KR20230004579A - 2 이상의 글리코사미노글리칸에 기초한 조성물 - Google Patents

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프란시스코 부르돈
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티옥산 에스.에이
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Abstract

2 이상의 글리코사미노글리칸에 기초한 조성물
본 발명은 가교된 히알루론산과, 히알루론산 전체 질량에 대하여 30 내지 70 질량%의 수용성 히알루론산을 포함하는 히알루론산계 수성 겔에 관한 것이다. 본 발명은 적어도 하나의 가교된 히알루론산 및 적어도 하나의 비가교된 히알루론산을 포함하는 수성 겔의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 수득가능한 수성 겔, 조성물, 상기 수성 겔을 포함하는 화장료 및/또는 피부과 조성물, 및 상기 수성 겔 또는 상기 조성물을 포함하는 사전충전된 주사기를 포함하는 키트에 관한 것이다. 이들 겔 및 조성물은 특히 피부의 표면 외관의 변화를 치료하고/하거나 연조직을 증대 및/또는 충전하는데 유용하다.

Description

2 이상의 글리코사미노글리칸에 기초한 조성물
본 발명은 적어도 가교된 히알루론산 및 하나 이상의 수용성 히알루론산을 포함하는 히알루론산계 수성 겔에 관한 것이다. 본 발명은 또한 연질(soft)의, 안정적인, 멸균 및 주입 가능한 글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산에 기초한 보충(supplemented) 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이렇게 수득된 수성 겔 및 조성물은 적어도 하나의 가교된 글리코사미노글리칸, 특히 적어도 하나의 히알루론산을 포함하는 2 이상의 글리코사미노글리칸을 포함하고, 비가교된 고몰질량(high-molar-mass) 글리코사미노글리칸 및 적어도 하나의 비가교된 저몰질량(low-molar-mass) 글리코사미노글리칸으로부터 제조된 것이고, 특히 적어도 하나의 비가교된 고몰질량 히알루론산 및 적어도 하나의 비가교된 저몰질량 히알루론산으로부터 제조된다.
글리코사미노글리칸과 같은 다당류(polysaccharides)는 생물의학 분야에서 널리 사용된다. 특히, 미용(aesthetic) 및/또는 화장(cosmetic) 용도로 판매되는 대부분의 제품은 히알루론산을 기초로 한다.
피부의 질을 향상시키기 위해 개질되지 않은 히알루론산 겔은 완벽하게 생체 적합하다는 장점이 있기 때문에 매력적이다. 그러나 생체 내 이식 후에는 매우 빠르게 분해된다. 따라서 이러한 겔의 효과는 지속 시간이 짧다.
생체 내 지속성과 분해 저항성을 높이기 위해 히알루론산은 일반적으로 가교에 의해 개질된다. 가교된 히알루론산 겔은 다양한 제조 공정을 통해 얻어질 수 있다. 히알루론산과 같은 다당류는 에폭시 제제(epoxy agents), 글루타르알데히드와 같은 알데히드류, 디비닐 설폰(DVS) 또는 폴리아민과 같은 다양한 가교제로 가교될 수 있다. 현재, 히알루론산을 가교하기 위해 사용되는 가장 일반적인 제제는 에폭시 제제인 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE)이다.
이러한 가교 공정은 두 가지 주요 단계, 즉 다당류의 수화(hydration) 및 가교를 필요로 한다.
이렇게 제조된 히알루론산을 기반으로 하는 시판 제품은 일반적으로, 그리고 그것들의 지시(indication)에 따라, 가교된 히알루론산 일부를 포함하고 개질도(modification degree)는 1% 내지 10% 범위이다.
그럼에도 불구하고, 히알루론산의 가교결합의 증가는 더 화학적으로 개질된 겔의 제조를 초래하고, 따라서 잠재적으로 덜 생체적합성이 된다. 다른 한편으로, 이러한 조성물의 기계적 성능은 제한적이며 결과적으로 매우 탄력성 있는 및/또는 부서지기 쉬운 최종 제품을 생성한다.
그러나, 제품 안전성 및 성능의 이유로, 가능한 천연으로, 그리고 거의 개질되지 않고, 따라서 거의 가교결합되지 않은 생체적합성 다당류를 포함하는 생체내 지속성을 갖는 조성물에 대한 관심이 있다.
가교도 외에도, 사용된 글리코사미노글리칸의 농도는 조성물의 기계적 및 저항 특성을 결정하는 핵심 매개변수(key parameter)이다. 따라서, 다당류 기반 조성물의 생체내 지속성 및 분해 저항성을 증가시키기 위한 대안은 최종 조성물에서 이의 총 농도를 증가시키는 것이다.
그러나, 저항성 및 지속성을 증가시키는 것 외에도, 상기 글리코사미노글리칸의 총 농도의 증가는 조성물의 점도를 상당히 증가시키는 것과 함께, 조성물을 되직하게(thickening) 한다. 따라서 이러한 점도 증가는 겔을 주입(주사; injection)하기 어렵게 만들고 조직에 자연적으로 통합할 수 없게 만든다. 특히 히알루론산 총 농도의 증가가 주입 후 구진(post-injection papules) 발생의 원인으로 알려져 있다.
따라서, 이러한 모든 이유로 현재까지 시판되는 대부분의 가교된 히알루론산 제품은 단지 약 25 또는 26 mg/g의 히알루론산 총 농도를 갖는다. 그러나, 이러한 겔은 잠재적으로 진피 충전 용도에 유용할 수 있지만, 기계적 충전이 추구되는 주요 효과가 아니며 피부의 표면 영역에 주입이 필요한 피부 재생 및 개선의 피부 용도에는 적합하지 않다. 후자 유형의 주입의 경우, 탄성(G') 및 점성(G") 계수가 더 낮고, 즉 부드럽고 주입하기 쉽고 조직으로 쉽게 확산되는 겔을 준비하는 것이 실제로 바람직하다.
히알루론산과 같은 글리코사미노글리칸을 기초로 하는 제품의 저항성 및 지속성을 증가시키는 이러한 맥락에서, 히알루론산에 대해 보호 특성을 갖는 다양한 화합물을 첨가하는 것이 또한 제안되었다. 따라서, 열에 의한 히알루론산의 분해에 대해, 출원 WO2014/032804는 마그네슘 아스코르빌 포스페이트의 첨가를 제안하고, 출원 WO2013/186493은 수크로스 옥타설페이트의 첨가를 제안하고, 출원 WO2007/077399는 글리세롤의 첨가를 제안한다. 그러나 이러한 유형의 안정화 화합물을 첨가하면 제품의 생체 적합성과 관련된 불확실성이 증가한다.
결과적으로, 부드럽고, 주입하기 쉽고, 조직 내로 쉽게 확산되며, 충분히 지속성이 있고, 피부 재생 및/또는 피부 외양 개선에 효과적인, 글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산을 기초로 하는 멸균 겔에 대한 요구가 남아 있다.
특히, 종래 기술의 문제점을 극복하기 위해 히알루론산과 같은 글리코사미노글리칸에 기초한 조성물의 저항성 및 지속성을 증가시킬 필요가 남아 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키기 위해 제안한다.
일 측면에 따르면, 본 발명은 가교된 히알루론산을 포함하는 히알루론산계 수성 겔에 관한 것으로서, 상기 겔은 적어도 다음을 포함하고:
히알루론산의 총 질량에 대해 30 질량% 내지 70 질량%의 양의, 0.02 MDa 내지 0.30 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량(mass-average molar mass)을 갖는 수용성 히알루론산(“LMW”및 선택적으로, 0.30 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는 수용성 히알루론산("sHA HMW"),
상기 수용성 히알루론산들은 5% 이하, 우선적으로는 3% 이하, 보다 우선적으로는 1% 이하의 개질도를 가지고, 상기 수용성 히알루론산들의 각각의 백분율은 다음에 의해 결정된다:
상기 수성 겔을 0.02%의 NaN3를 함유하는 150 nM 질산나트륨의 pH 7.2 용액 내에서 25 °C에서 5일 동안 희석하고, 상기 희석된 수성 겔을 4400rpm에서 10분 동안 원심분리하고 0.45 mm에서 여과하여 여과액(filtrate)를 얻은 후, 상기 여과액을 다각도 광산란(MALS) 검출기 및 굴절율 증분(dn/dc)이 0.165 ml/g으로 설정된 굴절율(RI) 검출기가 장착된 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 기기로 분석하고, 상기 여과액을 0.3 mL/min의 유속에서 pH 7.2의 질산나트륨을 이동상으로 하며, 0.001 Da 내지 20 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 분자에 적합한 크기 배제 컬럼의 이중 세트가 장착된 액체 크로마토그래피 펌핑 스테이션(liquid chromatography pumping station)으로 분석한다.
본 명세서는 하나 이상의 가교된 글리코사미노글리칸 및 하나 이상의 비가교된 글리코사미노글리칸을 포함하는 수성 겔의 제조 방법을 기술하며, 상기 방법은 적어도 다음 단계:
a) 0.50 MDa 이상, 우선적으로는 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로는 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 몰 질량을 갖는 비가교된 글리코사미노글리칸 및 가교제로부터 형성되며, "가교된 글리코사미노글리칸 HMW"로 칭한, 가교된 글리코사미노글리칸을 하나 이상 포함하는 수용액을 만드는 단계;
b) 0.04 MDa 내지 0.30 MDa, 우선적으로는 0.08 MDa 내지 0.20 Mda, 보다 우선적으로는 0.08 MDa 내지 0.15 MDa 범위의 몰질량을 가지며, “비가교된 글리코사미노글리칸 LMW”로 칭한, 비가교된 글리코사미노글리칸을 하나 이상 포함하는 수용액을 만드는 단계; 및
c) a) 및 b) 단계의 상기 수용액의 전부 또는 일부의 균질한 혼합물을 형성하는 단계;로 구성된다.
두번째 측면에 따르면, 본 발명은 하나 이상의 가교된 히알루론산 및 하나 이상의 비가교된 히알루론산을 포함하는 수성 겔의 제조 방법에 관한 것으로서 적어도 다음 단계:
a) 0.50 MDa 이상, 우선적으로는 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로는 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성되며, "가교된 HA HMW"로 칭한, 가교된 히알루론산을 하나 이상 포함하는 수용액을 만드는 단계;
b) 0.04 MDa 내지 0.30 MDa, 우선적으로는 0.08 MDa 내지 0.20 Mda, 보다 우선적으로는 0.08 MDa 내지 0.15 MDa 범위의 질량 평균 몰질량을 가지며, “비가교된 HA LMW”로 칭한, 비가교된 히알루론산을 하나 이상 포함하는 수용액을 만드는 단계; 및
c) a) 및 b) 단계의 상기 수용액의 전부 또는 일부의 균질한 혼합물을 형성하는 단계;로 구성되고
상기 제조 방법은 "비가교된 HA LMW" 대 "HA HMW"의 질량비가 1:3 내지 2:1인 히알루론산의 사용을 포함하는 것을 특징으로 한다.
뜻밖에도, 본 발명자들은 적어도 하나의 비가교된 고몰질량 글리코사미노글리칸으로부터 제조된 적어도 하나의 가교된 글리코사미노글리칸을 포함하는 조성물에 적어도 하나의 비가교된 저몰질량 글리코사미노글리칸을 보충하는 것, 특히 적어도 하나의 비가교된 고몰질량 히알루론산으로부터 제조된 적어도 하나의 가교된 히알루론산을 포함하는 조성물에 적어도 하나의 비가교된 저몰질량 글리코사미노글리칸을 보충하는 것은 최종 조성물의 저항성을 증폭시키는 것을 발견하였다.
하기 실시예들에서 나타낸 것과 같이 결과는 다음과 같다:
비가교된 저몰질량 글리코사미노글리칸의 첨가가 없는, 더 구체적으로는 비가교된 저몰질량 히알루론산의 첨가가 없는 동일한 조성물에 비해 개선된 분해 저항성; 및
글리코사미노글리칸의, 더 구체적으로는 히알루론산의 총 농도가 동일하며, 가교된 글리코사미노글리칸 부분(fraction), 더 구체적으로는 가교된 히알루론산 부분의 가교도가 동일한 조성물에 비해 우수한 분해 저항성
이러한 개선된 분해 저항성으로 인해, 본 발명에 따른 조성물은 열 멸균(heat sterilization)에 대해 더 큰 저항성을 갖는다. 따라서, 한 조성물은 본 발명에 따른 것이고 다른 하나의 조성물은 선행 기술의 교시에 따라 제조된 것인, 멸균 이전의 유사한 유변학적 특성을 갖는 2개의 멸균 및 주입가능한 조성물 사이에서, 전자는 후자의 것보다 멸균이후 유변학적 특성이 우수하다.
조성물들의 증가된 분해 저항성 덕분에, 본 발명에 따른 조성물은 유리하게도 특히 수송 및 저장 동안의 가변 온도를 견딜 수 있다.
또한, 하나 이상의 비가교된 저몰질량 글리코사미노글리칸, 특히 하나 이상의 비가교된 저몰질량 히알루론산을 보충하는 것은 총 글리코사미노글리칸 농도가 증가된 것인, 따라서 피부 생리학에 관한 하나 이상의 중요한(significant) 생체역학적 및/또는 생물학적(biological) 효과를 갖는 것인 연질(soft)의, 주입이 용이한, 및 조직에 쉽게 확산되는 조성물의 제조를 가능하게 한다.
게다가, 본 발명에 따라 제조된 조성물의 사용은 치료 부위에서 글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산의 생리학적 효과의 다양화(diversification)에 도움이 되는 상이한 몰질량을 갖는 글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산의 동시 투여(simultaneous administration)를 허용한다.
세번째 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 따라 얻어질 수 있는 글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산의 수성 겔에 관한 것이다.
네번째 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 수성 겔을 포함하는 화장료 및/또는 피부과 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 따라 얻어지는 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 피부의 점탄성 또는 생체역학적 특성의 변화의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 수성 겔 또는 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 예를 들어 스트레스, 대기 오염, 담배 또는 자외선(UV)에 대한 장기간 노출과 같은 외부 요인에 의해 유발되는 것인 피부 표면 외관의 변화의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 수성 겔 또는 본 발명에 따른 피부과 조성물에 관한 것이다.
우선적으로, 본 발명은 연조직의 증대 및/또는 충전에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 수성 겔 또는 본 발명에 따른 피부과 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 예를 들어 시간적 노화에 대한 피부 징후인 것인 피부 표면 외관의 변화의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 수성 겔 또는 본 발명에 따른 화장료 조성물의 비치료적 화장 용도에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 연조직의 증대 및/또는 충전을 위한, 특히 주름을 채우기 위한 본 발명에 따른 수성 겔 또는 본 발명에 따른 화장료 조성물의 비치료적 화장 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 열 멸균(heat sterilization)에 대해 더 큰 저항성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 멸균이후 유변학적 특성이 우수하다.조성물들의 증가된 분해 저항성 덕분에, 본 발명에 따른 조성물은 유리하게도 특히 수송 및 저장 동안의 가변 온도를 견딜 수 있다.
또한, 하나 이상의 비가교된 저몰질량 글리코사미노글리칸, 특히 하나 이상의 비가교된 저몰질량 히알루론산을 보충하는 것은 총 글리코사미노글리칸 농도가 증가된 것인, 따라서 피부 생리학에 관한 하나 이상의 중요한(significant) 생체역학적 및/또는 생물학적(biological) 효과를 갖는 것인 연질(soft)의, 주입이 용이한, 및 조직에 쉽게 확산되는 조성물의 제조를 가능하게 한다.
게다가, 본 발명에 따라 제조된 조성물의 사용은 치료 부위에서 글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산의 생리학적 효과의 다양화(diversification)에 도움이 되는 상이한 몰질량을 갖는 글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산의 동시 투여(simultaneous administration)를 허용한다.
또한 본 발명은, 예를 들어 시간적 노화에 대한 피부 징후인 것인 피부 표면 외관의 변화의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 수성 겔 또는 본 발명에 따른 화장료 조성물의 비치료적 화장 용도에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 연조직의 증대 및/또는 충전을 위한, 특히 주름을 채우기 위한 본 발명에 따른 수성 겔 또는 본 발명에 따른 화장료 조성물의 비치료적 화장 용도에 관한 것이다.
도 1은 시료 1-1 내지 시료 1-3 에서의 오토클레이브 멸균시의 탄성계수(G')의 손실률(ΔG′비가교된 저몰질량 히알루론산의 농도 및 가교된 고몰질량 히알루론산과 비가교된 고몰질량 히알루론산의 총 농도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 비가교된 히알루론산이 첨가되지 않은 시료 3-5 및 각각 0.04 MDa, 0.10MDa, 0.20 MDa 및 1.50 MDa의 몰질량을 갖는 비가교된 히알루론산이 첨가된 시료 3-6 내지 시료 3-9에서의 오토클레이브 멸균시의 탄성계수(G')의 손실률(ΔG′을 나타낸 그래프이다.
도 3은 비가교된 히알루론산이 첨가되지 않은 시료 3-5 및 각각 0.04 MDa, 0.10MDa, 0.20 MDa 및 1.50 MDa의 몰질량을 갖는 비가교된 히알루론산이 첨가된 시료 3-6 내지 시료 3-9에서의 오토클레이브 멸균시의 탄성계수(G')의 손실률의 개선률을 나타낸 그래프이다.
