KR20230018998A - 안구건조증을 치료하는 약물의 제조에서 사이클로스포린 a와 디쿠아포솔나트륨의 병용의 용도 - Google Patents
안구건조증을 치료하는 약물의 제조에서 사이클로스포린 a와 디쿠아포솔나트륨의 병용의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 안구건조증을 치료하는 약물의 제조에서 사이클로스포린A와 디쿠아포솔나트륨의 병용의 용도를 제공하고, 생물 의약 기술 분야에 속한다. 본 발명의 연구에 따르면 안구건조증 치료에 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨을 병용하면, 시너지 효과를 발휘할 수 있으며, 안구건조증 치료 효과는 사이클로스포린 A 또는 디쿠아포솔나트륨을 단독으로 사용하는 것에 비해 현저히 우수하며, 우수한 치료 효과를 가진다. 동시에, 본 발명은 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨을 함유하는 쉘층 나노 물질을 제조하고, 상기 쉘층 나노 물질을 점안으로 투여하여, 안구건조증을 효과적으로 치료할 수 있다. 본 발명은 안구건조증 치료 효과가 우수한 약물을 제공하며, 우수한 응용 전망이 있다.
Description
본 발명은 생물 의약 기술 분야에 속하며, 구체적으로, 안구건조증을 치료하는 약물의 제조에서 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨의 병용의 용도에 관한 것이다.
안구건조증은 안과에서 가장 흔히 볼 수 있는 질병 중 하나로서, 최근 인구 노령화 및 전자단말기 제품의 사용 증가로 인해 발병률이 크게 증가되고 있다. 미국의 국가건강 조사에 따르면, 미국에서만 안구건조증 진단을 받은 성인의 비율은 6.8%(6800만명 이상)이다. 안구건조증 환자의 연간 1인당 치료비용은 783달러로, 미 전역의 위생 건강 체계의 연간 지출액은 38억 달러를 초과하였다. 안구건조증은 안구 표면에서 가장 흔한 만성 질병이므로, 환자의 생활 수준, 정신 건강 및 업무 상태에 장기적인 부정적인 영향을 미친다. 통계에 따르면, 건강한 근로자에 비해 안구건조증 환자의 직장에서의 업무 효율이 약 30% 감소하여, 초과 근무 및 실업이 더 자주 발생하게 된다. 따라서, 환자의 안구 건조증 치료에 주의를 기울이는 것은 안과 의사 및 위생 건강 체계에 있어 특히 중요하다.
사이클로스포린 A는 11개의 아미노산으로 구성된 고리형 폴리펩타이드로 구성되고, 강력한 면역 억제제에 속한다. 임상에서 주로 간, 신장 및 심장 이식의 항거부 반응에 사용되고, 또한 면역 질환을 치료하기 위해 부신 피질 호르몬과 함께 사용될 수도 있다. 또한, 사이클로스포린 A는 눈물샘의 림프구 침윤을 억제함으로써, 염증 반응을 감소시키고, 눈물샘 조직의 흉터화를 억제하여 눈물 분비를 증가시켜, 안구건조증을 효과적으로 치료할 수 있다. 디쿠아포솔나트륨(디쿠아포솔사나트륨이라고도 칭함)은 P2Y2수용체 작용제이며, 결막 상피 및 술잔 세포막 상의 P2Y2수용체에 작용하여, 세포 내의 칼슘 이온 농도를 높여, 수분 및 뮤신의 분비를 촉진시켜, 안구건조증 증상을 개선한다. 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨을 점안액으로 제조하면, 모두 안구건조증을 치료 또는 개선할 수 있다.
사이클로스포린 A 디쿠아포솔나트륨
그러나, 사이클로스포린 A 또는 디쿠아포솔나트륨을 단독으로 사용하여 안구건조증을 치료할 경우 효과가 좋지 않다. 또한, 종래의 수성 제형의 점안액은 안구 표면에서 체류시간이 매우 짧아, 배제율이 높으므로, 생체 이용률을 크게 감소시킬 뿐만 아니라, 동시에 배제된 약물이 비루관 순환계에 흡수되고, 또한 불리한 전신적 부작용도 발생시킬 수 있다. 따라서, 안구 건조증 환자 치료를 위해 지속형 약물을 제공하는 것이 더 유리하다.
본 발명은 안구건조증을 치료하는 약물의 제조에서 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨의 병용의 용도를 제공한다.
추가적으로, 상기 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨의 질량비는 (1~10):(1~10)이다.
추가적으로, 상기 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨의 질량비는 1:1이다.
본 발명은 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨을 원료로 하여 제조되는 안구건조증 치료용 약물 조성물을 추가로 제공한다.
상기 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨의 질량비는 (1~10):(1~10)이다.
추가적으로, 상기 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨의 질량비는 1:1이다.
