KR20230010839A - 단층 리포좀에서 친수성 화합물의 고효율 캡슐화 - Google Patents

단층 리포좀에서 친수성 화합물의 고효율 캡슐화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단층 리포좀의 친수성 공간에서 친수성 물질의 고효율 캡슐화에 관한 것이다. 고효율 캡슐화는 리포좀의 지질 이중층을 형성하는 소수성 화합물을 용해시키기 위해 프로필렌 글리콜 또는 글리세린으로부터 선택된 다가 알콜의 사용에 의해 달성된다. 본 발명은 단층 리포좀(UL), 및 저온 압출에 의한 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 의약품, 화장품, 식품 첨가제 또는 소독제의 제조에서 이들 UL의 용도에 관한 것이다.

Description

단층 리포좀에서 친수성 화합물의 고효율 캡슐화{HIGH-EFFICIENCY ENCAPSULATION OF HYDROPHILIC COMPOUNDS IN UNILAMELLAR LIPOSOMES}
본 발명은 의약 기술 분야, 특히 친수성 물질의 고효율 리포좀 캡슐화에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 친수성 공간을 둘러싸는 하나의 지질 이중층(lipid bilayer)을 갖는 단층(unilamellar) 리포좀(UL)(여기서, 상기 친수성 공간은 적어도 하나의 친수성 화합물을 포함한다), 및 이러한 단층 리포좀을 포함하는 액체 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단층 리포좀(UL)에서 친수성 화합물의 캡슐화 방법, 및 의약품, 화장품, 식품 첨가제 또는 소독제의 제조에서 이들 UL의 용도에 관한 것이다.
리포좀은 친수성 공간을 둘러싸는 지질 이중층으로 이루어진 막(세포 막과 유사함)을 갖는 작은 소포이다. 특성은, 친수성 헤드 및 소수성 테일을 포함하는 막 분자의 양친매성이다. 리포좀의 막 내에서, 양친매성 분자는 친수성 부분이 리포좀의 내측과 외측의 수성 환경과 접촉하고 소수성 부분이 이중 층 내에 위치하도록 배치되어 있다. 막 분자는 비-공유 상호작용에 의해 서로 연결되어 있다. 리포좀은 하나 이상의 지질 이중 층을 갖고, 25 nm 내지 100 ㎛의 크기를 가질 수 있다. 소포의 형상 및 크기는 특히 주위의 수성 상의 특성, 이들 막의 정확한 화학적 조성 및 이들의 제조 방법에 의존한다.
리포좀은, 예를 들면, 양친매성 및 소수성 화합물의 용해성을 증가시키기 위해, 약리학적 및 화장품 제형에서 통상 사용되고, 그 결과, 이들의 생물이용성이 증가한다[참조: 예를 들어, Kshirsagar, N. A., Pandya, S. K., Kirodian, B. G., and Sanath, S. (2005) Liposomal drug delivery system from laboratory to clinic., J. Postgrad. Med. 51, S5-S15; 또는 Kalhapure, R. S., Suleman, N., Mocktar, C., Seedat, N., and Govender, T. (2015) Nanoengineered Drug Delivery Systems for Enhancing Antibiotic Therapy, J Pharm Sci-Us 104, 872-905]. 약물 전달 시스템으로서 리포좀을 사용하는 것은 인간 유기체의 관련 부위로 상기 약물의 표적화 및 선택적 수송을 용이하게 한다. 이는, 보다 낮은 용량이 투여될 수 있기 때문에, 리포좀 제형화된 약물의 부작용을 경감시키고 효율 및 치료 폭을 증가시킨다.
기본적으로, 리포좀 제형은 리포좀의 특별한 물리화학적 특성으로 인해 대부분의 화합물에 대하여 개방적이다. 수성 리포좀 분산액에서, 높은 분배 계수를 갖는 물질은, 이들의 토폴로지 또는 리포좀의 크기에 무관하게, 지질 이중층 내에서만 발견되는 반면, 낮은 분배 계수를 갖는 물질은 수성 분산 매질에서 분산 또는 희석될 수 있거나 리포좀의 친수성 공간 내에 캡슐화될 수 있다.
그럼에도 불구하고, 현재, 리포좀-포위 친수성 화합물의 실제 치료적 사용은 리포좀 중의 친수성 물질의 고효율 캡슐화를 위한 보편적 방법의 부족으로 인해 중요하지 않다. 캡슐화되는 친수성 화합물을 함유하는 수용액과 진탕시킴으로써 건조 지질 필름의 수화에 의해 리포좀을 제조하는 것을 포함하는 수동적 캡슐화는 매우 낮은 캡슐화 효율을 제공하고, 이는 종종 몇 퍼센트를 초과하지 않는다. 또한, 이러한 방법에 의해 수득한 리포좀은 다층 소포(MLV)이고, 이는 대부분 크기 및 토폴로지가 상이하다[참조: WO 01/13887, EP 1 565 164]. 수동적 캡슐화 방법은 수화된 지질 분산액을 균질화 프로세스[참조: EP 0 776 194 A1, PL396706 A1, PL399298 A1, PL388134 A1 및 PL399592 A1] 또는 초음파처리[참조: PL389430 A1; 또는 Watwe, R. M., and Bellare, J. R. (1995) Manufacture of Liposomes - a Review, Curr Sci India 68, 715-724]로 처리하여 보다 작은, 보다 균일한 크기의 현탁액을 생성함으로써 변형시킬 수 있다. 그러나, 이들 기술은 전형적으로 낮은 점도의 현탁액을 유도하고, 이는 지질 구조에 의한 수성 분산 매질의 구조화를 결여하고, 이는 또한 불량한 캡슐화 효율을 유도한다. 전형적으로, 지질 필름에 첨가된 총 친수성 약물의 약 5 내지 15%만이 소포에서 캡슐화된다. 더욱이, 균질화 또는 초음파처리 동안 적용된 높은 에너지는 산화에 기인하여 리포좀 현탁액의 불안정성을 유발하고, 단백질 또는 초분자 조립체와 같은 민감한 활성 물질의 기능 저하의 위험을 증가시킨다.
친수성 화합물의 리포좀 캡슐화를 위한 또 다른 기술 그룹은 상이한 극성을 갖는 물질의 혼합물을 사용한다. 그러나, 이들 기술은, 이들 기술에 사용된 비-극성 용매가 이러한 분자의 구조를 비가역적으로 변화시키기 때문에, 대부분의 단백질 또는 기타 복잡한 분자 구조물의 캡슐화에 적합하지 않다. 추가로, 이들 기술의 캡슐화 효율도 만족스럽지 않다. 예를 들면, EP 0 514 435 B1은 리포좀 겔 조성물을 제조하는 방법을 개시하고, 여기서 인지질(15-30wt%)은 모노하이드록시 알콜을 14 내지 20중량%의 양으로 함유하는 수용액을 진탕시킴으로써 용해되고, 수득되는 리포좀에는 균질화에 의해 친수성 화합물이 적재된다. 이 방법은 지질 소포 막에 의한 수성 상의 구조화를 유발할 것으로 예상할 수 없고, 이는 캡슐화 효율을 낮게 하고, 모노하이드록시 알콜은 변성 및 자극 특성을 갖는다. DE 40 03 783 A1는, 15 내지 20중량%의 양으로 모노하이드록시 알콜(에탄올 또는 2-프로판올)의 존재하에 식물 기원의 인지질을 최대 30중량%의 농도로 격렬하게 혼합함으로써 리포좀 분산액을 제조하는 방법을 기재한다. 또한, 이 경우에, 생성되는 수성 리포좀-함유 분산액은 구조화되지 않고, 캡슐화 효율은 낮을 것으로 예상된다. 이 방법의 또 다른 결점은 혼합에 의해 형성된 리포좀의 크기가 불균일하다는 것이다.
리포좀의 형성을 가능하게 하는 수용액의 극성을 변경하는 것도 용매로서 할로겐화 탄화수소를 사용하거나(WO 96/40061 A1) 클로로플루오로카본 용매("Freon")에 용해된 지질을 고온에서 수용액에 주입(US 4,752,425)함으로써 달성할 수 있다. 그러나, 이들 방법 중 어느 것도 50% 초과의 친수성 물질의 캡슐화 효율을 제공하지 못한다. 추가로, 고온이 용매의 증발을 위해 적용되어야 하고, 이는 단백질 및 초분자 복합체를 캡슐화하기 위한 상기 방법의 사용을 방해한다.