도 4는 시료 4-1(보충되지 않음) 및 시료 4-2 내지 시료 4-4에서의 오토클레이브 멸균시의 탄성계수(G')의 손실률(ΔG′비가교된 저몰질량 히알루론산의 농도 및 가교된 고몰질량 히알루론산과 비가교된 고몰질량 히알루론산의 총 농도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 비가교된 히알루론산이 첨가되지 않은 시료 6-1, 각각 0.10 MDa 및 1.50 MDa의 몰질량을갖는 비가교된 히알루론산이 첨가된 시료 6-2 및 시료 6-3에서의 히알루로디나제(hyaluronidase) 처리 전과 후의 탄성계수(G')의 차이(ΔG′를 나타낸 그래프이다.
본 명세서에서 사용된 용어들은 다음과 같이 정의된다:
- "글리코사미노글리칸"은 두 탄수화물 잔기 중 하나가 아미노 탄수화물(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)이고 두 번째 잔기가 우론산(글루쿠론산 또는 이두론산) 또는 갈락토스인 이당류의 반복 단위로 구성된 긴 사슬로 정의된다. 글리코사미노글리칸에는 히알루론산, 헤파로산, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트 및 케라탄 설페이트가 포함된다. 특히 바람직한 글리코사미노글리칸은 히알루론산이다.
- "히알루론산"이라 함은 히알루론산(hyaluronic acid 또는 hyaluronan) 및 그 유도체를 의미한다. 결과적으로, 용어 "히알루론산"은 또한, 예를 들어 산화, 환원, 탈아세틸화, 황산화 또는 아미드화에 의해 화학적으로 개질된 히알루론산 및 히알루론산 나트륨과 같은 히알루론산 염을 포함한다. 히알루론산은 교대하는 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-글루코사민 단위가 β글리코시드 결합과 β글리코시드 결합에 의해 교대로 연결된 선형 다당류이다.
Figure pct00001
이는 인체의 여러 조직에 자연적으로 존재하며 체내에도 존재하는 효소인, 히알루로니다제 및/또는 산화 메커니즘을 통해 분해된다.
- "수용성 히알루론산" 또는 "가용성 히알루론산" 또는 "추출형 히알루론산", 또는 "sHA"는 히알루론산을 기초로 하는 겔을 과량의 수성 매체에서 팽윤시킬 때 그로부터 추출할 수 있는 히알루론산을 의미한다.
가용성 히알루론산의 각각의 백분율은 수성 겔을 0.02% NaN3를 함유하는 150 nM 질산나트륨의 pH 7.2 용액 내에서 25°C에서 5일 동안 희석하고, 이를 4400rpm에서 10분 동안 원심분리하고 0.45 mm에서 여과하여 여과액(filtrate)를 얻은 다음, 여과액을 다각도 광산란(MALS) 검출기 및 굴절율 증분(dn/dc)이 0.165 ml/g으로 설정된 굴절율(RI) 검출기가 장착된 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC) 기기로 분석하고, 여과액을 0.3 mL/min의 유속에서 pH 7.2의 질산나트륨을 이동상으로 하며, 0.001 Da 내지 20 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 분자에 적합한 크기 배제 컬럼의 이중 세트가 장착된 액체 크로마토그래피 펌핑 스테이션(liquid chromatography pumping station)으로 분석한다.
실제로, 희석 단계를 위한 이동상에서의 겔 농도 및 SEC에 주입되는 부피는 신호 대 브루즈(signal-to-bruise) 비율을 최대화하고 컬럼 과부하(overload)를 피하기 위해서 당업자에 의해 상층액 조성물의 함수로서 당업자에 의해 적절하게 조정된다.
반대로, "비수용성 히알루론산" 또는 "비가용성 히알루론산" 또는 "비추출형 히알루론산", 또는 "nsHA"는 히알루론산을 기초로 하는 겔을 과량의 수성 매체에서 팽윤시킬 때 그로부터 추출할 수 없는 히알루론산을 의미한다.
- g/mol 또는 Da으로 표시되고 Mw로 약칭되는, 글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산의 "질량 평균 몰 질량"은 사용된 글리코사미노글리칸 분자의 질량 평균 몰 질량을 나타낸다. 글리코사미노글리칸의 질량-평균 몰 질량은 모세관 전기영동(capillary electrophoresis), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 또는 고유 점도(intrinsic viscosity)의 측정과 같은 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에서, "몰 질량", "평균 몰 질량", "질량 평균 몰 질량" 또는 "질량 몰 질량"이라는 표현은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
- mL/g 또는 m3/kg으로 표시되는, 글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산의 "고유 점도"([η])는 용액 점도에 대한 글리코사미노글리칸의 기여도를 나타낸다. 이는 모세관 점도계를 통한 흐름에 의해 측정될 수 있다. 이는 중합체가 유체역학적으로 단위 무게 당 차지하는 부피(hydrodynamic specific volume)를 나타낸다. 글리코사미노글리칸의 고유 점도가 낮을수록 몰 질량이 낮다. 주어진 글리코사미노글리칸의 경우 고유 점도는 경험적 관계식인 Mark-Houwink 관계식에 의해 몰 질량과 관련되고, 이는 당업자라면 이해할 수 있으며 그 공식은 다음과 같다.
Figure pct00002
상기 식에서:
- K 는 분석되는 중합체, 사용된 용매 및 온도의 상수 함수(constant function)이다. 특히, K 는 분석되는 중합체의 사슬의 치수(dimension)와 관련이 있다.
- α는 분석되는 중합체, 사용된 용매 및 온도의 상수 함수이다. 특히, α는 분석되는 중합체의 형태(conformation)와 관련이 있다.
- Mw는 달톤(Da)으로 표시되는, 중합체의 질량 평균 몰 질량이다.
- "저몰질량 글리코사미노글리칸"은 "글리코사미노글리칸 LMW" 또는 "LMW 글리코사미노글리칸"이라고도 하며, 질량 평균 몰 질량이 0.04 MDa 내지 0.30 MDa, 우선적으로 0.08 MDa 내지 0.20 MDa, 보다 우선적으로 0.08 MDa 내지 0.15 MDa, 더욱 보다 우선적으로 0.08 MDa 내지 0.10 MDa인 원료(raw material)로서 글리코사미노글리칸을 의미한다.
- "저몰질량 히알루론산"은 "히알루론산 LMW" 또는 "HA LMW" 또는 "LMW 히알루론산" 또는 "LMW HA"라고도 하며, 질량 평균 몰 질량이 0.04 MDa 내지 0.30 MDa, 우선적으로 0.08 MDa 내지 0.20 MDa, 보다 우선적으로 0.08 MDa 내지 0.15 MDa인, 이는 낮은 고유 점도, 즉 유럽약전(European Pharmacopoeia) (01판/2017:1472)에 표시된 방법에 따라 측정된 고유 점도 0.10 내지 0.8 m3/kg, 우선적으로 0.2 내지 0.5 m3/kg, 보다 우선적으로 0.2 내지 0.4 m3/kg에 해당하는, 원료로서 히알루론산을 의미한다.
- "저몰질량 수용성 히알루론산" 또는 "저몰질량 가용성 히알루론산"는 "sHA LMW" 또는 "LMW sHA"라고도 하며, 청구항 제1항에서 기재된 방법에 따라, 다시 말하자면 수성 겔을 0.02%의 NaN3를 함유하는 150 nM 질산나트륨의 pH 7.2 용액 내에서 25 °C에서 5일 동안 희석하고 희석된 수성 겔을 4400rpm에서 10분 동안 원심분리하고 0.45 mm에서 여과하여 여과액를 얻은 후, 상기 여과액을 다각도 광산란(MALS) 검출기 및 굴절율 증분(dn/dc)이 0.165 ml/g으로 설정된 굴절율(RI) 검출기가 장착된 크기 배제 크로마토그래피 기기로 분석하고, 상기 여과액을 0.3 mL/min의 유속에서 pH 7.2의 질산나트륨을 이동상으로 하며, 0.001 Da 내지 20 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 분자에 적합한 크기 배제 컬럼의 이중 세트가 장착된 액체 크로마토그래피 펌핑 스테이션으로 분석하여, 최종 겔에 대해 측정한 몰질량이 0.02 MDa 내지 0.30 MDa, 우선적으로는 0.04 MDa 내지 0.20 MDa, 보다 우선적으로는 0.04 MDa 내지 0.15 MDa인 가용성의 히알루론산을 의미한다. 실제로, 희석 단계를 위한 이동상에서의 겔 농도 및 SEC에 주입되는 부피는 신호 대 브루즈 비율을 최대화하고 컬럼 과부하를 피하기 위해서 당업자에 의해 상층액 조성물의 함수로서 당업자에 의해 적절하게 조정된다.
- "고몰질량 글리코사미노글리칸"은 "글리코사미노글리칸 HMW" 또는 "HMW 글리코사미노글리칸"이라고도 하며, 몰 질량이 0.50 MDa 초과, 바람직하게는 1.00 MDa 초과, 보다 바람직하게는 1.00 MDa 내지 4.00MDa인 원료로서 글리코사미노글리칸을 의미한다,
- "고몰질량 히알루론산"은 "히알루론산 HMW" 또는 "HA HMW" 또는 "HMW 히알루론산" 또는 "HMW HA"라고도 하며, 몰질량이 0.50 MDa 초과, 우선적으로 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로 1.00 MDa 내지 4.00 MDa인 원료로서 히알루론산을 의미하며, 이는 높은 고유 점도, 즉 유럽약전(European Pharmacopoeia) (01판/2017:1472)에 표시된 방법에 따라 측정된 고유 점도가 0.8 m3/kg 초과, 바람직하게는 1.2 m3/kg 초과, 보다 바람직하게는 1.2 m3/kg 내지 3.5 m3/kg인 히알루론산에 해당한다.
- "고몰질량 가용성 히알루론산" 또는 "고몰질량 수용성 히알루론산"은 "sHA HMW" 또는 "HMW sHA"라고도 하며, 하며, 청구항 제1항에서 기재된 방법에 따라, 다시 말하자면 수성 겔을 0.02%의 NaN3를 함유하는 150 nM 질산나트륨의 pH 7.2 용액 내에서 25 °C에서 5일 동안 희석하고 희석된 수성 겔을 4400rpm에서 10분 동안 원심분리하고 0.45 mm에서 여과하여 여과액을 얻은 후, 상기 여과액을 다각도 광산란(MALS) 검출기 및 굴절율 증분(dn/dc)이 0.165 ml/g으로 설정된 굴절율(RI) 검출기가 장착된 크기 배제 크로마토그래피 기기로 분석하고, 상기 여과액을 0.3 mL/min의 유속에서 pH 7.2의 질산나트륨을 이동상으로 하며, 0.001 Da 내지 20 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 분자에 적합한 크기 배제 컬럼의 이중 세트가 장착된 액체 크로마토그래피 펌핑 스테이션으로 분석하여 최종 겔에 대해 측정한 몰질량이 0.30 MDa 초과, 우선적으로는 0.30 MDa 초과 4.00 MDa 이하인 가용성 히알루론산을 의미한다. 실제로, 희석 단계를 위한 이동상에서의 겔 농도 및 SEC에 주입되는 부피는 신호 대 브루즈 비율을 최대화하고 컬럼 과부하를 피하기 위해서 당업자에 의해 상층액 조성물의 함수로서 당업자에 의해 적절하게 조정된다.
- "가교된 글리코사미노글리칸"은 가교 반응 동안에 가교제로 개질된 글리코사미노글리칸을 의미한다. 반대로, "비가교된 글리코사미노글리칸"은 가교제로 개질되지 않아 가교 반응을 겪지 않은 글리코사미노글리칸을 의미한다.
- 본 명세서에서, ≪비가교된≫ 및 ≪가교되지 않은≫은 동의어이며 상호교환적으로 사용될 수 있다.
- "글리코사미노글리칸 HMW" 또는 "HMW 글리코사미노글리칸"이라는 표현은 "가교된 글리코사미노글리칸 HMW" 성분 및 수성 겔에 존재하는 경우, "비가교된 글리코사미노글리칸 HMW" 성분을 의미한다.
- "히알루론산 HMW"은 "HA HMW" 또는 "HMW HA"라고도 하며, "가교된 히알루론산 HMW"("가교된 HA HMW" 또는 "가교된 HMW HA"라고도 함) 성분 및, 해당되는 경우, 수성 겔에 존재하는 경우 "비가교된 히알루론산 HMW"("비가교된 HA HMW" 또는 "비-가교 HMW HA"라고도 함) 성분을 의미한다.
- "가교된 글리코사미노글리칸", 특히 "가교된 히알루론산"의 제조 동안 적용되는 "가교도"는 가교제의 질량(또는 중량)과 상기 가교된 글리코사미노글리칸, 특히 상기 가교된 히알루론산 제조에 사용되는 글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산의 질량 사이의 비율에 해당한다. 이는 백분율로 표시된다.
- 가교된 글리코사미노글리칸 및 이러한 가교된 글리코사미노글리칸을 포함하는 조성물, 특히 가교된 히알루론산 및 이러한 가교된 히알루론산을 포함하는 조성물은 그들의 "개질도"(modification degree; MOD)에 의해 한정될 수 있다. 이러한 개질도는 상기 글리코사미노글리칸의 하나 이상의 말단에 연결된 개질제(modifying agent)의 몰량에 해당하며, 조성물 내 글리코사미노글리칸의 이당류 반복단위 100 몰당, 특히 조성물 내 히알루론산의 이당류 반복단위 100몰당 몰량으로 표시된다. 이 개질도를 결정하기 위한 기준 방법(reference method)은 핵 자기 공명 분광법(1H NMR)이다. 상기 개질도는 글리코사미노글리칸 이당류 단위 신호(글리코사미노글리칸은 가교결합된 것 또는 가교결합되지 않은 것임)에 대한 가교제 신호의 몰비에 의해 결정된다.
- "가교된 고몰질량(HMW) 글리코사미노글리칸" 또는 "가교된 고몰질량(HMW) 글리코사미노글리칸"은 비가교된 고몰질량 글리코사미노글리칸으로부터 제조된 가교된 글리코사미노글리칸을 의미한다. 우선적으로는, 가교된 HMW 글리코사미노글리칸은 8% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 보다 바람직하게는 2% 이하의 가교도를 갖는다.
- "가교된 고몰질량(HMW) 히알루론산" 은 가교되지 않은 고몰질량 히알루론산으로부터 제조된 가교된 히알루론산을 의미한다. 바람직하게는, 가교된 HMW 히알루론산은 8% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 보다 바람직하게는 2% 이하의 가교도를 갖는다.
- "피부 생리학에 관한 글리코사미노글리칸의 생체역학적 및 생물학적 특성"에는 특히 수화(hydration) 및 섬유아세포(fibroblast) 활성화가 포함된다. 예를 들어, 이 생체역학 및 생물학적 특성으로 인해, 히알루론산은 피부 재구축(restructuring), 재생(regeneration) 및/또는 회춘(rejuvenation)에 관여한다.
- 조성물의 "보충"은 이 조성물에 하나 이상의 비가교된 저몰질량 글리코사미노글리칸을 첨가하는 것을 나타낸다. 우선적으로는, 보충은 하나 이상의 비가교된 저몰질량 히알루론산을 조성물에 첨가하는 것에 해당한다.
- "총 글리코사미노글리칸 농도"는 가교결합된 고몰질량 글리코사미노글리칸의 및 선택적으로 가교결합되지 않은 고몰질량 글리코사미노글리칸의 농도와 보충에 사용되는 글리코사미노글리칸의 농도의 합을 의미한다. 이 농도는 겔 그램당 글리코사미노글리칸 밀리그램으로 표시된다.
- "총 히알루론산 농도"는 가교결합된 고몰질량 히알루론산 및 선택적으로 가교결합되지 않은 고몰질량 히알루론산의 농도와 보충에 사용되는 히알루론산의 농도의 합을 의미한다. 이 농도는 겔 그램당 글리코사미노글리칸 밀리그램으로 표시된다.
- 용액의 색상, 시각적 외관 및 점도가 육안 및 촉각에 의해 균일한 것으로 인식될 때 용액은 "균질"한 것으로 간주된다.
- "수성 매체"는 용매로서 적어도 물을 함유하고 글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산을 용해시키는 성질을 갖는 모든 액체 매질을 의미한다.
- "가교제"는 서로 다른 글리코사미노글리칸 사슬 사이에 가교결합을 도입할 수 있는 모든 화합물을 의미한다. 본 발명의 실시에 적합한 가교제로서, 특히 이관능성 또는 다관능성 에폭시 또는 비-에폭시 가교제가 언급될 수 있다. 에폭시 제제 중에는 부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE), 디에폭시 옥탄, 1,2-비스(2,3-에폭시프로필)-2,3-에틸렌, 1,2-비스(2,3-에폭시프로필)-2,3-에밀렌 및 이들의 혼합물이 언급될 수 있다. 비-에폭시 제제 중에는 스페르민, 스페르미딘 및 푸트레신같은 내인성(endogenous) 폴리아민, 알데히드, 카르보디이미드 및 디비닐술폰이 언급될 수 있다.
- ≪수성 겔≫은 달리 명시되지 않은 경우 본 발명에 따른 방법으로 얻을 수 있는 수성 겔 또는 본 발명에 따른 수성 겔 모두를 의미한다.
