F2A切断部位の配置の結果として、追加のアミノ酸をコードする配列がVH鎖に残り得る。軽鎖のリーダー配列が配列番号37のnt2830~2889にコードされ、VLのORFが配列番号37のnt2890~3210に提示され、CLのORFが配列番号37のnt3211~3531に位置する。
Biol. Chem. 272, 32061-32066;Stoneley M, et al., (1998). Oncogene 16, 423-428.]、または口蹄疫(FMD)に由来するものが選択され得る。
ルが選択される。さらに他の好適なpolyA配列も選択され得る。
,2008,”Recent developments in adeno-associated virus vector technology,”J.Gene Med.10:717-733;及びいかに引用される参考文献を参照でき、その各々は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。導入遺伝子のビリオンへのパッケージングのために、ITRは、発現カセットを含む核酸分子と同一のコンストラクトにおいて、シスで必要とされる唯一のAAVの構成要素である。cap遺伝子及びrep遺伝子は、トランスで供給できる。
Manual,ed.Green and Sambrook,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(2012)を参照。
Apr 26に記載されるような、Y447F、Y733F、及びT494V変異(「AAV8(C&G+T494V)」及び「rep2-cap8(Y447F+733F+T494V)」とも呼ばれる)を有し得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれるMowat et al,Tyrosine capsid-mutant AAV vectors for gene delivery to the canine retina from a subretinal or intravitreal approach,Gene Therapy 21,96-105(January
2014)を参照。別の実施形態において、AAVカプシドは、AAV8カプシドであり、優先的に双極細胞を標的とする。参照により本明細書に組み込まれるWO2014/024282を参照。
rAAV8.aVEGF製剤は、水性溶液に懸濁された有効量のrAAV8.aVEGFベクターを含む懸濁液である。ある実施形態において、懸濁液は、任意選択の界面活性
剤及び/または他の賦形剤と共に、緩衝食塩水を含む。緩衝食塩水は、典型的には、生理学的に適合可能な塩または塩の混合物を含み、例えばリン酸緩衝生理食塩水、塩化ナトリウム、またはそれらの混合物である。
Ther Methods 2014 Apr;25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014 Feb 14に記載されるように、oqPCRまたはデジタル液滴PCR(ddPCR)によって測定されるとき、例えば、約1×108GC/眼~約7×1012GC/眼、または約5×109GC/眼~約1×1011GC/眼、または約1010GC/眼または約を含み得る。
ポリアクリルアミドゲル(例えばNovex)上で分析される。製造者の取扱説明書に従ってSilverXpress(Invitrogen、CA)を用いる銀染色を実施してもよい。一実施形態において、カラム画分におけるAAVベクターゲノム(vg)の濃度は、定量的リアルタイムPCR(Q-PCR)によって測定することができる。試料を希釈してDNase I(または別の好適なヌクレアーゼ)によって切断して外来性DNAを除去する。ヌクレアーゼの不活化後、試料をさらに希釈して、プライマーとプライマー間のDNA配列に特異的なTaqMan(商標)蛍光発生プローブを用いて増幅する。所定のレベルの蛍光に到達するのに必要とされるサイクル数(閾値サイクル、Ct)は、Applied Biosystems Prism 7700 Sequence Detection Systemにおいて各々の試料について測定される。AAVベクターに含まれるものと同一の配列を含むプラスミドDNAは、Q-PCR反応において標準曲線を作成するのに利用される。試料から得られるサイクル閾値(Ct)の値は、それをプラスミド標準曲線のCt値に対して標準化することによって、ベクターゲノムの力価を測定するのに使用される。デジタルPCRに基づくエンドポイントアッセイもまた使用できる。
rAAV8.aVEGFベクターは、図9に示されるフローチャートに示されるように製造できる。手短に、細胞(例えばHEK293細胞)は、好適な細胞培養系において増殖され、ベクター生成のためにトランスフェクトされる。次いで、rAAV8.aVEGFベクターは、採取され、濃縮され、精製され、バルクベクターを調製することができ、次いでこれは、下流のプロセスにおいて充填され、完成される。本明細書において記載される遺伝子療法ベクターを製造する方法は、遺伝子療法ベクターの作製に使用されるプラスミドDNAの生成、ベクターの生成、及びベクターの精製などの当該技術分野において周知の方法を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子療法ベクターはAAVベクターであり、生成されるベクターは、AAVゲノム及び対象の遺伝子をコードするAAVシスプラスミド、AAVのrep及びcap遺伝子を含むAAVトランスプラスミド、ならび
にアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドDNAの細胞へのトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、ならびにベクター含有細胞及び培地の採取などの方法のステップを含み得る。採取されたベクター含有細胞及び培地は、粗細胞採取物として本明細書において言及される。
治療の候補である患者は、血管新生加齢性黄斑変性、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫(RVO)、糖尿病性黄斑浮腫(DME)、糖尿病性網膜症(非増殖性糖尿病性網膜症(NPDR)、DMEを有する患者における増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、糖尿病性黄斑浮腫を有する患者における糖尿病性網膜症を有するものを含む。これらの患者は、本明細書において記載されるようなAAV8.aVEGF組成物による網膜下治療に特によく適している。
翼状片(原発性翼状片手術のための補助的治療法を含む)、再発性翼状片、網膜ドルーゼン、眼腫瘍、眼球内黒色腫、白内障、角膜移植不全、線維柱帯切除術、脂肪性角膜症、全層角膜移植術、疱疹性角膜症、酒さ、網膜血管腫、腎血管性疾患、視覚障害、増殖性硝子体網膜症、虹彩血管新生(NV)、角膜NV、パンヌスを含む、毛様体扁平部炎サルコイド、またはイールズ病を有するものを含む。
び腎盂、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、子宮平滑筋肉腫、腟癌、血管腫瘍、外陰癌、ウィルムス腫瘍及びその他の小児腎腫瘍、腹部腫瘍(腺癌、肝細胞、乳頭状漿液ミュラー、ラパチニブ、結腸直腸、卵巣、卵管、腹膜の癌/新生物/癌腫/腫瘍)、リンパ増殖性疾患、小腸癌、聴神経腫瘍(例えば、前庭神経鞘腫、神経線維腫症2型)、急性骨髄性白血病、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、頭頚部癌、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、肉腫、神経芽細胞腫、進行癌、女性性器の悪性新生物、転移性または切除不能な固形腫瘍、悪性星状細胞腫、結腸癌、転移性黒色腫、悪性腹水、腎細胞癌、神経膠芽腫、神経膠肉腫、結腸直腸癌の肝転移、進行性悪性腫瘍、骨髄腫、妊娠性トロホブラスト腫瘍、絨毛癌、胎盤部トロホブラスト腫瘍、類上皮性トロホブラスト腫瘍、胆道癌、悪性神経膠腫、子宮頸癌、子宮癌、中皮腫を有するものを含んでもよい。その候補は、前記組成物単独によって、または例えば、パクリタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、放射線、カペシタビン、イリノテカン、フルオロウラシル、塩酸ドキソルビシンリポソーム、塩酸エルロチニブ、塩酸イリノテカン、塩酸イリノテカン水和物(CPT-11)、塩酸ゲムシタビン、塩酸パゾパニブ、塩酸トポテカン、トリフルリジン/塩酸チピラシル、ペグ化リポソーム封入塩酸ドキソルビシン、塩酸エンザスタウリン、塩酸ミトキサントロン、塩酸エピルビシン、ドセタキセル、ゲムシタビン、エルロチニブ、シスプラチン、化学療法、セツキシマブ、FOLFIRI-セツキシマブ、5-フルオロウラシル(5-FU)、LV5FU2、シクロホスファミド、テモゾロミド、ペメトレキセド、レボホリナートカルシウム(l-LV)、ロイコボリンカルシウム、FOLFOX、FOLFOX6、mFOLFOX、FOLFOXIRI、FOLFIRI、ドキソルビシン、リポソーム封入ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシンリポソーム、トシル酸ソラフェニブ、ソラフェニブ、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トラスツズマブ、エベロリムス、スニチニブ、デキサメタゾン、従来の手術、ゼローダ、放射線療法、テムシロリムス、パゾパニブ、ロイコボリン(LV)、l-LV、アニツムマブ(anitumumab)、エピルビシン、ベルテポルフィン、AMG 655、Amgen 386、AMG 479、AMG 706、AMG 951、AMG 102、ホリン酸、レボ-ホリン酸、エトポシド、BAY 43-9006、アテゾリズマブ、インターフェロンアルファ2b、インターフェロンアルファ2a、インターフェロンアルファ、γ-インターフェロン-1b、光力学的治療、酒石酸ビノレルビン、ビノレルビン、トポテカン、タルセバ、ペメトレキセド二ナトリウム、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、イメテルスタットナトリウム、XELOX、RAD001、ペグフィルグラスチム、パクリタキセルアルブミン安定化小粒子製剤、イピリムマブ、定位放射線手術(SRS)、定位放射線、オザルデックス、レトロゾール、AG-013736(アキシチニブ)、フィルグラスチム、クリゾチニブ、セジラニブマレイン酸塩、セジラニブ、ボルテゾミブ、アブラキサン、ボリノスタット、ビンクリスチン、TRC105、リツキシマブ、レゴラフェニブ、ペンブロリズマブ、メトトレキサート、イマチニブ、ハーセプチン、テセントリク、オキサリプラチン(OXA)、ロムスチン、イクサベピロン、CPT-11、CGC-11047、酒石酸ビノレルビン、酒石酸塩、プレドニゾン、ニボルマブ、フルベストラント、エンザスタウリン、ドキシル、AZD2014、AZD2281、AZD2171、AZD4547、AZD5363、AZD8931、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンD、バルプロ酸、マイトマイシンC、セジラニブマレイン酸塩、レナリドマイド、ラパチニブ、HAIアブラキサン、HAIイリノテカン、GDC-0941、GDC-0449、GDC-0980、ビカルタミド、XELIRI、バンデタニブ、サリドマイド、ラパマイシン、オラパリブ、NovoTTF100A、ナベルビン、MetMAb、メシル酸イマチニブ(グリベック)、イホスファミド、ヒドロキシクロロキン、及びGM-CSFであるが、これらに限定されない抗がん治療と組み合わせて治療される。