리포좀 중의 친수성 물질을 캡슐화하는 추가의 대안적인 기술은 활성 물질의 친수성, 고도 정전적으로 하전된 입자를 양친매성 카운터 이온으로 착물화시키는 단계를 수반한다. 그 결과, 양친매성 착물이 형성되고, 이어서 지질로 피복된다. 이 방법은 기술적으로 곤란한 상이한 특성을 갖는 혼합물의 조작을 필요로 한다. 추가로, 이는 고도로 하전된 분자, 즉 핵산에만 적용할 수 있고[참조: Oh, Y. K., and Park, T. G. (2009) siRNA delivery systems for cancer treatment, Adv Drug Deliv Rev 61, 850-862], 소수성 액체의 존재하에 변성하는 단백질의 캡슐화에 적합하지 않다.
친수성 퓨린 뉴클레오사이드의 캡슐화 효율을 현저히 증가시키고 높은 리포좀내 약물 농도를 수득하기 위한 노력으로, WO 95/15762는, 비다라빈(또는 유도체)을 함유하는 다층 리포좀을 형성하고 리포좀을 동결건조, 조절된 재수화 및, 임의로, 압력하의 압출에 제공하는 단계를 포함하는 리포좀 제형의 제조 방법을 개시한다. 그러나, 압출 후, 최대 45%의 캡슐화 효율에 도달했다.
따라서, 본 발명의 목적은 친수성 화합물을 포함하는 리포좀뿐만 아니라 이러한 리포좀을 제조하는 방법을 제공하는 것으로서, 이 리포좀 및 방법은 종래 기술의 상기 논의된 문제를 대부분 극복한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 목적은, 예를 들면, 소수성 액체의 존재하에 변성하는 이온, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 천연 및 합성 중합체, 핵산, 및 핵산 유도체를 포함하는, 크기 또는 전하와 같은 이들의 추가의 물리-화학적 특성에 관계 없이 다량의 친수성 화합물을 안정하게 캡슐화하는 리포좀을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은, 이러한 친수성 화합물을 최대 100%의 캡슐화 효율로 리포좀의 친수성 공간에 캡슐화하는 방법을 제공하는 것이다. 이들 목적은 놀랍게도 본 발명에 의해 충족된다.
제1 양태에서, 본 발명은, 친수성 공간을 둘러싸는 하나의 지질 이중층을 갖는 단층 리포좀(UL)으로서, 상기 UL이 (i) 지질 이중층을 형성하는 적어도 하나의 소수성 화합물 및 (ii) 프로필렌 글리콜 또는 글리세린을 포함하고, 상기 친수성 공간이 친수성 용매에 용해된 적어도 하나의 친수성 화합물을 포함하고, 상기 친수성 용매 중의 친수성 화합물의 농도가 20℃ 및 101 kPa에서 친수성 용매 중의 친수성 화합물의 포화 농도의 적어도 80%인, 단층 리포좀(UL)을 제공한다.
제1 양태에 따르는 UL의 구현예에서, 지질 이중층을 형성하는 적어도 하나의 소수성 화합물 및 프로필렌 글리콜 또는 글리세린의 중량비는 2:1 내지 1:1의 범위이다.
제1 양태에 따르는 UL의 추가의 구현예에서, 지질 이중층을 형성하는 적어도 하나의 소수성 화합물 및 적어도 하나의 친수성 화합물의 중량비는 100:1 내지 1:3, 50:1 내지 1:2 또는 25:1 내지 1:1의 범위이다.
본 발명의 제1 양태의 추가의 구현예에서, UL은 적어도 하나의 소수성 화합물을 UL의 15 내지 40중량%, 16 내지 39중량%, 17 내지 38중량%, 18 내지 37중량%, 19 내지 35중량%, 20 내지 30중량%, 21 내지 25중량% 또는 22 내지 24중량%, 바람직하게는 UL의 20 내지 40중량%의 양으로 포함한다.
제1 양태에 따르는 UL의 추가의 구현예에서, 적어도 하나의 친수성 화합물은 (i) 100Da 내지 1500Da, 200Da 내지 1400Da, 300Da 내지 1200Da 또는 500Da 내지 1000Da의 분자량을 갖는 저분자량 친수성 물질; 및 (ii) 1500Da 내지 300kDa, 2kDa 내지 280kDa, 5kDa 내지 250kDa, 10kDa 내지 200kDa 또는 50kDa 내지 200kDa의 분자량을 갖는 친수성 거대분자(macromolecule)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
제1 양태에 따르는 UL의 추가의 구현예에서, 적어도 하나의 친수성 화합물은 이온, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 천연 및 합성 중합체, 핵산, 핵산 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
제1 양태에 따르는 UL의 추가의 구현예에서, 친수성 용매 중의 친수성 화합물의 포화 농도는 친수성 용매 1000ml당 1g 내지 500g의 범위, 바람직하게는 10g 내지 200g의 범위이다.
제1 양태에 따르는 UL의 추가의 구현예에서, 상기 친수성 용매는 물, 수성 완충액, 수성 염 용액, 수성 단당류 또는 이당류 용액 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
제2 양태에서, 본 발명은 친수성 화합물을 UL에서 캡슐화하는 방법으로서, 상기 방법이 하기 단계: (a) 적어도 하나의 소수성 화합물, 및 프로필렌 글리콜 및 글리세린으로부터 선택된 다가 알콜을 포함하는 지질 용액을 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 친수성 화합물을 포함하는 수성 상을 제공하는 단계; (c) 단계(a)의 지질 용액을 단계(b)의 수성 상과 혼합하여 수화된 지질 용액을 제조하는 단계; 및 (d) 단계(c)의 수화된 지질 용액을 80℃ 미만의 온도에서 압출시키는 단계를 포함하고, 상기 적어도 하나의 소수성 화합물이 UL의 균질한 집단(population)을 형성하고, 상기 UL이 수성 상의 총 용적의 50% 이상을 포함하는, 방법을 제공한다.
제2 양태에 따르는 방법의 구현예에서, 적어도 하나의 친수성 화합물은 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%; 또는 적어도 99%로부터 선택된 캡슐화 효율로 UL 내에 캡슐화된다.
제2 양태에 따르는 방법의 추가의 구현예에서, 다가 알콜은 수화된 지질 용액의 5 내지 30중량%, 10 내지 25중량%, 15 내지 22중량% 또는 18 내지 20중량%의 농도로 단계(c)의 수화된 지질 용액에 포함된다.
제2 양태에 따르는 방법의 추가 구현예에서, 단계(c)의 수화된 지질 용액 중의 적어도 하나의 소수성 화합물의 전체 농도는 상기 수화된 지질 용액의 15 내지 40중량%, 16 내지 39중량%, 17 내지 38중량%, 18 내지 37중량%, 19 내지 35중량%, 20 내지 30중량%, 21 내지 25중량% 또는 22 내지 24중량%, 바람직하게는 상기 수화된 지질 용액의 20 내지 40중량%이다.
제2 양태에 따르는 방법의 추가 구현예에서, 적어도 하나의 소수성 화합물은 인지질, 스핑고지질 또는 스테롤로부터, 바람직하게는 포스파티딜콜린으로부터, 보다 바람직하게는 정제된 대두 포스파티딜콜린으로부터 선택된다.
제2 양태에 따르는 방법의 추가 구현예에서, 단계(b)는 수성 상의 pH를 바람직하게는 5.0 내지 7.5, 6.0 내지 7.4 또는 7.0 내지 7.2 범위 내의 pH로 조정하는 것을 포함한다.
추가 구현예에서, 단계(d)는 단계(c)의 수화된 지질 용액을 60℃ 미만, 40℃ 미만 또는 30℃ 미만의 온도, 바람직하게는 20℃에서 압출하는 것을 포함한다.
추가 구현예에서, 제2 양태에 따르는 방법은 추가 단계(e)를 포함하고, 여기서 프로필렌 글리콜 및 글리세린으로부터 선택된 다가 알콜은 단계(d)로부터 생성되는 압출 수화된 지질 용액으로부터 제거되고, 바람직하게는 상기 다가 알콜은 한외여과에 의해 상기 압출 수화된 지질 용액으로부터 제거된다.
제3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제2 양태에 따르는 방법에 의해 제조된 UL을 제공한다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 또는 제3 양태에 따르는 적어도 하나의 UL을 포함하는 액체 조성물을 제공한다.
상기 제4 양태의 구현예에서, 액체 조성물은 하기 특성 중 적어도 하나를 갖는다: (i) 5.0 내지 7.5, 6.0 내지 7.4 또는 7.0 내지 7.2 범위의 pH; (ii) 30 mOsm 내지 400 mOsm, 40 mOsm 내지 300 mOsm 또는 50 mOsm 내지 200 mOsm 범위의 오스몰농도(osmolarity); (iii) 10-5 내지 1의 친수성 화합물 대 소수성 화합물의 전체 몰 비. 바람직한 구현예에서, 상기 액체 조성물은 수성 조성물이다.