추가적으로, 상기 약물 조성물은 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨을 유효 성분으로 하여, 약학적으로 허용가능한 보조 물질 또는 보조 성분을 첨가하여 약학적으로 흔히 사용되는 안과용 제제로 제조된다.
추가적으로, 상기 안과용 제제는 점안액, 주사제이다.
추가적으로, 상기 점안액은 쉘층 나노 물질을 함유하고, 상기 쉘층 나노 물질은 3층 구조로 구성되고, 내부층은 유효 성분이고, 중간층은 폴리락트산-글리콜산 공중합체를 외각으로 하고, 최외층은 폴리락트산-글리콜산 공중합체를 감싸는 키토산이다.
추가적으로, 상기 쉘층 나노 물질은 중량배합비로 폴리락트산-글리콜산 공중합체 1~10중량부, 유효 성분 1~20중량부, 키토산 1~10중량부인 원료로 제조된다.
바람직하게는, 상기 쉘층 나노 물질은 중량배합비로 폴리락트산-글리콜산 공중합체 5중량부, 유효 성분 10중량부, 키토산 6중량부인 원료로 제조된다.
바람직하게는, 상기 폴리락트산-글리콜산 공중합체의 분자량은 8000Da이고, 락트산과 글리콜산의 질량비는 75:25이다.
바람직하게는, 상기 쉘층 나노 물질의 제조 방법은,
(1) 폴리락트산-글리콜산 공중합체를 유기 용매에 용해시킨 후, 유효 성분을 첨가하여 수상으로 하는 단계;
(2) 수상을 초음파로 진동시키는 단계;
(3) 키토산 용액을 첨가하여 외부 수상으로 하는 단계;
(4) 초음파 진동 후 정제하여 획득하는 단계를 포함한다.
바람직하게는,
단계(1)에서, 상기 유기 용매는 디클로로메탄이다.
및/또는, 단계(2)에서, 상기 초음파 진동의 전력은 50W이고, 시간은 3~10min이다.
및/또는, 단계(3)에서, 상기 키토산 용액은 키토산 초산 용액이다.
및/또는, 단계(4)에서, 상기 초음파 진동의 전력은 50W이고, 시간은 3~10min이다.
및/또는, 단계(4)에서, 상기 정제는 2%의 이소프로판올 수용액을 첨가하고, 실온에서 유기 용매가 완전히 휘발될 때까지 3시간 교반한 후, 이중 증류수로 세척한다.
바람직하게는,
단계(2)에서, 상기 초음파 진동은 5s 간격으로 켜지고, 5s 간격으로 꺼진다.
및/또는, 단계(3)에서, 상기 키토산 농도는 2%이고; 및/또는, 상기 초산은 농도가 3%인 초산이다.
및/또는, 단계(4)에서, 초음파 진동은 5s 간격으로 켜지고, 5s 간격으로 꺼진다.
본 발명은 질량비에 따라 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨을 칭량하여 혼합하고, 약학적으로 허용가능한 보조 물질 또는 보조 성분을 첨가하여, 획득하는 단계를 포함하는 상기 약물 조성물의 제조 방법을 추가로 제공한다.
본 발명의 연구에 따르면, 안구건조증 치료에 사이클로스포린 A 와 디쿠아포솔나트륨을 병용하면, 시너지 효과를 발휘할 수 있으며, 안구건조증 치료 효과는 사이클로스포린 A 또는 디쿠아포솔나트륨을 단독으로 사용하는 것에 비해 현저히 우수하며, 우수한 치료 효과를 가진다. 동시에, 본 발명은 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨을 함유하는 쉘층 나노 물질을 제조하고, 상기 쉘층 나노 물질을 점안으로 투여하여, 안구건조증을 효과적으로 치료할 수 있다. 본 발명은 안구건조증 치료 효과가 우수한 약물을 제공하며, 우수한 응용 전망이 있다.
자명한 것은, 본 발명의 상기 내용에 따라, 해당 분야의 일반 지식 및 관용 수단에 따라, 본 발명의 기본 기술 사상을 벗어나지 않으면서, 추가로 다양한 형태의 수정, 대체 또는 변경을 진행할 수 있다.
이하, 실시예 형태의 구체적인 실시방식을 통해, 본 발명의 상기 내용에 대해 다시 더욱 상세히 설명한다. 다만, 본 발명의 상기 주제의 범위가 하기 예시에만 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 상기 내용에 의해 구현되는 기술은 모두 본 발명의 범위에 속한다.
도 1은 CysA-Diqua@PLGA@CS의 입경 분포도이다.
본 발명의 구체적인 실시방식에서 사용되는 원료, 장치는 모두 공지된 제품이며, 시중에서 구할 수 있는 제품이다.