は眼への投与のための別の型の投与が特定されている場合を除いて、任意の好適な経路によって送達され得る。
離及び線維柱帯と虹彩の距離、中心部及び中心傍の変視症、網膜感度(mfERG、Nidek MP-1マイクロ視野計測)を分析することによる加齢性黄斑変性(AMD)の優先的超解像力視野計(Preferential Hyperacuity Perimeter)(PHP)試験、視覚的アナログスケール(VAS)、黄斑マッピング検査、網膜電図(ERG)、パターン網膜電図(PERG)及び全視野(またはフラッシュ)網膜電図(ffERG)、多局所網膜電図(mfERG)、mfERG中心環振幅濃度を含む電気生理学的変化、3つの同心円状の輪(4°、8°、及び12°)における平均網膜感度(dB)、視覚誘発電位(VEP):ECGパラメーターは、PRインターバル、QRSインターバル、及びFridericiaの公式を用いる補正QTインターバル(QTcF)を含む。NVE(網膜血管新生)、CNVM(脈絡膜血管新生膜)の退縮、黄斑の容積、黄斑の厚さ、中心部黄斑亜領域の厚さ、網膜の容積(内部網膜容積及び外部網膜容積)、網膜の厚さ、中心部網膜の厚さ、中心部亜領域の網膜の厚さ(CSRT)、中心窩下網膜の厚さ(SRT)、中心窩の厚さ、中心窩無血管域最大径、網膜層の完全性、外境界膜(ELM)の完全性、楕円体線/バンドの完全性、レンズの状態、レンズの不透明度を含む光干渉断層写真術(OCT)を用いて測定される変化、光干渉断層血管撮影(OCTA)によって測定される新血管膜の退縮パーセンテージ、中心窩を中心とする1mmにおける内部/外部セグメント層の光受容体の完全性の度合いを含む解剖学的変化。任意選択で、治験の間、AMD損傷サイズ及び漏出が蛍光眼底造影によるものであり得、蛍光眼底造影(FA)及びインドシアニングリーン眼底造影(ICG)による全損傷サイズ及びCNV(脈絡膜血管新生)サイズ、網膜下液または出血を含み得る活性CNV漏出、漏出の面積、黄斑漏出の面積、損傷出血のパーセンテージの変化、ドルーゼンサイズの変化、液体の量、網膜内嚢胞様変化(IRC)容積、血管密度、網膜内/網膜下液の存在、網膜下液(SRF)の高さ及び径、網膜内液の容積、前眼房反応、脈絡網膜還流(ICG)、眼底撮影法(FP)及び/または眼底自発蛍光(AF)によって検出されるような地図状萎縮(GA)の進行、毛細管閉塞の存在及び拡張、周辺部網膜虚血、マイクロ視野測定を用いる黄斑感度、虹彩の血管新生、角の血管新生、糖尿病性網膜症であり得る。
1-12.2015)が設定した推奨に従って実施できる。まとめると、網膜電図(ERG)は、通常、全網膜細胞がフラッシュ刺激(暗順応の動物、中程度から強烈な閃光)に能動的に応答するときに生成する。2つの構成要素は以下のものである:・a波:フラッシュ後の最初の角膜陰性シグナル。起源:光受容体光電流、光受容体機能の最も直接的な特徴。・b波:大部分がオン型双極細胞(光受容体下流の二次ニューロン)によって生成されるa波の後に続く角膜陽性シグナル。以下に記載される実施例において、国際臨床視覚電気生理学会(ISCEV)に従う標準及び追加プロトコールが使用された。しかしながら、これらのパラメーターは、必要により、または要求により、調整され得る。暗順応桿状体のERG:刺激強度:0.01~0.02cd s m-2応答:b波のみ、a波はなし。源:桿状体「オン型」双極細胞(桿状体からの入力に駆動される二次ニューロン)。意味:桿状体機能の測定。暗順応標準的なフラッシュERG:刺激強度:3cd s
m-2応答:桿体錐体のa波とb波の混合;60%~70%のシグナルは、桿状体駆動経路によって生成される。源:光受容体、桿状体と錐体の両方(a波);桿状体と錐体の両方によって駆動される高次ニューロン。意味:大部分の桿状体の機能の測定、暗順応の状態に対して感度が低く、「薄暗いフラッシュ」応答よりも低い可変性である。暗順応明るいフラッシュERG:刺激強度:10cd s m-2。応答及び意味:「標準的なフラッシュ」の応答についてと同一であるが、明るいフラッシュへの応答は、規模がより大きく、より可変性が低くあり得る。明順応標準的なフラッシュ錐体ERG:刺激強度:5分間の明順応の後、30cd m-2のバックグランド光の存在下で送達される3cd s m-2。応答:錐体駆動経路によって生成されるa波及びb波。意味:錐体を完全に非感光性にするバックグランド光の存在下で、ERGが錐体及び錐体駆動二次網膜ニューロンによって排他的に作成され、錐体の機能を測定する。明順応明るいフラッシュ錐体ERG(ISCEV標準に対して追加して)刺激強度:5分間の明順応の後、30cd m-2のバックグランド光の存在下で送達される10cd s m-2。応答及び意味:錐体駆動ERGは「標準的な錐体ERG」の場合のようであったが、より大きな規模であり、潜在的により低い可変性である。ERG測定(a波振幅、a波潜時、b波振幅、b波潜時)が、処理した眼及びコントロールの眼について平均及び標準偏差(SD)を用いてまとめられた。
投与後の遺伝子療法ベクターの安全性は、ベクター投与の後36ヶ月までの複数の時点において評価される、有害事象の数、身体診察において注目された変化、及び/または臨床検査パラメーターによって評価することができる。生理学的効果は、例えば約1日~1週間で早く観察され得るが、一実施形態において、定常状態レベルの発現レベルは約12週間までに到達する。
約15%、約20%、約30%、約40%、約50%またはそれ以上の減少をもたらす。他の実施形態において、中心網膜厚は安定であり、すなわち中心網膜厚における増加がまったくない。ある実施形態において、有効性の測定は、網膜厚の安定化、及び/または、滲出液及び/またはドルーゼンの安定化/減少を含む。
本発明は、rAAV8.aVEGFベクターの網膜下投与が、網膜全体にわたる遺伝子導入をもたらし、かつ網膜全体にわたる、ならびに硝子体及び前房液中における抗VEGF Fabの発現をもたらすことを実証する以下の例によって示される。遺伝子導入が元の注射ブレブの外側を水平方向に拡散するが、それらの拡張された境界に閉じ込められたままであり、この注射の拡張領域(網膜中の注射部位において形成される「ブレブ」)の外側における遺伝子導入及び導入遺伝子発現を達成しなかったということを実証する従来技術の遺伝子療法の研究の観点から、この結果は驚くべきであり、rAAV8.aVEGFベクターの単一投与が(i)結果として、経時的に消散するVEGF阻害剤の高用量ボーラスの繰り返されるIVT投与と比較して性能が向上し得るような網膜全体にわたるVEGF阻害剤の有効量の連続送達、ならびに(ii)患者に追加のリスク及び不便さを提示する繰り返される眼内注射の回避をもたらす点において、nAMR治療のための標準治療を超える利点をもたらす。各々の態様は、治療成績を改善し得る。
動態を指す。PEIはポリエチレンイミンを指す。PKは薬物動態を指す。POCは概念実証を指す。PRNは必要に応じて(必要に応じて)を指す。QAは品質保証を指す。qPCRは定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指す。rAAVは組換えアデノ随伴ウイルスを指す。RBGはウサギβグロビンを指す。PREは網膜色素上皮を指す。S-36はHYPERstack(登録商標)36層を指す。SENDは非臨床試験データ交換のための標準を指す。SOCは標準治療を指す。SOPは標準操作手順を指す。TCID50は50%組織培養感染価を指す。TTFはタンジェント流ろ過を指す。μLはマイクロリットルを指す。VAは視力を指す。VEGFは血管内皮増殖因子を指す。WAMDは滲出型加齢性黄斑変性を指す。YAGはイットリウム・アルミニウム・ガーネットを指す。
この実施例は、血管新生(滲出型)加齢性黄斑変性(nAMD)を有する患者の遺伝子療法治療に関する。この実施例において、可溶性抗VEGF Fabタンパク質のコード配列を担持する複製欠損アデノ随伴ウイルスベクター8(AAV8)である遺伝子療法ベクター、rAAV8.aVEGFがnAMDを有する患者に投与される。遺伝子療法治療の目的は、網膜変性の進行を遅らせるか、または阻止すること、及び最小限の介入/侵襲的処置によって視力喪失を遅らせるか、または阻止することである。
いくつかのrAAV8.aVEGF遺伝子療法ベクターの生成は、本明細書において実施例2に記載される。さらに、rAAV8.aVEGFベクターゲノムの略図は図1に示される。rAAV8.aVEGFは、ヒト抗血管内皮増殖因子(抗VEGF)抗原結合抗体フラグメント(Fab)の産生をもたらす導入遺伝子を含む非複製組換えAAV8ウイルスベクターである。遺伝子カセットは、AAV2末端逆位配列(ITR)に隣接される。カセットからの発現は、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーとトリβアクチンプロモーターとのハイブリッドであるCB7プロモーターに駆動される。このプロモーターからの転写はトリβアクチンイントロンの存在により増強される。発現カセットのためのポリアデニル化シグナルはウサギβグロビン遺伝子に由来する。抗VEGF Fabの重鎖及び軽鎖をコードする核酸配列は、自己切断フリン(F)/F2Aリンカーによって分離されている。フリン-F2Aリンカーの組み込みは、およそ等量の重鎖と軽鎖とのポリペプチドの発現を確かなものとする。