- "연질 겔"이란 점탄성 분포가 적당한 탄성을 유지하는 겔, 즉 충분히 점성이 있는 겔로서 위상각(δ이 15° 내지 50° 이고 낮은 탄성 계수 G', 즉 1 Hz의 주파수에서 진동 응력 스윕(osillation stress sweep)을 적용한 원뿔/판 형상을 갖는 레오미터를 사용하여 실온에서 5 Pa의 응력에 대해 측정된 탄성계수 G'가 150 Pa 이하, 바람직하게는 20 내지 150 Pa인 것이고 외부 직경이 0.3 mm (30G) 이하이고 길이가 ½″인 바늘을 가지고 내부 직경이 6.3 mm 이상인 주사기에서 약 12.5 mm/min의 고정된 속도로 실온에서 측정된 압출력이 18 N 이하, 바람직하게는 15 N 미만인 것이다.
- "주입이 용이한"이란 외부 직경이 0.3 mm (30G) 이하이고 길이가 ½″인 바늘을 가지고 외부 직경이 6.3 mm 이상인 주사기에서 약 12.5 mm/min의 고정된 속도로 실온에서 동력계(dynamometer)로 측정된 평균 압출력이 18 N 미만, 바람직하게는 15 N 미만인 것이다.
- "조직에 쉽게 확산되는" 조성물 또는 겔은 피부 표면, 즉 상부 및 중간 진피에서 주입 후 구진의 형성을 촉진하지 않는, 피부 외관의 개선 및 재생을 위한 피부 적용 조성물을 의미한다.
- "생체내 지속성"은 주입 후 시간이 지남에 따라 겔이 치료 부위에 남아 있는 능력을 의미한다. 생체내 지속성 겔은 적어도 1개월, 우선적으로는 적어도 3개월, 보다 우선적으로는 적어도 6개월 동안 치료 부위에 남아 있을 수 있는 겔, 다시 말해 적용 후 적어도 1개월, 우선적으로는 적어도 3개월, 보다 우선적으로는 적어도 6개월 동안 전반적인 미용적 개선을 유지할 수 있는 겔, 다시 말해 적용 후 적어도 1개월, 우선적으로는 적어도 3개월, 보다 우선적으로는 적어도 6개월 동안 5개의 등급: 1. 매우 개선됨; 2. 개선됨; 3. 변경되지 않음 4. 저하됨; 5. 매우 저하됨; 을 포함하는 전반적인 미용적 개선의 주관적 평가 척도에서 적어도 1등급 또는 2등급의 개선을 유지할 수 있는 겔이다
- "안정성"이라는 용어는 적어도 1년 보관하는 동안 사양에 따라, 물리화학적 특성(색상, pH, 균질성, 탁도(turbidity), 유변학(rheology) 등)을 유지하는 조성물의 능력을 특정짓는다. 조성물의 안정성은 일반적으로 이의 물리화학적 매개변수 중 하나 이상, 특히 탄성 계수(G') 또는 점도(η)와 같은 유변학적 매개변수 중 하나 이상을 관찰 및/또는 측정함으로써 모니터링된다.
- "멸균 겔"이란 피부의 표피 부위, 다시 말해 상부 및 중간 진피 부위 내 또는 이를 통해 투여하기에 안전한 겔을 의미한다. 특히, 주입 기법에 의해 투여되는 겔에는 숙주 유기체에서 바람직하지 않은 2차 반응을 유발할 수 있는 오염 물질이 없어야 한다.
- 용어 "첨가제", "추가 성분" 및 "부형제"는 상호교환적으로 사용되며, 피부 내부 및/또는 피부 상에 적용할 수 있는 모든 성분을 나타낸다. 사용되는 첨가제의 양은 상기 성분의 성질, 원하는 효과, 및 본 발명에 따른 조성물의 용도에 따라 달라진다. 이 첨가제는 마취제, 항산화제, 아미노산, 비타민, 미네랄, 핵산, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 조효소, 아드레날린성 유도체, 인산이수소나트륨 일수화물 및/또는 이수화물 또는 염화나트륨 중 하나 또는 그 유도체 중 하나일 수 있다.
- "마취제"로서 암부카인, 아목세카인, 아밀레인, 아프리딘, 압토카인, 아르티카인, 벤조카인, 베톡시카인, 부피바카인, 부타카인, 부탐벤, 부타닐리카인, 클로로부탄올, 클로로프로카인, 신코카인, 클로다카인, 코카인, 크리오풀로오란, 시클로메티카인, 덱시바카인, 디아모카인, 디페로돈, 디클로닌, 에티도카인, 유프로신, 페뷔에린, 포모카인, 구아페카이놀, 헵타카인, 헥실카인, 하이드록시프로카인, 하이드록시테트라카인, 이소부탐벤, 류시노카인, 레보부피바카인, 레복사드롤, 리다미딘, 리도카인, 로투카인, 멘글리테이트, 메피바카인, 메프릴카인, 미르테카인, 옥타카인, 옥토드린, 옥세타카인, 옥시부프로카인, 파레톡시카인, 파리도카인, 페나카인, 피페로카인, 피리도카인, 폴리도카놀, 프라모카인, 프릴로카인, 프로카인, 프로파노카인, 프로피포카인, 프로폭시카인, 프록시메타카인, 피로카인, 콰타카인, 퀴니소카인, 리소카인, 로도카인, 로피바카인, 테트라카인, 톨리카인, 트리메카인 및 이들의 염이 언급될 수 있다.
- "항산화제"로는 글루타티온, 엘라그산, 스페르민, 레스베라트롤, 레티놀, L-카르니틴, 폴리올, 폴리페놀, 플라보놀, 테아플라빈, 카테킨, 카페인, 유비퀴놀, 유비퀴논, 알파리포산이 언급될 수 있다.
- "아미노산"으로서는 아르기닌, 이소류신, 류신, 라이신, 글리신, 발린, 트레오닌, 프롤린, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 시스테인이 언급될 수 있다.
- "비타민"으로서는 비타민 E, A, C, B, 특히 비타민 B4, B5, B6, B8, B9, B7, B12 및 우선적으로 피리독신이 언급될 수 있다.
- "미네랄"로는 아연, 마그네슘, 칼슘, 칼륨, 망간, 나트륨, 구리의 염이 언급될 수 있다.
- "조효소"로서, 조효소 Q10, CoA, NAD, NADP이 언급될 수 있다.
- "아드레날린성 유도체(adrenergic derivative)"로 아드레날린과 노르아드레날린이 언급될 수 있다.
마지막으로, 표시된 모든 수치는 엄격하게가 아니라 일반적인 관례에 따라 대략적으로 고려되어야 함을 이해하여야 한다. 다시 말해, 수치의 표시되는 마지막 자리 숫자는 측정의 정밀도에 해당한다. 예를 들어, 몰 질량이 0.04 MDa인 경우 오차 한계(margin of error)는 0.035-0.044 MDa이다.
본 발명에 따른 방법(PROCESS ACCORDING TO THE INVENTION)
상기 명시된 바와 같이, 본 명세서는 수성 겔의 제조 방법을 설명한다.
제조 방법은, 한편으로 비가교된 고몰질량 글리코사미노글리칸 및 가교제로부터 형성되기 때문에 "가교된 글리코사미노글리칸 HMW"라고도 불리는, 하나 이상의 가교된 글리코사미노글리칸을 포함하는 수용액 및 다른 한편으로, "비가교된 글리코사미노글리칸 LMW"라고도 하는 비가교된 저몰질량의 글리코사미노글리칸을 하나 이상 포함하는 수용액을 필요로 하며, 상기 용액의 전부 또는 일부의 균질한 혼합물을 형성한다.
본 발명에 따른 방법에서 사용되는 글리코사미노글리칸은 히알루론산, 헤파로산, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 글리코사미노글리칸은 동일하거나 상이한 화학적 성질을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용된 글리코사미노글리칸은 화학적 성질이 동일하고 바람직하게는 모두 히알루론산이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 수성 겔의 제조 방법에 관한 것으로, 한편으로는 비가교된 고몰질량 히알루론산 및 가교제로부터 형성되기 때문에 "가교된 HA HMW"라고도 불리는, 하나 이상의 가교된 히알루론산을 포함하는 수용액 및 다른 한편으로는 "비가교된 HA LMW"라고도 하는 비가교된 저몰질량 히알루론산을 하나 이상 포함하는 수용액을 필요로 하며, 상기 용액의 전부 또는 일부의 균질한 혼합물을 형성한다. 상기 방법은 "비가교된 HA LMW" 대 "HA HMW"의 질량비가 1:3 내지 2:1인 히알루론산의 사용을 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 히알루론산은 화학적으로 개질되지 않는다.
앞서 서술한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 본 발명에 따른 방법의 단계 a) 및 b)에서 특히 정의된 바와 같은 수용액 형태로 이러한 글리코사미노글리칸 및 바람직하게는 이러한 히알루론산을 사용한다.
글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산의 이러한 용액은 유리하게는 균질한 것이다.
이들은 통상적인 방법, 예를 들어 인산염 완충 식염수와 같은 수성 매질에서, 가교되거나 가교되지 않은 글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산의 가용화(solubilization) 및/또는 희석에 의해 제조될 수 있다. 이러한 제조는 유리하게는 실온, 바람직하게는 15℃내지 25℃의 온도에서 기계적 또는 수동 교반 하에 수행된다.
단계 A)
단계 a)에서 고려되는 “가교된 글리코사미노글리칸 HMW”및 특히 “가교된 HA HMW”의 수용액과 관련하여, 이들은 0.50 MDa, 우선적으로 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로 1.00 MDa 내지 4.00 MDa의 질량 평균 몰질량을 갖는 적어도 하나의 비가교된 글리코사미노글리칸 및 적어도 하나의 가교제로부터 먼저 얻어질 수 있다; 특히 이들은 0.50 MDa, 우선적으로 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로 1.00 MDa 내지 4.00 MDa의 질량 평균 몰질량을 갖는 적어도 하나의 비가교된 히알루론산 및 적어도 하나의 가교제로부터 먼저 얻어질 수 있다
이러한 가교의 실현은 명백히 당업자의 능력 내에 있다.
유리하게는, 8 질량% 이하, 우선적으로는 5 질량% 이하, 보다 우선적으로는 2 질량% 미만의 가교도를 갖도록 상기 가교제가 도입된다.
유리하게는, 글리코사미노글리칸 단위의 총 몰수, 특히 히알루론산 단위의 총 몰수에 대해 0.001 내지 0.25 몰비로 상기 가교제가 도입된다.
따라서, 바람직한 구현예에 따르면, 상기 "가교된 HA HMW"는 8 질량% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 보다 바람직하게는 2% 미만의 가교도로 제조된다.
이 가교는 예상되는 개질도를 얻기 위해 다양한 온도와 시간에서 수행된다.
따라서, 실온, 즉 15℃내지 25℃의 온도에서 수행되는 가교는 5시간 이상, 또는 심지어 10시간 이상의 반응 시간을 요구할 수 있다.
한편, 가열, UV 노출, 마이크로파 노출 또는 촉매와 같은 자극 요소에 의해 자극되는 가교는 바람직하게는 가열을 사용하여 상당히 증가된 가교도 및 5시간 미만의 지속시간을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 0.50 MDa 이상, 우선적으로 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 몰질량을 갖는 비가교된 글리코사미노글리칸, 특히 비가교된 히알루론산의 가교는 40℃ 초과, 바람직하게는 50℃초과, 보다 구체적으로는 45℃내지 60℃또는 더 좋게는 50℃내지 55℃범위의 온도에서 수행된다.
이러한 가교는 유리하게는 30 내지 300분, 우선적으로는 100 내지 240분의 지속시간을 갖는다.
특히 바람직한 실시양태에서, 0.50 MDa 이상, 바람직하게는 1.00 MDa 초과, 보다 바람직하게는 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 몰 질량을 갖는 비가교된 히알루론산의 가교는 실온, 즉 15℃내지 25℃의 온도에서 수행된다..
이러한 가교는 유리하게는 5시간 초과, 또는 심지어 10시간 초과, 특히 10시간 내지 100시간의 반응 시간을 갖는다.
우선적으로는, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 가교제는 에폭시 가교제, 바람직하게는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE)이다.
사용된 가교제가 BDDE와 같은 이관능성 또는 다관능성 에폭시 가교제인 특정 실시양태에서, 수성 매질의 pH는 가교 반응을 활성화하기 위해 염기화되거나 산성화된다. 특정 실시양태에 따르면, 수성 매질은 일반적으로 수산화나트륨을 함유하는 용액으로 염기화되고, 바람직하게는 수성 매질의 pH는 11 이상, 더욱 바람직하게는 수성 매질의 pH는 12 이상이다. .
바람직한 실시양태에 따르면, 단계 a)의 수성 매질의 "가교된 HMW 글리코사미노글리칸", 보다 구체적으로는 "가교된 HMW HA"의 농도는, 단계 c)의 종료 시에 "가교된 HMW 글리코사미노글리칸", 보다 구체적으로는 "가교된 HMW HA"의 농도가 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 적어도 5 mg/g인 수성 겔을 형성할 수 있도록 조절된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 5 내지 15 mg/g의 "가교된 HA HMW"를 포함하는 수용액을 사용한다.
단계 B)
본 발명의 방법의 단계 b)는, 이와 관련하여, 적어도 하나의 "비가교된 글리코사미노글리칸 LMW", 특히 적어도 하나의 "비가교된 HA LMW"를 포함하는 수용액을 가질 것을 요구한다.
우선적으로는, 단계 b)의 수용액에서 고려되는 "비가교된 글리코사미노글리칸 LMW"의 농도, 특히 "비가교된 HA LMW"의 농도는 단계 c)의 종료 시에 "비가교된 글리코사미노글리칸 LMW" 농도, 특히 "비가교된 HA LMW"의 농도가 상기 수성 겔의 총 질량에 대하여 적어도 3 mg/g, 바람직하게는 10mg/g인 수성 겔을 형성할 수 있도록 조절된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 50 내지 60 mg/g의 "비가교된 HA LMW"를 포함하는 수용액을 사용한다.
하기에 상세히 서술된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 또한 단계 a) 및 b)에 대해 정의된 것과는 다른 글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산의 사용을 포함할 수 있다.
단계 C)
상기 기재된 바와 같이, 단계 c)는 단계 a) 및 b)에서 수득된 용액의 적어도 일부 또는 전부로부터 균질 혼합물을 형성하는 것으로 이루어진다.
단계 c)에서 고려되는 균질 혼합물의 형성은 유리하게는 적어도 하나의 균질화 단계를 포함한다.
균질화는 사용되는 글리코사미노글리칸 사슬의 분해를 방지하기 위해 온화한 조건에서 유리하게 수행된다.
하나 이상의 가교된 글리코사미노글리칸 및 하나 이상의 비가교된 글리코사미노글리칸, 특히 하나 이상의 가교된 히알루론산 및 하나 이상의 비가교된 히알루론산의 균질한 혼합물을 형성하는 이 단계 c)는, 3차원 교반, 패들 혼합기 교반, 주걱 교반 및/또는 적어도 하나의 그리드를 통한 압출 단계와 같은 통상적인 균질화에 따라 수행될 수 있다.
바람직한 실시양태에 따르면, 단계 c)는 적어도 하나의 그리드를 통해 상기 형성된 혼합물을 압출하는 단계를 하나 이상 포함한다. 그러한 그리드의 특성을 조정하는 것은 당업자의 일반적인 지식의 일부이다. 전통적으로, 이들은 형성될 혼합물에 대해 예상되는 특성들의 함수로서 선택되고 함께 혼합되는 글리코사미노글리칸 용액, 특히 히알루론산 용액의 각각의 특이성을 고려하여 선택된다.
따라서, 특정 실시양태에 따르면, 이 단계 c)는 패들 믹서에 의한 균질화 단계를 하나 이상 포함하며, 이어서 적어도 하나의 그리드를 통해 혼합물을 압출하는 단계를 하나 이상 포함한다.
수득된 겔이, 육안 및 촉감으로, 거시적으로(macroscopically) 균일한 색상, 균일한 점도를 가지며 덩어리가 없을 때 균질화는 만족스러운 것으로 간주된다. 균질화 지속 시간은 당업자의 일반적인 지식에 따라 그에 의해 평가된다. 상기 균질화는 특히 상기 겔 내 글리코사미노글리칸, 특히 히알루론산의 균질화 품질을 평가하기 위해, 선택적으로 휴지기로 시간 간격을 둔 여러 사이클을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 단계 c)는 총 지속 시간이 200분 미만, 바람직하게는 150분 미만, 또는 심지어 5 내지 100분 범위인 균질화를 포함할 수 있다.
비가교 HMW 글리코사미노글리칸, 특히 비가교 HMW 히알루론산
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 또한 0.50 MDa 이상, 우선적으로 1.00 MDa 이상, 보다 우선적으로 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 몰 질량의 "비가교된 HMW 글리코사미노글리칸"으로 칭한, 적어도 하나의 비가교 글리코사미노글리칸의 사용을 고려하며, 특히 0.50 MDa 이상, 우선적으로 1.00 MDa 이상, 보다 우선적으로 1.00 MDa 내지 4.00 범위의 질량 평균 몰 질량의 "비가교된 HA HMW"로 칭한 적어도 하나의 비가교 히알루론산의 사용을 고려한다.