본 발명의 쉘층 나노 물질은 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)로 나노 미립자 외각을 구성하여, 두 가지 소분자 안구 건조증 치료 약물인 사이클로스포린 A(CysA) 및 디쿠아포솔나트륨(Diquafosol, Diqua로 약칭)를 감싸고, PLGA 외각은 키토산(CS) 분자가 코팅된다.
실시예1. 본 발명의 쉘층 나노 물질의 제조
구체적인 제조 방법은 아래와 같다:
a) 50mg의 PLGA(75:25, 8000Da)을 2ml의 CH2Cl2에 충분히 용해시켜, PLGA용액을 얻는다.
b) 50mg의 CsyA 및 50mg의 Diqua를 함유한 100μl의 수용액을 PLGA용액에 첨가하여 내부 수상으로 한다.
c) 내부 수상을 초음파로 진동시키되, 전력은 50W이고, 시간은 3min이다(5s 간격으로 켜지고, 5s 간격으로 꺼진다).
d) 단계 c)의 초음파 후의 체계에 외부 수상을 첨가하고, 외부 수상은 농도가 4%(w/v)인 3ml의 폴리비닐알코올 수용액(4g의 PVA가 100ml의 수용액에 용해됨) 및 농도가 2%(w/v)인 3ml의 키토산 초산 용액(농도가 3%인 초산)이고, 다시 초음파로 진동(전력 50W, 시간 3min, 5s 간격으로 켜지고, 5s 간격으로 꺼짐)시켜, CysA-Diquafosol@PLGA@CS(CysA-Diqua@PLGA@CS)나노 입자를 형성한다.
e) 마지막으로 체계에 10ml의 2% 이소프로판올 수용액을 첨가하고, 실온에서 유기 용매가 완전히 휘발될 때까지 3시간 동안 교반시킨다.
f) 나노 입자를 이중 증류수로 3회 세척하여, 본 발명의 쉘층 나노 물질인 CysA-Diqua@PLGA@CS을 얻는다.
획득한 CysA-Diqua@PLGA@CS의 입경 분포는 도 1에 도시한 바와 같다. 측정 결과, CysA-Diqua@PLGA@CS의 입경은 299.47±5.57 nm이고, ζ전위는 30.71±3.08 mV이다.
비교예1, 사이클로스포린 A만 함유하는 쉘층 나노 물질의 제조
구체적인 제조 방법은 아래와 같다:
a) 50mg의 PLGA(75:25, 8000Da)을 2ml의 CH2Cl2에 충분히 용해시켜, PLGA용액을 얻는다.
b) 50mg의 CsyA 를 함유한 100μl의 수용액을 PLGA용액에 첨가하여 내부 수상으로 한다.
c) 내부 수상을 초음파로 진동시키되, 전력은 50W이고, 시간은 3min이다(5s 간격으로 켜지고, 5s 간격으로 꺼진다).
d) 단계 c)의 초음파 후의 체계에 외부 수상을 첨가하고, 외부 수상은 농도가 4%(w/v)인 3ml의 폴리비닐알코올 수용액(4g의 PVA가 100ml의 수용액에 용해됨) 및 농도가 2%(w/v)인 3ml의 키토산 초산 용액(농도가 3%인 초산)이고, 다시 초음파로 진동(전력 50W, 시간 3min, 5s 간격으로 켜지고, 5s 간격으로 꺼짐)시켜, CysA@PLGA@CS 나노 입자를 형성한다.
e) 마지막으로 체계에 10ml의 2% 이소프로판올 수용액을 첨가하고, 실온에서 유기 용매가 완전히 휘발될 때까지 3시간 동안 교반시킨다.
f) 나노 입자를 이중 증류수로 3회 세척하여, 사이클로스포린 A만 함유하는 쉘층 나노 물질인 CysA@PLGA@CS을 얻는다.
비교예 2, 디쿠아포솔나트륨만 함유하는 쉘층 나노 물질의 제조
구체적인 제조 방법은 아래와 같다:
a) 50mg의 PLGA(75:25, 8000Da)을 2ml의 CH2Cl2에 충분히 용해시켜, PLGA용액을 얻는다;
b) 50mg의 Diqua를 함유한 100μl의 수용액을 PLGA용액에 첨가하여 내부 수상으로 한다.
c) 내부 수상을 초음파로 진동시키되, 전력은 50W이고, 시간은 3min이다(5s 간격으로 켜지고, 5s 간격으로 꺼진다).
d) 단계 c)의 초음파 후의 체계에 외부 수상을 첨가하고, 외부 수상은 농도가 4%(w/v)인 3ml의 폴리비닐알코올 수용액(4g의 PVA가 100ml의 수용액에 용해됨) 및 농도가 2%(w/v)인 3ml의 키토산 초산 용액(농도가 3%인 초산)이고, 다시 초음파로 진동(전력 50W, 시간 3min, 5s 간격으로 켜지고, 5s 간격으로 꺼짐)시켜, Diqua@PLGA@CS 나노 입자를 형성한다.
e) 마지막으로 체계에10ml의 2% 이소프로판올 수용액 을 첨가하고, 실온에서 유기 용매가 완전히 휘발될 때까지 3시간 동안 교반시킨다.
f) 나노 입자를 이중 증류수로 3회 세척하여, 디쿠아포솔나트륨만 함유한 쉘층 나노 물질인 Diqua@PLGA@CS을 얻는다.
