JP2024016207A - 滲出型加齢性黄斑変性の治療のための組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】網膜内注射に好適であるAAV8カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を提供する。【解決手段】rAAVは、カプシドにパッケージングされたベクターゲノムを含み、それは、抗ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)抗原結合抗体フラグメント(aVEGF)の発現を誘導する制御因子に作動可能に連結され、aVEGFのコード配列を含み、コード配列は、眼内で抗VEGF Fabの発現を誘導する制御因子に作動可能に連結される。これらのrAAV8.aVEGFを含む液体懸濁液、ならびに滲出型AMD及び他の眼の障害の治療のためのそれの使用方法もまた提供される。【選択図】図1
Description
加齢性黄斑変性(AMD)は、最も高い視力(VA)の領域、すなわち黄斑を攻撃する進行性に変性する黄斑疾患であり、60歳以上の米国人における失明の主な原因である(NIH Medline Plus (2008), Leading cause of blindness, NIH Medline Plus 3(2)14-15、www.nlm.nih.gov/medlineplus/magazine/issues/summer08/articles/summer08pg14-15.html)。新生血管の「滲出」型の疾患(nAMDまたはwet AMD)は、網膜色素上皮(RPE)のものを含む血管及び細胞の増殖が顕著である、脈絡膜血管新生を特徴とする(Carmeliet (2005) Nature 438: 932-936)。最終的に、光受容体の死滅及び瘢痕形成が、中心視力の重篤な喪失をもたらし、かつ、読むこと、書くこと、及び顔を認識すること、または運転することが不可能になる。多くの患者は、もはや有給の雇用を維持できなくなり、日常活動を行えなくなり、結果として、減衰した生活の質を申告する(Mitchell and Bradley (2006), Health Qual Life Outcomes 4: 97)。予防的治療法はほとんど効果を示さず、治療戦略は主に血管新生病変の治療に焦点を当ててきている。
いくつかの現在使用可能な滲出型AMDの治療は、レーザー光凝固術、ベルテポルフィンによる光線力学的治療、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、またはアフリベルセプトなどの血管内皮増殖因子(VEGF)阻害剤の硝子体内(IVT)注射を含む(Schmidt-Erfurth, (2014) Guidelines for the management of neovascular age-related
macular degeneration by the European Society of Retina Specialists (EURETINA) Br J Ophthalmol 98:1144-1167)。これらの治療は、最良矯正視力(BCVA)に対していくらかの効果を有するが、それらの効果は、視力の回復及び期間において限定的である(Schmidt-Erfurth、上に引用される、2014, AAO PPP (2015) Preferred Practice Patterns: Age Related Macular Degeneration. American Academy of Ophthalmology)。
macular degeneration by the European Society of Retina Specialists (EURETINA) Br J Ophthalmol 98:1144-1167)。これらの治療は、最良矯正視力(BCVA)に対していくらかの効果を有するが、それらの効果は、視力の回復及び期間において限定的である(Schmidt-Erfurth、上に引用される、2014, AAO PPP (2015) Preferred Practice Patterns: Age Related Macular Degeneration. American Academy of Ophthalmology)。
市場における、滲出型AMDを治療するのに使用されるいくつかの薬物は、VEGFを阻害するメカニズムに依存し、硝子体内注射する必要がある。これらの治療は、疾患の進行を防ぐ点において成功することが報告されるが、それらは、薬物の頻繁な注射を必要とする。
具体的には、組換えヒト化モノクローナルIgG1抗原結合フラグメント(Fab)であるラニビズマブは、ヒト(VEGF)の全ての活性型に結合し阻害するよう設計されている。ラニビズマブは、組換えDNA技術によってEscherichia coli中で産生されるヒト化モノクローナル抗体フラグメントである。ラニビズマブのVEGF-Aに対する結合は、VEGF-Aと、その受容体である内皮細胞表面上のVEGFR-1及びVEGFR-2との相互作用を阻止する。この結合は、その全てが新生血管の「滲出」型の加齢性黄斑変性(Wet AMD)の進行に寄与すると考えられている、内皮細胞増殖及び血管新生、ならびに血管漏出を阻害する。ラニビズマブ(Lucentis(登録商標))の安全性及び有効性は、確立されてきており、ラニビズマブは、血管新生AMD、及び他の網膜疾患を有する患者におけるIVT注射治療について米国(US)食品医
薬品局(FDA)が承認するものである(2006年に最初にFDAが承認する)。毎月のラニビズマブまたは毎月/8週ごとのアフリベルセプトのいずれかによる長期間の治療は、視力喪失の進行を遅らせ、かつ視力を改善する場合があるが、これらの治療のいずれも血管新生の再帰を阻止しない(Brown et al (2006)N Engl J Med,355:1432-44;Rosenfeld et al.,(2006)N Engl J Med 355:1419 31;Schmidt-Erfurth,2014,上に引用される)。疾患の悪化を阻止するために、各々は再度投与する必要がある。繰り返し治療への必要性は、患者に追加リスクが発生する可能性があり、患者と臨床医との両方にとって不便である。
薬品局(FDA)が承認するものである(2006年に最初にFDAが承認する)。毎月のラニビズマブまたは毎月/8週ごとのアフリベルセプトのいずれかによる長期間の治療は、視力喪失の進行を遅らせ、かつ視力を改善する場合があるが、これらの治療のいずれも血管新生の再帰を阻止しない(Brown et al (2006)N Engl J Med,355:1432-44;Rosenfeld et al.,(2006)N Engl J Med 355:1419 31;Schmidt-Erfurth,2014,上に引用される)。疾患の悪化を阻止するために、各々は再度投与する必要がある。繰り返し治療への必要性は、患者に追加リスクが発生する可能性があり、患者と臨床医との両方にとって不便である。
一態様において、本発明は、網膜下及び/または網膜内の注射に好適なAAV8カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス(rAVV)を提供する。AAV8カプシドは、ヒト血管内皮増殖因子(hVEGF)に結合し、阻害するヒトモノクローナル抗体(MAb)の可溶性抗原結合フラグメント(Fab)の産生を提供するベクターゲノムをパッケージングし、発現産物は、しばしば「抗hVEGF Fab」または「aVEGF」と本明細書において呼ばれる。
ある実施形態では、ヒト対象における網膜下注射に適した液体懸濁液を提供する。当該懸濁液は、水性液体、及び、AAV8カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を含み、当該rAAVは、当該カプシド内にパッケージングされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは:(a)AAVの末端逆位配列(ITR);(b)抗ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)抗原結合抗体フラグメント(Fab)のためのコード配列であって、外来性リーダー配列、免疫グロブリン重鎖、リンカー、及び、外来性リーダー配列を有する免疫グロブリン軽鎖を有するコード配列であって、当該コード配列は、眼内における当該抗VEGF Fabの発現を誘導する制御因子へと作動可能に連結されている;(c)当該抗VEGF Fabの当該免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の発現を誘導し、トリベータ-アクチンプロモーター、または、ユビキチンCプロモーターより選択されるプロモーターを含む、制御因子;及び(d)AAVのITRを含み、当該懸濁液が、6.2×1011ゲノムコピー(GC)/mL、または、1×1012GC/mLの当該rAAVを含む。特定の実施形態では、当該懸濁液は、6.4×1011GC/mLのrAAV8.aVEGFを含む。加齢性黄斑変性症を有するヒトを治療するためのこれらの組成物の使用も提供する。特定の実施形態では、当該患者に、1.6×1011GCのrAAV8.aVEGF/治療眼を投与する。特定の実施形態では、当該患者に、1×1011GCのrAAV8.aVEGF/治療眼を投与する。
rAAV8カプシド中にパッケージングされるベクターゲノムは以下を含む:
(a)抗hVEGF Fabの発現コンストラクトに隣接する、AAVの末端逆位配列(複数可)(ITR(複数可));(b)抗hVEGF Fabをコードする導入遺伝子の眼における発現を導くトリβアクチンプロモーターまたはユビキチンCプロモーターを含む制御性因子を有する発現コンストラクト;ならびに(c)抗hVEGF Fabの重鎖及び軽鎖をコードする導入遺伝子であって、各々の鎖がそのアミノ末端へと付加された異種性リーダー配列を有し、ここで重鎖及び軽鎖のコード配列が、重鎖及び軽鎖のポリペプチドの別個の産生を確かにするために、「切断可能」なペプチドリンカーのコード配列またはIRES(配列内リボソーム進入部位)によって分離されており、ポリアデニル化シグナルを有する、導入遺伝子。生じる導入遺伝子発現産物は、Fab重鎖に通常見出されるものに加えて、アミノ酸残基を含んでもよい。
(a)抗hVEGF Fabの発現コンストラクトに隣接する、AAVの末端逆位配列(複数可)(ITR(複数可));(b)抗hVEGF Fabをコードする導入遺伝子の眼における発現を導くトリβアクチンプロモーターまたはユビキチンCプロモーターを含む制御性因子を有する発現コンストラクト;ならびに(c)抗hVEGF Fabの重鎖及び軽鎖をコードする導入遺伝子であって、各々の鎖がそのアミノ末端へと付加された異種性リーダー配列を有し、ここで重鎖及び軽鎖のコード配列が、重鎖及び軽鎖のポリペプチドの別個の産生を確かにするために、「切断可能」なペプチドリンカーのコード配列またはIRES(配列内リボソーム進入部位)によって分離されており、ポリアデニル化シグナルを有する、導入遺伝子。生じる導入遺伝子発現産物は、Fab重鎖に通常見出されるものに加えて、アミノ酸残基を含んでもよい。
特定の実施形態では、ヒト細胞における発現に最適化される、重鎖及び軽鎖のコドン配
列が使用される。例に示すように、これらは、AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv1.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv2.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv3.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv4.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv5.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv6.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv7.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv8.rBG;AAV2/8.CB7.CI.VEGFv9.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv10.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv11.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv12.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv13.rBGを含み得るが、これらに限定されない。
列が使用される。例に示すように、これらは、AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv1.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv2.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv3.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv4.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv5.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv6.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv7.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv8.rBG;AAV2/8.CB7.CI.VEGFv9.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv10.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv11.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv12.rBG;AAV2/8.CB7.CI.aVEGFv13.rBGを含み得るが、これらに限定されない。
本明細書において使用されるとき、「AAV2/8」及び「AAV8」は、AAV8カプシド及びAAV2のITRに隣接されるベクターゲノムを有する組換えAAVを指すのに交換可能に使用される。
さらに別の態様において、網膜下及び/または網膜内の注射のための上述のrAAV8.aVEGFのあらゆる液体懸濁液が提供される。組成物は、水性液体及び本明細書に記載のようなrAAV8.aVEGF、ならびに任意選択で1種以上のビヒクル、保存剤、及び/または界面活性剤を含む。
なおもさらなる態様において、滲出型加齢性黄斑変性を有する患者に対して抗hVEGF Fabを送達するための方法が提供される。方法は、抗hVEGF Fab(すなわち、rAAV8.抗hVEGF Fab、または、rAAV8.aVEGF)の発現コンストラクトを担持するrAAV8ベクターを含む液体懸濁液を患者の眼に網膜下注射することを含む。
ある実施形態では、本発明は、患者に網膜下投与することのできる本明細書に記載されるようなrAAV、または液体懸濁液を提供する。ある実施形態では、患者への網膜下投与のためのrAAVまたは液体懸濁液の使用が提供される。患者は、滲出型加齢性黄斑変性または本明細書で定義されるような他の眼の状態を有すると以前に診断されていてもよい。
なおもさらなる実施形態では、製品は以下を含む:(a)rAAV8.抗hVEGF Fab及び水性液体を含む第1の容器、(b)希釈剤を含む任意の第2の容器、ならびに(c)注射のための針。ある実施形態では、製品は注射キットである。
本発明は、rAAV8.aVEGFベクターの網膜下投与が、網膜全体にわたる遺伝子導入をもたらし、かつ網膜全体にわたる、ならびに硝子体及び前房液中における抗VEGF Fabの発現をもたらすことを実証する以下の例によって示される。遺伝子導入が元の注射ブレブの外側を水平方向に拡散するが、それらの拡張された境界に閉じ込められたままであり、この注射の拡張領域(網膜中の注射部位において形成される「ブレブ」)の外側における遺伝子導入及び導入遺伝子発現を達成しなかったということを実証する従来技術の遺伝子療法の研究を考慮すると、この結果は驚くべきであり、rAAV8.aVEGFベクターの単一投与が(i)結果として、経時的に消散するVEGF阻害剤の高用量ボーラスの繰り返されるIVT投与と比較して性能が向上し得るような網膜全体にわたるVEGF阻害剤の有効量の連続送達、ならびに(ii)患者に追加のリスク及び不便さを提示する繰り返される眼内注射の回避をもたらす点において、新生型AMD(nAMD)治療のための標準治療を超える利点をもたらす。各々の態様は、治療成績を改善し得る。
さらに他の態様及び本発明の利点は、以下の本発明の詳細な説明から明らかであろう。
AAV8カプシドを有する組換え複製欠損アデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター及びそれを含む組成物は、抗VEGF抗体結合フラグメント(Fab)を送達するための網膜下注射に好適である。それ、及び特に液体水性懸濁液を含む組成物もまた提供される。特定の実施形態では、当該懸濁液は、6.2×1011ゲノムコピー(GC)/mLのrAAV8.aVEGFを含む。特定の実施形態では、当該懸濁液は、または、1×1012GC/mLのrAAV8.aVEGFを含む。特定の実施形態では、当該懸濁液は、6.4×1011GC/mLのrAAV8.aVEGFを含む。それらの組成物の使用もまた提供される。特定の実施形態では、患者は、1.6×1011GCのrAAV8.aVEGF/治療眼の投与を受ける。特定の実施形態では、患者は、1×1011GCのrAAV8.aVEGF/治療眼の投与を受ける。
rAAV8ベクターは、哺乳動物において、より詳細にヒト細胞において、抗VEGF抗体結合フラグメント(Fab)を発現するよう設計される。これらの抗VEGF Fabは、加齢性黄斑変性(AMD)の治療に特によく適している。便宜上、これらのベクターをrAAV8.AMDと呼ぶ。本明細書に記載のように、高い収量、発現レベル、及び/または活性を実証している一連の新規のAAV8.aVEGFコンストラクトが開発されてきている。
本発明は、rAAV8.aVEGFベクターの網膜下投与が、網膜全体にわたる遺伝子導入をもたらし、かつ網膜全体にわたる、ならびに硝子体及び前房液中における抗VEGF Fabの発現をもたらすことを実証する以下の例によって示される。遺伝子導入が元の注射ブレブの外側を水平方向に拡散するが、それらの拡張された境界に閉じ込められたままであり、この注射の拡張領域(網膜中の注射部位において形成される「ブレブ」)の外側における遺伝子導入及び導入遺伝子発現を達成しなかったということを実証する従来技術の遺伝子療法の研究を考慮すると、この結果は驚くべきであり、rAAV8.aVEGFベクターの単一投与が(i)結果として、経時的に消散するVEGF阻害剤の高用量ボーラスの繰り返されるIVT投与と比較して性能が向上し得るような網膜全体にわたるVEGF阻害剤の有効量の連続送達、ならびに(ii)患者に追加のリスク及び不便さを提示する繰り返される眼内注射の回避をもたらす点において、nAMD治療のための標準治療を超える利点をもたらす。各々の態様は、治療成績を改善し得る。
本発明は、少なくとも配列番号1の重鎖アミノ酸配列及び配列番号2の軽鎖アミノ酸配列を有し、その各々が、重鎖及び軽鎖の各々に対する外来性リーダー配列を有するよう改変されている、新規の抗VEGF Fabをコードするコンストラクトを提供する。本明細書において示されるあるコンストラクトにおいて、リーダー配列は、ヒトIL2リーダー由来である。さらに、実施例において示されるあるコンストラクトにおいて、重鎖及び軽鎖は、フリン/F2aリンカーによって分離され、これは、重鎖[配列番号1]に対して付加される1つ以上の追加のアミノ酸をもたらす可能性がある。ある実施形態では、単一のアルギニン[R]が重鎖に付加される。しかしながら、ある実施形態では、別のリンカーが選択されるか、及び/または異なるシステムが追加のアミノ酸をまったくもたらさないか、もしくは1つ以上の追加のアミノ酸をもたらす[例えば、とりわけ、R、Lys(K)、RK、RKR、RKRR]。以前の仮出願において、生じるコンストラクトが明細書においてaVEGF-Rと名付けられた。しかしながら、明確性のために、本明細書に記載される抗VEGF Fab導入遺伝子産物をコードするこれらのコンストラクトを、抗VEGF Fab、aVEGF、抗hVEGF、抗ヒトVEGF、または抗VEGF
Fab導入遺伝子産物と呼ぶ。この導入遺伝子産物をコードするコンストラクトにおいて、用語aVEGFに続く数字表示、例えばaVEGFv1、aVEGFv2、aVEGFv3からaVEGFv13までは、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のオープンリーディングフレームのための配列をコードする異なる核酸を指す。
Fab導入遺伝子産物と呼ぶ。この導入遺伝子産物をコードするコンストラクトにおいて、用語aVEGFに続く数字表示、例えばaVEGFv1、aVEGFv2、aVEGFv3からaVEGFv13までは、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のオープンリーディングフレームのための配列をコードする異なる核酸を指す。
ある実施形態では、抗VEGF Fabのアミノ酸配列は、513アミノ酸を有し、抗VEGFは、リンカーの結果として追加のアミノ酸によって分離された重鎖及び軽鎖を含む。例えば、以下の発現カセットの各々は、同一の抗VEGFの重鎖及び軽鎖をコードするが、一実施形態において重鎖の最後の位置に付加される1つのアミノ酸が存在し得る。さらに他の実施形態では、重鎖に結合する2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の追加のアミノ酸が存在し得る。例えば、ある実施形態では、抗VEGF Fabの重鎖及び軽鎖をコードする核酸配列は、自己切断フリン(F)/F2Aリンカーによって分離されている。アルギニン-リジン-アルギニン-アルギニンのアミノ酸配列からなるフリン認識部位が使用されてもよい。フリン媒介性切断のメカニズムのために、ベクターが発現する抗VEGF Fabは、重鎖[配列番号1]の最後の位置に付加される追加のアルギニン(R)残基を含み得る。他の実施形態では、ベクターが発現する抗VEGF Fabは、重鎖の終端にジペプチド、アルギニン-リジン、重鎖の終端にトリペプチド、アルギニン-リジン-アルギニン、または重鎖の終端にポリペプチド、アルギニン-リジン-アルギニン-アルギニンを含み得る。ある実施形態では、ベクターが発現する抗VEGF Fabは、2つ以上のこれらのFab産物の異種性の混合物である。他のフリン切断部位(アルギニン-X-X-アルギニン、またはアルギニン-X-リジン、またはアルギニン-アルギニン)もまた使用でき、これはまたC末端の不均一性を生じ得る。換言すると、他のベク
ターが発現する抗VEGF Fabは、リンカー処理の結果として、重鎖がそのC末端に0、1つ、2つ、3つ、または4つのアミノ酸を有する、Fabの異質性の集合であり得る。さらに、軽鎖及び重鎖の各々は、宿主細胞の機構によって成熟タンパク質からリーダーペプチドを処理して除去する適切な細胞分画へと新生ペプチドを誘導する、異種性リーダーペプチドを含む。さらにその他の実施形態では、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上のさらなるアミノ酸が存在し得る。ある実施形態では、抗VEGF Fabは、HCまたはLCのリーダー配列をまったく含まない。例えば、配列番号33を参照されたい。
ターが発現する抗VEGF Fabは、リンカー処理の結果として、重鎖がそのC末端に0、1つ、2つ、3つ、または4つのアミノ酸を有する、Fabの異質性の集合であり得る。さらに、軽鎖及び重鎖の各々は、宿主細胞の機構によって成熟タンパク質からリーダーペプチドを処理して除去する適切な細胞分画へと新生ペプチドを誘導する、異種性リーダーペプチドを含む。さらにその他の実施形態では、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上のさらなるアミノ酸が存在し得る。ある実施形態では、抗VEGF Fabは、HCまたはLCのリーダー配列をまったく含まない。例えば、配列番号33を参照されたい。
ある実施形態では、抗VEGF Fabの重鎖は、リーダー配列と共に配列番号33の残基21~252のアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗VEGF Fabの軽鎖は、リーダー配列と共に配列番号33の残基300~513のアミノ酸配列を有する。例えば、リーダー配列は、約15~約25のアミノ酸、好ましくは約20のアミノ酸であってよい。ある実施形態では、リーダーは、配列番号33のアミノ酸1~20の配列を有する。
ある実施形態では、抗VEGFv1の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号24に提示される。より詳細には、配列番号24を参照して、重鎖可変領域のオープンリーディングフレーム(ORF)がヌクレオチド(nt)1843~2211に提示され、重鎖定常領域(CH1)のORFがnt2212~2532に提示される。したがって、リーダーを含まないaVEGFv1の重鎖は、nt1843~2532の核酸配列を有する。軽鎖可変領域(VL)のORFが配列番号24のnt2680~3000に提示され、軽鎖定常領域(CL)が配列番号24のnt3001~3321に提示される。したがって、リーダーを含まないaVEGFv2の軽鎖は、配列番号24のnt2680~3321の核酸配列を有する。
別の実施形態では、抗VEGFv2の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号3に提示される。より詳細には、VHのORFが配列番号3のnt2059~2427に提示され、CH1が配列番号3のnt2428~2748に提示され、リーダーを含まない重鎖が配列番号3のnt2059~2748の核酸配列を有する。VLのORFが配列番号3のnt2896~3216に提示されCLが配列番号3のnt3217~3536に提示され、リーダーを含まない軽鎖が配列番号3のnt2896~3536の核酸配列を有する。
さらに別の実施形態では、aVEGFv3の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号19に提示される。VHのORFが配列番号19のnt1842~2210に提示され、CH1が配列番号19のnt2211~2531に提示され、リーダーを含まない重鎖が配列番号19のnt1842~2531の核酸配列を有する。VLのORFが配列番号19のnt2679~2999に提示され、CLが配列番号19のnt3000~3320に提示され、リーダーを含まない軽鎖が配列番号19のnt2670~3320の核酸配列を有する。
さらなる実施形態では、aVEGFv4の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号35に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号35のnt1993~2052にコードされ、VHのORFが配列番号35のnt2053~2421にあり、CH1が配列番号35のnt2422~2742にある。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、F2A切断部位の配置の結果として、追加のアミノ酸をコードする配列がVH鎖に残り得る。軽鎖のリーダー配列が配列番号35のnt2830~2889にコードされ、VLのORFが配列番号35のnt2890~3210に提示され、CLのORFが配列番号35のnt3211~3531に位置する。
さらなる実施形態では、aVEGFv5の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号36に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号36のnt1993~2052にコードされ、VHのORFが配列番号36のnt2053~2421にコードされ、CH1が配列番号36のnt2422~2742にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、F2A切断部位の配置の結果として、追加のアミノ酸をコードする配列がVH鎖に残り得る。軽鎖のリーダー配列が配列番号36のnt2830~2889にコードされ、VLのORFが配列番号36のnt2890~3210に提示され、CLのORFが配列番号36のnt3211~3531に位置する。
さらなる実施形態では、aVEGFv6の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号37に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号37のnt1993~2051にコードされ、VHのORFが配列番号37のnt2053~2421にコードされ、CH1が配列番号37のnt2422~2742にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、F2A切断部位の配置の結果として、追加のアミノ酸をコードする配列がVH鎖に残り得る。軽鎖のリーダー配列が配列番号37のnt2830~2889にコードされ、VLのORFが配列番号37のnt2890~3210に提示され、CLのORFが配列番号37のnt3211~3531に位置する。
さらなる実施形態では、aVEGFv7の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号38に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号38のnt1993~2052にコードされ、VHのORFが配列番号38のnt2053~2421にコードされ、CH1が配列番号38のnt2422~2742にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、F2A切断部位の配置の結果として、追加のArgのコドンがVH鎖に残る。軽鎖のリーダー配列が配列番号38のnt2830~2889にコードされ、VLのORFが配列番号38のnt2890~3210に提示され、CLのORFが配列番号38のnt3211~3531に位置する。
さらなる実施形態では、aVEGFv8の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号39に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号39のnt1993~2052にコードされ、VHのORFが配列番号39のnt205~2421にコードされ、CH1が配列番号39のnt2422~2742にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、F2A切断部位の配置の結果として、追加のArgのコドンがVH鎖に残る。軽鎖のリーダー配列が配列番号39のnt2830~2889にコードされ、VLのORFが配列番号39のnt2890~3210に提示され、CLのORFが配列番号39のnt3211~3531に位置する。
さらなる実施形態では、aVEGFv9の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号40に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号40のnt1999~2058にコードされ、VHのORFが配列番号40のnt2059~2427にコードされ、CH1が配列番号40のnt2428~2748にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、F2A切断部位の配置の結果として、追加のArgのコドンがVH鎖に残る。軽鎖のリーダー配列が配列番号40のnt2836~2895にコードされ、VLのORFが配列番号40のnt2896~3216に提示され、CLのORFが配列番号40のnt3217~3637に位置する。
さらなる実施形態では、aVEGFv10の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号41に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号41のnt1993~2052にコードされ、VHのORFが配列番号41のnt2053~2421にコードされ、CH1が配列番号41のnt2422~2742にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、F2A切断部位の配置の結果として、追加のArgのコドンが
VH鎖に残る。軽鎖のリーダー配列が配列番号41のnt2830~2889にコードされ、VLのORFが配列番号41のnt2890~3210に提示され、CLのORFが配列番号41のnt3211~3231に位置する。
VH鎖に残る。軽鎖のリーダー配列が配列番号41のnt2830~2889にコードされ、VLのORFが配列番号41のnt2890~3210に提示され、CLのORFが配列番号41のnt3211~3231に位置する。
さらなる実施形態では、aVEGFv11の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号42に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号42のnt1993~2052にコードされ、VHのORFが配列番号42のnt2053~2421にコードされ、CH1が配列番号42のnt2422~2742にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、F2A切断部位が重鎖の終端と軽鎖の先頭の間に配置される。軽鎖のリーダー配列が配列番号42のnt2830~2889にコードされ、VLのORFが配列番号42のnt2890~3210に提示され、CLのORFが配列番号42のnt3211~3531に位置する。
さらなる実施形態では、aVEGFv12の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号43に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号43のnt1993~2052にコードされ、VHのORFが配列番号43のnt2053~2421にコードされ、CH1が配列番号43のnt2422~2742にコードされる。軽鎖のリーダー配列が配列番号43のnt2830~2889にコードされ、VLのORFが配列番号43のnt2890~3210に提示され、CLのORFが配列番号43のnt3211~3531に位置する。
さらなる実施形態では、aVEGFv13の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号44に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号44のnt1993~2052にコードされ、VHのORFが配列番号44のnt2053~2421にコードされ、CH1が配列番号44のnt2422~2742にコードされる。軽鎖のリーダー配列が配列番号44のnt2830~2889にコードされ、VLのORFが配列番号44のnt2890~3210であり、CLのORFが配列番号44のnt3211~3531に位置する。
ラニビズマブは、本明細書において陽性コントロールとして記載され、現在、Lucentis(登録商標)の商品名で市販されている。それは、組換えヒト化モノクローナル抗体rhuMAb血管内皮増殖因子(VEGF)の高親和性バージョンのFab部分として記載されている。それは、そのC末端において、231残基の重鎖のN末端部分へとジスルフィド結合により連結している214残基の軽鎖からなる。重鎖及び軽鎖の予測されるアミノ酸配列は、配列番号1及び2に提示される。CAS番号347396-82-1。
本明細書において使用されるとき、「免疫グロブリンドメイン」は、通常の全長の抗体を参照して定義されるような抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。より詳細には、全長の抗体は、4つのドメイン:1つのN末端可変(VH)領域、及び3つのC末端定常(CH1、CH2、及びCH3)領域を含む重(H)鎖ポリペプチド、ならびに2つのドメイン:1つのN末端可変(VL)領域、及び1つのC末端定常(CL)領域を含む軽(L)鎖ポリペプチドを含む。Fc領域は2つのドメイン(CH2-CH3)を含み得る。Fab領域は、重鎖と軽鎖の各々についての1つの定常ドメイン及び1つの可変ドメインを含む。
ある実施形態では、rAAV.aVEGFベクターは、AAV8カプシドと、AAV8に対して異種性の少なくとも1つの要素を含むそこにパッケージングされるベクターゲノムとを有する。ある実施形態では、ベクターゲノムは、5’から3’に、(a)AAVの5’ITR、(b)エンハンサー、(c)プロモーター、(d)イントロン、(e)リーダー配列及び抗VEGF重鎖コード配列、(f)フリン-F2aリンカー、(g)リーダ
ー配列及び抗VEGF軽鎖コード配列、(h)ポリAシグナル、ならびに(i)AAVの3’ITRを含む。
ー配列及び抗VEGF軽鎖コード配列、(h)ポリAシグナル、ならびに(i)AAVの3’ITRを含む。
ある実施形態では、抗VEGF Fabの重鎖及び軽鎖の処理は、ヒトIL2タンパク質由来のリーダーペプチドによって誘導される。ある実施形態では、リーダー配列はインターロイキン(IL)IL-2のリーダー配列であり、それは野生型ヒトIL2MYRMQLLSCIALSLALVTNS[配列番号29]、またはMYRMQLLLLIALSLALVTNS[配列番号30]もしくはMRMQLLLLIALSLALVTNS[配列番号31]のような変異したリーダーであってよい。別の実施形態では、ヒトセルピンF1の分泌シグナルがリーダーペプチドとして使用され得る。他のリーダー配列、または重鎖及び軽鎖にとって外来性である他のリーダーを使用することができる。
ベクターゲノムの以下の記載において使用されるとき、軽鎖または重鎖として他が指定されていない限り、コード配列(例えば、aVEGFv2)に対する言及は、抗VEGFの重鎖-フリン/F2aリンカー-抗VEGFの軽鎖を包含する。ある実施形態では、フリン認識部位、アルギニン-リジン-アルギニン-アルギニンをコードする核酸配列が選択される。ある実施形態では、FMDV(GenBank番号CAA2436.1)に由来する24アミノ酸ペプチドであるF2Aリンカーをコードする核酸が選択される。しかしながら、所望なら、例えば脳心筋炎ウイルス(EMCV)に由来するようなIRES配列:配列番号32:[TATGCTAGTACGTCTCTCAAGGATAAGTAAGTAATATTAAGGTACGGGAGGTATTGGACAGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGTACTAACATACGCTCTCCATCAAAACAAAACGAAACAAAACAAACTAGCAAAATAGGCTGTCCCCAGTGCAAGTGCAGGTGCCAGAACATTTCTCTGGCCTAACTGGCCGGTACCTGAGCTCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCCTCGAGGATATCAAGATCTGGCCTCGGCGGCCAG]、cMyc[Nanbru C, et al (1997). J. Biol. Chem. 272, 32061-32066;Stoneley M, et al., (1998). Oncogene 16, 423-428.]、または口蹄疫(FMD)に由来するものが選択され得る。
AAV2に由来する末端逆位配列(ITR)が選択され得る。そのカプシドとは異なる供給源に由来するITRを有するベクターは、「偽型」と呼ばれる。ある実施形態では、AAV2とは異なる供給源に由来するITRを、別の偽型AAVを生成するためにこのコンストラクトについて選択され得る。代替的に、カプシドと同一の供給源に由来するITRが選択され得る。ある実施形態では、以下に定義されるような自己相補型AAVを生成するようにITRが選択され得る。
ある実施形態では、プロモーターはCB7、すなわち、サイトメガロウイルス(CMV)最初期エンハンサー(C4)とトリβアクチンプロモーターとのハイブリッドである。他の実施形態では、プロモーターはユビキチンC(UbC)プロモーターである。例えばWO2001/091800を参照されたい。例えば、GenBank(登録商標)受託番号AF232305(ラット)及びD63791(ヒト)をそれぞれ参照されたい。さらに他のプロモーター及び/またはエンハンサーが選択され得る。例えば、サイトメガロウイルス(CMV)最初期エンハンサー(260bp、C4、GenBank番号K03104.1)、トリβアクチンプロモーター(281bp、CB、GenBank番号X00182.1)を参照されたい。さらに他の実施形態では、多重エンハンサー及び/またはプロモーターが含まれ得る。
ある実施形態では、イントロンが含まれる。1つの好適なイントロンはトリβアクチンのイントロンである。ある実施形態では、イントロンは875bp(GenBank番号X00182.1)である。別の実施形態では、Promegaより入手可能なキメライントロンが使用される。しかしながら、他の好適なイントロンも選択され得る。
本明細書に記載のベクターゲノムは、ポリアデニル化シグナル(polyA)を含む。様々な好適なpolyAが公知である。一例において、polyAは、127bpのウサギβグロビンポリアデニル化シグナル(GenBank番号V00882.1)のようなウサギβグロビンである。他の実施形態では、SV40polyAシグナルが選択される。さらに他の好適なpolyA配列も選択され得る。任意に、例えば、UTR配列またはコザック配列を含み得る他の好適なベクター因子が選択され得る。
ある実施形態では、ベクターゲノムはITR-CB7-CI-aVEGFv2-rBG-ITR[配列番号3]を含む。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ITR-UbC-CI-aVEGFv2-SV40-ITR[配列番号9]を含む。一実施形態においてベクターゲノムはITR-CB7-CI-aVEGFv3-rBG-ITR[配列番号14]を含む。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ITR-UbC-PI-aVEGFv3-SV40-ITR[配列番号19]を含む。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ITR-UbC-PI-aVEGFv1-SV40-ITR[配列番号24]を含む。さらなる実施形態では、ベクターゲノムはAAV2-ITR-CB7.CI.aVEGFv4.rBG-AAV2 ITR[配列番号35]を含む。さらなる実施形態では、ベクターゲノムはAAV2-ITR-CB7.CI.aVEGFv5.rBG-AAV2 ITR[配列番号36]を含む。さらなる実施形態では、ベクターゲノムはAAV2-ITR-CB7.CI.aVEGFv6.rBG-AAV2 ITR[配列番号37]を含む。さらなる実施形態では、ベクターゲノムはAAV2-ITR-CB7.CI.aVEGFv7.rBG-AAV2 ITR[配列番号38]を含む。さらなる実施形態では、ベクターゲノムはAAV2-ITR-CB7.CI.aVEGFv8.rBG-AAV2 ITR[配列番号39]を含む。さらなる実施形態では、ベクターゲノムはAAV2-ITR-CB7.CI.aVEGFv9.rBG-AAV2 ITR[配列番号40]を含む。さらなる実施形態では、ベクターゲノムはAAV2-ITR-CB7.CI.aVEGFv10.rBG-AAV2 ITR[配列番号41]を含む。さらなる実施形態では、ベクターゲノムはAAV2-ITR-CB7.CI.aVEGFv11.rBG-AAV2 ITR[配列番号42]を含む。さらなる実施形態では、ベクターゲノムはAAV2-ITR-CB7.CI.aVEGFv12.rBG-AAV2 ITR[配列番号43]を含む。さらなる実施形態では、ベクターゲノムはAAV2 ITR-CB7.CI.aVEGFv13.rBG-AAV2 ITR[配列番号44を参照されたい]を含む。さらなる実施形態では、ベクターゲノムはAAV2 ITR-CMV.PI.aVEGFv7.eCMVIres.aVEGF.SV40-AAV2 ITR[配列番号45]を含む。別の施形態において、ベクターゲノムはAAV2 ITR.CMV.PI.aVEGF.FMDV1IRES.SV40-ITR[配列番号46]を含む。なおもさらなる実施形態では、ベクターゲノムはAAV2 ITR.CMV.PI.aVEGF.cMycIRES.Fab.SV40-ITR[配列番号47]を含む。
