KR20230016306A - 굴 패각 세척용 미생물을 이용한 굴패각 세척방법 및 화장료조성물 - Google Patents
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Abstract
알굴이 분리되어 야전된 굴 패각을 굴 패각 1차 처리장치에 투입하여 교반에 의해 패각 표면의 이물질을 물리적인 방법으로 제거하는 굴 패각 1차 처리단계(가); 상기 (가)단계를 거친 굴 패각을 발효수가 저장된 발효조에 침지하여 일정 온도 및 기간동안 발효하는 발효수 침지단계(나); 상기 (나)단계를 거친 굴 패각을 발효조에서 분리하고 굴 패각 표면의 발효수의 세척 및 건조한 후 김 종자 이식장에 공급하는 김 종자 이식 생산장 공급 단계(다)로 이루어진 굴패각 세척 조성물을 유효성분으로 하는 굴패각 세척방법을 제공함으로써, 기존의 물리적인 방법으로 굴 패각을 세척하는 방법에 비하여 단시간에 완전한 세척이 가능하여, 세척 후에도 김 종자 이식 생산장에 즉시 사용이 가능한 효과가 있다.
Description
본 발명은 알굴을 분리하고 버려진 굴 패각에 부착되어 심한 악취를 유발시키는 패각 부착 이물질을 물리적인 세척과 생물학적 세척방법으로 보다 완벽하게 제거할 수 있는 굴패각 세척용 미생물 및 이를 이용한 굴패각 세척방법에 관한 것이다.
양식된 글개체에서 알굴을 분리하고 버려진 굴 패각은 김양식에서 패각사상체 배양 및 인공채묘용으로 사용된다. 우리나라에서 김양식은 기록상으로도 500여년의 오랜 역사를 가지고 있으며, 양식 기술 개발에 관한 연구는 70여년 전부터 시작되었다. 1970년대를 기점으로 하여 이전까지는 주로 자연 채묘에 의한 지주식 양식이 이루어져 왔으나, 이후 일본에서 선발 육종된 다수확 품종인 큰참김과 큰방사무늬김이 도입되면서 패각사상체 배양 및 인공채묘 기술 보급, 죽홍에서 망홍으로의 대체, 뜬흘림발에 의한 외연어장의 개발, 김 전자동 처리 시설의 증가 등으로 김양식은 비약적인 발전을 거듭하였다.
김양식은 자연채묘에서 인공채묘로 전화된 이후 우수 종묘의 정기, 적량 생산에 좌우되었다. 김의 종묘 생산이란 조가비 사상체의 배양과 관리 과정을 지칭한다. 조가비 사상체 배양 방법에는 두가지가 있다. 김의 엽상체에서 방출되는 과포자를 직접 조가비 속에 잠입시켜 기르는 방법과 과포자의 발아체를 일정 기간 동안 배양 용기에서 길러 유리 사상체를 이용하는 방법이다. 종래에는 후자의 방법을 주로 이용한다.
김 유리 사상체 배양 단계는 색택이 우수하며 병해 증상이 없는 우량 엽체를 선발하고 과포자를 받는다. 이후, 유리 사상체를 배양하여 증식 시키고, 굴 패각이 증식된 유리 사상체를 이식시킨다. 이때, 유리사상체를 이식할 굴 패각은 패각근이 붙어있지 않은 것으로 사용하는 것이 적절한데, 세척되지 않아 패각근이 붙어있는 굴의 패각은 배양 해수의 오염이 쉽게 되어 과포자의 병해 발생의 원인이 되기 때문이다.
국내 굴 수하식 양식장에서는 연간 약 28만여톤의 굴 패각이 가공 부산물로 양산되고 있고 이 중 약 18만톤은 채묘기, 패화석 비료 등으로 재활용되고 있으나 나머지의 약 10만여톤이 미처리된 굴 패각은 양식장 또는 가공시설 주변에 방치되고 있어 많은 환경, 위생문제의 원인이 된다.