이하, 구체적인 실험예를 통해 본 발명의 유익한 효과를 증명한다.
실험예 1, 본 발명의 쉘층 나노 물질 재료의 안구건조 치료 효과에 대한 연구
1. 연구 방법
1.1 연구 동물
종속: C57BL/6마우스;
등급: 보통급;
구매할 동물의 수와 성별: 25마리의 암컷 마우스;
연령: 8주;
체중: 구매 시 및 모델링 시 마우스는 15-25g이고, 체중의 개별 값은 평균 ±20% 범위 내임;
구매상: SPF BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.;
사육장: Chengdu Huaxi Haiqi Pharmaceutical Technology Co., Ltd의 일반 동물 집 중간 단지(제1동)(실험 동물 사용 허가증 번호: SYXK(천)2013-123);
케이지 종류: 일반 마우스 케이지;
케이지 밀집도: 5마리/케이지;
사육 환경 조건 기준: 중국국가기준 GB14925-2010;
사육 환경 제어 시스템: Honeywell사의 EBI400 자동 제어의 전신풍(all fresh air) 중앙 에어컨 시스템;
온도: 실온 16~26℃(일간 온도 차이≤4℃);
습도: 상대습도 40~70%;
조명: 인공 조명, 12/12시간 주야간 명암 교대
사료 종류: 마우스 성장 및 번식 사료(베이징 커아오 시에리 사료 유한공사. 사료 생산 허가증: 경사증(2014)06054);
사료 투여 방법: 자유 섭취
1.2 동물 그룹화
군별 설계: 대조군 5마리(1F001-1F005), 모델링군 5마리(2F001-2F005), CysA@PLGA@CS군 5마리(3F001-3F005), Diqua@PLGA@CS군 5마리(4F001-4F005), CysA-Diqua@PLGA@CS군 5마리(5F001-5F005).
그룹화 방법: 랜덤 그룹화
1.3 모델링 방법
1) 0.3%BAC 용액 점안
모델링 동물: 모델링군, CysA@PLGA@CS군, Diqua@PLGA@CS군 및 CysA-Diqua@PLGA@CS군의 모든 동물;
모델링 방식: 5μl 의 0.3% BAC용액을 마우스의 안구 표면에 떨어뜨린다.
모델링 빈도: 3회/일(오전 9:30, 오후 13:30, 오후 17:00)
모델링 시간: D1-D7(모델링 1일차를 D1로 표기하고, 총 7일을 모델링함)
시약: BAC(염화벤잘코늄)은 Sigma-Aldrich에서 구입함, 물건 번호 63449-41-2, PBS용액을 이용하여 0.3%의 최종 농도로 희석함.
2) 스코폴라민을 피하 주사
모델링 동물: 모델링군, CysA@PLGA@CS군, Diqua@PLGA@CS군 및 CysA-Diqua@PLGA@CS군의 모든 동물;
모델링 방식: 0.5mg의 스코폴라민을 함유하는 0.2ml의 용액을 마우스의 목에 피하 주사한다.
모델링 빈도: 3회/일(오전 9:30, 오후 13:30, 오후 17:00), 1)에 따라 0.3% BAC를 사용하여 점안할 대 동시에 스코폴라민을 투여한다.
모델링 시간: D1-D7(모델링 1일차를 D1로 표기하고, 총 7일을 모델링함).
시약: 스콜라민 하이드로브로마이드는 청두 이루이 생물 과학기술 유한공사, 물건 번호 114-49-8, PBS용액을 이용하여 0.25%의 최종 농도로 희석함.
3) 송풍으로 공기 유동을 증가
모델링 동물: 모델링군, CysA@PLGA@CS군, Diqua@PLGA@CS군 및 CysA-Diqua@PLGA@CS군의 모든 동물;
모델링 방식: 케이지 내에 소형 팬을 설치하고, 송풍 각도는 수평면과의 협각이 0°되도록 고정하고, 측정 풍속은 0.76-0.84m/s이다.
모델링 시간: D1-D7(모델링 1일차를 D1로 표기하고, 총 7일을 모델링함).
1) 0.3%의 BAC용액으로 점안, 2) 스코폴라민의 피하 주사 및 3) 송풍으로 공기 유동을 증가시키는 것을 동시에 진행한다.