바람직하게는, 상기 "비가교된 HMW 글리코사미노글리칸", 특히 상기 "비가교된 HA HMW"는 수용액 내에서 구현된다. 이 수용액은 단계 a) 및 b)에서 고려되는 수용액 중 하나와 구별되거나 공통될 수 있다.
대안적인 구현예에 따르면, 상기 "비가교된 글리코사미노글리칸 HMW", 특히 상기 "비가교된 HA HMW"의 전부 또는 일부가 단계 b)의 수용액에 사용된다.
또 다른 대안적 실시양태에 따르면, 상기 "비가교된 HMW 글리코사미노글리칸", 특히 상기 "비가교된 HA HMW"의 전부 또는 일부는 단계 a) 및 b)의 수용액과 구별되는 수용액의 형태로 사용된다. 이 대안에 따르면, 상기 "비가교된 HMW 글리코사미노글리칸", 특히 상기 "비가교된 HA HMW"의 전부 또는 일부를 함유하는 수용액, 및 단계 b)의 수용액은 단계 a)의 수용액과 동시에 또는 연속적으로 혼합된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 단계 b)에서 5 내지 15 mg/g의 "가교되지 않은 HA HMW"를 포함하는 수용액을 사용한다.
첨가제
특정 실시양태에서, 본 발명은 마취제, 항산화제, 아미노산, 비타민, 미네랄, 핵산, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 조효소, 아드레날린성 유도체, 인산이수소나트륨 일수화물 및/또는 이수화물 및 염화나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 첨가제의 구현을 추가적으로 포함하는 것인 상기 기재된 방법에 관한 것이다.
멸균
따라서, 본 발명의 한 측면에 따르면, 상기 겔의 멸균성을 유지하기 위해, 사용된 원료가 멸균이고, 투여장치에 이를 포장하는 과정을 포함하는 상기 겔의 제조는 제어된 대기 조건 하에서 수행된다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 멸균 및 주입가능한 수성 겔을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 수성 겔 또는 본 발명에 따른 수성겔을 구현하는 적어도 한 단계 및, 멸균, 특히 오토클레이브에서의 멸균 단계를 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 수성 겔의 제조 방법은 적어도 하기로 이루어진 단계를 포함한다:
a) 0.50 MDa 이상, 우선적으로는 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로는 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 몰 질량을 갖는 비가교된 글리코사미노글리칸 및 가교제로부터 형성되며, "가교된 글리코사미노글리칸 HMW"로 칭한, 가교된 글리코사미노글리칸을 하나 이상 포함하는 수용액을 만드는 단계;
b) 0.04 MDa 내지 0.30 MDa, 우선적으로는 0.08 MDa 내지 0.20 Mda, 보다 우선적으로는 0.08 MDa 내지 0.15 Mda 범위의 몰질량을 가지며, “비가교된 글리코사미노글리칸 LMW”로 칭한, 비가교된 글리코사미노글리칸을 하나 이상 포함하는 수용액을 만드는 단계; 및
c) a) 및 b) 단계의 상기 수용액의 전부 또는 일부의 균질한 혼합물을 형성하는 단계, 상기 혼합물은 특히 오토클레이브로서 멸균된다
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 수성 겔의 제조 방법은 적어도 하기로 이루어진 단계를 포함한다:
a) 0.50 MDa 이상, 우선적으로는 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로는 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성되며, "가교된 HA HMW"로 칭한, 가교된 히알루론산을 하나 이상 포함하는 수용액을 만드는 단계;
b) 0.04 MDa 내지 0.30 MDa, 우선적으로는 0.08 MDa 내지 0.20 Mda, 보다 우선적으로는 0.08 MDa 내지 0.15 MDa 범위의 질량 평균 몰질량을 가지며, “비가교된 HA LMW”로 칭한, 비가교된 히알루론산을 하나 이상 포함하는 수용액을 만드는 단계; 및
c) a) 및 b) 단계의 상기 수용액의 전부 또는 일부의 균질한 혼합물을 형성하는 단계, 상기 혼합물은 특히 오토클레이브에서, 멸균되고,
상기 제조 방법은 "비가교된 HA LMW" 대 "HA HMW"의 질량비가 1:3 내지 2:1인 히알루론산의 사용을 포함하는 것을 특징으로 한다.
이러한 멸균은 바람직하게는 투여 장치, 일반적으로 주사기에 이미 포장된 제품에 대해 수행된다.
따라서, 유리하게는, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 수성 겔은 멸균 전에 주사기에 포장된다.
바람직하게는, 상기 방법은 하나의 멸균 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 멸균 단계는 열적 수단에 의해, 예를 들어 오토클레이브에서, 특히 120℃내지 140℃의 온도에서 수행된다.
특히, 멸균 단계는 오토클레이브 내에서 습한 열 조건 아래, 121℃이상, 바람직하게는 121℃내지 135℃사이의 안정기 온도(plateau temperature), F0 값(멸균 값)이 15 초과인 조건으로 수행된다. 본 발명에 따르면, 멸균 값 F0는 121℃에서 멸균될 제품에 존재하는 미생물 수의 90%를 불활성화시키는 데 필요한 시간(분)에 해당한다.
수성 겔
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 일 측면은 가교된 히알루론산을 포함하는 히알루론산계 수성 겔로서, 상기 겔은 적어도 다음을 포함하는 것을 특징으로 하고:
히알루론산의 총 질량에 대해 30 질량% 내지 70 질량%의 양의, 0.02 MDa 내지 0.30 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 수용성 히알루론산(“LMW”및 선택적으로, 0.30 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는 수용성 히알루론산("sHA HMW"),
상기 수용성 히알루론산들은 5% 이하, 우선적으로는 3% 이하, 보다 우선적으로는 1% 이하의 개질도를 가지고, 상기 수용성 히알루론산들의 각각의 백분율은 다음에 의해 결정되는 것인 수성 겔에 관한 것이다:
상기 수성 겔을 0.02%의 NaN3를 함유하는 150 nM 질산나트륨의 pH 7.2 용액 내에서 25 °C에서 5일 동안 희석하고, 상기 희석된 수성 겔을 4400rpm에서 10분 동안 원심분리하고 0.45 mm에서 여과하여 여과액을 얻은 후, 상기 여과액을 다각도 광산란(MALS) 검출기 및 굴절율 증분(dn/dc)이 0.165 ml/g으로 설정된 굴절율(RI) 검출기가 장착된 크기 배제 크로마토그래피 기기로 분석하고, 상기 여과액을 0.3 mL/min의 유속에서 pH 7.2의 질산나트륨을 이동상으로 하며, 0.001 Da 내지 20 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 분자에 적합한 크기 배제 컬럼의 이중 세트가 장착된 액체 크로마토그래피 펌핑 스테이션으로 분석한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 수성 겔은 연질 겔, 즉 위상각(δ이 15° 내지 50° 이고 낮은 탄성 계수 G', 즉 1 Hz의 주파수에서 진동 응력 스윕(osillation stress sweep)을 적용한 원뿔/판 형상(원뿔 각도 1°/판 직경 4mm)을 갖는 레오미터(TA Instruments DHR2)를 사용하여 실온에서 5 Pa의 응력에 대해 측정된 탄성계수 G'가 150 Pa 이하, 바람직하게는 20 내지 150 Pa인 것이고 외부 직경이 0.3 mm (30G) 이하이고 길이가 ½″인 바늘을 가지고 내부 직경이 6.3 mm 이상인 주사기에서 약 12.5 mm/min의 고정된 속도로 실온에서 측정된 압출력이 18 N 이하, 바람직하게는 15 N 미만인 겔이다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 수성 겔은 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 35 내지 65질량%의 "sHA LMW"를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 수성 겔에서, "sHA LMW"로 칭한 상기 수용성 히알루론산은 0.04 MDa 내지 0.20 MDa, 바람직하게는 0.04 MDa 내지 0.15 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 수성 겔에서, "sHA HMW"로 칭한 상기 수용성 히알루론산은 0.30 MDa 초과 4.00 MDa 이하의 질량 평균 몰 질량을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 수성 겔은 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 10 내지 30질량%, 바람직하게는 15 내지 20질량%의 "sHA HMW"를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 수성 겔에서, 상기 가교된 히알루론산은 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 적어도 5 mg/g의 양으로 존재한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 수성 겔에서, "sHA LMW"로 칭한 상기 수용성 히알루론산은 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 적어도 3 mg/g, 우선적으로는 10mg/g의 양으로 존재한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 수성 겔에서, 상기 수성 겔의 총 질량에 대한 총 히알루론산의 농도는 10 내지 40 mg/g, 우선적으로는 15 내지 35 mg/g, 보다 우선적으로는 20 내지 30 mg/g이다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 수성 겔에서, 히알루론산의 총 개질도는 5% 이하, 바람직하게는 3% 이하, 보다 바람직하게는 1% 이하이다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 정의된 바와 같은 수성 겔에서:
가교된 히알루론산이 수성 겔의 총 질량에 대해 6 내지 12 mg/g 범위의 양으로 존재하고,
"sHA LMW"로 칭한 수용성 히알루론산이 수성 겔의 총 질량에 대해 12 내지 20 mg/g 범위의 양으로 존재하고,
"sHA HMW"로 칭한 수용성 히알루론산이 수성 겔의 총 질량에 대해 3 내지 6 mg/g 범위의 양으로 존재하고,
상기 수성 겔은 수성 겔의 총 질량에 대해 20 내지 30 mg/g 의 총 히알루론산 농도를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 수성 겔은 예를 들어 오토클레이브에서 가열 멸균 단계를 거친다.
히알루론산은 강한 산성 및 알칼리성 pH, 고온(예: 가열 멸균 중), 산화(예: 반응성 산소종(reactive oxygen species)) 및 효소 활성에 매우 민감한 것으로 알려져 있다. (Stern R, Kogan G, Jedrzejas MJ, et al. 등. 히알루로난을 절단하기 위한 많은 방법들. Biotechnol Adv 2007;25:537-57).
그 결과, 제조 공정, 특히 가교된 히알루론산을 포함하는 조성물을 제조하기 위해 적용된 가교 조건은 히알루론산 사슬을 분해하는 경향이 있어 LMW 가용성 히알루론산을 방출하게 된다. 이러한 LMW 히알루론산 부분(fragment)은 BDDE와 같은 사용된 가교제에 의해 적어도 부분적으로 개질된다.
이에 반해 제조과정에서 첨가된 비가교된 LMW 히알루론산의 가용성 히알루론산은 BDDE로 개질되지 않는다.
BDDE 개질은 개질도(MOD) 측정에 의해 시각화될 수 있다. 이러한 맥락에서, 가용성 히알루론산의 개질도가 높을수록, 연구된 겔의 제조 과정에서 생성된 LMW 히알루론산 부분의 비율이 더 높고, 제조 과정에서 첨가된 LMW 히알루론의 가용성 히알루론산의 비율은 더 낮아진다.
이것은 실시예 7에서 설명된다.
상술한 히알루론산 절단은 가열에 의한 멸균 전 겔 내에 첨가된 히알루론산의 몰질량이 멸균된 겔 내에서 측정된 가용성 히알루론산의 몰질량보다 높다는 것을 설명한다.
이러한 민감성은 다른 글리코사미노글리칸에서도 마찬가지이다다.
실제로 "sHA"는 다음에 해당한다.
- 가교 단계 a) 후 겔의 제조 과정 동안 첨가되는 비가교된 HA LMW; 그리고,
- 존재하는 경우, 가교 단계 a) 이후 겔의 제조 과정 동안 첨가되는 비가교된 HA HMW, 그리고
- 겔의 제조 과정 동안 방출된, BDDE와 같은 가교제로 적어도 부분적으로 개질되는 HA 부분.
따라서 "sHA LMW"의 양은 다음과 같은 양 이상이다.
- 가교 단계 a) 후 겔의 제조 과정 동안 첨가되는 비가교된 HA LMW; 그리고,
- 존재하는 경우, 가교 단계 a) 이후 겔의 제조 과정 동안 첨가되는 비가교된 HA HMW.
- 반대로 "nsHA"는 가교된 HA에 해당한다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 수성 겔은 적어도 다음:
히알루론산의 총 질량에 대해 30 질량% 내지 70 질량%의 양의, 0.04 MDa 내지 0.20 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 수용성 히알루론산(“LMW”및 선택적으로, 0.30 MDa 초과 4.00 MDa 이하의 질량 평균 몰 질량을 갖는 수용성 히알루론산("sHA HMW")을 포함하고,
총 수용성 히알루론산은 5% 이하, 우선적으로는 3% 이하, 보다 우선적으로는 1% 이하의 개질도를 가지고,
상기 수용성 히알루론산들의 각각의 백분율은 다음에 의해 결정된다:
상기 수성 겔을 0.02%의 NaN3를 함유하는 150 nM 질산나트륨의 pH 7.2 용액 내에서 25 °C에서 5일 동안 희석하고, 상기 희석된 수성 겔을 4400rpm에서 10분 동안 원심분리하고 0.45 mm에서 여과하여 여과액을 얻은 후, 상기 여과액을 다각도 광산란(MALS) 검출기 및 굴절율 증분(dn/dc)이 0.165 ml/g으로 설정된 굴절율(RI) 검출기가 장착된 크기 배제 크로마토그래피 기기로 분석하고, 상기 여과액을 0.3 mL/min의 유속에서 pH 7.2의 질산나트륨을 이동상으로 하며, 0.001 Da 내지 20 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 분자에 적합한 크기 배제 컬럼의 이중 세트가 장착된 액체 크로마토그래피 펌핑 스테이션으로 분석한다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 수성 겔은 적어도 다음:
히알루론산의 총 질량에 대해 30 질량% 내지 70 질량%의 양의, 0.04 MDa 내지 0.15 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 수용성 히알루론산(“LMW”및 선택적으로, 0.30 MDa 초과 4.00 MDa 이하의 질량 평균 몰 질량을 갖는 수용성 히알루론산("sHA HMW")을 포함하고,
총 수용성 히알루론산은 5% 이하, 우선적으로는 3% 이하, 보다 우선적으로는 1% 이하의 개질도를 가지고,
상기 수용성 히알루론산들의 각각의 백분율은 다음에 의해 결정된다:
상기 수성 겔을 0.02%의 NaN3를 함유하는 150 nM 질산나트륨의 pH 7.2 용액 내에서 25 °C에서 5일 동안 희석하고, 상기 희석된 수성 겔을 4400rpm에서 10분 동안 원심분리하고 0.45 mm에서 여과하여 여과액(filtrate)를 얻은 후, 상기 여과액을 다각도 광산란(MALS) 검출기 및 굴절율 증분(dn/dc)이 0.165 ml/g으로 설정된 굴절율(RI) 검출기가 장착된 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 기기로 분석하고, 상기 여과액을 0.3 mL/min의 유속에서 pH 7.2의 질산나트륨을 이동상으로 하며, 0.001 Da 내지 20 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 분자에 적합한 크기 배제 컬럼의 이중 세트가 장착된 액체 크로마토그래피 펌핑 스테이션(liquid chromatography pumping station)으로 분석한다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 수성 겔은 적어도 다음:
히알루론산의 총 질량에 대해 35 질량% 내지 65 질량%의 양의, 0.02 MDa 내지 0.30 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 수용성 히알루론산(“LMW”및 선택적으로, 0.30 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는 수용성 히알루론산("sHA HMW")을 포함하고,
총 수용성 히알루론산은 5% 이하, 우선적으로는 3% 이하, 보다 우선적으로는 1% 이하의 개질도를 가지고,
상기 수용성 히알루론산들의 각각의 백분율은 다음에 의해 결정된다:
상기 수성 겔을 0.02%의 NaN3를 함유하는 150 nM 질산나트륨의 pH 7.2 용액 내에서 25 °C에서 5일 동안 희석하고, 상기 희석된 수성 겔을 4400rpm에서 10분 동안 원심분리하고 0.45 mm에서 여과하여 여과액을 얻은 후, 상기 여과액을 다각도 광산란(MALS) 검출기 및 굴절율 증분(dn/dc)이 0.165 ml/g으로 설정된 굴절율(RI) 검출기가 장착된 크기 배제 크로마토그래피 기기로 분석하고, 상기 여과액을 0.3 mL/min의 유속에서 pH 7.2의 질산나트륨을 이동상으로 하며, 0.001 Da 내지 20 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 분자에 적합한 크기 배제 컬럼의 이중 세트가 장착된 액체 크로마토그래피 펌핑 스테이션으로 분석한다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 수성 겔은 적어도 다음:
히알루론산의 총 질량에 대해 35 질량% 내지 65 질량%의 양의, 0.04 MDa 내지 0.20 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 수용성 히알루론산(“LMW”및 선택적으로, 0.30 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는 수용성 히알루론산("sHA HMW")을 포함하고,
총 수용성 히알루론산은 5% 이하, 우선적으로는 3% 이하, 보다 우선적으로는 1% 이하의 개질도를 가지고,
상기 수용성 히알루론산들의 각각의 백분율은 다음에 의해 결정된다:
상기 수성 겔을 0.02%의 NaN3를 함유하는 150 nM 질산나트륨의 pH 7.2 용액 내에서 25 °C에서 5일 동안 희석하고, 상기 희석된 수성 겔을 4400rpm에서 10분 동안 원심분리하고 0.45 mm에서 여과하여 여과액을 얻은 후, 상기 여과액을 다각도 광산란(MALS) 검출기 및 굴절율 증분(dn/dc)이 0.165 ml/g으로 설정된 굴절율(RI) 검출기가 장착된 크기 배제 크로마토그래피 기기로 분석하고, 상기 여과액을 0.3 mL/min의 유속에서 pH 7.2의 질산나트륨을 이동상으로 하며, 0.001 Da 내지 20 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 분자에 적합한 크기 배제 컬럼의 이중 세트가 장착된 액체 크로마토그래피 펌핑 스테이션으로 분석한다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 수성 겔은 적어도 다음:
히알루론산의 총 질량에 대해 35 질량% 내지 65 질량%의 양의, 0.04 MDa 내지 0.15 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 수용성 히알루론산(“LMW”및 선택적으로, 0.30 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는 수용성 히알루론산("sHA HMW")을 포함하고,
총 수용성 히알루론산은 5% 이하, 우선적으로는 3% 이하, 보다 우선적으로는 1% 이하의 개질도를 가지고,
상기 수용성 히알루론산들의 각각의 백분율은 다음에 의해 결정된다:
상기 수성 겔을 0.02%의 NaN3를 함유하는 150 nM 질산나트륨의 pH 7.2 용액 내에서 25 °C에서 5일 동안 희석하고, 상기 희석된 수성 겔을 4400rpm에서 10분 동안 원심분리하고 0.45 mm에서 여과하여 여과액을 얻은 후, 상기 여과액을 다각도 광산란(MALS) 검출기 및 굴절율 증분(dn/dc)이 0.165 ml/g으로 설정된 굴절율(RI) 검출기가 장착된 크기 배제 크로마토그래피 기기로 분석하고, 상기 여과액을 0.3 mL/min의 유속에서 pH 7.2의 질산나트륨을 이동상으로 하며, 0.001 Da 내지 20 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 분자에 적합한 크기 배제 컬럼의 이중 세트가 장착된 액체 크로마토그래피 펌핑 스테이션으로 분석한다.