특히, 굴 패각에 부착된 코팅사 제거, 굴패각에 부착된 해양생물 제거 및 굴 패각 염분 제거 등 굴패각에 섞여있는 이물질 제거 과정은 종래에는 수세미 등으로 세척을 실시하는 등의 수작업으로 실시되었고 이러한 수작업은 많은 인력과 시간이 소요되었다.
이에 국내 공개실용신안공보 실1998-015197호 및 제20-0306721호에는 세척통에 패각과 물을 투입하여 세척통 내부에서 회전하면서 단시간에 많은 양을 자동으로 세척할 수 있는 발명이 고안되어 있으나 상기 선행문헌은 물리적인 세척방법으로 1차적인 이물질 제거만 가능한 문제점이 있다.
특히, 패각은 바다에서 서식하는 형태가 서로 엉켜서 군락생활을 하여 여러 개체가 덩어리를 이루고 있기 때문에 물리적인 세척 방법만으로 완벽하게 이물질을 제거하기는 시간과 노동 소모가 크기 때문에 굴 패각에 부착되어 심한 악취를 유발시키는 부착 이물질 및 유해세균을 보다 완벽하게 제거할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
본 발명은 패각은 바다에서 서식하는 형태가 서로 엉켜서 군락 생활하여 여러 개체가 덩어리를 이루고 있어 물리적인 세척 방법만으로는 굴패각의 표면에 붙은 이물질을 완벽하게 제거하는데, 많은 시간과 노동력이 소모된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 물리적 및 생물학적 세척방법으로 처리함으로서 굴 패각에 부착된 부착 이물질을 보다 완벽하게 제거할 수 있도록한 굴패각 세척 조성물 및 이를 유효성분으로 하는 굴패각 세척방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 굴 패각 이물질의 세척 및 분해능을 갖는 미생물로서 슈도모나스 린인젠시스(Pseudomonas linyingensis), 슈도모나스 후미(Pseudomonas humi), 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis), 커비박터 델리케터스(Curvibacter delicatus), 및 엑시도보락스 디라필디(Acidovorax delafieldii)로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상을 사용하는 방법일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 굴패각 세척 조성물을 유효성분으로 하는 굴패각 세척방법은 알굴이 분리되어 야적된 굴 패각을 굴 패각 1차 처리장치에 투입하여 교반에 의해 패각 표면의 이물질을 물리적인 방법으로 제거하는 굴 패각 1차 처리단계(가); 상기 (가)단계를 거친 굴 패각을 발효수가 저장된 발효조에 침지하여 일정 온도 및 기간 동안 발효하는 발효수 침지단계(나); 상기 (나)단계를 거친 굴 패각을 발효조에서 분리하고 굴 패각 표면의 발효수의 세척 및 건조한 후, 김 종자 이식장에 공급하는 김 종자 이식 생산장 공급 단계(다)로 이루어진 것일 수 있다.
상기 발효조는 30~35℃의 온도를 유지하고 지속적으로 산소를 주입하여 호기 상태로 24시간 동안 침지가 이루어지는 것일 수 있다. 또한, 상기 발효수에는 슈도모나스 린인젠시스(Pseudomonas linyingensis), 슈도모나스 후미(Pseudomonas humi), 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis), 커비박터 델리케터스(Curvibacter delicatus), 및 엑시도보락스 디라필디(Acidovorax delafieldii)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 굴 패각 이물질 분해능을 갖는 미생물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 기존의 물리적인 방법만으로 굴 패각을 세척하는 방법에 비하여 단시간에 완전한 세척이 가능하여, 세척 후에도 김 종자 이식 생산장에서 즉시 사용이 가능하다.
도 1은 평판배지 내에서 분리된 균주의 콜로니를 나타낸다.