AAVウイルスベクター(例えば、組換え(r)AAV)の作製における使用のために、発現カセットを、パッケージング宿主細胞へと送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミド上に担持し得る。本発明において有用なプラスミドは、原核細胞、哺乳動物細胞、またはその両方において複製及びパッケージングするのに好適なように改変し得る。好適なトランスフェクション技術及びパッケージング宿主細胞は、当業者に公知であり、及び/または当業者によって容易に設計できる。
ベクターとしての使用に好適なAAVの生成及び単離のための方法は、当該技術分野において公知である。概して、例えばGrieger & Samulski, 2005,”Adeno-associated virus as a gene therapy vector:Vector development,production and clinical applications,”Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.99:119-145;Buning et al.,2008,”Recent developments in adeno-associated virus vector technology,”J.Gene Med.10:717-733;及び、以下に引用する参考文献を参照でき、本明細書の一部を構成するものとして、その各々の全内容を援用する。導入遺伝子のビリオンへのパッケージングのために、ITRは、発現カセットを含む核酸分子と同一のコンストラクトにおいて、シスで必要とされる唯一のAAVの構成要素である。cap遺伝子及びrep遺伝子は、トランスで供給できる。
ある実施形態では、本明細書に記載の発現カセットは、ウイルスベクター産生のためにそこに担持する免疫グロブリンコンストラクト配列をパッケージング宿主細胞へと導入する遺伝因子(例えば、シャトルプラスミド)に入るよう操作される。ある実施形態では、選択される遺伝因子は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速DNA被覆ペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってAAVパッケージング細胞へと送達され得る。安定的なAAVパッケージング細胞もまた作製できる。代替的に、AAV以外のウイルスベクターを作製するために、またはインビトロにおいて抗体の混合物を作製するために、発現カセットを使用することもできる。そのようなコンストラクトを作製するのに使用される方法は、核酸操作における当業者に公知であり、遺伝子操作、組換え技術、及び合成技術を含む。例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ed.Green and Sambrook,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(2012)を参照されたい。
本明細書において使用されるとき、「AAV8カプシド」は、NCBI参照配列:NC_006261.1(配列番号49)の核酸配列にコードされるGenBank受託番号:YP_077180(配列番号48)のアミノ酸配列を有するAAV8カプシドを指し、その両方は参照により本明細書に組み込まれる。このコードされた配列のいくらかの変異は本発明によって包含され、これは、GenBank受託:YP_077180、米国特許第7,282,199号、同第7,790,449号、同第8,319,480号、同第8,962,330号、US8,962,332における参照アミノ酸配列に対して約99%の同一性を有する配列(すなわち、参照配列から約1%未満の変異)を含み得る。別の実施形態では、AAV8カプシドは、参照により本明細書に組み込まれるWO2014/124282に記載されるAAV8バリアントのVP1配列を有し得る。カプシド、コード配列の生成方法、したがって、rAAVウイルスベクターの作製方法は、これまでに記載されている。例えば、Gao,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(10),6081-6086(2003)、US2013/0045186A1、及びWO2014/124282を参照されたい。ある実施形態では、所望の標的細胞、例えば光受容体、RPE、または他の眼細胞に対する指向性を示すAAV8バリアントが選択される。例えば、AAV8カプシドは、参照により本明細書に組み込まれるKay et al,Targeting Photoreceptors
via Intravitreal Delivery Using Novel,Capsid-Mutated AAV Vectors,PLoS One.2013;8(4):e62097.Published online 2013 Apr 26
に記載されるような、Y447F、Y733F、及びT494V変異(「AAV8(C&G+T494V)」及び「rep2-cap8(Y447F+733F+T494V)」とも呼ばれる)を有し得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれるMowat et al,Tyrosine capsid-mutant AAV vectors for gene delivery to the canine retina from a subretinal or intravitreal approach,Gene Therapy 21,96-105(January 2014)を参照されたい。別の実施形態では、AAVカプシドは、AAV8カプシドであり、優先的に双極細胞を標的とする。参照により本明細書に組み込まれるWO2014/024282を参照されたい。
via Intravitreal Delivery Using Novel,Capsid-Mutated AAV Vectors,PLoS One.2013;8(4):e62097.Published online 2013 Apr 26
に記載されるような、Y447F、Y733F、及びT494V変異(「AAV8(C&G+T494V)」及び「rep2-cap8(Y447F+733F+T494V)」とも呼ばれる)を有し得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれるMowat et al,Tyrosine capsid-mutant AAV vectors for gene delivery to the canine retina from a subretinal or intravitreal approach,Gene Therapy 21,96-105(January 2014)を参照されたい。別の実施形態では、AAVカプシドは、AAV8カプシドであり、優先的に双極細胞を標的とする。参照により本明細書に組み込まれるWO2014/024282を参照されたい。
本明細書において使用されるとき、用語「NAb力価」は、その標的のエピトープ(例えばAAV)の生理学的効果を中和する中和抗体(例えば抗AAV Nab)がどれだけ産生されたかを測定するものである。抗AAV NAb力価は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるCalcedo,R.,et al.,Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses.Journal of Infectious Diseases,2009.199(3):p.381-390において記載されるように測定され得る。
アミノ酸配列の文脈における用語「パーセント(%)同一性」、「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、または「パーセント同一」は、一致についてアラインメントするときに同一である2つの配列中の残基を指す。タンパク質、ポリペプチド、約32アミノ酸、約330アミノ酸の全長、もしくはそれらのペプチドフラグメントのアミノ酸配列、または配列をコードする対応する核酸配列について、パーセント同一性は容易に決定できる。好適なアミノ酸フラグメントは、少なくとも8アミノ酸の長さであり得、約700アミノ酸までであり得る。一般的に、2つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」を指すとき、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、アラインメントされた配列を参照にして決定される。「アラインメントされた」配列または「アラインメント」は、参照配列と比較して、欠損または追加の塩基またはアミノ酸の修正をしばしば含む多重の核酸配列またはタンパク質(アミノ酸)配列を指す。アラインメントは、任意の様々な公的または商業的に利用可能な多重配列アラインメントプログラムを用いて実施する。例えば、「Clustal Omega」、「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」、及び「Match-Box」のプログラムのような配列アラインメントプログラムが、アミノ酸配列について利用可能である。一般的に、これらのあらゆるプログラムが、デフォールトの設定で利用されるが、当業者は必要に応じてこれらの設定を変えることができる。代替的に、当業者は、参照されるアルゴリズム及びプログラムによって提供されるもののレベルの同一性またはアラインメントを少なくとも提供する、別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを使用することができる。例えば、J.D.Thomson et al,Nucl.Acids.Res.,“A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”,27(13):2682-2690(1999)を参照されたい。本明細書において使用されるとき、用語「作動可能に連結」は、対象の遺伝子と隣接する発現制御配列と、トランスまたは遠位において対象の遺伝子を制御するように作用する発現制御配列との両方を指す。
「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、対象の遺伝子を含む発現カセットがウイルスカプシドまたはエンベロープにパッケージングされている合成または人工のウイルス粒子であって、ここで同様にウイルスカプシドまたはエンベロープにパッケージ
ングされている任意のウイルスゲノム配列が複製欠損である、すなわちそれらが子孫ビリオンを生成することができないが、標的細胞に感染する能力を残しているものを指す。ある実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まないが(ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに隣接された対象の導入遺伝子のみを含む「弱いもの」であるように改変され得る)、これらの遺伝子は作製の間供給され得る。したがって、子孫ビリオンによる複製及び感染が、複製に必要なウイルス酵素の存在下を除いて起こらないので、それは遺伝子療法における使用について安全であるとみなされる。
ングされている任意のウイルスゲノム配列が複製欠損である、すなわちそれらが子孫ビリオンを生成することができないが、標的細胞に感染する能力を残しているものを指す。ある実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まないが(ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに隣接された対象の導入遺伝子のみを含む「弱いもの」であるように改変され得る)、これらの遺伝子は作製の間供給され得る。したがって、子孫ビリオンによる複製及び感染が、複製に必要なウイルス酵素の存在下を除いて起こらないので、それは遺伝子療法における使用について安全であるとみなされる。
略語「sc」は、自己相補型を指す。「自己相補型AAV」は、組換えAAV核酸配列によって担持されるコード領域が、分子内二重鎖DNAテンプレートを形成するように設計されている発現カセットを有するプラスミドまたはベクターを指す。感染の際、第2の鎖の細胞媒介性合成を待つよりもむしろ、scAAVの2つの相補的な半分は、直接の複製及び転写の準備ができるまで、1つの二重鎖DNA(dsDNA)を形成するよう会合する。例えば、D M McCarty et al,“Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis”,Gene Therapy,(August 2001),Vol 8,Number 16,Pages 1248-1254を参照されたい。自己相補型AAVは、例えば米国特許第6,596,535号、同第7,125,717号、及び同第7,456,683号に記載され、その各々は参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
タンパク質または核酸を参照して使用されるとき、用語「異種性」は、タンパク質または核酸が、自然において、互いに対して同一の関係が見出されない2つ以上の配列または亜配列を含むことを示す。例えば、新規の機能の核酸を作製するよう配置される無関係の遺伝子からの2つ以上の配列を有する核酸が、典型的に組換えて作製される。例えば、ある実施形態では、核酸が、他の遺伝子からのコード配列の発現を誘導するよう配置される1つの遺伝子からのプロモーターを有する。したがって、コード配列を基準にして、プロモーターは異種性である。
タンパク質または核酸配列を参照して使用するとき、用語「外来性」は、異なる源、例えばAAV及びヒトタンパク質に由来する2つ以上の配列または亜配列を指す。
用語「a」または「an」が、1つ以上を指すことは注意されたい。そのようなとき、用語「a」(または「an」)、「1つ以上」、及び「少なくとも1つ」は、本明細書において交換可能に使用される。
単語「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、及び「含んでいる(comprising)」は、排他的ではなく包含的に解釈されるべきである。単語「からなる(consist)」、「からなる(consisting)」及びその変形は、包含的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書における様々な実施形態が、他の状況において「含む(comprising)」という言葉を用いて提示されるが、関連する実施形態はまた、「からなる(consisting of)」または「本質的に~からなる(consisting essentially of)」という言葉を用いて解釈され、記載される。
本明細書において使用されるとき、用語「約」は、他が特定されない限り、与えられる基準からの10%の可変性を意味する。
本明細書において他が特定されない限り、本明細書において使用される技術的及び科学的な用語は、当業者によって、及び本願において使用される用語の多くについての一般的な解説を当業者に提供する出版された文献を参照することによって、通常理解されるのと同一の意味を有する。
rAAV8.aVEGF製剤
rAAV8.aVEGF製剤は、水性溶液に懸濁された有効量のrAAV8.aVEGFベクターを含む懸濁液である。ある実施形態では、懸濁液は、任意に、界面活性剤及び/または他のビヒクルと共に、緩衝食塩水を含む。緩衝食塩水は、典型的には、生理学的に適合可能な塩または塩の混合物を含み、例えばリン酸緩衝生理食塩水、塩化ナトリウム、またはそれらの混合物である。
rAAV8.aVEGF製剤は、水性溶液に懸濁された有効量のrAAV8.aVEGFベクターを含む懸濁液である。ある実施形態では、懸濁液は、任意に、界面活性剤及び/または他のビヒクルと共に、緩衝食塩水を含む。緩衝食塩水は、典型的には、生理学的に適合可能な塩または塩の混合物を含み、例えばリン酸緩衝生理食塩水、塩化ナトリウム、またはそれらの混合物である。
ある実施形態では、製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるM.Lock
et al,Hu Gene Therapy Methods,Hum Gene Ther Methods 2014 Apr;25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014 Feb 14に記載されるように、oqPCRまたはデジタル液滴PCR(ddPCR)によって測定されるとき、例えば、約1×108GC/眼~約7×1012GC/眼、または約5×109GC/眼~約1×1011GC/眼、または約1010GC/眼または約を含み得る。
et al,Hu Gene Therapy Methods,Hum Gene Ther Methods 2014 Apr;25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014 Feb 14に記載されるように、oqPCRまたはデジタル液滴PCR(ddPCR)によって測定されるとき、例えば、約1×108GC/眼~約7×1012GC/眼、または約5×109GC/眼~約1×1011GC/眼、または約1010GC/眼または約を含み得る。
例えば、本明細書において提供されるとき、懸濁液はNaClとKClとの両方を含み得る。pHは、6.5~8または7.2~7.6の範囲であり得る。pHは、任意の好適な方法、例えば、USP<791>[米国薬局方協会、参照標準]を用いて評価できる。好適な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせは、ポロキサマー、すなわち、2つのポリオキシエチレン(ポリ(酸化エチレン)の親水性鎖に隣接されるポリオキシプロピレン(ポリ(酸化プロピレン))の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、SOLUTOL HS 15(マクロゴール-15ヒドロキシステアラート)、LABRASOL(ポリオキシカプリル酸グリセリド)、ポリオキシ10オレイルエーテル、TWEEN(ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル)、エタノール、及びポリエチレングリコールの中から選択できる。ある実施形態では、製剤はポロキサマーを含む。これらのコポリマーは、3桁の数字が後に続く字「P」(ポロキサマーに対して)によって一般的に名付けられ、最初の2桁×100は、ポリオキシプロピレンコアのおよその分子量をもたらし、最後の1桁×10は、ポリオキシエチレン含量のパーセンテージをもたらす。ある実施形態では、ポロキサマー188が選択される。界面活性剤は、懸濁液の約0.0005%~約0.001%までの量で存在し得る。ある実施形態では、rAAV8.aVEGF製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるM.Lock et al,Hu Gene Therapy Methods,Hum Gene Ther
Methods 2014 Apr;25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014 Feb 14に記載されるように、oqPCRまたはデジタル液滴PCR(ddPCR)によって測定されるとき、少なくとも1×1011またはそれ以上のゲノムコピー(GC)/mL、例えば約1×1013GC/mLを含む懸濁液である。ある実施形態では、ベクターは、180mMの塩化ナトリウム、10mMのリン酸ナトリウム、0.001%のポリオキサマー188を含むpH7.3の水性溶液中に懸濁される。製剤は、ヒト対象における使用に好適であり、網膜下に投与される。
Methods 2014 Apr;25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014 Feb 14に記載されるように、oqPCRまたはデジタル液滴PCR(ddPCR)によって測定されるとき、少なくとも1×1011またはそれ以上のゲノムコピー(GC)/mL、例えば約1×1013GC/mLを含む懸濁液である。ある実施形態では、ベクターは、180mMの塩化ナトリウム、10mMのリン酸ナトリウム、0.001%のポリオキサマー188を含むpH7.3の水性溶液中に懸濁される。製剤は、ヒト対象における使用に好適であり、網膜下に投与される。
空のカプシドが、患者に投与されるAAV8.aVEGFの用量から除去されることを確実にするために、ベクター精製プロセスの間に、空のカプシドをベクター粒子から分離する。ある実施形態では、パッケージングされたゲノムを含むベクター粒子は、参照により本明細書に組み込まれる、2016年12月9日に出願された国際特許出願第PCT/
US16/65976、及びその優先権書類である2016年4月13日に出願された米国特許出願第62/322,098号及び、2015年12月11日に出願され、「Scalable Purification Method for AAV8」と題する同第62/266,341号に記載されるプロセスを用いて空のカプシドから精製される。手短に、rAAV作製細胞培養の清澄にし、濃縮された上清から、ゲノム含有rAAVベクター粒子を選択的に捕捉及び単離する2ステップの精製スキームが記載される。プロセスは、高塩濃度で実施する親和性捕捉法、続いて高pHで実施するアニオン交換樹脂法を用い、rAAV中間体を実質的に含まないrAAVベクター粒子をもたらす。
US16/65976、及びその優先権書類である2016年4月13日に出願された米国特許出願第62/322,098号及び、2015年12月11日に出願され、「Scalable Purification Method for AAV8」と題する同第62/266,341号に記載されるプロセスを用いて空のカプシドから精製される。手短に、rAAV作製細胞培養の清澄にし、濃縮された上清から、ゲノム含有rAAVベクター粒子を選択的に捕捉及び単離する2ステップの精製スキームが記載される。プロセスは、高塩濃度で実施する親和性捕捉法、続いて高pHで実施するアニオン交換樹脂法を用い、rAAV中間体を実質的に含まないrAAVベクター粒子をもたらす。
ある実施形態では、使用されるpHは、10~10.4(約10.2)であり、rAAV粒子がAAV8の中間体から、少なくとも約50%~約90%精製されるか、または10.2のpHであり、AAV8の中間体から約90%~約99%精製される。ある実施形態では、これはゲノムコピーによって測定される。ストック中のrAAV8粒子は、ストック中のrAAV8の少なくとも約75%~約100%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも95%、または少なくとも99%であるとき、かつ「空のカプシド」が、ストックまたは製剤中のrAAV8の約1%未満、約5%未満、約10%未満、約15%未満であるとき、rAAV8粒子(パッケージングされたゲノム)のストックまたは製剤は、AAVの空のカプシド(及び他の中間体)を「実質的に含まない」ものである。ある実施形態では、製剤は、1未満、好ましくは0.75未満、より好ましくは0.5未満、より好ましくは0.3未満の「空」の「完全」に対する比を有するrAAVストックを特徴とする。
さらなる実施形態では、rAAV粒子の平均収率は少なくとも約70%である。これは、カラムに充填された混合物中の力価(ゲノムコピー)と最終的な溶離液中に存在する量とを測定することによって計算できる。さらに、これらは、本明細書に記載のもの、または当該技術分野において記載されてきているもののような、q-PCR解析及び/またはSDS-PAGE技術に基づいて測定できる。
例えば、空及び完全な粒子の含量を計算するために、選択された試料に関するVP3バンドの容量(例えば、イオジキサノール勾配精製調製物、ここでGCの数=粒子の数である)が、充填されたGC粒子に対してプロットされる。生じる線形方程式(y=mx+c)は、試験試料のピークのバンドの容量における粒子の数を計算するのに使用される。次いで、充填された20μL当たりの粒子(pt)の数は、50倍されて粒子(pt)/mLをもたらす。pt/mLをGC/mLによって割ると、粒子のゲノムコピーに対する比(pt/GC)をもたらす。pt/mL-GC/mLは空のpt/mLをもたらす。空のpt/mLをpt/mLで割って×100すると、空の粒子のパーセンテージをもたらす。
一般的に、空のカプシド及びパッケージングされたゲノムを有するAAVベクター粒子を分析する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Grimm et al.,Gene Therapy(1999)6:1322-1330;Sommer et al.,Molec.Ther.(2003)7:122-128を参照されたい。変性カプシドについて試験するために、方法は、処理したAAVストックを、3つのカプシドタンパク質を分離することのできる任意のゲルからなるSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、例えば、緩衝液中に3~8%のトリス酢酸塩を含む勾配ゲルに供することと、次いで試料物質が分離するまでゲルを泳動することと、ゲルをナイロンまたはニトロセルロースの膜上、好ましくはナイロンにブロットすることとを含む。次いで、変性カプシドタンパク質に結合する抗AAVカプシド抗体、好ましくは抗AAVカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくはB1抗AAV-2モノクローナル抗体が、一次抗体として使用される(Wobus et al.,J.Viral.(2000)74:9281-
9293)。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体との結合を検出するための手段を含む二次抗体、より好ましくは、それに共有結合した検出分子を含む抗IgG抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヤギ抗ウサギIgG抗体が使用される。結合を検出する方法は、一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に測定するために使用され、好ましくは、放射性同位体放出、電磁放射、または比色変化を検出することのできる検出方法であり、最も好ましくは、化学発光検出キットである。例えば、SDS-PAGEのために、カラム画分からの試料を採取でき、還元剤(例えば、DTT)を含むSDS-PAGEローディング緩衝液中で加熱でき、カプシドタンパク質は、プレキャストの勾配ポリアクリルアミドゲル(例えば、Novex)上で分析される。製造者の取扱説明書に従ってSilverXpress(Invitrogen、CA)を用いる銀染色を実施してもよい。ある実施形態では、カラム画分におけるAAVベクターゲノム(vg)の濃度は、定量的リアルタイムPCR(Q-PCR)によって測定することができる。試料を希釈してDNase I(または、別の好適なヌクレアーゼ)によって切断して外来性DNAを除去する。ヌクレアーゼの不活化後、試料をさらに希釈して、プライマーとプライマー間のDNA配列に特異的なTaqMan(商標)蛍光発生プローブを用いて増幅する。所定のレベルの蛍光に到達するのに必要とされるサイクル数(閾値サイクル、Ct)は、Applied Biosystems Prism 7700 Sequence Detection Systemにおいて各々の試料について測定される。AAVベクターに含まれるものと同一の配列を含むプラスミドDNAは、Q-PCR反応において標準曲線を作成するのに利用される。試料から得られるサイクル閾値(Ct)の値は、それをプラスミド標準曲線のCt値に対して標準化することによって、ベクターゲノムの力価を測定するのに使用される。デジタルPCRに基づく評価項目アッセイもまた使用できる。
9293)。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体との結合を検出するための手段を含む二次抗体、より好ましくは、それに共有結合した検出分子を含む抗IgG抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヤギ抗ウサギIgG抗体が使用される。結合を検出する方法は、一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に測定するために使用され、好ましくは、放射性同位体放出、電磁放射、または比色変化を検出することのできる検出方法であり、最も好ましくは、化学発光検出キットである。例えば、SDS-PAGEのために、カラム画分からの試料を採取でき、還元剤(例えば、DTT)を含むSDS-PAGEローディング緩衝液中で加熱でき、カプシドタンパク質は、プレキャストの勾配ポリアクリルアミドゲル(例えば、Novex)上で分析される。製造者の取扱説明書に従ってSilverXpress(Invitrogen、CA)を用いる銀染色を実施してもよい。ある実施形態では、カラム画分におけるAAVベクターゲノム(vg)の濃度は、定量的リアルタイムPCR(Q-PCR)によって測定することができる。試料を希釈してDNase I(または、別の好適なヌクレアーゼ)によって切断して外来性DNAを除去する。ヌクレアーゼの不活化後、試料をさらに希釈して、プライマーとプライマー間のDNA配列に特異的なTaqMan(商標)蛍光発生プローブを用いて増幅する。所定のレベルの蛍光に到達するのに必要とされるサイクル数(閾値サイクル、Ct)は、Applied Biosystems Prism 7700 Sequence Detection Systemにおいて各々の試料について測定される。AAVベクターに含まれるものと同一の配列を含むプラスミドDNAは、Q-PCR反応において標準曲線を作成するのに利用される。試料から得られるサイクル閾値(Ct)の値は、それをプラスミド標準曲線のCt値に対して標準化することによって、ベクターゲノムの力価を測定するのに使用される。デジタルPCRに基づく評価項目アッセイもまた使用できる。
一態様において、広域スペクトラムのセリンプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼK(Qiagenから市販されているものなど)を用いる最適化されたq-PCR法が本明細書において提供される。より詳細には、最適化されたqPCRゲノム力価アッセイは、DNase I消化の後に、試料をプロテイナーゼK緩衝液で希釈してプロテイナーゼKによって処理し、続けて熱不活化することを除いて標準的なアッセイと同様である。好適な試料は、試料サイズと同量のプロテイナーゼK緩衝液で希釈する。プロテイナーゼK緩衝液は、2倍以上に濃縮されていてもよい。典型的には、プロテイナーゼK処理は、約0.2mg/mLであり、0.1mg/mL~約1mg/mLで変動し得る。処理ステップは、一般的に約55℃において15分間で実施されるが、より低い温度(例えば約37℃~約50℃)でより長い時間(例えば約20分間~約30分間)を超えて実施してもよく、またはより高い温度(例えば約60℃まで)でより短い時間(例えば約5~10分間)で実施してもよい。同様に、熱不活化は一般的に約95℃で約15分間であるが、温度はより低く(例えば約70~約90℃)てもよく、延長した時間(例えば約20分間~約30分間)である。次いで、試料は希釈され(例えば1000倍)、標準アッセイに記載されるようなTaqMan解析に供される。
さらに、または代替的に、液滴デジタルPCR(ddPCR)を使用し得る。例えば、一本鎖及び自己相補型のAAVベクターゲノム力価をddPCRによって測定する方法はこれまでに記載されている。例えば、M.Lock et al,Hu Gene Therapy Methods,Hum Gene Ther Methods.2014
Apr;25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014 Feb 14を参照されたい。
Apr;25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014 Feb 14を参照されたい。
製造
rAAV8.aVEGFベクターは、図9に示されるフローチャートに示されるように製造できる。手短に、細胞(例えばHEK293細胞)は、好適な細胞培養系において増
殖され、ベクター生成のためにトランスフェクトされる。次いで、rAAV8.aVEGFベクターは、採取され、濃縮され、精製され、バルクベクターを調製することができ、次いでこれは、下流のプロセスにおいて充填され、完成される。本明細書に記載の遺伝子療法ベクターを製造する方法は、遺伝子療法ベクターの作製に使用されるプラスミドDNAの生成、ベクターの生成、及びベクターの精製などの当該技術分野において周知の方法を含む。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターはAAVベクターであり、生成されるベクターは、AAVゲノム及び対象の遺伝子をコードするAAVシスプラスミド、AAVのrep及びcap遺伝子を含むAAVトランスプラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドDNAの細胞へのトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、ならびにベクター含有細胞及び培地の採取などの方法のステップを含み得る。採取されたベクター含有細胞及び培地は、粗細胞採取物として本明細書において言及される。
rAAV8.aVEGFベクターは、図9に示されるフローチャートに示されるように製造できる。手短に、細胞(例えばHEK293細胞)は、好適な細胞培養系において増
殖され、ベクター生成のためにトランスフェクトされる。次いで、rAAV8.aVEGFベクターは、採取され、濃縮され、精製され、バルクベクターを調製することができ、次いでこれは、下流のプロセスにおいて充填され、完成される。本明細書に記載の遺伝子療法ベクターを製造する方法は、遺伝子療法ベクターの作製に使用されるプラスミドDNAの生成、ベクターの生成、及びベクターの精製などの当該技術分野において周知の方法を含む。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターはAAVベクターであり、生成されるベクターは、AAVゲノム及び対象の遺伝子をコードするAAVシスプラスミド、AAVのrep及びcap遺伝子を含むAAVトランスプラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドDNAの細胞へのトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、ならびにベクター含有細胞及び培地の採取などの方法のステップを含み得る。採取されたベクター含有細胞及び培地は、粗細胞採取物として本明細書において言及される。
その後、粗細胞採取物は、ベクター採取物の濃縮、ベクター採取物の透析ろ過、ベクター採取物の顕微溶液化、ベクター採取物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化中間体のろ過、クロマトグラフィーによる精製、超遠心分離法による精製、タンジェント流ろ過による緩衝液交換、ならびにバルクベクター調製のための製剤化及びろ過のような方法のステップに供し得る。
特定の実施形態では、遺伝子療法ベクターを製造するのに使用される方法は、本明細書の実施例に記載される。
患者集団
治療の候補である患者は、血管新生加齢性黄斑変性、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫(RVO)、糖尿病性黄斑浮腫(DME)、糖尿病性網膜症(非増殖性糖尿病性網膜症(NPDR)、DMEを有する患者における増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、糖尿病性黄斑浮腫を有する患者における糖尿病性網膜症を有するものを含む。これらの患者は、本明細書に記載のようなAAV8.aVEGF組成物による網膜下治療に特によく適している。
治療の候補である患者は、血管新生加齢性黄斑変性、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫(RVO)、糖尿病性黄斑浮腫(DME)、糖尿病性網膜症(非増殖性糖尿病性網膜症(NPDR)、DMEを有する患者における増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、糖尿病性黄斑浮腫を有する患者における糖尿病性網膜症を有するものを含む。これらの患者は、本明細書に記載のようなAAV8.aVEGF組成物による網膜下治療に特によく適している。
本明細書に記載のようなAAV8.aVEGFの、例えば網膜下及び/または硝子体内投与を含む眼内投与のための候補である患者は、黄斑変性、血管新生/滲出型/滲出性加齢性黄斑変性、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫(RVO)(網膜中心静脈閉塞(CRVO)及び網膜静脈分枝閉塞(BRVO)を含む)、網膜中心静脈/半側網膜静脈/網膜静脈分枝閉塞、網膜動脈閉塞、網膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫(DME)、糖尿病性網膜症(非増殖性糖尿病性網膜症(NPDR)、DMEを有する患者における増殖性糖尿病性網膜症(PDR))、黄斑浮腫を伴わない糖尿病性網膜症(増殖性糖尿病性網膜症のための硝子体切除の前治療を含む)、活動性の高い光凝固化糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生、脈絡膜血管新生の希少な原因(色素線条、脈絡膜炎[眼のヒストプラスマ症に続発する脈絡膜炎を含む]、特発性変性近視、網膜ジストロフィー、虹彩血管新生、及び外傷)、特発性脈絡膜炎、角膜血管新生、未熟児網膜症、視神経円板灌流、後水晶体線維形成、網膜変性、硝子体黄斑牽引症候群、網膜剥離、糖尿病性牽引性網膜剥離、黄斑下血管新生色素上皮剥離、フォークト・小柳・原田症候群、色素上皮剥離、色素上皮裂孔、増殖性硝子体網膜症、糖尿病性牽引性網膜剥離における硝子体網膜手術、ポリープ状脈絡膜血管症、点状脈絡膜内層症(PIC)、多病巣性脈絡膜炎、中心性漿液性網脈絡膜症(CSC)、匍行性脈絡膜炎、硝子体出血、硝子体出血に対する経毛様体扁平部硝子体切除術、活動性の高い血管結合組織増殖を伴う黄斑前出血、脈絡膜出血弱視、近視、近視性脈絡膜血管新生、高度近視における脈絡中心窩下/傍中心窩血管新生、脈絡膜悪性黒色腫、眼ヒストプラスマ症候群、難治性炎症性眼新血管新生(新生血管形成、結核、多巣性匍行性脈絡膜炎、原田トキソプラズマ症)、弾性線維性仮性黄色腫、遺伝性眼疾患、角膜内皮細胞減少、フォー
クト・小柳・原田症候群、前部虚血性視神経症、嚢胞様黄斑浮腫、類嚢胞黄斑浮腫、特発性類嚢胞黄斑浮腫、特発性黄斑毛細血管拡張症、コーツ病(滲出性網膜炎もしくは網膜毛細血管拡張症としても知られるコーツ病)、緑内障、血管新生緑内障、ステロイド誘発緑内障、高眼圧症、緑内障手術、創傷治癒の制御、ブドウ膜黒色腫、ブドウ膜炎、放射線黄斑障害、模様ジストロフィー、放射線網膜症、放射線壊死、ヒッペル病、フォンヒッペル-リンダウ症候群、眼内炎、視神経脊髄炎スペクトル障害、翼状片、原発性翼状片(原発性翼状片手術のための補助的治療法を含む)、再発性翼状片、網膜ドルーゼン、眼腫瘍、眼球内黒色腫、白内障、角膜移植不全、線維柱帯切除術、脂肪性角膜症、全層角膜移植術、疱疹性角膜症、酒さ、網膜血管腫、腎血管性疾患、視覚障害、増殖性硝子体網膜症、虹彩血管新生(NV)、角膜NV、パンヌスを含む、毛様体扁平部炎サルコイド、またはイールズ病を有するものを含む。
クト・小柳・原田症候群、前部虚血性視神経症、嚢胞様黄斑浮腫、類嚢胞黄斑浮腫、特発性類嚢胞黄斑浮腫、特発性黄斑毛細血管拡張症、コーツ病(滲出性網膜炎もしくは網膜毛細血管拡張症としても知られるコーツ病)、緑内障、血管新生緑内障、ステロイド誘発緑内障、高眼圧症、緑内障手術、創傷治癒の制御、ブドウ膜黒色腫、ブドウ膜炎、放射線黄斑障害、模様ジストロフィー、放射線網膜症、放射線壊死、ヒッペル病、フォンヒッペル-リンダウ症候群、眼内炎、視神経脊髄炎スペクトル障害、翼状片、原発性翼状片(原発性翼状片手術のための補助的治療法を含む)、再発性翼状片、網膜ドルーゼン、眼腫瘍、眼球内黒色腫、白内障、角膜移植不全、線維柱帯切除術、脂肪性角膜症、全層角膜移植術、疱疹性角膜症、酒さ、網膜血管腫、腎血管性疾患、視覚障害、増殖性硝子体網膜症、虹彩血管新生(NV)、角膜NV、パンヌスを含む、毛様体扁平部炎サルコイド、またはイールズ病を有するものを含む。
AAV8.aVEGF(抗VEGF導入遺伝子産物)による治療の候補である患者は、24GyEプロトン、16GyE、キシロカイン、プロパラカイン塩酸塩、Tetravisc、Acuvail、Zimura、トリアムシノロンアセトニド、ラニビズマブ、またはOzurdexとの組み合わせを含むが、これらに限定されないレジメンにおける治療の候補である。好適な適応症の例は、前出の段落にあるものを含む。例えば、1種以上の先に列挙した薬物を伴うAAV8.aVEGFを含む組み合わせレジメンは、滲出性加齢性黄斑変性、網膜中心静脈閉塞、特発性ポリープ状脈絡膜血管症、及び/または糖尿病性黄斑浮腫の治療に使用され得る。
本明細書に記載されるAAV8.aVEGF組成物はまた、多くのがん、新生物、及びVEGFに関連する他の疾患における血管新生を阻止するのに有用である。そのような組成物は、例えばとりわけ、静脈内、病巣内、腫瘍または器官への直接的な送達を含む、任意の好適な経路で投与できる。そのような患者として、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、副腎皮質癌、副腎皮質癌、エイズ関連癌、カポジ肉腫、エイズ関連リンパ腫、原発性CNSリンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様/横紋筋肉腫様腫瘍、皮膚の基底細胞癌、膀胱癌、骨癌(ユーイング肉腫及び骨肉腫ならびに悪性線維性組織球腫を含む)、脳腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発不明癌、心臓腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様/横紋筋肉腫様腫瘍、胚芽腫、胚細胞腫瘍、原発性CNSリンパ腫、子宮頸癌、小児には希少ながん、胆管細胞癌、胆管癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚T細胞リンパ腫、腺管上皮内癌(DCIS)、中枢神経系胚芽腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管癌、骨の線維性組織球腫、悪性骨肉腫、胆嚢癌、胃癌、小児胃癌、消化管間質腫瘍(GIST)、胚細胞腫瘍、小児中枢神経系胚細胞腫瘍、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、精巣癌、妊娠性絨毛性疾患、有毛状細胞性白血病、頭頚部癌、心臓腫瘍、肝細胞癌、組織球症、ランゲルハンス細胞、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、膵島腫瘍、膵内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、小児喉頭癌及び乳頭腫、白血病、口唇及び口腔癌、肝癌、肺癌(非小細胞及び小細胞)、小児肺癌、リンパ腫、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、黒色腫、眼球内黒色腫、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、転移性癌、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、NUT遺伝子が関与する正中線癌、口腔癌(Mouth Cancer)、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成、骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病、慢性(CML)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄増殖性腫瘍、副鼻腔癌及び鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌(Oral Cancer)、口唇及び口腔癌(Oral Cavity Cancer)ならびに中咽頭癌、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲
状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠及び乳癌、原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、再発癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、唾液腺癌、肉腫、小児横紋筋肉腫、小児血管腫瘍、ユーイング肉腫、骨肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部肉腫、皮膚の扁平上皮癌、原発不明扁平上皮性頸部癌、転移性、胃癌、皮膚T細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行上皮癌(腎臓(腎細胞)癌)、原発不明癌、小児原発不明癌、小児には希少ながん、尿管及び腎盂、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、子宮平滑筋肉腫、腟癌、血管腫瘍、外陰癌、ウィルムス腫瘍及びその他の小児腎腫瘍、腹部腫瘍(腺癌、肝細胞、乳頭状漿液ミュラー、ラパチニブ、大腸、卵巣、卵管、腹膜の癌/新生物/癌腫/腫瘍)、リンパ増殖性疾患、小腸癌、聴神経腫瘍(例えば、前庭神経鞘腫、神経線維腫症2型)、急性骨髄性白血病、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、頭頚部癌、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、肉腫、神経芽細胞腫、進行癌、女性性器の悪性新生物、転移性または切除不能な固形腫瘍、悪性星状細胞腫、結腸癌、転移性黒色腫、悪性腹水、腎細胞癌、神経膠芽腫、神経膠肉腫、結腸直腸癌の肝転移、進行性悪性腫瘍、骨髄腫、妊娠性トロホブラスト腫瘍、絨毛癌、胎盤部トロホブラスト腫瘍、類上皮性トロホブラスト腫瘍、胆道癌、悪性神経膠腫、子宮頸癌、子宮癌、中皮腫を有する患者がある。その候補は、当該組成物単独によって、または例えば、パクリタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、放射線、カペシタビン、イリノテカン、フルオロウラシル、塩酸ドキソルビシンリポソーム、塩酸エルロチニブ、塩酸イリノテカン、塩酸イリノテカン水和物(CPT-11)、塩酸ゲムシタビン、塩酸パゾパニブ、塩酸トポテカン、トリフルリジン/塩酸チピラシル、ペグ化リポソーム封入塩酸ドキソルビシン、塩酸エンザスタウリン、塩酸ミトキサントロン、塩酸エピルビシン、ドセタキセル、ゲムシタビン、エルロチニブ、シスプラチン、化学療法、セツキシマブ、FOLFIRI-セツキシマブ、5-フルオロウラシル(5-FU)、LV5FU2、シクロホスファミド、テモゾロミド、ペメトレキセド、レボホリナートカルシウム(1-LV)、ロイコボリンカルシウム、FOLFOX、FOLFOX6、mFOLFOX、FOLFOXIRI、FOLFIRI、ドキソルビシン、リポソーム封入ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシンリポソーム、トシル酸ソラフェニブ、ソラフェニブ、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トラスツズマブ、エベロリムス、スニチニブ、デキサメタゾン、従来の手術、ゼローダ、放射線療法、テムシロリムス、パゾパニブ、ロイコボリン(LV)、1-LV、アニツムマブ、エピルビシン、ベルテポルフィン、AMG 655、Amgen 386、AMG
479、AMG 706、AMG 951、AMG 102、フォリン酸、レボ-フォリン酸、エトポシド、BAY 43-9006、アテゾリズマブ、インターフェロンアルファ-2b、インターフェロンアルファ-2a、インターフェロンアルファ、ガンマ-インターフェロン-1b、光力学的治療、酒石酸ビノレルビン、ビノレルビン、トポテカン、タルセバ、ペメトレキセド二ナトリウム、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、イメテルスタットナトリウム、XELOX、RAD001、ペグフィルグラスチム、パクリタキセルアルブミン安定化小粒子製剤、イピリムマブ、定位放射線手術(SRS)、定位放射線、オザルデックス、レトロゾール、AG-013736(アキシチニブ)、フィルグラスチム、クリゾチニブ、セジラニブマレイン酸塩、セジラニブ、ボルテゾミブ、アブラキサン、ボリノスタット、ビンクリスチン、TRC105、リツキシマブ、レゴラフェニブ、ペンブロリズマブ、メトトレキサート、イマチニブ、ハーセプチン、テセントリク、オキサリプラチン(OXA)、ロムスチン、イクサベピロン、CPT-11、CGC-11047、酒石酸ビノレルビン、酒石酸塩、プレドニゾン、ニボルマブ、フルベストラント、エンザスタウリン、ドキシル、AZD2014、AZD2281、AZD2171、AZD4547、AZD5363、AZD8931、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンD、バルプロ酸、マイトマイシンC、セジラニブマレイン酸塩、レナリドマイド、ラパチニブ、HAIアブラキサン、HAIイリノテカン、GDC-0941、GDC-0449、GDC-0980、ビカルタミド、XELIRI、バンデタニブ、サリドマ
イド、ラパマイシン、オラパリブ、NovoTTF100A、ナベルビン、MetMAb、メシル酸イマチニブ(グリベック)、イホスファミド、ヒドロキシクロロキン、及びGM-CSFであるが、これらに限定されない抗がん治療と組み合わせて治療される。
状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠及び乳癌、原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、再発癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、唾液腺癌、肉腫、小児横紋筋肉腫、小児血管腫瘍、ユーイング肉腫、骨肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部肉腫、皮膚の扁平上皮癌、原発不明扁平上皮性頸部癌、転移性、胃癌、皮膚T細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行上皮癌(腎臓(腎細胞)癌)、原発不明癌、小児原発不明癌、小児には希少ながん、尿管及び腎盂、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、子宮平滑筋肉腫、腟癌、血管腫瘍、外陰癌、ウィルムス腫瘍及びその他の小児腎腫瘍、腹部腫瘍(腺癌、肝細胞、乳頭状漿液ミュラー、ラパチニブ、大腸、卵巣、卵管、腹膜の癌/新生物/癌腫/腫瘍)、リンパ増殖性疾患、小腸癌、聴神経腫瘍(例えば、前庭神経鞘腫、神経線維腫症2型)、急性骨髄性白血病、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、頭頚部癌、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、肉腫、神経芽細胞腫、進行癌、女性性器の悪性新生物、転移性または切除不能な固形腫瘍、悪性星状細胞腫、結腸癌、転移性黒色腫、悪性腹水、腎細胞癌、神経膠芽腫、神経膠肉腫、結腸直腸癌の肝転移、進行性悪性腫瘍、骨髄腫、妊娠性トロホブラスト腫瘍、絨毛癌、胎盤部トロホブラスト腫瘍、類上皮性トロホブラスト腫瘍、胆道癌、悪性神経膠腫、子宮頸癌、子宮癌、中皮腫を有する患者がある。その候補は、当該組成物単独によって、または例えば、パクリタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、放射線、カペシタビン、イリノテカン、フルオロウラシル、塩酸ドキソルビシンリポソーム、塩酸エルロチニブ、塩酸イリノテカン、塩酸イリノテカン水和物(CPT-11)、塩酸ゲムシタビン、塩酸パゾパニブ、塩酸トポテカン、トリフルリジン/塩酸チピラシル、ペグ化リポソーム封入塩酸ドキソルビシン、塩酸エンザスタウリン、塩酸ミトキサントロン、塩酸エピルビシン、ドセタキセル、ゲムシタビン、エルロチニブ、シスプラチン、化学療法、セツキシマブ、FOLFIRI-セツキシマブ、5-フルオロウラシル(5-FU)、LV5FU2、シクロホスファミド、テモゾロミド、ペメトレキセド、レボホリナートカルシウム(1-LV)、ロイコボリンカルシウム、FOLFOX、FOLFOX6、mFOLFOX、FOLFOXIRI、FOLFIRI、ドキソルビシン、リポソーム封入ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシンリポソーム、トシル酸ソラフェニブ、ソラフェニブ、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トラスツズマブ、エベロリムス、スニチニブ、デキサメタゾン、従来の手術、ゼローダ、放射線療法、テムシロリムス、パゾパニブ、ロイコボリン(LV)、1-LV、アニツムマブ、エピルビシン、ベルテポルフィン、AMG 655、Amgen 386、AMG
479、AMG 706、AMG 951、AMG 102、フォリン酸、レボ-フォリン酸、エトポシド、BAY 43-9006、アテゾリズマブ、インターフェロンアルファ-2b、インターフェロンアルファ-2a、インターフェロンアルファ、ガンマ-インターフェロン-1b、光力学的治療、酒石酸ビノレルビン、ビノレルビン、トポテカン、タルセバ、ペメトレキセド二ナトリウム、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、イメテルスタットナトリウム、XELOX、RAD001、ペグフィルグラスチム、パクリタキセルアルブミン安定化小粒子製剤、イピリムマブ、定位放射線手術(SRS)、定位放射線、オザルデックス、レトロゾール、AG-013736(アキシチニブ)、フィルグラスチム、クリゾチニブ、セジラニブマレイン酸塩、セジラニブ、ボルテゾミブ、アブラキサン、ボリノスタット、ビンクリスチン、TRC105、リツキシマブ、レゴラフェニブ、ペンブロリズマブ、メトトレキサート、イマチニブ、ハーセプチン、テセントリク、オキサリプラチン(OXA)、ロムスチン、イクサベピロン、CPT-11、CGC-11047、酒石酸ビノレルビン、酒石酸塩、プレドニゾン、ニボルマブ、フルベストラント、エンザスタウリン、ドキシル、AZD2014、AZD2281、AZD2171、AZD4547、AZD5363、AZD8931、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンD、バルプロ酸、マイトマイシンC、セジラニブマレイン酸塩、レナリドマイド、ラパチニブ、HAIアブラキサン、HAIイリノテカン、GDC-0941、GDC-0449、GDC-0980、ビカルタミド、XELIRI、バンデタニブ、サリドマ
イド、ラパマイシン、オラパリブ、NovoTTF100A、ナベルビン、MetMAb、メシル酸イマチニブ(グリベック)、イホスファミド、ヒドロキシクロロキン、及びGM-CSFであるが、これらに限定されない抗がん治療と組み合わせて治療される。
治療のためのさらに他の好適な病態は、例えば、血友病、滑膜炎、高血圧、ケロイド、炎症、放射線壊死、及び腫瘍性髄膜炎を含み得る。これら及び上述の病態は、網膜下または眼への投与のための別の型の投与が特定されている場合を除いて、あらゆる好適な経路によって送達され得る。
特定の実施形態では、患者は、網膜下に投与される単一用量のrAAV8.aVEGFの投与を受ける。例えば、これは、血管新生加齢性黄斑変性、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫(RVO)、糖尿病性黄斑浮腫(DME)、糖尿病性網膜症(非増殖性糖尿病性網膜症(NPDR)、DMEを有する患者における増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、糖尿病性黄斑浮腫を有する患者における糖尿病性網膜症の治療において特によく適している。
患者に投与されるrAAV8.aVEGFの用量は、(oqPCRまたはddPCRによって測定されるとき)少なくとも1×109GC/眼~1×1013GC/眼、または少なくとも1×1010GC/眼~7.5×1012GC/眼である。しかしながら、他の用量も選択され得る。例えば、患者に対して治療的に有効なrAAV8.aVEGFの網膜下の用量は、約0.1mL~約0.5mL、好ましくは、0.25mL(250μl)、または、0.1~0.15mL(100~150μl)の範囲の注射容量において、約3×109GC/眼~約6.6×1011GC/眼の範囲であり得、より好ましくは6.6×1010GC/眼である。さらに他の実施形態では、治療的に有効な濃度は、約1×105であってよく、濃度は1×105GC/μL~1×109GC/μLであり得、その範囲のあらゆるGC濃度に対する注射容量は、10μL~300μLであり得る。ある実施形態では、患者に投与されるrAAV8.aVEGFの用量は、約3×109GC/眼、約1×1010GC/眼、約6×1010GC/眼、約1.6×1011GC/眼、または、約2.5×1011GC/眼である。
ある実施形態では、患者は、局所麻酔下で、網膜外科医による網膜下投与によってrAAV8.aVEGFの投与を受け得る。処置は、中心部硝子体切除術を伴う標準的な3ポートの経毛様体扁平部硝子体切除術を含み得、網膜下カニューレ(36~41ゲージ)による網膜下腔への網膜下送達が後に続く。特定の実施形態では、100~150ミリリットルのrAAV8.aVEGFを送達する。
一部の実施形態では、rAAV8.aVEGFは、滲出型AMDまたは別の選択された障害の治療のための1種以上の療法と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、rAAV.aVEGFは、レーザー凝固法、ベルテポルフィンを伴う光線力学的治療、及び、硝子体内へのペガプタニブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、またはベバシズマブなど、これらに限定されない抗VEGF剤と組み合わせて投与される。
ある実施形態では、rAAV8.aVEGF療法のための患者は、従来の抗VEGF抗体(Fab)治療に以前に反応しているものを含み得る。
本発明の遺伝子療法治療の目的は、網膜変性の進行を遅らせるか、または阻止すること、及び最小限の介入/侵襲的処置によって視力喪失を遅らせるか、または阻止することである。ある実施形態では、遺伝子療法治療の有効性は、標準治療、例えば、ペガプタニブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、またはベバシズマブなど、これらに限定されない抗VEGF剤の硝子体内注射を用いる救援治療の排除またはその数の低減によって示され得る。
特定の実施形態では、有効性は以下の1つ以上によって測定され得る:視覚変化、(BCVA)スコアによって測定される最良矯正視力、スネレンチャートまたは早期治療糖尿病性網膜症(ETDRS)視力スコア、ETDRSによって測定される対象が喪失または獲得するパーセンテージ、遠方最良矯正視力、リーディング最良矯正視力、NEI視覚機能アンケート-25(VFQ-25)スコアにおける変化、視覚関連の生活の質のアンケート、ペリーロブソンチャートによって測定されたコントラスト感度を含む視力、電子視力計における低コントラスト視力、ゴールドマン視野によって測定されるような周辺視野、ハイデルベルグスリットランプ光干渉断層写真術によって測定される角膜と虹彩の距離及び線維柱帯と虹彩の距離、中心部及び中心傍の変視症、網膜感度(mfERG、Nidek MP-1マイクロ視野計測)を分析することによる加齢性黄斑変性(AMD)の優先的超解像力視野計(Preferential Hyperacuity Perimeter)(PHP)試験、視覚的アナログスケール(VAS)、黄斑マッピング検査、網膜電図(ERG)、パターン網膜電図(PERG)及び全視野(または閃光)網膜電図(ffERG)、多局所網膜電図(mfERG)、mfERG中心環振幅濃度を含む電気生理学的変化、3つの同心円状の輪(4°、8°、及び12°)における平均網膜感度(dB)、視覚誘発電位(VEP):ECGパラメーターは、PRインターバル、QRSインターバル、及びFridericiaの公式を用いる補正QTインターバル(QTcF)を含む。NVE(網膜血管新生)、CNVM(脈絡膜血管新生膜)の退縮、黄斑の容積、黄斑の厚み、中心部黄斑亜領域の厚み、網膜の容積(内部網膜容積及び外部網膜容積)、網膜の厚み、中心部網膜の厚み、中心部亜領域の網膜の厚み(CSRT)、中心窩下網膜の厚み(SRT)、中心窩の厚み、中心窩無血管域最大径、網膜層の完全性、外境界膜(ELM)の完全性、楕円体線/バンドの完全性、レンズの状態、レンズの不透明度を含む光干渉断層写真術(OCT)を用いて測定される変化、光干渉断層血管撮影(OCTA)によって測定される新血管膜の退縮パーセンテージ、中心窩を中心とする1mmにおける内部/外部セグメント層の光受容体の完全性の度合いを含む解剖学的変化。任意に、治験の間、AMD損傷サイズ及び漏出が蛍光眼底造影によるものであり得、蛍光眼底造影(FA)及びインドシアニングリーン眼底造影(ICG)による全損傷サイズ及びCNV(脈絡膜血管新生)サイズ、網膜下液または出血を含み得る活性CNV漏出、漏出の面積、黄斑漏出の面積、損傷出血のパーセンテージの変化、ドルーゼンサイズの変化、液体の量、網膜内嚢胞様変化(IRC)容積、血管密度、網膜内/網膜下液の存在、網膜下液(SRF)の高さ及び径、網膜内液の容積、前眼房反応、脈絡網膜還流(ICG)、眼底撮影法(FP)及び/または眼底自発蛍光(AF)によって検出されるような地図状萎縮(GA)の進行、毛細管閉塞の存在及び拡張、周辺部網膜虚血、マイクロ視野測定を用いる黄斑感度、虹彩の血管新生、角の血管新生、糖尿病性網膜症であり得る。
特定の実施形態では、AAV8.aVEGFの網膜下及び/または網膜内注射は、aVEGFを含まない血漿及び血清のレベルをもたらす。
特定の実施形態では、有効性は、BCVA(例えば、早期治療糖尿病性網膜症研究(ETDRS)チャートを使用する最良矯正視力)、眼内圧(IOP)、スリットランプ生体顕微鏡検査法、拡張眼底鏡検査、間接検眼鏡、SD-OCT(SD-Optical Coherence Tomography)、例えば、Heidelberg Spectralisを使用して)、眼底自家蛍光(FAF)、カラー眼底写真、及び/または、フルオレセイン血管造影(FA)を測定してモニターし得る。視力喪失、感染、炎症、及び網膜剥離を含むその他の安全性に関わる現象の徴候もまたモニターし得る。
SD-OCTは有用な非侵襲的インビボ断面網膜顕微鏡技術である。好適な装置は市販されている。例えば、Spectralis OCT,Heidelberg Engineering,Carlsbad,CAを参照されたい。手短に、この技術は、瞳孔を
散大することによって実施され得る。このイメージングシステムの走査型レーザー検眼鏡を使用して、近赤外(NIR)反射率(REF)及び/またはNIR眼底自発蛍光(FAF)によって、正面型網膜画像化を実施することができる。スペクトル領域光干渉断層写真術スキャンは、中心窩を通る9mmの長さの水平及び垂直断面、ならびにほぼ中間の領域に延びる30×25mmのラスタースキャンを重ね合わせて実施することができる。パラメーターは必要により変更することができ、または同等であると判定された他の好適なパラメーターであってもよい。
散大することによって実施され得る。このイメージングシステムの走査型レーザー検眼鏡を使用して、近赤外(NIR)反射率(REF)及び/またはNIR眼底自発蛍光(FAF)によって、正面型網膜画像化を実施することができる。スペクトル領域光干渉断層写真術スキャンは、中心窩を通る9mmの長さの水平及び垂直断面、ならびにほぼ中間の領域に延びる30×25mmのラスタースキャンを重ね合わせて実施することができる。パラメーターは必要により変更することができ、または同等であると判定された他の好適なパラメーターであってもよい。
別の実施形態では、網膜機能は、全視野網膜電図(ERG)によって評価することができる。ERGは、光刺激に応答する網膜によって生成される集合電位である。通常、それは、角膜表面と接触する電極によって記録される。網膜電図は、国際臨床視覚電気生理学会(ISCEV;McCulloch,Doc Ophthalmol.2015 Feb;130(1):1-12.2015)が設定した推奨に従って実施できる。まとめると、網膜電図(ERG)は、通常、全網膜細胞が閃光刺激(暗順応の動物、中程度から強烈な閃光)に能動的に応答するときに生成する。2つの構成要素は以下のものである:*a波:閃光後の最初の角膜陰性シグナル。起源:光受容体光電流、光受容体機能の最も直接的な特徴。*b波:大部分がオン型双極細胞(光受容体下流の二次ニューロン)によって生成されるa波の後に続く角膜陽性シグナル。以下に記載される実施例において、国際臨床視覚電気生理学会(ISCEV)に従う標準及び追加プロトコールが使用された。しかしながら、これらのパラメーターは、必要により、または要求により、調整され得る。暗順応桿体視細胞のERG:刺激強度:0.01~0.02cd s m-2応答:b波のみ、a波はなし。源:桿体「オン型」双極細胞(桿体視細胞からの入力に駆動される二次ニューロン)。意味:桿体視細胞機能の測定。暗順応標準的な閃光ERG:刺激強度:3cd s m-2応答:桿体錐体視細胞のa波とb波の混合;60%~70%のシグナルは、桿体視細胞駆動経路によって生成される。源:光受容体、桿体視細胞と錐体視細胞の両方(a波);桿体視細胞と錐体視細胞の両方によって駆動される高次ニューロン。意味:大部分の桿体視細胞の機能の測定、暗順応の状態に対して感度が低く、「薄暗い閃光」応答よりも低い可変性である。暗順応明るい閃光ERG:刺激強度:10cd s m-2。応答及び意味:「標準的な閃光」の応答についてと同一であるが、明るい閃光への応答は、規模がより大きく、より可変性が小さくなり得る。明順応標準的な閃光錐体視細胞ERG:刺激強度:5分間の明順応の後、30cd m-2のバックグランド光の存在下で送達される3cd s m-2。応答:錐体視細胞駆動経路によって生成されるa波及びb波。意味:錐体視細胞を完全に非感光性にするバックグランド光の存在下で、ERGが錐体視細胞及び錐体視細胞駆動二次網膜ニューロンによって排他的に作成され、錐体視細胞の機能を測定する。明順応明るい閃光錐体ERG(ISCEV標準に対して追加して)刺激強度:5分間の明順応の後、30cd m-2のバックグランド光の存在下で送達される10cd s m-2。応答及び意味:錐体視細胞駆動ERGは「標準的な錐体視細胞ERG」の場合のようであったが、より大きな規模であり、潜在的により小さな可変性である。ERG測定(a波振幅、a波潜時、b波振幅、b波潜時)が、処理した眼及びコントロールの眼について平均及び標準偏差(SD)を用いてまとめられた。
有効性の別の測定は、網膜厚の喪失を含み得る。
以下の実施例に示されるように、1×1010GC/眼のAAV8.aVEFGベクターの投与は、網膜機能の障害をまったく引き起こさない。この用量は投与することのできる治療的な有効量についての限定ではない。
治療目的の測定
投与後の遺伝子療法ベクターの安全性は、ベクター投与の後36ヶ月までの複数の時点において評価される、有害事象の数、身体診察において注目された変化、及び/または臨
床検査パラメーターによって評価することができる。生理学的効果は、例えば約1日~1週間で早く観察され得るが、ある実施形態では、定常状態レベルの発現レベルは約12週間までに到達する。
投与後の遺伝子療法ベクターの安全性は、ベクター投与の後36ヶ月までの複数の時点において評価される、有害事象の数、身体診察において注目された変化、及び/または臨
床検査パラメーターによって評価することができる。生理学的効果は、例えば約1日~1週間で早く観察され得るが、ある実施形態では、定常状態レベルの発現レベルは約12週間までに到達する。
rAAV.aVEGF投与によって生じる改善/有効性は、約12週、12ヶ月、24ヶ月、36ヶ月または他の所望の時点での視力のベースラインにおける所定の平均変化として評価することができる。その他の改善/有効性は、12、24、及び36ヶ月で、スペクトル領域光干渉断層写真術(SD-OCT)によって測定されるときの中心網膜厚のベースラインからの平均変化として評価することができる。
一部の実施形態では、rAAV.aVEGFによる治療は、視力のベースラインからの5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%またはそれ以上の増加をもたらす。一部の実施形態では、rAAV.aVEGFによる治療は、例えば、中心網膜厚の約5%、約10%、約15%、約20%、約30%、約40%、約50%またはそれ以上の減少をもたらす。その他の実施形態では、中心網膜厚は安定であり、すなわち中心網膜厚における増加がまったくない。ある実施形態では、有効性の測定は、網膜厚の安定化、及び/または、滲出液及び/またはドルーゼンの安定化/減少を含む。
ある実施形態では、発現は、投与後約8時間~24時間という早期に観察され得る。上述の1つ以上の所望の臨床効果は、投与後数日間から数週間以内で観察され得る。
本発明は、rAAV8.aVEGFベクターの網膜下投与が、網膜全体にわたる遺伝子導入をもたらし、かつ網膜全体にわたる、ならびに硝子体及び前房液中における抗VEGF Fabの発現をもたらすことを実証する以下の例によって示される。遺伝子導入が元の注射ブレブの外側を水平方向に拡散するが、それらの拡張された境界に閉じ込められたままであり、この注射の拡張領域(網膜中の注射部位において形成される「ブレブ」)の外側における遺伝子導入及び導入遺伝子発現を達成しなかったということを実証する従来技術の遺伝子療法の研究の観点から、この結果は驚くべきであり、rAAV8.aVEGFベクターの単一投与が、(i)結果として、経時的に消散するVEGF阻害剤の高用量ボーラスの反復IVT投与と比較して性能が向上し得るような網膜全体にわたるVEGF阻害剤の有効量の連続送達、ならびに(ii)患者に追加のリスク及び不便さを提示する反復眼内注射の回避をもたらす点において、nAMD治療のための標準治療を超える利点をもたらす。各々の態様は、治療成績を改善し得る。
以下の略語を、本明細書で使用する。AAVはアデノ随伴ウイルスを指す。ACFは前房液を指す。Ad5はアデノウイルス5型を指す。AEは有害事象を指す。AMDは加齢性黄斑変性を指す。BCAはビシンコニン酸を指す。BCVAは最良矯正視力を指す。BHはバルク採取物を指す。BIはバルク原薬中間体を指す。BPは塩基対を指す。CBはトリベータアクチンプロモーターを指す。CB7はCMVエンハンサー(C4)とトリβ-アクチンプロモーターとのハイブリッドを指す。CBCは全血球計算を指す。CIはトリβ-アクチンイントロンを指す。CMCは、化学、製造及び品質管理を指す。CMOは、医薬品製造受託機関を指す。CMVはサイトメガロウイルスを指す。CNVは脈絡膜血管新生を指す。CS-10はCorning10層CellSTACKs(登録商標)プレートを指す。ddPCRは液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応を指す。DLSは動的光散乱を指す。DMEMはダルベッコ改変イーグル培地を指す。DNAはデオキシリボ核酸を指す。DPは製剤を指す。ELISAは酵素結合免疫吸着検査法を指す。ERGは網膜電図を指す。ELISPOTは酵素結合免疫スポットアッセイを指す。Fabは抗原結合フラグメントを指す。FBSはウシ胎仔血清を指す。GCはゲノムコピーを指す。gはグラムを指す。GLPは医薬品安全性試験実施基準を指す。GMPは医薬品製造管理及び品
質管理基準を指す。HEK293はヒト胚腎臓細胞を指す。HCPは宿主細胞タンパク質を指す。HS-36はCorning36層HYPERStacks(登録商標)を指す。ICHは、調和国際会議を指す。INDは治験薬を指す。IPは工程内を指す。ITRは末端逆位配列を指す。IUは感染単位を指す。IVは静脈内を指す。IVTは硝子体内を指す。KDaはキロダルトンを指す。Kgはキログラムを指す。LOQは定量下限を指す。Lucentis(登録商標)は、ラニビズマブの商品名である。MCBはマスター細胞バンクを指す。MEDは最小有効用量を指す。μlはマイクロリットルを指す。mLはミリリットルを指す。Mmはミリメートルを指す。mRNAはメッセンジャーRNAを指す。MSは質量分析を指す。Ngはナノグラムを指す。NHPは非ヒト霊長類を指す。OCTは光干渉断層写真術を指す。oqPCRは最適化定量性ポリメラーゼ連鎖反応を指す。PCRはポリメラーゼ連鎖反応を指す。PDは薬力学を指す。popPKは母集団薬物動態を指す。PEIはポリエチレンイミンを指す。PKは薬物動態を指す。POCは概念実証を指す。PRNはpro re nata(必要に応じて)を指す。QAは品質保証を指す。qPCRは定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指す。rAAVは組換えアデノ随伴ウイルスを指す。RBGはウサギベータ-グロビンを指す。PREは網膜色素上皮を指す。S-36はHYPERstack(登録商標)36層を指す。SENDは非臨床試験データ交換のための標準を指す。SOCは標準治療を指す。SOPは標準操作手順を指す。TCID50は50%組織培養感染価を指す。TTFはタンジェント流ろ過を指す。μLはマイクロリットルを指す。VAは視力を指す。VEGFは血管内皮増殖因子を指す。WAMDは滲出型加齢性黄斑変性を指す。YAGはイットリウム・アルミニウム・ガーネットを指す。
質管理基準を指す。HEK293はヒト胚腎臓細胞を指す。HCPは宿主細胞タンパク質を指す。HS-36はCorning36層HYPERStacks(登録商標)を指す。ICHは、調和国際会議を指す。INDは治験薬を指す。IPは工程内を指す。ITRは末端逆位配列を指す。IUは感染単位を指す。IVは静脈内を指す。IVTは硝子体内を指す。KDaはキロダルトンを指す。Kgはキログラムを指す。LOQは定量下限を指す。Lucentis(登録商標)は、ラニビズマブの商品名である。MCBはマスター細胞バンクを指す。MEDは最小有効用量を指す。μlはマイクロリットルを指す。mLはミリリットルを指す。Mmはミリメートルを指す。mRNAはメッセンジャーRNAを指す。MSは質量分析を指す。Ngはナノグラムを指す。NHPは非ヒト霊長類を指す。OCTは光干渉断層写真術を指す。oqPCRは最適化定量性ポリメラーゼ連鎖反応を指す。PCRはポリメラーゼ連鎖反応を指す。PDは薬力学を指す。popPKは母集団薬物動態を指す。PEIはポリエチレンイミンを指す。PKは薬物動態を指す。POCは概念実証を指す。PRNはpro re nata(必要に応じて)を指す。QAは品質保証を指す。qPCRは定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指す。rAAVは組換えアデノ随伴ウイルスを指す。RBGはウサギベータ-グロビンを指す。PREは網膜色素上皮を指す。S-36はHYPERstack(登録商標)36層を指す。SENDは非臨床試験データ交換のための標準を指す。SOCは標準治療を指す。SOPは標準操作手順を指す。TCID50は50%組織培養感染価を指す。TTFはタンジェント流ろ過を指す。μLはマイクロリットルを指す。VAは視力を指す。VEGFは血管内皮増殖因子を指す。WAMDは滲出型加齢性黄斑変性を指す。YAGはイットリウム・アルミニウム・ガーネットを指す。
ヒト対象を治療する
この実施例は、血管新生(滲出型)加齢性黄斑変性(nAMD)を有する患者の遺伝子療法治療に関する。この実施例において、可溶性抗VEGF Fabタンパク質のコード配列を担持する複製欠損アデノ随伴ウイルスベクター8(AAV8)である遺伝子療法ベクター、rAAV8.aVEGFがnAMDを有する患者に投与される。遺伝子療法治療の目的は、網膜変性の進行を遅らせるか、または阻止すること、及び最小限の介入/侵襲的処置によって視力喪失を遅らせるか、または阻止することである。
この実施例は、血管新生(滲出型)加齢性黄斑変性(nAMD)を有する患者の遺伝子療法治療に関する。この実施例において、可溶性抗VEGF Fabタンパク質のコード配列を担持する複製欠損アデノ随伴ウイルスベクター8(AAV8)である遺伝子療法ベクター、rAAV8.aVEGFがnAMDを有する患者に投与される。遺伝子療法治療の目的は、網膜変性の進行を遅らせるか、または阻止すること、及び最小限の介入/侵襲的処置によって視力喪失を遅らせるか、または阻止することである。
A.遺伝子療法ベクター
いくつかのrAAV8.aVEGF遺伝子療法ベクターの生成は、本明細書において実施例2に記載される。さらに、rAAV8.aVEGFベクターゲノムの略図は図1に示される。rAAV8.aVEGFは、ヒト抗血管内皮増殖因子(抗VEGF)抗原結合抗体フラグメント(Fab)の産生をもたらす導入遺伝子を含む非複製組換えAAV8ウイルスベクターである。遺伝子カセットは、AAV2末端逆位配列(ITR)に隣接される。カセットからの発現は、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーとトリβ-アクチンプロモーターとのハイブリッドであるCB7プロモーターに駆動される。このプロモーターからの転写はトリβ-アクチンイントロンの存在により増強される。発現カセットのためのポリアデニル化シグナルはウサギβ-グロビン遺伝子に由来する。抗VEGF Fabの重鎖及び軽鎖をコードする核酸配列は、自己切断フリン(F)/F2Aリンカーによって分離されている。フリン-F2Aリンカーの組み込みは、およそ等量の重鎖と軽鎖とのポリペプチドの発現を確かなものとする。
いくつかのrAAV8.aVEGF遺伝子療法ベクターの生成は、本明細書において実施例2に記載される。さらに、rAAV8.aVEGFベクターゲノムの略図は図1に示される。rAAV8.aVEGFは、ヒト抗血管内皮増殖因子(抗VEGF)抗原結合抗体フラグメント(Fab)の産生をもたらす導入遺伝子を含む非複製組換えAAV8ウイルスベクターである。遺伝子カセットは、AAV2末端逆位配列(ITR)に隣接される。カセットからの発現は、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーとトリβ-アクチンプロモーターとのハイブリッドであるCB7プロモーターに駆動される。このプロモーターからの転写はトリβ-アクチンイントロンの存在により増強される。発現カセットのためのポリアデニル化シグナルはウサギβ-グロビン遺伝子に由来する。抗VEGF Fabの重鎖及び軽鎖をコードする核酸配列は、自己切断フリン(F)/F2Aリンカーによって分離されている。フリン-F2Aリンカーの組み込みは、およそ等量の重鎖と軽鎖とのポリペプチドの発現を確かなものとする。
最終産物は、ラテックスを含まないゴムストッパー及びアルミニウムフィリップオフシールによって封入されるCrystarl Zenith(登録商標)バイアル中の製剤緩衝液中のAAVベクター活性成分の凍結溶液として供給される。バイアルは-60℃以下で保存される。
B.投薬及び投与経路
250μLの容量のrAAV8.aVEGFが治療の必要のある対象の眼内に網膜下送達を介して単一用量として投与される。対象は、3×109GC/眼、1×1010GC/眼、または6×1010GC/眼の用量を投薬される。
250μLの容量のrAAV8.aVEGFが治療の必要のある対象の眼内に網膜下送達を介して単一用量として投与される。対象は、3×109GC/眼、1×1010GC/眼、または6×1010GC/眼の用量を投薬される。
rAAV8.aVEGFは、局所麻酔下で網膜外科医による単一の網膜下送達によって対象に投与される。処置は、中心部硝子体切除術を伴う標準的な3ポートの経毛様体扁平部硝子体切除術を含み、網膜下カニューレ(38ゲージ)による網膜下腔へのrAAV8.aVEGFの網膜下送達が後に続く。送達は、硝子体切除装置によって自動化され、250μLを網膜下腔に送達する。
rAAV8.aVEGFは、滲出型AMDの治療のための1つ以上の治療法と組み合わせて投与することができる。例えば、rAAV8.aVEGFは、レーザー凝固法、ベルテポルフィンを伴う光線力学的治療、及び、硝子体内へのペガプタニブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、またはベバシズマブなど、これらに限定されない抗VEGF剤と組み合わせて投与される。
rAAV8.aVEGFの投与後約4週間から開始して、患者は罹患した眼において、硝子体内ラニビズマブ救援治療を投薬され得る。
C.患者亜集団
好適な患者は以下のものを含み得る:
nAMDの診断を有するもの;
抗VEGF療法に応答性のもの;
抗VEGF療法の頻繁な注射を必要とするもの;
50歳以上の男性もしくは女性;
罹患した眼において20/100以下かつ20/400以上のBCVA(65以下かつ35以上のETDRS文字)を有するもの;
20/63以下かつ20/400以上の間のBCVA(75以下かつ35以上のETDRS文字)を有するもの;
罹患した眼においてAMDに続発する中心窩下CNVの確定診断を有するもの;
以下の:10ディスク領域未満の損傷サイズ(典型的なディスク領域は2.54mm2)、損傷サイズの50%未満の血液、及び/または瘢痕のようなCNVの損傷特性を有するもの;
治療の前に8ヶ月(または未満)の間、罹患した眼においてnAMDの治療のための抗VEGF剤の少なくとも4回の硝子体内注射を投薬され、SD-OCT上において確認された解剖学上の応答を有しているもの;及び/または
罹患した眼においてSD-OCT上において実証された網膜下もしくは網膜内液の存在を有するもの。
治療前に、患者は、スクリーニングされ、以下の基準の1つ以上がこの治療法が患者に好適でないことを示し得る:
●AMD以外のあらゆる要因に続発する罹患した眼におけるCNVまたは黄斑浮腫;
●罹患した眼において、血液がAMD損傷の50%以上を占めるか、または血液が1.0mm2を超えて中心窩の下に存在する;
●罹患した眼におけるVAの改善を阻止するあらゆる病態、例えば、線維症、萎縮、または中心窩の中心における網膜上皮裂孔;
●罹患した眼における活動性の高い網膜剥離または網膜剥離の病歴;
●罹患した眼における進行した緑内障;
●罹患した眼における対象のリスクを増加させる可能性があるか、視力喪失を阻止または治療する医学的または外科的介入のいずれかを必要とする可能性があるか、または処置
または評価の試験と干渉する可能性のあるあらゆる病態;
●スクリーニング前の12週間以内に罹患した眼における眼内手術の履歴(スクリーニング来院の前の10週間を超えて実施される場合、イットリウム・アルミニウム・ガーネットの嚢切開は容認され得る);
●スクリーニング前の6ヶ月以内に罹患した眼における硝子体内療法、例えば硝子体内ステロイド注射、または抗VEGF療法以外の治験薬の履歴;
●スクリーニング時の罹患した眼におけるインプラントの存在(眼内レンズを除外する)
●スクリーニング前の5年以内に化学療法及び/または放射線を必要とする悪性腫瘍の病歴(局在する基底細胞癌は容認され得る);
●網膜毒性を引き起こすことの知られている治療法、または視力に影響を及ぼし得るかもしくは既知の網膜毒性を有するあらゆる薬物との併用療法、例えばクロロキンまたはヒドロキシクロロキンの履歴;
●罹患した眼における外科手技と干渉し得る眼または眼周囲の感染;
●過去6ヶ月間の治療における心筋梗塞、脳血管障害、または一過性虚血発作;
●最大限の治療にもかかわらず制御不能の高血圧(180mmHgを超える収縮期血圧[BP]、100mmHgを超える拡張期血圧);
●眼の外科手術または治癒過程を妨げ得る付随するあらゆる治療;
●ラニビズマブもしくはそのあらゆる成分に対する既知の過敏性またはrAAV8.aVEGFに類似する作用物質に対する過去の過敏性;
●研究者の意見における、被験者の安全性または試験への成功裏の参加を損なうであろうあらゆる重篤なまたは不安定な医学的または心理的病態;
●正常上限(ULN)の2.5倍を超えるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)/アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT);
●対象が以前に知られているギルバート症候群の病歴を有していない限りULNの1.5倍を超える総ビリルビン、及び結合ビリルビンが総ビリルビンの35%未満であることを示す分画したビリルビン;
●ULNの1.5倍を超えるプロトロンビン時間(PT);
●オスの対象について10g/dL未満のヘモグロビン、メスの対象について9g/dL未満のヘモグロビン;
●100×103/μL未満の血小板;
●30mL/分/1.73m2未満の推定糸球体ろ過率(GFR)。
疾患活動性について以下の1以上の救援基準が適用される場合、rAAV8.aVEGFの投与後約4週間から開始して、患者は罹患した眼において、硝子体内ラニビズマブ救援治療を受け得る:
●スペクトル領域光干渉断層写真術(SD-OCT)上での網膜液の蓄積と関連する(最良矯正視力[BCVA]当たり)5文字以上の視力喪失;
●SD-OCT上での新規または持続する、網膜下または網膜内液の、脈絡膜血管新生(CNV)と関連した上昇;
●新規の眼の出血;
以下の所見セットの1つが発生する場合、研究者の裁量によりさらなる救援注射を延期することができる:
●SD-OCTによって評価されるとき、視力が20/20もしくはそれより良好であり、中心網膜厚が「正常」である、または
●2回の連続した注射の後で視力及びSD-OCTが安定である。
●注射が延期される場合、視力またはSD-OCTが上記の基準に従って悪化する場合、それらは再開される。
好適な患者は以下のものを含み得る:
nAMDの診断を有するもの;
抗VEGF療法に応答性のもの;
抗VEGF療法の頻繁な注射を必要とするもの;
50歳以上の男性もしくは女性;
罹患した眼において20/100以下かつ20/400以上のBCVA(65以下かつ35以上のETDRS文字)を有するもの;
20/63以下かつ20/400以上の間のBCVA(75以下かつ35以上のETDRS文字)を有するもの;
罹患した眼においてAMDに続発する中心窩下CNVの確定診断を有するもの;
以下の:10ディスク領域未満の損傷サイズ(典型的なディスク領域は2.54mm2)、損傷サイズの50%未満の血液、及び/または瘢痕のようなCNVの損傷特性を有するもの;
治療の前に8ヶ月(または未満)の間、罹患した眼においてnAMDの治療のための抗VEGF剤の少なくとも4回の硝子体内注射を投薬され、SD-OCT上において確認された解剖学上の応答を有しているもの;及び/または
罹患した眼においてSD-OCT上において実証された網膜下もしくは網膜内液の存在を有するもの。
治療前に、患者は、スクリーニングされ、以下の基準の1つ以上がこの治療法が患者に好適でないことを示し得る:
●AMD以外のあらゆる要因に続発する罹患した眼におけるCNVまたは黄斑浮腫;
●罹患した眼において、血液がAMD損傷の50%以上を占めるか、または血液が1.0mm2を超えて中心窩の下に存在する;
●罹患した眼におけるVAの改善を阻止するあらゆる病態、例えば、線維症、萎縮、または中心窩の中心における網膜上皮裂孔;
●罹患した眼における活動性の高い網膜剥離または網膜剥離の病歴;
●罹患した眼における進行した緑内障;
●罹患した眼における対象のリスクを増加させる可能性があるか、視力喪失を阻止または治療する医学的または外科的介入のいずれかを必要とする可能性があるか、または処置
または評価の試験と干渉する可能性のあるあらゆる病態;
●スクリーニング前の12週間以内に罹患した眼における眼内手術の履歴(スクリーニング来院の前の10週間を超えて実施される場合、イットリウム・アルミニウム・ガーネットの嚢切開は容認され得る);
●スクリーニング前の6ヶ月以内に罹患した眼における硝子体内療法、例えば硝子体内ステロイド注射、または抗VEGF療法以外の治験薬の履歴;
●スクリーニング時の罹患した眼におけるインプラントの存在(眼内レンズを除外する)
●スクリーニング前の5年以内に化学療法及び/または放射線を必要とする悪性腫瘍の病歴(局在する基底細胞癌は容認され得る);
●網膜毒性を引き起こすことの知られている治療法、または視力に影響を及ぼし得るかもしくは既知の網膜毒性を有するあらゆる薬物との併用療法、例えばクロロキンまたはヒドロキシクロロキンの履歴;
●罹患した眼における外科手技と干渉し得る眼または眼周囲の感染;
●過去6ヶ月間の治療における心筋梗塞、脳血管障害、または一過性虚血発作;
●最大限の治療にもかかわらず制御不能の高血圧(180mmHgを超える収縮期血圧[BP]、100mmHgを超える拡張期血圧);
●眼の外科手術または治癒過程を妨げ得る付随するあらゆる治療;
●ラニビズマブもしくはそのあらゆる成分に対する既知の過敏性またはrAAV8.aVEGFに類似する作用物質に対する過去の過敏性;
●研究者の意見における、被験者の安全性または試験への成功裏の参加を損なうであろうあらゆる重篤なまたは不安定な医学的または心理的病態;
●正常上限(ULN)の2.5倍を超えるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)/アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT);
●対象が以前に知られているギルバート症候群の病歴を有していない限りULNの1.5倍を超える総ビリルビン、及び結合ビリルビンが総ビリルビンの35%未満であることを示す分画したビリルビン;
●ULNの1.5倍を超えるプロトロンビン時間(PT);
●オスの対象について10g/dL未満のヘモグロビン、メスの対象について9g/dL未満のヘモグロビン;
●100×103/μL未満の血小板;
●30mL/分/1.73m2未満の推定糸球体ろ過率(GFR)。