단계 c)의 종료 시에, 적어도 하나의 “비가교된 LMW 글리코사미노글리칸” 및 적어도 하나의 “가교된 HMW 글리코사미노글리칸”을 포함하는 “ HMW 글리코사미노글리칸”을 함유하는 균질한 수성 겔이 얻어진다.
유리하게는, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 수성 겔의, 상기 수성 겔의 총 질량에 대한 총 글리코사미노글리칸 농도는 10 내지 40 mg/g, 우선적으로는 15 내지 35 mg/g, 보다 우선적으로는 20 내지 30 mg/g이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 수성 겔은 또한 1:4 내지 4:1, 우선적으로는 1:3 내지 5:3, 보다 우선적으로는 1:2 내지 2:1 범위의 “비가교된 글리코사미노글리칸 LMW”대 “글리코사미노글리칸 HMW” 질량비를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 상기 수성 겔은 5% 미만, 바람직하게는 3% 미만, 보다 바람직하게는 1% 미만의 상기 글리코사미노글리칸의 개질도를 갖는다.
보다 구체적으로, 단계 c)의 종료 시에, 적어도 하나의 “비가교된 HA LMW” 및 적어도 하나의 “가교된 HA HMW”를 포함하는 “HA HMW”를 함유하는 균질한 수성 겔이 얻어진다.
유리하게는, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 수성 겔의, 상기 수성 겔의 총 질량에 대한 총 히알루론산 농도는 10 내지 40 mg/g, 우선적으로는 15 내지 35 mg/g, 보다 우선적으로는 20 내지 30 mg/g이다.
한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 수성 겔은 또한 1:3 내지 5:3, 우선적으로는 1:2 내지 5:3 범위의 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”질량비를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 상기 수성 겔은 5% 이하, 바람직하게는 3% 이하, 보다 바람직하게는 1% 이하의 상기 히알루론산의 개질도를 갖는다.
다른 특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어지는 상기 수성 겔은 연질 겔, 즉 위상각(δ이 15° 내지 50° 이고 탄성 계수 G', 즉 1 Hz의 주파수에서 진동 응력 스윕을 적용한 원뿔/판 형상(원뿔 각도 1°/판 직경 40mm)을 갖는 레오미터(TA Instruments DHR2)를 사용하여 실온에서 5 Pa의 응력에 대해 측정된 탄성계수 G'가 150 Pa 이하, 바람직하게는 20 내지 150 Pa인 것이고 외부 직경이 0.3 mm (30G) 이하이고 길이가 ½″인 바늘을 가지고 내부 직경이 6.3 mm 이상인 주사기에서 약 12.5 mm/min의 고정된 속도로 실온에서 측정된 압출력이 18 N 이하, 바람직하게는 15 N 미만인 겔이다.
본 발명의 일 실시양태에따르면, 상기 수성 겔은 다음을 구현하는 공정의 마지막에 수득되며:
- 단계 a)에서, 5 내지 15 mg/g의 "가교된 글리코사미노글리칸 HMW"를 포함하는 수용액;
- 단계 b)에서 50 내지 60 mg/g의 "비가교된 글리코사미노글리칸 LMW" 및 5 내지 20 mg/g의 "비가교된 글리코사미노글리칸 HMW"를 포함하는 수용액,
형성된 상기 겔은 겔의 총 질량에 대해 20 내지 30 mg/g의 총 글리코사미노글리칸 농도를 갖는다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 수성 겔은 다음을 구현하는 공정의 마지막에 수득되고:
- 단계 a)에서 5 내지 15 mg/g의 "가교된 HA HMW"를 포함하는 수용액;
- 단계 b)에서, "비가교된 HA LMW" 50 내지 60 mg/g 및 "가교되지 않은 HA HMW" 5 내지 20 mg/g을 포함하는 수용액,
형성된 상기 겔은 겔의 총 질량에 대해 20 내지 30 mg/g의 총 히알루론산 농도를 갖는다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있고, 겔의 총 질량에 대해서 10 내지 40 mg/g, 우선적으로는 15 내지 35 mg/g, 보다 우선적으로는 20 내지 30 mg/g의 총 글리코사미노글리칸 농도를 갖는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
- "가교된 글리코사미노글리칸 HMW"로 칭한, 0.50 MDa 이상, 우선적으로 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 하나 이상의 비가교된 글리코사미노글리칸으로부터 형성된 하나 이상의 가교된 글리코사미노글리칸;
- "비가교된 글리코사미노글리칸 LMW"로 칭한, 0.04 MDa 내지 0.30 MDa, 우선적으로 0.08 MDa 내지 0.20 MDa, 보다 우선적으로 0.08 MDa 내지 0.15 MDa, 더욱 더 우선적으로 0.08 MDa 내지 0.10 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 하나 이상의 비가교된 글리코사미노글리칸, 및,
- 선택적으로, "비가교된 글리코사미노글리칸 HMW"로 칭한, 0.50 MDa 이상, 우선적으로 1 MDa 초과, 보다 우선적으로 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 몰 질량을 갖는 적어도 하나의 비가교 글리코사미노글리칸.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있고, 겔의 총 질량에 대해서 20 내지 30 mg/g의 총 히알루론산 농도를 갖는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
- 단계 a)에서 5 내지 15 mg/g의 "가교된 HA HMW"를 포함하는 수용액;
- 단계 b)에서 "비가교된 HA LMW" 50 내지 60 mg/g 및 "비가교된 HA HMW" 5 내지 20 mg/g을 포함하는 수용액.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
-1.00 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한 적어도 하나의 가교된 히알루론산;
- 0.08 MDa 내지 0.20 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA LMW"로 칭한 하나 이상의 비가교 히알루론산; 및
- 선택적으로, 1.00 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA HMW"로 칭한 하나 이상의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “ HA HMW”의 질량비가 1:3 내지 2:1로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
-1.00 MDa 내지 4.00 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한 적어도 하나의 가교된 히알루론산;
- 0.08 MDa 내지 0.15 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA LMW"로 칭한 하나 이상의 비가교 히알루론산; 및
- 선택적으로, 1.00 MDa 내지 4.00 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA HMW"로 칭한 하나 이상의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”의 질량비가 1:3 내지 2:1로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
- 0.50 MDa 이상의 질량 평균 몰 질량을 갖는 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한 적어도 하나의 가교된 히알루론산;
- 0.04 MDa 내지 0.30 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA LMW"로 칭한 하나 이상의 비가교 히알루론산; 및
- 선택적으로, 0.50 MDa 이상의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA HMW"로 칭한 하나 이상의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”의 질량비가 1:3 내지 5:3으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
-1.00 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한 적어도 하나의 가교된 히알루론산;
- 0.08 MDa 내지 0.20 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA LMW"로 칭한 하나 이상의 비가교 히알루론산; 및
- 선택적으로, 1.00 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA HMW"로 칭한 하나 이상의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”의 질량비가 1:3 내지 5:3으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
-1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한 적어도 하나의 가교된 히알루론산;
- 0.08 MDa 내지 0.15 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA LMW"로 칭한 하나 이상의 비가교 히알루론산; 및
- 선택적으로, 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA HMW"로 칭한 하나 이상의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”의 질량비가 1:3 내지 5:3으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
- 0.50 MDa 이상의 질량 평균 몰 질량을 갖는 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한 적어도 하나의 가교된 히알루론산;
- 0.04 MDa 내지 0.30 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA LMW"로 칭한 하나 이상의 비가교 히알루론산; 및
- 선택적으로, 0.50 MDa 이상의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA HMW"로 칭한 하나 이상의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”의 질량비가 1:2 내지 5:3으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
- 1.00 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한 적어도 하나의 가교된 히알루론산;
- 0.08 MDa 내지 0.20 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA LMW"로 칭한 하나 이상의 비가교 히알루론산; 및
- 선택적으로, 1.00 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA HMW"로 칭한 하나 이상의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”의 질량비가 1:2 내지 5:3으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
- 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한 적어도 하나의 가교된 히알루론산;
- 0.08 MDa 내지 0.15 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA LMW"로 칭한 하나 이상의 비가교 히알루론산; 및
- 선택적으로, 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA HMW"로 칭한 하나 이상의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”의 질량비가 1:2 내지 5:3으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있고, 겔의 총 질량에 대해서 10 내지 40 mg/g, 우선적으로는 15 내지 35 mg/g, 보다 우선적으로는 20 내지 30 mg/g의 총 글리코사미노글리칸 농도를 갖는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
- 0.50 MDa 이상, 우선적으로 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 하나 이상의 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한, 하나 이상의 가교된 히알루론산
- "비가교된 HA LMW"로 칭한, 0.04 MDa 내지 0.30 MDa, 우선적으로 0.08 MDa 내지 0.20 MDa, 보다 우선적으로 0.08 MDa 내지 0.15 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 하나 이상의 비가교된 히알루론산, 및,
- 선택적으로, "비가교된 HA HMW"로 칭한, 0.50 MDa 이상, 우선적으로 1 MDa 초과, 보다 우선적으로 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 적어도 하나의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”의 질량비가 1:3 내지 2:1로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있고, 겔의 총 질량에 대해서 10 내지 40 mg/g의 총 히알루론산 농도를 갖는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
- 1.00 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는 하나 이상의 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한 적어도 하나의 가교된 히알루론산;
- 0.08 MDa 내지 0.20 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA LMW"로 칭한 하나 이상의 비가교 히알루론산; 및
- 선택적으로, 1.00 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA HMW"로 칭한 하나 이상의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”의 질량비가 1:3 내지 2:1로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있고, 겔의 총 질량에 대해서 20 내지 30 mg/g의 총 히알루론산 농도를 갖는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
- 1.00 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는 하나 이상의 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한 적어도 하나의 가교된 히알루론산;
- 0.08 MDa 내지 0.20 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA LMW"로 칭한 하나 이상의 비가교 히알루론산; 및
- 선택적으로, 1.00 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA HMW"로 칭한 하나 이상의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”의 질량비가 1:3 내지 2:1로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있고, 겔의 총 질량에 대해서 10 내지 40 mg/g의 총 히알루론산 농도를 갖는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
- 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 하나 이상의 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한 적어도 하나의 가교된 히알루론산;
- 0.08 MDa 내지 0.15 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA LMW"로 칭한 하나 이상의 비가교 히알루론산; 및
- 선택적으로, 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA HMW"로 칭한 하나 이상의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”의 질량비가 1:3 내지 2:1로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있고, 겔의 총 질량에 대해서 20 내지 30 mg/g의 총 히알루론산 농도를 갖는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
- 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 하나 이상의 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한 적어도 하나의 가교된 히알루론산;
- 0.08 MDa 내지 0.15 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA LMW"로 칭한 하나 이상의 비가교 히알루론산; 및
- 선택적으로, 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는, "비가교된 HA HMW"로 칭한 하나 이상의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”의 질량비가 1:3 내지 2:1로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있고, 10 내지 40 mg/g, 우선적으로는 15 내지 35 mg/g, 보다 우선적으로는 20 내지 30 mg/g의 총 히알루론산 농도를 갖는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
- 0.50 MDa 이상, 우선적으로 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 하나 이상의 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한, 하나 이상의 가교된 히알루론산
- "비가교된 HA LMW"로 칭한, 0.04 MDa 내지 0.30 MDa, 우선적으로 0.08 MDa 내지 0.20 MDa, 보다 우선적으로 0.08 MDa 내지 0.15 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 하나 이상의 비가교된 히알루론산, 및,
- 선택적으로, "비가교된 HA HMW"로 칭한, 0.50 MDa 이상, 우선적으로 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 적어도 하나의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”의 질량비가 1:3 내지 5:3로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있고, 10 내지 40 mg/g, 우선적으로는 15 내지 35 mg/g, 보다 우선적으로는 20 내지 30 mg/g의 총 히알루론산 농도를 갖는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 구현하는 것의 결과이다:
- 0.50 MDa 이상, 우선적으로 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 하나 이상의 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성된, "가교된 HA HMW"로 칭한, 하나 이상의 가교된 히알루론산
- "비가교된 HA LMW"로 칭한, 0.04 MDa 내지 0.30 MDa, 우선적으로 0.08 MDa 내지 0.20 MDa, 보다 우선적으로 0.08 MDa 내지 0.15 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 하나 이상의 비가교된 히알루론산, 및,
- 선택적으로, "비가교된 HA HMW"로 칭한, 0.50 MDa 이상, 우선적으로 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 몰 질량을 갖는 적어도 하나의 비가교된 히알루론산,
여기서, 히알루론산은 “비가교된 HA LMW”대 “HA HMW”의 질량비가 1:2 내지 5:3로 사용되는 것이다.
물론, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 수성 겔은 또한 이러한 유형의 제형에서 통상적으로 고려되는 하나 이상의 첨가제, 특히 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있다.
물론, 첨가제(들)의 선택 및 함량은 본 발명에 따른 겔에 사용되는 다른 화합물, 특히 상기 히알루론산과의 비상용성(incompatibility) 위험을 증가시키지 않고 아래에 설명된 용도들과 양립할 수 있도록 조정된다. 이러한 조정은 당업자의 일반적인 능력 범위 내에 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따라 정의된 하나 이상의 수성 겔을 포함하고, 필요하다면 마취제, 항산화제, 아미노산, 비타민, 미네랄, 핵산, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 조효소, 아드레날린성 유도체, 인산이수소나트륨 일수화물 및/또는 이수화물 및 염화나트륨으로 부터 선택되는 적어도 하나의 첨가제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 첨가제는 상기 정의된 마취제, 특히 리도카인, 메피바카인 또는 염산염과 같은 그들의 염이다.
본 발명의 방법에 따라 수득된 겔 및 본 발명에 따른 수성 겔은 피부 표면 외관의 변화의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 조성물로서 특히 유용하다.
본 발명에 따른 조성물은 화장료 및/또는 피부과 조성물일 수 있다.
이들 조성물은 국소적으로 투여될 수 있지만 특히 피부의 표면 영역, 즉 상부 및 중간 진피에 주입에 의해 투여될 수도 있다.
주입이 고려되는 경우, 조성물 및/또는 수성 겔은 멸균되고 주입 가능한 것이어야만 한다.
본 발명에 따른 조성물이 국소 조성물인 경우, 이는 그의 적용에 적합한 임의의 생약(galenical) 형태, 예를 들어 크림, 연고, 로션, 세럼, 겔 또는 분산액 형태일 수 있다.