본 발명의 제4 양태의 추가 구현예에서, 액체 조성물은 적어도 하나의 부형제를 추가로 포함하고, 바람직하게는 상기 부형제는: 완충제, 삼투 활성제, 방부제, 항산화제, 향미제, 방향족 제제, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 바람직하게는 상기 삼투제는 일가 염 또는 당, 보다 바람직하게는 염화나트륨 및 수크로즈로부터 선택된다.
제5 양태에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한, 제1 또는 제3 양태에 따르는 UL 또는 제4 양태에 따르는 조성물에 관한 것이다.
제6 양태에서, 본 발명은 의약품, 화장품, 식품 첨가제 또는 소독제로서, 제1 또는 제3 양태에 따르는 UL 또는 제4 양태에 따르는 조성물의 용도에 관한 것이다.
[도면의 간단한 설명]
도 1: 스핀들(spindle) 속도의 함수로서 점도 변화의 그래프 표시. 그래프는 실시예 8에 기재된 레오미터 측정 결과를 예시한다. 시험된 리포좀 샘플은 상이한 지질 농도(10, 15, 20, 25중량%)를 포함했고, 상이한 압출 파라미터의 사용에 의해 수득했다. PC10%: 10중량%의 상기 샘플의 압출 전의 샘플 중의 지질 농도; PC15%: 15중량%의 상기 샘플의 압출 전의 샘플 중의 지질 농도; PC20%: 20중량%의 상기 샘플의 압출 전의 샘플 중의 지질 농도; PC25%: 25중량%의 상기 샘플의 압출 전의 샘플 중의 지질 농도; PC-MLV: 비-압출 샘플; PC-UL RT: 실온에서 압출된 샘플, PC - UL T70: 70℃에서 압출된 샘플.
도 2: 지질 농도의 함수로서 점도 값의 그래프 표시. 그래프는 실시예 8에 기재된 레오미터 측정에 의해 수득된 결과를 예시한다. 시험된 리포좀 샘플은 상이한 지질 농도(10중량%, 15중량%, 20중량%, 25중량%의 샘플)를 포함하고, 상이한 압출 파라미터의 사용에 의해 수득했다. 상세함은 도 1의 설명을 참조한다.
도 3a, 도 3b: 리포좀 크기 분포 및 상관 데이터의 그래프 표시. 그래프는, 샘플 내의 입자의 확산을 나타내는 상관 함수 맞춤이 플롯팅된 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정된 바와 같이, 실시예 8에서 제조된 샘플 중의 리포좀 크기 분포를 요약한다. 도 3a는 10중량%의 지질 함량을 갖는, 단일 압출 사이클로부터 수득된 샘플 중의 리포좀의 크기 분포를 나타낸다. 이들 샘플의 다분산 지수는 적어도 0.2(PDI > 0.2)인 것으로 밝혀졌다. 도 3b는 30중량%의 지질 함량을 갖는, 단일 압출 사이클로부터 수득된 샘플 중의 리포좀의 크기 분포를 나타낸다. 이들 샘플의 다분산 지수는 0.2 미만(PDI < 0.2)인 것으로 밝혀졌다.
도 4: 실온에서 지질 농도 및 압출 사이클 수의 함수로서 리포좀 크기의 그래프 표시. 그래프는 PDI < 0.2를 갖는 샘플을 수득하는데 필요한 지질 농도 및 압출 사이클 수의 함수로서, 실온에서 수행된 압출에 의해 실시예 8에서 제조된 샘플 중의 리포좀 크기를 예시한다. 20 내지 40중량% 범위의 지질 함량에 있어서, 고도로 균일한 리포좀 크기 분포를 갖는 샘플은 제1 압출 사이클에서 이미 수득되었다.
도 5: UL 캡슐화된, 형광 표지된 덱스트란(FITC-표지) 및 파파인의 샘플 방출 스펙트럼의 그래프 표시. 그래프는 실시예 9에 기재된 샘플의 한외여과 및 분별에 의해 수득된 투과물 및 잔류물의 방출 스펙트럼을 예시한다. 덱스트란FITC MW 5000 PC 16% 투과물: 5kDa의 UL 캡슐화된 FITC-표지된 덱스트란을 포함하는 샘플로부터 투과물의 방출 스펙트럼 및 16중량% 샘플의 전체 포스파티딜 콜린(PC) 농도; 덱스트란FITC MW 5000 PC 16% 잔류물: 5kDa의 UL 캡슐화된 FITC-표지된 덱스트란을 포함하는 샘플로부터 잔류물의 방출 스펙트럼 및 16중량% 샘플의 전체 PC 농도; 파파인 MW 23 000 PC 16% 투과물: 23kDa의 UL 캡슐화된 파파인을 포함하는 샘플로부터 투과물의 방출 스펙트럼 및 16중량% 샘플의 전체 PC 농도; 파파인 MW 23 000 PC 16% 잔류물: 23kDa의 UL 캡슐화된 파파인을 포함하는 샘플로부터 잔류물의 방출 스펙트럼 및 16중량% 샘플의 전체 PC 농도.
도 6: 형광 표지된 덱스트란(FITC-표지) 및 파파인에 대한 캡슐화 효율의 그래프 표시. 그래프는 생성되는 UL 현탁액 중의 지질 농도의 함수로서 실시예 9에 기재된 방법에 의한 5kDa의 분자량을 갖는 형광 표지된 덱스트란 및 23kDa의 분자량을 갖는 파파인의 캡슐화 효율을 예시한다.
도 7a, 7b: 본 발명에 따르는 UL의 친수성 공간 내에 캡슐화된 친수성 거대분자를 포함하는 샘플의 이미징. 이미지는 투과형 전자 현미경으로부터 수득했다. 도 7a는 UL 캡슐화된 비분획화 헤파린을 도시한다. 구조의 유체역학적 직경: 150nm. 도 7b는 12kDa의 분자량을 갖는 염소 E6의 공유 결합된 분자를 갖는 UL 캡슐화된 PVP 중합체를 나타낸다. 구조의 유체역학적 직경: 130nm.
본 발명을 하기에 상세히 기재하기 전에, 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약으로 한정되지 않고, 이들은 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정 구현예만을 기재하기 위한 것이고, 첨부된 청구범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니라는 것도 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
몇몇 문서가 본 명세서의 텍스트 전체에 걸쳐 인용되어 있다. 본원에 인용된 문서(모든 특허, 특허출원, 과학적 간행물, 제조업자의 사양, 설명서 등을 포함) 각각은 상기 및 하기에서, 이의 전체가 참조로서 본원에 도입된다. 본원의 어느 것도, 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 개시를 선행하는 권리를 부여받지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
하기에서, 본 발명의 요소가 기재될 것이다. 이들 요소는 특정 구현예와 함께 나열되지만, 추가의 구현예를 생성하기 위해 이들을 임의의 방식 및 임의의 수로 조합할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양하게 기재된 실시예 및 바람직한 구현예는, 명시적으로 기재된 구현예만으로 본 발명을 한정하도록 해석되지 않아야 한다. 이 설명은 명시적으로 기재된 구현예를 임의의 수의 개시된 및/또는 바람직한 요소와 조합하는 구현예를 지지하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 추가로, 본원에 기재된 모든 요소의 임의의 치환 및 조합은 문맥이 달리 나타내지 않는 한 본 출원의 설명에 의해 개시되어 있는 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서 및 하기 청구범위 전번에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 용어 "포함하다" 및 "포함한다" 및 "포함하는" 등의 변형태는 언급된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것은 아님을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는, 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다.
발명의 상세한 설명
하기 절에서, 본 발명의 상이한 양태가 보다 상세하게 정의된다. 그렇게 정의된 각각의 양태는, 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 임의의 다른 양태 또는 양태들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 지시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 지시되는 임의의 기타 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
본 발명에 도달하기 위한 연구에서, 놀랍게도, 다량의 친수성 화함물이 본 발명의 단층 리포좀 내에 안정하게 캡슐화될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 놀랍게도, 친수성 용매에 용해된 친수성 화합물이, 상기 UL이 프로필렌 글리콜 또는 글리세린을 포함하는 경우에, 20℃ 및 101kPa에서 상기 친수성 용매 중의 상기 친수성 화합물의 포화 농도의 적어도 80%의 농도에서 단층 리포좀(UL)의 친수성 공간에 캡슐화될 수 있음이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다.