疾患活動性について以下の1以上の救援基準が適用される場合、rAAV8.aVEGFの投与後約4週間から開始して、患者は罹患した眼において、硝子体内ラニビズマブ救援治療を受け得る:
●スペクトル領域光干渉断層写真術(SD-OCT)上での網膜液の蓄積と関連する(最良矯正視力[BCVA]当たり)5文字以上の視力喪失;
●SD-OCT上での新規または持続する、網膜下または網膜内液の、脈絡膜血管新生(CNV)と関連した上昇;
●新規の眼の出血;
以下の所見セットの1つが発生する場合、研究者の裁量によりさらなる救援注射を延期することができる:
●SD-OCTによって評価されるとき、視力が20/20もしくはそれより良好であり、中心網膜厚が「正常」である、または
●2回の連続した注射の後で視力及びSD-OCTが安定である。
●注射が延期される場合、視力またはSD-OCTが上記の基準に従って悪化する場合、それらは再開される。
D.治療目的の測定
主な治療目的は、網膜変性の進行を遅らせるかまたは阻止こと、及び視力喪失を遅らせ
るかまたは阻止することを含む。治療目的は、標準治療、例えば、ペガプタニブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、またはベバシズマブなど、これらに限定されない抗VEGF剤の硝子体内注射を用いる救援治療の排除及びその数の減少によって示される。治療目的はまた、視力喪失の減少もしくは阻止及び/または網膜剥離の減少もしくは阻止によって示される。
主な治療目的は、網膜変性の進行を遅らせるかまたは阻止こと、及び視力喪失を遅らせ
るかまたは阻止することを含む。治療目的は、標準治療、例えば、ペガプタニブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、またはベバシズマブなど、これらに限定されない抗VEGF剤の硝子体内注射を用いる救援治療の排除及びその数の減少によって示される。治療目的はまた、視力喪失の減少もしくは阻止及び/または網膜剥離の減少もしくは阻止によって示される。
治療目的は、BCVA(最良矯正視力)、眼圧、スリットランプ生体顕微鏡検査法、間接検眼鏡検査、及び/またはSD-OCT(SD-光干渉断層写真術)を測定することによって決定される。特に、治療目的は、BCVAの経時的なベースラインからの平均変化を測定する、BCVAに基づいたベースラインと比較して15文字以上の獲得もしくは喪失を測定する、経時的にSD-OCTによって測定されるときのCRTのベースラインからの平均変化を測定する、経時的なラニビズマブ救援注射の平均数を測定する、1回目の救援ラニビズマブ注射までの時間を測定する、経時的にCNVにおけるベースラインからの平均変化ならびにFAに基づいた損傷サイズ及び漏出領域を測定する、経時的に水性aVEGFタンパク質のベースラインからの平均変化を測定する、血清及び尿中のベクター脱落分析を実施する、及び/またはrAAV.aVEGFの免疫原性を測定する、すなわち、AAVに対するNabを測定する、AAVに対する結合抗体を測定する、aVEGFに対する抗体を測定する、及び/またはELISpotを実施して、決定する。
治療目的はまた、眼底自発蛍光(FAF)に基づく地図状萎縮の面積の経時的なベースラインからの平均変化を測定する、FAFによって地図状萎縮の新規領域の発生(ベースラインにおいて地図状萎縮のまったくない対象で)を測定する、BCVAによるベースラインと比較して、それぞれ、5以上及び10以上の文字の獲得または喪失をした対象の割合を測定する、前年と比較して、救援注射における50%の低減を有する対象の割合を測定する、SD-OCT上での液体を含まない対象の割合を測定して、決定する。
rAAV.aVEGF投与によって生じる改善/有効性は、約4週、12週、6ヶ月、12ヶ月、24ヶ月、36ヶ月またはその他の所望の時点での視力のベースラインにおける所定の平均変化として評価することができる。rAAV.aVEGFによる治療は、視力のベースラインからの5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%またはそれ以上の増加をもたらし得る。改善/有効性は、4週、12週、6ヶ月、12ヶ月、24ヶ月、及び36ヶ月で、スペクトル領域光干渉断層写真術(SD-OCT)によって測定されるときの中心網膜厚(CRT)のベースラインからの平均変化として評価することができる。rAAV.aVEGFによる治療は、中心網膜厚のベースラインからの5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%またはそれ以上の増加をもたらし得る。
AAV8.CMV.aVEGFの生成
本明細書に記載のavEGFベクターの各々は、各々がIL2リーダー配列を有する抗VEGF Fab重鎖及び軽鎖の発現を駆動するプロモーターを含む発現カセットを含む。試験組成物(懸濁液)中のrAAVに担持されるベクターゲノム中のFabコード配列は、同一となるように設計された。発現カセットは、5’のAAV2のITR及び3’のAAV2のITRに隣接される。試験されるベクターゲノムの各々は、同一の抗VEGF
Fab(以前はaVEGF-ArgまたはaVEGF-Rと呼ばれた)のコード配列バリアントを含む。ある実施形態では、発現するaVEGF Fabは均一集団である。ある実施形態では、発現するaVEGF Fabは、重鎖のカルボキシル末端における不均一性を有する。IL2-aVEGFの重鎖及びIL2-aVEGFの軽鎖のオープンリーディングフレームは、重鎖と軽鎖の両方の等モル発現を促進するためにコードされたフリン切断部位/F2Aリンカーによって分離された。これは、任意に、0、1、2、3また
は4個のアミノ酸をそのカルボキシル末端に含むaVEGF重鎖の発現をもたらす。そのカルボキシル末端におけるアルギニン、アルギニン-リジン、アルギニン-リジン-アルギニン、またはアルギニン-リジン-アルギニン-アルギニン。
本明細書に記載のavEGFベクターの各々は、各々がIL2リーダー配列を有する抗VEGF Fab重鎖及び軽鎖の発現を駆動するプロモーターを含む発現カセットを含む。試験組成物(懸濁液)中のrAAVに担持されるベクターゲノム中のFabコード配列は、同一となるように設計された。発現カセットは、5’のAAV2のITR及び3’のAAV2のITRに隣接される。試験されるベクターゲノムの各々は、同一の抗VEGF
Fab(以前はaVEGF-ArgまたはaVEGF-Rと呼ばれた)のコード配列バリアントを含む。ある実施形態では、発現するaVEGF Fabは均一集団である。ある実施形態では、発現するaVEGF Fabは、重鎖のカルボキシル末端における不均一性を有する。IL2-aVEGFの重鎖及びIL2-aVEGFの軽鎖のオープンリーディングフレームは、重鎖と軽鎖の両方の等モル発現を促進するためにコードされたフリン切断部位/F2Aリンカーによって分離された。これは、任意に、0、1、2、3また
は4個のアミノ酸をそのカルボキシル末端に含むaVEGF重鎖の発現をもたらす。そのカルボキシル末端におけるアルギニン、アルギニン-リジン、アルギニン-リジン-アルギニン、またはアルギニン-リジン-アルギニン-アルギニン。
様々なコード配列は、aVEGFv1、v2などと呼ばれる。これらのベクターゲノムは、本明細書の一部を構成するものとして援用する配列表に提示している。
マウスにおける抗VEGF Fabの発現のためのAAV2/8ベクター中の導入遺伝子カセットに含まれる以下の要素が評価された。
●7個の異なるプロモーター(98匹のオスC57BL/6マウス、Jackson Laboratories)が、AA2/8から発現される従来の抗体(F16)を用いて評価された。F16mAbの発現はヘマグルチニン(HA)タンパク質に対するELISAによって測定された。
●2個の異なるリーダーペプチド(28匹のオスC57BL/6マウス、Jackson Laboratories)。抗VEGF Fabの発現がVEGFに対するELISAによって測定された。
●3個の異なる軽-重鎖分離因子(42匹のオスC57BL/6マウス、Jackson Laboratories)が以下のベクターを用いて評価された。
●7個の異なるプロモーター(98匹のオスC57BL/6マウス、Jackson Laboratories)が、AA2/8から発現される従来の抗体(F16)を用いて評価された。F16mAbの発現はヘマグルチニン(HA)タンパク質に対するELISAによって測定された。
●2個の異なるリーダーペプチド(28匹のオスC57BL/6マウス、Jackson Laboratories)。抗VEGF Fabの発現がVEGFに対するELISAによって測定された。
●3個の異なる軽-重鎖分離因子(42匹のオスC57BL/6マウス、Jackson Laboratories)が以下のベクターを用いて評価された。
抗VEGF Fabの発現を、VEGFに対するELISAで測定した;
●13個の異なるコード配列(182匹のオスC57BL/6マウス、Jackson
Laboratories)。抗VEGF Fabの発現がVEGFに対するELISAによって測定された。
●13個の異なるコード配列(182匹のオスC57BL/6マウス、Jackson
Laboratories)。抗VEGF Fabの発現がVEGFに対するELISAによって測定された。
ベクターがマウスの眼の網膜下腔に送達された。レポーター遺伝子の発現は酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)によって測定された。
7個の異なるプロモーターが別の試験において評価された:3個のウイルス(サイトメ
ガロウイルス[CMV]、チミジンキナーゼ[TK]、シミアンウイルス[SV40])、3個の非ウイルス(ホスホグリセリン酸キナーゼ[PGK]、ヒト伸長因子-1α[EF1a]、ユビキチンC[UbC」)、及び1個のハイブリッド(チキンβアクチン[CB7])のプロモーター。
ガロウイルス[CMV]、チミジンキナーゼ[TK]、シミアンウイルス[SV40])、3個の非ウイルス(ホスホグリセリン酸キナーゼ[PGK]、ヒト伸長因子-1α[EF1a]、ユビキチンC[UbC」)、及び1個のハイブリッド(チキンβアクチン[CB7])のプロモーター。
2個の異なるリーダーペプチドはまた、リーダー配列(インターロイキン対セルピンのリーダー)を除いて、同一のベクター因子及び同一のコード配列、すなわちv3、を有するrAAV8ベクターを用いて評価された。AAV2/8=導入遺伝子に隣接するAAV末端逆位配列を有するアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシド8型;amd201Lead=IL2リーダー配列と軽-重鎖の分離因子としてのフリンF2Aとを有する抗VEGF Fab;amd201altLead=SF1のリーダー配列と軽-重鎖の分離因子としてのフリンF2Aとを有する抗VEGF Fab;CB7=トリβアクチンプロモーター;CI=キメライントロン;rBG=ウサギβグロビンポリアデニル化配列。
3個の異なる抗VEGF Fabの重鎖と軽鎖を分離する配列内リボソーム進入部位(IRES)配列が別の試験において評価された。これらのIRES配列は、脳心筋炎ウイルス(EMCV)、cMyc、及び口蹄疫ウイルス1(FMDV1)に由来した。この試験において、ベクターは、軽鎖と重鎖の分離因子(EMC、FMDV1、及びcMyc)を除いて同一であった。AAV2/8=導入遺伝子に隣接するAAV末端逆位配列を有するアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシド8型;amd201=IL2リーダー配列を有する抗VEGF Fabのコドンバリアント:CMV=サイトメガロウイルスプロモーター;EMCV=脳心筋炎ウイルス;Fab=フラグメント抗原結合領域;FMDV1=口蹄疫ウイルス1;IRES=配列内リボソーム進入部位;PI=Promegaイントロン;SV40=シミアンウイルスポリアデニル化配列。
別の試験において、抗VEGF Fabの13個の異なるコード配列が評価された。全体のコード配列の分散は約20%~30%の間であった。ベクターは以下の表に記載される。
使用された異なるコード配列を有するベクター。発現カセットの配列番号は以下の表に提示される。
動物は処理群に割り当てられ、右眼に1.00×109または5.00×109ゲノムコピー(GC)/眼のAAV2/8ベクターを投与された。左眼は未処理コントロールとして使用された。ベクターは、全量1μLで網膜下投与された。
A.網膜下注射
網膜下注射は無菌技術及び滅菌した解剖器具を用いて実施された。動物をケタミン/キシラジンまたは3~5%イソフルランで麻酔し、メロキシカムを投与した。動物を、注射する眼を視野下にして解剖顕微鏡下に置いた(15倍の倍率を使用する)。耳側結膜をジュエラー鑷子でつかみ、ヴァナス虹彩切開剪刀の先端を用いて慎重に強膜まで切った。結膜の角膜周囲切開術を、剪刀の下側のへりを、切開を通じて導入し、結膜の上方と下方の両方に円周方向に延ばすことによって実施した。全ての結膜の破片を強膜の表面から注意深く除去した。角膜に隣接する結膜を鉗子でつかみ、眼球を回転させるよう牽引力をもたらし、最適な外科的露出を可能にした。30 1/2ゲージの針を用いて、鈍端針が通過できるのに十分な大きさの小切開をもたらした。
網膜下注射は無菌技術及び滅菌した解剖器具を用いて実施された。動物をケタミン/キシラジンまたは3~5%イソフルランで麻酔し、メロキシカムを投与した。動物を、注射する眼を視野下にして解剖顕微鏡下に置いた(15倍の倍率を使用する)。耳側結膜をジュエラー鑷子でつかみ、ヴァナス虹彩切開剪刀の先端を用いて慎重に強膜まで切った。結膜の角膜周囲切開術を、剪刀の下側のへりを、切開を通じて導入し、結膜の上方と下方の両方に円周方向に延ばすことによって実施した。全ての結膜の破片を強膜の表面から注意深く除去した。角膜に隣接する結膜を鉗子でつかみ、眼球を回転させるよう牽引力をもたらし、最適な外科的露出を可能にした。30 1/2ゲージの針を用いて、鈍端針が通過できるのに十分な大きさの小切開をもたらした。
Hamilton自動注射シリンジに設置した33ゲージ鈍端針の先端が、眼球表面の接戦方向で切開に導入された。先端を約1mm進入させて、針を強膜の内部表面に沿って通過させた。33ゲージの針は、強膜及び脈絡膜を通過し、次いで、網膜下腔で終了した
。1μLまでのベクターを送達した。処置が完了すると、抗生物質眼軟膏を眼に適用した。
。1μLまでのベクターを送達した。処置が完了すると、抗生物質眼軟膏を眼に適用した。
B.アッセイ方法
採取した眼を、ステンレス鋼ビーズならびに200μLのタンパク質溶解及び抽出緩衝液(RIPA)及びcOmplete(商標)、Mini Protease Inhibitor Cocktail錠剤(1錠剤/10mLのRIPA緩衝液)を含むカクテルを有する円錐管に眼球全体を入れることによってホモジナイズした。眼は、TissueLyser(Qiagen,USA)中で、少なくとも2分間、または完全にホモジナイズされるまでホモジナイズした。ホモジネートは、低温室内で4℃において12000RPMで20分間遠心した。上清を新しいチューブに移し、分析アッセイで使用した。
採取した眼を、ステンレス鋼ビーズならびに200μLのタンパク質溶解及び抽出緩衝液(RIPA)及びcOmplete(商標)、Mini Protease Inhibitor Cocktail錠剤(1錠剤/10mLのRIPA緩衝液)を含むカクテルを有する円錐管に眼球全体を入れることによってホモジナイズした。眼は、TissueLyser(Qiagen,USA)中で、少なくとも2分間、または完全にホモジナイズされるまでホモジナイズした。ホモジネートは、低温室内で4℃において12000RPMで20分間遠心した。上清を新しいチューブに移し、分析アッセイで使用した。
眼のホモジネート中のタンパク質濃度の測定
眼のホモジネート中のタンパク質濃度は、製造者の指示書に従ってPierce(商標)BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いて測定した。全ての試料の等量のタンパク質をELISAで使用した。
眼のホモジネート中のタンパク質濃度は、製造者の指示書に従ってPierce(商標)BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いて測定した。全ての試料の等量のタンパク質をELISAで使用した。
酵素結合免疫吸着検査法
96ウェル丸底プレートを、2μg/mLのHA A-Beijingまたは1μg/mLのVEGFで4℃において一晩でコーティングした。コーティングの後、プレートを、405 TS Washer (BioTek Instruments,Winooski,VT)を用いて、200μLの0.05%Tween-20を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(PBS-T)で5回洗浄した。プレートを、200μL/ウェルの1%ウシ血清アルブミン(BSA)で、室温(RT)において1時間ブロッキングした。洗浄(記載したように)後、100μL/ウェルのサンプルを二重のウェルに充填し、37℃において1時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを洗浄(記載したように)し、次いで1%BSAで、RTにおいて1時間ブロッキングした。洗浄(記載したように)後、100μL/ウェルの一次抗体を添加し、RTにおいて1時間インキュベートした。次いでウェルを洗浄(記載したように)し、100μL/ウェルの二次抗体で、RTにおいて1時間インキュベートした。最終的な洗浄(記載したように)に続いて、150μL/ウェルの検出基質である3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジを添加し、遮光してRTにおいて30分間インキュベートした。反応を50μL/ウェルの2NのH2SO4で停止した。次いでプレートを、分光光度計であるSpectraMax(登録商標)M3(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を用いて450nm/540nmの励起/発光で読んだ。
96ウェル丸底プレートを、2μg/mLのHA A-Beijingまたは1μg/mLのVEGFで4℃において一晩でコーティングした。コーティングの後、プレートを、405 TS Washer (BioTek Instruments,Winooski,VT)を用いて、200μLの0.05%Tween-20を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(PBS-T)で5回洗浄した。プレートを、200μL/ウェルの1%ウシ血清アルブミン(BSA)で、室温(RT)において1時間ブロッキングした。洗浄(記載したように)後、100μL/ウェルのサンプルを二重のウェルに充填し、37℃において1時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを洗浄(記載したように)し、次いで1%BSAで、RTにおいて1時間ブロッキングした。洗浄(記載したように)後、100μL/ウェルの一次抗体を添加し、RTにおいて1時間インキュベートした。次いでウェルを洗浄(記載したように)し、100μL/ウェルの二次抗体で、RTにおいて1時間インキュベートした。最終的な洗浄(記載したように)に続いて、150μL/ウェルの検出基質である3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジを添加し、遮光してRTにおいて30分間インキュベートした。反応を50μL/ウェルの2NのH2SO4で停止した。次いでプレートを、分光光度計であるSpectraMax(登録商標)M3(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を用いて450nm/540nmの励起/発光で読んだ。
以下の一次抗体を使用した:PBS中で1:10000希釈、予め吸着させた1.0mg/mLのヤギ抗ヒトIgG H&L(ビオチン)(Abcam 0.5mg/mL);PBS中で1:5000希釈、予め吸着させた0.5mg/mLのヤギ抗ヒトIgG H&L(ビオチン)(Abcam, 1mg/mL)。以下の二次抗体を使用した:PBS中で1:30000希釈、1mg/mLストレプトアビジン(HRP)。
統計学的分析:ELISAのためのレポーター遺伝子の濃度の平均及び標準偏差の値は、Microsoft Office Excel 2010を用いて計算された。
C.結果
7個の異なるプロモーターを有するAAV2/8ベクターは、FI6 mAbの発現について評価された。プロモーターEF 1-αを使用したとき、FI6 mAbの発現は、いずれの動物においても観察されなかった。プロモーターSV40.PI、PGK.P
I、及びTK.PIを使用したとき、FI6 mAbの発現は低かった。プロモーターCMV.PI、CB7.CI、及びUbC.PIは、FI6 mAbの最も高い発現を実証した。いずれの動物においても、未処理の左眼においては発現が観察されなかった(データはファイル上にあり)。2個の異なるリーダーペプチドを有するAAV2/8ベクターは、抗VEGF Fabの発現について評価された。SF2リーダーを有するリーダーペプチドaVEGFv7を使用したとき、低用量での抗VEGF Fabの発現が、IL2リーダーを有するaVEGFv7と比較して、より高かかった。高用量において、抗VEGF Fabの発現は両方のリーダーペプチドについて同様であった。いずれの動物においても、未処理の左眼においては発現が観察されなかった(データはファイル上にあり)。3個の異なる軽-重鎖分離因子を有するAAV2/8ベクターは、抗VEGF Fabの発現について評価された。cMyc軽-重鎖分離因子が使用されたとき、抗VEGF Fabの発現はいずれの動物においても観察されなかた。EMCVとFMDV1の軽-重鎖分離因子を有するとき、抗VEGF Fabは低レベルで発現した。いずれの動物においても、未処理の左眼においては発現が観察されなかった(データはファイル上にあり)。
7個の異なるプロモーターを有するAAV2/8ベクターは、FI6 mAbの発現について評価された。プロモーターEF 1-αを使用したとき、FI6 mAbの発現は、いずれの動物においても観察されなかった。プロモーターSV40.PI、PGK.P
I、及びTK.PIを使用したとき、FI6 mAbの発現は低かった。プロモーターCMV.PI、CB7.CI、及びUbC.PIは、FI6 mAbの最も高い発現を実証した。いずれの動物においても、未処理の左眼においては発現が観察されなかった(データはファイル上にあり)。2個の異なるリーダーペプチドを有するAAV2/8ベクターは、抗VEGF Fabの発現について評価された。SF2リーダーを有するリーダーペプチドaVEGFv7を使用したとき、低用量での抗VEGF Fabの発現が、IL2リーダーを有するaVEGFv7と比較して、より高かかった。高用量において、抗VEGF Fabの発現は両方のリーダーペプチドについて同様であった。いずれの動物においても、未処理の左眼においては発現が観察されなかった(データはファイル上にあり)。3個の異なる軽-重鎖分離因子を有するAAV2/8ベクターは、抗VEGF Fabの発現について評価された。cMyc軽-重鎖分離因子が使用されたとき、抗VEGF Fabの発現はいずれの動物においても観察されなかた。EMCVとFMDV1の軽-重鎖分離因子を有するとき、抗VEGF Fabは低レベルで発現した。いずれの動物においても、未処理の左眼においては発現が観察されなかった(データはファイル上にあり)。
13個の異なるコード配列を有するAAV2/8ベクターは、抗VEGF Fabの導入遺伝子産物の発現について評価された。コード配列、aVEGFv4、aVEGFv5、aVEGFv6、aVEGFv7、aVEGFv8、及びaVEGFv9が使用されたとき、抗VEGF Fabの発現は低かった。コード配列、aVEGFv13、aVEGFv10、aVEGFv11、及びaVEGFv12を有するとき、発現はより高かった。コード配列、aVEGFv1、aVEGFv2、及びaVEGFv3が使用されたとき、抗VEGF Fabの発現は最も高かった。いずれの動物においても、未処理の左眼においては発現が観察されなかった(データはファイル上にあり)。
各々のベクターは、同一の抗VEGFの導入遺伝子産物をコードする。部分的にこれらの結果に基づいて、単一の複製欠損組換えAAV8.aVEGFがさらなる開発のために選択された。このベクターは、AAV8カプシド、ならびにAAV2のITRがCB7プロモーター、イントロン、上述されたようなコード配列から選択された抗VEGFコード配列、及びrBGのpolyA配列に隣接するベクターゲノムを有する。これは、他を具体的に特定した場合を除き、以下の実施例において試験ベクター(代替的に、AAV2/8.aVEGF試験ベクターまたはAAV8.aVEGF試験ベクター)と呼ぶ。
非ヒト霊長類における薬物動態(PK)試験
マカクは、網膜疾患を研究することに関してヒトに最も近い種であるため、この試験においてはマカクを使用した。カニクイザル及びヒトは、中心窩を含む眼の同様の解剖学的構造を有する。眼の寸法は同等であり、相対的な網膜領域に基づいてヒトの用量を決定することが可能である。
マカクは、網膜疾患を研究することに関してヒトに最も近い種であるため、この試験においてはマカクを使用した。カニクイザル及びヒトは、中心窩を含む眼の同様の解剖学的構造を有する。眼の寸法は同等であり、相対的な網膜領域に基づいてヒトの用量を決定することが可能である。
この試験は、臨床開発のためにAAV2/8ベクターを選択するため、ならびに、カニクイザルにおいてAAV2/8ベクター及び抗VEGF Fabの毒性及び免疫原性を評価するために実施された。試験は進行中である。提示される結果は、10ヶ月時点で集められたデータに基づく。AAV2/8ベクター及び抗VEGF Fabの毒性の評価が記載される。動物はAAV2/8ベクターを網膜下投与された。毒性は、臨床観察、体重、間接眼底検査、スペクトル領域光干渉断層写真術、血液学、凝固、臨床化学、及び肉眼病理所見に基づいて評価された。AAV2/8ベクターまたは抗VEGF Fabに関連した唯一の有害な所見は、1.00×1011GC/眼のAAV2/8ベクターを投与された動物のいくつかの眼においてスペクトル領域光干渉断層写真術によって観察された注射部位に局在する外顆粒層におけるいくらかの菲薄化であった。
動物は4つの処理群に割り当てられた。動物は、1.00×1011ゲノムコピー(GC)/眼の単一用量のAAV2/8ベクターを全量100μLで各々の眼に投与された。ベクターは、両方の眼に網膜下(顕微鏡下でドーム型の網膜剥離/網膜ブレブの外観によって肉眼で確認された)に投与された。以下の表は試験ベクターを列挙する。
網膜下注射
網膜下注射のために、2時または10時の位置で、硬膜切開によって導入された外套針を通して針を挿入した。硝子体を通して針を進め、後極において網膜を貫通した。顕微鏡での制御下で、100μLの試験試料を網膜下腔に注射した。これは、ドーム型の網膜剥離/網膜ブレブの外観によって確認された。最初の注射の試みが網膜剥離をもたらさなかった場合、カニューレを網膜内の別の部位に移動させた。注射部位は、一時的な盲点をもたらしている可能性がある。注射した溶液は、網膜によって数時間以内で再吸収された。網膜剥離は周辺部網膜で生じ、永続的な失明をもたらさなかった。硬膜切開の部位は、吸収性縫合糸で縫合し、PredG軟膏または同等物によって眼を手当した。結膜下ケナログまたは同等物を投与した。動物は毎日観察され、必要に応じて鎮痛剤を非経口投与した。硝子体の炎症が現れた場合、症状が解消するまで、動物を、局所アトロピン及びPredG軟膏または同等物によって処理した。
網膜下注射のために、2時または10時の位置で、硬膜切開によって導入された外套針を通して針を挿入した。硝子体を通して針を進め、後極において網膜を貫通した。顕微鏡での制御下で、100μLの試験試料を網膜下腔に注射した。これは、ドーム型の網膜剥離/網膜ブレブの外観によって確認された。最初の注射の試みが網膜剥離をもたらさなかった場合、カニューレを網膜内の別の部位に移動させた。注射部位は、一時的な盲点をもたらしている可能性がある。注射した溶液は、網膜によって数時間以内で再吸収された。網膜剥離は周辺部網膜で生じ、永続的な失明をもたらさなかった。硬膜切開の部位は、吸収性縫合糸で縫合し、PredG軟膏または同等物によって眼を手当した。結膜下ケナログまたは同等物を投与した。動物は毎日観察され、必要に応じて鎮痛剤を非経口投与した。硝子体の炎症が現れた場合、症状が解消するまで、動物を、局所アトロピン及びPredG軟膏または同等物によって処理した。
前房液の採取
動物を麻酔し、それらの頭部を固定した。ベタジン5%消毒液とプロパラカインまたは同等物を各々の眼に適用した。前房へのアクセスを可能にするために、開瞼器を配置した。処置は、27~30ゲージ皮下針を取り付けたツベルクリンシリンジによって実施した。眼は、鼻側結膜上の鉗子または綿棒で安定して保持された。針を、虹彩面の前方にある縁辺縁の透明角膜を通って斜角上方に挿入した。眼に進入したら、サンプラーは注射器のプランジャーをゆっくりと引き戻して房水を吸引する。最大で100μLの前房液を採取した。前房液を抜くと、針を眼から引き戻した。前房液は、使用または貯蔵するまで湿潤氷上に置いた。処置の後、局所フルルビプロフェン、PredG軟膏、及び抗生物質点滴薬を各々の眼に適用した。前房液を以下の試験日(時折、週末、祝日、またはスケジュールの問題のために調整された)において採取した。
● 0、15、29、43、57、71、85、120、149、183、212、2
47、274、及び302。
動物を麻酔し、それらの頭部を固定した。ベタジン5%消毒液とプロパラカインまたは同等物を各々の眼に適用した。前房へのアクセスを可能にするために、開瞼器を配置した。処置は、27~30ゲージ皮下針を取り付けたツベルクリンシリンジによって実施した。眼は、鼻側結膜上の鉗子または綿棒で安定して保持された。針を、虹彩面の前方にある縁辺縁の透明角膜を通って斜角上方に挿入した。眼に進入したら、サンプラーは注射器のプランジャーをゆっくりと引き戻して房水を吸引する。最大で100μLの前房液を採取した。前房液を抜くと、針を眼から引き戻した。前房液は、使用または貯蔵するまで湿潤氷上に置いた。処置の後、局所フルルビプロフェン、PredG軟膏、及び抗生物質点滴薬を各々の眼に適用した。前房液を以下の試験日(時折、週末、祝日、またはスケジュールの問題のために調整された)において採取した。
● 0、15、29、43、57、71、85、120、149、183、212、2
47、274、及び302。
スペクトル領域光干渉断層写真術
網膜の構造(ミクロンレベルの分解能で)をSD-OCT(Spectralis OCT,Heidelberg Engineering,Carlsbad,CA)を用いるインビボで非侵襲的な断面網膜顕微鏡により評価した。瞳孔は、フェニレフリン2.5%及びトロピカミド1%で散大された。このイメージングシステムの走査型レーザー検眼鏡を使用して、近赤外(NIR)反射率(REF)、及び動物の部分集合においてNIR眼底自発蛍光(FAF)によって、正面型網膜画像化を実施した。スペクトル領域光干渉断層写真術スキャンは、中心窩を通る9mmの長さの水平及び垂直断面、ならびにほぼ中間の領域に延びる30×25mmのラスタースキャンを重ね合わせて実施した。Aleman, Invest Ophthalmol Vis Sci.2007 Oct;48(10):4759-65を参照されたい。
網膜の構造(ミクロンレベルの分解能で)をSD-OCT(Spectralis OCT,Heidelberg Engineering,Carlsbad,CA)を用いるインビボで非侵襲的な断面網膜顕微鏡により評価した。瞳孔は、フェニレフリン2.5%及びトロピカミド1%で散大された。このイメージングシステムの走査型レーザー検眼鏡を使用して、近赤外(NIR)反射率(REF)、及び動物の部分集合においてNIR眼底自発蛍光(FAF)によって、正面型網膜画像化を実施した。スペクトル領域光干渉断層写真術スキャンは、中心窩を通る9mmの長さの水平及び垂直断面、ならびにほぼ中間の領域に延びる30×25mmのラスタースキャンを重ね合わせて実施した。Aleman, Invest Ophthalmol Vis Sci.2007 Oct;48(10):4759-65を参照されたい。
酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)
ELISAは、本質的に、前出のマウス試験で記載したように実施した。抗VEGF Fabの発現のために、96ウェル丸底プレートを、1μg/mLのVEGFでコーティングした。プレートを4℃において一晩コーティングした。コーティングの後、プレートを、405 TS Washer(BioTek Instruments,Winooski,VT)を用いて、200μLの0.05%Tween-20を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(PBS-T)で5回洗浄した。プレートを、200μL/ウェルの1%ウシ血清アルブミン(BSA)で、室温(RT)において1時間ブロッキングした。洗浄(記載したように)後、100μL/ウェルのサンプルを二重のウェルに充填し、37℃において1時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを洗浄(記載したように)し、次いで1%BSAで、RTにおいて1時間ブロッキングした。洗浄(記載したように)後、100μL/ウェルの一次抗体を添加し、RTにおいて1時間インキュベートした。次いでウェルを洗浄(記載したように)し、100μL/ウェルの二次抗体で、RTにおいて1時間インキュベートした。最終的な洗浄(記載したように)に続いて、150μL/ウェルの検出基質である3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジを添加し、遮光してRTにおいて30分間インキュベートした。反応を50μL/ウェルの2NのH2SO4で停止した。次いでプレートを、分光光度計であるSpectraMax(登録商標)M3(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を用いて450nm/540nmの励起/発光で読んだ。以下の一次抗体を使用した:PBS中で1:10000希釈、予め吸着させた1.0mg/mLのヤギ抗ヒトIgG
H&L(ビオチン);PBS中で1:5000希釈、予め吸着させた0.5mg/mLのヤギ抗ヒトIgG H&L(ビオチン)。以下の二次抗体を使用した:PBS中で1:30000希釈、1mg/mLストレプトアビジン(HRP)。
ELISAは、本質的に、前出のマウス試験で記載したように実施した。抗VEGF Fabの発現のために、96ウェル丸底プレートを、1μg/mLのVEGFでコーティングした。プレートを4℃において一晩コーティングした。コーティングの後、プレートを、405 TS Washer(BioTek Instruments,Winooski,VT)を用いて、200μLの0.05%Tween-20を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(PBS-T)で5回洗浄した。プレートを、200μL/ウェルの1%ウシ血清アルブミン(BSA)で、室温(RT)において1時間ブロッキングした。洗浄(記載したように)後、100μL/ウェルのサンプルを二重のウェルに充填し、37℃において1時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを洗浄(記載したように)し、次いで1%BSAで、RTにおいて1時間ブロッキングした。洗浄(記載したように)後、100μL/ウェルの一次抗体を添加し、RTにおいて1時間インキュベートした。次いでウェルを洗浄(記載したように)し、100μL/ウェルの二次抗体で、RTにおいて1時間インキュベートした。最終的な洗浄(記載したように)に続いて、150μL/ウェルの検出基質である3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジを添加し、遮光してRTにおいて30分間インキュベートした。反応を50μL/ウェルの2NのH2SO4で停止した。次いでプレートを、分光光度計であるSpectraMax(登録商標)M3(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を用いて450nm/540nmの励起/発光で読んだ。以下の一次抗体を使用した:PBS中で1:10000希釈、予め吸着させた1.0mg/mLのヤギ抗ヒトIgG
H&L(ビオチン);PBS中で1:5000希釈、予め吸着させた0.5mg/mLのヤギ抗ヒトIgG H&L(ビオチン)。以下の二次抗体を使用した:PBS中で1:30000希釈、1mg/mLストレプトアビジン(HRP)。
前房液及び血液中の抗VEGF Fabの濃度の平均及び標準偏差の値は、Microsoft Office Excel 2010を用いて計算された。
A 薬理学的結果
この実施例において、異なるプロモーター及びコード配列を有する4個のAAVベクターが、上述のように評価された。ベクターは網膜下に投与された。抗VEGF Fabの発現は、酵素結合免疫吸着検査法によって測定された。
この実施例において、異なるプロモーター及びコード配列を有する4個のAAVベクターが、上述のように評価された。ベクターは網膜下に投与された。抗VEGF Fabの発現は、酵素結合免疫吸着検査法によって測定された。
前房液における抗VEGF Fabの発現
全ての群の動物の前房液において、同様の発現動態が観察された(図3A~3D、図4A~4D)。抗VEGF Fabの発現の始まりは迅速であり、概して7日以内であった。定常発現レベルは1ヶ月以内に達成された。最後に評価された時点まで、2匹の動物を
除いて全てが定常レベルで抗VEGF Fabを発現し続けた。
全ての群の動物の前房液において、同様の発現動態が観察された(図3A~3D、図4A~4D)。抗VEGF Fabの発現の始まりは迅速であり、概して7日以内であった。定常発現レベルは1ヶ月以内に達成された。最後に評価された時点まで、2匹の動物を
除いて全てが定常レベルで抗VEGF Fabを発現し続けた。
群2(図3B)の1匹の動物及び群5(図4A)の1匹の動物が抗VEGF Fabの発現を喪失した。発現の喪失は、抗VEGF Fabに対する抗体の出現と一致した。オスとメスとの間で、及び右眼と左眼との間で、抗VEGF Fabの発現の差異はまったく観察されなかった。
概して、CB7.CIプロモーターに制御されるベクター(図4A~4D)は、UbC.PIプロモーターで制御されるベクター(図3)よりも高いレベルで抗VEGF Fabを発現した。ベクターAAV2/8.CB7.CI.aVEGFv3aVEGFv3.rBGは、臨床開発のための最重要なベクターとして選択された。この選択は、導入遺伝子の発現レベル、aVEGFv3コード配列についての相対発現レベルのマウスからカニクイザルへのより良好な移行可能性、及びCB7.CIプロモーターによって経験するより優れたレベルに基づいた。
血液における抗VEGF Fabの発現
Lucentisの単一のIVT注射を投与された一部の患者において、ラニビズマブが血清で観察された(Xu,2013)。AAV2/8ベクターの網膜下投与が抗VEGF Fabの全身曝露をもたらすかどうかを見極めるために、その血清における濃度を測定した。
Lucentisの単一のIVT注射を投与された一部の患者において、ラニビズマブが血清で観察された(Xu,2013)。AAV2/8ベクターの網膜下投与が抗VEGF Fabの全身曝露をもたらすかどうかを見極めるために、その血清における濃度を測定した。
抗VEGF Fabの発現は、全ての動物の血液においてベースラインレベル近辺であった(図3A~3D、図4A~4D)。
B.毒性学
AAV2/8ベクター及び抗VEGF Fabの毒性の評価はこのサブパートBに記載される。動物はAAV2/8ベクターを網膜下投与された。毒性は、臨床観察、体重、間接眼底検査、スペクトル領域光干渉断層写真術(SD-OCT)、血液学、凝固、臨床化学、及び肉眼病理所見に基づいて評価された。
AAV2/8ベクター及び抗VEGF Fabの毒性の評価はこのサブパートBに記載される。動物はAAV2/8ベクターを網膜下投与された。毒性は、臨床観察、体重、間接眼底検査、スペクトル領域光干渉断層写真術(SD-OCT)、血液学、凝固、臨床化学、及び肉眼病理所見に基づいて評価された。
各々の処理群における各々の変数について、ウィルコクソンの順位和検定を用いて各々の時点での測定が、対応するベースライン値と比較された。ウィルコクソンの順位和検定は、2標本t検定のノンパラメトリックな代替法であり、これは2標本からの観測が含まれる順位にのみ基づいている。それは小さな試料サイズを有するデータセットに好ましい検定である。統計学的有意性は、複数の検定について調整なしに0.05レベルで宣言された。分析は「wilcox.test」の機能でRプログラム(version 3.3.1;cran.r-project.org/)を用いて実施された。
試験は進行中である。提示される結果は、10ヶ月までに集められたデータに基づく。この試験において死亡はまったくなかった。AAV2/8ベクターまたは抗VEGF Fabに関連する有害な臨床観察は、いずれの動物においてもまったく注目されなかった。いずれの動物についても試験中の体重の臨床的に意味のある変化が観察されなかった。間接眼底検査の間に、AAV2/8ベクターまたは抗VEGF Fabに関連する有害所見は、いずれの動物においてもまったく注目されなかった。
スペクトル領域光干渉断層写真術
群6の全部で4匹の動物(8個の眼)がSD OCTで撮像された。中間用量レベルのAAV8.aVEGF試験ベクター(1.00×1011GC/眼)の投与を受けた眼の注射された領域は、実施例7(特にサブパートB)に記載される、1.00×1010及び1.00×1012用量レベルと比較して中間の結果を示した。2匹の動物(動物C7
1896及び動物C65936)において、ONLのいくらかの菲薄化が観察された(データはファイル上にあり)。さらに、2匹の動物(動物C74422及び動物C74414)において、最小限の変化が観察された(データはファイル上にあり)。血液学的、凝固または臨床化学的パラメーターにおいて臨床的に意味のある変化は、いずれの動物においても観察されなかった。
群6の全部で4匹の動物(8個の眼)がSD OCTで撮像された。中間用量レベルのAAV8.aVEGF試験ベクター(1.00×1011GC/眼)の投与を受けた眼の注射された領域は、実施例7(特にサブパートB)に記載される、1.00×1010及び1.00×1012用量レベルと比較して中間の結果を示した。2匹の動物(動物C7
1896及び動物C65936)において、ONLのいくらかの菲薄化が観察された(データはファイル上にあり)。さらに、2匹の動物(動物C74422及び動物C74414)において、最小限の変化が観察された(データはファイル上にあり)。血液学的、凝固または臨床化学的パラメーターにおいて臨床的に意味のある変化は、いずれの動物においても観察されなかった。
AAV2/8ベクターまたは抗VEGF Fabに関連する所見は10ヶ月で犠牲にした2匹の動物においてまったく観察されなかった。動物C65936において、肝重量が観察され、それは顕微鏡的に局所性慢性グレード3の炎症であった。動物C74414において、両側性のグレード3リンパ組織過形成が観察された。これらの所見はAAV2/8ベクターまたは抗VEGF Fabと関連していなかった。1.00×1011GC/眼のAAV2/8ベクターの用量レベルにおいて、AAV2/8ベクターまたは抗VEGF Fabに関連した唯一の所見は、動物C65926の右眼のレンズの最小限の空胞化であった。動物C74414において、血管周囲の単核性細胞が右の視神経の脈管構造の周辺に最小限浸潤することが観察された。同一の動物で、左眼において最小限の単核性細胞の結膜下の浸潤、及び右眼において最小限の血管周囲眼球外の単核性細胞の浸潤が注目された。
AAV2/8ベクターまたは抗VEGF Fabに関連した唯一の有害な所見は、1.00×1011GC/眼のAAV2/8ベクターを投与された動物のいくつかの眼においてSD-OCTによって観察された注射部位に局在するONLにおけるいくらかの菲薄化であった。
C.免疫学
この節において、AAV2/8ベクター及び抗VEGF Fabの免疫原性の評価が記載される。ベクターは、この実施例において前述したように、網膜下に投与された。免疫原性は、抗VEGF Fabに対するIgM及びIgG抗体、AAV8カプシドに対する中和抗体、ならびにAAV2/8ベクター及び抗VEGF Fabに対する細胞免疫応答の存在によって評価された。
この節において、AAV2/8ベクター及び抗VEGF Fabの免疫原性の評価が記載される。ベクターは、この実施例において前述したように、網膜下に投与された。免疫原性は、抗VEGF Fabに対するIgM及びIgG抗体、AAV8カプシドに対する中和抗体、ならびにAAV2/8ベクター及び抗VEGF Fabに対する細胞免疫応答の存在によって評価された。