250μLの容量のrAAV8.aVEGFが治療の必要のある対象の眼内に網膜下送達を介して単一用量として投与される。対象は、3×109GC/眼、1×1010GC/眼、または6×1010GC/眼の用量を投薬される。
テポルフィンを伴う光線力学的治療、及び、硝子体内へのペガプタニブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、またはベバシズマブを含むがこれらに限定されない抗VEGF剤と組み合わせて投与される。
好適な患者は以下のものを含み得る:
nAMDの診断を有するもの;
抗VEGF療法に応答性のもの;
抗VEGF療法の頻繁な注射を必要とするもの;
50歳以上の男性もしくは女性;
罹患した眼において20/100以下かつ20/400以上のBCVA(65以下かつ35以上のETDRS文字)を有するもの;
20/63以下かつ20/400以上の間のBCVA(75以下かつ35以上のETDRS文字)を有するもの;
罹患した眼においてAMDに続発する中心窩下CNVの確定診断を有するもの;
以下の:10ディスク領域未満の損傷サイズ(典型的なディスク領域は2.54mm2)、損傷サイズの50%未満の血液、及び/または瘢痕のようなCNVの損傷特性を有するもの;
治療の前に8ヶ月(またな未満)の間、罹患した眼においてnAMDの治療のための抗VEGF剤の少なくとも4回の硝子体内注射を投薬され、SD-OCT上において確認された解剖学上の応答を有しているもの;及び/または
罹患した眼においてSD-OCT上において実証された網膜下もしくは網膜内液の存在を有するもの。
治療前に、患者は、スクリーニングされ、以下の基準の1つ以上がこの治療法が患者に好適でないことを示し得る:
・AMD以外の任意の要因に続発する罹患した眼におけるCNVまたは黄斑浮腫;
・罹患した眼において、血液がAMD損傷の50%以上を占めるか、または血液が1.0mm2を超えて中心窩の下に存在する;
・罹患した眼におけるVAの改善を阻止する任意の状態、例えば、線維症、萎縮、または中心窩の中心における網膜上皮裂孔;
・罹患した眼における活動性の高い網膜剥離または網膜剥離の病歴;
・罹患した眼における進行した緑内障;
・罹患した眼における対象のリスクを増加させる可能性があるか、視力喪失を阻止または治療する医学的または外科的介入のいずれかを必要とする可能性があるか、または処置または評価の試験と干渉する可能性のある任意の状態;
・スクリーニング前の12週間以内に罹患した眼における眼内手術の履歴(スクリーニング来院の前の10週間を超えて実施される場合、イットリウム・アルミニウム・ガーネットの嚢切開は容認され得る);
・スクリーニング前の6ヶ月以内に罹患した眼における硝子体内療法、例えば硝子体内ステロイド注射、または抗VEGF療法以外の治験薬の履歴;
・スクリーニング時の罹患した眼におけるインプラントの存在(眼内レンズを除外する)
・スクリーニング前の5年以内に化学療法及び/または放射線を必要とする悪性腫瘍の病歴(局在する基底細胞癌は容認され得る);
・網膜毒性を引き起こすことの知られている治療法、または視力に影響を及ぼし得るかもしくは既知の網膜毒性を有する任意の薬物との併用療法、例えばクロロキンまたはヒドロキシクロロキンの履歴;
・罹患した眼における外科手技と干渉し得る眼または眼周囲の感染;
・過去6ヶ月間の治療における心筋梗塞、脳血管障害、または一過性虚血発作;
・最大限の治療にもかかわらず制御不能の高血圧(180mmHgを超える収縮期血圧[BP]、100mmHgを超える拡張期血圧);
・眼の外科手術または治癒過程を妨げ得る任意の付随する治療;
・ラニビズマブもしくはその任意の成分に対する既知の過敏性またはrAAV8.aVEGFに類似する剤に対する過去の過敏性;
・研究者の意見における、被験者の安全性または試験への成功裏の参加を損なうであろう任意の重篤なまたは不安定な医学的または心理的状態;
・正常上限(ULN)の2.5倍を超えるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)/アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT);
・対象が以前に知られているギルバート症候群の病歴を有していない限りULNの1.5倍を超える総ビリルビン、及び結合ビリルビンが総ビリルビンの35%未満であることを示す分画したビリルビン;
・ULNの1.5倍を超えるプロトロンビン時間(PT);
・男性の対象について10g/dL未満のヘモグロビン、女性の対象について9g/dL未満のヘモグロビン;
・100×103/μL未満の血小板;
・30mL/分/1.73m2未満の推定糸球体ろ過率(GFR)。
疾患活動性について以下の1以上の救援基準が適用される場合、rAAV8.aVEGFの投与後約4週間から開始して、患者は罹患した眼において、硝子体内ラニビズマブ救援治療を投薬され得る:
・スペクトル領域光干渉断層写真術(SD-OCT)上での網膜液の蓄積と関連する(最良矯正視力[BCVA]当たり)5文字以上の視力喪失;
・SD-OCT上での新規または持続する、網膜下または網膜内液の、脈絡膜血管新生(CNV)と関連した上昇;
・新規の眼の出血;
以下の所見セットの1つが発生する場合、研究者の裁量によりさらなる救援注射を延期することができる:
・SD-OCTによって評価されるとき、視力が20/20もしくはそれより良好であり、中心網膜厚が「正常」である、または
・2回の連続した注射の後で視力及びSD-OCTが安定である。
・注射が延期される場合、視力またはSD-OCTが上記の基準に従って悪化する場合、それらは再開される。
主な治療目的は、網膜変性の進行を遅らせるかまたは阻止こと、及び視力喪失を遅らせるかまたは阻止することを含む。治療目的は、標準治療、例えば、ペガプタニブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、またはベバシズマブを含むがこれらに限定されない抗VEGF剤の硝子体内注射を用いる救援治療の排除及びその数の低減によって示される。治療目的はまた、視力喪失の減少もしくは阻止及び/または網膜剥離の減少もしくは阻止によって示される。
測定することによって、経時的にCNVにおけるベースラインからの平均変化ならびにFAに基づいた損傷サイズ及び漏出領域を測定することによって、経時的に水性aVEGFタンパク質のベースラインからの平均変化を測定することによって、血清及び尿中のベクター脱落分析を実施することによって、及び/またはrAAV.aVEGFの免疫原性を測定することによって、すなわちAAVに対するNabを測定することによって、AAVに対する結合抗体を測定することによって、aVEGFに対する抗体を測定することによって、及び/またはELISpotを実施することによって、決定される。
本明細書において記載されるavEGFベクターの各々は、各々がIL2のリーダー配列を有する抗VEGF Fab重鎖及び軽鎖の発現を駆動するプロモーターを含む発現カセットを含む。試験組成物(懸濁液)中のrAAVに担持されるベクターゲノム中のFabコード配列は、同一であるように設計された。発現カセットは、5’のAAV2のITR及び3’のAAV2のITRに隣接される。試験されるベクターゲノムの各々は、同一の抗VEGF Fab(以前はaVEGF-ArgまたはaVEGF-Rと呼ばれた)のコード配列バリアントを含む。ある実施形態において、発現するaVEGF Fabは均一集団である。ある実施形態において、発現するaVEGF Fabは、重鎖のカルボキシル末端における不均一性を有する。IL2-aVEGFの重鎖及びIL2-aVEGFの軽鎖のオープンリーディングフレームは、重鎖と軽鎖の両方の等モル発現を促進するためにコードされたフリン切断部位/F2Aリンカーによって分離された。これは、任意選択で0、1、2、3または4個のアミノ酸をそのカルボキシル末端に含むaVEGF重鎖の発現をもたらす。そのカルボキシル末端におけるアルギニン、アルギニン-リジン、アルギニン-リジン-アルギニン、またはアルギニン-リジン-アルギニン-アルギニン。
・7個の異なるプロモーター(98匹のオスC57BL/6マウス、Jackson Laboratories)が、AA2/8から発現される従来の抗体(F16)を用いて評価された。F16mAbの発現はヘマグルチニン(HA)タンパク質に対するELIS
Aによって測定された。
・2個の異なるリーダーペプチド(28匹のオスC57BL/6マウス、Jackson
Laboratories)。抗VEGF Fabの発現がVEGFに対するELISAによって測定された。
・3個の異なる軽-重鎖分離因子(42匹のオスC57BL/6マウス、Jackson
Laboratories)が以下のベクターを用いて評価された。
ーター;CI=キメライントロン;rBG=ウサギβグロビンポリアデニル化配列。
網膜下注射は無菌技術及び滅菌した解剖器具を用いて実施された。動物をケタミン/キシラジンまたは3~5%イソフルランで麻酔し、メロキシカムを投与した。動物を、注射する眼を視野下にして解剖顕微鏡下に置いた(15倍の倍率を使用する)。耳側結膜をジュエラー鑷子でつかみ、ヴァナス虹彩切開剪刀の先端を用いて慎重に強膜まで切った。結膜の角膜周囲切開術を、剪刀の下側のへりを、切開を通じて導入し、結膜の上方と下方の両方に円周方向に延ばすことによって実施した。全ての結膜の破片を強膜の表面から注意深く除去した。角膜に隣接する結膜を鉗子でつかみ、眼球を回転させるよう牽引力をもたらし、最適な外科的露出を可能にした。30 1/2ゲージの針を用いて、鈍端針が通過できるのに十分な大きさの小切開をもたらした。
採取した眼を、ステンレス鋼ビーズならびに200μLのタンパク質溶解及び抽出緩衝液(RIPA)及びcOmplete(商標)、Mini Protease Inhibitor Cocktail錠剤(1錠剤/10mLのRIPA緩衝液)を含むカクテルを有する円錐管に眼球全体を入れることによってホモジナイズした。眼は、TissueLyser(Qiagen,USA)中で、少なくとも2分間、または完全にホモジナイズされるまでホモジナイズした。ホモジネートは、低温室内で4℃において12000RPMで20分間遠心した。上清を新しいチューブに移し、分析アッセイで使用した。
眼のホモジネート中のタンパク質濃度は、製造者の指示書に従ってPierce(商標)BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いて測定した。全ての試料の等量のタンパク質をELISAで使用した。