도 2은 본 발명의 굴패각 세척방법 모식도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 굴 패각 1차 처리장치를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 (나)단계의 발효수 침지 단계를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 (다)단계를 거친 굴 패각을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실험예 2에 따른 검사 성적서를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실험예 2에 따른 검사 성적서를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 실험예 2에 따른 검사 성적서를 나타낸다.
도 2은 본 발명의 굴패각 세척방법 모식도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 굴 패각 1차 처리장치를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 (나)단계의 발효수 침지 단계를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 (다)단계를 거친 굴 패각을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실험예 2에 따른 검사 성적서를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실험예 2에 따른 검사 성적서를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 실험예 2에 따른 검사 성적서를 나타낸다.
바다에서 양식된 알굴을 분리하고 난 굴 패각에는 담치, 해조류, 수분 등의 이물질이 많이 부착되어 있기 때문에 담수를 사용하여 실시되는 물리적인 세척방법이나 작업인부가 수작업을 통해 세척하는 방법으로는 세척의 한계가 있는 문제점이 있다. 본 발명은 보다 효율적으로 굴 패각에 부착된 이물질들을 제거함으로써 세척 후 김 종자 이식에 사용할 수 있는 모패로 사용할 수 있도록 굴패각 세척 조성물 및 굴 패각 세척방법을 제공하고자 한다.
실시예1. 미생물 균주 분리 동정 및 배양
1.1 균주 분리 및 배양 조건
본 발명에서 균주 분리원으로 사용한 순환여과식 양식장 정화조의 사육수는 경남 통영 소재의 순환여과식 양식장의 정화조 및 바이오플락 양식장에서 사육수를채취하여 배양하였다. 사육수 내부에 존재하는 미생물을 분리하기 위해 채취된 사육수를 BM buffer (Mikesell et al., 1993) 50 mL가 포함된 conical tube에 넣은 후 vortex에서 세 번 세척한 후, 70% ethanol에서 짧게 다시 한 번 세척하였다. 채집한 사육수는 BM buffer 50 mL가 포함된 conical tube에 넣어 격렬하게 vortexing 하여 사육수 내생 미생물이 buffer안에서 혼합되도록 하였다.
이어서, 12000 rpm으로 원심분리하여 pellet을 모은 후 2mL의 BM buffer를 첨가하여 잘 섞은 후, 100㎕씩 고체 Bacto marine agar 2216(MA) 배지에 접종하여 미생물을 배양하였다. MA배지는 1:10과 1:2로 희석한 배지 및 희석하지 않은 배지를 동시에 사용하여 배양법에 의하여 분석할 수 있는 미생물 다양성을 높이고자 하였다. 기타 환경조건별 균주의 생장 여부를 파악할 때는 분리한 모든 균주가 LB에서 생장할 수 있었기 때문에, LB 또는 LB agar 배지를 기본 배지로 사용하였다.
1.2. 균주의 분리와 정제
각 균주를 50 mL의 LB 배지에 접종하고 30℃에서 180 rpm으로 24시간 동안 배양한 후 원심분리 (6,300 ㅧ g, 10 min, 4℃)하여 세포를 수확하였다. 회수된 배양세포를 5 mL TES buffer [0.1 M Tris-HCl (pH 7.0), 0.01 M EDTA, 1 M NaCl]로 재현탁하고, lysozyme (10 mg/mL)을 200㎕ 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시켰다. 10% SDS를 100㎕ 첨가하고, 물리적인 DNA 절단을 방지하기 위하여 천천히 섞어준 후 50㎕ proteinase K (20㎎/㎖)와 5㎕ RNase를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 5㎖ TES buffer를 더 첨가형 10㎖의 phenol을 첨가하여 잘 섞어주었다.
원심부분리를 통하여 얻어진 상징액을 취하여 새로운 tube로 옮긴 후 동량의 phenol/chloroform/isoamyl alcohol로 2회, chlorofrom으로 1회 처리하였다. 상징액을 취하여 새로운 tube로 옮긴 후 1/10 volume의 3M sodium acetate(pH.5.4)와 2-3 volume의 100% ethanol을 첨가하여 30분간 실온에서 방치하였다. 원심분리 후 상징액을 버리고, 70% ethanol을 처리하여 염류를 씻어낸 후, 다시 한번 원심분리하였다. 상징액을 버리고 공기 중에서 ethanol을 제거한 후, 침전물 500㎕의 멸균수에 녹여 다음 실험에 사용하였다.