要約すると、群2及び群5の各々における1匹の動物が、抗VEGF Fabに対する抗体、AAV8カプシドに対する高レベルのNab、及びT細胞応答を有した。両方の動物は抗VEGF Fabの発現を喪失していた。予め存在したAAV8カプシドに対するNAbを有する動物は概して、予め存在したNabを有さない動物と比べたとき、AAV2/8ベクターの投与後に増加した応答を有した。約300日の試験日で犠牲にした一部の動物において、AAV8カプシドに対するNAbは、硝子体液に観察された。抗VEGF Fabに対する抗体及びT細胞応答は群6の動物においてまったく観察されなかった。群6の動物において、AAV2/8ベクターの投与後に、NAbレベルの緩やかな変動のみが観察された。
抗VEGF Fabは、AAV2/8ベクターを投与された全ての動物において発現した(この実施例のパートA)。2匹の動物(動物C74440及び動物C68127)は、抗VEGF Fabの発現を喪失していた。発現の喪失は、抗VEGF Fabに対する抗体の出現と一致した。
全体として、抗VEGF Fabに対するIgM及びIgGのレベルは、前房液及び血清のベースラインレベル未満であった。一部の動物で、一部の時点において、ベースラインレベルを超える増加が観察された。群2(動物C74440)及び群5(動物C68127)の各々における1匹の動物において、前房液の抗VEGF Fabに対するIgGのレベルが、約6ヶ月においてベースラインレベルを超えて増加した。その後、レベルは
概して増加した。両方の動物において、抗VEGF Fabに対するIgGが、血清のベースラインレベルを超えて増加した。これらのIgGにおける増加は、抗VEGF Fabの発現の喪失と一致した。重要なことに、群6の動物における抗VEGF Fabに対するIgM及びIgGは、試験の期間中、検出されなかったか、またはベースラインレベル未満であった。
概して増加した。両方の動物において、抗VEGF Fabに対するIgGが、血清のベースラインレベルを超えて増加した。これらのIgGにおける増加は、抗VEGF Fabの発現の喪失と一致した。重要なことに、群6の動物における抗VEGF Fabに対するIgM及びIgGは、試験の期間中、検出されなかったか、またはベースラインレベル未満であった。
手短に、動物の免疫系は、導入遺伝子産物がヒト抗体であるという事実にもかかわらず、抗VEGF導入遺伝子産物の局所的な発現の継続を許容した。
AAV8カプシドに対する中和抗体の存在
AAV8カプシドに対するNAbのベースラインレベルは、0日の試験日で採取した血液試料由来の血清中で測定された。検出限界は1:5希釈であり、5未満の力価を検出不能とみなした。16匹の動物の内の2匹(動物C63116及び動物C66122)において、血清中に予め存在するNAbが観察されなかった。AAV2/8ベクターの投与に続いてこれら2匹の動物におけるNAbのレベルは、検出限界未満に維持されたか、または低かった。16匹の動物の内の14匹において、予め存在するNAbが観察された。これらの動物のうちの11匹において、NAbのレベルは、試験を通して変動した。群2(動物C74440)及び群5(動物C68127)の各々の1匹の動物において、AAV2/8ベクターの投与に続いてNAbのレベルは、2ヶ月において、それぞれ256及び128まで、2倍希釈で増加した。これらのNAbにおける増加は、抗VEGF Fabの発現の喪失と一致した。群2、3、及び5からの6匹の犠牲にした動物において、硝子体液におけるNAbの存在が評価された。犠牲時に血清中のNAbが検出不能であった2匹の動物(動物C63116及び動物C66122)において、NAbは犠牲時に硝子体液中に存在しなかった。残りの動物において、犠牲時のNAbのレベルは、犠牲時の血清中のレベルと相関しなかった。群6における全ての動物において、予め存在するNAbが観察された。これらの動物におけるNAbのレベルは、試験を通じて緩やかに変動した。
AAV8カプシドに対するNAbのベースラインレベルは、0日の試験日で採取した血液試料由来の血清中で測定された。検出限界は1:5希釈であり、5未満の力価を検出不能とみなした。16匹の動物の内の2匹(動物C63116及び動物C66122)において、血清中に予め存在するNAbが観察されなかった。AAV2/8ベクターの投与に続いてこれら2匹の動物におけるNAbのレベルは、検出限界未満に維持されたか、または低かった。16匹の動物の内の14匹において、予め存在するNAbが観察された。これらの動物のうちの11匹において、NAbのレベルは、試験を通して変動した。群2(動物C74440)及び群5(動物C68127)の各々の1匹の動物において、AAV2/8ベクターの投与に続いてNAbのレベルは、2ヶ月において、それぞれ256及び128まで、2倍希釈で増加した。これらのNAbにおける増加は、抗VEGF Fabの発現の喪失と一致した。群2、3、及び5からの6匹の犠牲にした動物において、硝子体液におけるNAbの存在が評価された。犠牲時に血清中のNAbが検出不能であった2匹の動物(動物C63116及び動物C66122)において、NAbは犠牲時に硝子体液中に存在しなかった。残りの動物において、犠牲時のNAbのレベルは、犠牲時の血清中のレベルと相関しなかった。群6における全ての動物において、予め存在するNAbが観察された。これらの動物におけるNAbのレベルは、試験を通じて緩やかに変動した。
AAV2/8ベクター及び抗VEGF Fabに対するT細胞応答
群2の1匹の動物(動物C74440)において、単一の時点において上昇したT細胞応答が観察された。この動物において、抗VEGF Fabに対する抗体、及びAAV8カプシドに対する中和抗体もまた観察された。この動物は抗VEGF Fabの発現を喪失していた。群5の1匹の動物(動物C65873)において、AAV8カプシドのプールBペプチドに対する提示された持続したT細胞応答は、あらかじめ注射されたベースライン試料を含んで観察された。同一の動物は、AAV2/8ベクターの投与後、最も高いレベルのNAbを有した。同一の群の別の動物(動物C68127)は、AAV8カプシドの全てのペプチドプールに対するT細胞を生じたが経時的に持続されなかった。この動物は抗VEGF Fabに対する抗体及び2番目に高いレベルのNAbを有した。動物は抗VEGF Fabの発現を喪失していた。
群2の1匹の動物(動物C74440)において、単一の時点において上昇したT細胞応答が観察された。この動物において、抗VEGF Fabに対する抗体、及びAAV8カプシドに対する中和抗体もまた観察された。この動物は抗VEGF Fabの発現を喪失していた。群5の1匹の動物(動物C65873)において、AAV8カプシドのプールBペプチドに対する提示された持続したT細胞応答は、あらかじめ注射されたベースライン試料を含んで観察された。同一の動物は、AAV2/8ベクターの投与後、最も高いレベルのNAbを有した。同一の群の別の動物(動物C68127)は、AAV8カプシドの全てのペプチドプールに対するT細胞を生じたが経時的に持続されなかった。この動物は抗VEGF Fabに対する抗体及び2番目に高いレベルのNAbを有した。動物は抗VEGF Fabの発現を喪失していた。
この他の導入遺伝子産物に対する持続したT細胞応答は観察されなかった。群6の動物において、持続したT細胞応答はまったく観察されなかった。
AAV2/8.aVEGF及び抗VEGF導入遺伝子産物を評価するために有用な動物モデル
VEGFトランスジェニックマウスは、滲出型AMDの動物モデルとして使用した。2種のそのようなモデルは、Rho/VEGFマウスモデル及びTet/オプシン/VEGFモデルを含む。
VEGFトランスジェニックマウスは、滲出型AMDの動物モデルとして使用した。2種のそのようなモデルは、Rho/VEGFマウスモデル及びTet/オプシン/VEGFモデルを含む。
A.Rho/VEGFマウスモデル
Rho/VEGFマウスは、ロドプシンプロモーターが光受容体におけるヒト血管内皮増殖因子(VEGF165)の発現を駆動し、出生後10日目から新しい血管が網膜の深い毛細血管床から発芽し、網膜下腔に向けて成長する、トランスジェニックマウスである。VEGFの産生は、持続し、したがって新しい血管は成長し続け、拡張し、加齢性黄斑変性を有するヒトにおいてみられるものと同様の網膜下腔における大きな網を形成する。Tobe,Takao,et al.”Evolution of neovascularization in mice with overexpression of
vascular endothelial growth factor in photoreceptors.”Investigative ophthalmology & visual science 39.1(1998):180-188を参照されたい。
Rho/VEGFマウスは、ロドプシンプロモーターが光受容体におけるヒト血管内皮増殖因子(VEGF165)の発現を駆動し、出生後10日目から新しい血管が網膜の深い毛細血管床から発芽し、網膜下腔に向けて成長する、トランスジェニックマウスである。VEGFの産生は、持続し、したがって新しい血管は成長し続け、拡張し、加齢性黄斑変性を有するヒトにおいてみられるものと同様の網膜下腔における大きな網を形成する。Tobe,Takao,et al.”Evolution of neovascularization in mice with overexpression of
vascular endothelial growth factor in photoreceptors.”Investigative ophthalmology & visual science 39.1(1998):180-188を参照されたい。
酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)を以下のように実施できる。手短に、プレートを1μg/mLのVEGFで4℃において一晩コーティングする。1%BSAをブロッキング緩衝液として使用し、ウェル当たり200μLで室温において1時間インキュベートする。試料を、ウェル当たり100μLで二重で充填し、37℃で1時間インキュベートし、二次ブロッキング緩衝液のインキュベーションが後に続く。一次抗体は、ビオチン結合したヤギ抗ヒトIgG H&Lであり、ウェル当たり100μLで室温において1時間インキュベートするよう放置される。二次抗体は、1:30,000希釈のストレプトアビジンであり、ウェル当たり100μLで充填し、室温において1時間インキュベートする。TMB溶液を検出基質(0.1MのNaOAcクエン酸緩衝液(pH6.0)、過酸化水素、100×TMBストック)として使用し、ウェル当たり150μLで充填し、遮光して室温において30分間インキュベートする。50μLの停止溶液(2NのH2SO4)を各々のウェルに添加し、次いで、各々のプレートを450nm-540nmで読んだ。
このモデルと先行する実施例に記載されるような試験AAV8.aVEGFとを用いて実施した1つの試験において、ELISAの結果は以下のとおりであった:
B.Tet/オプシン/VEGFマウスモデル
Tet/オプシン/VEGFマウスは、飲料水中のドキシサイクリンを与えるまでは正常であるトランスジェニックマウスである。ドキシサイクリンは、非常に高い血管内皮増殖因子(VEGF)の光受容体における発現を誘導し、大規模な血管漏出をもたらし、誘導の4日以内にマウスの80~90%において、全滲出性網膜剥離を現出させる。Ohno-Matsui,Kyoko,et al.”Inducible expression of vascular endothelial growth factor
in adult mice causes severe proliferative retinopathy and retinal detachment.”The American journal of pathology 160.2(2002):711-719を参照されたい。
Tet/オプシン/VEGFマウスは、飲料水中のドキシサイクリンを与えるまでは正常であるトランスジェニックマウスである。ドキシサイクリンは、非常に高い血管内皮増殖因子(VEGF)の光受容体における発現を誘導し、大規模な血管漏出をもたらし、誘導の4日以内にマウスの80~90%において、全滲出性網膜剥離を現出させる。Ohno-Matsui,Kyoko,et al.”Inducible expression of vascular endothelial growth factor
in adult mice causes severe proliferative retinopathy and retinal detachment.”The American journal of pathology 160.2(2002):711-719を参照されたい。
ELISAは、この実施例のパートAに記載されるように実施できる。このモデルと先行する実施例に記載されるような試験AAV8.aVEGFとを用いて実施した1つの試験において、ELISAの結果は以下のとおりであった:結果は以下の表に平均±標準偏差(Std)として示される。
C.他の動物モデル
滲出型AMDの他の動物モデルを使用した。レーザー外傷モデルにおいて、ブルッフ膜において損傷を誘導するために高出力、集束レーザーエネルギーが使用される。マトリゲル、VEGF、マクロファージ、脂質ヒドロペルオキシド、及び/またはポリエチレングリコールの網膜下注射は、滲出型AMDの病態である脈絡膜血管新生(CNV)を誘導する。Pennesi,Mark E.,Martha Neuringer,and R
obert J.Courtney.”Animal models of age related macular degeneration.”Molecular aspects of medicine 33.4(2012):487-509を参照されたい。
滲出型AMDの他の動物モデルを使用した。レーザー外傷モデルにおいて、ブルッフ膜において損傷を誘導するために高出力、集束レーザーエネルギーが使用される。マトリゲル、VEGF、マクロファージ、脂質ヒドロペルオキシド、及び/またはポリエチレングリコールの網膜下注射は、滲出型AMDの病態である脈絡膜血管新生(CNV)を誘導する。Pennesi,Mark E.,Martha Neuringer,and R
obert J.Courtney.”Animal models of age related macular degeneration.”Molecular aspects of medicine 33.4(2012):487-509を参照されたい。
最適化されたrAAV.aVEGFベクターが生成され、希釈され、トランスジェニックマウスの眼の網膜下腔に先行する実施例に記載される用量で送達される。眼及び/または血漿におけるレポーター遺伝子、VEGF、及び抗VEGF抗体の発現は、先行する実施例に記載されるように、PCR、qPCR、ddPCR、oqPCR、ウェスタンブロット、及びELISAによって測定された。網膜血管新生を評価するために電子顕微鏡及び免疫組織化学解析もまた実施された。網膜当たりの損傷の数、損傷当たりの面積、網膜当たりの血管新生面積、及び牽引網膜剥離の網膜の組織病理学的評価が定量化される。
カニクイザルにおける抗VEGF Fab(導入遺伝子産物)の発現の評価
この試験は、カニクイザルにおける投与に続いて、抗VEGF Fab(導入遺伝子産物)の発現を評価し、かつ抗VEGF Fabを発現するAAV8ベクターの毒性、免疫原性、及び生体内分布を評価するために実施された。この報告において、導入遺伝子産物の発現及びベクターの免疫原性が記載される。動物は、これらの実施例において記載されるようなAAV2/8.aVEGFベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。前房液及び血液における導入遺伝子産物の発現は、酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)によって測定された。免疫原性は、投与の前後で、AAV8カプシドに対する中和抗体(NAb)の存在によって評価された。導入遺伝子産物は、ベクターを投与された全ての動物の前房液において発現している。導入遺伝子産物は、血液において発現していない。NAbのレベルにおける増加は、1匹のAAV8.aVEGFを投与された動物(C73723)において観察され、この動物は予め存在するNAbを有した。
この試験は、カニクイザルにおける投与に続いて、抗VEGF Fab(導入遺伝子産物)の発現を評価し、かつ抗VEGF Fabを発現するAAV8ベクターの毒性、免疫原性、及び生体内分布を評価するために実施された。この報告において、導入遺伝子産物の発現及びベクターの免疫原性が記載される。動物は、これらの実施例において記載されるようなAAV2/8.aVEGFベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。前房液及び血液における導入遺伝子産物の発現は、酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)によって測定された。免疫原性は、投与の前後で、AAV8カプシドに対する中和抗体(NAb)の存在によって評価された。導入遺伝子産物は、ベクターを投与された全ての動物の前房液において発現している。導入遺伝子産物は、血液において発現していない。NAbのレベルにおける増加は、1匹のAAV8.aVEGFを投与された動物(C73723)において観察され、この動物は予め存在するNAbを有した。
この試験における動物は、1.00×1012ゲノムコピー(GC)/眼の単一用量のAAV8.CB7.CI.aVEGFv3.rBGまたは製剤緩衝液、FFB-314を投与された。
AAV8.CB7.CI.aVEGFv3.RBG及びFFB-314は、100μLの全量で右眼において網膜下に投与された(顕微鏡下でドーム型の網膜剥離/網膜ブレブの外観によって肉眼で確認された)。
動物はwww.jamestease.co.uk/team-generatorを用いてランダム化された。www.randomizer.org/を用いて4匹の動物のうち1匹がランダムで選択され、群2に割り得てられた。残りの3匹の動物は群1に割り当てられた。この試験のための群の設計及び用量レベルは、以下の表に提示される。
動物は7日の試験日で安楽死させた。抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現及び/またはAAV8カプシドに対するNAbの存在を決定するために、前房液及び血液の試料を採取した。
先行する実施例に記載されるように網膜下注射は実施された。前房液の採取は先行する実施例に記載されるようであった。ELISAのために、96ウェル丸底プレートが、抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現のために1μg/mLのVEGFで、または抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するIgM及びIgGの発現のために0.5μg/mLの市販の抗VEGF Fabでコーティングされた。ELISAの方法は、先行する実施例に記載されるとおりであった。
以下の一次抗体を使用した:PBS中で1:10000希釈、予め吸着させた1.0mg/mLのヤギ抗ヒトIgG H&L(ビオチン);PBS中で1:5000希釈、予め吸着させた0.5mg/mLのヤギ抗ヒトIgG H&L(ビオチン)。以下の二次抗体を使用した:PBS中で1:30000希釈、1mg/mLストレプトアビジン(HRP)。
中和抗体アッセイ
AAV8カプシドに応答する中和抗体は以下のように分析された。ポリDリシンコーティングされた96ウェル黒色壁/透明底プレートは、1×105細胞/ウェルでヒト胚腎臓293(HEK293)細胞を播種され(細胞プレートと呼ぶ)、プレートを37℃で一晩インキュベートした。次の日に、血清試料を56℃で30分間熱不活化した。熱不活化した試料及び組換えベクター(1×109GC/ウェルの、Penn Vector Core at the University of Pennsylvaniaが提供したAAV8.CMV.LacZ)を血清-ベクタープレートを構成するために使用した。組換えベクターを無血清ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で希釈し、2倍系列希釈(1:5で開始)の熱不活化試料と共に37℃で1時間インキュベートした。血清ベクタープレートと細胞プレートとを組み合せる前に、HEK293細胞(ここで2×105細胞/ウェル)を野生型HAdV5(90粒子/細胞)によって感染させ、37℃で2時間インキュベートした。インキュベーションの後、血清-ベクタープレート及び細胞プレートを組み合せて37℃で1時間インキュベートした。インキュベーションの後、等量の20%ウシ胎仔血清(FBS)とDMEMを各々のウェルに添加し、組み合わせたプレートを37℃でさらに18~22時間培養した。次の日に、組み合わせたプレートをPBSで洗浄し、HEK293細胞を溶解し、製造者の取扱説明書に従って溶解物を、哺乳動物β-ガラクトシダーゼ生物発光アッセイキットを用いて発色させた。コントロールとして、血清試料の代わりにマウス血清を使用した。生じる発光は、SpectraMax(登録商標)M3マイクロプレートルミノメーターを用いて測定した。生じるNAbの力価は、マウス血清と比較して少なくとも50%ベクターの形質導入を阻害する血清希釈として報告された。
AAV8カプシドに応答する中和抗体は以下のように分析された。ポリDリシンコーティングされた96ウェル黒色壁/透明底プレートは、1×105細胞/ウェルでヒト胚腎臓293(HEK293)細胞を播種され(細胞プレートと呼ぶ)、プレートを37℃で一晩インキュベートした。次の日に、血清試料を56℃で30分間熱不活化した。熱不活化した試料及び組換えベクター(1×109GC/ウェルの、Penn Vector Core at the University of Pennsylvaniaが提供したAAV8.CMV.LacZ)を血清-ベクタープレートを構成するために使用した。組換えベクターを無血清ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で希釈し、2倍系列希釈(1:5で開始)の熱不活化試料と共に37℃で1時間インキュベートした。血清ベクタープレートと細胞プレートとを組み合せる前に、HEK293細胞(ここで2×105細胞/ウェル)を野生型HAdV5(90粒子/細胞)によって感染させ、37℃で2時間インキュベートした。インキュベーションの後、血清-ベクタープレート及び細胞プレートを組み合せて37℃で1時間インキュベートした。インキュベーションの後、等量の20%ウシ胎仔血清(FBS)とDMEMを各々のウェルに添加し、組み合わせたプレートを37℃でさらに18~22時間培養した。次の日に、組み合わせたプレートをPBSで洗浄し、HEK293細胞を溶解し、製造者の取扱説明書に従って溶解物を、哺乳動物β-ガラクトシダーゼ生物発光アッセイキットを用いて発色させた。コントロールとして、血清試料の代わりにマウス血清を使用した。生じる発光は、SpectraMax(登録商標)M3マイクロプレートルミノメーターを用いて測定した。生じるNAbの力価は、マウス血清と比較して少なくとも50%ベクターの形質導入を阻害する血清希釈として報告された。
統計学的分析
前房液及び血液中の抗VEGF Fab導入遺伝子産物の濃度の平均及び標準偏差の値は、Microsoft Office Excel 2010を用いて計算された。
前房液及び血液中の抗VEGF Fab導入遺伝子産物の濃度の平均及び標準偏差の値は、Microsoft Office Excel 2010を用いて計算された。
結果
前房液における抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現
抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、FFB-314を投与された動物の前房液において発現していなかった。抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物の右眼から採取した前房液において発現していた。
左眼において発現はまったく観察されなかった。オスとメスの間で抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現の差異はまったく観察されなかった。
前房液における抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現
抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、FFB-314を投与された動物の前房液において発現していなかった。抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物の右眼から採取した前房液において発現していた。
左眼において発現はまったく観察されなかった。オスとメスの間で抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現の差異はまったく観察されなかった。
血液における抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現
Lucentisの単一のIVT注射を投与された一部の患者において、ラニビズマブが血清で観察された(Xu, Invest Ophthalmol Vis Sci,54:1616-24(2013))。AAV8.aVEGF試験ベクターの網膜下投与が抗VEGF Fab導入遺伝子産物の全身曝露をもたらすかどうかを見極めるために、その血清における濃度を測定した。
Lucentisの単一のIVT注射を投与された一部の患者において、ラニビズマブが血清で観察された(Xu, Invest Ophthalmol Vis Sci,54:1616-24(2013))。AAV8.aVEGF試験ベクターの網膜下投与が抗VEGF Fab導入遺伝子産物の全身曝露をもたらすかどうかを見極めるために、その血清における濃度を測定した。
抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現は、FFB-314を投与された動物及びAAV8.aVEGFベクターを投与された全ての動物の血液において、対応する注射前のレベルと比較して、非特異的なバックグランドレベル未満であった。
AAV8カプシドに対する中和抗体の存在
AAV8カプシドに対するNAbのベースラインレベルは、0日の試験日で採取した血液試料由来の血清中で測定された。検出限界は1:5希釈であり、5未満の力価を検出不能とみなした。
AAV8カプシドに対するNAbのベースラインレベルは、0日の試験日で採取した血液試料由来の血清中で測定された。検出限界は1:5希釈であり、5未満の力価を検出不能とみなした。
FFB-314を投与された動物は、AAV8カプシドに対す予め存在するNAbを有した(先の表を参照されたい)。AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された1匹の動物(C74431)は検出可能なAAV8カプシドに対するNAbを有さなかった。AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された2匹の動物(C73723、C65027)は、予め存在するAAV8カプシドに対するNAbが観察され、7日目に持続した(先の表を参照されたい)。
毒性は、臨床観察、体重、間接眼底検査、血液学、凝固、臨床化学、及び肉眼病理所見に基づいて評価された。この試験において死亡または予定外の犠牲は皆無であった。AAV8.aVEGF試験ベクターまたは抗VEGF Fab導入遺伝子産物に関連する有害な臨床観察は、いずれの動物に対してまったく注目されなかった。一部の動物は、体重が安定したままであったために動物の活動に影響を与えることなく、間欠性の一過性の下痢を示した。いずれの動物についても試験中の体重の臨床的に意味のある変化が観察されなかった。間接眼底検査の間に、AAV8.aVEGF試験ベクターまたは抗VEGF Fab導入遺伝子産物に関連する有害所見は、いずれの動物においてもまったく注目されな
かった。血液学的、凝固または臨床化学的パラメーターにおいて臨床的に意味のある変化は、いずれの動物においても観察されなかった。全ての動物において、全ての臨床病理学的パラメーターが正常範囲にあった。動物C64956及びC74431において肉眼的な所見はまったく存在しなかった。C73723の右腎及び左腎の表面は青白かった。C65027の肝臓において巣状病変が存在した。結論として、主要な毒物学的所見は存在しなかった。
かった。血液学的、凝固または臨床化学的パラメーターにおいて臨床的に意味のある変化は、いずれの動物においても観察されなかった。全ての動物において、全ての臨床病理学的パラメーターが正常範囲にあった。動物C64956及びC74431において肉眼的な所見はまったく存在しなかった。C73723の右腎及び左腎の表面は青白かった。C65027の肝臓において巣状病変が存在した。結論として、主要な毒物学的所見は存在しなかった。
実施例6~11における試験ベクターは、rAAV8.CB7.CI.aVEGFrv3.rBGである。
カニクイザルにおけるAAV2/8.aVEGFベクターの発現
この試験は、カニクイザルにおいて、抗VEGF導入遺伝子産物の発現を評価するため、ならびにAAV2/8.aVEGF及び抗VEGF導入遺伝子産物、及びAAV8.aVEGFの脱落が、毒性、免疫原性、及び正常な網膜機能に与える影響を評価するために実施された。試験は進行中である。
この試験は、カニクイザルにおいて、抗VEGF導入遺伝子産物の発現を評価するため、ならびにAAV2/8.aVEGF及び抗VEGF導入遺伝子産物、及びAAV8.aVEGFの脱落が、毒性、免疫原性、及び正常な網膜機能に与える影響を評価するために実施された。試験は進行中である。
実施例において上述されるAAV2/8.aVEGFを、この試験において使用した。ベクターを0.001%Pluronic F-68を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に希釈する。コントロール試料として、FFB-314(0.001%Pluronic F-68を含むDPBS)を使用した。試験は進行中である。提示される結果は、3ヶ月時点で集められたデータに基づく。
マカクは、網膜疾患を研究することに関してヒトに最も近い種であるため、マカクを使用した。これらのサル及びヒトは、中心窩を含む眼の同様の解剖学的構造を有する。眼の寸法は匹敵するものであり、相対的な網膜領域に基づいてヒトの用量を決定することが可能である。
実施例7における動物は、1.00×1010ゲノムコピー(GC)/眼の単一用量のAAV8.aVEGF、または1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGFもしくはFFB-314を投与された。AAV8.aVEGF及びFFB-314は、100μLの全量で右眼において網膜下に投与された(顕微鏡下でドーム型の網膜剥離/網膜ブレブの外観によって肉眼で確認された)。
動物は、www.jamestease.co.uk/team-generatorを用いてセット当たり4匹の動物の6セットにランダムに割り当てられた。セットに割り当てられた後、6セットの各々から4匹の動物のうちの1匹をwww.randomizer.org/を用いてランダムに選択し、それぞれの所与の投与日に、FFB-314を投与される群に割り当てた(群2、4、6、8、10、及び12)。残りの3匹の動物を、1×1012GC/眼または1×1010GC/眼のAAV8.aVEGFを投与される群に割り当てた(群1、3、5、7、9、及び11)。実施例6及び7に対する群の称号及び用量レベルは、以下に提示される。
A.薬理学
提示される結果は、3ヶ月時点で集められたデータに基づく。この報告において、抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現が記載される。
提示される結果は、3ヶ月時点で集められたデータに基づく。この報告において、抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現が記載される。
1.方法
動物は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。前房液及び血液における抗VEGF導入遺伝子産物の発現は、酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)によって測定され、これは前出の実施例に記載されるように実施された。
動物は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。前房液及び血液における抗VEGF導入遺伝子産物の発現は、酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)によって測定され、これは前出の実施例に記載されるように実施された。
2.薬理学的結果
(a)前房液における導入遺伝子産物の発現
導入遺伝子産物は、FFB-314を投与されたいずれの動物の前房液においても発現していなかった。導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全
ての動物の前房液において発現していた。発現の始まりは迅速であり、概して7日以内であった。定常発現レベルは1ヶ月以内に達成された。最後に評価された時点まで、全ての動物が定常レベルで導入遺伝子産物を発現し続けた。しかしながら、抗導入遺伝子産物の全体の発現レベルは、1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターを投与された動物においてより高かった。オスとメスの間で導入遺伝子産物の発現の差異はまったく観察されなかった。
(a)前房液における導入遺伝子産物の発現
導入遺伝子産物は、FFB-314を投与されたいずれの動物の前房液においても発現していなかった。導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全
ての動物の前房液において発現していた。発現の始まりは迅速であり、概して7日以内であった。定常発現レベルは1ヶ月以内に達成された。最後に評価された時点まで、全ての動物が定常レベルで導入遺伝子産物を発現し続けた。しかしながら、抗導入遺伝子産物の全体の発現レベルは、1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターを投与された動物においてより高かった。オスとメスの間で導入遺伝子産物の発現の差異はまったく観察されなかった。
(b)血液における導入遺伝子産物の発現
Lucentisの単一のIVT注射を投与された一部の患者では、ラニビズマブが血清で観察された(Xu,Invest Ophthalmol Vis Sci.2013 Mar 5,54(3):1616-24)。これらの実施例において記載されるAAV2/8.aVEGF試験ベクターの網膜下投与が抗VEGF Fab導入遺伝子産物の全身曝露をもたらすかどうかを見極めるために、その血清における濃度を測定した。抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物の血液において、対応する注射前のレベルと比較して、非特異的なバックグランドレベル未満であった。
Lucentisの単一のIVT注射を投与された一部の患者では、ラニビズマブが血清で観察された(Xu,Invest Ophthalmol Vis Sci.2013 Mar 5,54(3):1616-24)。これらの実施例において記載されるAAV2/8.aVEGF試験ベクターの網膜下投与が抗VEGF Fab導入遺伝子産物の全身曝露をもたらすかどうかを見極めるために、その血清における濃度を測定した。抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物の血液において、対応する注射前のレベルと比較して、非特異的なバックグランドレベル未満であった。
3.結論
●抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物の前房液において発現していた。
●抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物の前房液において発現していた。
●抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物の血液において発現していない。
B.毒性学
この報告において、AAV2/8.aVEGF試験ベクターの毒性の評価が記載される。動物は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。毒性は、臨床観察、体重、眼圧、間接眼底検査、スペクトル領域光干渉断層写真術、血液学、凝固、臨床化学、及び肉眼病理所見、及び病理組織学的所見に基づいて評価された。
この報告において、AAV2/8.aVEGF試験ベクターの毒性の評価が記載される。動物は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。毒性は、臨床観察、体重、眼圧、間接眼底検査、スペクトル領域光干渉断層写真術、血液学、凝固、臨床化学、及び肉眼病理所見、及び病理組織学的所見に基づいて評価された。
眼圧はリバウンド眼圧測定(TonoVet)を介して評価した。この方法は、使用が簡単であり局所麻酔を必要としない。リバウンド眼圧測定は、角膜に対して発射される小さなプラスチックの先端の金属プローブを磁化するための誘導コイルを用いることによってOPを推定する。プローブが装置にリバウンドして戻るとき、誘導電流を生成し、そこからOPを計算する。2回までのデータ読み取りを実施し、そこから平均OPを決定し、結果の正確さが示された。装置の適用は、製造者の取扱説明書に従って実施した。
網膜の構造(ミクロンレベルの分解能で)をSD-OCT(Spectralis OCT,Heidelberg Engineering,Carlsbad,CA)を用いるインビボで非侵襲的な断面網膜顕微鏡により評価した。瞳孔は、フェニレフリン2.5%及びトロピカミド1%で散大された。このイメージングシステムの走査型レーザー検眼鏡を使用して、近赤外(NIR)反射率(REF)、及び動物の部分集合においてNIR眼底自発蛍光(FAF)によって、正面型網膜画像化を実施した。スペクトル領域光干渉断層写真術スキャンは、中心窩を通る9mmの長さの水平及び垂直断面、ならびにほぼ中間の領域に延びる30×25mmのラスタースキャンを重ね合わせて実施した。
唯一のAAV8.aVEGF試験ベクターの関連した有害所見は、1.00×1012GC/眼の試験ベクターを投与された動物におけるスペクトル領域光干渉断層写真術によって観察された重大な網膜の菲薄化及び光受容体の喪失であった。
C.網膜電図(ERG)
このサブパートにおいて、AAV8.aVEGF試験ベクター及び抗VEGF Fab導入遺伝子産物の正常な網膜機能に対する影響の評価が記載される。動物は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。網膜機能は、全視野網膜電図(ERG)によって評価された。全視野ERGは、広く使用される網膜機能の電気生理学試験である。網膜電図は、光刺激に応答する網膜によって生成される集合電位である。通常、それは、角膜表面と接触する電極によって記録される。この試験における網膜電図は、国際臨床視覚電気生理学会(ISCEV;McCulloch, Doc Ophthalmol. 2015 Feb;130(1):1-12. 2015)が設定した推奨に従って実施された。提示される結果は、3ヶ月時点で集められたデータに基づく。この報告において、AAV8.aVEGF試験ベクター及び抗VEGF Fab導入遺伝子産物の正常な網膜機能に対する影響の評価が記載される。動物は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。網膜機能は、全視野網膜電図によって評価された。要約すると、1.00×1010ゲノムコピー(GC)/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターの投与は網膜機能を損なわない。対照的に、1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターの投与は網膜機能を損なう。
このサブパートにおいて、AAV8.aVEGF試験ベクター及び抗VEGF Fab導入遺伝子産物の正常な網膜機能に対する影響の評価が記載される。動物は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。網膜機能は、全視野網膜電図(ERG)によって評価された。全視野ERGは、広く使用される網膜機能の電気生理学試験である。網膜電図は、光刺激に応答する網膜によって生成される集合電位である。通常、それは、角膜表面と接触する電極によって記録される。この試験における網膜電図は、国際臨床視覚電気生理学会(ISCEV;McCulloch, Doc Ophthalmol. 2015 Feb;130(1):1-12. 2015)が設定した推奨に従って実施された。提示される結果は、3ヶ月時点で集められたデータに基づく。この報告において、AAV8.aVEGF試験ベクター及び抗VEGF Fab導入遺伝子産物の正常な網膜機能に対する影響の評価が記載される。動物は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。網膜機能は、全視野網膜電図によって評価された。要約すると、1.00×1010ゲノムコピー(GC)/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターの投与は網膜機能を損なわない。対照的に、1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターの投与は網膜機能を損なう。
1.網膜電図(ERG)のパラメーター
網膜電図(ERG)は、通常、全網膜細胞が閃光刺激(暗順応の動物、中程度から強烈な閃光)に対し能動的な応答であるときに生成する。2つの構成要素は以下のものである:
●a波:閃光後の最初の角膜陰性シグナル。起源:光受容体光電流、光受容体機能の最も直接的な特徴。
●b波:大部分がオン型双極細胞(光受容体下流の二次ニューロン)によって生成されるa波の後に続く角膜陽性シグナル。
この試験において、国際臨床視覚電気生理学会(ISCEV)に従う標準及び追加プロトコールが使用された:
●暗順応桿状体のERG:刺激強度:0.01~0.02cd s m-2。応答:b波のみ、a波はなし。源:桿体「オン型」双極細胞(桿状体からの入力に駆動される二次ニューロン)。意味:桿体視細胞機能の測定。データシートにおける表記:「薄暗い閃光」
●暗順応標準的な閃光ERG:刺激強度:3cd s m-2。応答:桿体錐体視細胞のa波とb波の混合;60%~70%のシグナルは、桿体視細胞駆動経路によって生成される。源:光受容体、桿体視細胞と錐体視細胞の両方(a波);桿体視細胞と錐体視細胞の両方によって駆動される高次ニューロン。意味:大部分の桿体視細胞の機能の測定、暗順応の状態に対して感度が低く、「薄暗い閃光」応答よりも低い可変性である。データシートにおける表記:「標準的な閃光」。
●暗順応明るい閃光ERG:刺激強度:10cd s m-2。応答及び意味:「標準的な閃光」の応答についてと同一であるが、明るい閃光への応答は、規模がより大きく、より可変性が低くあり得る。データシートにおける表記:「明るい閃光」
●明順応標準的な閃光錐体視細胞ERG:刺激強度:5分間の明順応の後、30cd m-2のバックグランド光の存在下で送達される3cd s m-2。応答:錐体視細胞駆動経路によって生成されるa波及びb波。意味:錐体視細胞を完全に非感光性にするバックグランド光の存在下で、ERGが錐体視細胞及び錐体視細胞駆動二次網膜ニューロンによって排他的に作成され、錐体の機能を測定する。データシートにおける表記:「標準的な錐体ERG」
●明順応明るい閃光錐体ERG(ISCEV標準に対して追加して)刺激強度:5分間の明順応の後、30cd m-2のバックグランド光の存在下で送達される10cd s
m-2。応答及び意味:錐体視細胞駆動ERGは「標準的な錐体視細胞ERG」の場合のようであったが、より大きな規模であり、潜在的により低い可変性である。
網膜電図(ERG)は、通常、全網膜細胞が閃光刺激(暗順応の動物、中程度から強烈な閃光)に対し能動的な応答であるときに生成する。2つの構成要素は以下のものである:
●a波:閃光後の最初の角膜陰性シグナル。起源:光受容体光電流、光受容体機能の最も直接的な特徴。
●b波:大部分がオン型双極細胞(光受容体下流の二次ニューロン)によって生成されるa波の後に続く角膜陽性シグナル。
この試験において、国際臨床視覚電気生理学会(ISCEV)に従う標準及び追加プロトコールが使用された:
●暗順応桿状体のERG:刺激強度:0.01~0.02cd s m-2。応答:b波のみ、a波はなし。源:桿体「オン型」双極細胞(桿状体からの入力に駆動される二次ニューロン)。意味:桿体視細胞機能の測定。データシートにおける表記:「薄暗い閃光」
●暗順応標準的な閃光ERG:刺激強度:3cd s m-2。応答:桿体錐体視細胞のa波とb波の混合;60%~70%のシグナルは、桿体視細胞駆動経路によって生成される。源:光受容体、桿体視細胞と錐体視細胞の両方(a波);桿体視細胞と錐体視細胞の両方によって駆動される高次ニューロン。意味:大部分の桿体視細胞の機能の測定、暗順応の状態に対して感度が低く、「薄暗い閃光」応答よりも低い可変性である。データシートにおける表記:「標準的な閃光」。