1.4 투약 방법
투약 방법: 5μl의 약물(실시예1 및 비교문헌1-2에서 제조된 CysA-Diqua@PLGA@CS, CysA@PLGA@CS 및 Diqua@PLGA@CS) 용액을 마우스의 안구 표면에 떨어뜨리며, 약물 유출을 방지하고, 각 군의 투여 약물은 표1과 같다:
투약 빈도: 3회/일(오전 9:30, 오후 13:30, 오후 17:00);
투약 시간: D8-D17(실험 8일차 - 17일차, D8은 모델링 후의 첫날)
[표 1] 각 군별 투약표
1.5 페놀 레드 면사 눈물 검사
검사 시간: 모델링 전, D7, D12, D17;
검사 방법: 마우스를 0.6%의 펜토바르비탈 나트륨으로 마취한 후, 페놀 레드 면사(Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd)를 사용하여 눈물을 검사하고, 페놀 레드 면사를 마우스의 눈꼬리 부분에 삽입하고, 검사 과정에서 마우스 각막에 닿지 않도록 하고, 60초 후 페놀 레드 면사를 제거하고, 젖은 면사의 전체 길이를 측정한다.
1.6 각막환 불규칙성(corneal irregularity test)
검사 시간: 모델링 전, D7, D12, D17;
검사 방법: Kim등이 설명한 방법(Kim CE, Kim YJ, Hwang MW, et al. Cevimeline-induced anti-inflammatory effect through upregulations of mucins in the ocular surface of a dry eye mouse model[J]. Biomed Pharmacother, 2021, 139: 111571. doi: 10.1016/j.biopha.2021.111571)을 참조하여, 마우스를 마취시킨 후 마우스 각막 중앙에 백색 고리를 투사하여, 고리의 변형 정도를 관찰한다. 평가 기준은 다음과 같다: 0-변형 없음, 1-변형은 1상한(quadrant)으로 한정됨, 2-변형은 2상한으로 한정됨; 3-변형은 3상한으로 한정됨; 4-변형은 4상한으로 한정됨; 5-현저한 변형으로 인해 전체 고리 형상을 식별할 수 없음.
1.7 각막 플루오레세인 나트륨 염색 및 평점
검사 시간: 모델링 전, D7, D12, D17;
검사 방법: 0.6%의 펜토바르비탈 나트륨으로 마우스를 마취시킨 후, 0.2%의 플루오레세인 나트륨 용액 1 μl를 안구 표면에 적가하고, 눈꺼풀을 가볍게 3회 깜빡이고, 청색 코발트 램프 아래에서 각막 형광 염색 상황을 관찰한다. 평점은 중국 안구건조증 진단 및 치료 규범 전문가 의견(2013년판)의 12분법을 참조하여 각막 형광 염색에 대해 평점 하였다(중화의학회 안과학분회 각막 병학그룹, 안구 건조 임상 진단 및 치료 전문가 의견(2013년)[J]. 중국 안과 잡지, 2013, 49(01):73-75. Doi: 10.3760/cma.j.issn.0412-0481.2013.020). 평점 기준은 다음과 같다: 각막을 수평 및 수직 십자형에 따라 4상한으로 나누고, 각 상한의 염색을 각각 평점하여 합산하고, 0-염색 없음, 1-작은 점 모양의 염색, 각 상한<30개 염색점; 2-큰 점 모양의 염색 또는 작은 점 모양의 염색≥각 상한 30개 염색점; 3-염색이 판상 또는 선상으로 융합됨
1.8 TBUT
검사 시간: 모델링 전, D7, D12, D17;
검사 방법: 0.6%의 펜토바르비탈 나트륨으로 마우스를 마취시킨 후, 0.2%의 플루오레세인 나트륨 용액 1 μl를 안구 표면에 적가하고, 눈꺼풀을 가볍게 3회 깜빡이고, 청색 코발트 램프 아래에서 눈물막을 관찰한다. 스톱워치로 마지막 인위적 눈 깜빡임부터 첫번째 눈물막 파열점을 발견하기까지의 시간을 측정하여 눈물막 파열 시간으로 한다.
1.9 결막 조직TNF-α의 상대적 발현량 검사
검사 시간: D18;
검사 방법: 실험 마지막에 CO2로 마우스를 안락사시킨 후 각 군의 마우스의 왼쪽 안구 결막을 분리하고, 안구 결막을 냉동 바이알에 넣고 액체 질소를 신속하게 넣어, 냉동 보관하고, -80℃ 냉장고로 옮겨 테스트할 때까지 보관한다. qRT-PCR검사 매개변수는 다음과 같다:
1. mRNA 추출
솔레이보에서 생산한 전체 RNA 추출 키트를 사용하여, 사용 설명서에 따라 실험 조작을 진행하였다.