96ウェル丸底プレートを、2μg/mLのHA A-北京または1μg/mLのVEGFで4℃において一晩でコーティングした。コーティングの後、プレートを、405 TS Washer (BioTek Instruments,Winooski,VT)を用いて、200μLの0.05%Tween-20を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(PBS-T)で5回洗浄した。プレートを、200μL/ウェルの1%ウシ血清アルブミン(BSA)で、室温(RT)において1時間ブロッキングした。洗浄(記載したように)後、100μL/ウェルのサンプルを二重のウェルに充填し、37℃において1時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを洗浄(記載したように)し、次いで1%BSAで、RTにおいて1時間ブロッキングした。洗浄(記載したように)後、100μL/ウェルの一次抗体を添加し、RTにおいて1時間インキュベート
した。次いでウェルを洗浄(記載したように)し、100μL/ウェルの二次抗体で、RTにおいて1時間インキュベートした。最終的な洗浄(記載したように)に続いて、150μL/ウェルの検出基質である3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジを添加し、遮光してRTにおいて30分間インキュベートした。反応を50μL/ウェルの2NのH2SO4で停止した。次いでプレートを、分光光度計であるSpectraMax(登録商標)M3(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を用いて450nm/540nmの励起/発光で読んだ。
ELISAのためのレポーター遺伝子の濃度の平均及び標準偏差の値は、Microsoft Office Excel 2010を用いて計算された。
7個の異なるプロモーターを有するAAV2/8ベクターは、FI6 mAbの発現について評価された。プロモーターEF 1-αを使用したとき、FI6 mAbの発現は、いずれの動物においても観察されなかった。プロモーターSV40.PI、PGK.PI、及びTK.PIを使用したとき、FI6 mAbの発現は低かった。プロモーターCMV.PI、CB7.CI、及びUbC.PIは、FI6 mAbの最も高い発現を実証した。いずれの動物においても、未処理の左眼においては発現が観察されなかった(データはファイル上にあり)。2個の異なるリーダーペプチドを有するAAV2/8ベクターは、抗VEGF Fabの発現について評価された。SF2リーダーを有するリーダーペプチドaVEGFv7を使用したとき、低用量での抗VEGF Fabの発現が、IL2リーダーを有するaVEGFv7と比較して、より高かかった。高用量において、抗VEGF Fabの発現は両方のリーダーペプチドについて同様であった。いずれの動物においても、未処理の左眼においては発現が観察されなかった(データはファイル上にあり)。3個の異なる軽-重鎖分離因子を有するAAV2/8ベクターは、抗VEGF Fabの発現について評価された。cMyc軽-重鎖分離因子が使用されたとき、抗VEGF Fabの発現はいずれの動物においても観察されなかた。EMCVとFMDV1の軽-重鎖分離因子を有するとき、抗VEGF Fabは低レベルで発現した。いずれの動物においても、未処理の左眼においては発現が観察されなかった(データはファイル上にあり)。
7プロモーター、イントロン、上述されたようなコード配列から選択された抗VEGFコード配列、及びrBGのpolyA配列に隣接するベクターゲノムを有する。これは、他を具体的に特定した場合を除き、以下の実施例において試験ベクター(代替的に、AAV2/8.aVEGF試験ベクターまたはAAV8.aVEGF試験ベクター)と呼ぶ。
マカクは、網膜疾患を研究することに関してヒトに最も近い種であるため、この試験においてはマカクを使用した。カニクイザル及びヒトは、中心窩を含む眼の同様の解剖学的構造を有する。眼の寸法は同等であり、相対的な網膜領域に基づいてヒトの用量を決定することが可能である。
網膜下注射のために、2時または10時の位置で、硬膜切開によって導入された外套針を通して針を挿入した。硝子体を通して針を進め、後極において網膜を貫通した。顕微鏡での制御下で、100μLの試験試料を網膜下腔に注射した。これは、ドーム型の網膜剥
離/網膜ブレブの外観によって確認された。最初の注射の試みが網膜剥離をもたらさなかった場合、カニューレを網膜内の別の部位に移動させた。注射部位は、一時的な盲点をもたらしている可能性がある。注射した溶液は、網膜によって数時間以内で再吸収された。網膜剥離は周辺部網膜で生じ、永続的な失明をもたらさなかった。硬膜切開の部位は、吸収性縫合糸で縫合し、PredG軟膏または同等物によって眼を手当した。結膜下ケナログまたは同等物を投与した。動物は毎日観察され、必要に応じて鎮痛剤を非経口投与した。硝子体の炎症が現れた場合、症状が解消するまで、動物を、局所アトロピン及びPredG軟膏または同等物によって処理した。
動物を麻酔し、それらの頭部を固定した。ベタジン5%消毒液とプロパラカインまたは同等物を各々の眼に適用した。前房へのアクセスを可能にするために、開瞼器を配置した。処置は、27~30ゲージ皮下針を取り付けたツベルクリンシリンジによって実施した。眼は、鼻側結膜上の鉗子または綿棒で安定して保持された。針を、虹彩面の前方にあるパラリンバル(paralimbal)周辺の透明角膜を通って斜角上方に挿入した。眼に進入したら、サンプラーは注射器のプランジャーをゆっくりと引き戻して房水を吸引する。最大で100μLの前房液を採取した。前房液を抜くと、針を眼から引き戻した。前房液は、使用または貯蔵するまで湿潤氷上に置いた。処置の後、局所フルルビプロフェン、PredG軟膏、及び抗生物質点滴薬を各々の眼に適用した。前房液を以下の試験日(時折、週末、祝日、またはスケジュールの問題のために調整された)において採取した。0、15、29、43、57、71、85、120、149、183、212、247、274、及び302。
網膜の構造(ミクロンレベルの分解能で)をSD-OCT(Spectralis OCT,Heidelberg Engineering,Carlsbad,CA)を用いるインビボで非侵襲的な断面網膜顕微鏡により評価した。瞳孔は、フェニレフリン2.5%及びトロピカミド1%で散大された。このイメージングシステムの走査型レーザー検眼鏡を使用して、近赤外(NIR)反射率(REF)、及び動物の部分集合においてNIR眼底自発蛍光(FAF)によって、正面網膜イメージングを実施した。スペクトル領域光干渉断層写真術スキャンは、中心窩を通る9mmの長さの水平及び垂直断面、ならびにほぼ中間の領域に延びる30×25mmのラスタースキャンを重ね合わせて実施した。Aleman, Invest Ophthalmol Vis Sci.2007 Oct;48(10):4759-65を参照。
ELISAは、本質的に、上でマウス試験について記載したように実施した。抗VEGF Fabの発現のために、96ウェル丸底プレートを、1μg/mLのVEGFでコーティングした。プレートを4℃において一晩コーティングした。コーティングの後、プレートを、405 TS Washer(BioTek Instruments,Winooski,VT)を用いて、200μLの0.05%Tween-20を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(PBS-T)で5回洗浄した。プレートを、200μL/ウェルの1%ウシ血清アルブミン(BSA)で、室温(RT)において1時間ブロッキングした。洗浄(記載したように)後、100μL/ウェルのサンプルを二重のウェルに充填し、37℃において1時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを洗浄(記載したように)し、次いで1%BSAで、RTにおいて1時間ブロッキングした。洗浄(記載したように)後、100μL/ウェルの一次抗体を添加し、RTにおいて1時間インキュベートした。次いでウェルを洗浄(記載したように)し、100μL/ウェルの二次抗体で、RTにおいて1時間インキュベートした。
この実施例において、異なるプロモーター及びコード配列を有する4個のAAVベクターが、上述のように評価された。ベクターは網膜下に投与された。抗VEGF Fabの発現は、酵素結合免疫吸着検査法によって測定された。
全ての群の動物の前房液において、同様の発現動態が観察された(図3A~3D、図4A~4D)。抗VEGF Fabの発現の始まりは迅速であり、概して7日以内であった。定常発現レベルは1ヶ月以内に達成された。最後に評価された時点まで、2匹の動物を除いて全てが定常レベルで抗VEGF Fabを発現し続けた。
Lucentisの単一のIVT注射を投与されたいくらかの患者において、ラニビズマブが血清で観察された(Xu,2013)。AAV2/8ベクターの網膜下投与が抗VEGF Fabの全身曝露をもたらすかどうかを見極めるために、その血清における濃度を測定した。
AAV2/8ベクター及び抗VEGF Fabの毒性の評価はこのサブパートBに記載される。動物はAAV2/8ベクターを網膜下投与された。毒性は、臨床観察、体重、間
接眼底検査、スペクトル領域光干渉断層写真術(SD-OCT)、血液学、凝固、臨床化学、及び肉眼病理所見に基づいて評価された。
群6の全部で4匹の動物(8個の眼)がSD OCTで撮像された。中間用量レベルのAAV8.aVEGF試験ベクター(1.00×1011GC/眼)を投薬された眼の注射された領域は、実施例7(特にサブパートB)に記載される、1.00×1010及び1.00×1012用量レベルと比較して中間の結果を示した。2匹の動物(動物C71896及び動物C65936)において、ONLのいくらかの菲薄化が観察された(データはファイル上にあり)。さらに、2匹の動物(動物C74422及び動物C74414)において、最小限の変化が観察された(データはファイル上にあり)。血液学的、凝固または臨床化学的パラメーターにおいて臨床的に意味のある変化は、いずれの動物においても観察されなかった。
この節において、AAV2/8ベクター及び抗VEGF Fabの免疫原性の評価が記載される。ベクターは、この実施例において上記されたように、網膜下に投与された。免疫原性は、抗VEGF Fabに対するIgM及びIgG抗体、AAV8カプシドに対す
る中和抗体、ならびにAAV2/8ベクター及び抗VEGF Fabに対する細胞免疫応答の存在によって評価された。