당업자에게 잘 알려진 임의의 적합한 부형제는 원하는 징후에 따라 적절한 양으로 본 발명에 따른 조성물에 포함될 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기와 같은 멸균 공정에 따라 멸균된 주입용 수성 겔에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 포함하는 것이고:
- 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 0.6 내지 0.8 질량%의 하나 이상의 "가교된 글리코사미노글리칸 HMW";
- 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 1.4 내지 1.8 질량%의 하나 이상의 "비가교된 글리코사미노글리칸 LMW"; 및,
- 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 0.2 내지 0.4 질량%의 하나 이상의 "비가교된 글리코사미노글리칸 HMW";
그리고 상기 수성겔의 상기 총 글리코사민 농도는 20 내지 30 mg/g인 것이고, 위상각(δ이 15° 내지 50° 이고, 1 Hz의 주파수에서 진동 응력 스윕을 적용한 원뿔/판 형상(원뿔 각도 1°/ 판 직경 40 mm)을 갖는 레오미터(TA Instruments DHR2)를 사용하여 실온에서 5 Pa의 응력에 대해 측정된 탄성 계수 G'가 20 내지 150 Pa인 것이고 외부 직경이 0.3 mm (30G) 이하이고 길이가 ½″인 바늘을 가지고 내부 직경이 6.3 mm 이상인 주사기에서 약 12.5 mm/min의 고정된 속도로 실온에서 동력계로 측정된 압출력이 15 N 이하인 겔이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 대표적인 수성 겔은 특히 다음을 포함하는 것이고:
- 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 0.6 내지 1.0 질량%의 하나 이상의 "가교된 HA HMW";
- 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 1.4 내지 1.8 질량%의 하나 이상의 "비가교된 HA LMW"; 및,
- 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 0.2 내지 0.6 질량%의 하나 이상의 "비가교된 HA HMW";
그리고 상기 수성겔의 상기 총 히알루론산 농도는 20 내지 30 mg/g인 것이고, 위상각(δ이 15° 내지 50° 이고, 1 Hz의 주파수에서 진동 응력 스윕을 적용한 원뿔/판 형상(원뿔 각도 1°/ 판 직경 40 mm)을 갖는 레오미터(TA Instruments DHR2)를 사용하여 실온에서 5 Pa의 응력에 대해 측정된 탄성 계수 G'가 20 내지 150 Pa인 것이고 외부 직경이 0.3 mm (30G) 이하이고 길이가 ½″인 바늘을 가지고 내부 직경이 6.3 mm 이상인 주사기에서 약 12.5 mm/min의 고정된 속도로 실온에서 동력계로 측정된 압출력이 18 N 이하인 겔이다.
키트
특히, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 수성 겔 또는 본 발명에 정의된 바와 같은 수성 겔, 또는 본 발명에 따른 화장료 및/또는 피부과 조성물을 포함하는 미리 충전된 주사기에 관한 것이다.
하나의 추가 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 수성 겔 또는 본 발명에 정의된 바와 같은 수성 겔, 또는 본 발명에 따른 화장료 및/또는 피부과 조성물을 포함하는 미리 충전된 주사기 및 사용 지침을 포함하는 키트에 관한 것이다.
용도
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 피부 표면 외관의 변화의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 수성 겔 또는 본 발명에 따른 피부과 조성물에 관한 것이다. 우선적으로, 본 발명은 연조직의 확대 및/또는 충전에 사용하기 위한 본 발명에 정의된 수성 겔 또는 본 발명에 정의된 피부과 조성물에 관한 것이다.
또한, 피부의 점탄성 또는 생체역학적 특성의 변화의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명에 정의된 바와 같은 수성 겔 또는 본 발명에 따른 피부과 조성물에 관한 것이다.
예를 들어 스트레스, 대기 오염, 담배 또는 자외선(UV)에 대한 장기간 노출과 같은 외부 요인에 의해 유발되는 것인 피부 징후의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 수성 겔 또는 본 발명에 따른 피부과 조성물이 또한 설명된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 수성 겔 또는 본 발명에 따른 화장료 조성물의, 예를 들어 시간적 노화에 대한 피부 징후인 것인 피부 표면 외관의 변화를 예방 및/또는 치료하기 위한 비치료적 화장 용도에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 연조직의 증대 및/또는 충전을 위한, 특히 주름을 채우기 위한 본 발명에 따른 수성 겔 또는 본 발명에 따른 화장료 조성물의 비치료적 화장 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 수성 겔 또는 본 발명에 따른 피부과 조성물의 효과적인 양을, 이를 필요로 하는 환자와 같은 개체에 국소적으로 적용하는 단계 또는 이를 개체의 체내에 주입에 의해 투여하는 단계를 적어도 하나 포함하는 피부 표면 외관의 변화를 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 수성 겔 또는 본 발명에 따른 피부과 조성물의 효과적인 양을, 이를 필요로 하는 환자와 같은 개체에 국소적으로 적용하는 단계 또는 이를 개체의 체내에 주입에 의해 투여하는 단계를 적어도 하나 포함하는 피부 연조직을 증대 및/또는 충전, 특히 주름을 채우기 위한 방법에 관한 것이다.
실시예
재료
아래의 다양한 실시예에 대해 별도의 시료 세트를 준비했다. 이 시리즈 사이에는 피할 수 없는 가변성이 있는데, 특히 다른 배치의 히알루론산을 사용하거나 다른 멸균 주기를 사용하기 때문이다. 결과적으로 이러한 시리즈 예시 간(inter-example)의 비교는 적절하지 않다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
방법
실시예에서 분석된 조성물의 점탄성 특성을 연구하기 위해 다음 프로토콜이 적용된다.
시료의 유변학적 특성
조성물의 점탄성 특성은 원뿔/판 형상(원뿔 각도 1°/판 직경 40 mm)을 갖는 레오미터(TA Instruments DHR2)를 사용하여 실온에서 측정된다. 1 Hz의 주파수에서 진동 응력 스윕 측정이 수행된다. 탄성 계수(G', [Pa]), 위상각(δ [°]) 및 복합점도(complex viscosity)(η*)가 5 Pa의 응력에 대해 측정된다.
시료의 압출력 특성
시료의 압출력은 30G½″바늘을 가지고 내경이 6.4 mm인 1mL의 COC 주사기로 12.5 mm/min의 고정된 속도로, 25-mm의 낙하 경로(drop path)로, 실온에서 동력계를 사용하여 결정된다.
시간 경과 및 열에 따른 시료 분해 저항성 특성
주입가능한 히알루론산 겔의 멸균은 일반적으로 오토클레이브(습한 열 멸균 공정)에 의해 수행된다.
이러한 조성물의 저장 안정성은 고온에서 강제 분해 시험(ASTM F1980-16)을 통해 가속화된 방식에서 평가될 수 있다.
겔의 분해는 탄성 계수(G')의 상당한 손실에 의해 특징된다.
이러한 맥락에서, 멸균 시 G'의 손실률(Δ은 시간 경과 및 가열 멸균 모두에서 분해에 대한 겔의 저항성에 대한 관련 지표(relevant indicator)이다.
이를 위해 멸균 시 G'의 변화는 다음과 같이 계산된다.
ΔG′(%) = [(멸균 이후 G′- 멸균 이전 G′)/ 멸균 이전 G′]x 100
또한 G' 개선(G′improvement)은 다음과 같이 정의된다.
G′ 개선 (%) = [(기준 시료의 ΔG′ - 연구 시료의 ΔG′) / 기준 시료의 ΔG′]x 100
효소 분해에 대한 시료의 저항성 특성
효소 분해에 대한 시료의 저항성을 연구하기 위해, 실험되는 겔 2g을 인산염 완충 식염수(0.5U/겔mL)의 히알루로니다제(HAase) 용액과 접촉시키고 균질화한 다음, 37°C의 오븐에 24시간 놔둔다.
각 시료는 효소 처리 전후의 유변학 측정을 특징으로 하며 분해 전/후 G'의 차이는 다음과 같이 계산된다: ΔG′[(최종 G′- 초기 G′)/ 초기 G′]x 100. G'의 이러한 차이는 히알루로니다제의 존재 하에서 겔 분해 정도에 관한 직접적인 지표이다.
시료에 존재하는 수용성 및 비수용성 히알루론산의 크기 및 분포 특성
HA 겔에서 방출되는 sHA의 Mw 및 양은 다각도 광산란 검출기(Dawn Neon MALS, Wyatt Technology Corp) 및 굴절율 검출기(Optilab, Wyatt Technology Corp)가 징착된 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정된다.
기기는 광범위한 질량 평균 몰 질량(0.001 MDa ~ 20 MDa)을 포괄하는 직렬 흐름(Shodex)으로 유지되는 크기 배제 컬럼 OHpak LB-806M의 이중 세트가 장착된 Agilent Infinity LC 시스템을 사용했다.
150mM 질산나트륨(0.02% NaN3 함유)의 pH 7.2 이동상이, 0.3mL/min의 유속으로, 용리액으로 사용되었다.
이러한 조건에서 굴절률 증분(dn/dc)은 0.165mL/g으로 설정되었다. 크로마토그램(chromatograms)을 얻고 ASTRA 소프트웨어(Wyatt Technology Corp)를 사용하여 크로마토그램을 분석했다.
시료 준비는 5일 동안 25°C에서 0.02% NaN3를 포함하는 150 nM 질산나트륨의 pH 7.2 용액 내에서 수성 겔을 희석한 다음, 이를 4400rpm에서 10분 동안 원심분리하고 0.45mm에서 여과하여 여액을 얻은 후, 이 여과액을 상기한 바와 같이 장착된 SEC로 분석하여 이루어졌다.
희석 단계를 위한 이동상의 겔 농도와 SEC에서 주입되는 부피는 신호 대 브루즈 비율을 최대화하고 컬럼 과부하를 피하기 위해 상층액 조성물의 함수로서 적절하게 조정되었다.
결정된 sHA 백분율은 시료 내 HA의 총 질량에 대한 수용성 HA의 질량에 해당한다.
1 H NMR에 의한, 시료에 존재하는 수용성 히알루론산의 개질도
각 시료 3g을 실온에서 5일 동안 주사용 물 10mL와 함께 인큐베이션했다.
그런 다음 시료를 가볍게 원심분리(4400rpm, 10분)하여 상층액(수용성 HA를 함유)에서 겔을 분리하고, 0.45mm에서 여과하여 불용성 겔 응집물을 제거했다.
상기 상층액은 동결 건조되고 1 mL의 D2O로 용해되었다. 1H NMR 분석은 500MHz Bruker Avance 분광계에서 수행된다. 개질도는 HA 이당류 단위 신호(HA는 가교 또는 비가교됨)에 대한 가교제 신호의 몰비에 의해 결정되었다
실시예 1
가교된 HMW 히알루론산 조성물에 비가교 LMW 히알루론산을 보충한 효과
연구된 시료들은 하기와 같이 제시된다.
비교 시료 1-1은 오토클레이브에서 주사기 내에서 멸균되고, HMW 히알루론산(4.00 MDa, HTL, Eur. Ph. 제약/의료용 등급) 및 BDDE(Sigma Aldrich, ≥ 95%)로 제조된, 총 히알루론산 농도가 20 mg/g이고 개질도가 2%인 것인 가교된 히알루론산 겔이다.
본 발명에 따른 것인, 시료 1-2는 오토클레이브에서 주사기 내에서 멸균되고, 총 히알루론산 농도가 20 mg/g인 것이고, 멸균 이전의 시료 1-1과 20 mg/g의 농도의, 비가교된 LMW 히알루론산나트륨(0.10 MDa, HTL, Eur. Ph. 제약/의료 등급) 용액을 1:1로 혼합하여 제조된 가교된 히알루론산 겔이다.
비교 시료 1-3은 오토클레이브에서 주사기 내에서 멸균되고, 총 히알루론산 농도가 10 mg/g인 것이고, 멸균 이전의 시료 1-1과 비가교된 히알루론산염이 포함되지 않은 인산염 완충 식염수 용액을 1:1로 혼합하여 제조된 가교된 히알루론산 겔이다.
시료의 특성들, G' 및 멸균 시 G' 손실은 아래 표 1과 도 1에 요약되어 있다.
시료 가교된 HMW HA 농도 (mg/g) 비가교된 LMW HA 농도
(0.10　MDa) (mg/g) 		총 히알루론산 농도 (mg/g) ΔG′(%)
1-1 (참조) 20 0 20 -10.8
1-2 (본발명) 10 10 20 -2.4
1-3 (비교) 10 0 10 -21.6
결과는 동일한 총 히알루론산 농도를 갖지만 LMW 히알루론산을 포함하지 않는 조성물(시료 1-1(참조))과 비교했을때 LMW 히알루론산을 포함하는 조성물(본 발명에 따른 시료 1-2)의 더 우수한 분해 저항성을 보여준다.
게다가, 가교된 HMW 히알루론산의 농도가 높을수록 조성물의 안정성이 더 큰 것으로 나타난다. 따라서, 시료 1-3(비교 시료, 10 mg/g HMW 히알루론산)은 20 mg/g HMW 히알루론산을 포함하는 시료 1-1(비교 시료)에서의 G' 손실(ΔG′-10.8%)보다 더 큰 G' 손실(Δ-21.6%)을 나타낸다.
그럼에도 불구하고, 이러한 안정성 증가는 비가교된 LMW 히알루론산을 포함하는 시료 1-2(본발명)에서 발견된 것(Δ-2.4%)보다 훨씬 낮다.
결과적으로, 조성물의 분해 저항성 증가와 관련된 것은 총 히알루론산 농도의 단순한 증가가 아니라, 관련된 HMW 히알루론산 조성물의 보충이다.
실시예 2
비가교된 HMW 히알루론산을 선택적으로 포함하는, 가교된 HMW 히알루론산계 조성물을 LMW 히알루론산으로 보충하는 효과
시료 2-1은 다음과 같이 준비된다.
염기성 배지에서 비가교된 HMW 히알루론산(HTL, 4.00 MDa, Eur. Ph. 제약/의학 등급)으로부터 BDDE로 가교된 히알루론산 겔의 제조. 생성된 가교 부분을 중화하고 인산염 완충 식염수에서 팽윤시켜 15 mg/g NaHA를 함유하는 최종 겔을 수득한다. 그런 다음, 이는 투석된다(dialyzed). 이 단계에서 겔은 약 80 내지 120Pa의 탄성계수(G')와 7 내지 10°의 위상각(δ)을 갖는다.
비가교된 HMW 히알루론산나트륨(4.00 MDa, HTL, Eur. Ph. 제약/의료용 등급)의 15 mg/g 용액이 조성물 중 히알루론산의 총 질량에 대해 30 질량%의 비율에 도달하도록 가교된 부분에 첨가된다. 겔을 균질화하고, 그리드를 통해 압출하고 1mL COC 주사기에 채운다. 마지막으로 겔을 오토클레이브한다.
시료 2-2는 시료 2-1과 유사하게 제조되지만, 사용된 비가교 히알루론산 겔의 조성물이 개질되어서 최종 겔이 추가로 10 mg/g의 비가교된 LMW 히알루론산(0.10 MDa, HTL, Eur. Ph. 제약/의학 등급)을 포함한다.
시료 2-3은 시료 2-1과 동일하게 제조되지만 비가교된 4.00 MDa 히알루론산을 사용하지 않았다.
시료 2-4는 사용된 비가교된 4.00 MDa 히알루론산 대신 0.10 MDa 히알루론산을 사용하되, 시료 2-1과 동일하게 제조한다.
이러한 시료 각각에 대해 G'의 변동(백분율)이 계산된다. 얻어진 결과는 아래 표 2에 요약되었다
시료 HMW HA 비가교된
LMW HA의 첨가(0.10　MDa) 		ΔG′(%)
2-1 (비교) 가교된 + 비가교된 X -25
2-2 (본발명) 가교된 + 비가교된 O -15
표 3은 가교된 히알루론산이 단독으로 있는 것의 안정화를 나타낸다.
시료 HMW HA 비가교된
LMW HA의 첨가 (0.10　MDa) 		ΔG′(%)
2-3 (비교) 가교된 것 단독 X -15
2-4 (본발명) 가교된 것 단독 O -10
결과는 오토클레이브 멸균 동안 비가교된 LMW 히알루론산의 보호 효과가 가교된 HMW 히알루론산을 단독으로 포함하는 조성물(시료 2-4 대 시료 2-3) 및 가교된 HMW 히알루론산과 비가교된 HMW 히알루론산의 혼합물을 포함하는 조성물(시료 2-2 대 시료 2-1) 모두에 대해 관찰됨을 보여준다.
따라서, 가교된 HMW 히알루론산 단독 (시료 2-4) 또는 비가교 HMW 히알루론산과의 혼합물(시료 2-2)을 포함하는 조성물에 비가교 LMW 히알루론산을 첨가하면 분해에 대한 저항성이 유리하게 증가한다.
실시예 3
다른 몰질량의 비가교된 히알루론산을 포함하는 히알루론산 겔의 유변학 특성 및 안정성 연구
다른 몰 질량의 히알루론산 용액의 유변학
다양한 몰 질량(0.04 MDa, 0.10 MDa, 0.20 MDa 및 1.50 MDa, HTL, Eur. Ph. 제약/의학 등급)의 비가교된 히알루론산 10 mg/g(1%)의 용액은 인산염 완충 식염수에서 제조된다. 이러한 부분들 각각의 탄성 계수(G') 및 복합 점도(η*)가 결정되고 하기 표 4에 상세하게 기재되어 있다.
시료 비가교된 히알루론산 (MDa) 멸균 이전
η* (mPa.s) 		멸균 이전
G′(Pa)
3-1 0.04 N.D.** N.D.**
3-2 0.10 N.D.** N.D.**
3-3 0.20 21.2 <1
3-4 1.50 2110 6.0
**N.D.: 5 Pa 응력에서 측정할 수 없음(시료 3-1: η* = 2.55 mPa.s 이고 G' = 0.65 Pa 내지 0.6 Pa, 시료 3-2: η* = 5.2 mPa.s 이고 G' = 0.0057 Pa 내지 1 Pa ).
상기 결과는 단독으로 몰질량이 0.20 MDa 이하인 비가교된 히알루론산을 기반으로 하고, 1%로 농축된 겔이 현저한 탄성 특성을 갖지 않고 매우 낮은 점도를 가짐을 보여준다.
기계적 기여
가교 및 비가교 HMW 히알루론산의 혼합물인, 시료 3-5(참조 시료)는 다음과 같이 제조된다.