샘플 처리:
동물 조직: 조직 100mg을 취하여 1ml의 용균액을 첨가하고, 전동 균질기로 균질화하였다.
처리 후의 샘플을 5min동안 빙욕하고, 0.2ml의 클로로포름을 첨가하고, 15s 동안 격렬하게 진탕시키고, 5min 동안 빙욕한다.
4℃/12000g에서 10min 동안 원심 분리하고, 상층의 수성상을 흡입하여 새로운 관에 옮긴다. 컬럼세척액 500 μL를 흡착 컬럼에 넣고, 5min 동안 방치하고, 4℃/12000g에서 2min 동안 원심 분리하여, 준비한다.
수집된 상청액에 무수 에탄올 200 μL를 첨가하고 균일하게 혼합한 후, 흡착 컬럼에 넣고 2min 동안 방치하고, 4℃/12000g에서 2min 동안 원심 분리하여, 폐액을 버린다.
흡착 컬럼에 600μL의 린스 액체를 첨가하고, 4℃/12000g에서 2min 동안 원심 분리하여, 폐액을 버린다. 1회 반복한다. 4℃/12000g에서 2min 동안 원심 분리하여, 수집 튜브를 버리고, 몇 분 동안 방치한다.
흡착 컬럼을 새로운 튜브에 넣고, 50μL의 RNase free ddH2O를 멤브레인 중앙에 적가하고, 5min 동안 방치하고, 4℃/12000g에서 2min 동안 원심 분리하여, RNA를 얻었다.
2. 역전사
TIANGEN에서 생산한 Fasting cDNA 제1 체인 합성 키트를 사용하고, 키트 설명서에 따라 아래와 같이 작업한다:
DNA 제거 반응 체계(표2), 균일하게 혼합한 후, 42℃에서 3min동안 배양한 후, 얼음 위에 놓는다.
[표 2] DNA제거 반응 체계
역전사 체계(표3), 균일하게 혼합한 후, 42℃에서 15min 동안 배양한다. 95℃에서 3min 동안 배양한 후, 얼음 위에 놓는다.
[표 3] 역전사 체계
3.RT-PCR반응 체계
키트 설명서에 따르면, 작업은 아래와 같다:
qPCR반응 체계(표 4):
[표 4] qPCR반응 체계
프라이머 서열(표 5):
[표 5] 프라이머 서열
반응 조건:
제1 단계: 95℃, 15min;
제2 단계: 95℃, 10s;
제3 단계: 55℃, 20s;
제4 단계: 72℃, 30s;
제2단계, 제3단계, 제4단계는 40회 순환된다.
1.10 통계
모든 데이터는 SPSS 23.0소프트웨어를 이용하여 통계 분석을 진행하고, 정규 분포에 부합하는 연속 데이터(페놀 레드 면사 눈물, TBUT)에 대해 평균수±표준편차()로 표시하고, 여러 그룹 간의 비교는 일원 ANOVA를 사용하고, LSD방법을 이용하여 두 그룹을 비교하였다. 레벨 데이터(각막환 불규칙성, 각막 형광 염색 평점) 및 비정규 분포의 데이터는 중앙값(25%분위수, 75%분위수)으로 표시하고, 여러 그룹 간의 비교는 Kruskal-Wallis 1-way ANOVA검사를 이용하여, 두 그룹씩 비교하였다. 검사 수준 α=0.05.
2. 결과
2.1 페놀 레드 면사 눈물 검사
페놀 레드 면사 눈물 검사 결과는 표 6에 나타냈다. 모델링 후(D7) 각 군의 눈물 분비는 대조군에 비해 현저하게 낮다. 치료 5일차(D12)에, Diqua@PLGA@CS군 및 CysA-Diqua@PLGA@CS군의 눈물 분비는 대조군 수준으로 회복하였다(P=0.763 및0.498). 치료 10일차(D17), CysA@PLGA@CS군의 눈물 분비는 대조군 수준(P=1.000)으로 회복하였고, 모델링군(P=0.052)보다 높았다; Diqua@PLGA@CS군 및 CysA-Diqua@PLGA@CS군 눈물 분비는 모델링군보다 현저하게 높았다(P<0.001 및 P=0.002).
[표 6] 페놀 레드 면사 눈물 검사 결과
(페놀 레드 면사의 젖은 면실의 전체 길이, mm)
주: 표에서 F값, P값은 여러 그룹 간의 분산 분석 비교의 통계량 및 P값이고; 각 군과 대조군을 비교하면, a P<0.05 이고, 각 군과 모델링군을 비교하면, b P<0.05 이다.
페놀 레드 면사 눈물 검사 결과에 의하면, Diqua@PLGA@CS과 효과가 동일하고, CysA-Diqua@PLGA@CS는 눈물 분비 양을 현저하게 증가시킬 수 있고, CysA@PLGA@CS에 비해 눈물 분비량 증가 효과는 훨씬 우수하다.