단층 리포좀 중의 이러한 대량의 친수성 화합물의 성공적 캡슐화는 상기 리포좀의 적용 경로에 따라 몇 가지 이점을 제공한다. 정맥내 또는 근육내 경로에 의해 비경구 투여되는 경우, 리포좀은 캡슐화된 친수성 화합물을 조절된 "데포" 방출을 장기간에 걸쳐 제공하고, 혈류 중의 유리 친수성 화합물의 농도를 제한함으로써 친수성 화합물의 부작용을 감소시킬 수 있다. 리포좀은 치료적으로 유리한 방법으로 친수성 화합물의 조직 분포 및 섭취를 변경할 수 있고, 덜 빈번한 화합물 투여를 허용하여 치료의 편리성을 증가시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은, 제1 양태에서, 친수성 공간을 둘러싸는 하나의 지질 이중층을 갖는 단층 리포좀(UL)으로서, 상기 UL이 (i) 지질 이중층을 형성하는 적어도 하나의 소수성 화합물 및 (ii) 프로필렌 글리콜 또는 글리세린을 포함하고, 상기 친수성 공간이 친수성 용매에 용해된 적어도 하나의 친수성 화합물을 포함하고, 상기 친수성 용매 중의 친수성 화합물의 농도가 20℃ 및 101 kPa에서 친수성 용매 중의 친수성 화합물의 포화 농도의 적어도 80%인, 단층 리포좀(UL)을 제공한다.
단층 리포좀(UL)
본원에서 사용되는 용어 "단층 리포좀" 또는 "UL"은 친수성 공간을 둘러싸는 단일 지질 이중층으로 구성된 소포를 지칭한다. 상기 소포는, 타원체, 원반상, 배-형상 소포, 컵-형상 소포, 버드 소포 및 구형 소포를 포함하는 임의의 형상일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 단층 리포좀은 실질적으로 형상이 구형이다.
본 발명의 UL은 최대 100nm의 직경을 갖는 작은 단층 소포(SUV), 또는 100nm 초과 최대 1㎛의 직경을 갖는 거대 단층 소포(LUV)일 수 있다. 본 발명의 UL의 직경은 50 내지 250nm, 100 내지 200nm 또는 130 내지 150nm인 것이 바람직하다. 본원에서 사용되는 용어 "직경"은 유체역학적 직경을 지칭하고, 이는 측정되는 입자의 것과 동일한 방식으로 확산하는 가상 경질 구의 크기로서 이해되어야 한다. 본원에 개시된 UL의 유체역학적 직경을 측정하기에 적합한 방법, 예를 들면, 동적 광 산란(DLS)은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 UL은 치료, 또는 의약품, 화장품, 식품 첨가제 또는 소독제의 제조에 사용될 수 있다.
지질 이중층
본원에서 사용되는 용어 "지질 이중층"은 소수성 화합물의 조립에 의해 형성되는 2개의 지질 층으로 구성된 폐쇄된 구조를 지칭한다.
소수성 화합물
본원에서 사용되는 용어 "소수성 화합물"은 극성 및 비극성 영역을 함유하는 양친매성 지질 화합물을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 소수성 화합물은 인지질, 스핑고지질, 및 스테롤로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 소수성 화합물은 포스파티딜콜린, 보다 더 바람직하게는 정제된 대두 포스파티딜콜린이다.
본원에 기재된 UL에서, 소수성 화합물의 비극성 쇄는 서로 대면하는 지질 이중층의 내측을 향해 지향되고, 따라서 2개 극성 쇄 사이의 비-극성 영역을 한정한다. 2개 지질 층 사이의 이렇게 형성된 친지성 내부 구획은 내측 및 외측 둘 다에 친수성 물질을 위한 투과성 장벽으로 작용한다. 소수성 화합물의 극성 그룹은 지질 이중층에 의해 형성된 폐쇄 구조의 내부 공간 뿐만 아니라 주위 매체를 향해 위치된다.
본 발명에 따르는 UL에서, UL에 포함되는 지질 이중층을 형성하는 적어도 하나의 소수성 화합물 및 프로필렌 글리콜 또는 글리세린의 중량비는 2:1 내지 1:1의 범위인 것이 바람직하다. 상기 중량비를 측정하는 적합한 방법, 예를 들면, 화합물 분리를 위한 초원심분리, 소수성 화합물 농도 결정을 위한 HPLC-ELSD, 및 프로필렌 글리콜 및 글리세린 함량 결정을 위한 기체 크로마토그래피(GC)는 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다[참조: Elmoslemany RM, Abdallah OY, El-Khordagui LK, Khalafallah NM. Propylene Glycol Liposomes as a Topical Delivery System for Miconazole Nitrate: Comparison with Conventional Liposomes. AAPS PharmSciTech. 2012;13(2):723-731. doi:10.1208/s12249-012-9783-6].
또한, 본 발명의 UL은 적어도 하나의 소수성 화합물을 UL의 15 내지 40중량%, 16 내지 39중량%, 17 내지 38중량%, 18 내지 37중량%, 19 내지 35중량%, 20 내지 30중량%, 21 내지 25중량% 또는 22 내지 24중량%, 보다 바람직하게는 UL의 20 내지 40중량%의 양으로 포함한다.
또한, 바람직하게는, 지질 이중층을 형성하는 적어도 하나의 소수성 화합물 및 본원에 기재된 UL의 친수성 공간에 포함된 적어도 하나의 친수성 화합물의 중량비는 100:1 내지 1:3, 50:1 내지 1:2 또는 25:1 내지 1:1의 범위이다. UL 중의 상기 중량비는 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 소수성 화합물 추출, 이어서 소수성 화합물 농도의 HPCL-ELSD 검출에 의해 결정될 수 있다. 상기 친수성 화합물의 물리-화학적 특성에 따라 친수성 화합물 검출에 적절한 분석 방법을 선택하는 것은 개업의의 통상의 기술 내에 있다.
구현예에서, 본 발명의 UL은 하전된 지질을 함유하지 않는다.
친수성 공간
본원에서 사용되는 용어 "친수성 공간"은 지질 이중층에 의해 형성된 폐쇄 구조의 극성 내부 표면에 의해 결합되는 공간을 지칭한다. 본 발명에 따르는 UL의 친수성 공간은 친수성 용매, 및 상기 친수성 용매에 용해되는 적어도 하나의 친수성 화합물을 포함한다.
친수성 용매
본원에서 사용되는 용어 "친수성 용매"는 옥탄올과 비혼화성인 임의의 용매를 지칭한다. 바람직하게는, 상기 용어는 20℃에서 75.0 내지 80.1 범위 내의 비유전율 값(a relative permittivity value)을 갖는 임의의 용매를 지칭한다. 본원에 기재된 방법에서, 친수성 용매는 물, 수성 완충액, 수성 염 용액, 수성 단당류 또는 이당류 용액 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
적어도 90중량%, 적어도 95중량% 또는 적어도 99중량%의 친수성 용매가 본 발명의 UL의 친수성 공간에 포함되는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 100중량%의 친수성 용매가 본 발명의 UL의 친수성 공간에 포함된다.
친수성 화합물
본원에서 사용되는 용어 "친수성 화합물"은 음의 로그 P 값(P = 분배-계수 옥탄올-물)을 갖는 임의의 화합물을 지칭한다. 분배-계수는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정할 수 있다[참조: J. Sangster: Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997]. 바람직하게는, 친수성 화합물은 이온, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 천연 및 합성 중합체, 핵산, 핵산 유도체 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또한, 적어도 하나의 친수성 화합물은, (i) 100Da 내지 1500Da, 200Da 내지 1400Da, 300Da 내지 1200Da 또는 500Da 내지 1000Da의 분자량을 갖는 저분자량 친수성 물질; 및 (ii) 1500Da 내지 300kDa, 2kDa 내지 280kDa, 5kDa 내지 250kDa, 10kDa 내지 200kDa 또는 50kDa 내지 200kDa의 분자량 범위를 갖는 친수성 거대분자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 UL에 포함된 친수성 용매 중의 친수성 화합물의 농도는 20℃ 및 101kPa에서 친수성 용매 중의 친수성 화합물의 포화 농도의 적어도 80%이다.
본원에서 사용되는 용어 "포화 농도"는 친수성 용매가 친수성 화합물을 더 이상 용해시킬 수 없고 상기 친수성 화합물의 추가량이 별개의 상, 즉 침전물로서 나타나는, 20℃ 및 101kPa에서 친수성 용매 중의 친수성 화합물의 농도를 의미한다. 친수성 화합물의 포화 농도를 결정하는 적합한 방법, 예를 들면, 화학물질의 수용해도를 시험하는 OECD 가이드라인에 따르는 플라스크 방법 또는 컬럼 용출 방법은 통상 당업자에게 공지되어 있다[참조: OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 1, Test no. 105 - Water solubility].
바람직하게는, 친수성 용매 중의 친수성 화합물의 포화 농도는 친수성 용매 1000ml당 1g 내지 500g의 범위, 보다 바람직하게는 친수성 용매 1000ml당 10g 내지 200g의 범위이다.
본원에 기재된 UL에 포함된 친수성 화합물 대 소수성 화합물의 전체 몰 비는 1:100000 이상인 것이 추가로 바람직하다.