염기성 배지에서 비가교된 HMW 히알루론산(4.00 MDa, HTL, Eur. Ph. 제약/의료용 등급)으로부터 BDDE-가교된 히알루론산 겔이 제조되었다.
생성된 가교 부분을 중화하고 인산염 완충 식염수에서 팽윤시켜 15 mg/g NaHA를 함유하는 최종 겔을 수득한다. 그런 다음, 이는 투석된다. 이 단계에서 겔은 약 80 내지 120 Pa의 탄성계수(G')와 7 내지 10°의 위상각(δ을 갖는다. 비가교된 HMW 히알루론산나트륨(4.00 MDa, HTL, Eur. Ph. 제약/의료용 등급)의 15 mg/g 용액이 조성물 중 히알루론산의 총 질량에 대해 30 질량%의 비율에 도달하도록 가교된 부분에 첨가된다. 겔을 균질화하고, 그리드를 통해 압출하고 1mL COC 주사기에 채운다. 마지막으로 겔을 오토클레이브한다.
시료 3-6 내지 3-9는 비가교된 히알루론산 겔이 조성물의 총질량에 대해 10 mg/g의 비가교된 히알루론산의 추가 고정농도(1%)를 추가로 포함하는 것을 제외하고는 시료 3-5와 유사하게 제조되었다.
이 첨가를 위해, 상이한 몰 질량의 비가교된 히알루론산이, 즉 시료 3-6 내지 3-9에 대해 0.04 MDa, 0.10 MDa, 0.20 MDa 및 1.50 MDa의 순서로 사용된다(HTL, Eur. Ph. 제약/의학 등급).
이 시료의 유변학적 특성은 각 시료의 6개 주사기에서 멸균 이전 및 이후에 결정된다. 멸균 후 결과를 하기 표 5 및 도 2에 정리하였다.
시료 첨가된 비가교된 히알루론산
(MDa) 		δ (°)/ 표준편차 (°) 멸균 이전 G' (Pa) / 표준 편차 (Pa) 멸균 이후 G' (Pa) / 표준 편차 (Pa) F (N) / 표준 편차 (N)
3-5 (참조) - 16.4 / 0.5 137 / 3 110 / 3 10.4 / 0.6
3-6 (본발명) 0.04 16.8 / 0.4 138 / 2 111 / 3 12.0 / 0.3
3-7 (본발명) 0.10 17.2 / 0.4 144 / 5 124 / 5* 14.8 / 0.5
3-8 (본발명) 0.20 19.9 / 0.7 161 / 3 135 / 9* 15.6 / 0.4
3-9 (비교) 1.50 27.6 / 4 305 / 3 240 / 21* 16.0 / 0.7
*: 참조 시료의 평균과 유의하게 다른 평균, p < 0.001, 2-시료 t 테스트(two-sample t test).
비가교된 LMW 히알루론산의 제한된 기계적 기여 덕분에, 시료 3-6 내지 3-8은 연질 겔, 즉 위상각이 15°와 45° 사이, G'이 150Pa 이하이고 18 N 이하의 압출력을 갖는 겔로 유지된다.
본 발명에 따른 추가적인 LMW 히알루론산의 존재 및 이에 따른 겔에서의 증가된 히알루론산 농도는 이들의 유연성에 영향을 미치지 않음에 주목한다.
한편, HMW 히알루론산을 추가로 포함하는 비교 시료 3-9는 유변학적 특성이 매우 크게 증가하여 더 이상 연질겔로 볼 수 없다. (G' > 150 Pa)
분해 저항성
동일한 오토클레이브 1 사이클을 거친 후 손실된 G'의 백분율을 계산하여 각 시료의 열 분해에 대한 저항성이 연구되었다.
얻어진 결과는 하기 표 6, 도 2 및 도 3에 요약되어 있다.ΔΔ
시료 첨가된 비가교된 히알루론산 (MDa) ΔG' (%) G' 개선 (%)
3-5 (참조) - -20 0
3-6 (본발명) 0.04 -19 2
3-7 (본발명) 0.10 -13 32
3-8 (본발명) 0.20 -16 20
3-9 (비교) 1.50 -21 -8
도 2에 도시된 바와 같이, 구현된 멸균 조건(테스트된 모든 시료에 대해 동일) 하에서, 참조 시료 3-5는 약 20%의 손실을 겪는다.
비가교 HMW 히알루론산(1.50 MDa, 시료 3-9)의 첨가는 멸균 시 G'의 손실을 개선하지 않으며, 이는 참조 시료 3-5(20%)보다 높게 유지된다.
반대로, 본 발명에 따른 보충, 즉 0.04 MDa 내지 0.20 MDa, 보다 바람직하게는 0.08 MDa 내지 0.10 MDa 범위의 몰 질량의 히알루론산의 첨가는 G′ 손실의 감소를 제공한다(시료 3-6 내지 3-8과 시료 3-5의 비교), 즉 조성물의 분해 저항성을 증가시키는 것의 원인이다.
따라서, 본 발명에 따른 LMW 히알루론산이 보충된 조성물은 동일한 총 히알루론산 농도 및 가교된HMW 히알루론산 부분의 동일한 가교도를 가지지만 보충되지 않은 조성물에 비해 우수한 분해 저항성을 갖는다.
이러한 개선은 미미하지만, 사용된 히알루론산의 가장 낮은 몰 질량(0.04 MDa)에서 이미 눈에 띈다(시료 3-6). 이러한 개선은 0.10 MDa 및 0.20 MDa 히알루론산에서 상당하다(시료 3-7 및 3-8).
따라서 멸균 후 각 제품의 6개 주사기에 대한 6회 측정의 평균을 비교하면 시료 3-7 및 3-8이 시료 3-5보다 유의하게 더 높은 G' 값을 가짐을 알 수 있다(도 2 및 도 3).
G'의 이러한 증가는 제형(formulation)에 사용된 LMW HA와 HMW 히알루론산 사이의 상호작용과관련이 있고, 특히 조성물 내 LMW HA의 존재와 관련된 개선된 분해 저항성의 효과(멸균 시 G' 손실 값의 개선을 통해 보여짐)와 관련이 있다.
따라서, 비가교된 HMW 히알루론산(예를 들어 1.50 MDa)을 첨가하면 분해 저항성을 크게 개선하지 않으면서 조성물의 기계적 특성을 증가시키는 반면, 비가교된 LMW HA를 보충하면 연질 겔의 기계적 특성을 유지하면서 겔 분해 저항성이 증가한다
실시예 4
보충의 변화의 영향
이 실시예에서, 비교 시료 4-1은 실시예 3에서 제조된 시료 3-5(비교)와 동일하다. 상이한 농도의 비가교 LMW HA의 효과를 연구하기 위해 상이한 시료를 제조하였다.
시료 4-1은 사용된 비가교된 히알루론산 겔의 조성물이 추가로 증가하는 농도의 비가교된 LMW HA(0.10 MDa HTL, Eur. Ph. 제약/의학 등급) 포함하는 것을 제외하고는 시료 4-1과 유사한 방식으로 제조된 시료 4-2 내지 4-4와 비교된다.
비가교된 LMW HA(0.10 MDa, HTL, Eur. Ph. 제약/의료용 등급)의 비율은 조성물에서 비가교된 LMW 히알루론산의 질량과 가교된 HMW 히알루론산의 질량 사이의 비율에 해당한다(% ).
시료의 유변학적 특성과 멸균 시 G' 손실 Δ는 아래 표 7과 도 4에 요약되어 있다.
시료 비가교된 LMW HA의 비율 (%) 비가교된 LMW HA 농도 (mg/g) 가교된 및 비가교된 HMW HA의 농도 (mg/g) 멸균 이후
δ (°) 		멸균 이후 G' (Pa) ΔG' (%) F(N)
4-1
(비교)		 0 0 15 16.4 / 0.5 110 / 3 -20 10.4 / 0.6
4-2
(본발명)		 48 5 15 16.7 / 0.4 119 / 2 -15 12.4 / 0.5
4-3
(본발명)		 95 10 15 17.2 / 0.4 124 / 5 -13 14.8 / 0.5
4-4
(본발명)		 143 15 15 18.1 / 0.1 120 / 6 -16 17.4 / 0.4
보충의 안정화 효과는 본 발명에 따른 모든 시료 4-2 내지 4-4에서 가시적이다.
따라서, 비가교된 LMW HA의 양을 많거나 또는 적은 양으로, 하나 이상의 가교된 HMW 히알루론산을 포함하는 겔을 보충하는 유리한 효과를 얻는 것이 가능하다.
또한, 위의 결과는 비가교된 LMW HA의 낮은 비율(약 50%) 또는 더 높은 비율(약 150%)을 구현할 때 고농축 히알루론산 조성물(총 히알루론산에 대해 최대 30mg/g)이 여전히 연질이고 주입이 용이함을 보여준다.
실시예 5
HMW 히알루론산 농도 변화의 영향
이 실시예에서, 비교 시료 5-1은 실시예 3에서 제조된 시료 3-5(비교)와 동일한 방식으로 제조된다. 본 발명에 따라, 이전 시료들에 비해 더 낮은 농도의 HMW 히알루론산을 포함하는 시료 5-2 및 5-3은 고정된 농도의 비가교된 LMW 히알루론산이 상이한 농도의 가교된 및 비가교된 HMW 히알루론산의 조성에 미치는 효과를 연구하기 위한 목적으로 제조되었다.
시료 5-2는 시료 5-1과 유사하게 제조되지만, 가교된 HMW 히알루론산 부분의 목표 농도가 12 mg/g이고, 비가교된 HMW 히알루론산 용액의 목표 농도가 12 mg/g이며, 여기에 충분한 양의 0.10 MDa 비가교된 히알루론산(HTL, Eur. Ph. 약제/의료용 등급)이 첨가되어 최종 조성물에서 16 mg/g의 0.10 MDa 비가교된 히알루론산의 농도가 된다.
시료 5-3도 참조 시료와 유사하게 준비하되, 가교된 HMW 히알루론산 부분의 목표 농도가 9 mg/g이고, 비가교된 HMW 히알루론산 용액의 목표 농도가 9 mg/g이며, 여기에 충분한 양의 0.10 MDa 비가교된 LMW 히알루론산(HTL, Eur. Ph. 약제/의료용 등급)이 첨가되어 최종 조성물에서 16 mg/g의 0.10 MDa 비가교된 히알루론산의 농도가 된다.
시료 5-1 내지 5-3의 유변학적 특성, 비가교된 LMW 히알루론산의 비율(%) 및 멸균 시 G' 손실(Δ)을 하기 표 8에 정리하였다.
시료 비가교된 LMW HA의 비율 (%) 가교된 및 비가교된 HMW HA의 농도 (mg/g) 비가교된 LMW HA의 농도 (mg/g) 멸균 이후 G' (Pa) 멸균 이후 δ (°) ΔG' (%) 멸균 이후 F(N)
5-1
(비교)		 0 15 0 98 ± 4 17.7 ± 0.5 -25 11.9 ± 0.3
5-2
(본발명)		 190 12 16 74 ± 1 19.1 ± 0.6 -19 18.2 ± 0.3
5-3
(본발명)		 253 9 16 47 ± 8 21.3 ± 0.8 -4 14.1 ± 0.9
비가교된 LMW 히알루론산의 첨가 덕분에 가교된 및 비가교된 HMW 히알루론산 부분은 15 mg/g에서 12 mg/g으로 감소시킬 수 있고 G'는 약간 감소되는 것을 관찰할 수 있다(시료 5 -1(비교) 대 시료 5-2(본발명)).
또한, 비가교된 LMW 히알루론산을 첨가하여 연질 겔의 기계적 물성을 유지하면서 15mg/g의 히알루론산 겔에서 28mg/g의 히알루론산 겔로 전환이 가능하다(시료 5-1(비교) 대 시료 5-2(본발명)).
매우 적은 양의 가교된 및 비가교된 HMW 히알루론산으로 제조된 시료 5-3은 멸균 시 최소 G' 손실을 나타낸다(단지 - 4%).
비가교된 LMW 히알루론산의 존재는 유리하게는 연질 겔을 제조하는 데 필요한 가교된 히알루론산의 양을 감소시키고, 또한 총 히알루론산 농도를 증가시킬 수 있다. 즉, 보충은 따라서 잠재적으로 증가된 생체 적합성을 갖는 연질 겔을 얻을 수 있게 하면서도(사용된 가교된 히알루론산의 비율 감소) 생체역학적 및/또는 생물학적 관점에서 효과적이다.
실시예 6
효소에 대한 분해 저항성
시료 6-1은 실시예 3에서 제조된 시료 3-5(비교)와 동일한 방식으로 제조된다.
시료 6-2도 유사한 방식으로 제조되지만, 최종 겔이 10 mg/g의 비가교된 LMW 히알루론산(0.10 MDa, HTL, Eur. Ph. /의학 등급)을 추가로 포함하도록 사용된 비가교된 히알루론산 겔의 조성물이 개질되었다.
시료 6-3도 시료 6-1과 유사한 방식으로 제조되지만, 최종 겔이 10 mg/g의 비가교된 HMW 히알루론산(0.10 MDa, HTL, Eur. Ph. /의학 등급)을 추가로 포함하도록 사용된 비가교된 히알루론산 겔의 조성물이 개질되었다.
이러한 모든 시료는 히알루로니다제(HAase)를 사용한 효소 분해 실험을 거친다.
시료의 유변학적 특성과 효소 분해에 대한 G'의 손실은 아래 표 9와 도 5에 요약되어 있다.
시료 가교된 및 비가교된 HMW HA의 농도 (mg/g) 첨가된 비가교된 HA 농도 (mg/g) 첨가된 비가교된 HA (MDa) 멸균 이전 G' (Pa) / 표준 편차 멸균 이후 G' (Pa) / 표준 편차 ΔG' (%)
6-1
(비교)		 15 0 N/A 110 / 3 89 / 1 -19
6-2(본발명) 15 10 0.10 124 / 5 110 / 3 -12
6-3(비교) 25 10 1.50 240 / 21 188 / 4 -22
시료 6-2 및 6-3(각각 0.10 MDa 및 1.50 MDa의 몰 질량을 갖는 히알루론산 포함)은 매우 상이한 출발 특성(starting properties)을 갖는다는 점에 주목한다. 시료 6-3의 특성은 피부 재생 및/또는 피부 개선 용도에 바람직하지 않다(δ, G' 및 F 참조).
효소 분해에 대한 G'의 손실은 비가교된 LMW 히알루론산이 없을 때보다(시료 6-2 vs. 시료 6-1), 심지어 비가교된 HMW 히알루론산이 있을 때보다(시료 6-2 vs. 시료 6-3)더 낮다. 따라서, 본 발명에 따른 것으로 제시된 조성물(시료 6-2)의 증가된 저항성은 비가교된 히알루론산의 단순한 첨가가 아니라 구체적으로 비가교 LMW 히알루론산의 첨가와 관련이 있다.
따라서, 본 발명에 따라 보충된 조성물은 동일한 총 히알루론산 농도, 가교된 히알루론산 부분의 동일한 가교도를 갖지만 HMW 히알루론산만을 포함하는 조성물과 비교하여 효소 분해에 대한 더 나은 저항성을 갖는다.
히알루로니다제에 의한 분해에 대한 이러한 증가된 저항성은 본 발명에 따른 조성물의 생체내 지속성의 증가를 시사한다.
마지막으로, 위의 결과는 비가교된 LMW 히알루론산의 보호 효과를 강조하고, 따라서 하나 이상의 가교된 글리코사미노글리칸을 기반으로 하는 조성물을 보충하는 것의 유익한 효과를 나타낸다.
실시예 7
시료에 존재하는 수용성 및 비수용성 히알루론산의 특성화
여러 멸균된 시료의 수용성 및 비수용성 히알루론산(sHA 및 nsHA)은 위에서 설명한 대로 특성화되었다. HA 원료(Eur. Ph. 제약/의료 등급)은 HTL에서 얻는다.
다음 조성물은 참조로 간주된다:
- 시료 7-1: 가교된 HA HMW: 인산염 완충액 내에서 4.00 MDa HA 단독으로 제조된 가교된 HA 겔; 이 가교된 HA는 시료 2-1의 가교된 HA 부분과 동일하게 제조되지만, 팽윤되어 겔의 총 질량에 대해 NaHA의 농도가 10.5 mg/g인 겔을 얻는다.
- 시료 7-2: 비가교된 HA HMW: 비가교된 HA는 4.00 MDa 단독으로 인산 완충액 내에서 제조된 것으로, 겔의 총질량에 대해 NaHA의 농도가 4.5 mg/g이다.
- 시료 7-3: 비가교 HA LMW: 비가교된 HA는 0.10 MDa Ha 단독으로 인산 완충액 내에서 제조되고, 겔의 총질량에 대해 NaHA의 농도가 10 mg/g이다
다음 세 가지 시료에는 공정 중에 HMW HA 및 LMW HA가 다양한 비율로 추가된다.
- 시료 7-4: 시료 2-4와 동일한 겔로서, 멸균 이전에, HA 4.00 MDa 단독으로 제조된 가교된 HA HMW 및 HA 1.00 MDa으로 제조된 비가교된 HA LMW를 포함한다.
- 시료 7-5: 멸균 전 HA HMW 4.00 MDa 단독으로 제조된 가교된 HA 및 HA 0.10 MDa로 제조된 비가교 HA LMW 및 HA 4.00 MDa로 제조된 비가교된 HA HMW를 포함하는 겔; 상기 겔은 겔의 총 질량(1%)에 대해 10 mg/g의 비가교된 HA LMW 0.10 MDa의 추가 고정 농도를 추가로 포함하는 시료 2-1에 해당한다.