Fabの発現の喪失と一致した。重要なことに、群6の動物における抗VEGF Fabに対するIgM及びIgGは、試験の期間中、検出されなかったか、またはベースラインレベル未満であった。
AAV8カプシドに対するNAbのベースラインレベルは、0日の試験日で採取した血液試料由来の血清中で測定された。検出限界は1:5希釈であり、5未満の力価を検出不能とみなした。16匹の動物のうちの2匹(動物C63116及び動物C66122)において、血清中に予め存在するNAbが観察されなかった。AAV2/8ベクターの投与に続いてこれら2匹の動物におけるNAbのレベルは、検出限界未満に維持されたか、または低かった。16匹の動物のうちの14匹において、予め存在するNAbが観察された。これらの動物のうちの11匹において、NAbのレベルは、試験を通して変動した。群2(動物C74440)及び群5(動物C68127)の各々の1匹の動物において、AAV2/8ベクターの投与に続いてNAbのレベルは、2か月において、それぞれ256及び128まで、2倍希釈で増加した。これらのNAbにおける増加は、抗VEGF Fabの発現の喪失と一致した。群2、3、及び5からの6匹の犠牲にした動物において、硝子体液におけるNAbの存在が評価された。犠牲時に血清中のNAbが検出不能であった2匹の動物(動物C63116及び動物C66122)において、NAbは犠牲時に硝子体液中に存在しなかった。残りの動物において、犠牲時のNAbのレベルは、犠牲時の血清中のレベルと相関しなかった。群6における全ての動物において、予め存在するNAbが観察された。これらの動物におけるNAbのレベルは、試験を通じて緩やかに変動した。
群2の1匹の動物(動物C74440)において、単一の時点において上昇したT細胞応答が観察された。この動物において、抗VEGF Fabに対する抗体、及びAAV8カプシドに対する中和抗体もまた観察された。この動物は抗VEGF Fabの発現を喪失していた。群5の1匹の動物(動物C65873)において、AAV8カプシドのプールBペプチドに対する提示された持続したT細胞応答は、あらかじめ注射されたベースライン試料を含んで観察された。同一の動物は、AAV2/8ベクターの投与後、最も高いレベルのNAbを有した。同一の群の別の動物(動物C68127)は、AAV8カプシドの全てのペプチドプールに対するT細胞を生じたが経時的に持続されなかった。この動物は抗VEGF Fabに対する抗体及び2番目に高いレベルのNAbを有した。動物は抗VEGF Fabの発現を喪失していた。
VEGFトランスジェニックマウスは、滲出型AMDの動物モデルとして使用した。2種のそのようなモデルは、Rho/VEGFマウスモデル及びTet/オプシン/VEGFモデルを含む。
Rho/VEGFマウスは、ロドプシンプロモーターが光受容体におけるヒト血管内皮増殖因子(VEGF165)の発現を駆動し、出生後10日目から新しい血管が網膜の深い毛細血管床から発芽し、網膜下腔に向けて成長する、トランスジェニックマウスである。VEGFの産生は、持続し、したがって新しい血管は成長し続け、拡張し、加齢性黄斑変性を有するヒトにおいてみられるものと同様の網膜下腔における大きな網を形成する。Tobe,Takao,et al.”Evolution of neovascularization in mice with overexpression of
vascular endothelial growth factor in photoreceptors.”Investigative ophthalmology & visual science 39.1(1998):180-188を参照。
実施した1つの試験において、ELISAの結果は以下のとおりであった:
Tet/オプシン/VEGFマウスは、飲料水中のドキシサイクリンを与えるまでは正常であるトランスジェニックマウスである。ドキシサイクリンは、非常に高い血管内皮増殖因子(VEGF)の光受容体における発現を誘導し、大規模な血管漏出をもたらし、誘導の4日以内にマウスの80~90%において、全滲出性網膜剥離を現出させる。Ohno-Matsui,Kyoko,et al.”Inducible expression of vascular endothelial growth factor
in adult mice causes severe proliferative retinopathy and retinal detachment.”The American journal of pathology 160.2(2002):711-719を参照。
滲出型AMDの他の動物モデルを使用した。レーザー外傷モデルにおいて、ブルッフ膜において損傷を誘導するために高出力、集束レーザーエネルギーが使用される。マトリゲル、VEGF、マクロファージ、脂質ヒドロペルオキシド、及び/またはポリエチレングリコールの網膜下注射は、滲出型AMDの病態である脈絡膜血管新生(CNV)を誘導する。Pennesi,Mark E.,Martha Neuringer,and R
obert J.Courtney.”Animal models of age related macular degeneration.”Molecular aspects of medicine 33.4(2012):487-509を参照。
この試験は、カニクイザルにおける投与に続いて、抗VEGF Fab(導入遺伝子産物)の発現を評価し、かつ抗VEGF Fabを発現するAAV8ベクターの毒性、免疫原性、及び生体内分布を評価するために実施された。この報告において、導入遺伝子産物の発現及びベクターの免疫原性が記載される。動物は、これらの実施例において記載されるようなAAV2/8.aVEGFベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。前房液及び血液における導入遺伝子産物の発現は、酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)によって測定された。免疫原性は、投与の前後で、AAV8カプシドに対する中和抗体(NAb)の存在によって評価された。導入遺伝子産物は、ベクターを投与された全ての動物の前房液において発現している。導入遺伝子産物は、血液において発現していない。NAbのレベルにおける増加は、1匹のAAV8.aVEGFを投与された動物(C73723)において観察され、この動物は予め存在するNAbを有した。
AAV8カプシドに応答する中和抗体は以下のように分析された。ポリDリシンコーティングされた96ウェル黒色壁/透明底プレートは、1×105細胞/ウェルでヒト胚腎臓293(HEK293)細胞を播種され(細胞プレートと呼ぶ)、プレートを37℃で一晩インキュベートした。次の日に、血清試料を56℃で30分間熱不活化した。熱不活化した試料及び組換えベクター(1×109GC/ウェルの、Penn Vector Core at the University of Pennsylvaniaによって提供されたAAV8.CMV.LacZ)を血清-ベクタープレートを構成するために使用した。組換えベクターを無血清ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で希釈し、2倍系列希釈(1:5で開始)の熱不活化試料と共に37℃で1時間インキュベートした。血清ベクタープレートと細胞プレートとを組み合せる前に、HEK293細胞(ここで2×105細胞/ウェル)を野生型HAdV5(90粒子/細胞)によって感染させ、37℃で2時間インキュベートした。インキュベーションの後、血清-ベクタープレート及び細胞プレートを組み合せて37℃で1時間インキュベートした。インキュベーションの後、等量の20%ウシ胎仔血清(FBS)とDMEMを各々のウェルに添加し、組み合わせたプレートを37℃でさらなる18~22時間培養した。次の日に、組み合わせたプレートをPBSで洗浄し、HEK293細胞を溶解し、製造者の取扱説明書に従って溶解物を、哺乳動物βガラクトシダーゼ生物発光アッセイキットを用いて発色させた。コントロールとして、血清試料の代わりにマウス血清を使用した。生じる発光は、SpectraMax(登録商標)M3マイクロプレートルミノメーターを用いて測定した。生じるNAbの力価は、マウス血清と比較して少なくとも50%ベクターの形質導入を阻害する血清希釈として報告された。
前房液及び血液中の抗VEGF Fab導入遺伝子産物の濃度の平均及び標準偏差の値は、Microsoft Office Excel 2010を用いて計算された。
前房液における抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現
抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、FFB-314を投与された動物の前房液において発現していなかった。抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物の右眼から採取した前房液において発現していた。左眼において発現はまったく観察されなかった。オスとメスの間で抗VEGF Fab導
入遺伝子産物の発現の差異はまったく観察されなかった。
Lucentisの単一のIVT注射を投与されたいくらかの患者において、ラニビズマブが血清で観察された(Xu, Invest Ophthalmol Vis Sci,54:1616-24(2013))。AAV8.aVEGF試験ベクターの網膜下投与が抗VEGF Fab導入遺伝子産物の全身曝露をもたらすかどうかを見極めるために、その血清における濃度を測定した。
AAV8カプシドに対するNAbのベースラインレベルは、0日の試験日で採取した血液試料由来の血清中で測定された。検出限界は1:5希釈であり、5未満の力価を検出不能とみなした。
の臨床病理学的パラメーターが正常範囲にあった。動物C64956及びC74431において肉眼的な所見はまったく存在しなかった。C73723の右腎及び左腎の表面は青白かった。C65027の肝臓において巣状病変が存在した。結論として、主要な毒物学的所見は存在しなかった。
この試験は、カニクイザルにおいて、抗VEGF導入遺伝子産物の発現を評価するため、ならびにAAV2/8.aVEGF及び抗VEGF導入遺伝子産物、及びAAV8.aVEGFの脱落の、毒性、免疫原性、及び正常な網膜機能に対する影響を評価するために実施された。試験は進行中である。
提示される結果は、3ヶ月時点で集められたデータに基づく。この報告において、抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現が記載される。