●暗順応明るい閃光ERG:刺激強度:10cd s m-2。応答及び意味:「標準的な閃光」の応答についてと同一であるが、明るい閃光への応答は、規模がより大きく、より可変性が低くあり得る。データシートにおける表記:「明るい閃光」
●明順応標準的な閃光錐体視細胞ERG:刺激強度:5分間の明順応の後、30cd m-2のバックグランド光の存在下で送達される3cd s m-2。応答:錐体視細胞駆動経路によって生成されるa波及びb波。意味:錐体視細胞を完全に非感光性にするバックグランド光の存在下で、ERGが錐体視細胞及び錐体視細胞駆動二次網膜ニューロンによって排他的に作成され、錐体の機能を測定する。データシートにおける表記:「標準的な錐体ERG」
●明順応明るい閃光錐体ERG(ISCEV標準に対して追加して)刺激強度:5分間の明順応の後、30cd m-2のバックグランド光の存在下で送達される10cd s
m-2。応答及び意味:錐体視細胞駆動ERGは「標準的な錐体視細胞ERG」の場合のようであったが、より大きな規模であり、潜在的により低い可変性である。
各々の処理(FFB-314(ビヒクル)群、AAV8.aVEGF試験ベクター1.00×1010GC/眼群、AAV8.aVEGF試験ベクター1.00×1012GC/眼群)に対して、ERG測定(a波振幅、a波潜時、b波振幅、b波潜時)が、処理した眼及びコントロールの眼について平均及び標準偏差(SD)を用いてまとめられた。AAV8.aVEGF試験ベクター(処理)眼とFFB-314(コントロール眼)との間のERG測定を比較するため、及び注射後対注射前の比較のために、ペアt検定が使用された。AAV8.aVEGF試験ベクター1.00×1010GC/眼群対FFB-314(ビヒクル)群、AAV8.aVEGF試験ベクター1.00×1012GC/眼群対FFB-314(ビヒクル)群、及びAAV8.aVEGF試験ベクター1.00×1012GC/眼群対AAV8.aVEGF試験ベクター1.00×1010GC/眼群についてERG測定を比較するために、2標本t検定が使用された。t検定は、標本サイズが小さいとき[Winter JCF.Using the Student’s t-test with extremely small sample sizes.Practical Assessment,Research and Evaluation.2013;18(10)。オンラインで入手可能:pareonline.net/-getvn.asp?v=18&n=10]や、データが正規分布していないときでも適切である。Shuster JJ.Diagnostic for assumptions in moderate to large simple clinical trials: do they really help? Statist.Med.2005;24:2431-2438;Ganju J.D.“Diagnostic for assumptions in moderate to large simple clinical trials:do they really help?”に対するコメントStatist.Med.2006;25:1798-1800を参照されたい。全ての統計学的分析はSAS v9.4(SAS Institute Inc.,Cary,NC)で実施され、0.05以下の両側P値は統計学的に有意であるとみなされる。
2.結果
抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物において発現した(この実施例のパートAの薬理学的結果を参照されたい)。AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314の投与に続いて3ヶ月の網膜機能(注射後)を、処理された眼及び未処理の眼について投与前(注射前)の網膜機能と比較した。群8の動物は、FFB-314の投与後の取得できないERGのためにデータ分析から排除された。
抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物において発現した(この実施例のパートAの薬理学的結果を参照されたい)。AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314の投与に続いて3ヶ月の網膜機能(注射後)を、処理された眼及び未処理の眼について投与前(注射前)の網膜機能と比較した。群8の動物は、FFB-314の投与後の取得できないERGのためにデータ分析から排除された。
a.処理群間の網膜機能の比較
処理した眼について、注射後の網膜機能は、低用量群(1.00×1010GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクター)とFFB-314群との動物間で同等であった(前出の表を参照されたい)。処理した眼について、高用量群(1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクター)の動物における注射後の網膜機能は、FFB-314群の動物と比較して有意に低減していた(前出の表を参照されたい)。処理した眼について、高用量群の動物における注射後の網膜機能は、低用量群の動物と比較して有意に低減していた(前出の表を参照されたい)。未処理の眼について、注射後の網膜機能は、全ての群について、注射前と同等であった。
処理した眼について、注射後の網膜機能は、低用量群(1.00×1010GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクター)とFFB-314群との動物間で同等であった(前出の表を参照されたい)。処理した眼について、高用量群(1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクター)の動物における注射後の網膜機能は、FFB-314群の動物と比較して有意に低減していた(前出の表を参照されたい)。処理した眼について、高用量群の動物における注射後の網膜機能は、低用量群の動物と比較して有意に低減していた(前出の表を参照されたい)。未処理の眼について、注射後の網膜機能は、全ての群について、注射前と同等であった。
b.処理群内の網膜機能の比較
処理した眼について、低用量群及びFFB-314群において、注射後の網膜機能は、対応する注射前のベースラインと同等であった。処理した眼について、高用量群において、注射後の網膜機能は、対応する注射前のベースラインと比較して低減していた。未処理の眼について、注射後の網膜機能は、対応する注射前のベースラインと同等であった。
処理した眼について、低用量群及びFFB-314群において、注射後の網膜機能は、対応する注射前のベースラインと同等であった。処理した眼について、高用量群において、注射後の網膜機能は、対応する注射前のベースラインと比較して低減していた。未処理の眼について、注射後の網膜機能は、対応する注射前のベースラインと同等であった。
E.ウイルスの脱落
AAV8.aVEGF試験ベクターの脱落は、涙、鼻分泌物、血清、唾液、尿、及び糞便の試料中で導入遺伝子特異的配列を標的とする定量的PCR解析によって測定された。試料は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314の投与の前後で採取された。AAV8.aVEGF試験ベクターDNAは、AAV8.aVEGF試験ベクター
を投与された動物から採取された多くの試料において容易に検出可能であった。AAV8.aVEGFのDNAの存在は、用量依存的であり、一過性であり、経時的に低下した。
AAV8.aVEGF試験ベクターの脱落は、涙、鼻分泌物、血清、唾液、尿、及び糞便の試料中で導入遺伝子特異的配列を標的とする定量的PCR解析によって測定された。試料は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314の投与の前後で採取された。AAV8.aVEGF試験ベクターDNAは、AAV8.aVEGF試験ベクター
を投与された動物から採取された多くの試料において容易に検出可能であった。AAV8.aVEGFのDNAの存在は、用量依存的であり、一過性であり、経時的に低下した。
F.免疫原性
この試験において、AAV8.aVEGF試験ベクター及び抗VEGF Fab導入遺伝子産物の免疫原性が記載される。免疫原性は以下によって評価された:
●酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)を用いる、抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するIgM及びIgG抗体の存在;
●NAbアッセイを用いるAAV8カプシドに対する中和抗体(NAb)の存在;
●酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイを用いる、AAV8.aVEGF試験ベクター及び抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するT細胞応答。
この試験において、AAV8.aVEGF試験ベクター及び抗VEGF Fab導入遺伝子産物の免疫原性が記載される。免疫原性は以下によって評価された:
●酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)を用いる、抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するIgM及びIgG抗体の存在;
●NAbアッセイを用いるAAV8カプシドに対する中和抗体(NAb)の存在;
●酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイを用いる、AAV8.aVEGF試験ベクター及び抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するT細胞応答。
この実施例において上述されるように、動物は、AAV8.aVEGF試験ベクターまたはFFB-314(コントロール試料)を網膜下に投与された。抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対する持続するIgM、IgG、またはT細胞の応答は、いずれの動物においてもまったく観察されなかった。1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターを投与された動物は、1.00×1010GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターを投与された動物よりも高い、AAV8カプシドに応答する中和抗体(NAb)を生じた。NAb応答は、予め存在するNAbを有する動物においてより高かった。1.00×1012GC/眼の試験ベクターを投与された6匹の動物のうちの2匹において、少し増加したAAV8カプシドに対するT細胞応答が観察された。
結果
抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物において発現した(実施例6)。FFB-314を投与された動物の血清または前房液において抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するIgMは多くは存在しなかった。ベースラインレベルを超える抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するIgGは、FFB-314を投与された動物において観察されなかった。
抗VEGF Fab導入遺伝子産物は、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物において発現した(実施例6)。FFB-314を投与された動物の血清または前房液において抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するIgMは多くは存在しなかった。ベースラインレベルを超える抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するIgGは、FFB-314を投与された動物において観察されなかった。
抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するIgMは、1.00×1010GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターを投与された1匹の動物の前房液においてベースラインレベルを超えた。しかしながら、血清においては対応する上昇が存在せず、したがってこの観察は、臨床的に意味はなかった。ベースラインレベルを超える抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するIgGは、この処理群において観察されなかった。
ベースラインレベルを超える抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するIgMは、1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターを投与された1匹の動物の前房液において観察された。しかしながら、血清においては対応する上昇が存在せず、この観察は、臨床的に意味はなかった。ベースラインレベルを超える抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対するIgGは、この処理群において、別の動物からの血清及び前房液において、ならびに第3の動物の前房液のみにおいて観察された。しかしながら、いずれの検出可能なIgMが先行しなかったので、これらの観察は、臨床的に意味はなかった。これらの動物におけるIgGの存在は、抗VEGF Fab導入遺伝子産物の発現の喪失と関連しなかった。
AAV8カプシドに対するNAbのベースラインレベルは、0日の試験日で採取した血液試料由来の血清中で測定された。検出限界は1:5希釈であり、5未満の力価を検出不能とみなした。
FFB-314が投与された6匹の動物の内の4匹において、予め存在するNAbが観
察されなかった。90日の試験日まで追跡された2匹の動物はNAbを生じなかった。FFB-314が投与された2匹の動物において、予め存在するNAbが観察された。これら2匹の動物におけるNAbのレベルは、試験中に2倍希釈系列において2未満で変動した。
察されなかった。90日の試験日まで追跡された2匹の動物はNAbを生じなかった。FFB-314が投与された2匹の動物において、予め存在するNAbが観察された。これら2匹の動物におけるNAbのレベルは、試験中に2倍希釈系列において2未満で変動した。
1.00×1010GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターを投与された9匹の動物の内の2匹において、予め存在するNAbが観察されなかった。90日の試験日まで追跡された1匹の動物において、AAV8.aVEGF試験ベクターの投与に続いてNAbが観察されなかった。予め存在するNAbを有する動物において、それらのレベルは、AAV8.aVEGF試験ベクターの投与に続いて2倍希釈系列において4未満で増加した。
1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターを投与された9匹の動物の内の4匹において、予め存在するNAbが観察されなかった。予め存在するNAbの状態にもかかわらず、多くの動物において、AAV8.aVEGFの投与に続いて2倍希釈系列で9までのNAb応答における増加が観察された。この応答は、90日の試験日を通じて持続した。
AAV8.aVEGF試験ベクターに対するT細胞応答は、単一の時点で、FFB-314を投与された1匹の動物において観察された。1匹の動物において、非特異的なT細胞応答が全ての時点において観察された。
AAV8.aVEGF試験ベクターに対する持続するT細胞応答は、1.00×1010GC/眼の試験ベクターを投与された動物において、観察されなかった。
1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターを投与された6匹の動物の内の4匹において、AAV8.aVEGF試験ベクターに対する低いレベルの免疫応答が観察された。低いレベルの免疫応答を有する4匹の動物の内の2匹において、持続した(2回を超えて連続する時点)応答が観察された。抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対する持続するT細胞の応答は、いずれの動物においても観察されなかった。
抗VEGF Fab導入遺伝子産物に対する持続するIgM、IgG、またはT細胞の応答は、いずれの動物においてもまったく観察されなかった。
1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターを投与された動物は、1.00×1010GC/眼の同一の試験ベクターを投与された動物よりも高い、AAV8.aVEGF試験ベクターに対するNAb応答を生じた。NAb応答は、予め存在するNAbを有する動物においてより高かった。1.00×1012GC/眼のAAV8.aVEGF試験ベクターを投与された6匹の動物のうちの2匹において、少し増加したこのAAV8.aVEGF試験ベクターに対するT細胞応答が観察された。
カニクイザルにおけるAAV2/8ベクターの網膜下投与に続く、AAV2/8ベクターのmRNA及び抗VEGFフラグメント抗原結合の分布の評価
この試験は、AAV2/8ベクターの網膜下投与に続く、実施例3、実施例5、及び実施例6からの組織を用いて、AAV2/8ベクターのmRNAの網膜の分布及び抗VEGF Fabの眼全体にわたる分布を評価するために実施された。網膜の異なる部分におけるmRNAのレベルは、定量的逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応及びインサイチュハイブリダイゼーションによって評価された。抗VEGF Fabの濃度は、網膜の切片、前房液、及び硝子体液において酵素結合免疫吸着検査法によって測定された。
この試験は、AAV2/8ベクターの網膜下投与に続く、実施例3、実施例5、及び実施例6からの組織を用いて、AAV2/8ベクターのmRNAの網膜の分布及び抗VEGF Fabの眼全体にわたる分布を評価するために実施された。網膜の異なる部分におけるmRNAのレベルは、定量的逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応及びインサイチュハイブリダイゼーションによって評価された。抗VEGF Fabの濃度は、網膜の切片、前房液、及び硝子体液において酵素結合免疫吸着検査法によって測定された。
AAV2/8ベクターのmRNAは、網膜下投与に続き、網膜全体にわたって分布する。同様に、抗VEGF Fabは、網膜全体にわたって分布し、硝子体と前房液の両方において検出される。
網膜下投与の部位は、網膜ブレブによって示され、これはSD-OCTによって可視化できる。全てのSD-OCTの画像において、網膜ブレブは可視化されている。
RT-qPCRによって測定される網膜におけるAAV2/8.aVEGF試験ベクターのmRNAのレベル
AAV8.aVEGF試験ベクターのmRNAは、FFB-314を投与された動物の網膜において検出されなかった。AAV8.aVEGF試験ベクターのmRNAは、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物の網膜において検出された。網膜下注射の部位を含む網膜の切片において最も高いmRNAのレベルが検出された。しかしながら、AAV8.aVEGF試験ベクターのmRNAは、注射ブレブの外側の切片においても検出された。これらの切片のmRNAレベルは、ブレブにおけるものよりも低かった。レベルは、注射ブレブに対して最も辺縁のセクションにおいて4logまで低かった。注射ブレブにすぐ隣接する切片において、mRNAのレベルは中間であった。
AAV8.aVEGF試験ベクターのmRNAは、FFB-314を投与された動物の網膜において検出されなかった。AAV8.aVEGF試験ベクターのmRNAは、AAV8.aVEGF試験ベクターを投与された全ての動物の網膜において検出された。網膜下注射の部位を含む網膜の切片において最も高いmRNAのレベルが検出された。しかしながら、AAV8.aVEGF試験ベクターのmRNAは、注射ブレブの外側の切片においても検出された。これらの切片のmRNAレベルは、ブレブにおけるものよりも低かった。レベルは、注射ブレブに対して最も辺縁のセクションにおいて4logまで低かった。注射ブレブにすぐ隣接する切片において、mRNAのレベルは中間であった。
インサイチューハイブリダイゼーション(ISH)によって決定される網膜におけるAAV2/8ベクターのmRNAの発現
ISHによって決定されるAAV2/8ベクターのmRNAの発現は、注射部位で高かった。網膜層内の形質導入された細胞は、RPE細胞、光受容体、及び神経節細胞を含んだ。注射部位から離れるとき、mRNAの発現は低く、注射部位から最も遠位の領域においてほとんど完全に消失した。
ISHによって決定されるAAV2/8ベクターのmRNAの発現は、注射部位で高かった。網膜層内の形質導入された細胞は、RPE細胞、光受容体、及び神経節細胞を含んだ。注射部位から離れるとき、mRNAの発現は低く、注射部位から最も遠位の領域においてほとんど完全に消失した。
前房液、硝子体、及び網膜における抗VEGF Fabの濃度
抗VEGF Fabは、AAV2/8ベクターを投与された全ての動物の眼の網膜、硝子体、及び硝子体において発現していた(図6~8)。硝子体における発現は、前房液おけるものよりも3~9倍高かった。群5(図8)において1匹の動物(C65873)を除いて、網膜部分における最大発現は、硝子体におけるものよりも1.2~3.6倍高かった。この濃度勾配は、おそらく抗VEGF Fabの分布のメカニズムを反映している。抗VEGF Fabは、形質導入された網膜によって硝子体に分泌され、次いで、硝子体から前房液へと分散する。注目すべきことは、抗VEGF Fabの網膜全体にわたる発現は、mRNAの発現よりも均一である。
抗VEGF Fabは、AAV2/8ベクターを投与された全ての動物の眼の網膜、硝子体、及び硝子体において発現していた(図6~8)。硝子体における発現は、前房液おけるものよりも3~9倍高かった。群5(図8)において1匹の動物(C65873)を除いて、網膜部分における最大発現は、硝子体におけるものよりも1.2~3.6倍高かった。この濃度勾配は、おそらく抗VEGF Fabの分布のメカニズムを反映している。抗VEGF Fabは、形質導入された網膜によって硝子体に分泌され、次いで、硝子体から前房液へと分散する。注目すべきことは、抗VEGF Fabの網膜全体にわたる発現は、mRNAの発現よりも均一である。
全体として、機能的なAAV2/8ベクターは、驚くべきことに、注射ブレブに限定される代わりに、形質導入した細胞によるベクターmRNAの発現によって証明されるように、網膜下投与に続き、網膜全体にわたって分布する。抗VEGF Fabはまた、驚くべきことに、注射ブレブに対して辺縁である網膜部分を含む網膜全体にわたって分布し、硝子体と前房液の両方において検出される。
生体内分布の評価は、注射して7日後までに得た、涙液、鼻腔洗浄液、唾液、血清、尿、及び、糞便での一部のベクターの存在を明らかにした。当該ベクターを、病原性または健康障害原因と見なすことはなく、また、短期間での脱落は、臨床的関連性を持たない可能性がある。
抗VEGF導入遺伝子産物の組換えヒトVEGFに対する結合の親和性の測定
この試験は、抗VEGF Fab重鎖及び軽鎖の産物の組換えヒトVEGFに対する結合の親和性を測定するために実施された。結合親和性は、表面プラズモン共鳴(SPR)技術に基づくBiacore 3000システムを用いて測定された。この技術は、全内部反射の条件下でセンサーチップに当たる平面偏光に基づいている。センサーチップ上の固相化したリガンド(例えばVEGF)と相互作用する分子(例えば抗VEGF Fab導入遺伝子産物)との相互作用は、平面偏光の反射率における変化を引き起こす。この変化は、リアルタイムでセンサーグラムによって、応答単位としてすぐに検出される(Daghestani,Theory and applications of surface plasmon resonance,resonant mirror,resonant waveguide grating,and dual polarization interferometry biosensors.Sensors(Basel).2010;10(11): 9630-46.)。抗VEGF導入遺伝子産物の結合のための平衡結合親和定数は、ラニビズマブの公開された範囲と一致する。
この試験は、抗VEGF Fab重鎖及び軽鎖の産物の組換えヒトVEGFに対する結合の親和性を測定するために実施された。結合親和性は、表面プラズモン共鳴(SPR)技術に基づくBiacore 3000システムを用いて測定された。この技術は、全内部反射の条件下でセンサーチップに当たる平面偏光に基づいている。センサーチップ上の固相化したリガンド(例えばVEGF)と相互作用する分子(例えば抗VEGF Fab導入遺伝子産物)との相互作用は、平面偏光の反射率における変化を引き起こす。この変化は、リアルタイムでセンサーグラムによって、応答単位としてすぐに検出される(Daghestani,Theory and applications of surface plasmon resonance,resonant mirror,resonant waveguide grating,and dual polarization interferometry biosensors.Sensors(Basel).2010;10(11): 9630-46.)。抗VEGF導入遺伝子産物の結合のための平衡結合親和定数は、ラニビズマブの公開された範囲と一致する。
組織交差反応性試験
この試験の目的は、ヒト組織の選択されたパネル由来の組織学的に調製された凍結切片と共に免疫組織化学技術を用いて、スポンサーが提供した抗体FabフラグメントaVEGF導入遺伝子産物の可能性のある交差反応性を評価することであった。
この試験の目的は、ヒト組織の選択されたパネル由来の組織学的に調製された凍結切片と共に免疫組織化学技術を用いて、スポンサーが提供した抗体FabフラグメントaVEGF導入遺伝子産物の可能性のある交差反応性を評価することであった。
抗VEGF Fab導入遺伝子産物(1mg/mL)(「試験産物」)及びラニビズマブ(0.97mg/mL)をこの試験に使用した。天然ヒトIgG Fabフラグメントタンパク質(「コントロール試料」)は、14.64mg/mLのタンパク質濃度で提供された。試験遺伝子産物の免疫組織化学的検出を促進するために、天然ヒトIgG Fabフラグメントタンパク質及びラニビズマブをビオチンと結合した。それぞれのタンパク質濃度は、2.79mg/mL、2.88mg/mL、及び2.89mg/mLであった。試験のためのコントロール材料及びヒト組織からの凍結切片を調製した。組織生存性の評価は、ヒト組織のパネルが生存可能であることを示した。コントロール用量設定のスライド評価に続いて、以下の3つの濃度の試験導入遺伝子産物-ビオチン:5、2.5、及び1.25μg/mL、ならびに以下の濃度のラニビズマブ-ビオチン:2.5μg/mLが組織用量設定における使用のために選択された。組織用量設定において、特異的陽性染色が、試験された組織のいずれにおいても、抗VEGF導入遺伝子産物-ビオチンまたはラニビズマブ-ビオチンにおいてまったく観察されなかった。全てのその他の観察された染色は可変であり、非特異的であるとみなされた。
この試験の条件において、試験導入遺伝子産物-ビオチン及びラニビズマブ-ビオチンの抗原特異的結合が、陽性コントロール材料(ヒト神経膠芽腫及びVEGFタンパク質ス
ポット)において実証された。組織用量設定において試験された濃度において、天然ヒトIgG Fabフラグメントタンパク質-ビオチンまたは抗体希釈物において同様の染色がまったく観察されなかった。
ポット)において実証された。組織用量設定において試験された濃度において、天然ヒトIgG Fabフラグメントタンパク質-ビオチンまたは抗体希釈物において同様の染色がまったく観察されなかった。
臨床治験
単一の網膜下投与の利点を提供し、それによって繰り返し注射の負担を低減するrAAV8.aVEGFベクターがさらなる試験のために選択された。6ヶ月をこえて継続するNHPにおける抗VEGF Fabの発現及びrAAV8.aVEGFベクターで処理されたWANDの動物モデルにおける血管新生の低減が、前臨床試験において実証されてきており、網膜下注射の安全性が非ヒト霊長類において評価される。最初の臨床治験は、上述したようなrAAV8.aVEGF試験ベクターの単一の網膜下注射の後の安全性及び導入遺伝子の発現を評価する。網膜下に注射されると、これらのベクターは、抗VEGF
Fab遺伝子産物を放出し続け、血管新生シグナルを阻止し、それによって網膜をさらなる損傷から防御すると予想される。
単一の網膜下投与の利点を提供し、それによって繰り返し注射の負担を低減するrAAV8.aVEGFベクターがさらなる試験のために選択された。6ヶ月をこえて継続するNHPにおける抗VEGF Fabの発現及びrAAV8.aVEGFベクターで処理されたWANDの動物モデルにおける血管新生の低減が、前臨床試験において実証されてきており、網膜下注射の安全性が非ヒト霊長類において評価される。最初の臨床治験は、上述したようなrAAV8.aVEGF試験ベクターの単一の網膜下注射の後の安全性及び導入遺伝子の発現を評価する。網膜下に注射されると、これらのベクターは、抗VEGF
Fab遺伝子産物を放出し続け、血管新生シグナルを阻止し、それによって網膜をさらなる損傷から防御すると予想される。
各々の用量コホートは5対象を含む。
主要目的:
AAV8.aVEGF試験ベクターの安全性と忍容性を25週間にわたって評価する(nAMDを有する対象に対して網膜下送達で単回投与して24週間後)。
副次的目的:
●AAV8.aVEGF試験ベクターの長期的な安全性と忍容性を評価する;
●水性液でのaVEGFタンパク質レベルの濃度を評価する
●BCVAに関するAAV8.aVEGFの効果を評価する
●SD-OCTで測定した網膜中心部の厚み(CRT)に関するAAV8.aVEGFの効果を評価する
●救援治療の必要性を評価する
●フルオレセイン血管造影法(FA)で測定したCNV病変の成長と漏出に関するAAV8.aVEGF試験ベクターの効果を評価する
主要目的:
AAV8.aVEGF試験ベクターの安全性と忍容性を25週間にわたって評価する(nAMDを有する対象に対して網膜下送達で単回投与して24週間後)。
副次的目的:
●AAV8.aVEGF試験ベクターの長期的な安全性と忍容性を評価する;
●水性液でのaVEGFタンパク質レベルの濃度を評価する
●BCVAに関するAAV8.aVEGFの効果を評価する
●SD-OCTで測定した網膜中心部の厚み(CRT)に関するAAV8.aVEGFの効果を評価する
●救援治療の必要性を評価する
●フルオレセイン血管造影法(FA)で測定したCNV病変の成長と漏出に関するAAV8.aVEGF試験ベクターの効果を評価する
主要評価項目:
26週目までの安全性(rAAV8.aVEGF試験ベクターを投与して24週間後):眼及び非眼のAEと、重篤なAE(SAE)の発生率。処置後6週、24週、6ヶ月及び12ヶ月の眼及び非眼の安全性評価
26週目までの安全性(rAAV8.aVEGF試験ベクターを投与して24週間後):眼及び非眼のAEと、重篤なAE(SAE)の発生率。処置後6週、24週、6ヶ月及び12ヶ月の眼及び非眼の安全性評価
副次的評価項目:
●106週間を超える眼及び非眼の安全性
●水性rAAV8.aVEGFタンパク質の経時的なベースラインからの平均変化
●BCVAの経時的なベースラインからの平均変化
●26週、54週、及び106週でのBCVAによるベースラインと比較して15文字以上を獲得または喪失する対象の割合
●SD-OCTによって測定されるときのCRTの経時的なベースラインからの平均変化
●ラニビズマブ救援注射の経時的な平均数
●1回目の救援ラニビズマブ注射までの時間
●経時的な、CNV及び損傷サイズならびにFAに基づく漏出領域におけるベースラインからの平均変化
●免疫原性測定(AAV8に対するNAb、AAV8に対する結合抗体、aVEGFタンパク質に対する抗体、及び酵素結合免疫スポット[ELISpot])。
●血清及び尿におけるベクター脱落分析
●106週間を超える眼及び非眼の安全性
●水性rAAV8.aVEGFタンパク質の経時的なベースラインからの平均変化
●BCVAの経時的なベースラインからの平均変化
●26週、54週、及び106週でのBCVAによるベースラインと比較して15文字以上を獲得または喪失する対象の割合
●SD-OCTによって測定されるときのCRTの経時的なベースラインからの平均変化
●ラニビズマブ救援注射の経時的な平均数
●1回目の救援ラニビズマブ注射までの時間
●経時的な、CNV及び損傷サイズならびにFAに基づく漏出領域におけるベースラインからの平均変化
●免疫原性測定(AAV8に対するNAb、AAV8に対する結合抗体、aVEGFタンパク質に対する抗体、及び酵素結合免疫スポット[ELISpot])。
●血清及び尿におけるベクター脱落分析
探索的評価項目:
●眼底自発蛍光(FAF)による地図状萎縮領域における経時的なベースラインからの平均変化、FAFによる地図状萎縮の新しい領域の発生(ベースラインにおいて地図状萎縮がまったくない対象において)
●BCVAによるベースラインと比較してそれぞれ10文字以上を獲得または喪失する対象の割合
●前年と比較して救援注射における50%の低減を有する対象の割合
●SD-OCTにおいてまったく液体を有さない対象の割合
●眼底自発蛍光(FAF)による地図状萎縮領域における経時的なベースラインからの平均変化、FAFによる地図状萎縮の新しい領域の発生(ベースラインにおいて地図状萎縮がまったくない対象において)
●BCVAによるベースラインと比較してそれぞれ10文字以上を獲得または喪失する対象の割合
●前年と比較して救援注射における50%の低減を有する対象の割合
●SD-OCTにおいてまったく液体を有さない対象の割合
この試験のために、患者は血管新生加齢性黄斑変性(滲出型AMD)の診断を有し、以下の基準に合致する必要がある。
採用基準:
この研究に参加する資格を得るためには、対象は以下の基準の全てを満たす必要がある。1つ以上のこれらの基準はさらなる試験、及び他の集団の治療のために必要とされない場合があることは理解されよう。
1.50歳超かつ89歳未満の男性、もしくは、女性;
2.各用量コホートのセンチネル対象は、試験する眼において20/63以下かつ20/400以上のBCVA(63以下かつ19以上のETDRS文字)を有する必要がある;センチネル対象の評価に続いて、用量コホートにおける残りの対象は、20/40以下かつ20/400以上のBCVA(73以下かつ19以上のETDRS文字)を有する必要がある。
3.両方の眼が適格であれば、研究者が決定する場合、試験する眼は対象のより悪い方の眼とする必要がある。
4.試験する眼においてAMDに続発する中心窩下CNVの確定診断を有する必要がある。CNV損傷特徴:10円板領域未満であることを必要とする損傷サイズ(典型的な円板領域は2.54mm2)、及び、損傷サイズの50%未満の血液。
5.1日目の約8ヶ月前に、試験する眼においてnAMDの治療のための抗VEGF剤の少なくとも4回の硝子体内注射を受け、SD-OCTにおいて確認された解剖学上の応答を有する必要がある。
6.対象が再スクリーニングを受けていないのであれば、試験する眼において1日目の時点でSD-OCTに関して実証された網膜下もしくは網膜内液での存在を有する必要がある。以前にOCTに関する第1週応答性基準を含むすべての採用基準を満たしていたが、ウィンドウ内に抗VEGF Fabを持ち合わせていない対象は、改めてスクリーニングを行い得るものであり、そして、参加時に水分を与えたり、または、対象が改めて第1週応答性基準を満たす必要について、スポンサー医療モニターと協議したり、承認を受ける必要はない。
7.試験する眼において偽性(白内障手術後の状態)である必要がある。
8.全ての試験処置に従うことを自発的に受け入れることができ、試験の期間中対応可能でなければならない。
9.妊娠の可能性のある女性は、スクリーニング来院の時点で陰性の尿の妊娠検査を済ませておくべきであり、8日目までに陰性の血清の結果を有するべきであり、試験中に追加の妊娠検査をする意思があるべきである。
10.性的に活発な対象(女性と男性の両方)は、スクリーニング来院からベクター投与後24週間まで、医学的に許容可能なバリアー避妊法(例えば、コンドーム、ペッサリー、または禁欲)を使用する意思があるべきである。この時点以降の避妊の停止は、主治医と話し合うべきである。
11.署名された書面によるインフォームドコンセントを提供する意思と能力があるべきである。
この研究に参加する資格を得るためには、対象は以下の基準の全てを満たす必要がある。1つ以上のこれらの基準はさらなる試験、及び他の集団の治療のために必要とされない場合があることは理解されよう。
1.50歳超かつ89歳未満の男性、もしくは、女性;
2.各用量コホートのセンチネル対象は、試験する眼において20/63以下かつ20/400以上のBCVA(63以下かつ19以上のETDRS文字)を有する必要がある;センチネル対象の評価に続いて、用量コホートにおける残りの対象は、20/40以下かつ20/400以上のBCVA(73以下かつ19以上のETDRS文字)を有する必要がある。
3.両方の眼が適格であれば、研究者が決定する場合、試験する眼は対象のより悪い方の眼とする必要がある。
4.試験する眼においてAMDに続発する中心窩下CNVの確定診断を有する必要がある。CNV損傷特徴:10円板領域未満であることを必要とする損傷サイズ(典型的な円板領域は2.54mm2)、及び、損傷サイズの50%未満の血液。
5.1日目の約8ヶ月前に、試験する眼においてnAMDの治療のための抗VEGF剤の少なくとも4回の硝子体内注射を受け、SD-OCTにおいて確認された解剖学上の応答を有する必要がある。
6.対象が再スクリーニングを受けていないのであれば、試験する眼において1日目の時点でSD-OCTに関して実証された網膜下もしくは網膜内液での存在を有する必要がある。以前にOCTに関する第1週応答性基準を含むすべての採用基準を満たしていたが、ウィンドウ内に抗VEGF Fabを持ち合わせていない対象は、改めてスクリーニングを行い得るものであり、そして、参加時に水分を与えたり、または、対象が改めて第1週応答性基準を満たす必要について、スポンサー医療モニターと協議したり、承認を受ける必要はない。
7.試験する眼において偽性(白内障手術後の状態)である必要がある。
8.全ての試験処置に従うことを自発的に受け入れることができ、試験の期間中対応可能でなければならない。
9.妊娠の可能性のある女性は、スクリーニング来院の時点で陰性の尿の妊娠検査を済ませておくべきであり、8日目までに陰性の血清の結果を有するべきであり、試験中に追加の妊娠検査をする意思があるべきである。
10.性的に活発な対象(女性と男性の両方)は、スクリーニング来院からベクター投与後24週間まで、医学的に許容可能なバリアー避妊法(例えば、コンドーム、ペッサリー、または禁欲)を使用する意思があるべきである。この時点以降の避妊の停止は、主治医と話し合うべきである。
11.署名された書面によるインフォームドコンセントを提供する意思と能力があるべきである。
除外基準:
以下の除外基準のいずれかに合致する対象は試験に参加する資格がない。これらの基準のいずれかまたは全ては、さらなる試験、及び他の患者集団の治療では含希少ない場合があることは理解されよう。
1.AMD以外の任意の要因に続発する試験する眼におけるCNVまたは黄斑浮腫。
2.試験する眼において、血液がAMD損傷の50%以上を占めるか、または血液が1.0mm2を超えて中心窩の下に存在する。
3.試験する眼におけるVAの改善を阻止する任意の状態、例えば、線維症、萎縮、または中心窩の中心における網膜上皮裂孔。
4.試験する眼における活動性の高い網膜剥離または網膜剥離の病歴。
5.試験する眼における進行した緑内障。
6.研究者の意見において、試験する眼における対象のリスクを増加させる可能性があるか、試験期間中に視力喪失を阻止または治療する医学的または外科的介入のいずれかを必要とする可能性があるか、または処置または評価の試験と干渉する可能性のあるあらゆる病態。
7.スクリーニング来院の前の12週間以内に試験する眼における眼内手術の履歴。スクリーニング来院の10週間超以前に実施される場合、イットリウム・アルミニウム・ガーネットの嚢切開は容認される。
8.スクリーニング前の6ヶ月以内に試験する眼における硝子体内療法、例えば硝子体内ステロイド注射、または抗VEGF療法以外の治験薬の履歴。
9.スクリーニング時の試験する眼におけるインプラントの存在(眼内レンズを除外する)。
10.スクリーニング前の5年以内に化学療法及び/または放射線を必要とする悪性腫瘍の病歴。局在する基底細胞癌は容認される。
11.登録30日以内または治験薬の半減期の5倍のいずれか長い方の期間内にいずれかの治験薬を投薬される。
12.その他のいずれかの遺伝子療法試験への参加。
13.網膜毒性を引き起こすことの知られている治療法、または視力に影響を及ぼし得るかもしくは既知の網膜毒性を有する任意の薬物との併用療法、例えばクロロキンまたはヒドロキシクロロキンの履歴。
14.試験する眼における外科手技と干渉し得る眼または眼周囲の感染;
15.過去6ヶ月間における心筋梗塞、脳血管障害、または一過性虚血発作。
16.最大限の治療にもかかわらず制御不能の高血圧(180mmHgを超える収縮期血圧[BP]、100mmHgを超える拡張期血圧)。
17.研究者の意見における、眼の外科手術または治癒過程を妨げ得るあらゆる付随する治療。
18.ラニビズマブもしくはその任意の成分に対する既知の過敏性またはrAAV8.aVEFG試験ベクターに類似する剤に対する(研究者の意見における)過去の過敏性。
19.研究者の意見における、対象の安全性または研究におけるすべての評価と追跡調査を完了する能力を損い得るあらゆる深刻な慢性または不安定な医学的または心理的状態。
以下の除外基準のいずれかに合致する対象は試験に参加する資格がない。これらの基準のいずれかまたは全ては、さらなる試験、及び他の患者集団の治療では含希少ない場合があることは理解されよう。
1.AMD以外の任意の要因に続発する試験する眼におけるCNVまたは黄斑浮腫。
2.試験する眼において、血液がAMD損傷の50%以上を占めるか、または血液が1.0mm2を超えて中心窩の下に存在する。
3.試験する眼におけるVAの改善を阻止する任意の状態、例えば、線維症、萎縮、または中心窩の中心における網膜上皮裂孔。
4.試験する眼における活動性の高い網膜剥離または網膜剥離の病歴。
5.試験する眼における進行した緑内障。
6.研究者の意見において、試験する眼における対象のリスクを増加させる可能性があるか、試験期間中に視力喪失を阻止または治療する医学的または外科的介入のいずれかを必要とする可能性があるか、または処置または評価の試験と干渉する可能性のあるあらゆる病態。
7.スクリーニング来院の前の12週間以内に試験する眼における眼内手術の履歴。スクリーニング来院の10週間超以前に実施される場合、イットリウム・アルミニウム・ガーネットの嚢切開は容認される。
8.スクリーニング前の6ヶ月以内に試験する眼における硝子体内療法、例えば硝子体内ステロイド注射、または抗VEGF療法以外の治験薬の履歴。
9.スクリーニング時の試験する眼におけるインプラントの存在(眼内レンズを除外する)。
10.スクリーニング前の5年以内に化学療法及び/または放射線を必要とする悪性腫瘍の病歴。局在する基底細胞癌は容認される。
11.登録30日以内または治験薬の半減期の5倍のいずれか長い方の期間内にいずれかの治験薬を投薬される。
12.その他のいずれかの遺伝子療法試験への参加。
13.網膜毒性を引き起こすことの知られている治療法、または視力に影響を及ぼし得るかもしくは既知の網膜毒性を有する任意の薬物との併用療法、例えばクロロキンまたはヒドロキシクロロキンの履歴。
14.試験する眼における外科手技と干渉し得る眼または眼周囲の感染;
15.過去6ヶ月間における心筋梗塞、脳血管障害、または一過性虚血発作。
16.最大限の治療にもかかわらず制御不能の高血圧(180mmHgを超える収縮期血圧[BP]、100mmHgを超える拡張期血圧)。
17.研究者の意見における、眼の外科手術または治癒過程を妨げ得るあらゆる付随する治療。
18.ラニビズマブもしくはその任意の成分に対する既知の過敏性またはrAAV8.aVEFG試験ベクターに類似する剤に対する(研究者の意見における)過去の過敏性。
19.研究者の意見における、対象の安全性または研究におけるすべての評価と追跡調査を完了する能力を損い得るあらゆる深刻な慢性または不安定な医学的または心理的状態。
ラニビズマブの投与を受けた後に試験を継続する基準
1週目に、対象(このパートでは、この基準を満たした者の再スクリーニングを除く)は、ラニビズマブに対する最初の抗VEGF応答について評価される。対象はSD-OCTとBCVAの両方を受け、それは、研究者によって1日目の値と比較される。
1.応答性(対象は試験を継続する):応答性は、SD-OCTによる、50ミクロンを超えるCRTの低減、または液体における30%を超える改善によって定義される。