- 시료 7-6: 시료 2-1과 같은 겔로서, HA 4.00 MDa 및 비가교된 HA HMW 4.00 MDa으로부터 제조된 가교된 HA HMW를 포함하는 겔.
모든 시료 7-1에서 7-6은 F0 > 15분으로 오토클레이브(습열)에 의해 멸균된다.
또한, 시료 7-7로서 Allergan에서 상용화한 Juvederm Volift 제품을 테스트하였다. 이 제품은 LMW HA를 많이 포함하는 서로 다른 질량 평균 몰질량의 히알루론산으로 제조된 가교된 히알루론산에 관한 것으로 알려진 Vycross 가교 기술을 사용하여 제조된다. 상기 제품은 17.5 mg/g의 총 HA 농도인 리도카인 HCl을 포함하고 습열에 의해 멸균된다.
시료 가교된 HMW HA,
4.00 MDa
농도 (mg/g) 		비가교된 HMW HA, 4.00 MDa 농도 (mg/g) 비가교된 LMW HA, 0.10 Mda 농도 (mg/g) 총 sHA (%) MOD sHA (%) LMW sHA (0.02≤Mw≤ 0.30 MDa) (%) HMW sHA (Mw> 0.30 MDa) (%)
7-1
(참조)		 10.5 0 0 20.6 17 15.8 4.8
7-2 (참조) 0 4.5 0 100 0 12.5 87.5
7-3 (참조) 0 0 10 100 0 96.2 0.3
7-4(본발명) 10.5 0 4.5 40.5 5 33.8 5.7
7-5 (본발명) 10.5 4.5 10 58.3 3 37.0 17.7
7-6 (비교) 10.5 4.5 0 36.3 9 7.7 28.4
7-7(비교) - - - 20.7 7 15.9 2.3
시료 7-1(가교 반응에 100% HA 참여함)은 개질도가 17%인 sHA를 나타내는 반면, 시료 7-2 및 7-3(살균된 비가교된 HA 단독)은 논리적으로 어떠한 개질도도 나타내지 않는다. 가교된 시료 7-1은 가교제로 고도로 개질된 sHA 부분(주로 LMW)을 방출한다. 4.00 MDa 비가교 HA 원료로 제조된 시료 7-2는 0.30 MDa보다 높은 sHA의 가장 큰 비율을 나타내는 반면, 0.10 MDa 비가교된 HA 원료를 사용하여 제조된 시료 7-3은 전체 sHA가 0.30 MDa 미만인 비율을 나타낸다.
비가교된 LMW(0.10 MDa) HA이 sHA 내의 HA 이당류 반복단위의 몰량을 증가시키고 따라서 MOD값을 감소시키기 때문에, 본 발명에 따른 보충된 조성물은 보충되지 않은 조성물에 비해 더낮은 개질도를 갖는 sHA를 갖는다(시료 7-4 대 7-1, 7-5 대 7-6).
본 발명에 따른 겔(시료 7-3 및 7-4)이 시료 7-5, 7-6 및 7-7에 비해 0.3 MDa 미만의 LMW sHA의 비율이 더 높다는 점은 주목할 만하다. 특히, 가교용 미가교 LMW HA를 많이 사용하여 제조한 시판 시료 7-7은 LMW sHA의 양이 그렇게 많지 않다.
우리는 이론적으로 비가교된 HA LMW로 보충된 가교된 HA HMW를 포함하는 조성물이 다음의 합계와 동일한 총 sHA 백분율을 가질 것으로 예상할 수 있다:
- 조성물 내 HA의 총 질량에 대한 비가교 HA LMW의 백분율 및
- 가교된 부분에 대해서만 측정된 HA의 총 질량에 대한 총 sHA의 백분율.
시료 7-1(가교된 반응에 100% HA 참여)은 조성물 내 HA의 총 질량에 대해 총 sHA의 20.6%를 나타내므로, 따라서 이론적으로 시료 7-3(비가교된 HA LMW를 추가로 포함하고, 시료 7-1과 동일한 가교된 HA를 기반으로 함)은 조성물 내 HA의 총 질량에 대해 약 30 + 20.6 = 50.6%의 sHA를 갖는다.
그러나 시료 7-3에 대해 측정된 총 sHA 백분율은 약 10포인트 낮다(40.5%). 이는 본 발명에 따른 보충이 제조 과정에서 HA 사슬을 보호하여 LMW sHA의 방출을 낮추고, 즉 조성물의 분해에 대한 저항성을 증가시킴을 시사한다.
결론적으로,
SEC 및 1H NMR 기술은 겔 sHA를 특성화하고 본 발명에 따른 겔과 표준 겔을 구별하는 데 성공적으로 사용될 수 있다.
실시예 8
≪ HA HMW ≫에 대한 ≪HA LMW 비가교 ≫질량 비율의 영향
연구된 시료는 아래에 제시된다.
본 발명에 따른 것인, 시료 8-1은 오토클레이빙(F0 > 15분)에 의해 주사기 내에서 멸균된 가교된 히알루론산 겔로서, 총 히알루론산 농도가 20 mg/g이고 멸균 이전에 다음을 1:1의 비율로 혼합하여 제조된다:
- 인산염 완충액 내 히알루론산 총 농도가 20 mg/g 이고 2%의 가교도를 갖는, 비가교된 HA HMW(4.00 MDa, HTL, 약제/의료 Eur. Ph. 등급) 및 BDDE(Sigma Aldrich, ≥ 95%)로 제조된 가교 히알루론산 겔; 그리고,
- 20 mg/g의 비가교된 HA LMW(0.10 MDa, Altergon, 제약/의료 Eur. Ph. 등급)의 비가교된 히알루론산 용액.
시료 8-2는 비교겔로서 시료 8-1과 유사하게 제조되는 것이나, 인산염 완충액 내에 20 mg/g의 비가교된 HA LMW(0.10 MDa, Altergon, 제약/의료 Eur. Ph. 등급)의 비가교된 히알루론산 용액 대신에 2 mg/g의 비가교된 HA LMW(010 MDa, Altergon, 제약/의료 Eur. Ph. 등급)의 비가교 히알루론산 용액을 포함하는 것이다.
시료 8-3은 겔의 총 질량에 대해 가교된 HMW HA 농도가 10 mg/g인 참조 겔이다.
시료 8-1과 유사하게 제조되는 것이나, 20 mg/g의 비가교된 HA LMW(0.10 MDa, Altergon, 제약/의료 Eur. Ph. 등급)의 비가교된 히알루론산 용액 대신에 인산염 완충액만을 사용하여 제조하였다.
시료 가교된HMW HA 농도 (mg/g) 비가교된 LMW HA 농도 (mg/g) 비가교된 LMW HA : 가교된 HMW HA 의 질량비 ΔG' (%) G' 개선 (%)
8-1(본발명) 10 10 1 : 1 -17 23
8-2(비교) 10 1 1 : 10 -20 9
8-3(참조) 10 0 0 -22 0
시료 8-1은 좋은 G' 개선율을 보이지만 시료 8-2는 더 낮다. 따라서, 상당한 G' 개선율을 갖기 위해서는 충분한 비율의 LMW HA가 필요함을 유추할 수 있다.

Claims (35)

  1. 가교된 히알루론산을 포함하는 히알루론산계 수성 겔로서,
    상기 겔은 적어도 다음을 포함하는 것이고:
    히알루론산의 총 질량에 대해 30 질량% 내지 70 질량%의 양의, 0.02 MDa 내지 0.30 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량(mass-average molar mass)을 갖는 수용성 히알루론산(“sHA LMW”); 및 선택적으로, 0.30 MDa 초과의 질량 평균 몰 질량을 갖는 수용성 히알루론산("sHA HMW");
    상기 수용성 히알루론산들은 5% 이하, 우선적으로는 3% 이하, 보다 우선적으로는 1% 이하의 개질도를 가지고,
    상기 수용성 히알루론산들의 각각의 백분율은 다음에 의해 결정되는 것인 수성 겔:
    상기 수성 겔을 0.02%의 NaN3를 함유하는 150 nM 질산나트륨의 pH 7.2 용액 내에서 25 °C에서 5일 동안 희석하고, 상기 희석된 수성 겔을 4400rpm에서 10분 동안 원심분리하고 0.45 mm에서 여과하여 여과액(filtrate)를 얻은 후, 상기 여과액을 다각도 광산란(MALS) 검출기 및 굴절율 증분(dn/dc)이 0.165 ml/g으로 설정된 굴절율(RI) 검출기가 장착된 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 기기로 분석하고, 상기 여과액을 0.3 mL/min의 유속에서 pH 7.2의 질산나트륨을 이동상으로 하며, 0.001 Da 내지 20 MDa의 질량 평균 몰 질량을 갖는 분자에 적합한 크기 배제 컬럼의 이중 세트가 장착된 액체 크로마토그래피 펌핑 스테이션(liquid chromatography pumping station)으로 분석한다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 겔은 15° 내지 50°의 위상각(δ);
    1 Hz의 주파수에서 진동 응력 스윕(osillation stress sweep)을 적용한 원뿔/판 형상을 갖는 레오미터를 사용하여 실온에서 5 Pa의 응력에 대해 측정된 것인, 150 Pa 이하, 바람직하게는 20 내지 150 Pa의 탄성계수 G'; 및
    외부 직경이 0.3 mm (30G) 이하이고 길이가 ½″인 바늘을 가지고 내부 직경이 6.3 mm 이상인 주사기에서 약 12.5 mm/min의 고정된 속도로 실온에서 측정된 것인, 18 N 이하, 바람직하게는 15 N 미만의 압출력(extrusion force)을 갖는 연질 겔(soft gel)인 것인 수성 겔.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 35 내지 65 질량%의 "sHA LMW"를 포함하는 수성 겔.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, "sHA LMW"로 칭한 상기 수용성 히알루론산은 0.04 MDa 내지 0.20 MDa, 바람직하게는 0.04 MDa 내지 0.15 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 것인 수성 겔.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, "sHA HMW"로 칭한 상기 수용성 히알루론산은 0.30 MDa 초과 4.00 MDa 이하의 질량 평균 몰 질량을 갖는 것인 수성 겔.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 10 내지 30 질량%, 바람직하게는 15 내지 20 질량%의 "sHA HMW"를 포함하는 수성 겔.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교된 히알루론산이 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 5 mg/g 이상의 양으로 존재하는 수성 겔.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, "sHA LMW"로 칭한 상기 수용성 히알루론산은 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 적어도 3 mg/g, 우선적으로는 10 mg/g의 양으로 존재하는 것인 수성 겔.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 겔의 총 질량에 대한 상기 총 히알루론산의 농도는 10 내지 40 mg/g, 우선적으로는 15 내지 35 mg/g, 보다 우선적으로는 20 내지 30 mg/g인 것인 수성 겔.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루론산의 총 개질도가 5% 이하, 바람직하게는 3% 이하, 보다 바람직하게는 1% 이하인 수성 겔.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 가교된 히알루론산이 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 6 내지 12 mg/g 범위의 양으로 존재하고,
    상기 "sHA LMW"로 칭한 수용성 히알루론산이 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 12 내지 20 mg/g 범위의 양으로 존재하고,
    상기 "sHA HMW"로 칭한 수용성 히알루론산이 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 3 내지 6 mg/g 범위의 양으로 존재하고,
    상기 수성 겔의 총 질량에 대해 20 내지 30 mg/g 의 총 농도로 상기 히알루론산을 포함하는 수성 겔.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 겔이, 예를 들어 오토클레이브에서, 가열 멸균 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 수성 겔.
  13. 하나 이상의 가교된 히알루론산 및 하나 이상의 비가교된 히알루론산을 포함하는 수성 겔의 제조 방법으로서 적어도 다음 단계:
    a) 0.50 MDa 이상, 우선적으로는 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로는 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 범위의 질량 평균 몰 질량을 갖는 비가교된 히알루론산 및 가교제로부터 형성되며, "가교된 HA HMW"로 칭한, 가교된 히알루론산을 하나 이상 포함하는 수용액을 만드는 단계;
    b) 0.04 MDa 내지 0.30 MDa, 우선적으로는 0.08 MDa 내지 0.20 Mda, 보다 우선적으로는 0.08 MDa 내지 0.15 Mda 범위의 질량 평균 몰질량을 가지며, “비가교된 HA LMW”로 칭한, 비가교된 히알루론산을 하나 이상 포함하는 수용액을 만드는 단계; 및
    c) a) 및 b) 단계의 상기 수용액의 전부 또는 일부의 균질한 혼합물을 형성하는 단계;로 구성되고
    상기 제조 방법은 "비가교된 HA LMW" 대 "HA HMW"의 질량비가 1:3 내지 2:1인 히알루론산의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 "가교 HA HMW"는 8 질량% 이하, 우선적으로는 5 질량% 이하, 보다 우선적으로는 2 질량% 미만의 가교도로 제조된 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 "가교 HA HMW"의 제조에 사용되는 상기 가교제가 이관능성 또는 다관능성 에폭시 가교제, 우선적으로는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 질량 평균 몰 질량이 0.50 MDa 이상, 우선적으로는 1.00 MDa 초과, 보다 우선적으로는 1.00 MDa 내지 4.00 MDa 의 범위를 갖는, “비가교 HA HMW”로 칭한, 비가교된 히알루론산의 하나 이상의 사용을 추가로 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 "비가교 HA HMW"의 전부 또는 일부가 단계 b)의 수용액에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 단계 c)에서 상기 "비가교 HA HMW"의 수용액 및 단계 b)의 수용액을 단계 a)의 수용액과 동시에 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)가 적어도 하나의 그리드를 통해 상기 형성된 혼합물을 압출하는 단계를 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 적어도 5 mg/g의 "가교 HA HMW"의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 3 mg/g 이상, 우선적으로는 10 mg/g의 상기 "비가교 HA LMW"를 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 겔이 상기 수성 겔의 총 질량에 대해 10 내지 40 mg/g, 우선적으로는 15 내지 35 mg/g, 보다 우선적으로는 20 내지 30 mg /g 범위의 히알루론산 총 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 "비가교 HA LMW" 대 "HA HMW"의 질량비가 1:3 내지 5:3, 우선적으로는 1:2 내지 5:3인 히알루론산을 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 겔은 상기 히알루론산의 개질도가 5% 이하, 우선적으로는 3% 이하, 보다 우선적으로는 1% 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 a)에서 5 내지 15 mg/g의 "가교 HA HMW"를 포함하는 수용액을 사용하고,
    단계 b)에서, 50 내지 60 mg/g의 "비가교 HA LMW" 및 5 내지 20 mg/g의 "비가교 HA HMW" 을 포함하는 수용액을 사용하고,
    제조된 상기 겔은 상기 겔의 총 질량에 대해 20 내지 30 mg/g의 히알루론산 총 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제13항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균되고 주입 가능한 겔을 제조하기 위해서,
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 수성 겔 또는 제13항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따라 얻어진 수성 겔을 사용하는 하나 이상의 단계; 및
    예를 들어 오토클레이브에서의, 가열 멸균 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 겔은 멸균 단계 전에 주사기에 포장되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제13항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 히알루론산의 수성 겔.
  29. 청구항 제28항에 있어서,
    상기 겔은 15° 내지 50°의 위상각(δ);
    1 Hz의 주파수에서 진동 응력 스윕(osillation stress sweep)을 적용한 원뿔/판 형상을 갖는 레오미터를 사용하여 실온에서 5 Pa의 응력에 대해 측정된 것인, 150 Pa 이하, 바람직하게는 20 내지 150 Pa의 탄성계수 G';
    외부 직경이 0.3 mm (30G) 이하이고 길이가 ½″인 바늘을 가지고 내부 직경이 6.3 mm 이상인 주사기에서 약 12.5 mm/min의 고정된 속도로 실온에서 측정된 것인, 18 N 이하, 바람직하게는 15 N 미만의 압출력(extrusion force)을 갖는 연질 겔(soft gel)인 것인 수성 겔.
  30. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 수성 겔 또는 제28항 또는 제29항에 따른 수성 겔을 포함하는 화장료 및/또는 피부과(dermatological) 조성물.
  31. 피부 표면 외관의 변화의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 수성 겔 또는 제28항 또는 제29항에 따른 수성 겔 또는 제30항에 따른 피부과 조성물.
  32. 연조직 증대 및/또는 충전에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 수성 겔 또는 제28항 또는 제29항에 따른 수성 겔 또는 제30항에 따른 피부과 조성물.
  33. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 수성 겔 또는 제 28 항 또는 제 29 항에 따른 수성 겔 또는 제 30 항에 따른 피부과 조성물의 피부 표면 외관의 변화의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 비치료적 화장(non-therapeutic cosmetic use) 용도.
  34. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 수성 겔 또는 제28항 또는 제29항에 따른 수성 겔 또는 제30항에 따른 화장료 조성물의 연조직의 증대 및/또는 충전을 위한, 특히 주름을 채우기 위한 비치료적 화장 용도.
  35. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 수성 겔 또는 제28항 또는 제29항에 따른 수성 겔 또는 제30항에 따른 화장료 및/또는 피부과 조성물을 포함하는, 미리 채워진 주사기 및 사용 지침을 포함하는 키트.
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