본 발명의 실시예에 따르면 10㎖를 각각 멸균수 90㎖에 현탁하고 순차적으로 희석한 후 원액 10-4 희석 시료를 일반세균 선택배지(NA, difco)에 100㎕씩 접종하고 30℃에서 3~4일간 배양한 한 후 평판배지에서 형성된 상기 균주를 분리하였다.
이후, 상기 균주를 각각 멸균된 TSB(Tryptoic Soy Broth) 5mL에 접종하여 37℃에서 18~22시간 동안 배양한 후, 600 nm에서 흡광도를 측정하여 균의 배양정도를 확인하였다. 시험대상 균주의 초기 배양액을 TSB 배지(4℃ 냉장보관)로 10배 희석하였다. 도 1은 평판배지 내에서 분리된 균주의 콜로니를 나타낸다.
1.3. 16S rRNA 유전자 염기서열 및 계통관계 분석
각각의 배지에 배양된 균주 콜로니는 colony PCR방법에 의한 16S rRNA 유전자의 PCR증폭을 실시하였다. 하기의 표 1은 증폭에 사용된 프라이머와 PCR 조건을 나타낸다. 증폭된 16S rRNA 유전자의 부분염기서열은 PCR Product Purification Kit (Qiagen)을 사용하여 정제한다.
증폭에 사용된 Primer | PCR조건 | ||
16S rRNA gene | 27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) | 95℃ : 2min 94℃ : 30sec 54℃ : 40sec 72℃ : 60sec 72℃ : 5min 4℃ : ∞ |
30 cycles |
1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) |
PCR 정제산물은 Genetic analyzer 3730xl (Applied Biosystems)를 사용하여 염 염기서열을 분석하였다. 하기의 표 2는 유전자 염기서열 분석 결과를 나타낸다. 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성을 비교한 결과, No1. 의 균주는 Pseudomonas linyingensis, No2. 의 균주는 Pseudomonas humi, No3. 의 균주는 Bacillus altitudinis, No4. 의 균주는 Curvibacter delicatus, No5. 의 균주는 Acidovorax delafieldii 로 확인되었다.
대표세균 | 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 | |||
Hit strain name | Accession | Pairwise Similarity | ||
No1. | Pseudomonas linyingensis | LYBRD3-7(T) | HM246142 | 98.5 |
No2. | Pseudomonas humi | CCA1(T) | LC145037 | 99.15 |
No3. | Bacillus altitudinis, | 41KF2b(T) | ASJC01000029 | 99.87 |
No4. | Curvibacter delicatus | NNRC 14919(T) | BCWP01000019 | 99.86 |
No5. | Acidovorax delafieldii | DSM 64(T) | jgi.1055345 | 99.73 |
대표 균주 1은 국제미생물기탁기관 China General Microbiological Culture Collection Center(CGMCC:1.10701) 및 Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/ LMG Bacteria Collection( BCCM/LMG:25967)에서 분양 가능한 종이며, 상기 대표 균주 2 내지 5번은 국내 환경미생물은행(Korea Environmental Microorganisms Bank)에서 분양 가능한 종이다.
1.4 동정된 균주의 굴패각 처리수로의 이용
본 발명에서 동정된 균주들을 동일 비율로 액체 배양액에 접종하여 30-35℃에서 1-2일간 배양하였으며, 배양단계에서 얻은 결과물 일부를 액상 미생물제제로, 남은 일부를 무균적으로 건조시키고, 건조단계 후 얻어진 결과물을 무균적으로 분쇄하는 단계를 거쳐 분말형태의 미생물제제로 제조하였다.