2.2 각막환 불규칙성
각막환 불규칙성 검사 결과는 표7에 나타냈다. 모델링 7일차(D7), 각 모델링군의 각막환 불규칙성은 현저하게 증가하였다.
투약 5일차(D12), Diqua@PLGA@CS군의 각막 불규칙성은 모델링군에 비해 현저하게 낮았고(P=0.027), 기타 두 투약군의 각막 불규칙성은 모델링군과 현저한 차이가 없었다. 투약 17일차, CysA-Diqua@PLGA@CS군의 각막 불규칙성은 모델링군(P=0.044)보다 현저히 낮았고, 기타 두 투약군의 각막 불규칙성은 모델링군과 현저한 차이가 없었다.
[표 7] 각막환 불규칙성 검사 결과
주: 표에서 χ2값, P값은 여러 그룹 간의 Kruskal-Wallis 1-way ANOVA검출 결과이고; 표에서 M은 중앙값, P1은 25번째 분위수이고, P3은 75번째 분위수이고, 각 군과 대조군을 비교하면, a P<0.05 이고, 각 군과 모델링군을 비교하면, b P<0.05 이다.
각막환 불규칙성 결과에 의하면, CysA@PLGA@CS 및 Diqua@PLGA@CS에 비해, CysA-Diqua@PLGA@CS는 안구건조 모델링으로 인한 각막 표면 불규칙성 변화를 더 잘 회복할 수 있으며, 치료 효과가 더 좋다.
2.3 각막 플루오레세인 나트륨 염색 및 평점
각막 플루오레세인 나트륨 염색 평점 결과는 표8에 나타냈다. 모델링 후 7일차(D7), 각 모델링군의 각막상피가 현저하게 손상되었고, 각막에 중심궤양이 나타났고, 명백한 형광 염색이 나타났다. 투약 후 각 투약군의 각막 손상이 점차 회복되었고, 형광 염색이 점차 감소하였다. 투약 10일차(D17), CysA-Diqua@PLGA@CS군의 각막 형광 염색 평점은 모델링군보다 현저하게 낮았고(P=0.020), 기타 투약군의 각막 형광 염색 평점은 모델링군과 현저한 차이가 없었다.
[표 8] 각막 플루오레세인 나트륨 염색 평점 결과
주: 표에서 χ2값, P값은 여러 그룹 간의 Kruskal-Wallis 1-way ANOVA검사 결과이고; 표에서 M은 중앙값, P1은 25번째 분위수이고, P3은 75번째 분위수이고, 각 군과 대조군을 비교하면, a P<0.05 이고, 각 군과 모델링군을 비교하면, b P<0.05 이다.
각막 플루오레세인 나트륨 염색 평점 결과에 의하면, CysA@PLGA@CS 및 Diqua@PLGA@CS에 비해, CysA-Diqua@PLGA@CS 치료는 안구건조 모델링으로 인한 안구 표면 손상을 더 현저하게 개선할 수 있고, 각막상피 손상 회복을 촉진시킨다.
2.4 TBUT
TBUT(눈물막 파열 시간) 검사 결과는 표9에 나타냈다. 모델링 후 7일차(D7), 각 모델링군의 눈물막 파열 시간은 현저히 단축되었다. 이후 각 투약군의 TBUT는 점차 회복되었다. 투약 후 5일차(D12), CysA-Diqua@PLGA@CS군의 TBUT는 모델링군 및 CysA@PLGA@CS보다 현저히 높았다(P=0.012 및0.027). 투약 후 10일차, CysA-Diqua@PLGA@CS군의 TBUT는 모델링군 및 CysA@PLGA@CS군보다 현저히 높았고(P<0.001 및 0.005), Diqua@PLGA@CS군의 TBUT는 모델링군보다 현저히 높았지만(P=0.010), CysA@PLGA@CS군과의 차이는 현저하지 않았다(P=0.288).
[표 9] TBUT 측정 결과(눈물막 파열시간, 초)
주: 표에서 F값, P값은 여러 그룹 간의 분산 분석 비교의 통계량 및 P값이고; 각 군과 대조군을 비교하면, a P<0.05 이고, 각 군과 모델링군을 비교하면, b P<0.05 이고, 치료군과 CysA@PLGA@CS군을 비교하면, c P<0.05 이다.
TBUT 결과에 의하면, CysA-Diqua@PLGA@CS치료는 모델링으로 인한 눈물막 파열 시간을 현저히 단축하였고, 눈물막의 안정성을 개선하였으며, 또한 효과는 Diqua@PLGA@CS보다 우수하고, CysA@PLGA@CS보다 훨씬 우수하다.