動物は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。前房液及び血液における抗VEGF導入遺伝子産物の発現は、酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)によって測定され、これは上述の実施例に記載されるように実施された。
(a)前房液における導入遺伝子産物の発現
導入遺伝子産物は、FFB-314を投与されたいずれの動物の前房液においても発現していなかった。導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全
ての動物の前房液において発現していた。発現の始まりは迅速であり、概して7日以内であった。定常発現レベルは1ヶ月以内に達成された。最後に評価された時点まで、全ての動物が定常レベルで導入遺伝子産物を発現し続けた。しかしながら、抗導入遺伝子産物の全体の発現レベルは、1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターを投与された動物においてより高かった。オスとメスの間で導入遺伝子産物の発現の差異はまったく観察されなかった。
Lucentisの単一のIVT注射を投与されたいくらかの患者において。ラニビズマブが血清で観察された(Xu,Invest Ophthalmol Vis Sci.2013 Mar 5,54(3):1616-24)。これらの実施例において記載されるAAV2/8.aVEGF試験ベクターの網膜下投与が抗VEGF Fab導入遺伝子産物の全身曝露をもたらすかどうかを見極めるために、その血清における濃度を測定した。抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物の血液において、対応する注射前のレベルと比較して、非特異的なバックグランドレベル未満であった。
抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物の前房液において発現していた。
この報告において、AAV2/8.aVEGF試験ベクターの毒性の評価が記載される。動物は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。毒性は、臨床観察、体重、眼圧、間接眼底検査、スペクトル領域光干渉断層写真術、血液学、凝固、臨床化学、及び肉眼病理所見、及び病理組織学的所見に基づいて評価された。
このサブパートにおいて、AAV8.aVEGF試験ベクター及び抗VEGF Fab導入遺伝子産物の正常な網膜機能に対する影響の評価が記載される。動物は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。網膜機能は、全視野網膜電図(ERG)によって評価された。全視野ERGは、広く使用される網膜機能の電気生理学試験である。網膜電図は、光刺激に応答する網膜によって生成される集合電位である。通常、それは、角膜表面と接触する電極によって記録される。この試験における網膜電図は、国際臨床視覚電気生理学会(ISCEV;McCulloch, Doc Ophthalmol. 2015 Feb;130(1):1-12. 2015)が設定した推奨に従って実施された。提示される結果は、3ヶ月時点で集められたデータに基づく。この報告において、AAV8.aVEGF試験ベクター及び抗VEGF Fab導入遺伝子産物の正常な網膜機能に対する影響の評価が記載される。動物は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。網膜機能は、全視野網膜電図によって評価された。要約すると、1.00×1010ゲノムコピー(GC)/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターの投与は網膜機能を損なわない。対照的に、1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターの投与は網膜機能を損なう。
網膜電図(ERG)は、通常、全網膜細胞がフラッシュ刺激(暗順応の動物、中程度から強烈な閃光)に対し能動的な応答であるときに生成する。2つの構成要素は以下のものである:
・a波:フラッシュ後の最初の角膜陰性シグナル。起源:光受容体光電流、光受容体機能の最も直接的な特徴。
・b波:大部分がオン型双極細胞(光受容体下流の二次ニューロン)によって生成されるa波の後に続く角膜陽性シグナル。
この試験において、国際臨床視覚電気生理学会(ISCEV)に従う標準及び追加プロトコールが使用された:
・暗順応桿状体のERG:刺激強度:0.01~0.02cd s m-2。応答:b波のみ、a波はなし。源:桿状体「オン型」双極細胞(桿状体からの入力に駆動される二次ニューロン)。意味:桿状体機能の測定。データシートにおける称号:「薄暗いフラッシュ」
・暗順応標準的なフラッシュERG:刺激強度:3cd s m-2。応答:桿体錐体のa波とb波の混合;60%~70%のシグナルは、桿状体駆動経路によって生成される。源:光受容体、桿状体と錐体の両方(a波);桿状体と錐体の両方によって駆動される高次ニューロン。意味:大部分の桿状体の機能の測定、暗順応の状態に対して感度が低く、「薄暗いフラッシュ」応答よりも低い可変性である。データシートにおける称号:「標準的なフラッシュ」。
・暗順応明るいフラッシュERG:刺激強度:10cd s m-2。応答及び意味:「標準的なフラッシュ」の応答についてと同一であるが、明るいフラッシュへの応答は、規模がより大きく、より可変性が低くあり得る。データシートにおける称号:「明るいフラッシュ」
・明順応標準的なフラッシュ錐体ERG:刺激強度:5分間の明順応の後、30cd m-2のバックグランド光の存在下で送達される3cd s m-2。応答:錐体駆動経路によって生成されるa波及びb波。意味:錐体を完全に非感光性にするバックグランド光の存在下で、ERGが錐体及び錐体駆動二次網膜ニューロンによって排他的に作成され、錐体の機能を測定する。データシートにおける称号:「標準的な錐体ERG」
・明順応明るいフラッシュ錐体ERG(ISCEV標準に対して追加して)刺激強度:5分間の明順応の後、30cd m-2のバックグランド光の存在下で送達される10c
d s m-2。応答及び意味:錐体駆動ERGは「標準的な錐体ERG」の場合のようであったが、より大きな規模であり、潜在的により低い可変性である。
抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物において発現した(この実施例のパートAの薬理学的結果を参照)。AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314の投与に続いて3か月の網膜機能(注射後)を、処理された眼及び未処理の眼について投与前(注射前)の網膜機能と比較した。群8の動物は、FFB-314の投与後の取得できないERGのためにデータ分析から排除された。
処理した眼について、注射後の網膜機能は、低用量群(1.00×1010GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクター)とFFB-314群との動物間で同等であった(先行する表を参照)。処理した眼について、高用量群(1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクター)の動物における注射後の網膜機能は、FFB-314群の動物と比較して有意に低減していた(先行する表を参照)。処理した眼について、高用量群の動物における注射後の網膜機能は、低用量群の動物と比較して有意に低減していた(先行する表を参照)。未処理の眼について、注射後の網膜機能は、全ての群について、注射前と同等であった。
処理した眼について、低用量群及びFFB-314群において、注射後の網膜機能は、対応する注射前のベースラインと同等であった。処理した眼について、高用量群において、注射後の網膜機能は、対応する注射前のベースラインと比較して低減していた。未処理の眼について、注射後の網膜機能は、対応する注射前のベースラインと同等であった。
AAV8.aVEGF試験ベクターの脱落は、涙、鼻分泌物、血清、唾液、尿、及び糞便の試料中で導入遺伝子特異的配列を標的とする定量的PCR解析によって測定された。試料は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314の投与の前後で採取された。AAV8.aVEGF試験ベクターDNAは、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された動物から採取された多くの試料において容易に検出可能であった。AAV8.aVEGFのDNAの存在は、用量依存的であり、一過性であり、経時的に低下した。
この試験において、AAV8.aVEGF試験ベクター及び抗VEGF Fab導入遺伝子産物の免疫原性が記載される。免疫原性は以下によって評価された:
・酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)を用いる、抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するIgM及びIgG抗体の存在;
・NAbアッセイを用いるAAV8カプシドに対する中和抗体(NAb)の存在;
・酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイを用いる、AAV8.aVEGF試験ベクター及び抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するT細胞応答。
抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物において発現した(実施例6)。FFB-314を投与された動物の血清または前房液において抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するIgMは多くは存在しなかった。ベースラインレベルを超える抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するIgGは、FFB-314を投与された動物において観察されなかった。
この試験は、AAV2/8ベクターの網膜下投与に続く、実施例3、実施例5、及び実