액상제조물의 경우는 저장성 개선을 위한 부형제로서 비타민C 등이 첨가될 수 있으며, 효소능력 활성화를 위한 부형제로서 Tween80 등이 첨가될 수 있다.
고체분말용의 경우는 발효용 부형제로서 미강, 탈지강, 당밀 등이 부가적으로 첨가되고, 저장성 개선용 부형제로서 규산염 등이 첨가가능하다.
실시예 2 동정된 미생물 균주를 이용한 굴패각 처리
이하, 본 발명의 굴패각 세척 조성물 및 이를 유효성분으로 하는 굴패각 세척방법과 관련한 도면을 참조하여 상세히 설명하면 다음과 같다.
도 2는 본 발명의 굴패각 세척 조성물 및 이를 유효성분으로 하는 굴패각 세척방법 모식도를 나타낸다. 본 발명의 굴패각 세척 조성물 및 이를 유효성분으로 하는 굴패각 세척방법은 알굴이 분리되어 야적된 굴 패각을 굴 패각 1차 처리장치에 투입하여 교반에 의해 패각 표면의 이물질을 물리적인 방법으로 제거하는 굴 패각 1차 처리단계(가); 상기 (가)단계를 거친 굴 패각을 발효수가 저장된 발효조에 침지하여 일정 온도 및 기간동안 발효하는 발효수 침지단계(나); 상기 (나)단계를 거친 굴 패각을 발효조에서 분리하고 굴 패각 표면의 발효수의 세척 및 건조한 후 김 종자 이식용으로 사용하기 위한 김 종자 이식 생산장 공급 단계(다)로 이루어질 수 있다.
(가) 굴 패각 1차 처리단계
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 굴 패각 1차 처리장치를 나타낸다. 본 발명의 굴 패각 1차 처리단계(가)는 알굴이 분리되어 야적된 굴 패각을 굴 패각 1차 처리장치에 투입하여 교반에 의해 패각 표면에 부착된 비교적 큰 이물질을 물리적인 방법으로 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 굴 패각 1차 처리장치는 야적장에 야적된 굴 패각이 투입되는 투입호퍼로부터 장치 내부로 굴 패각이 이송되고, 일정 크기의 격자가 형성된 실린더 구조의 분리통이 바닥부와 수직하게 설치되어 회전하고, 상기 분리통 하부에는 일정 간격 이격되어 분리통의 격자에서 분리된 굴 패각 이물질을 수집하는 수집부가 설치되어 이루어질 수 있다.
상기 굴 패각 1차 처리장치의 실리더에 형성된 격자는 굴 패각보다 작고 굴 패각에 부착된 이물질보다 큰 크기로 형성되어 물리적인 이물질 분리가 가능하다.
(나) 발효수 침지 단계
본 발명의 발표수 침지 단계(나)는 상기 (가)단계를 거친 굴 패각을 발효수가 저장된 발효조에 침지하여 일정 온도 및 시간 동안 미생물 발효하는 단계이다. 도 4는 본 발명의 (나)단계의 발효수 침지 단계를 나타낸다. 본 발명의 발효수는 굴 패각에 부착된 이물질의 분해능을 갖는 균주의 배양액일 수 있다.
상기 배양액의 균주는 슈도모나스 린인젠시스(Pseudomonas linyingensis), 슈도모나스 후미(Pseudomonas humi), 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis), 커비박터 델리케터스(Curvibacter delicatus), 및 엑시도보락스 디라필디(Acidovorax delafieldii)로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 발효수는 발효조에 투입되고 30 내지 35℃의 온도를 유지하며 산소를 지속적으로 공급한다. 본 발명의 발효수 침지 단계는 상기 (가)단계가 완료된 굴 패각은 발효수가 저장된 발효조에 투입되어 30 내지 35℃의 온도로 24시간 동안 침지한다.