본 발명의 방법
본 발명자들은 단층 리포좀 내에의 친수성 화합물의 고효율 캡슐화 방법을 추가로 개발했다. 놀랍게도, 친수성 화합물을 포함하는 수성 상의 총 용적의 50% 이상이 지질 이중층을 형성하는 소수성 화합물을 위한 용매로서 프로필렌 글리콜 및 글리세린으로부터 선택된 다가 알콜을 사용함으로써 UL에 안정하게 캡슐화될 수 있음이 밝혀졌다.
따라서, 제2 양태에서, 본 발명은 친수성 화합물을 UL에 캡슐화시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하기 단계: 적어도 하나의 소수성 화합물, 및 프로필렌 글리콜 및 글리세린으로부터 선택된 다가 알콜을 포함하는 지질 용액을 제공하는 단계; 적어도 하나의 친수성 화합물을 포함하는 수성 상을 제공하는 단계; 단계(a)의 지질 용액을 단계(b)의 수성 상과 혼합하여 수화된 지질 용액을 제조하는 단계; 및 단계(c)의 수화된 지질 용액을 80℃ 미만의 온도에서 압출시키는 단계를 포함하고, 상기 적어도 하나의 소수성 화합물은 UL의 균질한 집단을 형성하고, 상기 UL은 수성 상의 총 용적의 50% 이상을 포함한다.
바람직하게는, 상기 UL은 수성 상의 총 용적의 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상; 또는 99% 이상을 포함한다.
캡슐화 효율
본 발명의 상기 방법은 실온에서 낮은 에너지 압출의 단순한 프로세스에 의해 명확하게 정의된 크기 분포를 갖는 안정한 UL 함유 현탁액의 제조를 용이하게 하고, 각각 캡슐화 친수성 화합물의 높은 구조적 안정성 및 고도의 캡슐화를 제공한다.
적어도 하나의 친수성 화합물은 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%로부터 선택된 캡슐화 효율로 본원에 기재된 방법에 의해 UL 내에 캡슐화될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "캡슐화 효율"은 퍼센트(%)로서 표시되는 "a"의 값을 지칭하고, 이는 하기 식에 따라 결정된다:
a = (Ctot - Cout)/Ctot
여기서, "Cout"는 샘플 중의 UL의 친수성 공간 외측에 잔류하는 수성 상 부분 중의 친수성 화합물의 농도를 지칭하고, "Ctot"는 샘플 중의 친수성 화합물의 전체 농도를 지칭한다. "Cout" 및 "Ctot"는 분광법에 의해 결정된다.
본 발명의 방법에 의한 친수성 화합물의 효율적 캡슐화는 적어도 하나의 친수성 화합물을 포함하는 수성 상의 캡슐화 용적 대 UL 외측에 잔류하는 상기 수성 상의 용적의 높은 비율의 결과로서 달성된다. 이는 본원에 기재된 방법의 단계(b)에서 제공된 수성 상의 총 용적의 적어도 절반이 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 리포좀 내부에 존재하는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명의 방법으로부터 수득된 조성물은 UL의 균질한 집단을 포함하고, 상기 UL은 수성 상의 총 용적의 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상을 포함한다.
본 발명의 방법의 단계(b)에서, 적어도 하나의 친수성 화합물을 포함하는 수성 상은 상기 적어도 하나의 친수성 화합물을 친수성 용매에 용해시킴으로써 제조할 수 있다. 바람직하게는, 단계(b)에서 제공된 수성 상 중의 친수성 화합물의 농도는 20℃ 및 101kPa에서 친수성 용매 중의 친수성 화합물의 포화 농도의 적어도 80%이다. 친수성 용매 중의 친수성 화합물의 포화 농도는 친수성 용매 1000ml당 1g 내지 500g 범위, 바람직하게는 친수성 용매 1000ml당 10g 내지 200g 범위일 수 있다.
본 발명의 방법의 단계(b)는 수성 상의 pH를, 바람직하는 5.0 내지 7.5, 6.0 내지 7.4 또는 7.0 내지 7.2 범위 내의 pH로 조정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 pH 조정은 20℃의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다. 액체 용액의 pH를 측정하고 조정하는 적합한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 기재된 방법에서, 다가 알콜은 수화된 지질 용액의 5 내지 30중량%, 10 내지 25중량%, 15 내지 22중량% 또는 18 내지 20중량%의 농도로 단계(c)의 수화된 지질 용액에 포함되는 것이 바람직하다.
소수성 화합물 농도
고농도의 적어도 하나의 소수성 화합물이 본 발명의 방법의 단계(c)에서 제조된 수화된 지질 용액에 포함되는 경우, 상기 UL의 지질 이중층으로 조밀하게 충전된 UL 현탁액이 수득된다는 것이 본 발명자들에 의해 추가로 밝혀졌다. 따라서, 단계(c)의 수화된 지질 용액 중의 적어도 하나의 소수성 화합물의 전체 농도는 상기 수화된 지질 용액의 15 내지 40중량%, 16 내지 39중량%, 17 내지 38중량%, 18 내지 37중량%, 19 내지 35중량%, 20 내지 30중량%, 21 내지 25중량% 또는 22 내지 24중량%일 수 있다.
단계(c)의 수화된 지질 용액 중의 적어도 하나의 소수성 화합물의 전체 농도는 상기 지질 용액의 20 내지 40중량%, 상기 수화된 지질 용액의 20 내지 30중량% 또는 상기 수화된 지질 용액의 30 내지 40중량%인 것이 특히 바람직하다. 이렇게 농축된 UL 현탁액의 단일 압출 사이클은 본원에 기재된 방법의 캡슐화 효율을 최대 99%까지 추가로 증강시키고 추가의 겔화제 또는 증점제의 사용 없이 4000cPs(6 RPM RT) 이상의 UL 현탁액의 고점도를 달성한다는 것이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다. 바람직하게는, 적어도 5000cPs, 적어도 7000cPs, 또는 적어도 10000cPs(6 RPM RT)의 UL 현탁액의 점도가 달성된다.
적어도 하나의 소수성 화합물은 인지질, 스핑고지질 또는 스테롤로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 소수성 화합물은 포스파티딜콜린, 보다 바람직하게는 정제된 대두 포스파티딜콜린으로부터 선택될 수 있다. 구현예에서, 단계(c)의 수화된 지질 용액은 하전된 지질을 함유하지 않는다.
압출
단계(d)에서 단계(c)의 수화된 지질 용액의 압출은 80℃ 미만, 60℃ 미만 또는 40℃ 미만의 온도에서 수행할 수 있다.
놀랍게도, 본 발명의 방법이 실온에서 단일 압출 사이클 후에 이미 95%를 초과하는 효율로 본원에 기재된 UL 중의 친수성 거대분자의 캡슐화를 달성한다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본원에 기재된 방법의 단계(d)가 30℃ 미만의 온도, 보다 바람직하게는 실온(20℃)에서 단계(c)의 수화된 지질 용액을 압출하는 것을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법이 단일 압출 사이클을 포함하는 것이 추가로 바람직하다. 가장 바람직하게는, 본원에 기재된 방법의 단계(d)는 단일 압출 사이클에서 실온(20℃)에서 단계(c)의 수화된 지질 용액을 압출하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "압출 사이클"은 100nm의 기공 직경을 갖는 폴리카보네이트 필터를 통해 단계(c)의 수화된 지질 용액의 1회 통과를 지칭한다.
추가의 방법 단계
본원에 기재된 방법의 압출 단계(d)는 압출 단계(d)로부터 생성되는 UL 함유 현탁액으로부터 글리세롤 또는 프로필렌 글리콜을 제거하는 추가 단계(f)를 수반할 수 있다. 바람직하게는, 다가 알콜의 상기 제거는 한외여과에 의해 달성된다. 특히 바람직한 구현예에서, 압출 단계(d)로부터 생성되는 UL 함유 현탁액을 한외여과 시스템(예: 실험실 규모를 위한 MicroKros MWCO 70kD 또는 대규모 제조를 위한 상업적으로 입수가능한 카세트)에 적용하고, 후속적으로 등삼투압 수성 상으로 세척한다. 한외여과 단계 후에 리포좀 현탁액에 잔류하는 다가 알콜의 양은 샘플 및 적용된 수성 상의 용적 분획에 비례한다. 바람직하게는, 상기 양은 UL 함유 현탁액의 1중량% 미만, 0.8중량% 미만, 0.5중량% 미만, 0.4중량% 미만, 0.3중량% 미만, 0.2중량% 미만 또는 0.1중량% 미만이다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 식염수 용액, 보다 바람직하게는 멸균 식염수 용액을 첨가함으로써 단계(d) 또는 (e)로부터 생성되는 UL 함유 현탁액을 희석시키는 추가 단계를 포함할 수 있다.
또는, 상기 추가 방법 단계는 리포좀 분말과 같은 고체 리포좀-함유 조성물을 제공하기 위해, 단계(d) 또는 (e)로부터 생성되는 UL 함유 현탁액을 동결건조 또는 분무-건조시키는 것을 포함할 수 있다.