施例6からの組織を用いて、AAV2/8ベクターのmRNAの網膜の分布及び抗VEGF Fabの眼全体にわたる分布を評価するために実施された。網膜の異なる部分におけるmRNAのレベルは、定量的逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応及びインサイチューハイブリダイゼーションによって評価された。抗VEGF Fabの濃度は、網膜の切片、前房液、及び硝子体液において酵素結合免疫吸着検査法によって測定された。
AAV8.aVEGF試験ベクターのmRNAは、FFB-314を投与された動物の網膜において検出されなかった。AAV8.aVEGF試験ベクターのmRNAは、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物の網膜において検出された。網膜下注射の部位を含む網膜の切片において最も高いmRNAのレベルが検出された。しかしながら、AAV8.aVEGF試験ベクターのmRNAは、注射ブレブの外側の切片においても検出された。これらの切片のmRNAレベルは、ブレブにおけるものよりも低かった。レベルは、注射ブレブに対して最も辺縁のセクションにおいて4logまで低かった。注射ブレブにすぐ隣接する切片において、mRNAのレベルは中間であった。
ISHによって決定されるAAV2/8ベクターのmRNAの発現は、注射部位で高かった。網膜層内の形質導入された細胞は、RPE細胞、光受容体、及び神経節細胞を含んだ。注射部位から離れるとき、mRNAの発現は低く、注射部位から最も遠位の領域においてほとんど完全に消失した。
抗VEGF Fabは、AAV2/8ベクターを投与された全ての動物の眼の網膜、硝子体、及び硝子体において発現していた(図6~8)。硝子体における発現は、前房液おけるものよりも3~9倍高かった。群5(図8)において1匹の動物(C65873)を除いて、網膜部分における最大発現は、硝子体におけるものよりも1.2~3.6倍高か
った。この濃度勾配は、恐らく抗VEGF Fabの分布のメカニズムを反映している。抗VEGF Fabは、形質導入された網膜によって硝子体に分泌され、次いで、硝子体から前房液へと分散する。注目すべきことは、抗VEGF Fabの網膜全体にわたっての発現は、mRNAの発現よりも均一である。
この試験は、抗VEGF Fab重鎖及び軽鎖の産物の組換えヒトVEGFに対する結合の親和性を測定するために実施された。結合親和性は、表面プラズモン共鳴(SPR)技術に基づくBiacore 3000システムを用いて測定された。この技術は、全内部反射の条件下でセンサーチップに当たる平面偏光に基づいている。センサーチップ上の固相化したリガンド(例えばVEGF)と相互作用する分子(例えば抗VEGF Fab導入遺伝子産物)との相互作用は、平面偏光の反射率における変化を引き起こす。この変化は、リアルタイムでセンサーグラムによって、応答単位としてすぐに検出される(Daghestani,Theory and applications of surface plasmon resonance,resonant mirror,resonant waveguide grating,and dual polarization interferometry biosensors.Sensors(Basel).2010;10(11): 9630-46.)。抗VEGF導入遺伝子産物の結合のための平衡結合親和定数は、ラニビズマブの公開された範囲と一致する。
この試験の目的は、ヒト組織の選択されたパネル由来の組織学的に調製された凍結切片と共に免疫組織化学技術を用いて、スポンサーに提供された抗体FabフラグメントaVEGF導入遺伝子産物の可能性のある交差反応性を評価することであった。
がまったく観察されなかった。
単一の網膜下投与の利点を提供し、それによって繰り返し注射の負担を低減するrAAV8.aVEGFベクターがさらなる試験のために選択された。6ヶ月をこえて継続するNHPにおける抗VEGF Fabの発現及びrAAV8.aVEGFベクターで処理されたWANDの動物モデルにおける血管新生の低減が、前臨床試験において実証されてきており、網膜下注射の安全性が非ヒト霊長類において評価される。最初の臨床治験は、上述されるようなrAAV8.aVEGF試験ベクターの単一の網膜下注射の後の安全性及び導入遺伝子の発現を評価する。網膜下に注射されると、これらのベクターは、抗VEGF Fab遺伝子産物を放出し続け、血管新生シグナルを阻止し、それによって網膜をさらなる損傷から防御すると予想される。
処置後6週、24週、6ヶ月及び12ヶ月の眼及び非眼の安全性評価
・106週間を超える眼及び非眼の安全性
・水性rAAV8.aVEGFタンパク質の経時的なベースラインからの平均変化
・BCVAの経時的なベースラインからの平均変化
・26週、54週、及び106週でのBCVAによるベースラインと比較して15文字以上を獲得または喪失する対象の割合
・SD-OCTによって測定されるときのCRTの経時的なベースラインからの平均変化・ラニビズマブ救援注射の経時的な平均数
・1回目の救援ラニビズマブ注射までの時間
・経時的な、CNV及び損傷サイズならびにFAに基づく漏出領域におけるベースラインからの平均変化
・免疫原性測定(AAV8に対するNAb、AAV8に対する結合抗体、aVEGFタンパク質に対する抗体、及び酵素結合免疫スポット[ELISpot])。
・血清及び尿におけるベクター脱落分析
・眼底自発蛍光(FAF)による地図状萎縮領域における経時的なベースラインからの平均変化、FAFによる地図状萎縮の新しい領域の発生(ベースラインにおいて地図状萎縮がまったくない対象において)
・BCVAによるベースラインと比較してそれぞれ10文字以上を獲得または喪失する対象の割合
・前年と比較して救援注射における50%の低減を有する対象の割合
・SD-OCTにおいてまったく液体を有さない対象の割合
組み入れ基準:
この研究に参加する資格を得るためには、対象は以下の基準の全てを満たす必要がある。1つ以上のこれらの基準はさらなる試験、及び他の集団の治療のために必要とされない
場合があることは理解されよう。
1.50歳以上の男性もしくは女性;
2.各用量コホートのセンチネル対象は、試験する眼において20/100以下かつ20/400以上のBCVA(65以下かつ35以上のETDRS文字)を有する必要がある;
センチネル対象の評価に続いて、用量コホートにおける残りの対象は、20/63以下かつ20/400以上のBCVA(75以下かつ35以上のETDRS文字)を有する必要がある。
3.両方の眼が適格である場合において、研究者に決定されるとき、試験する眼は対象のより悪い目である必要がある。
4.試験する眼においてAMDに続発する中心窩下CNVの確定診断を有する必要がある。
a.以下の:10ディスク領域未満である必要のある損傷サイズ(典型的なディスク領域は2.54mm2)、損傷サイズの50%未満の血液、及び/または瘢痕のようなCNVの損傷特性。
5.来院1の8ヶ月(または未満)前に、試験する眼においてnAMDの治療のための抗VEGF剤の少なくとも4回の硝子体内注射を投薬され、SD-OCT上において確認された解剖学上の応答を有する必要がある。
6.試験する眼において来院1の時点でSD-OCT上において実証された網膜下もしくは網膜内液の存在を有する必要がある。
7.試験する眼において偽性(白内障手術後の状態)である必要がある。
8.全ての試験処置に従うことを自発的に受け入れることができ、試験の期間中対応可能でなければならない。
9.妊娠の可能性のある女性は、スクリーニング来院の時点で陰性の尿の妊娠検査を有するべきであり、8日目までに陰性の血清の結果を有するべきであり、試験中に追加の妊娠検査をする意思があるべきである。
10.性的に活発な対象(女性と男性の両方)は、スクリーニング来院からベクター投与後24週間まで、医学的に許容可能なバリアー避妊法(例えば、コンドーム、ペッサリー、または禁欲)を使用する意思があるべきである。この時点以降の避妊の停止は、主治医と話し合うべきである。
11.署名された書面によるインフォームドコンセントを提供する意思と能力があるべきである。
以下の除外基準のいずれかに合致する対象は試験に参加する資格がない。これらの基準のいずれかまたは全ては、さらなる試験、及び他の患者集団の治療では含まれない場合があることは理解されよう。
1.AMD以外の任意の要因に続発する試験する眼におけるCNVまたは黄斑浮腫。
2.試験する眼において、血液がAMD損傷の50%以上を占めるか、または血液が1.0mm2を超えて中心窩の下に存在する。
3.試験する眼におけるVAの改善を阻止する任意の状態、例えば、線維症、萎縮、または中心窩の中心における網膜上皮裂孔。
4.試験する眼における活動性の高い網膜剥離または網膜剥離の病歴。
5.試験する眼における進行した緑内障。
6.研究者の意見において、試験する眼における対象のリスクを増加させる可能性があるか、試験期間中に視力喪失を阻止または治療する医学的または外科的介入のいずれかを必要とする可能性があるか、または処置または評価の試験と干渉する可能性のある任意の状態。
7.スクリーニング来院の前の12週間以内に試験する眼における眼内手術の履歴。スクリーニング来院の前の10週間を超えて実施される場合、イットリウム・アルミニウム・
ガーネットの嚢切開は容認される。
8.スクリーニング前の6ヶ月以内に試験する眼における硝子体内療法、例えば硝子体内ステロイド注射、または抗VEGF療法以外の治験薬の履歴。
9.スクリーニング時の試験する眼におけるインプラントの存在(眼内レンズを除外する)
10.スクリーニング前の5年以内に化学療法及び/または放射線を必要とする悪性腫瘍の病歴。局在する基底細胞癌は容認される。
11.登録30日以内または治験薬の半減期の5倍のいずれか長い方の期間内にいずれかの治験薬を投薬される。
12.他のいずれかの遺伝子療法試験への参加。
13.網膜毒性を引き起こすことの知られている治療法、または視力に影響を及ぼし得るかもしくは既知の網膜毒性を有する任意の薬物との併用療法、例えばクロロキンまたはヒドロキシクロロキンの履歴。
14.試験する眼における外科手技と干渉し得る眼または眼周囲の感染;
15.過去6ヶ月間における心筋梗塞、脳血管障害、または一過性虚血発作。
16.最大限の治療にもかかわらず制御不能の高血圧(180mmHgを超える収縮期血圧[BP]、100mmHgを超える拡張期血圧)。
17.研究者の意見における、眼の外科手術または治癒過程を妨げ得る任意の付随する治療。
18.ラニビズマブもしくはその任意の成分に対する既知の過敏性またはrAAV8.aVEFG試験ベクターに類似する剤に対する(研究者の意見における)過去の過敏性。
19.研究者の意見における、被験者の安全性または試験への成功裏の参加を損なうであろう任意の重篤なまたは不安定な医学的または心理的状態。