2.非応答性(対象は早期撤退として試験から出る):非応答性は、上述の基準に合致
しないとして定義される。各々のコホートにおいて6までの対象のさらなる対象が登録され続け、単一用量のrAAV8.aVEFG試験ベクターを投薬される。
この来院の時点において、中央検査室の結果がレビューされる。以下の値を有する全ての対象は撤退する:
3.正常上限(ULN)の2.5倍を超えるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)/アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)。
4.対象が以前に知られているギルバート症候群の病歴を有していない限りULNの1.5倍を超える総ビリルビン、及び結合ビリルビンが総ビリルビンの35%未満であることを示す分画したビリルビン。
5.ULNの1.5倍を超えるプロトロンビン時間(PT)
6.男性の対象について10g/dL未満のヘモグロビン、女性の対象について9g/dL未満のヘモグロビン
7.100×103/μL未満の血小板
8.30mL/分/1.73m2未満の推定糸球体ろ過率(GFR)
禁止されている薬物と手順
対象は:
●研究眼の救援治療、または、ベバシズマブ(Avastin(登録商標)、Genentech)での片方の眼の治療を受け得ない
●スクリーニングから4週間以内、または、治験薬の5半減期内、または、試験期間のあらゆる時点で、実験的薬物療法、または、治療を受け得ない。
●臨床医の意見では、眼の外科的処置または治癒過程を妨げ得るあらゆる併用治療を受け得ない。
1週目に、対象(このパートでは、この基準を満たした者の再スクリーニングを除く)は、ラニビズマブに対する最初の抗VEGF応答について評価される。対象はSD-OCTとBCVAの両方を受け、それは、研究者によって1日目の値と比較される。
1.応答性(対象は試験を継続する):応答性は、SD-OCTによる、50ミクロンを超えるCRTの低減、または液体における30%を超える改善によって定義される。
2.非応答性(対象は早期撤退として試験から出る):非応答性は、上述の基準に合致
しないとして定義される。各々のコホートにおいて6までの対象のさらなる対象が登録され続け、単一用量のrAAV8.aVEFG試験ベクターを投薬される。
この来院の時点において、中央検査室の結果がレビューされる。以下の値を有する全ての対象は撤退する:
3.正常上限(ULN)の2.5倍を超えるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)/アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)。
4.対象が以前に知られているギルバート症候群の病歴を有していない限りULNの1.5倍を超える総ビリルビン、及び結合ビリルビンが総ビリルビンの35%未満であることを示す分画したビリルビン。
5.ULNの1.5倍を超えるプロトロンビン時間(PT)
6.男性の対象について10g/dL未満のヘモグロビン、女性の対象について9g/dL未満のヘモグロビン
7.100×103/μL未満の血小板
8.30mL/分/1.73m2未満の推定糸球体ろ過率(GFR)
禁止されている薬物と手順
対象は:
●研究眼の救援治療、または、ベバシズマブ(Avastin(登録商標)、Genentech)での片方の眼の治療を受け得ない
●スクリーニングから4週間以内、または、治験薬の5半減期内、または、試験期間のあらゆる時点で、実験的薬物療法、または、治療を受け得ない。
●臨床医の意見では、眼の外科的処置または治癒過程を妨げ得るあらゆる併用治療を受け得ない。
最初の試験では、rAAV8.aVEGF試験ベクターの網膜下送達を行う14日前の1日目において、ラニビズマブ(LUCENTIS,Genentech)0.5mgを硝子体内注射して投与する。rAAV8.aVEGFは、網膜外科医によって、局所麻酔下で網膜下投与により1回量として与えられる。処置は、中心部硝子体切除術を伴う標準的な3ポートの経毛様体扁平部硝子体切除術を含み、網膜下カニューレ(36~41ゲージ、例えば、38ゲージ)による網膜下腔への単回の網膜下投与が後に続く。この送達は、硝子体切除術機器を介して自動化されており、250マイクロリットルのブレブ(複数可)のrAAV8.aVEGFを、網膜下腔に送達する。対象(複数可)に、網膜下腔に250μlの用量を完全に投与しない場合、さらなる対象を登録し得る。患者には、5つの用量の内の1つを投与する。5つの用量レベルは次のとおりである。3×109ゲノムコピー(GC)/眼(1.2×1010GC/mL)、1×1010GC/眼(4×1010)GC/mL)、6×1010GC/眼(2.4×1011GC/mL)、1.6×1011GC/眼(6.2×1011GC/mL)、及び、2.5×1011GC/眼(1×1012GC/mL)。
実施例に基づいて、1×1011GC/眼(1×1012GC/mL)の用量は、NHPにおけるMTDである。NHP眼の網膜下に送達したrAAV8.aVEGF試験ベクターを用いた研究では、1×1010、1×1011、または1×1012GCの量を、100μlの容量で注射しており、それぞれ、1×1011、1×1012、及び1×1013GC/mLの濃度に対応する。ヒトの研究で注射する量、つまり、総GC投与量は、ヒトの眼の大きなサイズに対応するように調整する。目標は、NHPで非毒性であることが示されているベクターの濃度(1×1012GC/mL以下、MTD)に、領域または網膜を曝すことで、期待される安全性と臨床的利益プロファイルを維持しつつ、脈絡膜血管新生のマウスモデルでの用量反応研究で決定したMEDを上回る、ことにある。ヒトでの投与量は、手順の違いを考慮して、生理学の違いを概ね勘案して、250μLにスケーリングする。ヒトで試験した提案開始用量は、濃度に基づいて投与したMEDの1.2倍であり、また、MTDの2logであり;最高用量はMTDである。
MTD以下の用量を使用して毒性のリスクを低減することに加えて、さらなるリスクを、投与箇所によって緩和する。網膜下送達は、黄斑を回避する血管アーケード内の中心窩よりも上の領域を目標とする。最後に、非臨床試験では正常な脈管構造の変化は認められず、このことが、過剰なVEGF阻害で認め得る、ことは重要である。
疾患活動性について以下の1以上の救援基準が適用される場合、rAAV8.aVEGF試験ベクターの投与の4週間後から開始して、対象は臨床医の裁量で、試験する眼に硝子体内ラニビズマブ救援治療の投与を受け得る。スペクトル領域光干渉断層写真術(SD-OCT)での網膜液の蓄積と関連する(最良矯正視力[BCVA]当たり)5文字以上の視力喪失;SD-OCTでの新規または持続する、網膜下または網膜内液の、脈絡膜血管新生(CNV)と関連した上昇;及び、新規の眼の出血。
以下の所見セットの1つが発生する場合、臨床医の裁量により、さらなる救援注射を延期し得る。SD-OCTによって評価されるとき、視力が20/20もしくはそれより良好であり、そして、中心網膜厚(CRT)が「正常」である;または、視力及びSD-OCTが2回の連続する注射の後で安定している。注射が延期される場合、視力またはSD-OCTが上記の基準に従って悪化する場合、それらを再開する。臨床医は、眼救援療法を、ラニビズマブからアフリベルセプトに変更し得る。
用量段階的増加試験
このフェーズI、非盲検、多重コホート、用量段階的増加試験は、予め治療された血管新生AMD(nAMD)を有する対象におけるrAAV8.aVEGF遺伝子療法の安全性及び忍容性を評価するよう設計される。これらの用量は約30の対象において、5つの用量で試験される。選択/除外基準に合致し、最初の抗VEGF注射に対する解剖学的な応答性を有する対象は、網膜下送達によって投与される単一用量のrAAV8.aVEGFを投薬される。rAAV8.aVEGFは、VEGFに結合してVEGF活性を中和するモノクローナル抗体フラグメントをコードする遺伝子を含むAAV8ベクターを使用する。安全性は、rAAV8.aVEGF投与後の最初の24週間(最初の試験期間)を最初の焦点とする。特定の実施形態では、試験は抗VEGF抗体、例えばラニビズマブを投与することを含み、応答性はSD-OCTによって1週目において測定される。抗VEGF抗体投与後、この治療に応答性である患者に対して、rAAV8.aVEGFを2週目に投与でき、次いで、安全性は、26週(rAAV8.aVEGF投与後24週)を通じて評価される。最初の試験期間の完了に続き、対象はrAAV8.aVEGFによる投与に続く104週まで評価され続ける。
このフェーズI、非盲検、多重コホート、用量段階的増加試験は、予め治療された血管新生AMD(nAMD)を有する対象におけるrAAV8.aVEGF遺伝子療法の安全性及び忍容性を評価するよう設計される。これらの用量は約30の対象において、5つの用量で試験される。選択/除外基準に合致し、最初の抗VEGF注射に対する解剖学的な応答性を有する対象は、網膜下送達によって投与される単一用量のrAAV8.aVEGFを投薬される。rAAV8.aVEGFは、VEGFに結合してVEGF活性を中和するモノクローナル抗体フラグメントをコードする遺伝子を含むAAV8ベクターを使用する。安全性は、rAAV8.aVEGF投与後の最初の24週間(最初の試験期間)を最初の焦点とする。特定の実施形態では、試験は抗VEGF抗体、例えばラニビズマブを投与することを含み、応答性はSD-OCTによって1週目において測定される。抗VEGF抗体投与後、この治療に応答性である患者に対して、rAAV8.aVEGFを2週目に投与でき、次いで、安全性は、26週(rAAV8.aVEGF投与後24週)を通じて評価される。最初の試験期間の完了に続き、対象はrAAV8.aVEGFによる投与に続く104週まで評価され続ける。
選択/除外基準に合致する対象は、登録され、試験する眼において0.5mgのラニビズマブの硝子体内注射を受ける(1日目)。1週目(ラニビズマブ注射の7日後)の時点で、対象はSD-OCTによって評価され、それらのベースライン評価と比較して、ラニビズマブ注射と関連する最初の抗VEGF活性に対する解剖学的な応答性を確かめる。解剖学的な応答性を有さない対象は試験から撤退する。撤退した対象に関して、1日目におけるラニビズマブ注射と関連するAEを有する全ての者は、AEが解消するまで(注射後30日まで)追跡される。2週目(15日目)において、対象は、網膜下送達によって、手術室において投与される単一用量のrAAV8.aVEGF試験ベクターを投薬される。
各々のコホートにおける最初のセンチネル対象は、20/63以下、かつ20/400以上(63以下かつ19以上のETDRS文字)の視力を有する。センチネル対象に対するrAAV8.aVEGF Fab投与の後、安全性のために最短で1週間の観察期間が
ある。安全上の懸念がない場合は、さらなる5名までの対象(20/40以下かつ20/400以上[73以下かつ19以上のETDRS文字]の拡張した視力基準)を、rAAV8.aVEGF試験ベクターと並行して、それぞれの治療の間に最低1日(連続した暦日)は治療し得る。研究を中止するか、次の投与コホートに進むか、または、より低用量(最大で半対数)で進めることが推奨される。安全審査トリガー(SRT)がまったく観察されない場合、4週間後に最後の対象に投与をする。対象は、rAAV8.aVEGF
Fab試験ベクターの治療の後に、最初の4週以内に、3回来院する。rAAV8.aVEGF Fab試験ベクターを投与して4週間後に開始し、対象は、それらが予め規定した救援注射基準に合致する場合、臨床医の裁量で、硝子体内ラニビズマブ救援療法を受け得る。rAAV8.aVEGF試験ベクター及び導入遺伝子に対する免疫原性が、試験期間にわたって評価される。
ある。安全上の懸念がない場合は、さらなる5名までの対象(20/40以下かつ20/400以上[73以下かつ19以上のETDRS文字]の拡張した視力基準)を、rAAV8.aVEGF試験ベクターと並行して、それぞれの治療の間に最低1日(連続した暦日)は治療し得る。研究を中止するか、次の投与コホートに進むか、または、より低用量(最大で半対数)で進めることが推奨される。安全審査トリガー(SRT)がまったく観察されない場合、4週間後に最後の対象に投与をする。対象は、rAAV8.aVEGF
Fab試験ベクターの治療の後に、最初の4週以内に、3回来院する。rAAV8.aVEGF Fab試験ベクターを投与して4週間後に開始し、対象は、それらが予め規定した救援注射基準に合致する場合、臨床医の裁量で、硝子体内ラニビズマブ救援療法を受け得る。rAAV8.aVEGF試験ベクター及び導入遺伝子に対する免疫原性が、試験期間にわたって評価される。
対象は、rAAV8.aVEGF試験ベクターで治療をした後の最初の4週間で3回来院する。rAAV8.aVEGF試験ベクターを投与して4週間後から、対象は、硝子体内ラニビズマブ救援治療を受け得る。研究全体を通じて、rAAV8.aVEGF試験ベクター、及び、その導入遺伝子に対する免疫原性を評価する。
安全性は、rAAV8.aVEGF投与後の最初の24週間(最初の試験期間)を最初の焦点とする。最初の試験期間の完了に続き、対象はrAAV8.aVEGFによる投与に続く104週まで評価され続ける(106週)。試験の最後に、対象は、長期追跡調査研究に参加するように求められる。rAAV8.aVEGFの安全性及び忍容性が各々の用量の対象において評価され、そして、眼及び非眼のAE及びSAE、化学、血液学、凝固、尿検査、免疫原性、眼の検査及び撮像(BCVA、眼圧、スリットランプ生体顕微鏡、間接眼底検査、及びSD-OCT)、ならびにバイタルサインの評価を通じて観察される。
有効性分析
観察した値と、ベースラインからの経時変化(該当する場合)が説明のためにまとめており、そして、95%信頼区間を、用量コホートと有効性評価項目(SAPで定義した)全体の研究で提供する。有意水準は5%であり、そして、多重比較調整は実行しない。
観察した値と、ベースラインからの経時変化(該当する場合)が説明のためにまとめており、そして、95%信頼区間を、用量コホートと有効性評価項目(SAPで定義した)全体の研究で提供する。有意水準は5%であり、そして、多重比較調整は実行しない。
医療と投薬の履歴
関連する病歴及び手術歴(例えば、対象に併存する病状、及び、薬物療法に関する情報、完全な眼病歴、及び、過去12ヶ月の従前の抗VEGF療法と眼病歴、その他の抗VEGF療法などのnAMDの主要な治療)を収集する。
関連する病歴及び手術歴(例えば、対象に併存する病状、及び、薬物療法に関する情報、完全な眼病歴、及び、過去12ヶ月の従前の抗VEGF療法と眼病歴、その他の抗VEGF療法などのnAMDの主要な治療)を収集する。
眼科的評価
以下の眼科的評価を行い得る。該当する場合、記載した順序で評価を行う必要がある。
1.完全な眼科検査-スリットランプ生体顕微鏡検査、IOP、及び、拡張型眼底鏡検査
2.4メートルでETDRSを使用するBCVA、必要に応じて、1メートルで繰り返す(両側)
3.Heidelberg Spectralisを使用するSD-OCT(両側)
4.FAF(試験眼)
5.カラー眼底写真(試験眼)
6.FA(試験眼)
以下の眼科的評価を行い得る。該当する場合、記載した順序で評価を行う必要がある。
1.完全な眼科検査-スリットランプ生体顕微鏡検査、IOP、及び、拡張型眼底鏡検査
2.4メートルでETDRSを使用するBCVA、必要に応じて、1メートルで繰り返す(両側)
3.Heidelberg Spectralisを使用するSD-OCT(両側)
4.FAF(試験眼)
5.カラー眼底写真(試験眼)
6.FA(試験眼)
有害事象
AEは、薬物関連と見なすか否かに関係なく、ヒトでの薬物の使用に関連する有害な医学的事象として定義する。したがって、AEは、医薬品(治験薬)との関連性の有無に関
係なく、医薬品(治験薬)の使用に一時的に関連する、好ましくない、意図しない兆候(異常な検査所見など)、症状、または、疾患とすることができる。
AEは、薬物関連と見なすか否かに関係なく、ヒトでの薬物の使用に関連する有害な医学的事象として定義する。したがって、AEは、医薬品(治験薬)との関連性の有無に関
係なく、医薬品(治験薬)の使用に一時的に関連する、好ましくない、意図しない兆候(異常な検査所見など)、症状、または、疾患とすることができる。
副作用の疑いは、薬剤がAEを引き起こすことが合理的に考えられるAEを意味する。迅速な報告のために、「合理的な可能性」とは、薬物とAEとの間の因果関係を示唆する証拠があることを意味する。疑わしい副作用は、副作用より因果関係に関する確実性が小さいこと、つまり、薬物が引き起こすAEのことを意味する。
AEの定義を満足する事象として、以下のものがある:
●病態の頻度、及び/または、強度の増大など、慢性または断続的な既存の病態の悪化
●試験開始前に存在し得る場合でも、治験薬投与後に検出または診断した新規の病態
●相互作用の疑いの兆候、症状、または、臨床的後遺症
●治験薬または併用薬の過剰摂取が疑われる場合の兆候、症状、または、臨床的後遺症(過剰摂取それ自体は、AE/SAEと見なす)
●異常な検査所見
●病態の頻度、及び/または、強度の増大など、慢性または断続的な既存の病態の悪化
●試験開始前に存在し得る場合でも、治験薬投与後に検出または診断した新規の病態
●相互作用の疑いの兆候、症状、または、臨床的後遺症
●治験薬または併用薬の過剰摂取が疑われる場合の兆候、症状、または、臨床的後遺症(過剰摂取それ自体は、AE/SAEと見なす)
●異常な検査所見
AEの定義を満足しない事象として、以下のものがある:
●医療または外科的処置(例えば、内視鏡検査、虫垂切除術);この手法に至る病態はAEである
●有害な医学的出来事が発生しなかった状況(例えば、病院への社会的、及び/または、便宜的な入院)
●研究の開始時に存在または検出した、悪化しない既存の疾患(複数可)または病態(複数可)の予測される日々の変動
●患者の病態が予想以上に重篤でなければ、研究を行っている疾患/障害、または、研究を行っている疾患/障害の予期した進行、兆候、または症状
●医療または外科的処置(例えば、内視鏡検査、虫垂切除術);この手法に至る病態はAEである
●有害な医学的出来事が発生しなかった状況(例えば、病院への社会的、及び/または、便宜的な入院)
●研究の開始時に存在または検出した、悪化しない既存の疾患(複数可)または病態(複数可)の予測される日々の変動
●患者の病態が予想以上に重篤でなければ、研究を行っている疾患/障害、または、研究を行っている疾患/障害の予期した進行、兆候、または症状
臨床医の観点から、次のいずれかの結果を招く場合、AEをSAEと見なす。
●死亡
●生命を脅かすAE
注記:生命にかかわるAE、または、生命にかかわる疑わしい副作用とは、いずれかの臨床医の観点から、その発生によって、対象が即座に死亡リスクに直面する場合に、「生命にかかわる」と見なすAEまたは疑わしい副作用とする。そこには、それが、より重篤な形態で起こった場合に死を招きかねないAEまたは疑わしい副作用は含まない。
●入院患者診療、または、入院の延長
注記:一般的に、入院とは、診療所や外来では適切ではなく、対象を、病院または緊急病棟で、観察、及び/または、治療のために(通常は少なくとも一晩の滞在を含む)留めることを意味する。入院中に発生する合併症は、AEである。合併症によって、入院が長期化し、または、その他のあらゆる深刻な基準を満たしている場合、その事象は、深刻である。「入院」に至るが、または、その必要性について疑問がある場合、AEは深刻であると見なす。
●永続的または重大な不能/身体障害
注記:身体障害という用語は、通常の生活機能を実行する方の能力の実質的な撹乱を意味する。この定義は、合併症のない頭痛、吐き気、嘔吐、下痢、インフルエンザ、及び、偶発的な外傷(例えば、足首の捻挫)など、日常生活機能を妨げたり、阻んだりし得るが、実質的な撹乱にまでは至らない、比較的軽微な医学的意義のある経験を含むことを意図していない。
●先天性異常/先天性欠損症
●次の3つの要素を含む、高ビリルビン血症を伴う薬物誘発性肝障害の可能性があるすべての事象は、「Hyの法則」事象と称する。
1.ALT≧3×ULN、または、AST≧3×ULN
2.総ビリルビン≧2×ULN
3.上記#1と#2で認められた変更を説明するその他の理由が見つからない。
●死亡
●生命を脅かすAE
注記:生命にかかわるAE、または、生命にかかわる疑わしい副作用とは、いずれかの臨床医の観点から、その発生によって、対象が即座に死亡リスクに直面する場合に、「生命にかかわる」と見なすAEまたは疑わしい副作用とする。そこには、それが、より重篤な形態で起こった場合に死を招きかねないAEまたは疑わしい副作用は含まない。
●入院患者診療、または、入院の延長
注記:一般的に、入院とは、診療所や外来では適切ではなく、対象を、病院または緊急病棟で、観察、及び/または、治療のために(通常は少なくとも一晩の滞在を含む)留めることを意味する。入院中に発生する合併症は、AEである。合併症によって、入院が長期化し、または、その他のあらゆる深刻な基準を満たしている場合、その事象は、深刻である。「入院」に至るが、または、その必要性について疑問がある場合、AEは深刻であると見なす。
●永続的または重大な不能/身体障害
注記:身体障害という用語は、通常の生活機能を実行する方の能力の実質的な撹乱を意味する。この定義は、合併症のない頭痛、吐き気、嘔吐、下痢、インフルエンザ、及び、偶発的な外傷(例えば、足首の捻挫)など、日常生活機能を妨げたり、阻んだりし得るが、実質的な撹乱にまでは至らない、比較的軽微な医学的意義のある経験を含むことを意図していない。
●先天性異常/先天性欠損症
●次の3つの要素を含む、高ビリルビン血症を伴う薬物誘発性肝障害の可能性があるすべての事象は、「Hyの法則」事象と称する。
1.ALT≧3×ULN、または、AST≧3×ULN
2.総ビリルビン≧2×ULN
3.上記#1と#2で認められた変更を説明するその他の理由が見つからない。
死亡に至らず、直ちに生命を脅かし、あるいは、入院を必要とする結果を招き得ない重要な医療事象は、対象を危険に曝し、及び、この定義で示した結果の1つを予防するための医学的または外科的介入を必要とし得る場合、適切な医学的判断に基づいて深刻と見なす。そのような事象の例は、重度の視力低下を引き起こす眼の炎症である(ETDRSチャートの>6行)。
妊娠検査
rAAV8.aVEGF試験ベクターの投与(2週目)の前に、尿または血清妊娠試験が陽性であり、出産の可能性のある女性対象は、登録の適格基準を満たしていないが、研究には登録する。出産の可能性がないと考えられる女性として、子宮全摘出術を受けている、閉経が少なくとも2年間続いている、または、スクリーニングの少なくとも1年前に卵管結紮があった女性がいる。
rAAV8.aVEGF試験ベクターの投与(2週目)の前に、尿または血清妊娠試験が陽性であり、出産の可能性のある女性対象は、登録の適格基準を満たしていないが、研究には登録する。出産の可能性がないと考えられる女性として、子宮全摘出術を受けている、閉経が少なくとも2年間続いている、または、スクリーニングの少なくとも1年前に卵管結紮があった女性がいる。
さらなる尿妊娠検査は、妊娠状態が問題となっている来院時に行う。血清妊娠検査は、尿妊娠検査結果が、陽性または不明確な場合に行う。
臨床検査
以下の臨床検査と抗体検査を評価する。
●化学:グルコース、血中尿素窒素、クレアチニン、ナトリウム、カリウム、塩化物、二酸化炭素、カルシウム、総タンパク質、アルブミン、総ビリルビン、直接ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ALT、AST、及び、クレアチンキナーゼ。
●血液学:ヘマトクリット、ヘモグロビン、及び、赤血球、白血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球算定など、白血球百分率と血小板算定を用いた完全血球算定、ならびに、平均赤血球体積、平均赤血球ヘモグロビン、及び、平均赤血球ヘモグロビン濃度
●凝固:PT、及び、部分的トロンボプラスチン時間
●尿検査:グルコース、ケトン、タンパク質、血液用のディップスティック(必要に応じて、顕微鏡による評価を完了する)
●血清、及び、水性液でのaVEGFタンパク質濃度
●免疫原性測定:
○NAbからAAV8
○AAV8への抗体の結合
○aVEGFタンパク質に対する抗体
○ELISpot
●血清と尿でのベクター脱落分析
以下の臨床検査と抗体検査を評価する。
●化学:グルコース、血中尿素窒素、クレアチニン、ナトリウム、カリウム、塩化物、二酸化炭素、カルシウム、総タンパク質、アルブミン、総ビリルビン、直接ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ALT、AST、及び、クレアチンキナーゼ。
●血液学:ヘマトクリット、ヘモグロビン、及び、赤血球、白血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球算定など、白血球百分率と血小板算定を用いた完全血球算定、ならびに、平均赤血球体積、平均赤血球ヘモグロビン、及び、平均赤血球ヘモグロビン濃度
●凝固:PT、及び、部分的トロンボプラスチン時間
●尿検査:グルコース、ケトン、タンパク質、血液用のディップスティック(必要に応じて、顕微鏡による評価を完了する)
●血清、及び、水性液でのaVEGFタンパク質濃度
●免疫原性測定:
○NAbからAAV8
○AAV8への抗体の結合
○aVEGFタンパク質に対する抗体
○ELISpot
●血清と尿でのベクター脱落分析
バイタルサイン
バイタルサイン(BP、及び、心拍数)の評価を、取得/実行する。
バイタルサイン(BP、及び、心拍数)の評価を、取得/実行する。
B.評価項目
主要評価項目測定:
1.安全性:26週間を超えての、眼の有害事象(AE)、及び、非眼の重篤な有害事象(SAE)の発生
主要評価項目測定:
1.安全性:26週間を超えての、眼の有害事象(AE)、及び、非眼の重篤な有害事象(SAE)の発生
副次評価項目測定:
2.安全性:106週間を超えての、眼及び非眼でのAE及びSAEの発生。
3.106週間を超えての最良矯正視力(BCVA)における変化。
4.106週間を超えての、SD-OCTで測定したときの中心網膜厚み(CRT)における変化。
5.救援注射:106週間を超えての救援注射の平均数。
6.106週間を超えてFAで測定するときの、脈絡膜血管新生、及び、損傷サイズにおける変化ならびに漏出領域CNVの変化。
2.安全性:106週間を超えての、眼及び非眼でのAE及びSAEの発生。
3.106週間を超えての最良矯正視力(BCVA)における変化。
4.106週間を超えての、SD-OCTで測定したときの中心網膜厚み(CRT)における変化。
5.救援注射:106週間を超えての救援注射の平均数。
6.106週間を超えてFAで測定するときの、脈絡膜血管新生、及び、損傷サイズにおける変化ならびに漏出領域CNVの変化。
基準:採用基準:
1.以前に硝子体内抗VEGF療法を受けている試験する眼におけるAMDに続発する
中心窩下CNVの診断を有する50歳超かつ89歳未満の患者。選択された患者集団は、性別に基づかない(男性及び女性が含まれる)。
2.各々のコホートの最初の患者に対して20/63以下、かつ20/400以上の間のBCVA(63以下、かつ19以上の糖尿病網膜症の早期治療研究[ETDRS]文字)、続いてコホートの残りに対して、20/40以下、かつ20/400以上の間のBCVA(73以下、かつ19以上のETDRS文字)。
3.抗VEGF療法の必要性及び応答の履歴。
4.試験登録時の抗VEGFに対する応答性(1週目においてSD-OCTによって評価される)
5.試験眼において偽性(白内障手術後の状態)である必要がある。
6.正常上限(ULN)の2.5倍未満のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)/アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT);ULNの1.5倍未満の総ビリルビン(TB);ULNの1.5倍未満のプロトロンビン時間(PT);10g/dLを超えるヘモグロビン(Hb)(男性)、9g/dLを超えるヘモグロビン(女性);100×103/μLを超える血小板;30mL/分/1.73m2を超える推定糸球体ろ過率(eGFR)
7.署名された書面によるインフォームドコンセントを提供する意思と能力があるべきである。
1.以前に硝子体内抗VEGF療法を受けている試験する眼におけるAMDに続発する
中心窩下CNVの診断を有する50歳超かつ89歳未満の患者。選択された患者集団は、性別に基づかない(男性及び女性が含まれる)。
2.各々のコホートの最初の患者に対して20/63以下、かつ20/400以上の間のBCVA(63以下、かつ19以上の糖尿病網膜症の早期治療研究[ETDRS]文字)、続いてコホートの残りに対して、20/40以下、かつ20/400以上の間のBCVA(73以下、かつ19以上のETDRS文字)。
3.抗VEGF療法の必要性及び応答の履歴。
4.試験登録時の抗VEGFに対する応答性(1週目においてSD-OCTによって評価される)
5.試験眼において偽性(白内障手術後の状態)である必要がある。
6.正常上限(ULN)の2.5倍未満のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)/アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT);ULNの1.5倍未満の総ビリルビン(TB);ULNの1.5倍未満のプロトロンビン時間(PT);10g/dLを超えるヘモグロビン(Hb)(男性)、9g/dLを超えるヘモグロビン(女性);100×103/μLを超える血小板;30mL/分/1.73m2を超える推定糸球体ろ過率(eGFR)
7.署名された書面によるインフォームドコンセントを提供する意思と能力があるべきである。
除外基準:
1.AMD以外のあらゆる要因に続発する試験眼におけるCNVまたは黄斑浮腫。
2.試験する眼における視力の改善を阻止するあらゆる病態、例えば、線維症、萎縮、または中心窩の中心における網膜上皮裂孔。
3.試験眼における活動性の高い網膜剥離または網膜剥離の病歴。
4.試験眼における進行した緑内障。
5.スクリーニング前の6ヶ月以内に試験眼における硝子体内療法、例えば、硝子体内ステロイド注射、または抗VEGF療法以外の治験薬の履歴。
6.スクリーニング時の試験眼におけるインプラントの存在(眼内レンズを除外する)
7.過去6ヶ月間における心筋梗塞、脳血管障害、または一過性虚血発作。
8.最大限の治療にもかかわらず制御不能の高血圧(180mmHgを超える収縮期血圧[BP]、100mmHgを超える拡張期血圧)。
1.AMD以外のあらゆる要因に続発する試験眼におけるCNVまたは黄斑浮腫。
2.試験する眼における視力の改善を阻止するあらゆる病態、例えば、線維症、萎縮、または中心窩の中心における網膜上皮裂孔。
3.試験眼における活動性の高い網膜剥離または網膜剥離の病歴。
4.試験眼における進行した緑内障。
5.スクリーニング前の6ヶ月以内に試験眼における硝子体内療法、例えば、硝子体内ステロイド注射、または抗VEGF療法以外の治験薬の履歴。
6.スクリーニング時の試験眼におけるインプラントの存在(眼内レンズを除外する)
7.過去6ヶ月間における心筋梗塞、脳血管障害、または一過性虚血発作。
8.最大限の治療にもかかわらず制御不能の高血圧(180mmHgを超える収縮期血圧[BP]、100mmHgを超える拡張期血圧)。
ベクター作製及び製造
A.製造プロセスの記載
細胞播種:正規のヒト胚腎臓293細胞株が作製プロセスのために使用される。ベクター作製に使用される細胞培養は、単一の解凍したMCBバイアルから開始し、マスターバッチ記録文書(MBR)に従って拡張する。細胞はCorningのT-フラスコ及びCS-10を用いて5×109~5×1010の細胞まで拡張し、これは、BDSロットごとのベクター作製のための50までのHS-36への播種を生成するのに十分な細胞量をもたらす。細胞は、10%のガンマ線照射した、米国起源の、ウシ胎仔血清(FBS)で補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)からなる培地で培養する。細胞は、足場依存性であり、細胞解離は動物由来成分不含の細胞解離試薬であるTrypLE(商標)Selectを用いて達成される。細胞播種は、滅菌、単回使用の、使い捨てバイオプロセスバッグ及びチューブセットを用いて達成される。細胞は、37℃(±2℃)で、5%(±0.5%)CO2空気中に維持される。
A.製造プロセスの記載
細胞播種:正規のヒト胚腎臓293細胞株が作製プロセスのために使用される。ベクター作製に使用される細胞培養は、単一の解凍したMCBバイアルから開始し、マスターバッチ記録文書(MBR)に従って拡張する。細胞はCorningのT-フラスコ及びCS-10を用いて5×109~5×1010の細胞まで拡張し、これは、BDSロットごとのベクター作製のための50までのHS-36への播種を生成するのに十分な細胞量をもたらす。細胞は、10%のガンマ線照射した、米国起源の、ウシ胎仔血清(FBS)で補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)からなる培地で培養する。細胞は、足場依存性であり、細胞解離は動物由来成分不含の細胞解離試薬であるTrypLE(商標)Selectを用いて達成される。細胞播種は、滅菌、単回使用の、使い捨てバイオプロセスバッグ及びチューブセットを用いて達成される。細胞は、37℃(±2℃)で、5%(±0.5%)CO2空気中に維持される。
一過性トランスフェクション:約3日の増殖(DMEM培地+10%FBS)に続き、HS-36細胞培養培地を新しい無血清DMEM培地と交換し、最適化されたPEIに基づくトランスフェクション法を用いて3つの作製プラスミドでトランスフェクトする。作
製プロセスにおいて使用される全てのプラスミドは、トレーサビリティ、文書管理、材料の分離を確実にするための制御を利用するCMO品質システム及びインフラストラクチャーに照らして作製される。
製プロセスにおいて使用される全てのプラスミドは、トレーサビリティ、文書管理、材料の分離を確実にするための制御を利用するCMO品質システム及びインフラストラクチャーに照らして作製される。
50のHS-36(BDSバッチごとに)をトランスフェクトするのに十分なDNAプラスミドトランスフェクション複合体が、BSC中で調製される。最初に、7.5mgの関連するベクターゲノムプラスミド、150mgのpAdDeltaF6(Kan)、75mgのpAAV2/8Kan AAVヘルパープラスミド、及びGMPグレードのPEI(PEIPro,PolyPlus Transfection SA)を含むDNA/PEI混合物が調製される。このプラスミドの比率は、小規模最適化試験においてAAV作製のために最適化されるよう決定されている。よく混合した後、溶液を室温において25分間放置し、次いで、反応を停止するために無血清培地に添加し、次いで、HS-36に添加する。トランスフェクション混合物は、HS-36の全ての36層間で均質化され、細胞は37℃(±2℃)で、5%(±0.5%)CO2空気中に5日間インキュベートされる。
細胞培地採取:トランスフェクトされた細胞及び培地は、使い捨てバイオプロセスバッグを用いて、無菌的に培地をユニットから流出させることによって、各々のHS-36から採取される。培地の採取に続いて、約200リットルの容量がMgCl2で2mMの最終濃度まで補充され(Benzonaseの補因子)、Benzonaseヌクレアーゼ(Cat#:1.016797.0001,Merck Group)が25単位/mLの最終濃度まで添加される。産物(使い捨てバイオプロセスバッグ中)が、トランスフェクション処理の結果として採取物中に存在する残留する細胞及びプラスミドDNAの酵素的消化に十分な時間を提供するために、37℃で2時間インキュベーターの中でインキュベートされる。このステップは、最終ベクターDPに残留するDNA量を最小化するために実施される。インキュベーション期間の後、ろ過及び下流のタンジェント流ろ過の間の産物の回復を助けるために、NaClを500nMの最終濃度まで添加する。
浄化:細胞及び細胞残屑は、ペリスタポンプで駆動される、滅菌の閉鎖されたチューブ及びバッグセットとして連続的に接続されるデプスフィルターカプセル(1.2/0.22μm)を用いて産物から除去される。浄化は、下流のフィルター及びクロマトグラフィーカラムが汚染から防御されることを保証し、バイオバーデン低減ろ過は、フィルターの連なりの最後に、下流の精製の前に上流の作製プロセス中に潜在的に導入された全てのバイオバーデンが除去されることを確実にする。採取された物質はSartorius Sartoguard PESカプセルフィルター(1.2/0.22μm)(Sartorius Stedim Biotech Inc.)を通過させる。
大規模タンジェント流ろ過:浄化産物の容量低減(10倍)は、カスタム滅菌、閉鎖されたバイオプロセスチューブ、バッグ及び膜のセットを用いるタンジェント流ろ過(TFF)によって達成される。TFFの原理は、好適な多孔度(100kDa)の膜と平行の圧の下、溶液を流すことである。圧力差は、より小さいサイズの分子を駆動して膜を通らせ、廃棄ストリームに効果的に移動させる一方で、膜の孔よりも大きな分子を保持する。溶液を再循環させることによって、平行流が膜表面を掃引して膜孔の汚染を防止する。適切な膜の孔径及び表面積を選択することによって、液体試料は迅速に用量を低減でき、一方で所望の分子を保持して濃縮する。TFFの適用における透析ろ過は、液体が膜を通って廃棄ストリームに移動するのと同一の速度で再循環試料に新しい緩衝液を添加することを含む。透析ろ過の容量の増加に伴って量を増加する小分子は、再循環試料から除去される。これは浄化産物の適度な精製をもたらすが、後に続くアフィニティーカラムクロマトグラフィーステップと適合する緩衝液交換をも達成する。したがって、100kDaのPES膜が濃縮に使用され、次いで、20mMのTris pH 7.5及び400mMの
NaClからなる緩衝液の最小で4の透析容量で透析ろ過がされる。透析ろ過された産物は、4℃において一晩保存され、次いで、1.2/0.22μmのデプスフィルターカプセルを用いて浄化され、全ての沈殿した物質を除去する。
NaClからなる緩衝液の最小で4の透析容量で透析ろ過がされる。透析ろ過された産物は、4℃において一晩保存され、次いで、1.2/0.22μmのデプスフィルターカプセルを用いて浄化され、全ての沈殿した物質を除去する。
アフィニティークロマトグラフィー:透析ろ過された産物は、効果的にAAV8セロタイプを捕捉するPoros(商標)Capture Select(商標)AAV8親和性樹脂(Life Technologies)へと適用される。これらのイオン条件において、相当の割合の残留細胞DNA及びタンパク質はカラムを通過し、一方でAAV粒子は効果的に捕捉される。適用に続いて、カラムを追加の供給不純物を除去するために洗浄し、1/10容量の中和緩衝液(Bis Trisプロパン、200mM、pH10.2)中への回収によって即座に中和される低pHステップ溶離(400mMのNaCl、20mMのクエン酸ナトリウム;pH 2.5)が後に続く。
アニオン交換クロマトグラフィー:空のAAV粒子を含む工程内不純物のさらなる低減を達成するために、Poros-AAV8溶離プールを50倍に希釈し(20mMのBis Trisプロパン、0.001%のPluronic F68;pH10.2)、イオン強度を低下させ、CIMultus(商標)QAモノリスマトリックス(BIA Separations)への結合を可能にする。低塩洗浄に続いて、ベクター産物を60CV NaCl線状塩勾配(10~180mMのNaCl)を用いて溶離する。この浅い塩勾配は、ベクターゲノム(完全な粒子)を含む粒子からベクターゲノム(空の粒子)含まずにカプシド粒子を効果的に分離し、完全なカプシドの濃縮された調製物をもたらす。それぞれがチューブへの非特異的結合を最小化し、高pHへの曝露時間を最小化する、1/100容量の0.1%のpluronic F68と1/27容量のBis Tris
pH6.3を含むチューブに画分を回収する。適切なピーク画分を回収し、ピーク面積を評価し、適切なベクター収量決定のための以前のデータと比較する。
pH6.3を含むチューブに画分を回収する。適切なピーク画分を回収し、ピーク面積を評価し、適切なベクター収量決定のための以前のデータと比較する。
最終的な製剤、及び、BDSを得るためのバイオバーデン低減ろ過:プールされたAEX画分で最終的な製剤を達成するために100kDa膜によるTFFを用いる。これは、製剤緩衝液(安定性試験の完了に続いて選択されるNaCl及び0.001%のPluronicを含むPBSまたは0.001%のPluronicを含むPBS)の透析ろ過によって達成され、所望の標的でBDS中間体を得るよう濃縮される。試料はBDS中間体試験(以下の節に記載される)のために回収される。BDS中間体は、滅菌ポリプロピレンチューブに貯蔵され、最終的な充填のためのリリースまで-60℃以下で隔離された場所で凍結される。安定性試験は、-60℃未満での貯蔵に続く安定性を評価するために進行中である。
最終的な充填:凍結されたBDSは解凍され、プールされ、最終的な製剤緩衝液(安定性試験の完了に続いて選択されるNaCl及び0.001%のPluronicを含むPBSまたは0.001%のPluronicを含むPBS)を用いて目的の濃度に調整(希釈またはTFFによる濃縮ステップ)される。次いで、産物は0.22μmフィルターを通して最終的なろ過をされ、バイアル当たり0.1mL以上から0.5mL以下の充填容量で、West Pharmaceutical’s “Ready-to-Use”(予め滅菌された)ガラスバイアルまたはCrystal Zenith(ポリマー)バイアル(バイアルのタイプは比較試験の結果を待つ)いずれかとクリンプシール付きストッパーとで充填される。バイアルは、以下の仕様に従って個別にラベルされる。ラベルされたバイアルは-60℃以下で保存される。投与前に全ての用量は製剤緩衝液における希釈を必要とする。希釈は、投与時に薬局により実施される。
B.アッセイ方法
無菌性及び静菌性/真菌性:この手順は、試料マトリックスがアッセイの阻害を引き起
こさないことを確実にするために、米国薬局方(USP)<71>に従って1回行われる。試験に含まれるのは適合性試験である。
無菌性及び静菌性/真菌性:この手順は、試料マトリックスがアッセイの阻害を引き起
こさないことを確実にするために、米国薬局方(USP)<71>に従って1回行われる。試験に含まれるのは適合性試験である。
粒子凝集:製剤粒子の凝集は、動的光散乱(DLS)アッセイを用いて評価された。DLSは、分散粒子による散乱光強度の変動を測定し、試料中の様々な粒子のサイズを分析するために使用される。DLS装置ソフトウェアは、典型的には異なる直径の粒子集団を示す。系が単分散である場合、1つの集団のみが検出され、粒子の平均有効直径を決定することができる。凝集の場合のような多分散系では、CONTIN分析を用いて複数の粒子集団が検出され、サイズ決定される。
残留プラスミドDNA:プラスミドDNA配列の検出は、プラスミドバックボーンに存在するがベクターゲノムに存在しないカナマイシン遺伝子に特異的なqPCRとプライマープローブセットとを用いて達成される。DNase消化の存在下と非存在下の両方においてアッセイを実施し、遊離したプラスミドの量と、ベクター粒子にパッケージングされた量とを決定できるようにする。
E1 DNA:アデノウイルスE1 DNAは宿主細胞の混入物質であり、遺伝子に特異的なqPCRによって検出される。DNase消化の存在下と非存在下の両方においてアッセイを実施し、遊離したE1 DNAとパッケージングされたE1 DNAとを定量化できるようにする。
残留宿主細胞DNA:残留する宿主細胞DNA(HCDNA)のレベルは、高コピー数DNA配列であり、したがって感度をもたらす、ヒト18s rDNA遺伝子に対するqPCRを用いて定量化される。全体の残留HCDNAレベルに加えて、様々なサイズ範囲のDNAの量も測定される。
残留宿主細胞タンパク質:残留する293宿主細胞タンパク質(HCP)は、Cygnus Technologiesが販売しているような、市販のELISAキットを用いて検出される。
Poros-AAV8浸出性リガンド:Poros-AAV8樹脂の製造者であるLife Technologiesによって供給される、酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)キットを、製剤中に滲出したラクダ抗体を検出するのに使用する。
マイコプラズマ検出:マイコプラズマ試験はUSP<63>に従って実施する。
バイオバーデン試験:この試験はUSP<61>に従って実施する。
エンドトキシン試験:この試験はUSP<85>に従って実施する。
外来性の作用物質のためのインビトロアッセイ:ウイルス混入物質のためのインビトロアッセイの目的は、AAV8.AMDベクター作製中に導入される可能性のある外来性のウイルスを検出することであり、CBER’s 1993 Points to Consider及びICH Q5Aに基づく。インビトロアッセイは3つの指標細胞株:ヒト二倍体肺(MRC-5)細胞、アフリカミドリザル腎臓(Vero)細胞、及びヒト包皮線維芽細胞(Hs68)細胞を使用する。アッセイ評価項目は、広範囲のウイルスの検出を促進する、アッセイ期間の終了時における少なくとも28日間の過程における細胞変性効果(CPE)の観察及び血球吸着である。
ベクターゲノム識別:DNAシーケンシング:ウイルスベクターゲノムDNAは単離さ