부형제
본 발명의 방법은 적어도 하나의 부형제를 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 이는: 완충제, 삼투 활성제, 방부제, 항산화제, 향미제, 방향족 제제, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 삼투제는 1가 염 또는 당, 보다 바람직하게는 염화나트륨 및 수크로즈로부터 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법이 삼투압제를 30 mOsm 내지 400 mOsm 범위의 최종 생성물의 오스몰농도가 수득되도록 하는 양으로 첨가하는 것을 포함하는 것이 추가로 바람직하다.
본 발명의 조성물
제3 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 발명에 따르는 적어도 하나의 UL을 포함하는 조성물을 제공한다. 제4 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 조성물을 제공한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "조성물"은 각각 제3 양태에 따르는 조성물 및 제4 양태에 따르는 조성물 둘 다를 지칭하고, 액체, 반-고체 및 고체 조성물을 포함한다. 본 발명의 조성물은 액체 조성물, 바람직하게는 수성 액체 조성물, 예를 들면, 수성 희석액 또는 현탁액, 또는 반-고체 조성물, 예를 들면, 연고 또는 겔일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 고체 조성물, 바람직하게는 분말 조성물, 예를 들면, 분무-건조된 또는 동결건조된 분말 조성물일 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 약제학적 조성물, 화장품 조성물, 식품 조성물, 식품 첨가제 조성물, 또는 소독제 조성물로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 조성물이 약제학적 조성물인 경우, 친수성 화합물이 약제학적 활성제 또는 약물 화합물인 것이 바람직하다.
본원에 기재된 조성물은 적어도 하나의 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 부형제는: 완충제, 삼투 활성제, 방부제, 항산화제, 향미제, 방향족 제제, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 바람직하게는 상기 삼투제는 1가 염 또는 당, 보다 바람직하게는 염화나트륨 및 수크로즈로부터 선택된다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 하기 특성 중 적어도 하나를 갖는다: (i) 5.0 내지 7.5, 6.0 내지 7.4 또는 7.0 내지 7.2 범위의 pH; (ii) 30 mOsm 내지 400 mOsm, 40 mOsm 내지 300 mOsm 또는 50 mOsm 내지 200 mOsm 범위의 오스몰농도; 및/또는 (iii) 10-5 내지 1의 친수성 화합물 대 소수성 화합물의 전체 몰 비.
본원에 기재된 조성물은 적어도 4000cPs(6 RPM RT), 적어도 5000cPs(6 RPM RT), 적어도 7000cPs(6 RPM RT), 또는 적어도 10000cPs(6 RPM RT)의 점도를 갖는 것이 추가로 바람직하다.
본 발명의 UL 및 조성물의 용도
본원에 기재된 단층 리포좀(UL) 또는 조성물은 의약품, 화장품, 식품 첨가제 또는 소독제로서, 또는 각각 의약품, 화장품, 식품 첨가제 또는 소독제의 제조에서 사용될 수 있다. 구현예에서, 본 발명의 UL 또는 조성물은 치료에 사용된다.
본원에 기재된 조성물은 연고의 형태로 피부용 제품 또는 화장품으로서 추가의 변형 없이 사용될 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 희석된 형태로 또한 사용될 수 있다. UL에 캡슐화된 친수성 물질이 의약품으로서 전신 사용을 의도하는 경우, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 등장성 용액으로 희석되고, 이는 UL 내에 캡슐화된 친수성 화합물의 양을 변화시키지 않는다. 이러한 희석된 UL 현탁액은 치료적 적용에서 펩티드, 완전 단백질, 중합체, 당 또는 핵산의 투여를 위해 사용될 수 있다. 현재까지, 이들 화합물의 약제학적 사용은 생리학적 유체로부터 이들의 즉시 제거에 기인하여 한정된다. 이는 소화 동안 단백질, 중합체, 당 또는 핵산이 가수분해되는 경구 투여에서 특히 관련된다.
따라서, 요약하면, 생물학적 약물의 개발 및 치료적 적용에서 주요 장애는 본 발명에 의해 극복된다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 기재되고, 이는 단지 예시적이고 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1
1000mg의 포스포리폰(Phospholipon) 90G(Lipoid AG)를 균질한 지질 황색 용액이 수득될 때까지 교반하면서(4h, RT) 750mg 프로필렌 글리콜(Chempur)에 용해시킨 다음, 포스페이트 완충액(0.01M, pH 7.2)으로 완충된 5mg의 형광-표지된 덱스트란(MW 5kDa)을 함유하는 3250mg의 수성 상과 혼합했다. 생성되는 혼합물을 1회 사이클로 100nm의 기공 직경을 갖는 폴리카보네이트 필터를 통해 압출시켰다.
그 결과, 상기 현탁액 중량당 20%의 지질 농도를 함유하는 리포좀 현탁액이 수득되었고, 여기서 96%의 표지된 덱스트란은 단층 리포좀(UL) 내에 캡슐화되었다.
실시예 2
1500mg의 포스포리폰 90G(Lipoid AG)를 균질한 지질 황색 용액이 수득될 때까지 교반하면서(4h, RT) 1000mg 프로필렌 글리콜(Chempur)에 용해시킨 다음, 포스페이트 완충액(0.01M, pH 7.2)으로 완충된 5mg의 형광-표지된 덱스트란(MW 5kDa)을 함유하는 2500mg의 수성 상과 혼합했다. 생성되는 혼합물을 1회 사이클로 100nm의 기공 직경을 갖는 폴리카보네이트 필터를 통해 압출시켰다.
그 결과, 상기 현탁액 중량당 30%의 지질 농도를 함유하는 리포좀 현탁액이 수득되었고, 여기서 96%의 표지된 덱스트란은 단층 리포좀(UL) 내에 캡슐화되었다.
실시예 3
2000mg의 포스포리폰 90G(Lipoid AG)를 균질한 지질 황색 용액이 수득될 때까지 교반하면서(4h, RT) 1000mg 프로필렌 글리콜(Chempur)에 용해시킨 다음, 포스페이트 완충액(0.01M, pH 7.2)으로 완충된 5mg의 형광-표지된 덱스트란(MW 5kDa)을 함유하는 2000mg의 수성 상과 혼합했다. 생성되는 혼합물을 1회 사이클로 100nm의 기공 직경을 갖는 폴리카보네이트 필터를 통해 압출시켰다.
그 결과, 상기 현탁액 중량당 40%의 지질 농도를 함유하는 리포좀 현탁액이 수득되었고, 여기서 99%의 표지된 덱스트란은 단층 리포좀(UL) 내에 캡슐화되었다.
실시예 4
1500mg의 포스포리폰 90G(Lipoid AG)를 균질한 지질 황색 용액이 수득될 때까지 교반하면서(4h, RT) 1000mg 프로필렌 글리콜(Chempur)에 용해시킨 다음, 포스페이트 완충액(0.01M, pH 7.2)으로 완충된 50mg의 파파인(MW 23kDa)을 함유하는 2500mg의 수성 상과 혼합했다. 생성되는 혼합물을 1회 사이클로 100nm의 기공 직경을 갖는 폴리카보네이트 필터를 통해 압출시켰다.
그 결과, 상기 현탁액 중량당 30%의 지질 농도를 함유하는 리포좀 현탁액이 수득되었고, 여기서 99%의 파파인은 단층 리포좀(UL) 내에 캡슐화되었다.
실시예 5
암의 치료에서 첨가제 또는 식이 보충제로서 사용하기 위한 고농축 비타민 C 제품을 하기 성분을 갖도록 제조했다:
Figure pat00001
생성물은 210mg의 포스포리폰 90G(Lipoid AG)를 180mg의 프로필렌 글리콜(Chempur)에 용해시키고 이 혼합물을 균질한 지질 황색 용액이 수득될 때까지 교반(4h, RT)시킴으로써 제조했다. 상기 용액을 포스페이트 완충액(0.01M, pH 7.2)으로 완충된 210mg의 비타민 C를 함유하는 590mg의 수성 상과 혼합했다(12h, RT, 200RPM). 생성되는 혼합물을 1회 사이클로 100nm의 기공 직경을 갖는 폴리카보네이트 필터를 통해 압출시켰다. EDTA, 천연 향료 및 감미 물질을 순차적으로 첨가하고, 교반하여(0.5h, RT, 60 RPM) 최종 생성물을 수득했다.