来院2において、対象は、ラニビズマブに対する最初の抗VEGF応答について評価される。対象はSD-OCTとBCVAの両方を受け、それは、研究者によって来院1の値と比較される。
1.応答性(対象は試験を継続する):応答性は、SD-OCTによる、50ミクロンを超えるCRTの低減、または液体における30%を超える改善によって定義される。
2.非応答性(対象は早期撤退として試験から出る):非応答性は、上述の基準に合致しないとして定義される。各々のコホートにおいて6までの対象のさらなる対象が登録され続け、単一用量のrAAV8.aVEFG試験ベクターを投薬される。
この来院の時点において、中央検査室の結果がレビューされる。以下の値を有する全ての対象は撤退する:
3.正常上限(ULN)の2.5倍を超えるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)/アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)。
4.対象が以前に知られているギルバート症候群の病歴を有していない限りULNの1.5倍を超える総ビリルビン、及び結合ビリルビンが総ビリルビンの35%未満であることを示す分画したビリルビン。
5.ULNの1.5倍を超えるプロトロンビン時間(PT)。
6.男性の対象について10g/dL未満のヘモグロビン、女性の対象について9g/dL未満のヘモグロビン;
7. 100×103/μL未満の血小板;
8. 30mL/分/1.73m2未満の推定糸球体ろ過率(GFR)。
ポートの経毛様体扁平部硝子体切除術を含み、網膜下カニューレ(36~41ゲージ)による網膜下腔への単一の網膜下投与が後に続く。100~150マイクロリットルのrAAV8.aVEGFが送達される。患者は3、4、または5の用量の1を投薬される。3つの用量レベル:3×109ゲノムコピー(GC)/眼、1×1010GC/眼、及び6×1010GC/眼。疾患活動性について以下の1以上の救援基準が適用される場合、rAAV8.aVEGF試験ベクターの投与後4週間から開始して、対象は試験する眼において、硝子体内ラニビズマブ救援治療を投薬され得る。スペクトル領域光干渉断層写真術(SD-OCT)上での網膜液の蓄積と関連する(最良矯正視力[BCVA]当たり)5文字以上の視力喪失。SD-OCT上での新規または持続する、網膜下または網膜内液の、脈絡膜血管新生(CNV)と関連した上昇。新規の眼の出血。
このフェーズI、非盲検、多重コホート、用量段階的増加試験は、予め治療された血管新生AMD(nAMD)を有する対象におけるrAAV8.aVEGF遺伝子療法の安全性及び忍容性を評価するよう設計される。これらの用量は約18の対象において試験される。選択/除外基準に合致し、最初の抗VEGF注射に対する解剖学的な応答性を有する対象は、網膜下送達によって投与される単一用量のrAAV8.aVEGFを投薬される。rAAV8.aVEGFは、VEGFに結合してVEGF活性を中和するモノクローナル抗体フラグメントをコードする遺伝子を含むAAV8ベクターを使用する。安全性は、rAAV8.aVEGF投与後の最初の24週間(最初の試験期間)を最初の焦点とする。ある実施形態において、試験は抗VEGF抗体、例えばラニビズマブを投与することを含み、応答性はSD-OCTによって1週目(来院2)において測定される。抗VEGF抗体投与後、この治療に応答性である患者に対して、rAAV8.aVEGFを来院3(2週目)に投与でき、次いで安全性は、26週(rAAV8.aVEGF投与後24週)を通じて評価される。最初の試験期間の完了に続き、対象はrAAV8.aVEGFによる投与に続く104週まで評価され続ける。
8.aVEGFのベクター及び導入遺伝子に対する免疫原性が、試験期間にわたって評価される。
主要評価項目測定:
1.安全性:26週間を超えての、眼の有害事象(AE)及び非眼の重篤な有害事象(SAE)の発生
2.安全性:106週間を超えての、眼及び非眼のAE及びSAEの発生。
3. 106週間を超えての最良矯正視力(BCVA)における変化。
4. 106週間を超えての、SD-OCTによって測定されるときの中心網膜厚(CRT)における変化。
5.救援注射:106週間を超えての救援注射の平均数。
6. 106週間を超えてのFAによって測定されるときの、脈絡膜血管新生及び損傷サイズにおける変化ならびに漏出領域CNVの変化。
1.以前に硝子体内抗VEGF療法を受けている試験する眼におけるAMDに続発する中心窩下CNVの診断を有する50歳以上の患者。選択された患者集団は、性別に基づかない(男性及び女性が含まれる)。
2.各々のコホートの最初の患者に対して20/100以下、かつ20/400以上の間のBCVA(65以下、かつ35以上の糖尿病網膜症の早期治療研究[ETDRS]文字)、続いてコホートの残りに対して、20/63以下、かつ20/400以上の間のBCVA(75以下、かつ35以上のETDRS文字)。
3.抗VEGF療法の必要性及び応答の履歴。
4.試験登録時の抗VEGFに対する応答性(1週目(来院2)においてSD-OCTによって評価される)
5.試験する眼において偽性(白内障手術後の状態)である必要がある。
6.正常上限(ULN)の2.5倍未満のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)/アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT);ULNの1.5倍未満の総ビリルビン(TB);ULNの1.5倍未満のプロトロンビン時間(PT);10g/dLを超えるヘモグロビン(Hb)(男性)、9g/dLを超えるヘモグロビン(女性);100×103/μLを超える血小板;30mL/分/1.73m2を超える推定糸球体ろ過率(eGFR)
7.署名された書面によるインフォームドコンセントを提供する意思と能力があるべきである。
1.AMD以外の任意の要因に続発する試験する眼におけるCNVまたは黄斑浮腫。
2.試験する眼における視力の改善を阻止する任意の状態、例えば、線維症、萎縮、または中心窩の中心における網膜上皮裂孔。
3.試験する眼における活動性の高い網膜剥離または網膜剥離の病歴。
4.試験する眼における進行した緑内障。
5.スクリーニング前の6ヶ月以内に試験する眼における硝子体内療法、例えば硝子体内ステロイド注射、または抗VEGF療法以外の治験薬の履歴。
6.スクリーニング時の試験する眼におけるインプラントの存在(眼内レンズを除外する)
7.過去6ヶ月間における心筋梗塞、脳血管障害、または一過性虚血発作。
8.最大限の治療にもかかわらず制御不能の高血圧(180mmHgを超える収縮期血圧[BP]、100mmHgを超える拡張期血圧)。
A.製造プロセスの記載
細胞播種:正規のヒト胚腎臓293細胞株が作製プロセスのために使用される。ベクター作製に使用される細胞培養は、単一の解凍したMCBバイアルから開始し、マスターバッチ記録文書(MBR)に従って拡張する。細胞はCorningのT-フラスコ及びCS-10を用いて5×109~5×1010の細胞まで拡張し、これは、BDSロットごとのベクター作製のための50までのHS-36への播種を生成するのに十分な細胞量をもたらす。細胞は、10%のガンマ線照射した、米国起源の、ウシ胎仔血清(FBS)で補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)からなる培地で培養する。細胞は、足場依存性であり、細胞解離は動物由来成分不含の細胞解離試薬であるTrypLE(商標)Selectを用いて達成される。細胞播種は、滅菌、単回使用の、使い捨てバイオプロセスバッグ及びチューブセットを用いて達成される。細胞は、37℃(±2℃)で、5%(±0.5%)CO2空気中に維持される。
れる。これは浄化産物の適度な精製をもたらすが、後に続くアフィニティーカラムクロマトグラフィーステップと適合する緩衝液交換をも達成する。したがって、100kDaのPES膜が濃縮に使用され、次いで、20mMのTris pH 7.5及び400mMのNaClからなる緩衝液の最小で4の透析容量で透析ろ過がされる。透析ろ過された産物は、4℃において一晩保存され、次いで、1.2/0.22μmのデプスフィルターカプセルを用いて浄化され、全ての沈殿した物質を除去する。
pH6.3を含むチューブに画分を回収する。適切なピーク画分を回収し、ピーク面積を評価し、適切なベクター収量決定のための以前のデータと比較する。
無菌性及び静菌性/真菌性:この手順は、試料マトリックスがアッセイの阻害を引き起こさないことを確実にするために、米国薬局方(USP)<71>に従って1回行われる。試験に含まれるのは適合性試験である。
(CPE)の観察及び血球吸着である。
された関連性のないDNAの回復に基づいて標準化される。
患者への投与の最中のDP喪失の評価を可能にする。送達装置を通過した後の製剤の活性を評価するために、平行した試験もまた同様の方法で実施した。この目的のためにインビトロラニビズマブ発現に基づく効力検定が使用される。
Claims (5)
- AAV8カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)であって、前記rAAVが、前記カプシド内にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、5’AAV-2末端逆位配列(ITR)、配列番号14の連続するヌクレオチド198~3733から成る発現カセット、及び3’AAV-2末端逆位配列(ITR)を含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)。
- 網膜下及び/または網膜内注射に好適な液体懸濁液であって、前記液体懸濁液が、水性液体及び請求項1に記載の組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を含み、任意に1種以上の賦形剤、保存剤、及び/または界面活性剤を含む、前記液体懸濁液。
- (a)請求項1に記載のrAAV及び水性液体を含む第1の容器と、(b)任意に希釈剤を含む第2の容器と、(c)注射のための針とを含む、製品。
- 前記懸濁液が、約1×1011ゲノムコピー(GC)/mL~約1×1013GC/mLのrAAVを含む、請求項2に記載の懸濁液。
- 懸濁液の容量が、約10μL~約300μLである、請求項2に記載の懸濁液。
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