れ、プライマーウォーキングを用いた2倍の配列カバー率によって配列決定される。配列のアラインメントが実施され、予想される配列と比較される。
れ、プライマーウォーキングを用いた2倍の配列カバー率によって配列決定される。配列のアラインメントが実施され、予想される配列と比較される。
ベクターカプシド識別:VP1のAAVカプシド質量分析:製剤のAAV2/8セロタイプの確認は、AAVカプシドタンパク質のペプチドの分析に基づくアッセイによって達成される。
ゲノムコピー(GC)力価:AAVベクターのゲノムコピー(GC)力価を測定するための液滴デジタルPCR(ddPCR)に基づく技術はLock et al.Human Gene Therapy Methods 25:115-125に記載される。用いられるアッセイは、DNase Iによる消化、後に続くカプセルに包まれたベクターゲノムコピーを測定するデジタルPCR解析を含む。DNA検出は、RBGのpolyA領域を標的とする配列特異的プライマーを、この同じ領域にハイブリダイズする蛍光標識されたプローブと組み合わせて用いて達成される。標準の数、評価試料、及びコントロール(バックグランド及びDNA混入のための)がアッセイに導入されている。
空対完全な粒子の比:製剤の全粒子含量は、SDS-PAGE解析によって測定される。イオジキサノール勾配において精製された参照ベクター製剤が様々な方法(分析的超遠心、電子顕微鏡、及び260/280nmの吸光度)によって解析され、製剤中の完全な粒子のパーセンテージを確立する。この参照物質は、既知のゲノムコピー数(従って外延により、粒子数)に系列希釈され、各々の希釈は、同様の希釈系列の製剤と共にSDS-PAGEゲルで泳動される。参照物質と製剤のVP3タンパク質のバンドのピーク領域の容量は、デンシトメトリーで測定され、参照物質の容量が粒子数に対してプロットされる。製剤の全粒子濃度は、この曲線から外挿によって測定され、ゲノムコピー(GC)力価が差し引かれて空の粒子の力価を得る。空対完全な粒子の比は、空の粒子の力価対GC力価の比である。
感染力価:感染単位(IU)アッセイは、RC32細胞(rep2発現HeLa細胞)においてAAV8.AMDベクターの生産的な取り込みと複製とを測定するのに使用される。以前に公開されたものと同様に、96ウェル評価項目型が使用されている。手短に、RC32細胞を系列希釈のAAV8.AMD.BDSと統一希釈のAd5とで、rAAVの各々の希釈について12の重複で、共感染する。感染の72時間後に細胞を溶解し、入力したものを超えるrAAVベクター増幅を検出するためにqPCRを実施する。評価項目希釈組織培養感染量50%(TCID50)計算(Spearman-Karber)を実施してIU/mLとして表される複製力価を決定する。「感染」値は、細胞と接触する粒子、受容体結合、インターナリゼーション、核への移行、及びゲノム複製に依存するので、それらは、アッセイの幾何学的配置ならびに使用される細胞株における適切な受容体及び結合後の経路の存在に影響を受ける。受容体及び結合後の経路は、通常、不死化細胞株において維持されないため、感染性アッセイ力価は、存在する「感染性」粒子の数の絶対的な尺度ではない。しかし、「感染性単位」に対するカプシド化されたGCの比(GC/IU比として記載される)は、ロットからロットへの製品一貫性の尺度として使用することができる。
宿主細胞DNA:残留するヒト293DNAを検出するためにqPCRアッセイが使用される。「関連性のないDNA」でスパイクした後、全DNA(関連性のないベクター及び残留するゲノム)を約1mLの産物から抽出する。宿主細胞DNAは18S rDNA遺伝子を標的としてqPCRを用いて定量化される。検出されるDNAの量は、スパイクした関連性のないDNAの回復に基づいて標準化される。
宿主細胞タンパク質:ELISAは、混入する宿主HEK293細胞タンパク質のレベ
ルを測定するために実施される。The Cygnus Technologies HEK293 Host Cell Proteins 2nd Generation ELISAキットが説明書に従って使用される。
ルを測定するために実施される。The Cygnus Technologies HEK293 Host Cell Proteins 2nd Generation ELISAキットが説明書に従って使用される。
複製可能なAAV(rcAAV)アッセイ:試料は、作製プロセスにおいて生じる可能性があり得る複製可能なAAV2/8(rcAAV)の存在について分析される。
このタイプのアッセイの例は(図10A~10D)に示され、そこではwtAAV8が異なるGC数のAAV8ベクター中にスパイクされ、細胞溶解物の新しい細胞に対する3代の連続的な継代の後に1μgの293細胞のDNA当たりのcap遺伝子コピー数が測定される。アッセイ開発の詳細はCTA提出資料に含まれる。これらの結果は、このアッセイを用いる最小限検出可能なwtAAV8の量は104GCであることを示す。この数は、1TCID50IUとほぼ同等であり、AAV8の293細胞に対する感染性の欠失を反映し、AAV2と比較して得られる高いGC:IU比によって実証される。低い感度は、現在のアッセイ系においては避けられないが、将来的に未だ発見されていないAAVの細胞受容体または進入後の経路に重要な他のタンパク質を有する細胞株を作出することによって克服できるかもしれない。wtAAV8の、1011GCまでの濃度のAAV8ベクターへのスパイクは、検出にほとんど影響を及ぼさず、このベクターのレベルにおける、ベクターのwtAAV8の複製に対する干渉の欠如を示す。野生型AAVが、過去においてrcAAV2に対する代替物として、及び我々自身のrcAAVアッセイ開発の努力においてAAV8に対する代替物として、過度に使用されてきている一方で、最良の代替物は、AAV2のITRを含むAAV8カプシド、AAV2のrep遺伝子、及びAAV8のcap遺伝子である。
臨床的に好適な界面活性剤、Pluronic F68をAAV8.AMDの最終的な製剤緩衝液に添加し、このタイプの損失を最小限に抑えることを期待する。製剤と貯蔵バイアル及び臨床送達装置との間の相互作用は、表面への結合を通じてベクターの損失量を決定するために調査された。エンジニアリングラン製剤のGC力価(oqPCR)を、バイアル化及び-60℃以下での貯蔵の前後で測定する。送達装置に関して、DPは解凍され、適切な臨床希釈剤で正しい用量濃度へと希釈され、装置を通過させる。GC力価決定は解凍直後、希釈後、及び装置を通過した後にDPにおいて実施し、適切な数の重複が統
計学的有意性を保証するために含められた。この方法におけるGC力価の比較は、貯蔵及び患者への投与の最中のDP喪失の評価を可能にする。送達装置を通過した後の製剤の活性を評価するために、平行した試験もまた同様の方法で実施した。この目的のためにインビトロラニビズマブ発現に基づく効力検定が使用される。
計学的有意性を保証するために含められた。この方法におけるGC力価の比較は、貯蔵及び患者への投与の最中のDP喪失の評価を可能にする。送達装置を通過した後の製剤の活性を評価するために、平行した試験もまた同様の方法で実施した。この目的のためにインビトロラニビズマブ発現に基づく効力検定が使用される。
全視野ERGにより評価される非非ヒト霊長類におけるAAV8-抗VEGF Fabの網膜下送達の安全性。
非ヒト霊長類で網膜下に送達したAAV8-抗VEGF Fabの前臨床用量依存毒性を評価するために実験を行った。
非ヒト霊長類で網膜下に送達したAAV8-抗VEGF Fabの前臨床用量依存毒性を評価するために実験を行った。
この研究では、20匹のオスとメスの成体CMを使用した。それぞれの動物/眼について、完全な眼科検査と、光コヒーレンストモグラフィーによる網膜画像検査を行い、網膜機能に影響を与え得る異常がないことを確認した。このERGセッションは、薄暗い光の条件下で行った。全視野刺激は、内部をアルミホイルで裏打ちしたカスタムメイドのGanzfeld刺激装置とその床に取り付けたLEDエミッタで生成した。光源は、ILT5000光度計(International Light Technologies(Peabody、MA))を使用して校正した。Diagnosys LLC(Lowell,MA)のEspionワークステーションが刺激装置を制御し、そして、シグナルを得た。ERGを、双極性のブリアンアレン電極(Hansen Labs,Coralwhille,IA)で記録した。使用した閃光刺激の強度(cd s m-2)は、ISCEV標準に従っており、そして、以下の表に示す。すべての刺激は、LED光源によって提供される5msの閃光であった。ERGは、作用物質の送達前、及び3、6、9、及び、12ヶ月後に記録した。作用物質を、1E10(低用量、LD)、または、1E12(高用量、HD)vg/眼で、右眼に送達した;そして、左眼をコントロールとした。ERGは、作用物質の送達前、及び3、6、9、及び、12ヶ月後に記録した。
現在の作業で使用した刺激のパラメーター
動物を、8mg/kgのケタミンと、0.025mg/kgのデクスメジトミジンで鎮静させ、それらの瞳孔を、フェニレフリン(2.5%)とトロピカミド(1%)で拡張し、そして、局所麻酔にプロパラカイン(0.5%)を使用した。必要に応じて、4mg/kgケタミンと、0.0125mg/kgデクスメドとを追加投与した。心拍数、SPO2、呼吸数、及び、体温をモニターした。サルを、バイトバーとイヤークランプとを備えたカスタムデザインのステージに、「スフィンクス」の姿勢(頭を過度に伸ばした腹臥位)で、頭と眼を前方に向くように置いた。
GONAKメチルセルロース溶液(AKORN、Inc,Lake Forest,IL)で湿らせた2つの記録用双極性ブリアンアレン電極を動物の眼に置き、そして、接地電極(GRASS金電極、Astro-Med,West Warwick、RI)を、クラウンとイニオンの間にある剃った肌にテープで固定した。ELECTRO-GEL(Electro-Cap International,Eston、OH)の1滴を、接地電極下の皮膚に塗布して、良好な電気的接触を提供した。動物がいるステージをガンツフェルトの囲いに移動して、記録セッションの間に、動物の頭全体がガンツフェルト内にあるようにした。
図19及び20が実証しているように、1E10 vg/眼で網膜下に注射したAAV8-抗VEGF Fabは、ERGの大きさに影響を及ばしておらず、したがって、この用量では毒性は示さない。1E12 vg/眼の高用量では、毒性が明白である。適用をした後に、ERGの大きさは、約50%低下する。この減少は、同様の方法で、すべてのERGコンポーネントで発生しており、このことは、当該作用物質が、特定の細胞タイプを標的とせず、むしろ、非常に高濃度で一般的な毒性を示すことを示している。毒性効果は、注射後の最初の3ヶ月間で完全に発現し、そして、統計的有意性は3ヶ月の時点(n=6)のみに限定されていたが、この時点以降は静止している。作用物質を投与して6、9、及び、12ヶ月後に記録したERGの規模は、3ヶ月の時点と同様であったが、2~3匹/群という動物の数は、統計分析には不十分であった。
これらの結果は、以下のことを示唆している。
(1)1E10 vg/サルの眼でのAAV8抗VEGF Fabの網膜下送達は、全視野網膜電図で検出可能なあらゆる網膜機能の不都合を招かない。
(2)全視野ERGの振幅の減少によって明らかになった網膜機能の統計的に有意な障害は、高用量(1E12 vg/眼)でのベクター使用で認められる。
(3)網膜機能障害の完全な発現は、注射をして3ヶ月後の時点で達成される;1E12 vg/眼の作用物質を注射した後の時点で、網膜機能は、低下したレベルで静止したままである。
(4)AAV8抗VEGF Fabは、特定の細胞タイプの機能を選択的に低下させるのではなく、むしろ、高濃度で一般的な毒性を示す。
(1)1E10 vg/サルの眼でのAAV8抗VEGF Fabの網膜下送達は、全視野網膜電図で検出可能なあらゆる網膜機能の不都合を招かない。
(2)全視野ERGの振幅の減少によって明らかになった網膜機能の統計的に有意な障害は、高用量(1E12 vg/眼)でのベクター使用で認められる。
(3)網膜機能障害の完全な発現は、注射をして3ヶ月後の時点で達成される;1E12 vg/眼の作用物質を注射した後の時点で、網膜機能は、低下したレベルで静止したままである。
(4)AAV8抗VEGF Fabは、特定の細胞タイプの機能を選択的に低下させるのではなく、むしろ、高濃度で一般的な毒性を示す。
NHPにおけるAAV8-抗VEGF Fabの網膜下送達の安全性:
1年後の網膜構造
加齢性黄斑変性症(AMD)は、進行性の不可逆的かつ重度の中心視野の喪失を引き起こす変性網膜疾患である。AMD(nAMD)の新生血管(「滲出」)型は、神経網膜内及び神経網膜下の異常な血管の発達を特徴とする。異常な血管の成長は、急速な漏出を招き、通常の出血、変形、及び、正常な網膜構造の破壊を引き起こす。抗VEGF Fab(フラグメント抗原結合)は、nAMDの治療について承認を受けた組換えヒト化モノクローナルIgG1アイソタイプカッパフラグメントである。抗VEGF Fabは、ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)-Aのすべてのアイソフォームに結合し、そして、その生物学的活性を阻害する。これは、内皮細胞の増殖、異常な血管の成長、及び、血管漏出を
抑制する。しかしながら、血管新生の再発を防ぐためには、抗VEGF Fabを繰り返し投与する必要がある。抗VEGF Fabの反復投与は、遺伝子治療で回避することができる。ベクターの単回網膜下投与は、抗VEGF剤の連続的な治療レベルをもたらすのに十分な数の目的の遺伝子のコピーの送達を可能にした。
1年後の網膜構造
加齢性黄斑変性症(AMD)は、進行性の不可逆的かつ重度の中心視野の喪失を引き起こす変性網膜疾患である。AMD(nAMD)の新生血管(「滲出」)型は、神経網膜内及び神経網膜下の異常な血管の発達を特徴とする。異常な血管の成長は、急速な漏出を招き、通常の出血、変形、及び、正常な網膜構造の破壊を引き起こす。抗VEGF Fab(フラグメント抗原結合)は、nAMDの治療について承認を受けた組換えヒト化モノクローナルIgG1アイソタイプカッパフラグメントである。抗VEGF Fabは、ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)-Aのすべてのアイソフォームに結合し、そして、その生物学的活性を阻害する。これは、内皮細胞の増殖、異常な血管の成長、及び、血管漏出を
抑制する。しかしながら、血管新生の再発を防ぐためには、抗VEGF Fabを繰り返し投与する必要がある。抗VEGF Fabの反復投与は、遺伝子治療で回避することができる。ベクターの単回網膜下投与は、抗VEGF剤の連続的な治療レベルをもたらすのに十分な数の目的の遺伝子のコピーの送達を可能にした。
AAV8抗VEGF Fabは、nAMDの遺伝子治療のために開発されている。AAV8抗VEGF Fabは、AAV2逆位末端反復(AAV2/8ベクター)が隣接する遺伝子カセットを含む、血清型8カプシドからなる非複製組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。AAV8抗VEGF Fabの遺伝子カセットは、抗VEGF Fabをコードする。
長期(1年間)の安全性を評価し、網膜下に送達したAAV8抗VEGF Fabの用量上限を、非ヒト霊長類(NHP)の滲出型AMDの治療として定義するために、実験を行った。
方法:
Cynomolgus macaquesを、様々な治療群に無作為に割り当てた。それぞれの処理グループに、抗VEGF Fabを発現する特定の用量のAAV2/8ベクター、または、最終製剤バッファーコントロール(FFB-314)のいずれかを与えた。動物に、1.00e12GC/眼、1.00e11GC/眼(Aleman et al.,2017,Trctiakova et al.,2017)、または、1.00e10GC/眼のいずれかのAAV2/8ベクターを、100μLの総容量で、単回投与した。ベクターは、指定した眼に(右眼(OD)だけに高用量と低用量を、左眼(OS)と右眼の両方に中用量を)網膜下投与した。実験は、ベースラインと3ヶ月に実施した。動物のサブセットは、低用量、高用量、及び、コントロール群を注射して6ヶ月後(n=7)、及び、12ヶ月後(n=6)まで追跡した。前房液は、事前に指定した時点で回収した。
Cynomolgus macaquesを、様々な治療群に無作為に割り当てた。それぞれの処理グループに、抗VEGF Fabを発現する特定の用量のAAV2/8ベクター、または、最終製剤バッファーコントロール(FFB-314)のいずれかを与えた。動物に、1.00e12GC/眼、1.00e11GC/眼(Aleman et al.,2017,Trctiakova et al.,2017)、または、1.00e10GC/眼のいずれかのAAV2/8ベクターを、100μLの総容量で、単回投与した。ベクターは、指定した眼に(右眼(OD)だけに高用量と低用量を、左眼(OS)と右眼の両方に中用量を)網膜下投与した。実験は、ベースラインと3ヶ月に実施した。動物のサブセットは、低用量、高用量、及び、コントロール群を注射して6ヶ月後(n=7)、及び、12ヶ月後(n=6)まで追跡した。前房液は、事前に指定した時点で回収した。
ELISA:
抗VEGF Fabの濃度は、前房液、硝子体液、及び、注射した網膜と注射していない網膜の様々なセグメントから調製した組織ホモジネートのVEGF酵素免疫測定法(ELISA)で決定した。
抗VEGF Fabの濃度は、前房液、硝子体液、及び、注射した網膜と注射していない網膜の様々なセグメントから調製した組織ホモジネートのVEGF酵素免疫測定法(ELISA)で決定した。
網膜画像化:
網膜構造は、スペクトル領域光干渉断層写真術(SD-OCT)(Spectralis OCT,Heidelberg Engineering GmbH,Heiderberg,Germany)で評価した。正面型網膜画像化は、近赤外線反射(NIR-REF)を備えた(ERG実験への適応を維持するための)暗室で行い、そして、このイメージングシステムの走査型レーザー検眼鏡を使用して、近赤外線眼底自家蛍光(NIR-FAF)で、動物のサブセットにおいて行った。SD-OCTスキャンは、中心窩を通る長さ9mmの水平及び垂直断面で、30°x25°mmのラスタースキャンを重ねて実行した。網膜の層を、Spectralisシステムの内蔵型自動セグメンテーションを使用して定量し、異なる層の境界の正確な識別を確実にするために監視をした。網膜全体の厚みトポグラフィーマップを生成して、正面の画像化と組み合わせて、治療領域を、さらに焦点を絞ったセグメンテーションの分析を行った関心領域(ROI)として視覚化するために使用した。ROI内で調査したセグメンテーションパラメーターとして:1-内部制限膜(ILM)と網膜色素上皮シグナル(RPE)の基底側との間の距離として定義される網膜全体の厚み;2-ILMと外網状層(OPL)との間の距離として定義される内網膜の厚み;3-OPLと外部制限膜(ELM)との間の距離として定義される外核層(ONL)の厚み;4-楕円ゾーン(EZ)帯からブルッフ膜(BrM)であって、SD
-OCTでのこれら2つの帯の間の距離として定義されるもの(Aleman et al.,2017)がある。治療前と治療後のパラメーター間、及び、反対側の注射をしていない眼での類似した領域との比較を行った。非注射眼からの垂直経線に沿ったデータから構築した規範的データベースを使用して、ROIでの非注射ベースライン(1.00E+11 GC/眼、n=4)画像化を使用せずに、眼の注射領域を比較した。
網膜構造は、スペクトル領域光干渉断層写真術(SD-OCT)(Spectralis OCT,Heidelberg Engineering GmbH,Heiderberg,Germany)で評価した。正面型網膜画像化は、近赤外線反射(NIR-REF)を備えた(ERG実験への適応を維持するための)暗室で行い、そして、このイメージングシステムの走査型レーザー検眼鏡を使用して、近赤外線眼底自家蛍光(NIR-FAF)で、動物のサブセットにおいて行った。SD-OCTスキャンは、中心窩を通る長さ9mmの水平及び垂直断面で、30°x25°mmのラスタースキャンを重ねて実行した。網膜の層を、Spectralisシステムの内蔵型自動セグメンテーションを使用して定量し、異なる層の境界の正確な識別を確実にするために監視をした。網膜全体の厚みトポグラフィーマップを生成して、正面の画像化と組み合わせて、治療領域を、さらに焦点を絞ったセグメンテーションの分析を行った関心領域(ROI)として視覚化するために使用した。ROI内で調査したセグメンテーションパラメーターとして:1-内部制限膜(ILM)と網膜色素上皮シグナル(RPE)の基底側との間の距離として定義される網膜全体の厚み;2-ILMと外網状層(OPL)との間の距離として定義される内網膜の厚み;3-OPLと外部制限膜(ELM)との間の距離として定義される外核層(ONL)の厚み;4-楕円ゾーン(EZ)帯からブルッフ膜(BrM)であって、SD
-OCTでのこれら2つの帯の間の距離として定義されるもの(Aleman et al.,2017)がある。治療前と治療後のパラメーター間、及び、反対側の注射をしていない眼での類似した領域との比較を行った。非注射眼からの垂直経線に沿ったデータから構築した規範的データベースを使用して、ROIでの非注射ベースライン(1.00E+11 GC/眼、n=4)画像化を使用せずに、眼の注射領域を比較した。
AAV8抗VEGF Fabの長期発現
抗VEGF Fabの発現を、ELISAで決定した。高用量、中用量、及び、低用量群の発現の比較を行った。導入遺伝子の発現を喪失した高用量の1匹の動物は、ヒト導入遺伝子産物に対する抗体応答を示した(データ示さず)。
抗VEGF Fabの発現を、ELISAで決定した。高用量、中用量、及び、低用量群の発現の比較を行った。導入遺伝子の発現を喪失した高用量の1匹の動物は、ヒト導入遺伝子産物に対する抗体応答を示した(データ示さず)。
この結果は、すべての投与群において、抗VEGF Fabの堅調で、かつ、持続的な発現があることを示している。
正面型網膜画像化
近赤外線反射(NIR-REF):
注射をして12ヶ月後に追跡調査を完了した6匹の動物のNIR-REF画像を得た(データ示さず)。暗い凸線は、網膜下ブレブの輪郭に対応している。高用量の動物では、注射した網膜内のNIR-REFシグナルに明らかな変化が認められるが、シグナルは正常で、かつ、低用量の動物での注射を行っていない周囲の網膜との間に大きな差異は認められない。
近赤外線反射(NIR-REF):
注射をして12ヶ月後に追跡調査を完了した6匹の動物のNIR-REF画像を得た(データ示さず)。暗い凸線は、網膜下ブレブの輪郭に対応している。高用量の動物では、注射した網膜内のNIR-REFシグナルに明らかな変化が認められるが、シグナルは正常で、かつ、低用量の動物での注射を行っていない周囲の網膜との間に大きな差異は認められない。
近赤外眼底自家蛍光(NIR-FAF):
注射後12ヶ月と比較した注射後3ヶ月のNIR-FAF(データ示さず)。すべての動物の注射した網膜内で、脱メラニン化の暗い領域が認められる。これらの病変は、高用量の動物で、より密であり、かつ、より広範囲であるように見える。注射した網膜の中心にある68587のハイパーFAFは、限局性の慢性漿液性剥離に対応する。色素消失した網膜は、NIR-REFシグナルに変化をもたらすRPEの表面の構造によるNIR光吸収とは対照的に、RPE及び/または脈絡膜脱メラニン化を示唆するNIR-REFに関して正常に見える網膜において明らかである。これらの病変は、鼻腔周囲、及び、乳頭周囲網膜の色素消失した境界のわずかな動きを示した76562を除いて、最も早い時点以降に、時間の経過とともに安定しているように見える。
注射後12ヶ月と比較した注射後3ヶ月のNIR-FAF(データ示さず)。すべての動物の注射した網膜内で、脱メラニン化の暗い領域が認められる。これらの病変は、高用量の動物で、より密であり、かつ、より広範囲であるように見える。注射した網膜の中心にある68587のハイパーFAFは、限局性の慢性漿液性剥離に対応する。色素消失した網膜は、NIR-REFシグナルに変化をもたらすRPEの表面の構造によるNIR光吸収とは対照的に、RPE及び/または脈絡膜脱メラニン化を示唆するNIR-REFに関して正常に見える網膜において明らかである。これらの病変は、鼻腔周囲、及び、乳頭周囲網膜の色素消失した境界のわずかな動きを示した76562を除いて、最も早い時点以降に、時間の経過とともに安定しているように見える。
通常の構造による脱メラニン化
代表的な画像は、図21と図22にある。低自己蛍光領域の断面での網膜のSD-OCTの外観(左側の点線の矢印、図21)は、NIR-FAFの変化がない場合(中央の破線の矢印、図21)と非常に類似している。当該ブレブの境界は、網膜の外側の頂端RPEの局所的な破壊を示す(データ示さず)。指状突起間シグナル(白い矢印、図21)は、低自己蛍光領域に近い注射領域内で減衰(灰色の矢印、図21)して現れる。
代表的な画像は、図21と図22にある。低自己蛍光領域の断面での網膜のSD-OCTの外観(左側の点線の矢印、図21)は、NIR-FAFの変化がない場合(中央の破線の矢印、図21)と非常に類似している。当該ブレブの境界は、網膜の外側の頂端RPEの局所的な破壊を示す(データ示さず)。指状突起間シグナル(白い矢印、図21)は、低自己蛍光領域に近い注射領域内で減衰(灰色の矢印、図21)して現れる。
断面網膜画像化
正面型画像:
メラニン発蛍光団の励起に起因する近赤外眼底自家蛍光(NIR-FAF)画像。注射して12ヶ月後に画像を得た。網膜血管系と視神経頭は、通常の灰色がかったNIR-FAF背景に暗い画像として現れる。限局性慢性漿液性網膜剥離を確認した(データ示さず)。
正面型画像:
メラニン発蛍光団の励起に起因する近赤外眼底自家蛍光(NIR-FAF)画像。注射して12ヶ月後に画像を得た。網膜血管系と視神経頭は、通常の灰色がかったNIR-FAF背景に暗い画像として現れる。限局性慢性漿液性網膜剥離を確認した(データ示さず)。
注射した網膜の中心付近の脱メラニン化(暗い)領域と、正常、または、ほぼ正常なNIR-FAFの外観を有する網膜との間に移行ゾーンがある(データ示さず)。
厚みトポグラフィー:
9mm長のSD-OCTラスタースキャンを使用して、同じ領域の事前注射位置に対応する、注射して12ヶ月後の注射後網膜内の関心領域(ROI)から網膜全体の厚みトポグラフィーを決定した。画像を共同登録した。スキャンの方向と、注射前後での位置が重複するセグメントを記録した。
9mm長のSD-OCTラスタースキャンを使用して、同じ領域の事前注射位置に対応する、注射して12ヶ月後の注射後網膜内の関心領域(ROI)から網膜全体の厚みトポグラフィーを決定した。画像を共同登録した。スキャンの方向と、注射前後での位置が重複するセグメントを記録した。
主に高用量の動物で、ブレブ内の脱メラニン化した薄い網膜と、隣接する通常はメラニン化している正常な厚みの網膜との間の移行領域がある(データ示さず)。
断面画像化:
注射前の画像と比較した、注射して12ヶ月後の注射部位の1.5mm SD-OCT断面。血管要素を使用して、注射前後の画像を調整した。核層を、標識した(GCL=神経節細胞層;INL=内核層;ONL=外核層)。網膜中心部のこれらの場所で一貫して識別したONLの遠位の構造にも標識を付けた(EZ=楕円帯、RPE=網膜色素上皮、BrM=ブルッフ膜)。T=時間的;N=鼻側網膜。
注射前の画像と比較した、注射して12ヶ月後の注射部位の1.5mm SD-OCT断面。血管要素を使用して、注射前後の画像を調整した。核層を、標識した(GCL=神経節細胞層;INL=内核層;ONL=外核層)。網膜中心部のこれらの場所で一貫して識別したONLの遠位の構造にも標識を付けた(EZ=楕円帯、RPE=網膜色素上皮、BrM=ブルッフ膜)。T=時間的;N=鼻側網膜。
最大のベクター用量では、全体的に網膜が薄くなり、組織が乱れる。最小のベクター用量では、正常に見える網膜、または、RPEを有する光受容体の外側セグメント指状突起間に限定して認められる異常のいずれかを示す。
構造パラメーターの縦方向の変化:
相対変化(ベースラインの割合)として表され、かつ、ビヒクルを注射した眼と比較して、AAV2/8-抗VEGF Fabを単眼網膜下に単回注射した後の時間の関数としてプロットしたSD-OCTパラメーターの比較(データ示さず)。ビヒクルを注射したコントロールで推定したパラメーターの来院間変動の限界(変更の99パーセンタイル限界:TRT=14%、IRT=31%、ONL=18%;EZ-RPE10%;n=4)を、ベクターを注射した動物で測定したパラメーターとの比較で記録した。ビヒクルを注射した眼に関する破線は、注射していない眼から推定した限界を表すようにプロットした(変更の99パーセンタイル限界:TRT=7%、IRT=16%、ONL=22%;EZ-RPE19%;n=16)。EZからBrM/RPEまでの距離は、光受容体の外側セグメント(POS)の長さの代替的測定値である。
相対変化(ベースラインの割合)として表され、かつ、ビヒクルを注射した眼と比較して、AAV2/8-抗VEGF Fabを単眼網膜下に単回注射した後の時間の関数としてプロットしたSD-OCTパラメーターの比較(データ示さず)。ビヒクルを注射したコントロールで推定したパラメーターの来院間変動の限界(変更の99パーセンタイル限界:TRT=14%、IRT=31%、ONL=18%;EZ-RPE10%;n=4)を、ベクターを注射した動物で測定したパラメーターとの比較で記録した。ビヒクルを注射した眼に関する破線は、注射していない眼から推定した限界を表すようにプロットした(変更の99パーセンタイル限界:TRT=7%、IRT=16%、ONL=22%;EZ-RPE19%;n=16)。EZからBrM/RPEまでの距離は、光受容体の外側セグメント(POS)の長さの代替的測定値である。
1e12 GC/眼:
3ヶ月の時点で、注射した領域の網膜全体の厚みは、1匹の動物(C76562)でのベースラインよりも大幅に薄くなった。この群で縦方向に追跡した2匹の動物(C61636は6ヶ月間、C71849は12ヶ月間)は、最終的に網膜の全体的な薄化を示した。内側の網膜は、大抵の場合、通常よりも厚みがあったが、これは重要性には関係なかった。網膜の厚みの全体的な縮小は、ONLの薄化と関連するPOSの不足または縮小を前提にして発生した。4/6の動物では、注射して3ヶ月後に、有意なONL及びPOSの薄化が認められた。3ヶ月目にONLの厚みに変化が認められなかった1匹の動物(C71849)は、追跡調査時に、最終的にONLの薄化を示した。この群でのすべての動物は、すべての時点でのPOSの不足または縮小を表すEZからRPE/BrMまでの距離の短縮を示した。
3ヶ月の時点で、注射した領域の網膜全体の厚みは、1匹の動物(C76562)でのベースラインよりも大幅に薄くなった。この群で縦方向に追跡した2匹の動物(C61636は6ヶ月間、C71849は12ヶ月間)は、最終的に網膜の全体的な薄化を示した。内側の網膜は、大抵の場合、通常よりも厚みがあったが、これは重要性には関係なかった。網膜の厚みの全体的な縮小は、ONLの薄化と関連するPOSの不足または縮小を前提にして発生した。4/6の動物では、注射して3ヶ月後に、有意なONL及びPOSの薄化が認められた。3ヶ月目にONLの厚みに変化が認められなかった1匹の動物(C71849)は、追跡調査時に、最終的にONLの薄化を示した。この群でのすべての動物は、すべての時点でのPOSの不足または縮小を表すEZからRPE/BrMまでの距離の短縮を示した。
1e10 GC/眼:
観察期間中、網膜全体、網膜の内部、及び、網膜の外側の厚みは、大きく変化しなかった。3ヶ月の試験で、5/6匹の動物に、POS不足の範囲(9~30%)があり、これは、注射無しのコントロールとは有意に異なったが、高用量群で認められたものほど重篤ではなかった。追跡調査時に、EZからRPE/BrMでの薄化を示した動物は、正常値にまで回復した(C73946;C75760)。厚みの増大は、持続的な限局的漿液性
剥離(C68587)に関連していた。
観察期間中、網膜全体、網膜の内部、及び、網膜の外側の厚みは、大きく変化しなかった。3ヶ月の試験で、5/6匹の動物に、POS不足の範囲(9~30%)があり、これは、注射無しのコントロールとは有意に異なったが、高用量群で認められたものほど重篤ではなかった。追跡調査時に、EZからRPE/BrMでの薄化を示した動物は、正常値にまで回復した(C73946;C75760)。厚みの増大は、持続的な限局的漿液性
剥離(C68587)に関連していた。
コントロール眼:
初期の時点から、(低用量群で観察した傾向と同様に)網膜内層の厚みと、EZからRPE/BrMまでの距離が大きくなる傾向があったが、いずれのパラメーターでも、12ヶ月では、厚みに有意な変化は無かった。
初期の時点から、(低用量群で観察した傾向と同様に)網膜内層の厚みと、EZからRPE/BrMまでの距離が大きくなる傾向があったが、いずれのパラメーターでも、12ヶ月では、厚みに有意な変化は無かった。
結論
AAV8-抗VEGF Fabは、抗VEGF Fabの長期用量依存的発現をもたらす。NHPでのAAV8抗VEGF Fabの網膜下注射は、低用量群では、注射して最長で12ヶ月後まで、SD-OCT構造パラメーターに大きな変化を招かずに、長期安全性を示し、そして、高用量群の注射の領域内では、全体的な網膜薄化などの顕著な構造変化を伴うことを実証した。NIR-FAF画像化は、RPE脱メラニン化を示唆する実験的注射とビヒクル注射の両方を行ったNHP眼での注射領域内での低自己蛍光を明らかにした。
AAV8-抗VEGF Fabは、抗VEGF Fabの長期用量依存的発現をもたらす。NHPでのAAV8抗VEGF Fabの網膜下注射は、低用量群では、注射して最長で12ヶ月後まで、SD-OCT構造パラメーターに大きな変化を招かずに、長期安全性を示し、そして、高用量群の注射の領域内では、全体的な網膜薄化などの顕著な構造変化を伴うことを実証した。NIR-FAF画像化は、RPE脱メラニン化を示唆する実験的注射とビヒクル注射の両方を行ったNHP眼での注射領域内での低自己蛍光を明らかにした。
本明細書で引用する全ての刊行物は、本明細書の一部を構成するものとして、それらの全内容を援用しており、2018年4月27日に出願された米国特許仮出願第62/663,532号、及び、2018年2月20日に出願された米国特許仮出願第62/632,775号も同様である。同様に、本明細書で記載がされており、かつ、添付した配列表で認められる配列番号を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。本発明を、特定の実施形態を参照して説明してきたが、本発明の趣旨から逸脱せずに、改変し得ることは理解されよう。そのような改変が、添付した特許請求の範囲の範囲内に属するものである、ことを意図している。
さらに別の実施形態では、aVEGFv3の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号19に提示される。VHのORFが配列番号19のnt1842~2210に提示され、CH1が配列番号19のnt2211~2531に提示され、リーダーを含まない重鎖が配列番号19のnt1842~2531の核酸配列を有する。VLのORFが配列番号19のnt2679~2999に提示され、CLが配列番号19のnt3000~3320に提示され、リーダーを含まない軽鎖が配列番号19のnt2679~3320の核酸配列を有する。
Claims (21)
- ヒト対象における網膜下注射に適した液体懸濁液であって、前記懸濁液は、水性液体、及び、AAV8カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を含み、前記rAAVは、前記カプシド内にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが:
(a)AAVの末端逆位配列(ITR);
(b)抗ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)抗原結合抗体フラグメント(Fab)のためのコード配列であって、外来性リーダー配列、免疫グロブリン重鎖、リンカー、及び、外来性リーダー配列を有する免疫グロブリン軽鎖を有し、前記コード配列が、眼内における前記抗VEGF Fabの発現を誘導する制御因子へと作動可能に連結されている、前記コード配列;
(c)前記抗VEGF Fabの前記免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の発現を誘導し、トリベータ-アクチンプロモーター、または、ユビキチンCプロモーターより選択されるプロモーターを含む、制御因子;及び
(d)AAVのITR、を含む、前記液体懸濁液。 - 前記リンカーが、F2Aリンカーである、請求項1に記載の懸濁液。
- 前記異種性リーダー配列が、IL2リーダーである、請求項1または請求項2に記載の懸濁液。
- 前記制御因子が、UTR配列をさらに含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の懸濁液。
- 前記制御因子が、エンハンサー、及び、イントロンをさらに含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の懸濁液。
- 前記制御因子が、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー、CB7プロモーター、及び、トリBアクチンイントロンを含む、請求項5に記載の懸濁液。
- 前記抗VEGF Fab重鎖及び軽鎖の可変領域の前記コード配列が、
(a) aVEGFv3(配列番号24);
(b) aVEGFv2(配列番号3);または
(c) aVEGFv1(配列番号19);
(d) aVEGFv4(配列番号35);
(e) aVEGFv5(配列番号36);
(f) aVEGFv6(配列番号37);
(g) aVEGFv7(配列番号38);
(h) aVEGFv8(配列番号39);
(i) aVEGFv9(配列番号40);
(j) aVEGFv10(配列番号41);
(k) aVEGFv11(配列番号42);
(l) aVEGFv12(配列番号43);または
(m) aVEGFv13(配列番号44)からなる群より選択される、請求項1~6のいずれか1項に記載の懸濁液。 - 前記ベクターゲノムが、
(a) ITR-CB7-CI-aVEGFv3-rBG-ITR(配列番号14);
(b) ITR-CB7-CI-aVEGFv2-rBG-ITR(配列番号3);
(c) ITR-UbC-CI-aVEGFv2-SV40-ITR(配列番号9):
(d) ITR-UbC-PI-aVEGFv3-SV40-ITR(配列番号19);
(e) ITR-UbC-PI-aVEGFv1-SV40-ITR(配列番号24);
(f) ITR-CB7.CI.aVEGFv4.rBG-ITR(配列番号35);
(g) ITR-CB7.CI.aVEGFv5.rBG-ITR(配列番号36);
(h) ITR-CB7.CI.aVEGFv6.rBG-ITR(配列番号37);
(i) ITR-CB7.CI.aVEGFv7.rBG-ITR(配列番号38);
(j) ITR-CB7.CI.aVEGFv8.rBG-ITR(配列番号39);
(k) ITR-CB7.CI.aVEGFv9.rBG-ITR(配列番号40);
(l) ITR-CB7.CI.aVEGFv10.rBG-ITR(配列番号41);
(m) ITR-CB7.CI.aVEGFv11.rBG-ITR(配列番号42);
(n) ITR-CB7.CI.aVEGFv13.rBG-ITR(配列番号43);
(o) ITR-CB7.CI.aVEGFv14.rBG-ITR(配列番号44);
(p) 配列番号45;
(q) 配列番号46;または
(r) 配列番号47
からなる群より選択される、請求項1~7のいずれか1項に記載の懸濁液。 - 前記患者が、滲出型加齢性黄斑変性を有する、請求項1~8のいずれか1項に記載の懸濁液。
- 患者に網膜下投与するための医薬の調製における、請求項1~9のいずれか1項に記載の液体懸濁液の使用。
- 前記患者が、滲出型加齢性黄斑変性を有する、請求項10に記載の使用。
- 滲出型加齢性黄斑変性を有するヒト対象に対して抗VEGF Fabを投与する方法であって、前記方法は、ヒト対象における網膜下注射に適した液体懸濁液で、ヒト対象の網膜に注射することを含み、前記懸濁液は、水性液体、及び、AAV8カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を含み、前記rAAVは、前記カプシド内にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが:
(a)AAVの末端逆位配列(ITR);
(b)抗ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)抗原結合抗体フラグメント(Fab)のためのコード配列であって、外来性リーダー配列、免疫グロブリン重鎖、リンカー、及び、外来性リーダー配列を有する免疫グロブリン軽鎖を有し、前記コード配列が、眼内における前記抗VEGF Fabの発現を誘導する制御因子へと作動可能に連結されている、
前記コード配列;
(c)前記抗VEGF Fabの前記免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の発現を誘導し、トリベータ-アクチンプロモーター、または、ユビキチンCプロモーターより選択されるプロモーターを含む、制御因子;及び
(d)AAVのITR、を含み、
前記懸濁液を、1.6×1011GC/眼(6.2×1011GC/mL)、または、2.5×1011GC/眼(1×1012GC/mL)の用量で注射する、前記方法。 - 前記リンカーが、F2Aリンカーである、請求項12に記載の方法。
- 前記異種性リーダー配列が、IL2リーダーである、請求項12または請求項13に記載の方法。
- 前記制御因子が、UTR配列をさらに含む、請求項12~14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記制御因子が、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー、CB7プロモーター、及び、トリBアクチンイントロンを含む、請求項12~15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗VEGF Fab重鎖及び軽鎖の可変領域の前記コード配列が、
(a) aVEGFv3(配列番号24);
(b) aVEGFv2(配列番号3);または
(c) aVEGFv1(配列番号19);
(d) aVEGFv4(配列番号35);
(e) aVEGFv5(配列番号36);
(f) aVEGFv6(配列番号37);
(g) aVEGFv7(配列番号38);
(h) aVEGFv8(配列番号39);
(i) aVEGFv9(配列番号40);
(j) aVEGFv10(配列番号41);
(k) aVEGFv11(配列番号42);
(l) aVEGFv12(配列番号43);または
(m) aVEGFv13(配列番号44)からなる群より選択される、請求項12~16のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ベクターゲノムが、
(a) ITR-CB7-CI-aVEGFv3-rBG-ITR(配列番号14);
(b) ITR-CB7-CI-aVEGFv2-rBG-ITR(配列番号3);
(c) ITR-UbC-CI-aVEGFv2-SV40-ITR(配列番号9):
(d) ITR-UbC-PI-aVEGFv3-SV40-ITR(配列番号19);
(e) ITR-UbC-PI-aVEGFv1-SV40-ITR(配列番号24);
(f) ITR-CB7.CI.aVEGFv4.rBG-ITR(配列番号35);
(g) ITR-CB7.CI.aVEGFv5.rBG-ITR(配列番号36);
(h) ITR-CB7.CI.aVEGFv6.rBG-ITR(配列番号37)
;
(i) ITR-CB7.CI.aVEGFv7.rBG-ITR(配列番号38);
(j) ITR-CB7.CI.aVEGFv8.rBG-ITR(配列番号39);
(k) ITR-CB7.CI.aVEGFv9.rBG-ITR(配列番号40);
(l) ITR-CB7.CI.aVEGFv10.rBG-ITR(配列番号41);
(m) ITR-CB7.CI.aVEGFv11.rBG-ITR(配列番号42);
(n) ITR-CB7.CI.aVEGFv13.rBG-ITR(配列番号43);
(o) ITR-CB7.CI.aVEGFv14.rBG-ITR(配列番号44);
(p) 配列番号45;
(q) 配列番号46;または
(r) 配列番号47
からなる群より選択される、請求項12~17のいずれか1項に記載の方法。 - 前記rAAVが、約75μL~約150μLの懸濁液の容量で送達される、請求項1~11のいずれか1項に記載の懸濁液、または、請求項12~18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記rAAVが、約100μLの懸濁液の容量で送達される、請求項1~11のいずれか1項に記載の懸濁液、または、請求項12に記載の方法。
- (a)請求項1~11のいずれか1項に記載の懸濁液を含む第1の容器、(b)希釈剤を含む任意の第2の容器、及び、(c)注射のための針、を含む、製品。
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