실시예 6
빈혈 치료에서 첨가제 또는 식이 보충제로서 사용하기 위한 고농축 철 제형을 하기 성분을 갖도록 제조했다:
Figure pat00002
생성물은 220mg의 포스포리폰 90G(Lipoid AG)를 180mg 프로필렌 글리콜(Chempur)에 용해시키고 이 혼합물을 균질한 지질 황색 용액이 수득될 때까지 교반(4h, RT, 60RPM)시킴으로써 제조했다. 상기 용액을 포스페이트 완충액(0.01M, pH 7.2)으로 완충된 20mg의 이인산철(III)을 함유하는 580mg의 수성 상과 혼합했다(12h, RT, 200RPM). 생성되는 혼합물을 1회 사이클로 100nm의 기공 직경을 갖는 폴리카보네이트 필터를 통해 압출시켰다. 항산화제로서 비타민 E, 천연 향료 및 감미 물질을 순차적으로 첨가하고, 교반하여(0.5h, RT, 60 RPM) 최종 생성물을 수득했다.
실시예 7
유전자 치료에서 사용하기 위한 의약품을 하기 성분을 갖도록 제조했다:
Figure pat00003
생성물은 240mg 포스파티딜콜린, 10mg N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸-설페이트(DOTAP) 및 20mg 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 200mg 프로필렌 글리콜(Chempur)에 용해시켜 제조하고, 균질한 지질 황색 용액이 수득될 때까지 교반시켰다(4h, RT, 60 RPM). 상기 용액을 포스페이트 완충된 식염수 1×(PBS)로 완충된 20mg의 데옥시리보핵산(DNA)을 함유하는 530mg의 수성 상과 혼합했다(12h, RT, 200RPM). 생성되는 혼합물을 1회 사이클로 100nm의 기공 직경을 갖는 폴리카보네이트 필터를 통해 압출시켰다. 생성되는 생성물을 동결건조시키거나, 직접 투여를 위해 식염수에서 희석시켰다.
실시예 8
단층 리포좀(UL)의 제조 프로세스를 최적화하기 위해, 몇몇 리포좀 함유 샘플을 표 1에 제시된 제형 및 프로세스 파라미터를 사용하여 제조하고, 이들 샘플에서 점도 및 크기 분포를 결정했다.
[표 1]: 시험된 리포좀 샘플의 제형 및 프로세스 파라미터의 개요
Figure pat00004
단층 리포좀(UL) 함유 샘플의 제조 프로세스의 제1 단계에서, 지질 용액은 포스파티딜콜린과 프로필렌 글리콜의 혼합물을 교반시키고 상기 혼합물을 포스파티딜콜린의 전체 용해 때까지 실온에서 수시간 동안 배양하여 제조했다. 수득된 투명한 황색 지질 용액에, 증류수를 10g의 최종 샘플 중량이 수득되도록 하는 양으로 첨가했다. 샘플을 균질해질 때까지 격렬하게 혼합하고, 인지질의 백색 현탁액을 수득했다.
다층 리포좀(MLV)의 수득된 현탁액을 3개의 동일한 배치로 분할했다. 하나의 배치를 점도 시험으로 처리했다(비교정 배치). 2개의 다른 배치는 100nm의 기공 직경을 갖는 폴리카보네이트 필터를 통한 압출에 의해 조정했다. 압출 프로세스는 샘플 중의 생성되는 단층 리포좀(UL)의 균질한 크기 분포가 수득될 때까지, 각각 실온(RT) 또는 70℃에서 수행했다.
수득된 리포좀 함유 샘플의 점도는 콘-플레이트 측정 시스템을 구비한 브루커(Bruker) 레오미터를 사용하여 결정했다. 소량의 샘플(0.1-0.2g)을 항온 측정 챔버에 넣고, 콘의 회전 속도에 대한 점도의 변화를 측정하여 특성화했다. 측정은 실온(20℃)에서 수행했다. 이들 점도 측정 결과는 도 1 및 도 2에 제시된다.
추가로, 수득된 샘플 중의 리포좀의 크기 분포는, 샘플을 1:100의 비로 증류수로 희석시킨 후, 말베른 제타사이저 나노(Malvern ZetaSizer Nano) ZS 장치를 사용하여 동적 광 산란(DLS)에 의해 결정했다. 크기 결정 결과는 도 3a, 도 3b 및 도 4에 제시된다.
결과
단층 리포좀(UL)의 생산 프로세스의 최적화 결과, UL의 형성은 실온에서 저압 압출 후에 이미 발생한다는 것이 밝혀졌다. 추가로, 압출된 샘플 중의 지질의 양은 적어도 20중량%인 것이 바람직한 것으로 밝혀졌다. 상기 지질 농도를 20중량% 이상으로 설정하는 것은, 보다 낮은 양의 지질을 함유하는 샘플과는 반대로, 폴리카보네이트 필터를 통한 샘플의 단일 통과에 의해 리포좀의 단분산 집단(PDI < 0.2)의 수득을 용이하게 하는 것으로 추가로 밝혀졌다.
실시예 9
친수성 거대분자에 대한 본 발명의 캡슐화 방법의 고효율을 입증하기 위해, 프로필렌 글리콜 중의 지질의 용액을 각각 형광 표지된 친수성 중합체(5kDa의 FITC-표지된 덱스트란) 또는 단백질(23kDa의 분자량을 갖는 파파인)의 수용액과 혼합하고 100nm의 기공 직경을 갖는 폴리카보네이트 필터를 통해 생성되는 현탁액을 압출시킴으로써 실시예 1 내지 4에 따라 샘플을 제조했다. 생성되는 UL 현탁액 중의 지질 농도는 상기 현탁액의 20중량% 내지 40중량% 범위였다.
UL의 크기는, 샘플을 1:100의 비로 증류수로 희석시킨 후, 실시예 8에 기재된 DSL 기술을 사용하여 검증했다.
UL 캡슐화된 형광 표지된 중합체 또는 단백질의 농도는 분광법에 의해 결정했다. 따라서, 샘플은, 양 구획, 즉 리포좀의 외부(투과물 분획) 및 리포좀의 내부(잔류물 분획)에서 친수성 화합물의 농도를 결정하기 위해, 컷-오프 범위 140-300kDa를 갖는 Biomax-50 여과 카세트(Merck Millipore)를 통해 한외여과로 처리했다. 정상-상태 형광 방출 스펙트럼은 써모 사이언티픽 니콜렛 에볼루션(Thermo Scientific Nicolet Evolution) 100 UV-VIS 분광광도계로 측정했다. 여기 파장은 파파인 및 플루오레세인-표지된 덱스트란(FITC-덱스트란)에 대해 각각 280nm 및 490nm로 설정했다.
캡슐화 효율은 상기 본원에 제공된 식에 따라 결정했다. 요약하면, 퍼센트[%]로 표현된 캡슐화 효율 "a"는 하기 식에 따라 결정했다:
a = (Ctot - Cout)/Ctot
여기서, "Cout"는 샘플 중의 UL의 친수성 공간 외측에 잔류하는 수성 상 부분 중의 친수성 화합물의 농도를 결정하고, "Ctot"는 샘플 중의 친수성 화합물의 전체 농도를 결정한다.
결과
모든 샘플에서 약 100nm의 평균 크기 및 PDI < 0.2를 갖는 UL의 균질한 집단이 단일 압출 사이클 후에 수득되었고, 여기서 거의 100%의 덱스트란 또는 파파인이 각각 UL 내에 캡슐화되었다. 파파인 및 형광-표지된 덱스트란을 각각 함유하는 샘플 둘 다에 대해 여액(투과물) 및 UL 내에 캡슐화된 수성 분획(잔류물)의 샘플 방출 스펙트럼은 도 5에 제시되어 있다.
구체적으로, 본 발명의 방법은 95%를 초과하는 효율로 상기 UL 중의 이들 친수성 거대분자의 캡슐화를 달성하는 것으로 나타났다. 계산된 캡슐화 효율은 샘플 중의 지질 농도의 함수로서 도 6에 제시되어 있다.
실시예 10
수득된 구조의 완전성 뿐만 아니라 친수성 거대분자를 캡슐화하기 위한 본원에 제공된 방법의 고효율을 확인하기 위해, 염소 E6의 공유 결합된 분자를 갖는 비분획화 헤파린 및 PVP를 각각 함유하는 본 발명에 따르는 UL 제형의 이미징은 투과 전자 현미경을 사용하여 수행했다(참조: 도 7). 생성되는 이미지는 본원에 기재된 발명의 UL 중의 친수성 거대분자의 캡슐화 유효성 및 본원에 기재된 캡슐화 방법의 고효율을 확인한다.
실시예 11
친수성 거대분자에 대한 본 발명의 캡슐화 방법의 고효율을 추가로 입증하기 위해, 1000mg의 포스포리폰 90G(Lipoid AG)를 균질한 지질 황색 용액이 수득될 때까지 교반하면서(4h, RT) 1000mg 글리세린(PCC, Poland)에 용해시킨 다음, 0.1M NaCl 중의 10mg의 알부민(66kDa 이상의 MW)을 함유하는 2000mg의 수용액과 혼합했다. 캡슐화 효율은 상기 실시예 9에 기재된 바와 같이 결정했다.