2.5 결막 조직TNF-α의 발현량
마우스 결막 조직TNF-α의 qRT-PCR검사 결과는 표10에 나타냈다. 해부 시(D18), 모델링군, CysA@PLGA@CS군 및 Diqua@PLGA@CS군의 결막 조직TNF-α의 발현 수준은 대조군에 비해 현저히 높았으나(P<0.001, =0.021 및 0.004), CysA-Diqua@PLGA@CS군의 결막 조직TNF-α의 발현 수준은 대조군과 비교하면 차이가 현저하지 않았다(P=0.122).
[표 10] 결막 조직 TNF-α의 상대적 발현량
주: 표에서 χ2값, P값은 여러 그룹 간의 Kruskal-Wallis 1-way ANOVA검사 결과이고; 표에서 M은 중앙값이고, P1은 25번째 분위수이고, P3은 75번째 분위수이고, 각 군과 대조군을 비교하면, a P<0.05 이고, 각 군과 모델링군을 비교하면, b P<0.05 이다.
결막 조직 TNF-α의 발현량 결과에 의하면, sA-Diqua@PLGA@CS로 10일 치료하면 안구건조 모델링으로 인한 안구 표면 염증의 활성화가 현저히 감소되었고, CysA@PLGA@CS 및 Diqua@PLGA@CS에 비해 안구 표면 염증 억제 효과가 더 현저하다.
상기 결과에 의하면, 본 발명의 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨을 유효 성분으로 병용하여 제조된 쉘층 나노 물질의 안구건조증 치료 효과는 사이클로스포린 A 또는 디쿠아포솔나트륨을 유효 성분으로 단독 사용하여 제조된 쉘층 나노 물질에 비해 현저히 우수하다. 이는 사이클로스포린 A 및 디쿠아포솔나트륨을 병용하여 안구건조증을 치료하면, 시너지 효과를 발휘할 수 있음을 보여준다.
종합하자면, 본 발명의 연구에 따르면 안구건조증 치료에 사이클로스포린 A 와 디쿠아포솔나트륨을 병용하면, 시너지 효과를 발휘할 수 있으며, 안구건조증 치료 효과는 사이클로스포린 A 또는 디쿠아포솔나트륨을 단독으로 사용하는 것에 비해 현저히 우수하며, 우수한 치료 효과를 가진다. 동시에, 본 발명은 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨을 함유하는 쉘층 나노 물질을 제조하고, 상기 쉘층 나노 물질을 점안으로 투여하여, 안구건조증을 효과적으로 치료할 수 있다. 본 발명은 안구건조증 치료 효과가 우수한 약물을 제공하며, 우수한 응용 전망이 있다.
Claims (10)
- 안구건조증을 치료하는 약물의 제조에서 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨의 병용의 용도.
- 제1항에 있어서,
상기 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨의 질량비는 (1~10):(1~10)인, 안구건조증을 치료하는 약물의 제조에서 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨의 병용의 용도. - 제2항에 있어서,
상기 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨의 질량비는 1:1인, 안구건조증을 치료하는 약물의 제조에서 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨의 병용의 용도. - 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨을 원료로 하여 제조되고,
상기 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨의 질량비는 (1~10):(1~10)인, 안구건조증 치료용 약물 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨의 질량비는 1:1인, 안구건조증 치료용 약물 조성물. - 제4항 또는 제5항에 있어서,
사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨을 유효 성분으로 하고, 약학적으로 허용가능한 보조 물질 또는 보조 성분을 첨가하여 약학적으로 흔히 사용되는 안과용 제제로 제조되는, 안구건조증 치료용 약물 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 안과용 제제는 점안액, 주사제인, 안구건조증 치료용 약물 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 점안액은 쉘층 나노 물질을 함유하고, 상기 쉘층 나노 물질은 3층 구조로 구성되고, 내부층은 유효 성분이고, 중간층은 폴리락트산-글리콜산 공중합체를 외각으로 하고, 최외층은 폴리락트산-글리콜산 공중합체를 감싸는 키토산인, 안구건조증 치료용 약물 조성물. - 제8항에 있어서,
상기 쉘층 나노 물질은 중량배합비로 폴리락트산-글리콜산 공중합체 1~10 중량부, 유효 성분 1~20 중량부, 키토산 1~10 중량부인 원료로 제조되고,
바람직하게는, 상기 폴리락트산-글리콜산 공중합체의 분자량은 8000Da이고, 락트산과 글리콜산의 질량비는 75:25인, 안구건조증 치료용 약물 조성물. - 질량비에 따라 사이클로스포린 A와 디쿠아포솔나트륨을 칭량하여 혼합하고, 약학적으로 허용가능한 보조 물질 또는 보조 성분을 첨가하여, 획득하는 단계를 포함하는, 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 안구건조증 치료용 약물 조성물의 제조 방법.
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