또한, 상기 발효조에는 발효수 내의 호기상태를 유지할 수 있도록 산소가 주입될 수 있다. 상기 수온 30 내지 35℃ 는 미생물이 발효 및 세척활동을 하는데 가장 호적한 상태라 할 수 있다. 상기 수온의 발효수에 포함되어 있는 균주는 굴 패각에 부착된 이물질을 발효 및 분해시킴으로써 보다 간편하고 단기간 내에 완벽한 세척이 가능하다.
(다) 김 종자 이식 생산장 공급 단계
본 발명의 김의 유리사상체를 이식시키기 위한 굴 패각으로 사용하기 위한 김 사상체 이식 생산장 공급 단계(다)는 상기 (나)단계를 거친 굴 패각을 발효조에서 분리하여 발효수를 세척하고 건조한 후, 김 종자 이식 생산장으로 공급하여 사용하는 단계를 포함한다.
도 5는 본 발명의 (다)단계를 거친 굴 패각을 나타낸다. 본 발명의 (가) 내지 (다)단계를 거쳐 세척이 완료된 굴 패각은 통상적인 중금속 및 유해세균이 포함되지 않은 것으로 기존의 물리적인 방법으로 굴 패각을 세척하는 방법에 비하여 단시간에 완전한 세척이 가능한 방법이라 할 수 있으며 김 종자 이식 생산장에서도 즉시 사용이 가능하다.
도 6은 본 발명의 방법에 따라 세척이 완료된 굴 패각의 성분을 분석한 결과를 나타낸다. 본발명의 굴패각의 주성분은 알칼리분이 49.51%로 구성되고 염분 및 수분은 1% 미만으로 이루어진 것을 알 수 있다.
또한 본 발명의 방법에 따라 세척이 완료된 굴 패각을 에이티분석센타(주)에 의뢰하여 품질 분석검사를 실시하였다. 도 7은 본 발명의 실험예에 따른 굴패각의 분석 결과를 나타낸다. 검사 결과, 본 발명에 의해 세척된 굴패각에서는 유해 중금속인 비소, 카드뮴, 수은, 납, 크롬, 니켈은 검출되지 않았고, 대장균 및 살모넬라 또한 검출되지 않았다. 본 발명의 세척 방법에 따라 세척된 굴 패각은 김 종자 이식 시에 포자의 잠입이 가능한 정도의 패각으로 사용할 수 있는 정도로 세척되었다.
본 발명은 야적된 굴 패각을 세척하여 김양식용 재료로 사용하는데 있어 기존의 수작업 및 물리적인 세척방법으로는 군락생활에 따른 굴 패각의 틈 사이에 존재하는 미세한 이물질 및 유해세균을 완벽하게 제거하기 어려웠던 기존의 문제점을 해결함으로써, 보다 단기간에 자동화된 방법으로 세척이 가능하여 관련 산업인의 수고 및 노동시간을 단축시킴으로 산업상 이용가능성이 있다.
Claims (3)
- 슈도모나스 린인젠시스(Pseudomonas linyingensis), 슈도모나스 후미(Pseudomonas humi), 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis), 커비박터 델리케터스(Curvibacter delicatus), 및 엑시도보락스 디라필디(Acidovorax delafieldii)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 미생물을 포함하는 굴 패각 이물질 세척용 조성물
- 청구항 1의 균주 조성물을 발효조의 정제수에 접종하여 수온을 30~35℃의 온도를 유지하여 발효된 발효수에 알굴이 분리되고 남은 굴 패각을 일정 시간 침지하여 굴 패각의 이물질을 발효조에서 분리하는 것을 특징으로 하는 굴 패각 이물질 세척용 미생물을 이용한 굴패각 세척방법
- 제2항에 있어서, 상기 굴패각은 발효조에서 24시간 이상 침지되며, 정제수에 지속적으로 산소를 공급하여 호기상태로 이루어지는 것을 특징으로 하는 굴 패각 이물질 세척용 미생물을 이용한 굴패각 세척방법
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