그 결과, 상기 현탁액 중량당 25%의 지질 농도를 함유하는 UL 현탁액이 수득되었고, 여기서 83%의 알부민은 단층 리포좀(UL) 내에 캡슐화되었다.
실시예 12
친수성 거대분자에 대한 본 발명의 캡슐화 방법의 고효율을 추가로 입증하기 위해, 25g 포스포리폰 90G(Lipoid AG)를 균질한 지질 황색 용액이 수득될 때까지 교반하면서(4h, RT) 25g 글리세린(PCC, Poland)에 용해시킨 다음, 0.1M NaCl 중의 0.5% w/w 헤파린을 함유하는 50g의 수성 상과 혼합했다. 생성되는 혼합물을 1회 사이클로 100nm의 기공 직경을 갖는 폴리카보네이트 필터를 통해 압출시켰다. 캡슐화 효율을 평가하기 위해, 생성되는 UL 현탁액은 양 구획, 즉 리포좀의 외부(투과물 분획) 및 리포좀의 내부(잔류물 분획)에서 친수성 화합물의 농도를 결정하기 위해, 컷-오프 범위 140-300kDa를 갖는 Biomax-50 여과 카세트(Merck Millipore)를 통해 한외여과로 처리했다. 검출기 및 UL 캡슐화된 헤파린의 농도는 ELSD 검출기 및 SEC 컬럼이 구비된 HPLC를 사용하여 결정했다.
그 결과, 상기 현탁액 중량당 25%의 지질 농도를 함유하는 리포좀 현탁액이 수득되었고, 여기서 56%의 헤파린은 단층 리포좀(UL) 내에 캡슐화되었다.
실시예 13
친수성 거대분자에 대한 본 발명의 캡슐화 방법의 고효율을 추가로 입증하기 위해, 30g 포스포리폰 90G(Lipoid AG)를 균질한 지질 황색 용액이 수득될 때까지 교반하면서(4h, RT) 20g 글리세린(PCC, Poland)에 용해시킨 다음, 0.1M NaCl 중의 0.5% w/w 헤파린을 함유하는 50g의 수성 상과 혼합했다. 생성되는 혼합물을 1회 사이클로 100nm의 기공 직경을 갖는 폴리카보네이트 필터를 통해 압출시켰다. 캡슐화 효율을 평가하기 위해, 생성되는 UL 현탁액은 양 구획, 즉 리포좀의 외부(투과물 분획) 및 리포좀의 내부(잔류물 분획)에서 친수성 화합물의 농도를 결정하기 위해, 컷-오프 범위 140-300kDa를 갖는 Biomax-50 여과 카세트(Merck Millipore)를 통해 한외여과로 처리했다. 검출기 및 UL 캡슐화된 헤파린의 농도는 ELSD 검출기 및 SEC 컬럼이 구비된 HPLC를 사용하여 결정했다.
그 결과, 상기 현탁액 중량당 30%의 지질 농도를 함유하는 리포좀 현탁액이 수득되었고, 여기서 80%의 헤파린은 각각 단층 리포좀(UL) 내에 캡슐화되었다.

Claims (17)

  1. 친수성 공간을 둘러싸는 하나의 지질 이중층을 갖는 단층 리포좀(unilamellar liposome, UL)으로서, UL은
    (i) 지질 이중층을 형성하는 적어도 하나의 소수성 화합물; 및
    (ii) 프로필렌 글리콜 또는 글리세린
    을 포함하고,
    친수성 공간은 친수성 용매 중에 용해된 핵산 또는 핵산 유도체를 포함하고,
    적어도 하나의 소수성 화합물은 극성 및 비극성 영역을 둘 모두 함유하는 양친매성 지질 화합물을 의미하고,
    지질 이중층을 형성하는 적어도 하나의 소수성 화합물과 프로필렌 글리콜 또는 글리세린의 중량비는 2:1 내지 1:1의 범위이고,
    친수성 용매 중의 핵산 또는 핵산 유도체의 농도는 20℃ 및 101 kPa에서 친수성 용매 중의 핵산 또는 핵산 유도체의 포화 농도의 적어도 80%인 단층 리포좀(UL).
  2. 제1항에 있어서, 지질 이중층을 형성하는 적어도 하나의 소수성 화합물과 핵산 또는 핵산 유도체의 중량비는 100:1 내지 1:3, 50:1 내지 1:2, 또는 25:1 내지 1:1의 범위인 단층 리포좀(UL).
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, UL은 적어도 하나의 소수성 화합물을 UL의 15 내지 40 중량%, 20 내지 40 중량%, 16 내지 39 중량%, 17 내지 38 중량%, 18 내지 37 중량%, 19 내지 35 중량%, 20 내지 30 중량%, 21 내지 25 중량%, 또는 22 내지 24 중량%의 양으로 포함하는 단층 리포좀(UL).
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 핵산 유도체는 1000 Da 내지 300 kDa, 1500 Da 내지 300 kDa, 2 kDa 내지 280 kDa, 5 kDa 내지 250 kDa, 10 kDa 내지 200 kDa, 또는 50 kDa 내지 200 kDa의 분자량을 갖는 단층 리포좀(UL).
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 핵산 유도체의 포화 농도는 친수성 용매 1000 ml당 1 g 내지 200 g의 범위인 단층 리포좀(UL).
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 친수성 용매는 물, 수성 완충액, 수성 염 용액, 수성 단당류 또는 이당류 용액 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단층 리포좀(UL).
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 UL을 포함하는 액체 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 하기 특성 중 적어도 하나를 보유하는 액체 조성물:
    (i) 5.0 내지 7.5, 6.0 내지 7.4, 또는 7.0 내지 7.2 범위의 pH;
    (ii) 30 mOsm 내지 400 mOsm, 40 mOsm 내지 300 mOsm, 또는 50 mOsm 내지 200 mOsm 범위의 오스몰농도(osmolarity);
    (iii) 10-5 내지 1의 소수성 화합물에 대한 핵산 또는 핵산 유도체의 전체 몰 비.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 적어도 하나의 부형제, 완충제, 삼투 활성제, 1가 염, 당, 염화나트륨, 또는 수크로즈, 방부제, 항산화제 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 액체 조성물.
  10. UL 내에 핵산 또는 핵산 유도체를 캡슐화시키는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계:
    (a) 프로필렌 글리콜 및 글리세린으로부터 선택된 다가 알콜 및 적어도 하나의 소수성 화합물을 포함하는 지질 용액을 제공하는 단계;
    (b) 핵산 또는 핵산 유도체를 포함하는 수성 상을 제공하는 단계;
    (c) 단계 (a)의 지질 용액과 단계 (b)의 수성 상을 혼합하여 수화된 지질 용액을 제조하는 단계로서, 다가 알콜이 단계 (c)의 수화된 지질 용액 내에 상기 수화된 지질 용액의 5 내지 30 중량%의 농도로 포함되는 단계; 및
    (d) 단계 (c)의 수화된 지질 용액을 80℃ 미만의 온도에서 압출시키는 단계
    를 포함하고,
    적어도 하나의 소수성 화합물은 극성 및 비극성 영역을 둘 모두 함유하는 양친매성 지질 화합물을 의미하고,
    적어도 하나의 소수성 화합물은 UL의 균질한 집단(population)을 형성하고, 및
    상기 UL은 수성 상의 총 용적의 50% 초과를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 핵산 또는 핵산 유도체는 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%; 또는 적어도 99%로부터 선택된 캡슐화 효율로 UL 내에 캡슐화되는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 단계 (c)의 수화된 지질 용액 중의 적어도 하나의 소수성 화합물의 전체 농도는 상기 수화된 지질 용액의 15 내지 40 중량%, 16 내지 39 중량%, 17 내지 38 중량%, 18 내지 37 중량%, 19 내지 35 중량%, 20 내지 30 중량%, 21 내지 25 중량%, 또는 22 내지 24 중량%, 또는 상기 수화된 지질 용액의 20 내지 40 중량%인 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 소수성 화합물은 인지질, 스핑고지질, 스테롤, 포스파티딜콜린 또는 정제된 대두 포스파티딜콜린으로부터 선택되는 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 수성 상의 pH를 6.0 내지 7.5, 6.0 내지 7.4, 또는 7.0 내지 7.2 범위 내의 pH로 조정하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 프로필렌 글리콜 및 글리세린으로부터 선택된 다가 알콜이 단계 (d)로부터 생성된 압출 수화된 지질 용액으로부터 제거되거나, 또는 상기 다가 알콜이 한외여과에 의해 상기 압출 수화된 지질 용액으로부터 제거되는 추가 단계 (e)를 포함하는 방법.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 단층 리포좀(UL).
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 UL을 포함하는, 암 또는 빈혈 치료용 조성물.
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